Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк вируса папилломы человека 52 типа высокого канцерогенного риска в слизистой оболочке цервикального канала

Авторы патента:

C12Q1/6806 - Способы измерения или испытания, использующие ферменты или микроорганизмы (устройства для измерения или испытания при работе с ферментами или микроорганизмами, например счетчики колоний C12M 1/34); составы для них; способы получения подобных составов

C12Q1/68 - использующие нуклеиновые кислоты

Владельцы патента RU 2737619:

Общество с ограниченной ответственностью "НекстБио" (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК вируса папилломы человека 52 типа высокого канцерогенного риска следующих последовательностей Seq.N1 и Seq.N2, также использования зонда с флуоресцентной меткой, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, Seq.N3: GGCTGCAGTGTGTGCAGTG Seq.N1, AAGCGTAGGCACATAATACACACG Seq.N2, TGGACAAGCAGAACAAGC Seq.N3. Изобретение позволяет расширить арсенал средств выявления ДНК вируса папилломы человека 52 типа высокого канцерогенного риска в биологическом материале. 3 пр.

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, молекулярной биологии и эпидемиологии, и касается синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК вируса папилломы человека 52 типа высокого канцерогенного риска. Изобретение предназначено для исследования биологического материала человека, полученного от лиц с подозрением на наличие папилломавирусной инфекции с целью выявления ДНК вируса папилломы человека 52 типа высокого канцерогенного риска. Олигонуклеотиды могут быть использованы для создания набора реагентов для выявления ДНК вирусов папилломы человека 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 типов высокого канцерогенного риска методом полимеразной цепной реакции. Изобретение позволяет проводить обнаружение указанного типа вируса папилломы человека в биологическом материале с высокой точностью.

В последнее время разрабатываются различные специфические олигонуклеотиды для идентификации последовательностей ДНК вируса папилломы человека различных типов высокого канцерогенного риска в биологических материалах, в частности ДНК вируса папилломы человека 52 типа высокого канцерогенного риска.

Известны способы, которые обеспечивают возможность детектировать до пятнадцати типов ВПЧ в одном мультиплексном тесте, а именно ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 и 73. Эти способы частично основаны на присутствии или отсутствии ДНК и РНК ВПЧ. (Processes and compositions for detecting human papilloma virus types. № публ. WO/2012/047897, дата публ. 12.04.2012, заявители: STOERKER, SEQUENOM, INC. [US/US]) США.

Известен метод, основанный на количественном ПЦР, который позволяет обнаруживать 30 типов ВПЧ (6, 11, 26, 40, 42, 43, 44, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 66, 68, 70, 72, 73, 81, 82 и 83). (Human papilloma virus detection method. Заявители: JIANGSU MOLE BIOSCIENCE CO., LTD., номер публикации: 104630384, дата публикации: 20.05.2015) Китай.

Известен способ основанный на ПЦР, позволяющий обнаруживать 14 типов ВПЧ (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68), которые классифицируются как ВПЧ высокого онкогенного риска, а также обнаруживать кандидата в ВПЧ высокого онкогенного риска (ВПЧ 67). (New detection method for cervical HPVs. Заявители: Self-screen B.V., номер публикации: 2007360826, дата публикации: 27.05.2010).

Известны праймеры, зонды, наборы праймеров, наборы праймеров и зондов, способы и наборы реагентов для обнаружения вирусов папилломы человека, последовательностей бета-глобина человека и вирусов папилломы человека и последовательностей бета-глобина человека исследуемом образце (Праймеры и зонды для детекции последовательностей вируса папилломы человека в исследуемых образцах. № публ.: 0002530550, дата публикации: 10.10.2014).

Известно изобретение, направленное на ПЦР-амплификацию в реальном времени, в которой задействованы химические принципы системы Taq-Man для того, чтобы одновременно обнаруживать большее количество типов ВПЧ, чем существует каналов детекции. В данной системе анализа задействован набор праймеров/зондов для обнаружения каждого типа ВПЧ, для обнаружения которого сконструирована эта система анализа. Различные серотипы, которые можно успешно обнаруживать с помощью этого анализа, включают, например, ВПЧ типов 33, 39, 51, 56, 58, 59, 66 и 68. (Система анализа для обнаружения близкородственных серотипов вируса папилломы человека (ВПЧ). Патент на изобретение №: 2558236, Дата публикации: 2015).

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является расширение арсенала средств выявления ДНК вируса папилломы человека 52 типа высокого канцерогенного риска в биологическом материале.

Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК вируса папилломы человека 52 типа высокого канцерогенного риска в области амплификации - Е6 gene, включающего в себя праймеры следующих последовательностей Seq.N1 и Seq.N2, также используется зонд с флуоресцентной меткой, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, Seq.N3:

GGCTGCAGTGTGTGCAGTG Seq.N1

AAGCGTAGGCACATAATACACACG Seq.N2

TGGACAAGCAGAACAAGC Seq.N3

Существенным отличием работы с данными праймерами является:

1) Высокая специфичность и чувствительность праймеров в области Е6 gene рибосомальной ДНК позволяет выявить ДНК вируса папилломы человека 52 типа высокого канцерогенного риска в биологическом материале при низкой концентрации возбудителя.

2) Для снижения вероятности образования неспецифических продуктов реакции использовали праймеры с высокой температурой отжига.

3) Использование данных праймеров для ПЦР совместимо с образцами ДНК, выделенных с применением коммерческих наборов, таких как «АмплиПрайм^® ДНК-сорб-АМ», «МагноПрайм ЮНИ» и «МагноПрайм ФАСТ» (ООО «НекстБио» Россия).

Указанный набор синтетических олигонуклеотидов может являться составной частью многосоставных реакционных смесей, реакционных смесей раскапаных под прослойку парафина и лиофильно высушенных реакционных смесей.

Синтетические олигонуклеотиды могут являться составной частью наборов реагентов, предназначенных для определения ДНК вируса папилломы человека 52 типа высокого канцерогенного риска, в состав которых входят:

1. ПЦР-смесь, включающая в состав указанные праймеры и зонд, специфические к участку ДНК вируса папилломы человека 52 типа высокого канцерогенного риска, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ).

2. ПЦР-буфер.

3. Набор контрольных образцов (положительный контрольный образец (ПК) и отрицательный контрольный образец):

3.1. Положительный контрольный образец (ПК) - смесь бактериофагов λ и плазмид со вставками специфических последовательностей. Положительный контрольный образец вносится в отдельную пробирку с реакционной смесью. Результат амплификации ПК демонстрирует эталонное положительное прохождение реакции, с которым сравниваются результаты амплификации исследуемых образцов.

3.2. Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Отрицательный контрольный образец вносится в отдельную пробирку с реакционной смесью. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости замены реагентов и необходимости переставить эксперимент.

Возможность осуществления заявленного изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Определение наличия ДНК вируса папилломы человека 52 типа высокого канцерогенного риска в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе многосоставной реакционной смеси.

Биологический материал (отделяемое слизистой оболочки цервикального канала) перед проведением ПЦР проводится через процедуру пробоподготовки с использованием набора реагентов для пробоподготовки. В ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для проведения ПЦР. Вместе с образцами биологического материала процедуру экстракции проходят контрольные образцы - отрицательный контроль и положительный контроль.

Предварительно готовится реакционная смесь путем смешивания ПЦР-смеси, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонд, и ПЦР-буфера в объемах, необходимых для исследования образцов биологического материала и контрольных образцов (отрицательный и положительный контроли).

В предварительно подготовленные маркированные пробирки вносится приготовленная реакционная смесь.

В пробирки с реакционной смесью, промаркированные для образцов биологического материала, вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции.

В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из отрицательного контроля.

В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из положительного контроля.

Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.

Предложенный набор синтетических олигонуклеотидов позволяет определять наличие ДНК вируса папилломы человека 52 типа высокого канцерогенного риска с высокой точностью.

Пример 2. Определение наличия ДНК вируса папилломы человека 52 типа высокого канцерогенного риска в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе реакционной смеси раскапаной под прослойку парафина.

Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью для амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов. Убедиться, что парафин полностью покрывает раствор на дне пробирок.

На поверхность парафина внести буферный раствор с полимеразой, при этом он не должен проваливаться под парафин и смешиваться с ПЦР-смесью.

Внести в подготовленные маркированные пробирки пробы ДНК, полученные в результате экстракции из исследуемых образцов. В специально промаркированную пробирку вносится проба ДНК, полученная на этапе экстракции из отрицательного контроля.

Пример 3. Определение наличия ДНК вируса папилломы человека 52 типа высокого канцерогенного риска в биологическом образце с помощью набора синтетических олигонуклеотидов в составе лиофильновысушенной реакционной смеси

Отобрать необходимое количество пробирок или достать 96-луночный планшет для амплификации с готовой лиофилизированной реакционной смесью для амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов.

В подготовленные пробирки или лунки планшета внести по пробу ДНК, полученную в результате экстракции из исследуемых образцов.

Поставить контрольные реакции:

а) в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести контрольный образец.

б) в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести контрольный образец.

в) отрицательный контроль экстракции (ОК) - в пробирку или лунку планшета с реакционной смесью внести пробы, экстрагированной из ОКО.

Установить пробирки или планшет в ячейки реакционного модуля прибора, провести амплификацию и выполнить анализ результатов.

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК вируса папилломы человека 52 типа высокого канцерогенного риска в слизистой оболочке цервикального канала методом полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что включает в себя праймеры следующих последовательностей Seq.N1 и Seq.N2, также используется зонд с флуоресцентной меткой, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, Seq.N3:

GGCTGCAGTGTGTGCAGTG Seq.N1,

AAGCGTAGGCACATAATACACACG Seq.N2,

TGGACAAGCAGAACAAGC Seq.N3.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к системе для предсказания прогноза и пользы от вспомогательной химиотерапии для больных раком желудка II и III стадии, разработан алгоритм, который может предсказывать прогноз и отвечаемость на химиотерапию с использованием результатов количественного анализа уровней экспрессии мРНК группы связанных с прогнозом или отвечаемостью на химиотерапию маркерных генов и группы эталонных генов при прогрессирующем раке желудка, что может быть использовано в качестве дополнительной информации для определения способа лечения больного раком желудка.

Днк-аптамеры к днк-полимеразе эта человека // 2737285

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к ДНК-аптамерам к ДНК-полимеразе эта (Pol eta) человека и способу применения ДНК-аптамеров для ингибирования активности Pol eta.

Модифицированные 50-звенные днк-аптамеры, связывающие внеклеточный домен egfr // 2736790

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая аптамерный модифицированный ДНК олигонуклеотид, специфически связывающийся с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) (варианты), аптамерный модифицированный ДНК олигонуклеотид, специфически связывающийся с мутантной формой рецептора эпидермального фактора роста (EGFR vIII) (варианты), способ узнавания рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) и способ узнавания мутантной формы рецептора эпидермального фактора роста (EGFR vIII).

Транспозиция с сохранением сцепления генов // 2736728

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена композиция для получения библиотеки.

Секвенирование с помощью одиночного источника света и двух оптических каналов // 2736384

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены система и осуществляемый посредством компьютера способ определения нуклеотидной последовательности полинуклеотидов.

Способы дискретной амплификации полного генома // 2736351

Изобретение относится к биотехнологии и представляет способ амплификации геномной ДНК, например, полного генома, включающий использование системы транспозазы для получения фрагментов геномной ДНК, содержащих участки связывания праймеров, изолирование в масле каждого фрагмента внутри его собственной микрокапли воды вместе с реагентами для ПЦР-амплификации, амплификацию каждого фрагмента внутри его собственной микрокапли воды, деэмульгирование микрокапель с целью получения ампликонов и секвенирование ампликонов.

Композиции и способы для улучшения молочной продуктивности и репродуктивного здоровья млекопитающих, основанные на применении il-8 // 2736131

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к композициям и способам улучшения репродуктивного здоровья млекопитающих и увеличения молочной продуктивности самками млекопитающих.

Способ и устройство для обнаружения аналита с использованием электрохимического биосенсора // 2735654

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ обнаружения аналита с использованием сенсора (варианты) и система обнаружения аналита.

Меченые волокна ацетата целлюлозы, способы получения и продукты, содержащие такие волокна // 2735553

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ и аппарат для получения содержащихся в сигаретах меченых волокон ацетата целлюлозы, способ обнаружения содержащегося в нуклеотидной последовательности элемента информации (варианты), способ получения кипы жгута, волокна ацетата целлюлозы, жгут или кипа жгута, фильтр и сигарета.

Способ вакцинации против аутоантигена у пациента-человека // 2734924

Раскрыт способ вакцинации против аутоантигена у пациента-человека, где дозу с эффективным количеством аутоантигена применяют у пациента для индукции первичного иммунного ответа, характеризующийся тем, что пациента подвергают бустерному применению указанного аутоантигена, где количество аутоантигена в дозе для бустерного применения выше количества аутоантигена в дозе, используемой для применения с целью первичного иммунного ответа.