Модулирование экспрессии аполипопротеина с-iii (аросiii) у пациентов с липодистрофией

Изобретение относится к области медицины и предназначено для предупреждения, замедления или облегчения частичной липодистрофии у животного. Для этого применяют антисмысловое соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид. Указанный модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из последовательности нуклеиновых оснований из SEQ ID NO: 3. Использование изобретения обеспечивает эффективное предупреждение, замедление и облегчение частичной липодистрофии. 18 з.п. ф-лы, 1 пр.

 

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка подана вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей представлен в виде файла под названием BIOL0268WOSEQ_ST25.txt, созданного 24 февраля 2016 года, размером 12 Кб. Информация о перечне последовательностей в электронном формате в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе предложены способы, соединения и композиции для снижения экспрессии мРНК и белка аполипопротеина С-III (ApoCIII), снижения уровня триглицеридов и повышения уровней липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) или активности ЛПВП у пациентов с частичной липодистрофией (ЧЛ). Также в данном документе представлены соединения и композиции для применения при лечении частичной липодистрофии или связанных с ней расстройств.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Липопротеины представляют собой глобулярные, мицеллоподобные частицы, которые состоят из неполярного ацилглицеринового ядра и эфиров холестерина, окруженных амфифильным покрытием из белка, фосфолипида и холестерина. Липопротеины разделены на пять основных категорий на основании их функциональных и физических свойств: хиломикроны, липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеины промежуточной плотности (ЛППП), липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и липопротеины высокой плотности (ЛПВП). Хиломикроны переносят пищевые липиды из кишечника к тканям. ЛПОНП, ЛППП и ЛПНП все переносят триацилглицериды и холестерин от печени к тканям. ЛПВП переносят эндогенный холестерин от тканей к печени.

Аполипопротеин С-III (также называемый АРОС3, АРОС-III, ApoCIII и АРО С-III) представляет собой компонент ЛПВП и богатых триглицеридами липопротеинов (ТГ). Повышенный ApoCIII связан с повышенными уровнями ТГ при таких заболеваниях как сердечно-сосудистое заболевание, метаболический синдром, ожирение, диабет (Chan et al., Int J Clin Pract, 2008, 62:799-809; Onat et al., Atherosclerosis, 2003, 168:81-89; Mendivil et al., Circulation, 2011, 124:2065-2072; Mauger et al., J. Lipid Res, 2006. 47:1212-1218; Chan et al., Clin Chem, 2002, 278-283; Ooi et al., Clin. Sci, 2008,114:611-624; Davidsson et al., J. Lipid Res, 2005. 46:1999-2006; Sacks et al., Circulation, 2000. 102:1886-1892; Lee et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2003, 23:853-858) and Lipodystrophy (Kassai et al., электронная публикация тезисов научной конференции ENDO 2015, по адресу https://endo.confex. com/endo/2015endo/webprogram/Paper22544.html).

Липодистрофические синдромы представляют собой группу редких метаболических заболеваний, характеризующихся селективной потерей жировой ткани, что приводит к эктопическому отложению жира в печени и мышцах, а также к развитию резистентности к инсулину, диабету, дислипидемии и стеатозу печени. Эти синдромы классифицируются в генерализованную или частичную липодистрофию в соответствии с лежащей в их основе этиологией (унаследованной или приобретенной) и в соответствии с распределением потери жира (Garg et al., J Clin Endocrinol Metab, 2011, 96:3313-3325; Chan et al., Endocr Pract, 2010, 16:310-323; Simha et al., Curr Opin Lipidol, 2006, 17(2): 162-169; Garg, N Engl J Med, 2004, 350:1220-1234).

Современное лечение липодистрофии включает изменение образа жизни путем снижения потребления калорий и увеличения расхода энергии с помощью упражнений. Обычные методы лечения, применяемые для лечения тяжелой резистентности к инсулину (метформин, тиазолидиндионы, ГПП-1, инсулин), и/или высоких ТГ (фибраты, рыбий жир) являются не очень эффективными для этих пациентов (Chan et al., Endocr Pract, 2010, 16:310-323).

Для пациентов с ВИЧ-ассоциированной липодистрофией Egrifta^® (тезаморелин) является коммерчески доступной для снижения избыточного брюшного жира (Egrifta^® Package Insert, 2013).

У пациентов с генерализованной липодистрофией метаболические осложнения связаны с дефицитом лептина. Лептинзаместительная терапия с помощью Myalept^® (метрелефин) является коммерчески доступной для пациентов с генерализованной липодистрофией, но из-за связанных с Myalept^® рисков образования вызывающих ослабление действия препарата нейтрализующих антител к эндогенному лептину или метрелефину, и риску развития лимфомы, он доступен только через программу оценки рисков и стратегии смягчения последствий (REMS), которая требует сертификации по рецепту и фармации и специальной документации (Myalept, FDA Briefing Document, 2013; Chang et al., Endocr Pract, 2011, 17(6):922-932).

В настоящее время не существует специфического фармакологического лечения неятрогенных форм частичной липодистрофии.

Соответственно существует необходимость в обеспечении пациентов новыми возможностями лечения липодистрофии. Антисмысловая технология представляет собой эффективный способ модулирования экспрессии одного или более специфических генных продуктов и, следовательно, может быть признана исключительно подходящей в ряде терапевтических, диагностических и исследовательских применений для модулирования ApoCIII. Ранее нами были описаны композиции и способы ингибирования ApoCIII антисмысловыми соединениями в US 20040208856 (патент США 7598227), US 20060264395 (патент США 7750141), WO 2004/093783, WO 2012/149495, WO 2014/127268, WO 2014/205449 и WO 2014/179626, все включены в данный документ посредством ссылок. Антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на ApoCIII, был испытан в ходе фазы I и II клинических исследований, и в настоящее время он находится в фазе III исследований для изучения его эффективности при синдроме семейной хиломикронемии (ССХ) и у пациентов с гипертриглицеридемией.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения, предупреждения, замедления или облегчения липодистрофии, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения предложен специфический ингибитор ApoCIII для использования в лечении, предупреждении, замедлении или облегчении липодистрофии. В некоторых вариантах реализации изобретения липодистрофия представляет собой генерализованную липодистрофию или частичную липодистрофию.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения, предупреждения, замедления или облегчения сердечно-сосудистого и/или метаболического заболевания, или расстройства, или его симптома у животного с липодистрофией, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение предупреждает, замедляет или облегчает сердечно-сосудистое и/или метаболическое заболевание, расстройство, патологическое состояние, или его симптом у животного с липодистрофией путем снижения уровней ТГ, повышения уровней ЛПВП у животного и/или улучшения соотношения ТГ к ЛПВП. В некоторых вариантах реализации изобретения

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения, предупреждения, замедления или облегчения стеатоза печени, НАЖБП или НАСГ, или его симптома у животного с липодистрофией, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение предупреждает, замедляет или облегчает стеатоз печени, НАЖБП или НАСГ, или его симптом у животного с липодистрофией путем снижения уровней ТГ, повышения уровней ЛПВП у животного и/или улучшения соотношения ТГ к ЛПВП. В некоторых вариантах реализации изобретения улучшается течение, облегчается симптом или снижается риск стеатоза печени, НАЖБП или НАСГ. В некоторых вариантах реализации изобретения введение терапевтически эффективного количества соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII, животному с связанным с липодистрофией стеатозом печени, НАЖБП или НАСГ, предотвращает или замедляет прогрессирование цирроза печени или гепатоцеллюлярной карциномы.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения, предупреждения, замедления или облегчения панкреатита или его симптома у животного с липодистрофией, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение предупреждает, замедляет или облегчает панкреатит или его симптом у животного с липодистрофией, путем снижения уровней ТГ, повышения уровней ЛПВП у животного и/или улучшения соотношения ТГ к ЛПВП. В некоторых вариантах реализации изобретения улучшается течение, облегчается симптом или снижается риск панкреатита.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ снижения уровней ТГ у животного с липодистрофией, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения улучшается течение, облегчается симптом или снижается риск гипертриглицеридемии.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ повышения уровней ЛПВП и/или улучшение соотношения ТГ к ЛПВП у животного с липодистрофией, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ снижения тощакового уровня ТГ, снижения HbA1c, снижения глюкозы в плазме, уменьшения объема печени, снижение увеличения объема печени и снижения стеатоза печени у животного с липодистрофией, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения HbA1c снижается до менее чем 9%, менее чем 8%, менее чем 7,5% или менее чем 7%. В некоторых вариантах реализации изобретения HbA1c снижается по меньшей мере на 0,2%, по меньшей мере на 0,5%, по меньшей мере на 0,7%, по меньшей мере на 1%, по меньшей мере на 1,2% или по меньшей мере на 1,5%.

В некоторых вариантах реализации изобретения специфический ингибитор ApoCIII представляет собой нуклеиновую кислоту, пептид, антитело, малую молекулу или другой агент, способный ингибировать экспрессию ApoCIII. В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловое соединение, нацеленное на ApoCIII. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение представляет собой антисмысловой олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации антисмысловой олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из ISIS 304801, AGCTTCTTGTCCAGCTTTAT (SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из последовательности нуклеиновых оснований из SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид является по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 100% комплементарным SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах реализации изобретения липодистрофия представляет собой генерализованную липодистрофию. В некоторых вариантах реализации изобретения липодистрофия представляет собой частичную липодистрофию.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следует понимать, что изложенное выше общее описание и следующее подробное описание являются лишь типовыми и пояснительными, и не являются ограничивающими заявленное изобретение. В данном документе использование единственного числа включает множественное число, если специально не указано иное. При использовании в данном документе, термин "или" означает "и/или", если не указано иное. Кроме того, использование термина "включающий", а также других форм, таких как "включает" и "включенный", не является ограничивающим. Также такие термины как "элемент" или "компонент" охватывают как элементы и компоненты, содержащие одну единицу, так и элементы и компоненты, которые содержат более чем одну субъединицу, если специально не указано иное.

Заголовки разделов, используемые в данном документе, предназначены только для организационных целей и не должны интерпретироваться как ограничивающие описанный объект. Все документы или части документов, цитируемых в данной заявке, в том числе, но не ограничиваясь ими, патенты, патентные заявки, статьи, книги и трактаты, таким образом, явно включены посредством ссылки на части документа, обсуждаемого в данном описании, а также в полном объеме.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Если только не были предложены конкретные определения, номенклатура, используемая в связи с, а также методики и методы аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, описанные в данном документе, являются хорошо известными и традиционно применяемыми в данной области техники. Для химического синтеза и химического анализа могут быть использованы стандартные методы. В допустимых случаях, все патенты, заявки, опубликованные заявки и другие публикации, номера доступа GENBANK и связанная информация о последовательностях, доступная через базы данных, такие как Национальный Центр Биотехнологической Информации (NCBI) и другие данные, на которые присутствует ссылка в данном описании, включены посредством ссылки в части документа, обсуждаемой в данном описании, а также в полном объеме.

Если не указано иное, следующие термины имеют следующие значения:

"2'-O-метоксиэтил" (также известный как 2'-МОЭ, 2'-O(CH₂)₂-ОСН₃ и 2'-O-(2-метоксиэтил)) означает О-метокси-этил-модификацию положения 2' фурозильного кольца. 2'-O-метоксиэтил-модифицированный сахар представляет собой модифицированный сахар.

"2'-O-метоксиэтил-нуклеотид" означает нуклеотид, содержащий 2'-O-метоксиэтил-модифицированный сахарный фрагмент.

"3' Сайт-мишень" означает нуклеотид нуклеиновой кислоты-мишени, комплементарный 3'-крайнему нуклеотиду конкретного антисмыслового соединения.

"5' Сайт-мишень" означает нуклеотид нуклеиновой кислоты-мишени, комплементарный крайнему 5'-нуклеотиду конкретного антисмыслового соединения.

"5-Метилцитозин" означает цитозин, модифицированный метильной группой, присоединенной в 5' положении. 5-Метилцитозин представляет собой модифицированное нуклеиновое основание.

"Около" означает в пределах ±10% от значения. Например, если указано, что "маркер может быть увеличен на около 50%", то подразумевается, что маркер может быть увеличен на 45%-55%.

"Активный фармацевтический агент" означает субстанцию или субстанции в фармацевтической композиции, которые обеспечивают терапевтическое действие при введении индивидууму. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на ApoCIII, представляет собой активный фармацевтический агент.

"Активная область-мишень" или "область-мишень" означает область, на которую нацелено одно или более активных антисмысловых соединений". Активные антисмысловые соединения" означают антисмысловые соединения, которые снижают уровни целевой нуклеиновой кислоты или уровни белка.

"Вводят совместно" означает одновременное введение двух агентов в любой форме, в которой фармакологические эффекты обоих проявляется в организме больного в одно и то же время. Совместное введение не требует, чтобы оба агента были введены в одной фармацевтической композиции, в одной лекарственной форме или одним и тем же способом введения. Эффекты обоих агентов не обязательно должны проявляться одновременно. Эффекты должны только перекрываться в промежутке времени и не обязательно должны иметь одинаковую продолжительность.

"Введение" означает доставку фармацевтического агента в организм индивидуума, и включает, но не ограничиваясь ими, введение медицинским работником и самостоятельное введение.

"Агент" означает активное вещество, которое может обеспечивать терапевтический эффект при введении животному. "Первый агент" означает терапевтическое соединение по настоящему изобретению. Например, первый агент может быть антисмысловым олигонуклеотидом, нацеленным на ApoCIII. "Второй агент" означает второе терапевтическое соединение по изобретению (например, второй антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на ApoCIII) и/или не-ApoCIII терапевтическое соединение.

"Облегчение" означает уменьшение по меньшей мере одного показателя, признака или симптома связанного заболевания, расстройства или состояния. Степень тяжести показателей может быть определена субъективными или объективными показателями, которые известны специалистам в данной области техники.

"Животное" относится к человеку или животному, которое не является человеком, включая, но не ограничиваясь ими, мышей, крыс, кроликов, собак, кошек, свиней и приматов, включая, но не ограничиваясь ими, обезьян и шимпанзе.

"Антисмысловая активность" означает любую обнаруживаемую или поддающуюся измерению активность, обусловленную гибридизацией антисмыслового соединения с его нуклеиновой кислотой-мишенью. В неких вариантах реализации изобретения антисмысловая активность представляет собой уменьшение количества или экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени или белка, кодируемого такой нуклеиновой кислотой-мишенью.

"Антисмысловое соединение" означает олигомерное соединение, которые способно гибридизироваться с целевой нуклеиновой кислотой посредством водородной связи. Примеры антисмысловых соединений включают одноцепочечные и двухцепочечные соединения, такие как антисмысловые олигонуклеотиды, миРНК, кшРНК, оцРНКи и соединения на основе занятости.

"Антисмысловое ингибирование" означает снижение уровней нуклеиновой кислоты-мишени или уровней белка-мишени в присутствии антисмыслового соединения, комплементарного к нуклеиновой кислоте-мишени, по сравнению с уровнями нуклеиновой кислоты-мишени или уровнями белка-мишени в отсутствие антисмыслового соединения.

"Антисмысловой олигонуклеотид" означает одноцепочечный олигонуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновых оснований, которая позволяет гибридизацию с соответствующей областью или сегментом нуклеиновой кислоты-мишени. В данном контексте термин "антисмысловой олигонуклеотид" включает фармацевтически приемлемые производные соединений, описанных в данном документе.

"ApoCIII", "аполипопротеин С-III" или "АРОС3" означает любую нуклеиновую кислоту или последовательность белка, кодирующую ApoCIII. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения ApoCIII включает последовательность ДНК, кодирующую ApoCIII, последовательность РНК, транскрибированную из ДНК, кодирующей ApoCIII (включая геномную ДНК, содержащую интроны и экзоны), последовательность мРНК, кодирующую ApoCIII, или пептидную последовательность, кодирующую ApoCIII.

"Специфический ингибитор ApoCIII" относится к любому агенту, способному специфически ингибировать экспрессию мРНК ApoCIII и/или экспрессию, или активность белка ApoCIII на молекулярном уровне. Например, специфические ингибиторы ApoCIII включают нуклеиновые кислоты (включая антисмысловые соединения), пептиды, антитела, низкомолекулярные молекулы и другие агенты, способные ингибировать экспрессию мРНК ApoCIII и/или белка ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловое соединение. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение представляет собой олигонуклеотид, нацеленный на ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид, нацеленный на ApoCIII, представляет собой модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид, нацеленный на ApoCIII, имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3 или другую последовательность, например, такую, как описанная в патенте США 7598227, патенте США 7750141, публикации РСТ WO 2004/093783 или WO 2012/149495, все включенные в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации изобретения путем специфического модулирования уровня мРНК ApoCIII и/или экспрессии белка ApoCIII специфические ингибиторы ApoCIII могут влиять на компоненты липогенного пути. Аналогичным образом, в некоторых вариантах реализации изобретения специфические ингибиторы ApoCIII могут влиять на другие молекулярные процессы у животного.

"мРНК ApoCIII" означает мРНК, кодирующую белок ApoCIII.

"Белок ApoCIII" означает любую последовательность белка, кодирующую ApoCIII.

"Атеросклероз" означает отвердевание артерий, поражающее крупные и среднего размера артерии, и характеризуется присутсвием жировых отложений. Жировые отложения называются "атеромами" или "бляшками", которые состоят, в основном, из холестерина и других жиров, кальция и рубцовой ткани и повреждают выстилку артерий.

"Бициклический сахар" означает фурозильное кольцо, модифицированное образованием мостика между двух негеминальных атомов кольцевой формы. Бициклический сахар представляет собой модифицированный сахар.

"Бициклическая нуклеиновая кислота" или "БНК" относится к нуклеозиду или нуклеотиду, в котором фуранозная часть нуклеозида или нуклеотида включает мостик, соединяющий два атома углерода фуранозного кольца, с формированием, таким образом, бициклической системы колец.

"Кэп-структура" или "кэп-терминальный фрагмент" означает химические модификации, которые были сделаны на любом конце антисмыслового соединения.

"Сердечно-сосудистое заболевание" или "сердечно-сосудистое расстройство" означает группу патологических состояний, связанных с сердцем, кровеносными сосудами или кровообращением. Примеры сердечно-сосудистых заболеваний включают, не ограничиваются ими, аневризму, стенокардию, аритмию, атеросклероз, цереброваскулярное заболевание (инсульт), заболевание коронарных сосудов сердца, гипертензию, дислипидемию, гиперлипидемию, гипертриглицеридемию или гиперхолестеринемию.

"Химически отличная область" означает область антисмыслового соединения, которая некоторым образом химически отличается от другой области такого же антисмыслового соединения. Например, область, содержащая 2'-О-метоксиэтиловые нуклеотиды, химически отличается от области, содержащей нуклеотиды без 2'-O-метоксиэтиловых модификаций.

"Химерное антисмысловое соединение" означает антисмысловое соединение, которое содержит по меньшей мере две химически отличные области.

"Холестерин" представляет собой молекулу стерина, находящуюся в клеточных меабранах всех животных тканей. Холестерин должен транспортироваться в плазме крови животного липопротеинами, включая липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеины промежуточной плотности (ЛППП), липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и липопротеины высокой плотности (ЛПВП). "Холестерин плазмы" относится к сумме всех липопротеинов (ЛПОНП, ЛППП, ЛПНП, ЛПВП) эстерифицированного и/или неэстерифицированного холестерина, присутствующих в плазме или сыворотке.

"Ингибитор абсорбции холестерина" относится к агенту, который ингибирует абсорбцию экзогенного холестерина, поступающего из пищевых продуктов.

"Совместное введение" означает введение двух или более агентов индивидууму. Два или более агентов могут быть в одной фармацевтической композиции или могут быть в отдельных фармацевтических композициях. Каждый из двух или более агентов может быть введен одним и тем же или различными способами введения. Совместное введение включает параллельное или последовательное введение.

"Комплементарность" означает способность к спариванию нуклеиновых оснований первой нуклеиновой кислоты и второй нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения комплементарность между первой и второй нуклеиновой кислотой может быть между двумя цепями ДНК, между двумя цепями РНК или между цепями ДНК и РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения некоторые нуклеиновые основания на одной цепи соответствуют комплементарному основанию, образующему водородную связь, на другой цепи. В некоторых вариантах реализации изобретения все нуклеиновые основания на одной цепи соответствуют комплементарному основанию, образующему водородную связь, на другой цепи. В некоторых вариантах реализации изобретения первая нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловое соединение, и вторая нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту-мишень. В некоторых из таких вариантов реализации изобретения антисмысловой олигонуклеотид представляет собой первую нуклеиновую кислоту, и нуклеиновая кислота-мишень представляет собой вторую нуклеиновую кислоту.

"Смежные нуклеиновые основания" означают нуклеиновые основания, непосредственно примыкающие друг по отношению к другу.

"Ограниченный этил" или "cEt" означает бициклический нуклеозид, содержащий фуранозильный сахар, который содержит метил(метиленокси) (4'-СН(СН₃)-O-2') мостик между углеродными атомами 4' и 2'.

"Перекрестно-реагирующий" означает олигомерное соединение, нацеленное на одну последовательность нуклеиновой кислоты, которое может гибридизироваться с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, в некоторых случаях антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на ApoCIII человека, может перекрестно реагировать с ApoCIII мыши. Будет ли олигомерное соединение перекрестно реагировать с другой последовательностью нуклеиновой кислоты, кроме его предусмотренной мишени, зависит от степени комплементарности соединения с нецелевой последовательностью нуклеиновой кислоты. Чем выше степень комплементарности между олигомерным соединением и нецелевой нуклеиновой кислотой, тем вероятнее олигомерное соединение будет перекрестно реагировать с нуклеиновой кислотой.

"Лечение" означает способ, который восстанавливает здоровье, или назначенное лечение заболевания.

"Ишемическая болезнь сердца (ИБС)" означает сужение мелких кровеносных сосудов, которые поставляют кровь и кислород к сердцу, что часто является результатом атеросклероза.

"Дезоксирибонуклеотид" означает нуклеотид, содержащий водород в 2' положении сахарной части нуклеотида. Дезоксирибонуклеотиды могут быть модифицированы с помощью любого из множества заместителей.

"Сахарный диабет" или "диабет" представляет собой синдром, характеризующийся нарушенным метаболизмом и аномально высоким уровнем сахара в крови (гипергликемия), что является результатом недостаточных уровней инсулина или сниженной чувствительности к инсулину. Характерные симптомы включают чрезмерную выработку мочи (полиурия) за счет высоких уровней глюкозы в крови, чрезмерную жажду и повышенное потребление жидкости (полидипсия) для компенсации увеличенного мочеиспускания, затуманивание зрения в результате воздействия высокого уровня глюкозы в крови на оптические структуры глаза, необъяснимую потерю массы и летаргию.

"Диабетическая дислипидемия" или "диабет 2 типа с дислипидемией" означает состояние, характеризующееся диабетом 2 типа, снижением уровней ЛПВП-Х, повышением уровней триглицеридов и повышением содержания плотных частиц ЛПНП маленького размера.

"Разбавитель" означает ингредиент в композиции, который не обладает фармакологической активностью, но необходим или желателен с фармацевтической точки зрения. Например, разбавитель в инъекционной композиции может быть жидкостью, например, солевым раствором.

"Дислипидемия" означает расстройство метаболизма липидов и/или липопротеинов, включая, чрезмерную выработку или дефицит липидов и/или липопротеинов. Дислипидемия может проявляться повышением уровня липидов, таких как хиломикрон, холестерин и триглицериды, а также липопротеинов, таких как холестерин липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). Примером дислипидемии является хиломикронемия или гипертриглицеридемия.

"Единица лекарственной формы" означает форму, в которой предоставлен фармацевтический агент, например, пилюля, таблетка или другая единица лекарственной формы, известная в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения единица лекарственной формы представляет собой флакон, содержащий лиофилизированный антисмысловой олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации изобретения единица лекарственной формы представляет собой флакон, содержащий ресуспендированный антисмысловой олигонуклеотид.

"Доза" означает количество указанного фармацевтического агента, предоставляемое при одном введении или в определенный период времени. В некоторых вариантах реализации изобретения доза может быть введена в виде одного, двух или более болюсов, таблеток или инъекций. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения, если необходимо подкожное введение, нужная доза требует объема, который сложно адаптировать к одной инъекции, поэтому две или более инъекций могут использоваться для доставки желаемой дозы. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтический агент вводят путем инфузии в течение длительного периода времени или непрерывно. Дозы могут быть указаны как количество фармацевтического агента в час, день, неделю, или месяц. Дозы также могут быть указаны как мг/кг или г/кг.

"Эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" означает количество активного фармацевтического агента, достаточное для достижения желаемого физиологического результата у индивидуума, нуждающегося в таком агенте. Эффективное количество может варьировать от одного индивидуума к другому, в зависимости от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, который подлежит лечению, таксономической группы индивидуумов, которые подлежат лечению, состава композиции, оценки медицинского состояния индивидуума и других соответствующих факторов.

"Фибраты" являютс агонистами рецептора, активируемого пролифератором пероксисом-α (PPAR-α), действуя через факторы транскрипции, регулирующие различные стадии в метаболизме липидов и липопротеинов. Взаимодействуя с PPAR-α, фибраты рекрутируют различные кофакторы и регулируют генную экспрессию. Как следствие, фибраты эффективны в снижении тощаковых ТГ, а также постпрандиальных остаточных частиц ТГ и ТБЛП. Фибраты также обладают эффектами умеренного снижения ХС-ЛПНП и повышения ХС-ЛПВП. Снижение экспрессии и уровней АроС-III является последовательным эффектом агонистических PPAR-α (Hertz et al. J Biol Chem, 1995, 270(22): 13470-13475). Сообщалось о снижении уровня АроС-III в плазме на 36% при лечении фенофибратом при метаболическом синдроме (Watts et al. Diabetes, 2003, 52:803-811).

"Полностью комплементарный" или "100% комплементарность" означает, что каждому нуклеиновому основанию в последовательности нуклеиновых оснований первой нуклеиновой кислоты соответствует комплементарное нуклеиновое основание во второй последовательности нуклеиновых оснований второй нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения первая нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловое соединение, и вторая нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту-мишень.

"Гэпмер" означает химерное антисмысловое соединение, в котором внутренняя область, имеющая множество нуклеозидов, которые поддерживают расщепление РНКазой Н, располагается между внешними областями, имеющими один или более нуклеозидов, причем нуклеозиды, составляющие внутренние области, химически отличаются от нуклеозида или нуклеозидов, составляющих внешние области. Внутренняя область может быть описана как "гэп" или "сегмент гэпа", а внешние области могут быть описаны как "крылья" или "сегменты крыла".

"Генетический скрининг" означает скрининг генотипического разнообразия или мутаций у животного. В некоторых случаях мутация может приводить к фенотипическому изменению у животного. В некоторых случаях фенотипическое изменение является или приводит к заболеванию, расстройству или патологическому состоянию у животного. Например, мутации в LMNA, PPARγ, PLIN1, АКТ2, CIDEC и других генах могут привести к липодистрофии. Генетический скрининг может быть осуществлен с использованием любого из известных методов, например, секвенирования гена или мРНК LMNA, PPARγ, PLIN1, АКТ2, CIDEC для обнаружения мутаций. Последовательность животного, подвергаемого скринингу, сравнивается с последовательностью нормального животного для определения наличия какой-либо мутации в последовательности. В альтернативном варианте, например, идентификацию мутаций в гене или мРНК LMNA, PPARγ, PLIN1, АКТ2, CIDEC можно выполнить, используя ПЦР амплификацию и гель или чип-анализ.

"Глюкоза" представляет собой моносахарид, используемый клетками в качестве источника энергии и воспалительного промежуточного соединения. "Глюкоза плазмы" означает наличие глюкозы в плазме.

"Липопротеин высокой плотности" или "ЛПВП" означает макромолекулярный комплекс липидов (холестерин, триглицериды и фосфолипиды) и белки (аполипопротеины (апо) и ферменты). Поверхность ЛПВП содержит главным образом аполипопротеины А, С и Е. Функция некоторых из этих апопротеинов заключается в том, чтобы направлять ЛПВП из периферических тканей в печень. Уровни ЛПВП в сыворотке могут быть обусловлены генетическими причинами (Weissglas-Volkov and Pajukanta, J Lipid Res, 2010, 51:2032-2057). Эпидемиологические исследования показали, что повышенные уровени ЛПВП защищают от сердечно-сосудистых заболеваний или ишемической болезни сердца (Gordon et al., Am. J. Med. 1977. 62:707-714). Эти эффекты ЛПВП не зависят от концентрации триглицеридов и ЛПНП. В клинической практике низкие уровни ЛПВП в плазме чаще связаны с другими расстройствами, которые увеличивают содержание триглицеридов в плазме, например, центральное ожирение, инсулинорезистентность, сахарный диабет 2 типа и заболевание почек (хроническая почечная недостаточность или нефротическая протеинурия) (Kashyap.Am. J. Cardiol. 1998. 82:42U-48U).

"Липопротеин высокой плотности-холестерин" или "ЛПВП-Х" означает холестерин, связанный с частицами липопротеина высокой плотности. Концентрация ЛПВП-Х в сыворотке (или плазме), как правило, определяется в мг/дл или нмоль/л. "ЛПВП-Х" и "ЛПВП-Х в плазме" означают ЛПВП-Х в сыворотке и плазме, соответственно.

"Ингибитор ГМГ-КоА редуктазы" означает средство, которое действует посредством ингибирования фермента ГМГ-КоА редуктазы, такое как аторвастатин, розувастатин, флувастатин, ловастатин, правастатин и симвастатин.

"Гибридизация" означает отжиг комплементарных молекул нуклеиновых кислот.В некоторых вариантах реализации изобретения комплементарные молекулы нуклеиновых кислот включают антисмысловое соединение и нуклеиновую кислоту-мишень.

"Гиперхолестеринемия" означает состояние, характеризующееся повышенным уровнем холестерина или циркулирующего (в плазме) холестерина, ЛПНП-холестерина и ЛПОНП-холестерина, в соответствии с директивами отчета экспертной комиссии Национальной программы по холестерину (NCEP) по обнаружению, оценке и лечению высокого содержания холестерина у взрослых (см. Arch. Int. Med. (1988) 148, 36-39).

"Гиперлипидемия" или "гиперлипемия" представляет собой патологическое состояние, характеризующееся повышенными уровнями липидов в сыворотке или циркулирующих (в плазме) липидов. Такое состояние проявляется аномально высокой концентрацией жиров. Липидные фракции в кровотоке представляют собой холестерин, липопротеины низкой плотности, липопротеины очень низкой плотности, хиломикроны и триглицериды.

"Гипертриглицеридемия" означает патологическое состояние, характеризующееся повышенными уровнями триглицеридов. Гипертриглицеридемия является последствием повышенной выработки и/или сниженного или замедленного катаболизма богатых триглицеридами липопротеинов (ТГ): ЛПОНП и, в меньшей степени, хиломикрон (ХМ). Ее этиология включает первичные (т.е., генетические причины) и вторичные факторы (другие базовые причины, такие как диабет, метаболический синдром/инсулинорезистентность, ожирение, низкий уровень физической активности, курение сигарет, избыточное потребление спиртного и рацион с высоким содержанием углеводов) или, чаще всего, комбинацию обоих (Yuan et al., CMAJ, 2007, 176:1113-1120). Гипертриглицеридемия является общим клиническим признаком, связанным с липодистрофией. Погранично высокие уровни ТГ (150-199 мг/дл) широко распространены в общей популяции и представляют собой общий компонент состояний метаболического синдрома/инсулинорезистентности. Это же справедливо для высоких уровней ТГ (200-499 мг/дл), за исключением того, что по мере повышения уровней ТГ в плазме, базовые генетические факторы играют все более и более важную этиологическую роль. Самые высокие уровни ТГ (≥500 мг/дл) чаще всего связаны также с повышенными уровнями ХМ и сопровождаются повышенным риском острого панкреатита. Риск панкреатита рассматривается как клинически значимый, если уровень ТГ превышает 880 мг/дл (>10 ммоль), и Европейское сообщество атеросклероза/Европейское сообщество кардиологии (EAS/ESC) в директивах 2011 г. заявляет, что обязательными являются действия по предупреждению острого панкреатита (Catapanoet al. 2011, Atherosclerosis, 217S:S1-S44). Согласно директивам EAS/ESC 2011, гипертриглицеридемия является причиной приблизительно 10% всех случаев панкреатита, и развитие панкреатита может происходить при уровнях ТГ 440-880 мг/дл. На основе полученных в ходе клинических исследований доказательств, которые демонстрируют, что повышенные уровни ТГ являются независимым фактором риска для атеросклеротического ЗКС, директивы панели III Национальной образовательной программы по холестерину для взрослых (NCEP 2002, Circulation, 106:3143-421) и Американской диабетической ассоциации (ADA 2008, Diabetes Care, 31:S12-S54) рекомендуют целевой уровень ТГ менее 150 мг/дл, чтобы снизить риск сердечно-сосудистых заболеваний.

"Идентификация" или "диагностирование" животного с упомянутым заболеванием, расстройством или патологическим состоянием означает идентификацию с помощью известных в данной области техники способов субъекта, предрасположенного или страдающего упомянутым заболеванием, расстройством или патологическим состоянием.

"Идентификация" или "диагностирование" животного с липодистрофией (общей или частичной) означает идентификацию субъекта, предрасположенного или страдающего липодистрофией. Идентификация субъектов с липодистрофией может быть выполнена путем изучения анамнеза заболевания субъекта в сочетании с любым известным в данной области техники методом скрининга, например, генетическим скринингом. Например, пациент с документально подтвержденным анамнезом тощакового уровня ТГ выше 500 мг/дл затем подвергается скринингу на мутации в генах, связанных с липодистрофией, таких как LMNA, PPARγ, PLIN1, АКТ2, CIDEC и т.п.

"Идентификация" или "диагностирование" животного с метаболическим или сердечно-сосудистым заболеванием означает идентификацию субъекта, предрасположенного или страдающего метаболическим заболеванием, сердечно-сосудистым заболеванием или метаболическим синдромом; или идентификацию субъекта, у которого присутствует любой из симптомов метаболического заболевания, сердечно-сосудистого заболевания или метаболического синдрома, включая, но не ограничиваясь ими, гиперхолестеринемия, гипергликемия, гиперлипидемию, гипертриглицеридемию, гипертензию, повышенную инсулинорезистентность, сниженную чувствительность к действию инсулина, массу тела выше нормы и/или содержание жира в организме выше нормы или любую их комбинацию. Такая идентификация может быть проведена любым способом, включая, но не ограничиваясь ими, стандартные клинические исследования или испытания, такие как измерение холестерина в сыворотке или циркулирующего холестерина (в плазме), измерение глюкозы в сыворотке или в кровотоке (в плазме), измерение триглицеридов в сыворотке или циркулирующих триглицеридов (в плазме), измерение кровяного давления, измерение содержания телесного жира, измерение массы тела и т.п.

"Улучшенный исход сердечно-сосудистого заболевания" означает уменьшение частоты сердечно-сосудистых явлений или снижение их риска. Примеры неблагоприятных сердечно-сосудистых явлений включают, но не ограничиваются ими, смерть, повторный инфаркт, инсульт, кардиогенный шок, отек легких, остановку сердца и атриальную дизритмию.

"Непосредственно смежный" означает отсутствие промежуточных элементов между непосредственно смежными элементами, например, между областями, сегментами, нуклеотидами и/или нуклеозидами.

"Повышение уровня ЛПВП" или "увеличение концентрации ЛПВП" означает повышение уровня ЛПВП у животного после введения по меньшей мере одного соединения по изобретению, по сравнению с уровнем ЛПВП у животного, не получавшего соединения.

"Индивидуум" или "субъект", или "животное" означает человека или животного, не являющегося человеком, выбранного для лечения или терапии.

"Индуцировать", "ингибировать", "потенцировать", "повышать", "увеличивать", "уменьшать", "снижать" или подобные термины означают количественные отличия между двумя состояниями. Например, "количество, эффективное для ингибирования активности или экспрессии ApoCIII" означает, что уровень активности или экспрессия ApoCIII в обработанном образце будет отличаться от уровня активности или экспрессии ApoCIII в необработанном образце. Такие термины применяются, например, к уровням экспрессии и уровням активности.

"Ингибирование экспрессии или активности" означает уменьшение или блокаду экспрессии, или активности РНК или белка и необязательно указывает на полное отсутствие экспрессии или активности.

"Резистентность к инсулину" определяется как состояние, при котором нормальные количества инсулина недостаточны для получения нормальной реакции на инсулин жировых клеток, клеток мышц и печени. "Резистентность к инсулину" в жировых клетках приводит к гидролизу запасенных триглицеридов, что увеличивает содержание свободных жирных кислот в плазме крови. Резистентность к инсулину в мышцах снижает поглощение глюкозы, тогда как резистентность к инсулину в печени снижает запасы глюкозы, и оба эффекта приводят к повышению глюкозы в крови. Высокие уровни инсулина и глюкозы в плазме, обусловленные резистентностью к инсулину, зачастую приводят к метаболическому синдрому и диабету 2 типа.

"Чувствительность к действию инсулина" является мерой того, насколько эффективно индивидуум утилизирует глюкозу. Индивидуум с высокой чувствительностью к инсулину эффективно утилизирует глюкозу, тогда как индивидуум с низкой чувствительностью к инсулину неэффективно утилизирует глюкозу.

"Межнуклеозидная связь" означает химическую связь между нуклеозидами.

"Внутривенное введение" означает введение в вену.

"Связанные нуклеозиды" означают смежные нуклеозиды, которые связаны между собой.

"Снижающий уровень липидов" означает уменьшение уровня одного или более липидов в организме субъекта. "Повышающий уровень липидов" означает повышение уровня липидов (например, ЛПВП) в организме субъекта. Снижение уровня липидов или повышение уровня липидов может происходить при введении одной или более доз в динамике.

"Терапия для снижения уровня липидов" или "агент для снижения уровня липидов" означает схему лечения, проводимого субъекту для снижения уровня одного или более липидов у субъекта. В некоторых вариантах реализации изобретения терапия для снижения уровня липидов проводят с целью снижения уровня одного или более из ТБХЭ, АроВ, общего холестерина, ХС-ЛПНП, ХС-ЛПОНП, ХС-ЛППП, ХС-не-ЛПВП, триглицеридов, плотных частиц ЛПНП небольшого размера и Lp(a) у субъекта. Примеры лекарственного средства для снижения уровня липидов включают статины, фибраты, ингибиторы МТР.

"Липопротеин", такой как ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВП, относится к группу белков, находящихся в сыворотке, плазме и лимфе, и которые важны для транспорта липидов. Химический состав каждого липопротеина отличается в том отношении, что ЛПВП имеет более высокое содержание белка относительно липида, тогда как ЛПОНП имеет более низкое содержание белка относительно липида.

"Липопротеин низкой плотности-холестерин (ХС-ЛПНП)" означает холестерин, переносимый частицами липопротеина низкой плотности. Концентрация ХС-ЛПНП в сыворотке (или плазме), как правило, определяется в мг/дл или нмоль/л. "ХС-ЛПНП сыворотки" и "ХС-ЛПНП плазмы" означает ХС-ЛПНП в сыворотке и плазме, соответственно.

"Основные факторы риска" относятся к факторам, которые способствуют высокому уровню риска конкретного заболевания или патологического состояния. В некоторых вариантах реализации изобретения основные факторы риска заболевания коронарных сосудов сердца включают, но не ограничиваются ими, курение сигарет, гипертензию, низкий уровень Х-ЛПВП, семейный анамнез заболевания коронарных сосудов сердца, возраст и другие факторы, раскрытые в данном описании.

"Метаболическое расстройство" или "метаболическое заболевание" означает патологическое состояние, характеризующееся изменением или расстройством метаболической функции. "Метаболический" и "метаболизм" представляют собой термины, хорошо известные в данной области техники, и включают, в целом, весь диапазон биохимических процессов, протекающих в живом организме. Метаболические расстройства включают, но не ограничиваются ими, гипергликемию, преддиабетическое состояние, диабет (типа 1 и типа 2), ожирение, инсулинорезистентность, метаболический синдром и дислипидемию вследствие диабета 2 типа.

"Метаболический синдром" означает патологическое состояние, характеризующееся набором липидных и нелипидных факторов риска сердечнососудистого заболевания метаболического происхождения. В некоторых вариантах реализации изобретения метаболический синдром идентифицируют по наличию любого из 3-х следующих факторов: объем талии более 102 см у мужчин или более 88 см у женщин; уровень триглицеридов сыворотки по меньшей мере 150 мг/дл; уровень ХС-ЛПВП менее 40 мг/дл у мужчин или менее 50 мг/дл у женщин; артериальное давление по меньшей мере 130/85 мм рт.ст.; и уровень глюкозы в крови натощак по меньшей мере 110 мг/дл. Эти показатели могут быть легко измерены в клинической практике (JAMA, 2001, 285:2486-2497).

"Несоответствие" или "некомплементарное нуклеиновое основание" относится к случаю, когда нуклеиновое основание первой нуклеиновой кислоты не способно связываться с соответствующим нуклеиновым основанием второй или нуклеиновой кислоты-мишени.

"Смешанная дислипидемия" означает состояние, характеризующееся повышенным уровнем холестерина и повышенным уровнем триглицеридов.

"Модифицированная межнуклеозидная связь" означает замену или любое изменение межнуклеозидной связи естественного происхождения. Например, фосфоротиоатная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь.

"Модифицированное нуклеиновое основание" означает любое нуклеиновое основание, кроме аденина, цитозина, гуанина, тимидина или урацила. Например, 5-метилцитозин представляет собой модифицированное нуклеиновое основание. "Немодифицированное нуклеиновое основание" означает пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U).

"Модифицированный нуклеозид" означает нуклеозид, содержащий по меньшей мере один модифицированный сахарный фрагмент и/или модифицированное нуклеиновое основание.

"Модифицированный нуклеотид" означает нуклеотид, содержащий по меньшей мере один модифицированный сахарный фрагмент, модифицированную межнуклеозидную связь и/или модифицированное нуклеиновое основание.

"Модифицированный олигонуклеотид" означает олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере один модифицированный нуклеотид.

"Модифицированный сахар" означает замещение или модификацию природного сахара. Например, 2'-O-метоксиэтил-модифицированный сахар представляет собой модифицированный сахар.

"Мотив" означает образец химически отличных областей в антисмысловом соединении.

"Межнуклеозидная связь естественного происхождения" означает 3'-5' фосфодиэфирную связь.

"Природный сахарный фрагмент" означает сахар, находящийся в ДНК (2'-Н) или РНК (2'-ОН).

Сообщалось, что "никотиновая кислота" или "ниацин" уменьшают приток жирных кислот в печень и секрецию ЛПОНП печенью. По-видимому, данный эффект частично опосредован воздействиями на гормон-чувствительную липазу в жировой ткани. Никотиновая кислота имеет ключевые сайты активности как в печени, так и в жировой ткани. Сообщается, что в печени никотиновая кислота ингибирует диацилглицерол-ацилтрансферазу-2 (ДГАТ-2), что приводит к уменьшению секреции частиц ЛПОНП из печени, что также отражается на уменьшении секреции как частиц ЛППП, так и частиц ЛПНП, кроме того, никотиновая кислота повышает ХС-ЛПВП и apoAl, главным образом, стимулируя продукцию apoAl в печени и снижает концентрации ЛПОНП-ApoCIII у пациентов с гиперлипидемией (Wahlberg et al. Acta Med Scand 1988; 224:319-327). Эффекты никотиновой кислоты на липолиз и мобилизацию жирных кислот в адипоцитах хорошо известны.

"Нуклеиновая кислота" означает молекулы, состоящие из мономерных нуклеотидов. Нуклеиновая кислота включает рибонуклеиновые кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), одноцепочечные нуклеиновые кислоты (опДНК), двухцепочечные нуклеиновые кислоты (дцДНК), малые интерферирующие рибонуклеиновые кислоты (миРНК) и микроРНК (микроРНК). Нуклеиновая кислота также может содержать комбинацию этих элементов в одной молекуле.

"Нуклеиновое основание" означает гетероциклический фрагмент, способный спариваться с основанием другой нуклеиновой кислоты.

"Комплементарность нуклеиновых оснований" означает нуклеиновое основание, способное спариваться с другим нуклеиновым основанием. Например, в ДНК аденин (А) комплементарен тимину (Т). Например, в РНК аденин (А) комплементарен урацилу (U). В некоторых вариантах реализации изобретения комплементарное нуклеиновое основание означает нуклеиновое основание антисмыслового соединения, способное спариваться с нуклеиновым основанием его нуклеиновой кислоты-мишени. Например, если нуклеиновое основание в определенном положении антисмыслового соединения способно образовывать водородную связь с нуклеиновым основанием в определенном положении нуклеиновой кислоты-мишени, то олигонуклеотид и нуклеиновая кислота-мишень рассматриваются как комплементарные по указанной паре нуклеиновых оснований.

"Последовательность нуклеиновых оснований" означает порядок смежных нуклеиновых оснований, независимо от любой модификации сахара, связи или нуклеинового основания.

"Нуклеозид" означает нуклеиновое основание, связанное с сахаром.

"Миметический нуклеозид" включает структуры, используемые для замены сахара или сахара и основания, и, необязательно, связи, в одном или более положениях олигомерного соединения; например, миметический нуклеозид, содержащий морфолино, циклогексенил, циклогексил, тетрагидропиранил, бицикло или трицикло миметические сахара, такие как нефуранозные сахарные единицы.

"Нуклеотид" означает нуклеозид, содержащий фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида.

"Миметический нуклеотид" включает структуры, используемые для замены нуклеозида и связи в одном или более положениях олигомерного соединения, например, такие как пептиднуклеиновые кислоты или морфолиновые группы (морфолиновые группы, присоединенные посредством -N(H)-C(=O)-O- или другой нефосфодиэфирной связи).

"Олигомерное соединение" или "олигомер" означает полимер из связанных мономерных субъединиц, которые способны гибридизироваться с областью молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения олигомерные соединения представляют собой олигонуклеозиды. В некоторых вариантах реализации изобретения олигомерные соединения представляют собой олигонуклеотиды. В некоторых вариантах реализации изобретения олигомерные соединения представляют собой антисмысловые соединения. В некоторых вариантах реализации изобретения олигомерные соединения представляют собой антисмысловые олигонуклеотиды. В некоторых вариантах реализации изобретения олигомерные соединения представляют собой химерные олигонуклеотиды.

"Олигонуклеотид" означает полимер из связанных нуклеозидов, каждый из которых может быть модифицированным или немодифицированным, независимо друг от друга.

"Парентеральное введение" означает введение посредством инъекции или инфузии. Парентеральное введение включает подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутриартериальное введение, внутрибрюшинное введение или интракраниальное введение, например, интратекальное или интрицеребровентрикулярное введение. Введение может быть непрерывным, постоянным, кратковременным или прерывистым.

"Пептид" означает молекулу, образованную соединением по меньшей мере двух аминокислот амидной связи. Пептид означает полипептиды и белки.

"Фармацевтический агент" означает субстанцию, которая обеспечивает терапевтический эффект при введении индивидууму. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на ApoCIII, представляет собой фармацевтический агент.

"Фармацевтическая композиция" или "композиция" означает смесь субстанций, пригодных для введения индивидууму. Например, фармацевтическая композиция может содержать один или более активных ингредиентов и фармацевтический носитель, такой как стерильный водный раствор.

"Фармацевтически приемлемый носитель" означает среду или разбавитель, который не влияет отрицательно на структуру соединения. Некоторые из таких носителей дают возможность фармацевтическим композициям принимать форму, например, таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, жидких или густых суспензий и пастилок для приема субъектом. Некоторые из таких носителей дают возможность фармацевтическим композициям принимать форму для инъекций, инфузии или местного нанесения. Например, фармацевтически приемлемый носитель может быть стерильным водным раствором.

"Фармацевтически приемлемое производное" или "соли" включают производные соединений, описанных в данном документе, такие как сольваты, гидраты, эфиры, пролекарства, полиморфы, изомеры, меченные изотопами варианты, фармацевтически приемлемые соли и другие производные, известные в данной области техники.

"Фармацевтически приемлемые соли" означают физиологически и фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, т.е., соли, которые сохраняют желаемую биологическую активность материнского соединения и не оказывают дополнительно нежелательного токсичного воздействия. Термин "фармацевтически приемлемая соль" или "соль" включает соль, полученную с фармацевтически приемлемыми нетоксичными кислотами или основаниями, в том числе неорганическими или органическими кислотами и основаниями. "Фармацевтически приемлемые соли" соединений, описанных в данном документе, могут быть получены способами, хорошо известными в данной области техники. Обзор фармацевтически приемлемых солей см. в Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties, Selection and Use (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002). Натриевые соли антисмысловых олигонуклеотидов пригодны и хорошо известны для терапевтического введения человеку. Соответственно, в одном варианте реализации изобретения соединения, описанные в данном описании, находятся в форме натриевой соли.

"Фосфоротиоатная связь" означает связь между нуклеозидами, в которой фосфодиэфирная связь модифицирована путем замены одного из не образующих мостик атомов кислорода на атом серы. Фосфоротиоатная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь.

"Часть" означает некоторое количество смежных (т.е. связанных) нуклеиновых оснований нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения часть представляет собой некоторое количество смежных нуклеиновых оснований нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах часть представляет собой некоторое количество смежных нуклеиновых оснований антисмыслового соединения.

"Предупреждать" означает замедлять или предупреждать манифестацию или развитие заболевания, расстройства или патологического состояния в течение периода времени от нескольких минут до неопределенного срока. Предупреждение также означает также снижение риска развития заболевания, расстройства или патологического состояния.

"Пролекарство" означает лекарственное средство, которое получено в неактивной форме, и которое превращается в активную форму (т.е. лекарство) в организме или его клетках под действием эндогенных ферментов или других химических веществ, или условий.

"Повышение" означает увеличение количества. Например, повышение уровней ЛПВП в плазме означает увеличение количества ЛПВП в плазме.

"Соотношение ТГ к ЛПВП" означает уровни ТГ относительно уровней ЛПВП. Распространенность высоких уровней ТГ и/или низких уровней ЛПВП связывают с распространенностью сердечно-сосудистых заболеваний, исходов и смертности. "Улучшение соотношения ТГ к ЛПВП" означает снижение уровней ТГ и/или повышение уровней ЛПВП.

"Снижение" означает уменьшение до меньшей степени, размера, количества или числа. Например, снижение уровней триглицеридов в плазме означает уменьшение количества триглицеридов в плазме.

"Область" или "область-мишень (целевая область)" определяется как часть нуклеиновой кислоты-мишени, содержащая по меньшей мере одну поддающуюся идентификации структуру, функцию или характеристику. Например, целевая область может содержать 3' нетранслируемую область, 5' нетранслируемую область, экзон, интрон, соединение экзон/интрон, кодирующую область, область инициации трансляции, область окончания трансляции или другую определенную область нуклеиновой кислоты. Структурно определенные области для ApoCIII могут быть получены по номеру доступа из баз данных последовательностей, таких как NCBI, и такая информация включена в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации изобретения целевая область может содержать последовательность от 5' сайта мишени одного сегмента-мишени в пределах области-мишени до 3' сайта мишени другого сегмента-мишени в пределах области-мишени.

"Рибонуклеотид" означает нуклеотид, содержащий гидроксигруппу в положении 2' сахарной части нуклеотида. Рибонуклеотиды могут быть модифицированы любым из различных заместителей.

"Второй агент (средство)" или "второй терапевтический агент (лекарственное средство) "означает средство, которое может применяться в комбинации с "первым агентом (средством)". Второй терапевтический агент может включать, но не ограничиваясь ими, миРНК или антисмысловой олигонуклеотид, включая антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на ApoCIII. Второй агент может также включать антитела к ApoCIII, ингибиторы пептида ApoCIII, ингибиторы ДГАТ1, средства для снижения уровня холестерина, средства для снижения уровня липидов, средства для снижения уровня глюкозы и противовоспалительные средства.

"Сегменты" определяют как меньшие субфрагменты областей в составе нуклеиновой кислоты. Например, "сегмент-мишень" означает последовательность нуклеотидов нуклеиновой кислоты-мишени, на которую нацелено одно или более антисмысловых соединений. "5' сайт-мишень" относится к крайнему 5' нуклеотиду сегмента-мишени. "3' сайт-мишень" относится к крайнему 3' нуклеотиду сегмента-мишени.

"Сокращенные" или "укороченные" версии антисмысловых олигонуклеотидов или нуклеиновых кислот-мишеней, описанных в данном документе, включают делецию одного, двух или более нуклеозидов.

"Побочные эффекты" означают физиологические реакции, связанные с лечением, кроме желаемых эффектов. В некоторых вариантах реализации изобретения побочные эффекты включают реакции в месте инъекции, аномалии функциональных проб печени, отклонения в функциях почек, гепатотоксичность, нефротоксичность, аномалии центральной нервной системы, миопатии и недомогание. Например, повышенные уровни аминотрансферазы в сыворотке могут указывать на гепатотоксичность или нарушение функции печени. Например, повышенный билирубин может указывать на гепатотоксичность или нарушение функции печени.

"Одноцепочечный олигонуклеотид" означает олигонуклеотид, который не гибридизуется с комплементарной цепью.

"Специфично гибридизующийся" относится к антисмысловому соединению, обладающему достаточной степенью комплементарности к нуклеиновой кислоте-мишени, чтобы оказывать желательное эффект, при демонстрации минимального или отсутствии воздействия на нецелевые нуклеиновые кислоты, в условиях, в которых желательно специфичное связывание, т.е., в физиологических условиях в случае анализов in vivo и терапевтического применения.

"Статин" означает агент, который ингибирует активность ГМГ-КоА редуктазы. Статины снижают синтез холестерина в печени путем конкурентного ингибирования активности ГМГ-КоА редуктазы. Снижение концентрации внутриклеточного холестерина вызывает экспрессию рецептора ЛПНП на поверхности клеток гепатоцитов, что приводит к увеличению экстракции ХС-ЛПНП из крови и снижению концентрации циркулирующего ХС-ЛПНП и других липопротеинов, содержащих аро-В, включая частицы, богатые на ТГ. Независимо от их влияния на рецепторы ХС-ЛПНП и ЛПНП статины снижают концентрацию в плазме и клеточные уровни мРНК АроС-III (Ooi et al. Clinical Sci, 2008, 114:611-624). Поскольку статины оказывают значительное влияние на смертность, а также на большинство параметров исхода сердечно-сосудистых заболеваний, эти препараты являются препаратами первого выбора для снижения как общего риска сердечнососудистых заболеваний, так и умеренно повышенных уровней ТГ. Более мощные статины (аторвастатин, розувастатин и питавастатин) демонстрируют достоверное снижение уровней ТГ, особенно в высоких дозах и у пациентов с повышенным уровнем ТГ.

"Подкожное введение" означает введение непосредственно под кожу.

"Субъект" означает человека или животного, не являющегося человеком, выбранного для лечения или терапии.

"Симптом сердечно-сосудистого заболевания или расстройства" означает феномен, который возникает в результате и сопровождает сердечно-сосудистое заболевание или расстройство, а также служит указанием на него. Например, стенокардия; боль в груди; одышка; сердцебиение; слабость; головокружение; тошнота; повышение потоотделение; тахикардия; брадикардия; аритмия; мерцание предсердий; отек нижних конечностей; цианоз; усталость; слабость; онемение лица; онемение конечностей; хромота или мышечные спазмы; вздутие живота; или лихорадка являются симптомами сердечно-сосудистого заболевания или расстройства.

"Нацеливание" или "нацеленный" означает процесс конструирования и выбора антисмыслового соединения, которое будет специфически гибридизироватся с целевой нуклеиновой кислотой и вызывать желательный эффект.

"Нуклеиновая кислота-мишень (целевая нуклеиновая кислота)", "РНК-мишень (целевая РНК)" и "транскрипт РНК-мишень (целевой транскрипт РНК)" все означают нуклеиновую кислоту, на которую могут быть нацелены антисмысловые соединения.

"Терапевтическое изменение образа жизни" означает модификацию рациона и образа жизни, цель которой состоит в снижении содержания жира/массы жировой ткани и/или уровня холестерина. Такое изменение может снижать риск развития заболевания сердца, и может включать рекомендации по диетическому потреблению общего суточного количества калорий, общего жира, насыщенных жиров, полиненасыщенных жиров, ненасыщенных жиров, углеводов, белков, холестерина, нерастворимых волокон, а также рекомендации по физической активности.

"Лечить" относится к введению соединения по изобретению с целью изменения или улучшения протекания заболевания, расстройства или патологического состояния.

"Триглицерид" или "ТГ" означает липид или нейтральный жир, состоящий из глицерина, соединенного с тремя молекулами жирных кислот.

"Диабет 2 типа" (также известный как "сахарный диабет 2 типа", "сахарный диабет, тип 2", "инсулиннезависимый диабет (ИНЗСД)", "связанный с ожирением диабет" или "диабет зрелого возраста") представляет собой метаболическое расстройство, которое, прежде всего, характеризуется инсулинорезистентностью, относительным дефицитом инсулина и гипергликемией.

"Немодифицированный нуклеотид" означает нуклеотид, состоящий из нуклеиновых оснований естественного происхождения, сахарных фрагментов и межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах немодифицированный нуклеотид представляет собой РНК нуклеотид (т.е. β-D-рибонуклеозиды) или ДНК нуклеотид (т.е. β-D-дезоксирибонуклеозид).

"Сегмент крыла" означает один или несколько нуклеозидов, модифицированных таким образом, чтобы придать олигонуклеотиду такие свойства, как повышенная ингибирующая активность, повышенная аффинность связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью или устойчивость к разложению нуклеазами in vivo.

Некоторые варианты реализации изобретения

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ снижения уровней ApoCIII в организме животного с липодистрофией, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения уровни ApoCIII снижаются в печени, жировой ткани, сердце, скелетных мышцах или тонком кишечнике.

В некоторых вариантах реализации изобретения липодистрофия представляет собой генерализованную липодистрофию или частичную липодистрофию.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения, предупреждения, замедления или облегчения липодистрофии у животного, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения улучшается течение, облегчается симптом или снижается риск липодистрофии.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения, предупреждения, замедления или облегчения сердечно-сосудистого и/или метаболического заболевания, или расстройства, или его симптома у животного с липодистрофией, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение предупреждает, замедляет или облегчает сердечно-сосудистое и/или метаболическое заболевание, расстройство, патологическое состояние, или его симптом у животного с липодистрофией путем снижения уровней ТГ, повышения уровней ЛПВП у животного и/или улучшения соотношения ТГ к ЛПВП. В некоторых вариантах реализации изобретения улучшается течение, облегчается симптом или снижается риск сердечно-сосудистого и/или метаболического заболевания.

В некоторых вариантах реализации изобретения сердечно-сосудистое заболевание представляет собой аневризму, стенокардию, аритмию, атеросклероз, цереброваскулярное заболевание, заболевание коронарных сосудов сердца, гипертензию, дислипидемию, гиперлипидемию, гипертриглицеридемию или гиперхолестеринемию. В некоторых вариантах реализации изобретения дислипидемия представляет собой гипертриглицеридемию или хиломикронемию. В некоторых вариантах реализации изобретения метаболическое заболевание представляет собой диабет, ожирение или метаболический синдром.

В некоторых вариантах реализации изобретения симптомы сердечно-сосудистого заболевания включают, но не ограничиваются ими, стенокардию; боль в груди; одышку; сердцебиение; слабость; головокружение; тошноту; повышение потоотделения; тахикардию; брадикардию; аритмию; мерцание предсердий; отек нижних конечностей;

цианоз; усталость; слабость; онемение лица; онемение конечностей; хромоту или мышечные спазмы; вздутие живота; или лихорадку.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения, предупреждения, замедления или облегчения стеатоза печени, НАЖБП или НАСГ, или его симптома у животного с липодистрофией, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение предупреждает, замедляет или облегчает стеатоз печени, НАЖБП или НАСГ, или его симптом у животного с липодистрофией путем снижения уровней ТГ, повышения уровней ЛПВП у животного и/или улучшения соотношения ТГ к ЛПВП. В некоторых вариантах реализации изобретения улучшается течение, облегчается симптом или снижается риск стеатоза печени, НАЖБП или НАСГ. В некоторых вариантах реализации изобретения введение терапевтически эффективного количества соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII, животному с связанным с липодистрофией стеатозом печени, НАЖБП или НАСГ, предотвращает или замедляет прогрессирование цирроза печени или гепатоцеллюлярной карциномы.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения, предупреждения, замедления или облегчения панкреатита или его симптома у животного с липодистрофией, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение предупреждает, замедляет или облегчает панкреатит или его симптом у животного с липодистрофией, путем снижения уровней ТГ, повышения уровней ЛПВП у животного и/или улучшения соотношения ТГ к ЛПВП. В некоторых вариантах реализации изобретения улучшается течение, облегчается симптом или снижается риск панкреатита.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ снижения уровней ТГ у животного с липодистрофией, включающий введение вводят животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения улучшается течение, облегчается симптом или снижается риск гипертриглицеридемии.

В некоторых вариантах реализации изобретения животное имеет уровень ТГ по меньшей мере ≥1200 мг/дл, ≥1100 мг/дл, ≥1000 мг/дл, ≥900 мг/дл, ≥880 мг/дл, ≥850 мг/дл, ≥800 мг/дл, ≥750 мг/дл, ≥700 мг/дл, ≥650 мг/дл, ≥600 мг/дл, ≥550 мг/дл, ≥500 мг/дл, ≥450 мг/дл, ≥440 мг/дл, ≥400 мг/дл, 350 мг/дл, ≥300 мг/дл, ≥250 мг/дл, ≥200 мг/дл, ≥150 мг/дл. В некоторых вариантах реализации изобретения животное имеет историю уровня ТГ ≥880 мг/дл, тощакового уровеня ТГ ≥750 мг/дл и/или уровеня ТГ ≥440 мг/дл после диеты.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение уменьшает ТГ (постпрандиальный или тощаковый) по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 5% или по меньшей мере на 1% от базового уровня ТГ. В некоторых вариантах реализации изобретения уровень ТГ (постпрандиальный или тощаковый) составляет ≤1900 мг/дл, ≤1800 мг/дл, ≤1700 мг/дл, ≤1600 мг/дл, ≤1500 мг/дл, ≤1400 мг/дл, ≤1300 мг/дл, ≤1200 мг/дл, ≤1100 мг/дл, ≤1000 мг/дл, ≤900 мг/дл, ≤800 мг/дл, ≤750 мг/дл, ≤700 мг/дл, ≤650 мг/дл, ≤600 мг/дл, ≤550 мг/дл, ≤500 мг/дл, ≤450 мг/дл, ≤400 мг/дл, ≤350 мг/дл, ≤300 мг/дл, ≤250 мг/дл, ≤200 мг/дл, ≤150 мг/дл или ≤100 мг/дл.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ повышения уровней ЛПВП и/или улучшение соотношения ТГ к ЛПВП у животного с липодистрофией, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение повышает уровень ЛПВП (постпрандиальный или тощаковый) по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 5% или по меньшей мере на 1% тт исходного уровня ЛПВП.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ снижения тощакового уровня ТГ, снижения HbA1c, снижения глюкозы в плазме, уменьшения объема печени, снижение увеличения объема печени и снижения стеатоза печени у животного с липодистрофией, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения HbA1c снижается до менее чем 9%, менее чем 8%, менее чем 7,5% или менее чем 7%. В некоторых вариантах реализации изобретения HbA1c снижается по меньшей мере на 0,2%, по меньшей мере на 0,5%, по меньшей мере на 0,7%, по меньшей мере на 1%, по меньшей мере на 1,2% или по меньшей мере на 1,5%.

В дополнительных варианты реализации изобретения предложен способ улучшения физиологических маркеров, таких как гликемические индексы, параметры липидов, параметры жировой ткани и результаты лечения пациента с липодистрофией, включающие введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII.

Примеры показателей гликемического индекса для улучшения включают, но не ограничиваются ими, уровни глюкозы, оценку гомеостатической модели (НОМА), инсулинорезистентность, тощаковые уровни инсулина, уровни С-пептида и потребление инсулина. В некоторых вариантах реализации изобретения желательно

Примеры липидных показателей, требующие улучшения включают, но не ограничиваются ими, ХС-ЛПВП, ХС-ЛПНП, общий холестерин, ХС-ЛПОНП, ХС-не-ЛПВП, ароВ, apoAl, АРОС3 (общий, хиломикрон, ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВП), размер частиц свободных жирных кислот и/или липопротеинов, и/или их количество будут оцениваться для улучшения.

Примеры показателей жировой ткани для улучшения включают, но не ограничиваются ими, толщину кожной складки, процентное содержание жира в теле (ДЭРА сканирование), адипонектин, лептин, массу тела и объем талии.

Примеры улучшенных показателей результатов лечения пациентов включают, но не ограничиваются ими, качество жизни (опросы EQ-5D, SF36) и шкала голода.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения пациентов с липодистрофией, страдающих тяжелыми или множественными вспышками панкреатита, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения пациент страдает от панкреатита, несмотря на ограничения жира в рационе.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ идентификации субъекта, страдающего липодистрофией, включающий генетический скрининг субъекта. В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ идентификации субъекта, подверженного риску развития липодистрофии, включающий генетический скрининг субъекта. В некоторых вариантах реализации изобретения генетический скрининг осуществляют с помощью анализа последовательности гена или транскрипта РНК, кодирующего LMNA, PPARγ, PLIN1, АKТ2, CIDEC или любого другого гена или РНК, связанного с липодистрофией.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ идентификации субъекта, страдающего липодистрофией, включающий генетический скрининг субъекта с помощью клинической оценки и/или генетического скрининга.

В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота ApoCIII представляет собой последовательность с номером доступа GenBankNM_000040. 1 (включена в данный документ как SEQ ID NO: 1), номер доступа GENBANKNT_033899. 8 укороченная от нуклеотида 20262640 до 20266603 (включена в данный документ как SEQ ID NO: 2) и с номером доступа GenBankNT_035088. 1, укороченная от нуклеотида 6238608 до 6242565 (включена в данный документ как SEQ ID NO: 4).

В некоторых вариантах реализации изобретения специфический ингибитор ApoCIII содержит нуклеиновую кислоту, пептид, антитело, малую молекулу или другой агент, способный ингибировать экспрессию ApoCIII. В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота содержит антисмысловое соединение, нацеленное на ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение содержит антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на ApoCIII. В некоторых вариантах реализации антисмысловой олигонуклеотид содержит модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность, комплементарную SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид является по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или на 100% комплементарным SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из антисмыслового олигонуклеотида, комплементарного ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований из ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на ApoCIII, имеет последовательность, отличную от последовательности SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из последовательности, выбранной из любой последовательности, описанной в патенте США 7598227, патенте США 7750141, публикации РСТ WO 2004/093783 или публикации РСТ WO 2012/149495, все включенные в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность, выбранную из любой последовательности, описанной в патенте США 7598227, патенте США 7750141, публикации РСТ WO 2004/093783 или публикации РСТ WO 2012/149495, все включенные в данный документ посредством ссылки.

В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из одноцепочечного модифицированного олигонуклеотида.

В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 19-22 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов и последовательности нуклеиновых оснований из ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3).

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь. В некоторых вариантах реализации изобретения межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную межнуклеозидную связь. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную межнуклеозидную связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит по меньшей мере один нуклеозид, содержащий модифицированный сахар. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один модифицированный сахар содержит 2'-O-метоксиэтил.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит по меньшей мере один нуклеозид, содержащий модифицированное нуклеиновое основание. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированное нуклеиновое основание представляет собой 5-метилцитозин.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, содержащий: (i) сегмент гэпа, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов; (ii) сегмент 5' крыла, состоящий из связанных нуклеозидов; (iii) сегмент 3' крыла, состоящий из связанных нуклеозидов; причем сегмент гэпа расположен непосредственно рядом с и между сегментом 5' крыла и сегментом 3' крыла, и при этом каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит модифицированный сахар.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, содержащий: (i) сегмент гэпа, состоящий из 8-12 связанных дезоксинуклеозидов; (ii) сегмент 5' крыла, состоящий из 1-5 связанных нуклеозидов; (iii) сегмент 3' крыла, состоящий из 1-5 связанных нуклеозидов; причем сегмент гэпа расположен непосредственно рядом с и между сегментом 5' крыла и сегментом 3' крыла, и при этом каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтильный сахар, где каждый цитозиновый остаток представляет собой 5'-метилцитозин, и при этом по меньшей мере одна межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, содержащий: (i) сегмент гэпа, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; (ii) сегмент 5' крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; (iii) сегмент 3' крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов, причем сегмент гэпа расположен непосредственно рядом с и между сегментом 5' крыла и сегментом 3' крыла, и при этом каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтильный сахар, где каждый цитозин представляет собой 5'-метилцитозин, и при этом по меньшей мере одна межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения, предупреждения, замедления или облегчения частичной липодистрофии или заболевания, связанного с частичной липодистофией у животного, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, имеющий последовательность из SEQ ID NO: 3, в которой модифицированный олигонуклеотид содержит: (i) сегмент гэпа, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; (ii) сегмент 5' крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; (iii) сегмент 3' крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов, причем сегмент гэпа расположен непосредственно рядом с и между сегментом 5' крыла и сегментом 3' крыла, и при этом каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтильный сахар, где каждый цитозин представляет собой 5'-метилцитозин, и при этом по меньшей мере одна межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ лечения, предупреждения, замедления или облегчения частичной липодистрофии или заболевания, связанного с частичной липодистофией у животного, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, причем модифицированный олигонуклеотид является комплементарным нуклеиновой кислоте ApoCIII, и при этом модифицированный олигонуклеотид уменьшает уровни ТГ, увеличивает уровни ЛПВП и/или улучшает соотношение ТГ к ЛПВП. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота ApoCIII представляет собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид является по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или на 100% комплементарным SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из антисмыслового олигонуклеотида, нацеленного на ApoCIII. В дополнительных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из последовательности нуклеиновых оснований из ISIS 304801 (SEQ IDNO: 3).

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ снижения уровней триглицеридов у животного с липодистрофией, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, имеющий последовательность из SEQ ID NO: 3, в которой модифицированный олигонуклеотид содержит: (i) сегмент гэпа, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; (ii) сегмент 5' крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; (iii) сегмент 3' крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов, причем сегмент гэпа расположен непосредственно рядом с и между сегментом 5' крыла и сегментом 3' крыла, и при этом каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтильный сахар, где каждый цитозин представляет собой 5'-метилцитозин, и при этом по меньшей мере одна межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ предложен способ снижения уровней триглицеридов (ТГ) у животного с частичной липодистрофией, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, причем модифицированный олигонуклеотид является комплементарным нуклеиновой кислоте ApoCIII, и при этом модифицированный олигонуклеотид уменьшает уровни ТГ, увеличивает уровни ЛПВП и/или улучшает соотношение ТГ к ЛПВП. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота ApoCIII представляет собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид является по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или на 100% комплементарным SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из антисмыслового олигонуклеотида, нацеленного на ApoCIII. В дополнительных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из последовательности нуклеиновых оснований из ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3).

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ предупреждения, замедления или облегчения сердечно-сосудистого и/или метаболического заболевания, расстройства, патологического состояния, или его симптома у животного с частичной липодистрофией, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, имеющий последовательность из SEQ ID NO: 3, в которой модифицированный олигонуклеотид содержит: (i) сегмент гэпа, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; (ii) сегмент 5' крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; (iii) сегмент 3' крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов, причем сегмент гэпа расположен непосредственно рядом с и между сегментом 5' крыла и сегментом 3' крыла, и при этом каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-О-метоксиэтильный сахар, где каждый цитозин представляет собой 5'-метилцитозин, и при этом по меньшей мере одна межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ предупреждения, замедления или облегчения сердечно-сосудистого и/или метаболического заболевания, расстройства, патологического состояния, или его симптома у животного с частичной липодистрофией, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, причем модифицированный олигонуклеотид является комплементарным нуклеиновой кислоте ApoCIII, и при этом модифицированный олигонуклеотид уменьшает уровни ТГ, увеличивает уровни ЛПВП и/или улучшает соотношение ТГ к ЛПВП. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота ApoCIII представляет собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид является по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или на 100% комплементарным SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из антисмыслового олигонуклеотида, нацеленного на ApoCIII. В дополнительных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из последовательности нуклеиновых оснований из ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3).

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ предупреждения, замедления или облегчения панкреатита или его симптома у животного с частичной липодистрофией, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, имеющий последовательность из SEQ ID NO: 3, в которой модифицированный олигонуклеотид содержит: (i) сегмент гэпа, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; (ii) сегмент 5' крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; (iii) сегмент 3' крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов, причем сегмент гэпа расположен непосредственно рядом с и между сегментом 5' крыла и сегментом 3' крыла, и при этом каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтильный сахар, где каждый цитозин представляет собой 5'-метилцитозин, и при этом по меньшей мере одна межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ предупреждения, замедления или облегчения панкреатита или его симптома у животного с частичной липодистрофией, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, причем модифицированный олигонуклеотид является комплементарным нуклеиновой кислоте ApoCIII, и при этом модифицированный олигонуклеотид уменьшает уровни ТГ, увеличивает уровни ЛПВП и/или улучшает соотношение ТГ к ЛПВП. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота ApoCIII представляет собой SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид является по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или на 100% комплементарным SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из антисмыслового олигонуклеотида, нацеленного на ApoCIII. В дополнительных вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из последовательности нуклеиновых оснований из ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3).

В некоторых вариантах реализации изобретения животное представляет собой человека.

В некоторых вариантах животное находится в группе риска панкреатита. В некоторых вариантах реализации изобретения снижение уровней ApoCIII в печени и/или тонком кишечнике предупреждает панкреатит. В некоторых вариантах реализации изобретения повышение уровней ТГ, повышение уровней ЛПВП и/или улучшение соотношения ТГ к ЛПВП предупреждает панкреатит.

В некоторых вариантах реализации изобретения снижение уровней ApoCIII в печени и/или тонком кишечнике животного с липодистрофией увеличивает клиренс триглицеридов после приема пищи. В некоторых вариантах реализации изобретения повышение уровней ЛПВП и/или улучшение соотношения ТГ к ЛПВП увеличивает клиренс ТГ после приема пищи у животного с липодистрофией. В некоторых вариантах реализации изобретения снижение уровней ApoCIII в печени и/или тонком кишечнике снижает уровень триглицеридов после приема пищи у животного с липодистрофией. В некоторых вариантах реализации изобретения повышение уровней ЛПВП и/или улучшение соотношения ТГ к ЛПВП снижает уровень ТГ после приема пищи.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение вводят парентерально. В дополнительных вариантах реализации изоретения парентеральное введение представляет собой подкожное введение.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение вводят совместно со вторым агентом или терапией. В некоторых вариантах реализации изобретения вторым агентом является фактор высвобождения гормона роста (ФВГР), агент, замещающий лептин, агент, снижающий уровень ApoCIII, агент, снижающий уровень Аро С-II, агент, снижающий уровень ДГАТ1, агент, повышающий уровень ЛПЛ, агент, снижающий уровень холестерина, агент, снижающий уровень не-ЛПВП липидов, агент, снижающий уровень ЛПНП, агент, снижающий уровень ТГ, агент, снижающий уровень холестерина, агент, повышающий уровень ЛПВП, рыбий жир, ниацин (никотиновая кислота), фибрат, статин, DCCR (соль диазоксида), агент, снижающий уровень глюкозы, или антидиабетические агенты. В некоторых вариантах реализации изобретения вторая терапия представляет собой ограничение жира в рационе.

Примером агента, замещающего лептин, является Myalept^®.

Примером фактора высвобождения гормона роста (ФВГР) является Egrifta^®.

В некоторых вариантах реализации изобретения агенты, снижающие уровень ApoCIII включают антисмысловой олигонуклеотид ApoCIII, отличный от первого агента, фибрат или антисмысловой олигонуклеотид Аро В.

В некоторых вариантах реализации изобретения агент, снижающий уровень ДГАТ1 представляет собой LCQ908.

В некоторых вариантах реализации изобретения агенты, повышающие уровень ЛПЛ, включают агенты генной терапии, которые повышают уровень ЛПЛ (например, Glybera^R, нормальные копии АроС-II, GPIHBP1, АРОА5, LMF1 или другие гены, которые при мутации могут привести к дисфункциональной ЛПЛ).

В некоторых вариантах реализации изобретения агенты, снижающие уровень глюкозы, и/или антидиабетические агенты включают, но не ограничиваются ими, агонист PPAR, ингибитор дипептидилпептидазы (IV), аналог ГПП-1, инсулин или аналог инсулина, стимулятор секреции инсулина, ингибитор SGLT2, аналог человеческого амилина, бигуанид, ингибитор альфа-глюкозидазы, метформин, сульфонилмочевину, росиглитазон, меглитинид, тиазолидиндион, ингибитор альфа-глюкозидазы и тому подобное. Сульфонилмочевина может представлять собой ацетогексамид, хлорпропамид, толбутамид, толазамид, глимепирид, глипизид, глибурид или гликлазид. Меглитинид может представлять собой натеглинид или репаглинид. Тиазолидиндион может представлять собой пиоглитазон или росиглитазон. Альфа-глюкозидаза может представлять собой акарбозу или миглитолом.

В некоторых вариантах реализации изобретения агенты, снижающие уровень холестерина и липидов, включают, но не ограничиваются ими, статины, секвестранты желчных кислот, никотиновую кислоту и фибраты. Статины могут представлять собой аторвастатин, флувастатин, ловастатин, правастатин, розувастатин и симвастатин и тому подобное. Секвестранты желчных кислот могут представлять собой колесевелам, холестирамин, колестипол и тому подобное. Фибратами могут представлять собой гемфиброзил, фенофибрат, клофибрат и тому подобное. Терапевтическое изменение образа жизни может представлять собой ограничение жира в рационе.

В некоторых вариантах реализации изобретения агенты, повышающие ЛПВП, включают препараты, ингибирующие транспортный белок холестериновых эфиров (СЕТР) (такие как торцетрапиб), агонисты рецептора, активируемого пероксисомными пролифераторами, Аро-А1, пиоглитазон и тому подобное.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение и второй агент вводят совместно и последовательно.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение находится в форме соли.

В дополнительных вариантах реализации изобретения соединение дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединение является конъюгированным. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение является GalNAc конъюгированным. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение содержит конъюгированную группу GalNAc с формулой:

В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгированное соединение имеет формулу:

В некоторых вариантах реализации изобретения предусмотрено применение соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII для снижения уровней ApoCIII у животного с липодистрофией. В некоторых вариантах реализации изобретения уровни ApoCIII снижаются в печени или тонком кишечнике.

В некоторых вариантах реализации изобретения предлагается соединение, содержащее специфический ингибитор ApoCIII для применения в: лечении, предупреждении, замедлении или облегчении частичной липодистрофии или заболевания, связанного с частичной липодистофией у животного; снижении уровней триглицеридов у животного с частичной липодистрофией; повышении уровня ЛПВП и/или улучшении соотношения ТГ к ЛПВП у животных с частичной липодистрофией; предупреждении, замедлении или облегчении сердечно-сосудистого и/или метаболического заболевания, расстройства, патологического состояния или его симптома у животного с частичной липодистрофией; и/или предупреждении, замедлении или облегчении панкреатита или его симптома у животного с частичной липодистрофией.

В некоторых вариантах реализации изобретения предложено соединении, содержащее специфический ингибитор ApoCIII, для использования при получении лекарственного средства для лечения, предупреждения, замедления или облегчения липодистрофии.

В некоторых вариантах реализации изобретения предлагается применение соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII для снижения уровней ApoCIII у животного с липодистрофией. В некоторых вариантах реализации изобретения уровни ApoCIII снижаются в печени или тонком кишечнике.

В некоторых вариантах реализации изобретения предлагается применение соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII при получении лекарственного средства для снижения уровней ТГ, повышения уровней ЛПВП и/или улучшения соотношения ТГ к ЛПВП у животного с липодистрофией.

В некоторых вариантах реализации изобретения предлагается применение соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII при получении лекарственного средства для предупреждения, лечения, облегчения или уменьшения сердечно-сосудистого или метаболического заболевания у животного с липодистрофией.

В некоторых вариантах реализации изобретения предлагается применение соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII при получении лекарственного средства для предупреждения, лечения, облегчения или уменьшения панкреатита у животного с липодистрофией.

В некоторых вариантах реализации изобретения предлагается применение соединения, содержащего специфический ингибитор ApoCIII при получении лекарственного средства для предупреждения, лечения, облегчения или уменьшения стеатоза печени, НАЖБП, НАСГ, цирроза печени или гепатокарциномы у животного с липодистрофии.

В некоторых вариантах реализации изобретения специфический ингибитор ApoCIII, используемый для получения лекарственного средства, представляет собой нуклеиновую кислоту, пептид, антитело, малую молекулу или другой агент, способный ингибировать экспрессию ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловое соединение. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение представляет собой модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид является по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 100% комплементарным SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах реализации изобретения используемый специфический ингибитор ApoCIII представляет собой нуклеиновую кислоту, пептид, антитело, малую молекулу или другой агент, способный ингибировать экспрессию ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловое соединение. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение представляет собой модифицированный олигонуклеотид, нацеленный на ApoCIII. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный олигонуклеотид является по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 100% комплементарным SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4.

Антисмысловые соединения

Олигомерные соединения включают, но не ограничиваются ими, олигонуклеотиды, олигонуклеозиды, аналоги олигонуклеотидов, миметики олигонуклеотидов, антисмысловые соединения, антисмысловые олигонуклеотиды и миРНК. Олигомерное соединение может быть "антисмысловым" по отношению к целевой нуклеиновой кислоте, и это означает, что соединение способно к гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью посредством водородной связи.

Антисмысловые соединения, представленные в данном документе, относятся к олигомерным соединениям, способным к гибридизации нуклеиновой кислоты-мишени посредством водородных связей. Примеры антисмысловых соединений включают одноцепочечные и двухцепочечные соединения, такие как антисмысловые олигонуклеотиды, миРНК, кшРНК, микроРНК.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение содержит последовательность нуклеиновых оснований, которая, при написании в направлении от 5' к 3', содержит обратную последовательность, комплементарную целевому сегменту целевой нуклеиновой кислоты на которую она нацелена. В некоторых таких вариантах реализации изобретения, антисмысловой олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований, которая, при написании в направлении от 5' к 3', содержит обратную последовательность, комплементарную целевому сегменту целевой нуклеиновой кислоты на которую она нацелена.

В некоторых вариантах реализации изобретения длина антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту ApoCIII, составляет 12-30 нуклеотидов. Другими словами, длина антисмыслового соединения составляет 12-30 связанных нуклеиновых оснований. В других вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-80, 10-80, 12-50, 15-30, 18-24, 19-22 или 20 связанных нуклеиновых оснований. В некоторых таких вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение содержит модифицированный олигонуклеотид длиной 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23,24, 25,26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 связанных нуклеиновых оснований или в интервале, определенном любыми двумя из упомянутых выше значений. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение представляет собой антисмысловой олигонуклеотид.

В некоторых вариантах антисмысловое соединение содержит сокращенный или укороченный модифицированный олигонуклеотид. В сокращенном или укороченном модифицированном олигонуклеотиде один или более нуклеозидов могут быть удалены с 5' конца (5' укорачивание), один или более нуклеозидов могут быть удалены с 3' конца (3' укорачивание) или один или более нуклеозидов могут быть удалены из центральной части. В альтернативном варианте удаленные нуклеозиды могут быть распределены в модифицированном олигонуклеотиде, например, в антисмысловом соединении один нуклеозид удален с 5' конца и один нуклеозид удален с 3' конца.

Если один дополнительный нуклеозид присутствует в удлиненным олигонуклеотиде, дополнительный нуклеозид может быть расположен в центральной части, на 5' или 3' конце олигонуклеотида. Если присутствуют два или более дополнительных нуклеозидов, дополнительные нуклеозиды могут быть смежными по отношению друг к другу, например, в олигонуклеотиде, содержащем два нуклеозида, добавленных к центральной части, к 5' концу (5' добавление) или, альтернативно, к 3' концу (3' добавление) олигонуклеотида. В альтернативном варианте дополнительные нуклеозиды могут быть распределены в антисмысловом соединении, например, в олигонуклеотиде, содержащем один нуклеозид, добавленный 5' концу, и одну субъединицу, добавленную к 3' концу.

Длина антисмыслового соединения, такого как антисмысловой олигонуклеотид, может быть увеличена или уменьшена, и/или могут быть введены некомплементарные основания без потери активности. Например, в Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7305-7309, 1992) ряд антисмысловых олигонуклеотидов длиной 13-25 нуклеиновых оснований был испытан на предмет способности индуцировать расщепление целевой РНК в модели инъекции ооцита. Антисмысловые олигонуклеотиды длиной 25 нуклеиновых оснований с 8 или 11 некомплементарными основаниями вблизи концов антисмысловых олигонуклеотидов были способны направлять специфическое расщепление целевой мРНК, хотя и в меньшей степени, чем антисмысловые олигонуклеотиды, которые не содержали никаких несоответствий. Аналогичным образом целевое специфическое расщепление было достигнуто с использованием антисмысловых олигонуклеотидов длиной 13 нуклеиновых оснований, включая те, которые имели 1 или 3 несоответствия.

Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001) продемонстрировали способность олигонуклеотида, обладающего 100% комплементарностью мРНК bcl-2 и содержащего 3 рассогласованных основания по отношению к мРНК bcl-xL, уменьшать экспрессию как bcl-2, так и bcl-xL in vitro и in vivo. Кроме того, данный олигонуклеотид продемонстрировал высокую противоопухолевую активность in vivo.

Maher and Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) провели испытания серии тандемных антисмысловых олигонуклеотидов длиной 14 нуклеиновых оснований, и антисмысловых олигонуклеотидов длиной 28 и 42 нуклеиновых основания, состоящих из последовательности 2-х или 3-х тандемных антисмысловых олигонуклеотидов, соответственно, на предмет их способности останавливать трансляцию ДГФР человека в анализе на ретикулоцитах кролика. Каждый из трех антисмысловых олигонуклеотидов длиной 14 нуклеиновых оснований по отдельности мог воспрепятствовать трансляции, хотя на более низком уровне, чем антисмысловые олигонуклеотиды длиной 28 или 42 нуклеиновых основания.

Мотивы антисмысловых соединений

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту ApoCIII, содержат химически модифицированные субъединицы, организованные в паттерны или мотивы, для обеспечения таких свойств антисмысловых соединений, как повышенная ингибирующая активность, повышенная аффинность связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью или устойчивость к расщеплению нуклеазами in vivo.

Как правило, химерные антисмысловые соединения содержат по меньшей мере одну область, модифицированную таким образом, чтобы придать повышенную устойчивость к разложению под действием нуклеаз, усиление клеточного поглощения, повышенную аффинность связывания с целевой нуклеиновой кислотой, и/или повышенную ингибирующую активность. Вторая область химерного антисмыслового соединения необязательно может служить субстратом для клеточной эндонуклеазы РНКазы Н, которая расщепляет цепь РНК в дуплексе РНК:ДНК.

Антисмысловые соединения, имеющие гэпмерный мотив, представляют собой химерные антисмысловые соединения. В гэпмере внутренняя область, имеющая множество нуклеотидов, которые поддерживают расщепление РНКазой Н, расположена между внешними областями, имеющими множество нуклеотидов, химически отличающихся от нуклеозидов внутренней области. В случае антисмыслового олигонуклеотида, имеющего гэпмерный мотив, сегмент гэпа, как правило, служит в качестве субстрата для расщепления эндонуклеазой, в то время как сегменты крыла содержат модифицированные нуклеозиды. В некоторых вариантах реализации изобретения области гэпмера различаются по типам сахарных фрагментов в составе каждой отдельной области. Виды сахарных фрагментов, которые применяются для дифференциации областей гэпмера, в некоторых вариантах реализации изобретения могут включать β-D-рибонуклеозиды, β-D-дезоксирибонуклеозиды, 2'-модифицированные нуклеозиды (такие как 2'-модифицированные нуклеозиды, среди прочего, могут включать 2'-МОЕ и 2'-O-СН₃) и и модифицированные бициклическими сахарами нуклеозиды (такие как модифицированные бициклическими сахарами нуклеозиды могут включать содержащие мостик 4'-(CH₂)n-O-2' bridge, where n=1 or n=2). Предпочтительно, каждая отличная область содержит однородные остатки сахара. Мотив крыло-гэп-крыло часто описывают как "X-Y-Z", в котором "X" представляет длину области 5' крыла, "Y" представляет длину гэпа, и "Z" представляет длину области 3' крыла. В данном контексте гэпмер, описанный как "X-Y-Z", имеет такую конфигурацию, что сегмент гэпа расположен непосредственно примыкающим к каждому из сегмента 5' крыла и сегмента 3' крыла. Таким образом, отсутствуют промежуточные нуклеотиды между сегментом 5' крыла и сегментом гэпа или сегментом гэпа и сегментом 3' крыла. Любое из антисмысловых соединении, описанных в данном документе, может иметь гэпмерный мотив. В некоторых вариантах реализации изобретения X и Z являются одинаковыми; в других вариантах реализации изобретения они являются различными. В предпочтительном варианте реализации изобретения длина Y составляет от 8 до 15 нуклеотидов. Длина X, Y или Z может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более нуклеотидов. Таким образом, гэпмеры включают, не ограничиваясь ими, например 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3, 4-12-4, 3-14-3, 2-13-5, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 1-10-1, 2-8-2, 6-8-6, 5-8-5, 1-8-1, 2-6-2, 2-13-2, 1-8-2, 2-8-3, 3-10-2, 1-18-2 или 2-18-2.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение как мотив "вингмера" имеет конфигурацию крыло-гэп или гэп-крыло, т.е. конфигурацию X-Y или Y-Z, как описано выше для конфигурации гэпмера. Таким образом, конфигурации вингмера включают, не ограничиваясь ими, например 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13 или 5-13.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту ApoCIII, содержат гэпмерый мотив 5-10-5.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту ApoCIII, содержит расширенный гэп-мотив.

Нуклеиновые кислоты-мишени, области-мишени и нуклеотидные последовательности

Нуклеотидные последовательности, которые кодируют ApoCIII, включают, но не ограничиваются ими, следующие: номер доступа GENBANKNM_000040. 1 (включена в данный документ как SEQ ID NO: 1), номер доступа GENBANKNT_033899. 8 укороченная от нуклеотида 20262640 до 20266603 (включена в данный документ как SEQ ID NO: 2) и номер доступа GenBankNT_035088. 1, укороченная от нуклеотида 6238608 до 6242565 (включена в данный документ как SEQ ID NO: 4).

Следует понимать, что последовательность, изложенная в каждой SEQ ID NO в примерах, содержащихся в данном документе, является независимой от любой модификации сахарного фрагмента, межнуклеозидной связи или нуклеинового основания. Как таковые, антисмысловые соединения, определенные SEQ ID NO, независимо могут содержать одну или более модификаций сахарного фрагмента, межнуклеозидной связи или нуклеинового основания. Антисмысловые соединения, описанные номером Isis (Isis No), показывают комбинацию последовательности нуклеиновых оснований и мотива.

В некоторых вариантах реализации изобретения область-мишень представляет собой структурно определенную область нуклеиновой кислоты-мишени. Например, область-мишень может содержать 3' нетранслируемую область, 5' нетранслируемую область, экзон, интрон, соединение экзон/интрон, кодирующую область, область инициации трансляции, область окончания трансляции или другую определенную область нуклеиновой кислоты. Структурно определенные области для ApoCIII могут быть получены по номеру доступа из баз данных последовательностей, таких как NCBI, и такая информация включена в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации изобретения область-мишень может содержать последовательность от 5' сайта мишени одного сегмента-мишени в пределах области-мишени до 3' сайта мишени другого сегмента-мишени в пределах области-мишени.

В некоторых вариантах реализации изобретения "сегмент-мишень" представляет собой меньший, субфрагмент области-мишени в составе нуклеиновой кислоты. Например, сегмент-мишень может представлять собой последовательность нуклеотидов нуклеиновой кислоты-мишени, на которую нацелено одно или более антисмысловых соединений. "5' сайт-мишень" относится к крайнему 5' нуклеотиду сегмента-мишени. "3" сайт-мишень" относится к 3'-крайнему нуклеотиду сегмента-мишени.

Область-мишень может содержать один или более сегментов-мишеней. Множество сегментов-мишеней в области-мишени могут быть перекрывающимися. В альтернативном варианте они могут быть не перекрывающимися. В некоторых вариантах реализации изобретения сегменты-мишени в пределах области-мишени разделены не более чем около 300 нуклеотидами. В некоторых вариантах реализации изобретения сегменты-мишени в пределах области-мишени разделены числом нуклеотидов, которое составляет не более чем или не более чем около 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50,40, 30, 20 или 10 нуклеотидов в нуклеиновой кислоте-мишени или представляет собой интервал, определенный любыми двумя из предшествующих значений. В некоторых вариантах реализации изобретения сегменты-мишени в пределах области-мишени разделены не более чем или не более чем около 5 нуклеотидами в нуклеиновой кислоте-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения сегменты-мишени являются смежными. Предусмотрены области-мишени, определенные интервалом, содержащим начало нуклеиновой кислоты, которая представляет собой любой из 5' сайта-мишени или 3' сайта-мишени, перечисленных в данном документе.

Нацеливание включает определение по меньшей мере одного сегмента-мишени, с которым гибридизируется антисмысловое соединение, например, для достижения желаемого эффекта. В некоторых вариантах реализации изобретения желаемый эффект представляет собой снижение уровней мРНК нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения желаемый эффект представляет собой снижение уровней белка, кодируемого нуклеиновой кислотой-мишенью или фенотипическое изменение, связанное с нуклеиновой кислотой-мишенью.

Подходящие сегменты-мишени могут быть расположены в пределах 5' UTR, кодирующей области, 3' UTR, интрона, экзона или соединения экзон/интрон. Сегменты-мишени, содержащие старт-кодон или стоп-кодон, также представляют собой подходящие сегменты-мишени. Подходящий сегмент-мишень может специфически исключать некоторую структурно определенную область, такую как старт-кодон или стоп-кодон.

Определение пригодных сегментов-мишеней может включать сравнение последовательности нуклеиновой кислоты-мишени с другими последовательностями в геноме. Например, для идентификации областей сходства среди различных нуклеиновых кислот может быть использован алгоритм BLAST. Такое сравнение может предотвратить отбор последовательностей антисмыслового соединения, которые способны гибридизироваться неспецифическим образом с последовательностями, отличными от выбранной нуклеиновой кислоты-мишени (т.е., нецелевыми или побочными последовательностями).

Может существовать вариация активности (например, определенной по процентному снижению уровней нуклеиновой кислоты-мишени) антисмысловых соединений внутри активной области-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения снижение уровней мРНК ApoCIII указывает на ингибирование экспрессии ApoCIII. Снижение уровней белка ApoCIII может указывать на ингибирование экспрессии мРНК мишени. Дополнительно фенотипические изменения могут указывать на ингибирование экспрессии ApoCIII. Например, повышение уровней ЛПВП, снижение уровней ЛПНП или снижение уровней триглицеридов находятся среди фенотипических изменений, которые можно анализировать на предмет ингибирования экспрессии ApoCIII. Другие фенотипические показания, например, симптомы, связанные с сердечно-сосудистым или метаболическим заболеванием, также можно оценивать; например, стенокардию; боль в груди; одышку; сердцебиение; слабость; головокружение; тошноту; повышенное потоотделение; тахикардию; брадикардию; аритмию; мерцание предсердий; отек нижних конечностей; цианоз; усталость; слабость; онемение лица; онемение конечностей; хромоту или мышечные спазмы; вздутие живота; или лихорадку.

Гибридизация

В некоторых вариантах реализации изобретения происходит гибридизация между антисмысловым соединением, описанными в данном документе, и нуклеиновой кислотой ApoCIII. Наиболее общий механизм гибридизации включает участие водородной связи (например, уотсон-криковское, хугстиновское или обратное хугстиновское образование водородной связи) между комплементарными нуклеиновыми основаниями молекул нуклеиновой кислоты.

Гибридизация может происходить в различных условиях. Жесткие условия являются последовательность - зависимыми и определяются природой и составом гибридизуемых молекул нуклеиновых кислот.

Способы определения того, способна ли последовательность к специфичной гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью, хорошо известны в данной области техники (Sambrooke and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd Ed., 2001, CSHL Press). В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, предложенные в данном документе, способны специфично гибридизироваться с нуклеиновой кислотой ApoCIII.

Комплементарность

Антисмысловое соединение и нуклеиновая кислота-мишень комплементарны друг к другу, когда достаточное количество нуклеиновых оснований антисмыслового соединения может образовывать водородную связь с соответствующими нуклеиновыми основаниями нуклеиновой кислоты-мишени, таким образом, чтобы оказывать желательный эффект (например, антисмысловое ингибирование нуклеиновой кислоты-мишени, такой как нуклеиновая кислота ApoCIII).

Антисмысловое соединение может гибридизироваться с одним или более сегментов нуклеиновой кислоты ApoCIII таким образом, что промежуточные или смежные сегменты не участвуют в процессе гибридизации (например, петлевая структура, несоответствие или шпилькообразная структура).

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, представленные в данном документе, или определенные их части, являются или по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% комплементарны нуклеиновой кислоте ApoCIII, области-мишени, сегменту-мишени или определенной ее части. Процент комплементарности антисмыслового соединения к нуклеиновой кислоте-мишени может быть определен с применением стандартных способов.

Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеиновых оснований антисмыслового соединения являются комплементарными к области-мишени, и поэтому будут специфически гибридизоваться, будут имеет 90 процентов комплементарности. В данном примере оставшиеся некомплементарные нуклеиновые основания могут быть расположены кластерно или вперемешку с комплементарных азотистыми основаниями и не обязательно должны быть смежными по отношению друг к другу или к комплементарным нуклеиновым основаниям. Таким образом, антисмысловое соединение, длина которого составляет 18 нуклеиновых оснований, содержащее 4 (четыре) некомплементарных нуклеиновых основания, фланкированных двумя областями полной комплементарности с нуклеиновой кислотой-мишенью, обладает общей комплементарностью с нуклеиновой кислотой-мишенью 77,8%, и таким образом, входит в границы объема настоящего изобретения. Процент комплементарности антисмыслового соединения с областью нуклеиновой кислоты-мишени может быть определен с помощью программ BLAST (поисковые инструменты для основного локального выравнивания) и программ PowerBLAST, известных в данной области техники (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). Процент гомологии, идентичность или комплементарность последовательностей могут быть определены, например, программой Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), с использованием настроек по умолчанию, которые используют алгоритм Смита и Ватермана (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489).

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, представленные в данном документе, или указанные их части являются полностью комплементарными (т.е. на 100% комплементарными) нуклеиновой кислоте-мишени или указанной ее части. Например, антисмысловое соединение может быть полностью комплементарным к нуклеиновой кислоте ApoCIII или ее области-мишени, или ее сегменту-мишени, или ее последовательности-мишени. В данном контексте "полностью комплементарный" означает, что каждое нуклеиновое основание антисмыслового соединения способно точно спариваться с соответствующими нуклеиновыми основаниями нуклеиновой кислоты-мишени. Например, антисмысловое соединение длиной 20 нуклеиновых оснований является полностью комплементарным к последовательности-мишени, длина которой составляет 400 нуклеиновых оснований при условии, что в нуклеиновой кислоте-мишени присутствует соответствующая часть длиной 20 нуклеиновых оснований, которая является полностью комплементарной к антисмысловому соединению. Полностью комплементарный может также использоваться в отношении определенной части первой и/или второй нуклеиновой кислоты. Например, часть длиной 20 нуклеиновых оснований антисмыслового соединения длиной 30 нуклеиновых оснований может быть "полностью комплементарной" к последовательности-мишени длиной 400 нуклеиновых оснований. Часть длиной 20 нуклеиновых оснований олигонуклеотида длиной 30 нуклеиновых оснований полностью комплементарна к последовательности-мишени, если последовательность-мишень содержит соответствующую часть длиной 20 нуклеиновых оснований, причем каждое нуклеиновое основание комплементарно к части антисмыслового соединения длиной 20 нуклеиновых оснований. В то же время, полноразмерное антисмысловое соединение длиной 30 нуклеиновых оснований может быть или не быть полностью комплементарным к последовательности-мишени, в зависимости от того, будут ли остальные 10 нуклеиновых оснований антисмыслового соединения также комплементарными к последовательности-мишени.

Некомплементарное(ые) нуклеиновое(ые) основание(я) может быть расположено на 5' конце или на 3' конце антисмыслового соединения. В альтернативном варианте некомплементарное(ые) нуклеиновое(ые) основание(я) может быть расположено внутри антисмыслового соединения. При наличии двух или более некомплементарных нуклеиновых оснований, они могут быть смежными (т.е., связанными) или несмежными. В одном варианте реализации изобретения некомплементарное нуклеиновое основание расположено в сегменте крыла гэпмера антисмыслового олигонуклеотида.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, которые содержат точно или до 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеиновых оснований, включают не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 некомплементарного(ых) нуклеинового(ых) основания(й) относительно нуклеиновой кислоты-мишени, такой как нуклеиновая кислота ApoCIII или указанная ее часть.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, которые содержат точно или до 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеиновых оснований, содержат не более 6, не более 5, не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 некомплементарного(ых) нуклеинового(ых) основания(й) относительно нуклеиновой кислоты-мишени, такой как нуклеиновая кислота ApoCIII или указанная ее часть.

Антисмысловые соединения, представленные в данном документе, включают также те, которые являются комплементарными части нуклеиновой кислоты-мишени. В данном контексте "часть" относится к некоторому количеству смежных (т.е., связанных) нуклеиновых оснований в пределах области или сегмента нуклеиновой кислоты-мишени. "Часть" также может относиться к определенному количеству смежных нуклеиновых оснований антисмыслового соединения. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения комплементарны к части сегмента-мишени длиной по меньшей мере 8 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения комплементарны к части сегмента-мишени длиной по меньшей мере 10 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения комплементарны к части сегмента-мишени длиной по меньшей мере 12 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения комплементарны к части сегмента-мишени длиной по меньшей мере 15 нуклеиновых оснований. Также предусмотрены антисмысловые соединения, которые комплементарны к части сегмента-мишени длиной по меньшей мере 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более нуклеиновых оснований или с длиной в интервале, определенном любыми двумя из этих значений.

Идентичность

Антисмысловые соединения, представленные в данном документе, также могут иметь определенный процент идентичности конкретной нуклеотидной последовательности, SEQ ID NO или последовательности соединения, представленного конкретным номером Isis, или его частью. В данном контексте антисмысловое соединение идентично последовательности, описанной в данном документе, если оно обладает такой же способностью к спариванию с нуклеиновыми основаниями. Например, РНК, которая содержит урацил вместо тимидина в описанной последовательности ДНК, считалась бы идентичной последовательности ДНК, поскольку и урацил, и тимидин спариваются с аденином. Также предусматриваются укороченные и удлиненные версии антисмысловых соединений, описанных в данном документе, а также соединения, содержащие неидентичные основания относительно антисмысловых соединений, представленных в данном документе. Неидентичные основания могут быть смежными по отношению друг к другу или рассеянными по всему антисмысловому соединению. Процент идентичности антисмыслового соединения вычисляют согласно количеству оснований с идентичным спариванием оснований относительно последовательности, с которой его сравнивают.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения или их части являются по меньшей на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичными одному или более антисмысловых соединений или SEQ ID NO, или их частей, описанных в данном документе.

Модификации

Нуклеозид представляет собой комбинацию основание-сахар. Часть нуклеинового основания (также известного как основание) нуклеозида обычно представляет собой фрагмент гетероциклического основания. Нуклеотиды представляют собой нуклеозиды, которые дополнительно содержат фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида. Для тех нуклеозидов, которые содержат пентофуранозильный сахар, фосфатная группа может быть связана с 2', 3' или 5' гидроксильными фрагментами сахара. Олигонуклеотиды образуются посредством ковалентного связывания смежных нуклеозидов друг с другом с образованием линейного полимерного олигонуклеотида. В пределах структуры олигонуклеотида, фосфатные группы обычно называют образующими межнуклеозидные связи олигонуклеотида.

Модификации антисмысловых соединений включают замены или модификации межнуклеозидных связей, сахарных фрагментов или нуклеиновых оснований. Модифицированные антисмысловые соединения зачастую предпочтительны по сравнению с нативными формами за счет желаемых свойств, таких как, например, улучшенное клеточное поглощение, повышенная аффинность связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью, повышенная стабильность в присутствии нуклеаз или повышенная ингибирующая активность.

Химически модифицированные нуклеозиды также могут быть использованы для повышения аффинности связывания укороченного или усеченного антисмыслового олигонуклеотида с его нуклеиновой кислотой-мишенью. Следовательно, сопоставимые результаты часто могут быть получены с помощью более коротких антисмысловых соединений, которые имеют такие химически модифицированные нуклеозиды.

Модифицированные межнуклеозидные связи

Природная межнуклеозидная связь РНК и ДНК представляет собой 3'-5' фосфодиэфирную связь. Антисмысловые соединения, содержащие одну или более модифицированных, т.е. неприродных межнуклеозидных связей часто предпочтительны по сравнению с антисмысловыми соединениями, содержащими природные межнуклеозидные связи, благодаря желательным свойствам, например, таких как улучшенное клеточное поглощение, повышенная аффинность к нуклеиновым кислотам-мишеням, и повышенная устойчивость в присутствии нуклеаз.

Олигонуклеотиды, имеющие модифицированные межнуклеозидные связи, включают межнуклеозидные связи, которые сохраняют атом фосфора, а также межнуклеозидные связи, которые не имеют атома фосфора. Характерные фосфорсодержащие межнуклеозидные связи, включают, но не ограничиваются ими, фосфодиэфиры, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, фосфорамидат и фосфоротиоаты. Способы получения фосфорсодержащих и не содержащих фосфор связей являются хорошо известными.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту ApoCIII, содержат одну или более модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированные межнуклеозидные связи представляют собой тиофосфатные связи. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая межнуклеозидная связь антисмыслового соединения представляет собой тиофосфатную межнуклеозидную связь.

Модифицированные сахарные фрагменты

Антисмысловые соединения по изобретению необязательно могут содержать один или более нуклеозидов, в которых сахарная группа модифицирована. Такие нуклеозиды с модифицированным сахаром могут придавать антисмысловым соединениями повышенную устойчивость к нуклеазам, повышенную аффинность связывания или некоторые другие полезные биологические свойства. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеозиды содержат химически модифицированные фрагменты рибофуранозного кольца. Примеры химически модифицированных рибофуранозных колец включают, не ограничиваясь ими, добавление групп заместителей (включая 5' и 2' группы заместителей, соединение мостиком негеминальных кольцевых атомов с образованием бициклических нуклеиновых кислот (БНК), замену атома кислорода в рибозильном кольце на S, N(R) или C(R₁)(R₂) (R, R₁ и R₂, каждый независимо, представляют собой Н, С₁-С₁₂ алкил или защитную группу) и их комбинации. Примеры химически модифицированных cахаров включают 2'-F-5'-метил-замещенный нуклеозид (см. международную заявку РСТ WO 2008/101157, опубликованную 8/21/08, где представлены другие описанные 5',2'-бис-замещенные нуклеозиды) или замену атома кислорода рибозильного кольца на S с дополнительным замещением в 2'-положении (см. опубликованную заявку на патент США US 2005-0130923, опубликованную 16 июня 2005 года), или в альтернативном варианте с 5'-замещением БНК (см. международную заявку РСТ WO 2007/134181, опубликованную 11/22/07, где ЗНК замещена, например, 5'-метильной или 5'-винильной группой).

Примеры нуклеозидов, имеющих модифицированные сахарные фрагменты, включают, но не ограничиваясь ими, нуклеозиды, содержащие 5'-винильные, 5'-метильные (R или S), 4'-S, 2'-F, 2'-ОСН₃, 2'-OCH₂CH₃, 2'-OCH₂CH₂F и 2'-O(CH₂)₂ОСН₃ группы заместителей. Заместитель в 2' положении также может быть выбран из аллила, амино, азидо, тио, О-аллила, O-C₁-C₁₀ алкила, OCF₃, OCH₂F, O(CH₂)₂SCH₃, O(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n), O-CH₂-C(=O)-N(R_m)(R_n) и O-CH₂-C(=O)-N(R₁)-(CH₂)₂-N(R_m)(R_n), где каждый R₁, R_m и R_n независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный C₁-С₁₀ алкил.

В данном контексте "бициклические нуклеозиды" относятся к модифицированным нуклеозидам, содержащим бициклический сахарный фрагмент. Примеры бициклических нуклеиновых кислот (БНК) включают, но не ограничиваясь ими, нуклеозиды, содержащие мостик между 4' и 2' атомами рибозильного кольца. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, представленные в данном документе, содержат один или более БНК нуклеозидов, при этом мостик содержит одну из формул:4'-(CH₂)-O-2' (ЗНК); 4'-(CH₂)-S-2'; 4'-(CH₂)₂-O-2' (ЭНК); 4'-СН(СН₃)-O-2' и 4'-СН(CH₂OCH₃)-O-2' (и их аналоги, см. патент США 7399845, выданный 15 июля 2008 года); 4'-С(СН₃)(СН₃)-O-2' (и их аналоги, см. PCT/US 2008/068922, опубликованную как WO 2009/006478 8 января 2009 года); 4'-CH₂-N(OCH₃)-2' (и их аналоги, см. PCT/US 2008/064591, опубликованную как WO/2008/150729 11 декабря 2008 года); 4'-CH₂-O-N(CH₃)-2' (см. опубликованную заявку на патент США US 2004-0171570, опубликованную 2 сентября 2004 года); 4'-CH₂-N(R)-O-2', где R представляет собой Н, C₁-C₁₂ алкил или защитную группу (см. патент США 7427672, выданный 23 сентября 2008 года); 4'-CH₂-С(Н)(СН₃)-2' (см. Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); и 4'-CH₂-C(=CH₂)-2' (и их аналоги, см. PCT/US 2008/066154, опубликованную как WO 2008/154401 8 декабря 2008 года).

Дополнительные бициклические нуклеозиды описаны в опубликованной литературе (см., например: Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372; Elayadi et al., Curr. Opinion Inverts. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 2000, 97, 5633-5638; Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett.,1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem.,1998, 63, 10035-10039; патенты США №: 7399845; 7053207; 7034133; 6794499; 6770748; 6670461; 6525191; 6268490; публикации патентов США №: US 2008-0039618; US 2007-0287831; US 2004-0171570; заявки на патент США, серийные номера: 12/129154; 61/099844; 61/097787; 61/086231; 61/056564; 61/026998; 61/026995; 60/989574; международные заявки WO 2007/134181; WO 2005/021570; WO 2004/106356; WO 94/14226; и международные заявки РСТ №: PCT/US 2008/068922; PCT/US 2008/066154; и PCT/US 2008/064591). Каждый из указанных бициклических нуклеозидов может быть получен с одной или более стереохимическими конфигурациями сахара, включая, например, α-L-рибофуранозу и β-D-рибофуранозу (см. международную заявку РСТ PCT/DK98/00393, опубликованную 25 марта 1999 года как WO 99/14226).

В данном контексте "моноциклические нуклеозиды" относятся к нуклеозидам, содержащим модифицированные сахарные фрагменты, которые не являются бициклическими сахарными фрагментами. В некоторых вариантах реализации изобретения сахарный фрагмент или аналог сахарного фрагмента нуклеозида может быть модифицирован или замещен в любом положении.

В данном контексте "4'-2' бициклический нуклеозид" или "4' к 2' бициклический нуклеозид" относится к бициклическому нуклеозиду, содержащему фуранозное кольцо, содержащее мостик, соединяющий два атома углерода фуранозного кольца, соединяющий 2' атом углерода и 4' атом углерода сахарного кольца.

В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические сахарные фрагменты нуклеозидов БНК включают, но не ограничиваются ими, соединения, имеющие по меньшей мере один мостик между 4' и 2' атомами углерода пентофуранозильного сахарного фрагмента, включая, без ограничения, мостики, содержащие 1 или от 1 до 4 связанных групп, независимо выбранных из -[C(R_a)(R_b)]_n-, -C(R_a)=C(R_b)-, -C(R_a)=N-, -C(=NR_a)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R_a)₂-, -S(=O)_x- и -N(R_a)-; где: x равен 0, 1 или 2; n равен 1, 2, 3 или 4; каждый R_a и R_b независимо представляет собой Н, защитную группу, гидроксил, С₁-С₁₂ алкил, замещенный С₁-С₁₂ алкил, С₂-С₁₂ алкенил, замещенный С₂-С₁₂ алкенил, С₂-С₁₂ алкинил, замещенный С₂-С₁₂ алкинил, C₅-C₂₀ арил, замещенный С₅-С₂₀ арил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, гетероарил, замещенный гетероарил, С₅-С₇ алициклический радикал, замещенный С₅-С₇ алициклический радикал, галоген, OJ₁, NJ₁J₂, SJ₁, N₃, COOJ₁, ацил (С(=O)-Н), замещенный ацил, CN, сульфонил (S(=O)₂-J₁) или сульфоксил (S(=O)-J₁); и

каждый J₁ и J₂ независимо представляет собой Н, С₁-С₁₂ алкил, замещенный С₁-С₁₂ алкил, С₂-С₁₂ алкенил, замещенный С₂-С₁₂ алкенил, С₂-С₁₂ алкинил, замещенный С₂-С₁₂ алкинил, С₅-С₂₀ арил, замещенный С₅-С₂₀ арил, ацил (С(=O)-Н), замещенный ацил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, С₁-С₁₂ аминоалкил, замещенный С₁-С₁₂ аминоалкил или защитную группу.

В некоторых вариантах реализации изобретения мостик бициклического сахарного фрагмента представляет собой -[C(R_a)(R_b)]_n-, -[C(R_a)(R_b)]_n-O-, -C(R_aR_b)-N(R)-O- или -C(R_aR_b)-O-N(R)-. В некоторых вариантах реализации изобретения мостик представляет собой 4'-CH₂-2', 4'-(CH₂)₂-2', 4'-(CH₂)₃-2', 4'-CH₂-O-2', 4^,-(CH₂)₂-O-2', 4'-CH₂-O-N(R)-2' и 4'-CH₂-N(R)-O-2'-, где каждый R независимо представляет собой Н, защитную группу или C₁-С₁₂ алкил.

В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды дополнительно определяют по изомерной конфигурации. Например, нуклеозид, содержащий мостик 4'-(CH₂)-O-2', может быть в α-L конфигурации или в β-D конфигурации. Ранее α-L-метиленокси (4'-CH₂-O-2') БНК были внедрены в антисмысловые олигонуклеотиды, которые демонстрировали антисмысловую активность (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).

В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды включают нуклеозиды, имеющие 4'-2' мостик, где такие мостики включают, без ограничения, α-L-4'-(CH₂)-O-2', β-D-4'-CH₂-O-2', 4'-(CH₂)₂-O-2', 4'-CH₂-O-N(R)-2', 4'-CH₂-N(R)-O-2', 4'-CH(CH₃)-O-2', 4'-CH₂-S-2', 4'-CH₂-N(R)-2', 4'-CH₂-СН(СН₃)-2' и 4'-(CH₂)₃-2', где R представляет собой Н, защитную группу или С₁-С₁₂ алкил.

В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды имеют формулу:

где:

Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;

-Q_a-Q_b-Q_c- представляет собой -CH₂-N(R_c)-CH₂-, -C(=O)-N(R_c)-CH₂-, -CH₂-O-N(R_c)-, -CH₂-N(R_c)-O- или -N(R_c)-O-CH₂;

R_c представляет собой C₁-C₁₂ алкил или аминозащитную группу; и

Т_а и T_b, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, группу конъюгата, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки.

В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды имеют формулу:

где:

Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;

Т_а и T_b, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, группу конъюгата, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки;

Z_a представляет собой C₁-С₆ алкил, С₂-С₆ алкенил, С₂-С₆ алкинил, замещенный C₁-С₆ алкил, замещенный С₂-С₆ алкенил, замещенный С₂-С₆ алкинил, ацил, замещенный ацил, замещенный амид, тиол или замещенный тиол.

В одном варианте реализации изобретения каждая из замещенных групп независимо является моно или полизамещенной группами заместителей, выбранными из галогена, оксо, гидроксила, OJ_c, NJ_сJ_d, SJ_с, N₃, OC(=X)J_c и NJ_eC(=X)NJ_cJ_d, где каждый J_c, J_d и J_e независимо представляет собой Н, C₁-С₆ алкил или замещенный C₁-С₆ алкил, и X представляет собой О или NJ_c.

В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды имеют формулу:

где:

Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;

Т_а и Т_b, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, группу конъюгата, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки;

Z_b представляет собой C₁-С₆ алкил, C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил, замещенный C₁-С₆ алкил, замещенный C₂-C₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкинил или замещенный ацил (С(=O)-).

В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды имеют формулу:

где:

Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;

Т_а и Т_b, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, группу конъюгата, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки;

R_d представляет собой C₁-С₆ алкил, замещенный C₁-С₆ алкил, C₂-C₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил или замещенный C₂-C₆ алкинил;

каждый q_a, q_b, q_c и q_d независимо представляет собой Н, галоген, C₁-C₆ алкил, замещенный C₁-С₆ алкил, C₂-C₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил или замещенный C₂-C₆ алкинил, C₁-С₆ алкоксил, замещенный C₁-С₆ алкоксил, ацил, замещенный ацил, C₁-С₆ аминоалкил или замещенный C₁-С₆ аминоалкил;

В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды имеют формулу:

где:

Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;

Т_а и Т_b, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, группу конъюгата, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки;

q_a, q_b, q_e и q_f, каждый независимо, представляют собой водород, галоген, C₁-C₁₂ алкил, замещенный C₁-C₁₂ алкил, C₂-C₁₂ алкенил, замещенный C₂-C₁₂ алкенил, C₂-C₁₂ алкинил, замещенный C₂-C₁₂ алкинил, C₁-C₁₂ алкокси, замещенный C₁-C₁₂ алкокси, OJ_j, SJ_j, SOJ_j, SO₂J_j, NJ_jJ_k, N₃, CN, C(=O)OJ_j, C(=O)NJ_jJ_k, C(=O)J_j, O-C(=O)NJ_jJ_k, N(H)C(=NH)NJ_jJ_k, N(H)C(=O)NJ_jJ_k или N(H)C(=S)NJ_jJ_k;

или q_e и q_f вместе представляют собой =C(q_g)(q_h);

q_g и q_h, каждый независимо, представляют собой Н, галоген, C₁-C₁₂ алкил или замещенный C₁-C₁₂ алкил.

Описаны синтез и получение бициклических нуклеозидов аденина, цитозина, гуанина, 5-метилцитозина, тимина и урацила, имеющих мостик 4'-CH₂-O-2', а также их олигомеризация и свойства распознавания нуклеиновых кислот (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Описан также синтез бициклических нуклеозидов в WO 98/39352 и WO 99/14226.

Были также получены аналоги различных бициклических нуклеозидов, которые имеют 4'-2' мостиковые группы, такие как 4'-CH₂-O-2' и 4'-CH₂-S-2' (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett, 1998, 8, 2219-2222). Описано также получение олигодезоксирибонуклеотидных дуплексов, содержащих бициклические нуклеозиды, для применения в качестве субстратов для полимераз нуклеиновых кислот (Wengel et al., WO 99/14226). Кроме того, в данной области техники описан синтез 2'-амино-БНК, нового конформационно ограниченного высокоаффинного аналога олигонуклеотида (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Кроме того, ранее были получены 2'-амино- и 2'-метиленамино БНК, и была описана термостабильность их дуплексов с комплементарными нитями РНК и ДНК.

В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды имеют формулу:

где:

Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;

Т_а и Т_b, каждый независимо, представляют собой Н, гидрокси-защитную группу, группу конъюгата, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки;

каждый q_i, d_j, q_k и q₁ независимо представляет собой Н, галоген, C₁-C₁₂ алкил, замещенный C₁-C₁₂ алкил, C₂-C₁₂ алкенил, замещенный C₂-C₁₂ алкенил, C₂-C₁₂ алкинил, замещенный C₂-C₁₂ алкинил, C₁-C₁₂ алкоксил, замещенный C₁-C₁₂ алкоксил, OJ_j, SJ_j, SOJ_j, SO₂J_j, NJ_jJ_k, N₃, CN, C(=O)OJ_j, C(=O)NJ_jJ_k, C(=O)J_j, O-C(=O)NJ_jJ_k, N(H)C(=NH)NJ_jJ_k, N(H)C(=O)NJ_jJ_k или N(H)C(=S)NJ_jJ_k; и

q_i и q_j или q_l и q_k вместе представляют собой =C(q_g)(q_h), где q_g и q_h, каждый независимо, представляют собой Н, галоген, C₁-C₁₂ алкил или замещенный C₁-C₁₂ алкил.

Описан один карбоциклический бициклический нуклеозид, имеющий мостик 4'-(CH₂)₃-2', и мостик из аналога алкенила 4'-СН=СН-CH₂-2' (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 и Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). Описан также синтез и получение карбоциклических бициклических нуклеозидов вместе с их олигомеризацией и биохимическими исследованиями (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129 (26), 8362-8379).

В некоторых вариантах реализации изобретения бициклические нуклеозиды включают, но не ограничиваются ими, (А) α-L-метиленокси (4'-CH₂-O-2') БНК, (В) β-D-метиленокси (4'-CH₂-O-2') БНК, (С) этиленокси (4'-(CH₂)₂-O-2') БНК, (D) аминоокси (4'-CH₂-O-N(R)-2') БНК, (Е) оксиамино (4'-CH₂-N(R)-O-2') БНК, (F) метил(метиленокси) (4'-СН(CH₃)-O-2') БНК (также называемый стерически затрудненным этилом или cEt), (G) метилентио (4'-CH₂-S-2') БНК, (Н) метиленамино (4'-CH₂-N(R)-2') БНК, (I) метилкарбоциклическую (4'-CH₂-СН(CH₃)-2') БНК, (J) пропиленкарбоциклическую (4'-(CH₂)₃-2') БНК и (K) винил-БНК, как показано ниже.

где Вх представляет собой фрагмент основания, a R независимо представляет собой Н, защитную группу, C₁-C₆ алкил или C₁-С₆ алкокси.

В данном контексте термин "модифицированный тетрагидропирановый нуклеозид" или "модифицированный ТГП нуклеозид" означает нуклеозид, имеющий шестичленный тетрагидропирановый "сахар", заменивший пентофуранозильный остаток в обычных нуклеозидах, и он может быть упомянут как заменитель сахара. ТГП-модифицированные нуклеозиды включают, но не ограничиваются ими, те, которые в данной области техники называют гекситоловой нуклеиновой кислотой (ГНК), анитоловой нуклеиновой кислотой (АНК), манитоловой нуклеиновой кислотой (МНК) (см. Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) или фтор-ГНК (F-ГНК), имеющие тетрагидропирановую кольцевую систему, как показано ниже.

В некоторых вариантах реализации изобретения выбраны заменители сахара, имеющие формулу:

где:

Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;

Т₃ и Т₄, каждый независимо, представляют соой межнуклеозидную линкерную группу, связывающую аналог тетрагидропиранового нуклеозида с олигомерным соединением, или один из Т₃ и Т₄ представляет собой межнуклеозидную линкерную группу, связывающую аналог тетрагидропиранового нуклеозида с олигомерным соединением или олигонуклеотидом, а другой из Т₃ и Т₄ представляет собой Н, гидроксил-защитную группу, связанную группу конъюгата или 5' или 3'-концевую группу;

q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇, каждый независимо, представляют собой Н, C₁-С₆ алкил, замещенный C₁-С₆ алкил, C₂-C₆ алкенил, замещенный С₂-С₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил или замещенный C₂-C₆ алкинил; и

один из R₁ и R₂ представляет собой водород, а другой выбран из галогена, замещенного или незамещенного алкокси, NJ₁J₂, SJ₁, N₃, OC(=X)J₁, OC(=X)NJ₁J₂, NJ₃C(=X)NJ₁J₂ и CN, где X представляет собой О, S или NJ₁, и каждый J₁, J₂ и J₃ независимо представляет собой Н или C₁-С₆ алкил.

В некоторых вариантах реализации изобретения каждый q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇ представляет собой H. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один из q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇ отличен от H. В некоторых вариантах реализации изобретения по меньшей мере один из q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆ и q₇ представляет собой метил. В некоторых вариантах реализации изобретения предложены ТГП нуклеозиды, в которых один из R₁ и R₂ представляет собой F. В некоторых вариантах реализации изобретения R₁ представляет собой фтор, a R₂ представляет собой Н; R₁ представляет собой метокси, a R₂ представляет собой Н, и R₁ представляет собой метоксиэтокси, a R₂ представляет собой Н. В некоторых вариантах реализации изобретения заменители сахара содержат кольца, имеющие более 5 атомов и более одного гетероатома. Например, описаны нуклеозиды, содержащие морфолиносахарные фрагменты, и их применение в олигомерных соединениях (см., например: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; и патенты США 5698685; 5166315; 5185444; и 5034506). В данном контексте термин "морфолино" означает заменитель сахара, имеющий следующую формулу:

В некоторых вариантах реализации изобретения морфолиновые фрагменты могут быть модифицированными, например, введением или модификацией различных заместителей, по сравнению с упомянутой выше структурой морфолино. Такие заменители сахара в данном контексте называют "модифицированными морфолино".

Предложены также комбинации модификаций, без ограничения, такие как 2'-F-5'-метил-замещенные нуклеозиды (см. международную заявку РСТ WO 2008/101157, опубликованную 8/21/08, где описаны другие 5',2'-бис-замещенные нуклеозиды) и замену рибозильного кольцевого атома кислорода на S с дополнительным замещением в 2'-положении (см. опубликованнуюзаявку на патент США US 2005-0130923, опубликованную 16 июня 2005 года) или в альтернативном варианте с 5'-замещением бициклической нуклеиновой кислоты (см. международную заявку РСТ WO 2007/134181, опубликованную 11/22/07, где 4'-CH₂-O-2' бициклический нуклеозид дополнительно замещен в 5' положении 5'-метильной или 5'-винильной группой). Описан также синтез и получение карбоциклических бициклических нуклеозидов вместе с их олигомеризацией и биохимическими исследованиями (см., например, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129 (26), 8362-8379).

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения содержат один или более модифицированных циклогексенильных нуклеозидов, которые представляют собой нуклеозиды, имеющие шестичленный циклогексенил вместо пентофуранозильного остатка в природных нуклеозидах. Модифицированные циклогексенильные нуклеозиды включают, но не ограничиваются ими, нуклеозиды, описанные в данной области техники (см., например, параллельную опубликованную заявку РСТ WO 2010/036696, опубликованную 10 апреля, 2010, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130(6), 1979-1984; et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al, J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(30), 9340-9348; Gu et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F:Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61(6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001, 29(24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, 20(4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; опубликованную заявку РСТ WO 06/047842; и опубликованную заявку РСТ WO 01/049687; полное содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки). Некоторые модифицированные циклогексенильные нуклеозиды имеют формулу X.

где независимо для каждого указанного по меньшей мере одного циклогексенильного нуклеозидного аналога формулы X:

Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;

Т₃ и Т₄, каждый независимо, представляют собой межнуклеозидную линкерную группу, которая связывает циклогексенильный нуклеозидный аналог с антисмысловым соединением, или один из Т₃ и Т₄ представляет собой межнуклеозидную линкерную группу, которая связывает тетрагидропирановый нуклеозидный аналог с антисмысловым соединением, а другой из Т₃ и Т₄ представляет собой Н, гидроксил-защитную группу, связанную группу конъюгата или 5'-или 3'-концевую группу; и

q₁, q₂, q₃, q₄, q₅, q₆, q₇, q₈ и q₉, каждый независимо, представляют собой Н, C₁-С₆ алкил, замещенный C₁-С₆ алкил, C₂-C₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил, замещенный C₂-C₆ алкинил или другие группы-заместители сахара.

В данной области техники известны также многие другие моноциклические, бициклические и трициклические кольцевые системы, и они подходят в качестве заменителей сахара, которые могут быть использованы для модификации нуклеозидов для внедрения в олигомерные соединения, предложенные в данном документе (см., например, обзорную статью: Leumann, Christian J. Bioorg. & Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Такие кольцевые системы могут быть подвергнуты различным дополнительным замещениям для дополнительного повышения их активности.

В данном контексте "2'-модифицированный сахар" означает фуранозильный сахар, модифицированный в 2' положении. В некоторых вариантах реализации изобретения такие модификации включают заместители, выбранные из: галогенидов, включая, но не ограничиваясь ими, замещенный и незамещенный алкокси, замещенный и незамещенный тиоалкил, замещенный и незамещенный аминоалкил, замещенный и незамещенный алкил, замещенный и незамещенный аллил и замещенный и незамещенный алкинил. В некоторых вариантах реализации изобретения 2' модификации выбраны из заместителей, включающих, но не ограничиваясь ими: O[(CH₂)_nО]_mCH₃, O(CH₂)_nNH₂, O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_nF, O(CH₂)_nONH₂, OCH₂C(=O)N(H)CH₃ и O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃]₂, где n и m равны от 1 до около 10. Другие 2' группы заместителей также могут быть выбраны из: C₁-C₁₂ алкила, замещенного алкила, алкенила, алкинила, алкарила, аралкила, О-алкарила или О-аралкила, SH, SCH₃, OCN, Cl, Br, CN, F, CF₃, OCF₃, SOCH₃, SO₂CH₃, ONO₂, NO₂, N₃, NH₂, гетероциклоалкила, гетероциклоалкарила, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенного силила, РНК расщепляющей группы, репортерной группы, интеркалятора, группы для улучшения фармакокинетических свойств или группы для улучшения фармакодинамических свойств антисмыслового соединения, и других заместителей с подобными свойствами. В некоторых вариантах реализации модифицированные нуклеозиды содержат 2'-МОЕ боковую цепь (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Такие 2'-MOE замещения описаны как улучшающие аффинность связывания по сравнению с немодифицированными нуклеозидами и с другими модифицированными нуклеозидами, такими как 2'-О-метил, O-пропил и О-аминопропил. Было показано, что олигонуклеотиды, имеющие 2'-МОЕ заместитель, являются антисмысловыми ингибиторами экспрессии генов с перспективными возможностями для применения in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; и Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).

В данном контексте "2'-модифицированный" или "2'-замещенный" относится к нуклеозиду, содержащему сахар, содержащий заместитель в 2' положении, отличный от Н или ОН. 2'-модифицированные нуклеозиды включают, но не ограничиваются ими, бициклические нуклеозиды, в которых мостик, соединяющий два атом углерода сахарного кольца, соединяет 2' атом углерода и другой атом углерода сахарного кольца; и нуклеозиды с немостиковыми 2' заместителями, такими как аллил, амино, азидо, тио, О-аллил, O-C₁-C₁₀ алкил, -OCF₃, O-(CH₂)₂-O-СН₃, 2'-O(CH₂)₂SCH₃, O-(CH₂)₂-O-N(R_m)(R_n), or O-CH₂-C(=O)-N(R_m)(R_n), где каждый R_m и R_n независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный C₁-С₁₀ алкил. 2'-модифицированные нуклеозиды могут также содержать другие модификации, например, в других положениях сахара и/или нуклеотидного основания.

В данном контексте "2'-F" относится к нуклеозиду, содержащему сахар, содержащий группу фтора в 2' положении сахарного кольца.

В данном контексте "2'-ОМе" или "2'-ОСН₃", "2'-O-метил" или "2'-метокси" относятся к нуклеозиду, содержащему сахар, содержащий группу -ОCH₃ в 2' положении сахарного кольца.

В данном контексте "МОЕ" или "2'-МОЕ", или "2'-ОCH₂CH₂ОCH₃", или "2'-O-метоксиэтил" относится к нуклеозиду, содержащему сахар, содержащий группу -ОCH₂CH₂ОСН₃ в 2' положении сахарного кольца.

Способы получения модифицированных сахаров хорошо известны специалистам в данной области техники. Некоторые иллюстративные патенты США, которые описывают получение таких модифицированных сахаров, включают, без ограничения, патенты США: 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5670633; 5700920; 5792847 и 6600032 и международную заявку PCT/US 2005/019219, поданную 2 июня 2005 года и опубликованную как WO 2005/121371 12 декабря 2005 года, содержание каждого из которых в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.

В данном контексте "олигонуклеотид" относится к соединению, содержащему множество связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения один или более из множества нуклеозидов являются модифицированными. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит один или более рибонуклеозидов (РНК) и/или дезоксирибонуклеозидов (ДНК).

В нуклеотидах, имеющих модифицированные сахарные фрагменты, фрагменты нуклеиновых оснований (природные, модифицированные или их комбинации) сохраняются для гибридизации с соответствующей нуклеиновой кислотой-мишенью.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения содержат один или более нуклеозидов, имеющих модифицированные сахарные фрагменты. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный сахарный фрагмент представляет собой 2'-МОЕ. В некоторых вариантах реализации 2'-МОЕ модифицированные нуклеозиды расположены в гэпмерном мотиве. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированный сахарный фрагмент представляет собой бициклический нуклеозид, имеющий мостиковую группу (4'-СН(CH₃)-O-2'). В некоторых вариантах реализации изобретения (4'-СН(CH₃)-O-2') модифицированные нуклеозиды расположены в крыльях гэпмерного мотива.

Модифицированные нуклеиновые основания

Модификации или замещения нуклеинового основания (или основания) структурно отличаются, хотя по-прежнему функционально взаимозаменяемы с природными или синтетическими немодифицированными нуклеиновыми основаниями. Природные и модифицированные нуклеиновые основания могут участвовать в водородном связывании. Такие модификации нуклеиновых оснований могут влиять на стабильность к действию нуклеаз, аффинность связывания или некоторые другие полезные биологические свойства антисмысловых соединений. Модифицированные нуклеиновые основания включают синтетические и природные нуклеиновые основания, такие как, например, 5-метилцитозин (5-me-C). Некоторые замещения нуклеиновых оснований, включая 5-метилцитозиновые замещения, особенно подходят для повышения аффинности связывания антисмыслового соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью. Например, было показано, что 5-метилцитозиновые замещения повышают стабильность дуплекса нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.Т. and Lebleu, В., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).

Дополнительные модифицированные нуклеиновые основания включают 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинил (-C≡C-CH₃) урацил и цитозин и другие алкинильные производные пиримидиновых оснований, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 2-F-аденин, 2-аминоаденин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-дезазагуанин и 7-дезазааденин, и 3-дезазагуанин и 3-дезазааденин.

Фрагменты гетероциклических оснований могут включать те, в которых пуриновое или пиримидиновое основание заменено другими гетероциклами, например, 7-дезазааденин, 7-дезазагуанозин, 2-аминопиридин и 2-пиридон. Нуклеиновые основания, которые особенно подходят для повышения аффинности связывания антисмысловых соединений, включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и O-6 замещенные пурины, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту АроСIII, включают одно или более модифицированных нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения гэп-расширенные антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на нуклеиновую кислоту АроСIII, содержат одно или более модифицированных нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированное нуклеиновое основание представляет собой 5-метилцитозин. В некоторых вариантах каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.

Некоторые мотивы и механизмы антисмысловых соединений

В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения имеют химически модифицированные субъединицы, организованные в паттерны или мотивы, для придания антисмысловым соединениям таких свойств, как усиленная ингибирующая активность, повышенная аффинность связывания с целевой нуклеиновой кислотой или устойчивость к разложению нуклеазами in vivo.

Как правило, химерные антисмысловые соединения содержат по меньшей мере одну область, модифицированную таким образом, чтобы придать повышенную устойчивость к разложению под действием нуклеаз, усиление клеточного поглощения, повышенную аффинность связывания с целевой нуклеиновой кислотой, и/или повышенную ингибирующую активность. Вторая область химерного антисмыслового соединения может придавать другое желаемое свойство, например, служить в качестве субстрата для клеточной эндонуклеазы РНКазы Н, которая расщепляет нить РНК в дуплексе РНК ДНК.

Антисмысловая активность может быть результатом любого механизма, затрагивающего гибридизацию антисмыслового соединения (например, олигонуклеотида) с целевой нуклеиновой кислотой, при этом гибридизация в конечном итоге приводит к биологическому эффекту. В некоторых вариантах реализации изобретения модулируют количество и/или активность нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения уменьшают количество и/или активность нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения гибридизация антисмыслового соединения с целевой нуклеиновой кислотой в конечном итоге приводит к разложению целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения гибридизация антисмыслового соединения с целевой нуклеиновой кислотой не приводит к разложению целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых таких вариантах реализации изобретения наличие антисмыслового соединения, гибридизированного с целевой нуклеиновой кислотой (занятость) приводит к модулированию антисмысловой активности. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, имеющие определенный химический мотив или паттерн химических модификаций, особенно подходят для использования одного или более механизмов. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения действуют более чем по одному механизму и/или по неустановленным механизмам. Соответственно, антисмысловые соединения, описанные в данном документе, не ограничены конкретным механизмом.

Антисмысловые механизмы включают, без ограничения, антисенс, опосредованный РНКазой Н; механизмы РНКи, в которых участвует каскад RISC и которые включают, без ограничения, механизмы миРНК, кшРНК и микроРНК; и механизмы на основе занятости. Некоторые антисмысловые соединения могут действовать более чем по одному такому механизму и/или по дополнительным механизмам.

Антисенс, опосредованный РНКазой Н

В некоторых вариантах реализации изобретений антисмысловая активность по меньшей мере частично обусловлена разрушением РНК-мишени под действием РНКазы Н. РНКаза Н представляет собой клеточную эндонуклеазу, которая расщепляет спираль РНК дуплекса РНК:ДНК. В данной области техники известно, что односпиральные антисмысловые соединения, которые являются "ДНК-подобными", вызывают активность РНКазы Н в клетках млекопитающих. Соответственно, антисмысловые соединения, содержащие по меньшей мере часть ДНК или ДНК-подобных нуклеозидов, могут активировать РНКазу Н, приводя к расщеплению нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, использующие РНКазу Н, содержат один или более модифицированных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения такие антисмысловые соединения содержат по меньшей мере один блок из 1-8 модифицированных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения модифицированные нуклеозиды не поддерживают активность РНКазы Н. В некоторых вариантах реализации изобретения такие антисмысловые соединения представляют собой гэпмеры, как описано в данном документе. В некоторых таких вариантах реализации изобретения гэп гэпмера содержит нуклеозиды ДНК. В некоторых таких вариантах реализации изобретения гэп гэпмера содержит ДНК-подобные нуклеозиды. В некоторых таких вариантах реализации изобретения гэп гэпмера содержит нуклеозиды ДНК и ДНК-подобные нуклеозиды.

Некоторые антисмысловые соединения, имеющие гэпмерный мотив, считают химерными антисмысловыми соединениями. В гэпмере внутренняя область, имеющая множество нуклеотидов, которые поддерживают расщепление РНКазой Н, расположена между внешними областями, имеющими множество нуклеотидов, химически отличающихся от нуклеозидов внутренней области. В случае антисмыслового олигонуклеотида, имеющего гэпмерный мотив, сегмент гэпа, как правило, служит в качестве субстрата для расщепления эндонуклеазой, в то время как сегменты крыла содержат модифицированные нуклеозиды. В некоторых вариантах реализации изобретения области гэпмера различаются по типам сахарных фрагментов в составе каждой отдельной области. Типы сахарных фрагментов, которые используют для дифференциации областей гэпмера, в некоторых вариантах реализации изобретения могут включать β-D-рибонуклеозиды, β-D-дезоксирибонуклеозиды, 2'-модифицированные нуклеозиды (такие 2'-модифицированные нуклеозиды могут включать, среди прочего, 2'-МОЕ и 2'-O-CH₃) и модифицированные бициклическими сахарами нуклеозиды (такие модифицированные бициклическими сахарами нуклеозиды могут включать те, которые содержат стерически затрудненный этил). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеозиды в крыльях могут включать несколько модифицированных сахарных фрагментов, включая, например, 2'-МОЕ и бициклические сахарные фрагменты, такие как фрагменты со стерически затрудненным этилом или ЗНК. В некоторых вариантах реализации изобретения крылья могут включать несколько модифицированных и немодифицированных сахарных фрагментов. В некоторых вариантах реализации изобретения крылья могут содержать различные комбинации 2'-МОЕ нуклеозидов, бициклических сахарных фрагментов, таких как нуклеозиды со стерически затрудненным этилом или ЗНК нуклеозиды, и 2'-дезоксинуклеозидов.

Каждая отдельная область может содержать одинаковые сахарные фрагменты, различные или чередующиеся сахарные фрагменты. Мотив крыло-гэп-крыло часто описывают как "X-Y-Z", где "X" означает длину 5' крыла, "Y" означает длину гэпа, a "Z" означает длину 3' крыла. "X" и "Z" могут содержать одинаковые, различные или чередующиеся сахарные фрагменты. В некоторых вариантах реализации "X" и "Y" могут содержать один или более 2'-дезоксинуклеозида. "Y" может содержать 2'-дезоксинуклеозиды. В данном контексте гэпмер, описанный как "X-Y-Z", имеет такую конфигурацию, что гэп расположен непосредственно рядом каждого из 5' крыла и 3' крыла. Таким образом, между 5'-крылом и гэп или гэп и 3'-крылом нет промежуточных нуклеотидов. Любое из антисмысловых соединении, описанных в данном документе, может иметь гэпмерный мотив. В некоторых вариантах реализации изобретения "X" и "Z" являются одинаковыми; в других вариантах реализации они различны. В некоторых вариантах реализации изобретения "Y" составляет от 8 до 15 нуклеозидов. X, Y или Z могут составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 или более нуклеозидов.

В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту АРОСIII, имеет гэпмерный мотив, в котором гэп состоит из 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 связанных нуклеозидов.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловой олигонуклеотид имеет сахарный мотив, описанный формулой А, представленной ниже: (J)_m-(В)_n-(J)_р-(В)_r-(A)_t-(D)_g-(A)_v-(B)_w-(J)_x-(B)_y-(J)_z

где:

каждый А независимо представляет собой 2'-замещенный нуклеозид;

каждый В независимо представляет собой бициклический нуклеозид;

каждый J независимо представляет собой либо 2'-замещенный нуклеозид, либо 2'-дезоксинуклеозид;

каждый D представляет собой 2'-дезоксинуклеозид;

m равен 0-4; n равен 0-2; р равен 0-2; r равен 0-2; t равен 0-2; v равен 0-2; w равен 0-4; x равен 0-2; y равен 0-2; z равен 0-4; g равен 6-14;

при условии, что:

по меньшей мере один из m, n и r отличен от 0;

по меньшей мере один из w и y отличен от 0;

сумма m, n, p, r и t равна от 2 до 5; и

сумма v, w, х, y и z равна от 2 до 5.

Соединения РНКи

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения представляют собой соединения интерферирующей РНК (РНКи), которые включают двухцепочечные соединения РНК (также называемые малой интерферирующей РНК или миРНК) и одноцепочечные соединения РНКи (или оцРНК). Такие соединения по меньшей мере частично действуют по пути RISC для разрушения и/или изолирования нуклеиновой кислоты-мишени (следовательно, включают соединения микроРНК/микроРНК-миметики). В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения содержат модификации, которые делают их особенно подходящими для таких механизмов.

i. Соединения оцРНК

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, включая соединения, особенно подходящие для применения в качестве одноцепочечных РНКи соединений (оцРНК), содержат модифицированный 5'-терминальный конец. В некоторых таких вариантах реализации изобретения 5'-терминальный конец содержит модифицированный фосфатный фрагмент. В некоторых вариантах реализации изобретения такой модифицированный фосфат является стабилизированным (например, устойчивым к разложению/расщеплению по сравнению с немодифицированным 5'-фосфатом). В некоторых вариантах реализации изобретения такие 5'-концевые нуклеозиды стабилизируют 5'-фосфорный фрагмент. Некоторые модифицированные 5'-концевые нуклеозиды могут быть найдены в данной области техники, например, в WO/2011/139702.

В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-нуклеозид соединения оцРНК имеет формулу IIс:

где:

T₁ представляет собой необязательно защищенный фосфорный фрагмент;

Т₂ представляет собой межнуклеозидную линкерную группу, связывающую соединение формулы IIс с олигомерным соединением;

А имеет одну из формул:

или

Q₁ и Q₂, каждый независимо, представляют собой Н, галоген, C₁-С₆ алкил, замещенный C₁-С₆ алкил, C₁-С₆ алкокси, замещенный C₁-С₆ алкокси, C₂-C₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил, замещенный C₂-C₆ алкинил или N(R₃)(R₄);

Q₃ представляет собой О, S, N(R₅) или C(R₆)(R₇);

каждый R₃, R₄ R₅, R₆ и R₇ независимо представляет собой Н, C₁-С₆ алкил, замещенный C₁-С₆ алкил или C₁-С₆ алкокси;

М₃ представляет собой О, S, NR₁₄, C(R₁₅)(R₁₆), C(R₁₅)(R₁₆)C(R₁₇)(R₁₈), C(R₁₅)=C(R₁₇), OC(R₁₅)(R₁₆) или OC(R₁₅)(Bx₂);

R₁₄ представляет собой H, C₁-С₆ алкил, замещенный C₁-С₆ алкил, C₁-С₆ алкокси, замещенный C₁-С₆ алкокси, C₂-C₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил или замещенный C₂-C₆ алкинил;

R₁₅, R₁₆, R₁₇ и R₁₈, каждый независимо, представляют собой Н, галоген, C₁-С₆ алкил, замещенный C₁-С₆ алкил, C₁-С₆ алкокси, замещенный C₁-С₆ алкокси, C₂-C₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил или замещенный C₂-C₆ алкинил;

Bx₁ представляет собой фрагмент гетероциклического основания;

или если присутствует Вх₂, то Вх₂ представляет собой фрагмент гетероциклического основания, a Bx₁ представляет собой Н, галоген, C₁-С₆ алкил, замещенный C₁-С₆ алкил, C₁-С₆ алкокси, замещенный C₁-С₆ алкокси, C₂-C₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил или замещенный C₂-C₆ алкинил;

J₄, J₅, J₆ и J₇, каждый независимо, представляют собой Н, галоген, C₁-С₆ алкил, замещенный C₁-С₆ алкил, C₁-С₆ алкокси, замещенный C₁-С₆ алкокси, C₂-C₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил или замещенный C₂-C₆ алкинил;

или J₄ образует мостик с одним из J₅ или J₇, где указанный мостик состоит из 1-3 связанных бирадикальных групп, выбранных из О, S, NR₁₉, C(R₂₀)(R₂₁), C(R₂₀)=C(R₂₁), C[=C(R₂₀)(R₂₁)] и С(=O), а другие два из J₅, J₆ и J₇, каждый независимо, представляют собой Н, галоген, C₁-С₆ алкил, замещенный C₁-С₆ алкил, C₁-С₆ алкокси, замещенный C₁-С₆ алкокси, C₂-C₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил или замещенный C₂-C₆ алкинил;

каждый R₁₉, R₂₀ и R₂₁ независимо представляет собой Н, C₁-С₆ алкил, замещенный C₁-С₆ алкил, C₁-С₆ алкокси, замещенный C₁-С₆ алкокси, C₂-C₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил или замещенный C₂-C₆ алкинил;

G представляет собой Н, ОН, галоген или O-[C(R₈)(R₉)]_n-[(C=O)_m-X₁]_j-Z;

каждый R₈ и R₉ независимо представляет собой Н, галоген, C₁-C₆ алкил или замещенный C₁-С₆ алкил;

X₁ представляет собой О, S или N(E₁);

Z представляет собой Н, галоген, C₁-С₆ алкил, замещенный C₁-С₆ алкил, C₂-C₆ алкенил, замещенный C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил, замещенный C₂-C₆ алкинил или N(E₂)(E₃);

E₁, Е₂ и Е₃, каждый независимо, представляют собой Н, C₁-С₆ алкил или замещенный C₁-С₆ алкил;

n равен от 1 до около 6;

m равен 0 или 1;

j равен 0 или 1;

каждая замещенная группа содержит одну или более необязательно защищенных групп заместителей, независимо выбранных из галогена, OJ₁, N(J₁)(J₂), =NJ₁, SJ₁, N₃, CN, OC(=X₂)J₁, OC(=X₂)N(J₁)(J₂) и C(=X₂)N(J₁)(J₂);

X₂ представляет собой O, S или NH₃;

каждый J₁, J₂ и J₃ независимо представляет собой Н или C₁-С₆ алкил;

если j равен 1, то Z отличен от галогена или N(Е₂)(Е₃); и

где указанное олигомерное соединение содержит от 8 до 40 мономерных субъединиц и может подвергаться гибридизации с по меньшей мере частью нуклеиновой кислоты-мишени.

В некоторых вариантах реализации изобретения М₃ представляет собой О, СН=СН, ОCH₂ или ОС(Н)(Вх₂). В некоторых вариантах реализации изобретения М₃ представляет собой О.

В некоторых вариантах реализации изобретения J₄, J₅, J₆ и J₇ представляют собой Н. В некоторых вариантах реализации изобретения, J₄ образует мостик с одним из J₅ или J₇.

В некоторых вариантах реализации изобретения А имеет одну из формул:

или

где:

Q₁ и Q₂, каждый независимо, представляют собой Н, галоген, C₁-С₆ алкил, замещенный C₁-С₆ алкил, C₁-С₆ алкокси или замещенный C₁-С₆ алкокси. В некоторых вариантах реализации изобретения Q₁ и Q₂ представляют собой Н. В некоторых вариантах реализации изобретения Q₁ и Q₂, каждый независимо, представляют собой Н или галоген. В некоторых вариантах реализации изобретения Q₁ и Q₂ представляет собой Н, а другой из Q₁ и Q₂ представляет собой F, CH₃ или ОCH₃.

В некоторых вариантах реализации изобретения T₁ имеет формулу:

где:

R_a и R_c, каждый независимо, представляют собой защищенный гидроксил, защищенный тиол, C₁-С₆ алкил, замещенный C₁-С₆ алкил, C₁-С₆ алкокси, замещенный C₁-С₆ алкокси, защищенный амино или замещенный амино; и

R_b представляет собой O или S. В некоторых вариантах реализации изобретения R_b представляет собой О, a R_a и R_c, каждый независимо, представляют собой ОCH₃, ОCH₂СН₃ или СН(CH₃)₂.

В некоторых вариантах реализации изобретения G представляет собой галоген, ОCH₃, OCH₂F, OCHF₂, OCF₃, ОCH₂СН₃, O(CH₂)₂F, OCH₂CHF₂, OCH₂CF₃, ОCH₂-СН=CH₂, O(CH₂)₂-ОСН₃, O(CH₂)₂-SCH₃, O(CH₂)₂-OCF₃, O(CH₂)₃-N(R₁₀)(R₁₁), O(CH₂)₂-ON(R₁₀)(R₁₁), O(CH₂)₂-O(CH₂)₂-N(R₁₀)(R₁₁), OCH₂C(=O)-N(R₁₀)(R₁₁), OCH₂C(=O)-N(R₁₂)-(CH₂)₂-N(R₁₀)(R₁₁) или O(CH₂)₂-N(R₁₂)-C(=NR₁₃)[N(R₁₀)(R₁₁)], где R₁₀, R₁₁, R₁₂ и R₁₃, каждый независимо, представляют собой Н или C₁-С₆ алкил. В некоторых вариантах реализации изобретения G представляет собой галоген, ОCH₃, OCF₃, ОCH₂СН₃, OCH₂CF₃, ОCH₂-СН=CH₂, O(CH₂)₂-ОСН₃, O(CH₂)₂-O(CH₂)₂-N(CH₃)₂, OCH₂C(=O)-N(H)CH₃, ОCH₂С(=O)-N(H)-(CH₂)₂-N(CH₃)₂ или OCH₂-N(H)-C(=NH)NH₂. В некоторых вариантах реализации изобретения G представляет собой F, ОCH₃ или O(CH₂)₂-ОСН₃. В некоторых вариантах реализации изобретения G представляет собой O(CH₂)₂-ОCH₃.

В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-концевой нуклеозид имеет формулу IIе:

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, включая соединения, которые особенно подходят для оцРНК, содержат один или более типов модифицированных сахарных фрагментов и/или природных сахарных фрагментов, расположенных вдоль олигонуклеотида или его области в определенном паттерне или мотиве сахарной модификации. Такие мотивы могут содержать любые сахарные модификации, рассмотренные в данном документе, и/или другие известные модификации сахара.

В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды содержат или состоят из области, имеющей одинаковые сахарные модификации. В некоторых таких вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид указанной области содержит одинаковую РНК-подобную сахарную модификацию. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид области представляет собой 2'-F нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид области представляет собой 2'-ОМе нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид области представляет собой 2'-МОЕ нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид области представляет собой cEt нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый нуклеозид области представляет собой ЗНК нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения однородная область образует весь или по существу весь олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации изобретения область образует весь нуклеотид, за исключением 1-4 концевых нуклеозидов.

В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды содержат одну или более областей чередующихся сахарных модификаций, где нуклеозиды чередуются между нуклеотидами, имеющими сахарную модификацию первого типа, и нуклеотидами, имеющими сахарную модификацию второго типа. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеозиды обоих типов представляют собой РНК-подобные нуклеозиды. В некоторых вариантах реализации изобретения чередующиеся нуклеозиды выбраны из: 2'-ОМе, 2'-F, 2'-МОЕ, ЗНК и cEt. В некоторых вариантах реализации изобретения чередующиеся модификации представляют собой 2'-F и 2'-ОМе. Такие области могут быть смежными или могут быть прерваны по-другому модифицированными нуклеозидами или конъюгированными нуклеозидами.

В некоторых вариантах реализации изобретения каждая чередующаяся область чередующихся модификаций состоит из одного нуклеозида (т.е. паттерн представляет собой (АВ)_хА_у, где А представляет собой нуклеозид, имеющий сахарную модификацию первого типа, и В представляет собой нуклеозид, имеющий сахарную модификацию второго типа; x равен 1-20, и y равен 0 или 1). В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более чередующихся областей в чередующемся мотиве содержит более одного нуклеозида некоторого типа. Например, олигонуклеотиды могут содержать одну или более областей любого из следующих нуклеозидных мотивов:

ААВВАА;

АВВАВВ;

ААВААВ;

АВВАВААВВ;

АВАВАА;

ААВАВАВ;

АВАВАА;

АВВААВВАВАВАА;

ВАВВААВВАВАВАА; или

АВАВВААВВАВАВАА;

где А представляет собой нуклеозид первого типа, и В представляет собой нуклеозид второго типа. В некоторых вариантах реализации изобретения каждый А и В выбран из 2'-F, 2'-ОМе, БНК и МОЕ.

В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды, имеющие такой чередующийся мотив, содержат также модифицированный 5'-концевой нуклеозид, такой как нуклеозид формулы IIс или IIе.

В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды содержат область, имеющую мотив 2-2-3. Такие области содержат следующий мотив:

-(А)₂-(В)_х-(А)₂-(С)_у-(А)₃-

где: А представляет собой первый тип модифицированного нуклеозида; В и С представляют собой нуклеозиды, модифицированные иначе, чем А, однако В и С могут иметь одинаковые или разные модификации относительно друг друга;

x и y равны от 1 до 15.

В некоторых вариантах реализации изобретения А представляет собой 2'-ОМе модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации изобретения В и С представляют собой 2'-F модифицированные нуклеозиды. В некоторых вариантах реализации изобретения А представляет собой 2'-ОМе модифицированный нуклеозид, а В и С представляют собой 2'-F модифицированные нуклеозиды.

В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеозиды имеют следующий сахарный мотив:

5'-(Q)-(AB)_xA_y-(D)_z где:

Q представляет собой нуклеозид, содержащий стабилизированный фосфатный фрагмент. В некоторых вариантах реализации изобретения Q представляет собой нуклеозид, имеющий формулы IIс или IIе;

А представляет собой первый тип модифицированного нуклеозида;

В представляет собой второй тип модифицированного нуклеозида;

D представляет собой модифицированный нуклеозид, содержащий модификацию, отличную от нуклеозида, смежного с ним. Так, если у равен 0, то D должен быть модифицирован иначе, чем В, а если у равен 1, то D должен быть модифицирован иначе, чем А. В некоторых вариантах реализации изобретения D отличен и от А, и от В.

X равен 5-15;

Y равен 0 или 1;

Z равен 0-4.

В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеозиды имеют следующий сахарный мотив:

5'-(Q)-(A)_x-(D)_z где:

Q представляет собой нуклеозид, содержащий стабилизированный фосфатный фрагмент. В некоторых вариантах реализации изобретения Q представляет собой нуклеозид, имеющий формулы IIс или IIе;

А представляет собой первый тип модифицированного нуклеозида;

D представляет собой модифицированный нуклеозид, содержащий модификацию, отличную от А.

X равен 11-30;

Z равен 0-4.

В некоторых вариантах реализации изобретения А, В, С и D в представленных выше мотивах выбраны из:2'-ОМе, 2'-F, 2'-МОЕ, ЗНК и cEt. В некоторых вариантах реализации изобретения D представляет собой концевые нуклеозиды. В некоторых вариантах реализации изобретения такие концевые нуклеозиды не предназначены для гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью (хотя может происходить случайная гибридизация одного или более из них). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновое основание каждого нуклеозида D представляет собой аденин, независимо от идентичности азотистого основания в соответствующем положении нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновое основание каждого нуклеозида D представляет собой тимин.

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения, включая соединения, которые особенно подходят для применения в качестве оцРНК, содержат модифицированные межнуклеозидные связи, расположенные вдоль олигонуклеотида или его области в определенном порядке или в мотиве модифицированной межнуклеозидной связи. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды содержат область, имеющую мотив чередующихся межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотиды содержат область одинаково модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых таких вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит область, которая равномерно связана тиофосфатными межнуклеозидными связями. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид равномерно связан тиофосфатными межнулеозидными связями. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая межнуклеозидная связь олигонуклеотида выбрана из фосфодиэфира и тиофосфата. В некоторых вариантах реализации изобретения каждая межнуклеозидная связь олигонуклеотида выбрана из фосфодиэфира и тиофосфата, и по меньшей мере одна межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфат.

В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере 6 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере 10 тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок по меньшей мере из 6 последовательных тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок по меньшей мере из 8 последовательных тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок по меньшей мере из 10 последовательных тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации изобретения олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок по меньшей мере из 12 последовательных тиофосфатных межнуклеозидных связей. В некоторых таких вариантах реализации изобретения по меньшей мере один такой блок расположен на 3' конце олигонуклеотида. В некоторых таких вариантах реализации изобретения по меньшей мере один такой блок расположен в пределах 3 нуклеозидов от 3' конца олигонуклеотида.

Олигонуклеотиды, имеющие любые из различных сахарных мотивов, описанных в настоящем документе, могут иметь любой связывающий мотив. Например, олигонуклеотиды, включая, но не ограничиваясь ими, те, которые описаны выше, могут иметь связывающий мотив, выбранный из неограничивающей таблицы, представленной ниже:

ii. Соединения миРНК

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения представляют собой двухцепочечные РНКи соединения (миРНК). В таких вариантах реализации изобретения одна или обе цепи могут содержать любой мотив модификации, описанный выше для оцРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения оцРНК соединения могут представлять собой немодифицированные РНК. В некоторых вариантах реализации изобретения соединения миРНК могут содержать немодифицированные нуклеозиды РНК, но модифицированные межнуклеозидные связи.

Некоторые варианты реализации изобретения относятся к двухцепочечным композициям, в которых каждая цепь содержит мотив, определенный положением одного или более модифицированных или немодифицированных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации изобретения предложены композиции, содержащие первое и второе олигомерное соединение, которые полностью или по меньшей мере частично гибридизованы с образованием дуплексной области, и дополнительно содержащие область, которая комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени и гибридизуется с ней. Удобно, что такая композиция содержит первое олигомерное соединение, которое представляет собой антисмысловую цепь, имеющую полную или частичную комплементарность нуклеиновой кислоте-мишени, и второе олигомерное соединение, которое представляет собой смысловую цепь, имеющую одну или более областей, комплементарных и образующих по меньшей мере одну дуплексную область с первым олигомерным соединением.

Композиции согласно некоторым вариантам реализации изобретения модулируют генную экспрессию посредством гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью, что приводит к потере ее нормальной функции. Композиции согласно некоторым вариантам реализации изобретения модулируют генную экспрессию посредством гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью, что приводит к потере ее нормальной функции. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеинова кислота-мишень представляет собой АРОСIII. В некоторых вариантах реализации изобретения разрушение АРОСIII-мишени облегчается активированным комплексом RISC, который образуется с композициями, описанными в данном документе.

Некоторые варианты реализации изобретения относятся к двухцепочечным композициям, в которых одна из цепей подходит, например, для воздействия на предпочтительное включение противоположной цепи в RISC (или расщепляющий) комплекс. Указанные композиции подходят для направленного воздействия на выбранные молекулы нуклеиновых кислот и для модулирования экспрессии одного или более генов. В некоторых вариантах реализации изобретения композиции согласно настоящему изобретению гибридизуются с частью РНК-мишени, что приводит к потере нормальной функции РНК-мишени.

Некоторые варианты реализации изобретения относятся к двухцепочечным композициям, в которых обе цепи содержат гемимерный мотив, полностью модифицированный мотив, позиционно модифицированный мотив или чередующийся мотив. Каждая цепь композиций согласно настоящему изобретению может быть модифицирована для выполнения определенной роли, например, в каскаде миРНК. Используя различные мотивы в каждой цепи или одинаковый мотив с различными химическими модификациями в каждой цепи, может быть обеспечено направленное воздействие на антисмысловую цепь комплекса RISC при ингибировании внедрения смысловой цепи. В рамках такой модели каждая цепь может быть модифицирована независимо, так что она лучше выполняет свою конкретную роль. Антисмысловая цепь может быть модифицирована на 5'-конце для усиления его роли в одной области RISC, тогда как 3'-конец может быть модифицирован иначе для усиления его роли в другой области RISC.

Молекулы двухцепочечных олигонуклеотидов могут представлять собой молекулу двухцепочечного полинуклеотида, содержащую самокомплементарные смысловые и антисмысловые области, где антисмысловая область содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты-мишени или ее части, а смысловая область имеет нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или ее части. Двухцепочечные молекулы олигонуклеотида могут быть собраны из двух отдельных олигонуклеотидов, где одна спираль представляет собой смысловую спираль, а другая спираль представляет собой антисмысловую спираль, где антисмысловая и смысловая спирали являются самокомплементарными (т.е. каждая спираль содержит последовательность нуклеотидов, которая комплементарна последовательности нуклеотидов в другой спирали; например, если антисмысловая спираль и смысловая спираль образуют дуплекс или двухцепочечную структуру, например, если двухцепочечная область имеет от около 15 до около 30, например, около 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 пар оснований; антисмысловая спираль содержит последовательность нуклеотидов, которая комплементарна последовательности нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты-мишени или ее части, а смысловая спираль содержит последовательность нуклеотидов, соответствующую последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или ее части (например, от около 15 до около 25 или более нуклеотидов двухцепочечной молекулы олигонуклеотида комплементарны нуклеиновой кислоте-мишени или ее части. В альтернативном варианте двухцепочечный олигонуклеотид собран из одного олигонуклеотида, при этом самокомплементарные смысловые и антисмысловые области миРНК связаны посредством линкера(-ов), основанных на нуклеиновой кислоте или не основанных на нуклеиновой кислоте.

Двухцепочечный олигонуклеотид может представлять собой полинуклеотид с дуплексной, асимметричной дуплексной, шпилечной или асимметричной шпилечной вторичной структурой, имеющий самокоплементарные смысловые и антисмысловые области, при этом антисмысловая область содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в отдельной молекуле целевой нуклеиновой кислоты или ее части, а смысловая область имеет нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности целевой нуклеиновой кислоты или ее части. Двухцепочечный олигонуклеотид может представлять собой кольцевой одноцепочечный полинуклеотид, имеющий две или более петлевых структур и ствол, содержащий самокомплементарные смысловые и антисмысловые области, при этом антисмысловая область содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты-мишени или ее части, а смысловая область имеет нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или ее части, и при этом кольцевой полинуклеотид может быть процессирован in vivo или in vitro с получением активной молекулы миРНК, способной опосредовать РНКи.

В некоторых вариантах реализации изобретения двухцепочечный олигонуклеотид содержит отдельные смысловые и антисмысловые последовательности или области, при этом смысловая и антисмысловая области ковалентно связаны нуклеотидными или ненуклеотидными линкерными молекулами, известными в данной области техники, или в альтернативном варианте реализации связаны нековалентно посредством ионных взаимодействий, водородного связывания, ван-дер-ваальсовских взаимодействий, гидрофобных взаимодействий и/или стэкинг-взаимодействий. В некоторых вариантах реализации изобретения двухцепочечный олигонуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности гена-мишени. В другом варианте реализации изобретения двухцепочечный олигонуклеотид взаимодействует с нуклеотидной последовательностью гена-мишени, таким образом, который вызывает ингибирование экспрессии гена-мишени.

В данном контексте двухцепочечные олигонуклеотиды не ограничены молекулами, содержащими только РНК, а дополнительно охватывают химически модифицированные нуклеотиды и ненуклеотиды. В некоторых вариантах реализации изобретения молекулы малой интерферирующей нуклеиновой кислоты не имеют нуклеотидов, содержащих 2'-гидрокси (2'-ОН). В некоторых вариантах реализации изобретения малые интерферирующие нуклеиновые кислоты необязательно не содержат рибонуклеотидов (например, нуклеотидов, имеющих группу 2'-ОН). Такие двухцепочечные олигонуклеотиды, которые не требуют наличия рибонуклеотидов в молекуле для поддержания РНКи, могут тем не менее иметь присоединенный линкер или линкеры или другие присоединенные или связанные группы, фрагменты или цепи, содержащие один или более нуклеотидов с группами 2'-ОН. Необязательно двухцепочечный олигонуклеотиды могут содержать рибонуклеотиды в около 5, 10, 20, 30, 40 или 50% положений нуклеотидов. В данном контексте термин миРНК считают эквивалентным другим терминам, используемым для описания молекул нуклеиновых кислот, которые могут опосредовать последовательность-специфичную РНКи, например, малой интерферирующей РНК (миРНК), двухцепочечной РНК (дцРНК), микро-РНК (микроРНК), короткой шпилечной РНК (кшРНК), малого интерферирующего олигонуклеотида, малой интерферирующей нуклеиновой кислоты, малого интерферирующего модифицированного олигонуклеотида, химически модифицированной миРНК, РНК посттранскрипционного сайленсинга гена (птсгРНК) и других. Кроме того, в данном контексте термин РНКи считают эквивалентным другим терминам, используемым для описания последовательность-специфической интерференции РНК, такой как посттранскрипционный сайленсинг гена, трансляционное ингибирование или эпигенетика. Например, двухцепочечные олигонуклеотиды могут быть использованы для эпигенетического сайленсинга генов на посттранскрипционном уровне и на дотранскрипционном уровне. В неограничивающем примере эпигенетическое регулирование генной экспрессии молекулами миРНК согласно настоящему изобретению может быть результатом миРНК-опосредованной модификации структуры хроматина или паттерна метилирования для изменения генной экспрессии (см., например, Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676; Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; и Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237).

Подразумевается, что соединения и композиции согласно некоторым вариантам реализации, предложенным в настоящем документе, могут направленно воздействовать на АРОСIII посредством дцРНК-опосредованного сайленсинга гена или механизма РНКи, включая, например,эффекторные молекулы "шпилечной" или двухцепочечной РНК на основе структуры стебель-петля, в которых одна цепь РНК с самокомплементарными последовательностями может принимать двухцепочечную конформацию, или эффекторные молекулы дуплексной дцРНК, содержащие две отдельные цепи РНК. В различных вариантах реализации дцРНК полностью состоит из рибонуклеотидов или состоит из смеси рибонуклеотидов и дезоксинуклеотидов, таких как гибриды РНК/ДНК, описанные, например, в WO 00/63364, поданной 19 апреля 2000 года, или в патенте США с серийным №60/130377, поданном 21 апреля 1999 года. ДцРНК или эффекторная молекула дцРНК может представлять собой одну молекулу с областью самокомплементарности, так что нуклеотиды в одном сегменте молекулы участвуют в спаривании оснований с нуклеотидами в другом сегменте молекулы. В различных вариантах реализации изобретения дцРНК, которая состоит из одной молекулы, полностью состоит из рибонуклеотидов или содержит область рибонуклеотидов, которая комплементарна области дезоксирибонуклеотидов. В альтернативном варианте дцРНК может включать две разные цепи, которые имеют область комплементарности друг с другом.

В различных вариантах реализации изобретения обе цепи полностью состоят из рибонуклеотидов, одна цепь полностью состоит из рибонуклеотидов, и одна цепь полностью состоит из дезоксирибонуклеотидов, или одна или обе цепи содержат смесь рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов. В некоторых вариантах реализации изобретения области комплементарности по меньшей мере на 70, 80, 90, 95, 98 или 100% комплементарны друг другу и последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения область дцРНК, которая находится в двухцепочечной конформации, содержит по меньшей мере 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 50, 75,100, 200, 500, 1000, 2000 или 5000 нуклеотидов или содержит все нуклеотиды в кДНК или другой последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, находящейся в дцРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения дцРНК не содержит одноцепочечных областей, таких как одноцепочечные концы, или дцРНК представляет собой шпильку. В других вариантах реализации изобретения дцРНК имеет одну или более одноцепочечных областей или липких концов. В некоторых вариантах реализации изобретения гибриды РНК/ДНК содержат цепь или область ДНК, которая представляет собой антисмысловую цепь или область (например, имеет по меньшей мере 70, 80, 90, 95, 98 или 100% комплементарность с нуклеиновой кислотой-мишенью), и цепь или область РНК, которая представляет собой смысловую цепь или область (например, имеет по меньшей мере 70, 80,90,95, 98 или 100% идентичность с нуклеиновой кислотой-мишенью) и наоборот.

В различных вариантах реализации изобретения гибрид РНК/ДНК получают in vitro с помощью методов ферментного или химического синтеза, таких как описаны в данном документе или в WO 00/63364, поданной 19 апреля 2000 года, или в патенте США с серийным №60/130377, поданном 21 апреля 1999 года. В других вариантах реализации изобретения цепь ДНК, синтезированная in vitro, связана в комплекс с цепью РНК, полученной in vivo или in vitro до, после или одновременно с трансформацией ДНК цепи в клетку. В других вариантах реализации изобретения дцРНК представляет собой одну кольцевую нуклеиновую кислоту, содержащую смысловую и антисмысловую область, или дцРНК содержит кольцевую нуклеиновую кислоту и вторую кольцевую нуклеиновую кислоту или линейную нуклеиновую кислоту (см., например, WO 00/63364, поданную 19 апреля 2000 года, или в патенте США с серийным №60/130377, поданном 21 апреля1999 года). Типовые кольцевые нуклеиновые кислоты включают лариатные структуры, в которых свободная 5' фосфорильная группа нуклеотида становится связанной с 2' гидроксильной группой другого нуклеотида путем закольцовывания.

В других вариантах реализации изобретения дцРНК содержит один или более модифицированных нуклеотидов, в которых 2' положение сахара содержит галоген (такой как группа фтора) или содержит алкокси-группу (такую как метокси-группа), что увеличивает период полувыведения дцРНК in vitro или in vivo по сравнению с соответствующей дцРНК, в которой соответствующее 2' положение содержит водород или гидроксильную группу. В других вариантах реализации изобретения дцРНК содержит одну или более связей между смежными нуклеотидами, отличных от природной фосфодиэфирной связи. Примеры таких связей включают фосфорамидные, тиофосфатные и дитиофосфатные связи. ДцРНК также могут представлять собой химически модифицированные молекулы нуклеиновых кислот, как описано в патенте США №6673661. В других вариантах реализации изобретения дцРНК содержит одну или две кэпированных цепей, как описано, например, в WO 00/63364, поданной 19 апреля 2000 года, или в патенте США с серийным №60/130377, поданном 21 апреля 1999 года.

В других вариантах реализации изобретения дцРНК может представлять собой любую из по меньшей мере частично дцРНК молекул, описанных в WO 00/63364, а также любую из дцРНК молекул, описанных впредварительной заявке США 60/399998; и впредварительной заявке США 60/419532, и в PCT/US2003/033466, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки. Любая из дцРНК может быть экспрессирована in vitro или in vivo с помощью способов, описанных в данном документе, или стандартных способов, таких как описаны в WO 00/63364.

Занятость

В некоторых вариантах реализации изобретения антисмысловые соединения предположительно не приводят к расщеплению нуклеиновой кислоты-мишени посредством РНКазы Н или не приводят к расщеплению или секвестрации по пути RISC. В некоторых таких вариантах реализации изобретения антисмысловая активность может быть результатом занятости, причем наличие гибридизованного антисмыслового соединения нарушает активность нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых таких вариантах реализации антисмысловое соединение может быть равномерно модифицировано или может содержать смесь модификаций и/или модифицированных и немодифицированных нуклеозидов.

Составы и способы для разработки фармацевтических композиций

Антисмысловые соединения могут быть смешаны с фармацевтически приемлемыми активными или инертными веществами для получения фармацевтических композиций или составов. Композиции и способы составления фармацевтических композиций зависят от множества критериев, включая, но не ограничиваясь ими, способ введения, тяжесть заболевания или дозу, подлежащую введению.

Антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту АроСIII могут быть использованы в фармацевтических композициях путем объединения антисмыслового соединения с подходящим фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем. В некоторых вариантах реализации изобретения "фармацевтический носитель" или вспомогательное "вещество" представляет собой фармацевтически приемлемый растворитель, суспендирующий агент или любой другой фармакологически инертный носитель для доставки одной или более нуклеиновых кислот в организм животного. Вспомогательное вещество может быть жидким или твердым, и может быть выбрано с учетом планируемого способа введения, чтобы предусмотреть желательную массу, консистенцию, и т.п., при объединении с нуклеиновой кислотой и другими компонентами данной фармацевтической композиции. Типичные фармацевтические носители включают, но не ограничиваются ими, связующие агенты (например, прежелатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза, и т.п.); наполнители (например, лактоза и другие сахара, микрокристаллическая целлюлоза, пектин, желатин, сульфат кальция, этилцеллюлоза, полиакрилаты или гидрофосфат кальция, и т.п.); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк, кремнезем, коллоидный кремния диоксид, стеариновая кислота, стеараты металлов, гидрогенизированные растительные масла, зерновой крахмал, полиэтиленгликоли, натрия бензоат, натрия ацетат, и т.п.); дезинтегранты (например, крахмал, натрий крахмал гликолят, и т.п.); и увлажняющие средства (например, натрий лаурилсульфат, и т.п.).

Фармацевтически приемлемые органические или неорганические вспомогательные вещества, которые не реагируют нежелательным образом с нуклеиновыми кислотами, пригодные для парентерального или непарентерального введения, могут также использоваться для получения композиций по настоящему изобретению. Пригодные фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются ими, воду, солевые растворы, спирты, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, магния стеарат, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон, и т.п.

Фармацевтически приемлемый разбавитель включает фосфатно-солевой буфер (ФСБ). ФСБ представляет собой разбавитель, пригодный для применения в композициях, которые вводятся парентерально. Соответственно, в одном варианте реализации изобретения, используемых в способах, описанных в данном докуменете, представлена фармацевтическая композиция, содержащая антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту АроСIII, и фармацевтически приемлемый разбавитель. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой ФСБ. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение представляет собой антисмысловой олигонуклеотид.

Фармацевтические композиции, содержащие антисмысловые соединения, охватывают любые фармацевтически приемлемые соли, эфиры или соли таких эфиров или олигонуклеотид, который, при введении животному, в том числе человеку, способен обеспечивать (прямо или косвенно) биологически активный метаболит или его остаток. Соответственно, например, настоящее описание относится также к фармацевтически приемлемым солям антисмысловых соединений, пролекарствам, фармацевтически приемлемым солям таких пролекарств и к другим биоэквивалентам. Пригодные фармацевтически приемлемые соли включают, но не ограничиваются ими, соли натрия и калия.

Пролекарство может включать внедрение дополнительных нуклеозидов с одного или обоих концов антисмыслового соединения, которые расщепляются в организме под действием эндогенных нуклеаз с образованием активного антисмыслового соединения.

Сопряженные антисмысловые соединения

Антисмысловые соединения могут быть ковалентно связаны с одним или более фрагментами или конъюгатами, которые усиливают активность, клеточное распределение или клеточное поглощение полученных антисмысловых олигонуклеотидов. Типичные сопряженные группы включают фрагменты холестерина и липидные фрагменты. Дополнительные сопряженные группы включают углеводы, фосфолипиды, биотин, феназин, соль фолиевой кислоты, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины, и красители. В некоторых вариантах реализации изобретения конъюгат содержит углевод. В некоторых вариантах реализации изобретения сопряженная группа содержит один или более фрагментов N-ацетилгалактозамина (или "GalNAc"). В некоторых вариантах реализации изобретения сопряженная группа содержит один, два или три фрагмента N-ацетилгалактозамина (или "GalNAc").

Иллюстративные патенты Соединенных Штатов Америки, публикации патентных заявок Соединенных штатов Америки и публикации международных патентных заявок, в которых описано получение некоторых из конъюгатов GalNAc, сопряженных олигомерных соедиенеий, таких как антисмысловые соединения, связи, сопряженные линкеры, группы ветвления, лиганды, расщепляемые фрагменты, а также другие модификации, включают, без ограничения, в патентах США 5994517, 6300319, 6660720, 6906182, 7262177, 7491805, 8106022, 7723509, 2006/0148740, US 2011/0123520, WO 2013/033230, WO 2012/037254, и WO 2014022739, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

Иллюстративные публикации, в которых описано получение некоторых из конъюгатов GalNAc, сопряженных олигомерных соедиенеий, таких как антисмысловые соединения, связи, сопряженные линкеры, группы ветвления, лиганды, расщепляемые фрагменты, а также другие модификации, включают, без ограничения, BIESSEN et al., "The Cholesterol Derivative of a Triantennary Galactoside with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor: a Potent Cholesterol Lowering Agent" J. Med. Chem. (1995) 38:1846-1852, BIESSEN et al., "Synthesis of Cluster Galactosides with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1995) 38:1538-1546, LEE et al., "New and more efficient multivalent glyco-ligands for asialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes" Bioorganic & Medicinal Chemistry (2011) 19:2494-2500, RENSEN et al., "Determination of the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and in Vivo" J. Biol. Chem. (2001) 276(40):37577-37584, RENSEN et al., "Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (2004) 47:5798-5808, SLIEDREGT et al., "Design and Synthesis of Novel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomes to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1999) 42:609-618, R.T. Lee et al., "New and more efficient multivalent glyco-ligands for asialoglycoprote in receptor of mammalian hepatocytes," Bioorg. Med. Chem. 19 (2011) 2494-2500, и Valentijn et al., "Solid-phase synthesis of lysine-based cluster galactosides with high affinity for the Asialoglycoprotein Receptor" Tetrahedron, 1997, 53(2), 759-770, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

Антисмысловые соединения могут также быть модифицированными, чтобы иметь одну или более стабилизирующих групп, которые обычно присоединяются к одному или обоим концам антисмысловых соединений для улучшения свойств, таких как, например, устойчивость к нуклеазам. Стабилизирующие группы включают кэпирующие структуры. Такие концевые модификации защищают антисмысловое соединение с концевой нуклеиновой кислотой от разрушения под действием экзонуклеаз и могут способствовать доставке и/или локализации внутри клетки. Кэп может быть расположен на 5'-конце (5'-кэп) или на 3'-конце (3'-кэп), или может находиться на обоих концах. Кэпирующие структуры хорошо известны в данной области техники и включают, например, инвертированные дезокси кэпы с удаленными азотистыми основаниями. Дополнительные 3' и 5'-стабилизирующие группы, которые могут быть использованы для кэпирования одного или обоих концов антисмыслового соединения для придания устойчивости к нуклеазам, включают группы, описанные в WO 03/004602, опубликованном 16 января 2003 года.

Культура клеток и обработка антисмысловыми соединениями

Влияние антисмысловых соединений на уровень активности или экспрессию нуклеиновых кислот или белков АроСIII может быть проверено in vitro на различных видах клеток. Типы клеток, используемые для таких анализов, доступны от коммерческих продавцов (например, Американская коллекция типов культур (АТСС), Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) и клетки культивируют согласно инструкциям производителей с применением коммерчески доступных реагентов (например, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Иллюстративные типы клеток включают, но не ограничиваются ими, клетки HepG2, клетки Нер3В, клетки Huh7 (гепатоцеллюлярная карцинома), первичные гепатоциты, клетки А549, фибробласты GM04281 и клетки LLC-MK2.

Тестирование антисмысловых олигонуклеотидов in vitro

В данном документе описаны способы обработки клеток антисмысловыми олигонуклеотидами, которые могут быть модифицированы соответствующим образом для обработки другими антисмысловыми соединениями.

В целом, клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами, когда клетки достигают приблизительно 60-80% конфлуентности в культуре.

Один из реагентов, традиционно используемый для введения антисмыслового олигонуклеотида в культивируемые клетки, включает реагент катионной трансфекции липида LIPOFECTIN® (Invitrogen, Carlsbad, СА). Антисмысловые олигонуклеотиды смешивают с LIPOFECTIN® в OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, СА), чтобы достичь желаемой конечной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации LIPOFECTIN®, которая обычно варьирует в интервале 2-12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.

Другой реагент, используемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает LIPOFECTAMINE 2000® (Invitrogen, Carlsbad, СА). Антисмысловой олигонуклеотид смешивают с LIPOFECTAMINE 2000® в среде OPTI-MEM® 1 со сниженным содержанием сыворотки (Invitrogen, Carlsbad, СА), чтобы достичь желаемой концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации LIPOFECTAMINE®, которая обычно варьирует в интервале 2-12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.

Другой реагент, используемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает Cytofectin® (Invitrogen, Carlsbad, СА). Антисмысловой олигонуклеотид смешивают с Cytofectin® в среде OPTI-MEM® 1 со сниженным содержанием сыворотки (Invitrogen, Carlsbad, СА), чтобы достичь желательной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации Cytofectin®, которая обычно варьирует в интервале 2-12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.

Другой реактив, используемый для введения антисмыслового олигонуклеотида в культивируемые клетки, включает Oligofectamine™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Антисмысловой олигонуклеотид смешивают с Oligofectamine™ в среде Opti-MEM™-1 со сниженным содержанием сыворотки (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), чтобы достичь желательной концентрации олигонуклеотида, с соотношением Oligofectamine™ к олигонуклеотиду приблизительно 0,2-0,8 мкл на 100 нМ.

Другой реактив, используемый для введения антисмыслового олигонуклеотида в культивируемые клетки, включает FuGENE 6 (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN). Антисмысловое олигомерное соединение смешивают с FuGENE 6 в 1 мл не содержащей сыворотки среды RPMI, чтобы достичь желательной концентрации олигонуклеотида, с соотношением FuGENE 6 к олигонуклеотиду 1-4 мкл FuGENE 6 на 100 нМ.

Другой метод, используемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает электропорацию (Sambrook and Russell in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 2001).

Клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами с помощью стандартных способов. Клетки обычно собирают через 16-24 часов после обработки антисмысловым олигонуклеотидом, после чего уровни РНК или белков нуклеиновых кислот-мишеней измеряют методами, известными в данной области техники и описанными в настоящем документе (Sambrook and Russell in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 2001). Как правило, если обработку проводят в нескольких повторностях, данные представляют как среднее значение для многократных обработок.

Концентрация используемого антисмыслового олигонуклеотида варьирует от одной линии клеток к другой. Способы определения оптимальной концентрации антисмыслового олигонуклеотидна для конкретной линии клеток хорошо известны в данной области техники (Sambrook and Russell in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 2001). Антисмысловые олигонуклеотиды обычно используют в концентрациях от 1 нМ до 300 нМ, при трансфекции с использованием реагентов LIPOFECTAMINE2000® (Invitrogen, Carlsbad, С A), Lipofectin® (Invitrogen, Carlsbad, С А) или Cytofectin™ (Genlantis, San Diego, CA). Антисмысловые олигонуклеотиды используют в более высоких концентрациях в диапазоне от 625 до 20000 нМ при трансфекции с использованием электропорации.

Выделение РНК

Анализ РНК может быть проведен на общей клеточной РНК или поли(А)+ мРНК. Способы выделения РНК хорошо известны в данной области техники (Sambrook and Russell in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 2001). РНК получают с использованием способов, хорошо известных в данной области техники, например, с использованием реагента TRIZOL® (Invitrogen, Carlsbad, СА) по рекомендуемым протоколам производителя.

Анализ ингибирования уровней или экспрессии мишени

Ингибирование уровней или экспрессии нуклеиновой кислоты АроСIII может быть проанализировано разнообразными способами, известными в данной области техники (Sambrook and Russell in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 2001). Например, уровни нуклеиновой кислоты-мишени могут быть количественно определены, например, нозерн-блоттингом, конкурентной полимеразной цепной реакцией (ПЦР) или количественной ПЦР в реальном времени. Анализ РНК может быть проведен на общей клеточной РНК или поли(А)+ мРНК. Способы выделения РНК хорошо известны в данной области техники. Нозерн-блоттинг также является общепринятым в данной области техники. Количественная ПЦР в реальном времени может быть традиционно выполнена с использованием коммерчески доступной системы обнаружения последовательности ABI PRISM® 7600, 7700 или 7900, доступной от PE-Applied Biosystems, Foster City, СА и используемой согласно инструкциям производителя.

Анализ уровней РНК мишени методом количественной ПЦР в реальном времени

Количественная оценка уровней РНК мишени может быть выполнена методом количественной ПЦР в реальном времени с использованием системы обнаружения последовательности ABI PRISM® 7600, 7700 или 7900, доступной от PE-Applied Biosystems, Foster City, СА согласно инструкциям производителя. Способы количественной ПЦР в реальном времени хорошо известны в данной области техники.

Перед проведением ПЦР в реальном времени, выделенную РНК подвергают реакции с обратной транскриптазой (ОТ), которая производит комплементарную ДНК (кДНК), в дальнейшем используемую в качестве субстрата для ПЦР-амплификации в реальном времени. Реакции ОТ и ПЦР в реальном времени выполняются последовательно в одной и той же ячейке с образцом. Реагенты для ОТ и ПНР в реальном времени получены от Invitrogen (Carlsbad, СА). Реакции ОТ и ПЦР в реальном времени проводят способами, хорошо известными специалистам в данной области техники.

Количества целевого гена (или РНК), полученные с помощью ПЦР в реальном времени, могут быть нормализованы с использованием уровня экспрессии гена, экспрессия которого является постоянной, такого как циклофилин А, или количественным определением общей РНК с использованием RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, СА). Экспрессию циклофилина А определяют количественно с помощью ПЦР в реальном времени, проводя ее одновременно с мишенью, мультиплексно или отдельно. Общее количество РНК определяют с использованием реактива для количественного определения РНК RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, СА). Способы количественного определения РНК с помощью RIBOGREEN® приведены в Jones, L.J., et al., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Инструмент CYTOFLUOR® 4000 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) используются для измерения флуоресценции RIBOGREEN®.

Зонды и праймеры конструируют для гибридизации с нуклеиновой кислотой АроСIII. Способы конструирования зондов и праймеров для ПЦР в реальном времени хорошо известны в данной области техники, и могут включать использование программного обеспечения, такого как PRIMER EXPRESS® (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Для получения количеств целевого гена методом ОТ-ПЦР в реальном времени можно использовать либо уровень экспрессии GAPDH или Циклофилина А, генов, экспрессия которых является постоянной, либо количественно определяя общую РНК с использованием RiboGreenTM (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). Экспрессия GAPDH или Циклофилина А может быть количественно определена ОТ-ПЦР в реальном времени, при проведении одновременно с мишенью, мультиплексно или отдельно. Общую РНК количественно определяют с помощью реагента для количественного определения РНК RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR).

Анализ уровней белка

Антисмысловое ингибирование нуклеиновых кислот АроСIII может быть оценено путем измерения уровней белка АроСIII. Уровни белка АроСIII могут быть оценены или количественно определены различными способами, хорошо известными в данной области техники, такими как иммунопреципитация, анализ методом вестерн-блоттинга (иммуноблоттинг), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), количественные анализы белка, анализы активности белка (например, анализы активности каспазы), иммуногистохимия, иммуноцитохимия или флуоресцентная сортировка клеток (FACS) (Sambrook and Russell in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 2001). Антитела, нацеленные на мишень, могут быть идентифицированы и получены из различных источников, таких как каталог антител MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI) или могут быть получены традиционными способами получения моноклональных или поликлональных антител, хорошо известных в данной области техники. Антитела, пригодные для обнаружения АроСIII человека и мыши, являются коммерчески доступными.

Тестирование антисмысловых соединений in vivo

Антисмысловые соединения, например, антисмысловые олигонуклеотиды, изучали на животных, чтобы оценить их способность ингибировать экспрессию АроСIII и продуцировать фенотипические изменения. Тестирование может выполняться на нормальных животных или на экспериментальных моделях заболеваний. Для введения животным антисмысловые олигонуклеотиды комбинировались с фармацевтически приемлемым разбавителем, таким как фосфатно-солевой буфер. Введение включает парентеральные способы введения. Вычисление доз антисмыслового олигонуклеотида и частоты введения проводят с учетом таких факторов, как способ введения и масса тела животного. После периода лечения антисмысловыми олигонуклеотидами, РНК выделяют из ткани и измеряют изменения экспрессии нуклеиновой кислоты АроСIII. Также измеряют изменения уровней белка АроСIII.

Некоторые показания

Были идентифицированы и описаны в данном документе новые эффекты ингибирования АроСIII у пациентов с липодистрофией (генерализованная липодистрофия или частичная липодистрофия). Пример, описанный в данном документе ниже, раскрывает снижение ТГ и увеличение ЛПВП среди других биомаркеров у пациентов с липодистрофией.

В некоторых вариантах реализации изобретения, предложенных в данном документе, представлены способы лечения субъекта с липодистрофией, включающие введение одной или более фармацевтических композиций согласно настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит антисмысловое соединение, нацеленное на АроСIII.

В некоторых вариантах реализации изобретения введение антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту АроСIII субъекта с липодистрофией, приводит к снижению экспрессии АроСIII по меньшей мере на 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или на значение в диапазоне между любыми двумя из указанных значений. В некоторых вариантах реализации изобретения экспрессия АроСIII снижается до ≤50 мг/л, ≤60 мг/л, ≤70 мг/л, ≤80 мг/л, ≤90 мг/л, ≤100 мг/л, ≤110 мг/л, ≤120 мг/л, ≤130 мг/л, ≤140 мг/л, ≤150 мг/л, ≤160 мг/л, ≤170 мг/л, ≤180 мг/л, ≤190 мг/л или ≤200 мг/л.

В некоторых вариантах реализации изобретения субъект страдает заболеванием и расстройством, связанным с липодистрофией. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект страдает заболеванием и расстройством, связанным с генерализованной липодистрофией. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект страдает заболеванием и расстройством, связанным с частичной липодистрофией. В некоторых вариантах реализации изобретения заболевание или расстройство представляет собой сердечно-сосудистое или метаболическое заболевание или расстройство у субъекта с липодистрофией. В некоторых вариантах реализации изобретения сердечно-сосудистое заболевание или расстройство включает, но не ограничивается ими, аневризму, стенокардию, аритмию, атеросклероз, цереброваскулярное заболевание, заболевание коронарных сосудов сердца, гипертензию, дислипидемию, гиперлипидемию, гипертриглицеридемию, гиперхолестеринемию, инсульт и тому подобное. В некоторых вариантах реализации изобретения метаболическое заболевание или расстройство включает, но не ограничивается ими, гипергликемию, преддиабет, диабет (I типа и 2 типа), ожирение, резистентность к инсулину, метаболический синдром и диабетическую дислипидемию. В некоторых вариантах реализации изобретения заболевание или расстройство представляет собой гипертриглицеридемию у субъекта с липодистрофией. В некоторых вариантах реализации изобретения заболевание или расстройство представляет собой панкреатит у субъекта с липодистрофией. В некоторых вариантах реализации изобретения заболевание или расстройство представляет собой НАЖБП или НАСГ у субъекта с липодистрофией. В некоторых вариантах реализации изобретения заболевание или расстройство представляет собой цирроз или гепатокарцинома у субъекта с липодистрофией.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединения, нацеленные на АроСII, согласно настоящему описанию, модулируют физиологические маркеры или фенотипы панкреатита, сердечно-сосудистого или метаболического заболевания или расстройства у субъекта с липодистрофией. В некоторых экспериментах соединения могут увеличивать или уменьшать физиологические маркеры или фенотипы по сравнению с необработанными животными. В некоторых вариантах реализации изобретения увеличение или уменьшение физиологических маркеров или фенотипов связано с ингибированием АроСIII соединениями, описанными в данном документе.

В некоторых вариантах реализации изобретения физиологические маркеры или фенотипы сердечно-сосудистого заболевания или расстройства могут быть количественно определены. Например, уровни ТГ или ЛПВП могут быть измерены и количественно определены, например, стандартными липидными тестами. В некоторых вариантах реализации изобретения физиологические маркеры или фенотипы, такие как ЛПВП, могут быть увеличены на около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% или на значение в диапазоне между любыми двумя из указанных значений. В некоторых вариантах реализации изобретения фенотипы физиологических маркеров, такие как ТГ (постпрандиальный или тощаковый), могут быть уменьшены на около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% или на значение в диапазоне между любыми двумя из указанных значений. В некоторых вариантах реализации изобретения ТГ (постпрандиальный или тощаковый) снижается до ≤100 мг/дл, ≤110 мг/дл, ≤120 мг/дл, ≤130 мг/дл, ≤140 мг/дл, ≤150 мг/дл, ≤160 мг/дл, ≤170 мг/дл, ≤180 мг/дл, ≤190 мг/дл, ≤200 мг/дл, ≤210 мг/дл, ≤220 мг/дл, ≤230 мг/дл, ≤240 мг/дл, ≤250 мг/дл, ≤260 мг/дл, ≤270 мг/дл, ≤280 мг/дл, ≤290 мг/дл, ≤300 мг/дл, ≤350 мг/дл, ≤400 мг/дл, ≤450 мг/дл, ≤500 мг/дл, ≤550 мг/дл, ≤600 мг/дл, ≤650 мг/дл, ≤700 мг/дл, ≤750 мг/дл, ≤800 мг/дл, ≤850 мг/дл, ≤900 мг/дл, ≤950 мг/дл, ≤1000 мг/дл, ≤1100 мг/дл, ≤1200 мг/дл, ≤1300 мг/дл, ≤1400 мг/дл, ≤1500 мг/дл, ≤1600 мг/дл, ≤1700 мг/дл, ≤1800 мг/дл или ≤1900 мг/дл.

В некоторых вариантах реализации изобретения физиологические маркеры или фенотипы метаболического заболевания или расстройства могут быть количественно определены. Например, уровни глюкозы или резистентность к инсулину могут быть измерены и количественно определены стандартными тестами, известными в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения физиологические маркеры или фенотипы, такие как уровни глюкозы или резистентность к инсулину, могут быть уменьшены на около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% или на значение в диапазоне между любыми двумя из указанных значений. В некоторых вариантах реализации изобретения фенотипы физиологических маркеров, такие как чувствительность к инсулину, могут быть увеличены на около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% или на значение в диапазоне между любыми двумя из указанных значений.

В данном документе также представлены способы предупреждения, лечения или облегчения симптома, связанного с заболеванием, расстройством у субъекта с липодистрофией с помощью соединения, описанного в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ снижения скорости манифестации симптома или заболевания, связанного с липодистрофией. В некоторых вариантах реализации изобретения предложен способ уменьшения тяжести симптома или заболевания, связанного с липодистрофией. В таких вариантах реализации изобретения способы включают введение индивидууму с липодистрофией терапевтически эффективного количества соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту АроСIII. В некоторых вариантах реализации изобретения заболевание или расстройство представляет собой панкреатит или сердечно-сосудистое или метаболическое заболевание или расстройство.

Сердечно-сосудистые заболевания или расстройства характеризуются многочисленными физическими симптомами. Любой симптом, известный специалисту в данной области, который связан с сердечно-сосудистым заболеванием, можно предупреждать, лечить, облегчать протекание или иным способом модулировать, как указано в способах, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения симптом может представлять собой любой из, но не ограничиваясь ими, стенокардию; боль в груди; одышку; сердцебиение; слабость; головокружение; тошноту; повышение потоотделения; тахикардию; брадикардию; аритмию; мерцание предсердий; отек нижних конечностей; цианоз; усталость; слабость; онемение лица; онемение конечностей; хромоту или мышечные спазмы; вздутие живота; или лихорадку.

Метаболические заболевания или расстройства характеризуются многочисленными физическими симптомами. Любой симптом, известный специалисту в данной области, который связан с метаболическим расстройством, можно предупреждать, лечить, облегчать протекание или иным способом модулировать, как указано в способах, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения симптом может представлять собой любой из, но не ограничиваясь ими, чрезмерной секреции мочи (полиурия), чрезмерной жажды и повышенного потребления жидкости (полидипсия), затуманивания зрения, необъяснимого снижения массы тела и летаргии.

Панкреатит характеризуется рядом физических и физиологических симптомов. Любой симптом, известный специалисту в данной области техники, который связан с панкреатитом, можно предупреждать, лечить, облегчать протекание или иным способом модулировать, как указано в способах, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения симптом может представлять собой любой из, но не ограничиваясь ими, болей в животе, рвоты, тошноты и чувствительности брюшной полости к давлению.

В некоторых вариантах реализации изобретения, предложенных в данном документе, представлены способы лечения субъекта с липодистрофией, включающие введение терапевтически эффективного количества одной или более фармацевтических композиций согласно настоящему описанию. В некоторых вариантах реализации изобретения введение терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту АроСIII, сопровождается мониторингом уровней АроСIII или маркеров заболевания, связанных с липодистрофией, для определения ответа субъекта на введение антисмыслового соединения. Ответ субъекта на введение антисмыслового соединения врач использует для определения объема и продолжительности терапевтического вмешательства.

В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции, содержащие антисмысловое соединение, направленное на АроСIII, используют для получения лекарственного средства для лечения субъекта с липодистрофией.

Введение

Соединения или фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить множеством способов, в зависимости от того, необходимо местное или системное лечение, и от области, подвергаемой лечению. Введение может быть пероральным или парентеральным.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединения и композиции, описанные в данном документе, вводят парентерально. Парентеральное введение включает внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию.

В некоторых вариантах реализации изобретения парентеральное введение осуществляют инфузией. Инфузия может быть постоянной или непрерывной, или кратковременной, или прерывистой. В некоторых вариантах реализации изобретения введенные инфузионно фармацевтические агенты доставляют с помощью насоса. В некоторых вариантах реализации изобретения инфузию проводят внутривенно.

В некоторых вариантах реализации изобретения парентеральное введение осуществляют инъекцией. Инъекция может быть доставлена с помощью шприца или насоса. В некоторых вариантах реализации изобретения инъекция представляет собой болюсную инъекцию. В некоторых вариантах реализации изобретения инъекцию осуществляют непосредственно в ткань или орган. В некоторых вариантах реализации изобретения парентеральное введение представляет собой подкожное введение.

В некоторых вариантах реализации изобретения препараты для парентерального введения могут включать стерильные водные растворы, которые могут также содержать буферные вещества, разбавители и другие подходящие добавки, такие как, но не ограничиваясь ими, усилители проникновения, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или вспомогательные вещества.

В некоторых вариантах реализации изобретения препараты для перорального введения соединений или композиций по изобретению могут содержать, но не ограничиваются ими, фармацевтические носители, вспомогательные вещества, порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в воде или безводных средах, капсулы, гелевые капсулы, саше, таблетки или минитаблетки. Загустители, вкусовые добавки, разбавители, эмульгаторы, вспомогательные вещества для суспендирования или связующие вещества могут быть желательными. В некоторых вариантах реализации изобретения препараты для перорального введения являются такими, в которых соединения по изобретению вводят в сочетании с одним или более усилителей проникновения, поверхностно-активных веществ и хелатирующих агентов.

Схема приема

В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции вводят согласно схеме применения (например, доза, частота и продолжительность введения), причем схема применения может быть выбрана таким образом, чтобы достичь желаемого эффекта. Желаемый эффект может представлять собой, например, снижение уровня АроСIII или предупреждение, уменьшение, облегчение или замедление прогрессирования заболевания или патологического состояния, связанного с липодистрофией.

В некоторых вариантах реализации изобретения переменные схемы применения регулируют таким образом, чтобы обеспечить желаемую концентрацию фармацевтической композиции в организме субъекта. "Концентрация фармацевтической композиции" в связи со схемой применения может означать соединение, олигонуклеотид или активный ингредиент фармацевтической композиции. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения дозу и частоту приема регулируют таким образом, чтобы обеспечить концентрацию фармацевтической композиции в ткани или плазме в количестве, достаточном для достижения желаемого эффекта.

Дозы зависят от тяжести и ответа патологического состояния, которое подлежит лечению, с длительностью курса лечения от нескольких дней до нескольких месяцев или до излечения или ослабления патологического состояния. Дозы также зависят от активности лекарственного средства и метаболизма. В некоторых вариантах реализации изобретения дозы составляют от 0,01 мкг до 100 мг на кг массы тела или в пределах интервала дозы 0,001-1000 мг, и могут вводиться ежедневно один или более раз в день, еженедельно, ежемесячно или ежегодно или хотя бы один раз каждые 2-20 лет. После успешного лечения, может быть желательным для пациента проходить поддерживающую терапию, чтобы предупредить рецидив патологического состояния, причем олигонуклеотид вводят в поддерживающих дозах, варьирующих от 0,01 мкг до 100 мг на кг массы тела, от ежедневного введения один или более раз в день до введения один раз в каждые 20 лет, или в дозах, варьирующих от 0,001 мг до 1000 мг.

Некоторые комбинированные терапии

В некоторых вариантах реализации изобретения первый агент, содержащий соединение, описанное в данном документе, вводят совместно с одним или более вторыми агентами. В некоторых вариантах реализации изобретения такие вторые агенты предназначены для лечения того же заболевания, расстройства или патологического состояния, что и первый агент, описанный в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения такие вторые агенты предназначены для лечения другого заболевания, расстройства или патологического состояния, чем первый агент, описанный в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения первый агент предназначен для лечения нежелательного побочного эффекта второго агента. В некоторых вариантах реализации изобретения вторые агенты вводят совместно с первым агентом для лечения нежелательного эффекта первого агента. В некоторых вариантах реализации изобретения такие вторые агенты предназначены для лечения нежелательного побочного эффекта одной или более фармацевтических композиций, описанных в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения вторые агенты вводят совместно с первым агентом для получения комбинированного эффекта. В некоторых вариантах реализации изобретения вторые агенты вводят совместно с первым агентом для получения синергетического эффекта. В некоторых вариантах реализации изобретения совместное введение первого и второго агента дает возможность применять более низкие дозы, чем требовались бы для достижения терапевтического или профилактического эффекта, если бы агенты вводили в качестве независимой терапии. В некоторых вариантах реализации изобретения первый агент вводят субъекту, который не чувствителен или не дает ответа на второй агент. В некоторых вариантах реализации изобретения первый агент вводят субъекту в качестве замещения второго агента.

В некоторых вариантах реализации изобретения одна или более композиций, описанных в данном документе, и одно или более других фармацевтических средств вводят одновременно. В некоторых вариантах реализации изобретения одну или более композиций по изобретению и одно или более других фармацевтических средств вводят в разное время. В некоторых вариантах реализации изобретения одну или более композиций, описанных в данном докуменете, и одно или более других фармацевтических средств вводят совместно в виде одной лекарственной формы. В некоторых вариантах реализации изобретения одну или более композиций, описанных в данном документе, и одно или более других фармацевтических средств получают отдельно.

В некоторых вариантах реализации изобретения вторые агенты включают, но не ограничиваются ими, фактор высвобождения гормона роста (ФВГР), агент, замещающий лептин, агент, снижающий уровень АроСIII, ингибитор ДГАТ1, агент, снижающий уровень холестерина, агент, снижающий уровень не-ЛПВП липидов (например, ЛПНП), агент, повышающий уровень ЛПВП, рыбий жир, ниацин (никотиновая кислота), фибрат, статин, DCCR (соль диазоксида), агент, снижающий уровень глюкозы, или антидиабетические агенты. В некоторых вариантах реализации изобретения первый агент вводят в комбинации с максимально переносимой дозой второго агента. В некоторых вариантах реализации изобретения первый агент вводят субъекту, который не отвечает на максимально переносимую дозу второго агнета.

Примером агента, замещающего лептин, является Myalept®.

Примером фактора высвобождения гормона роста (ФВГР) является Egrifta®.

Примеры агентов, снижающих уровень АроСIII, включают антисмысловой олигонуклеотид АроСIII, отличный от первого агента, фибрат или антисмысловой олигонуклеотид Аро В.

Примером ингибитора ДГATI является LCQ908 (Novartis Pharmaceuticals).

Примеры агентов для снижения уровня глюкозы и/или антидиабетических агенов включают, но не ограничиваются ими, терапевтическое изменение образа жизни, агонист PPAR, ингибитор дипептидилпептидазы (IV), аналог ГПП-1, инсулин или аналог инсулина, стимулятор секреции инсулина, ингибитор SGLT2, аналог человеческого амилина, бигуанид, ингибитор альфа-глюкозидазы, метформин, сульфонилмочевину, росиглитазон, меглитинид, тиазолидиндион, ингибитор альфа-глюкозидазы и тому подобное. Сульфонилмочевина может представлять собой ацетогексамид, хлорпропамид, толбутамид, толазамид, глимепирид, глипизид, глибурид или гликлазид. Меглитинид может представлять собой натеглинид или репаглинид. Тиазолидиндион может представлять собой пиоглитазон или росиглитазон. Альфа-глюкозидаза может представлять собой акарбозу или миглитолом.

Терапия, снижающая уровень холестерина или липидов, может включать, но не ограничиваться ими, статины, секвестранты желчных кислот, никотиновую кислоту и фибраты. Статины могут представлять собой аторвастатин, флувастатин, ловастатин, правастатин, розувастатин и симвастатин и тому подобное. Секвестранты желчных кислот могут представлять собой колесевелам, холестирамин, колестипол и тому подобное. Фибратами могут представлять собой гемфиброзил, фенофибрат, клофибрат и тому подобное. Терапевтическое изменение образа жизни может представлять собой ограничение жира в рационе.

Агенты, повышающие ЛПВП, включают препараты, ингибирующие транспортный белок холестериновых эфиров (СЕТР) (такие как торцетрапиб), агонисты рецептора, активируемого пероксисомными пролифераторами, Аро-А1, пиоглитазон и тому подобное.

Некоторые группы лечения

В некоторых вариантах реализации изобретения соединения, композиции и способы, описанные в данном документе, пригодны для лечении субъектов с липодистрофией. У пациентов с липодистрофией имеется значительный риск развития панкреатита, сердечнососудистых и метаболических заболеваний. Для этих субъектов рецидивирующий панкреатит является изнурительным и потенциально летальным осложнением; другие клинические осложнения включают повышенную склонность к атеросклерозу и диабету.

Липодистрофические синдромы представляют собой группу редких метаболических заболеваний, характеризующихся селективной потерей жировой ткани, что приводит к эктопическому отложению жира в печени и мышцах, а также к развитию резистентности к инсулину, диабету, дислипидемии и стеатозу печени. Эти синдромы классифицируются в генерализованную или частичную липодистрофию в соответствии с лежащей в их основе этиологией (унаследованной или приобретенной) и в соответствии с распределением потери жира (Garg et al., J Clin Endocrinol Metab, 2011, 96:3313-3325; Chan et al., Endocr Pract, 2010, 16:310-323; Simha et al., Curr Opin Lipidol, 2006, 17(2):162-169; Garg, N Engl J Med, 2004, 350:1220-1234).

А. Генерализованная липодистрофия

Генерализованная липодистрофия имеет распространенность 1 на 1 миллион (Garg et al., J Clin Endocrinol Metab, 2011, 96:3313-3325). Генерализованная врожденная липодистрофия (ГВЛ) является основным подтипом унаследованной липодистрофии с распространенностью 1 на 10 миллионов (National Organza for Rare Disorders [NORD], The Physician's Guide to Lipodystrophy Disorders, 2012). ГВЛ обычно диагностируется при рождении и около 300 случаев были зарегистрированы. Приобретенная генерализованная липодистрофия обычно возникает в детском или подростковом возрасте и зарегистрирована примерно в 100 случаях. Точный механизм снижения жира неизвестен: 50 % - идиопатический, 25% - панникулит, 25% - аутоиммунные заболевания (например, ювенильный дерматомиозит). Клинический фенотип генерализованных липодистрофий включает общую потерю подкожного и висцерального жира, низкие уровни лептина и адипонектина, гиперинсулинемию, диабет, гипертриглицеридемию и неалкогольную жировую болезнь печени (НАЖБП). Цирроз чаще встречается при ГВЛ.

В. Частичная липодистрофия

Частичная липодистрофия является очень редким признаком, для которого существует значительная неудовлетворенная медицинская потребность. Связанные с этим патологическим состоянием диабет и/или гипертриглицеридемия могут приводить к серьезным осложнениям (Handelsman et al., Endocrine Practice, 2013; 19 (1):107-116): острому панкреатиту, особенно при уровне триглицеридов >1000 мг/дл; ускоренным микрососудистым осложнениям из-за неконтролируемого диабета; ускоренному сердечнососудистому заболеванию из-за нарушений липидного обмена и резистентности к инсулину; стеатогепатиту, который может прогрессировать до цирроза; и/илипротеинурным нефропатиям, которые могут прогрессировать до стадии почечной болезни.

Частичная липодистрофия может иметь более высокую распространенность, чем генерализованная липодистрофия, но истинная распространенность неизвестна, так как такое патологическое состояние у этих пациентов очень редко диагностируется (Garg et al., J Clin Endocrinol Metab, 2011, 96:3313-3325; Chan et al., Endocr Pract, 2010, 16:310-323).

Для частичной липодистрофий существуют как генетические, так и приобретенные формы. Приобретенные липодистрофий являются вызванными лекарствами, аутоиммунными механизмами или другими неизвестными механизмами (идиопатическими). Приобретенная форма, наблюдаемая у пациентов с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) на ингибиторах протеазы, стала самой распространенной формой частичной липодистрофий с оценкой в 100000 пациентов в Соединенных Штатах и многих других в других странах.

Приобретенная частичная липодистрофия (ПЧЛ, синдром Барракера-Саймонса) была зарегистрирована примерно в 250 случаях. Начало заболевания обычно происходит в возрасте до 15 лет. Пациенты теряют подкожный жир постепенно, потеря начинается с лица и распространяется вниз, и у большинства пациентов наблюдается потеря жира с лица, шеи, верхних конечностей и туловища, с сохранением на животе и нижних конечностях. Вероятно, потеря жировой ткани является аутоиммунно-опосредованной, о чем свидетельствуют низкие уровни 3 комплемента и 3-нефритогенного фактора в сыворотке. Метаболические осложнения встречаются редко, но у одной пятой пациентов развивается мембранопролиферативный гломерулонефрит.

Семейная частичная липодистрофия (СЧЛ), описанная в 1970-х годах независимо друг от друга Кобберлингом и Данниганом, является наиболее распространенным подтипом унаследованной частичной липодистрофии (National Organization for Rare Disorders [NORD], The Physician's Guide to Lipodystrophy Disorders, 2012). СЧЛ охватывает несколько подтипов, дифференцированных с помощью лежащей в их основе генетической мутации (были идентифицированы шесть подтипов СЧЛ и мутации в 5 генах). Сообщалось, что СЧЛ тип 1 (тип Кобберлинг) была обнаружена у небольшого количества людей, и ее молекулярная основа неизвестна. СЧЛ тип 2, тип Данниган, является наиболее распространенной формой и наилучшим образом охарактеризованным расстройством, обусловленным мисенс мутациями в гене А и С LMNA. Сообщалось, что СЧЛ тип 3 була обнаружена у 30 пациентов, и обусловлена мутациями в гене PPARγ. Сообщалось, что СЧЛ тип 4 была обнаружена у 5 пациентов, и обусловлена мутациями в гене PLIN1. Сообщалось, что СЧЛ тип 5 была обнаружена у 4 членах семьи, которые были имели резистентность к инсулину и диабету, и вызвана мутациями в гене АКТ2. Последний подтип, аутосомно-рецессивная СЧЛ, была идентифицирован недавно у одного пациента с гомозиготной мутацией в CIDEC. Некоторые индивидуумы с СЧЛ не имеют мутаций ни в одном из этих генов, что указывая на то, что дополнительные, пока еще неидентифицированные гены могут вызывать это расстройство.

Диагностирование частичной липодистрофии является главным образом клиническим и должно учитываться у пациентов с триадой симптомов: резистентность к инсулину (с или без явного диабета), значительная дислипидемия в форме гипертриглицеридемии и стеатоз печени (Huang-Dorang et al., J Endocrinol, 2010, 207:245-255). Пациенты часто имеют диабет и выраженную резистентность к инсулину, требующую высоких доз инсулина. Другими свидетельствами серьезной резистентности к инсулину являются наличие папиллярно-пигментной дистрофии кожи, синдрома поликистозных яичников (с такими симптомами, как гиперандрогения и олигоменорея). У некоторых пациентов развивается тяжелая гипертриглицеридемия, приводящая к эпизодам панкреатита. У многих пациентов уровни триглицеридов (ТГ) остаются постоянно повышенными, несмотря на полностью оптимизированную терапию или модификации диеты. Рентгенологические данные о стеатозе печени или стеатогепатитах с гепатомегалией и/или повышенными трансаминазами не являются необычными (Handelsman et al., Endocrine Practice, 2013, 19 (1):107-116). По сравнению с другими подтипами, тип 3 СЧЛ, по-видимому, имеет более легкие метаболические нарушения. Эти пациенты могут также иметь аномальные секреции ЛГ/ФСГ и проблемы с фертильностью, а также сердечно-сосудистую и почечную патологию (Handelsman et al., Endocrine Practice, 2013, 19(1):107-116). Пациенты с типом Данниган имеют более высокий риск ишемической болезни сердца и других типов атеросклеротических заболеваний. Хотя и очень редко, у пациентов со специфической мутацией в гене LMNA повышен риск развития кардиомиопатии и связанных с ней осложнений, застойной сердечной недостаточности и дефектов проводимости.

Тщательная клиническая оценка распределения жира путем визуального и физикального обследования может подтвердить диагноз. Пациенты с СЧЛ имеют уменьшенное содержание подкожного жира в конечностях и области туловища, и могут иметь избыточное подкожное отложение жира в области шеи, лица и внутрибрюшной области. Пациенты с типом Данниган имеют нормальное распределение жировых отложений в детском возрасте и постепенно теряют подкожный жир с конечностей и туловища во время полового созревания. У женщин потеря жира может быть наиболее явной на ягодицах и бедрах. В то же время эти пациенты накапливают жир на лице ("двойной подбородок") и шеи и верхней часть спины ("кушингоидная внешность с бычьим горбом"). При типе Кобберлинг потеря жира обычно ограничивается руками и ногами. У пациентов с мутациями PPAR гамма быстрая потеря жира имеет более дистальное распределение, более выраженное в задней части голени и предплечье, чем на бедрах и руках. У пациентов с мутациями PLIN1 потеря жира была более выраженной в нижних конечностях и ягодицах. У пациентов с мутациями АКТ2 потеря жира более выражена на руках и ногах. Степень потери жировой ткани обычно определяет тяжесть метаболических нарушений. Пациенты имеют выраженную мускулатуру и флебомегалию (расширенные вены) в конечностях и жалуются на непропорциональную гиперфагию. Патологическое состояние у женщин более легко распознается, чем у мужчин, и поэтому о нем сообщается чаще. Пациенты также могут иметь семейную историю с похожим внешним видом и/или потерей жира.

Генетическое исследование, когда оно доступно, является подтверждающим. (Hegele et al., J. Lipid Res, 2007, 48:1433-1444; Garg et al., J Clin Endocrinol Metab, 2011, 96:3313-3325; Huang-Dorang et al., J Endocrinol, 2010, 207:245-255).

С. Доступные в настоящее время методы лечения липодистрофии

Современное лечение липодистрофии включает изменение образа жизни путем снижения потребления калорий и увеличения расхода энергии с помощью упражнений. Традиционные методы лечения, применяемые для лечения тяжелой резистентности к инсулину (например, метформин, тиазолидиндионы, ГПП-1, инсулин) и/или высоких ТГ (фибраты, рыбий жир), являются не очень эффективными для этих пациентов (Chan et al., Endocr Pract, 2010, 16:310-323).

Для пациентов с ВИЧ-ассоциированной липодистрофией Egrifta^® (тезаморелин) является коммерчески доступной для снижения избыточного брюшного жира (Egrifta^® Package Insert, 2013). Egrifta^®, фактор высвобождения гормона роста была оценена в двух клинических исследованиях, включавших 816 ВИЧ-инфицированных взрослых мужчин и женщин с липодистрофией и избытком брюшного жира. Egrifta^® демонстрировала более значительное уменьшение брюшного жира, измеренное с помощью компьютерной томографии, по сравнению с плацебо. Некоторые пациенты сообщали об улучшении самовосприятия (Egrifta^® Package Insert, 2013).

У пациентов с генерализованной липодистрофией метаболические осложнения связаны с дефицитом лептина. Myalept® (метрелептин) был одобрен в качестве лептинзаместительной терапии для лечения осложнений дефицита лептина в дополнение к диете у пациентов с врожденной или приобретенной генерализованной липодистрофией (Myalept® Package Insert, 2014). Безопасность и эффективность Myalepta® оценивали в двух открытых исследованиях, проведенных в НИЗ, которые включали 72 пациента (48 с генерализованной липодистрофией и 24 с частичной липодистрофией) с диабетом, с высоком уровнем ТГ и повышенными уровнями тощакового инсулина. Myalept® был эффективен в снижении HbAlc, тощаковой глюкозы, и триглицеридов (Myalept®, FDA Briefing Document, 2013; Oral et al., N Engl J Med, 2002, 346:570-578; Chan et al., Endocr Pract, 2011, 17(6):922-932).

В клиническом исследовании НИЗ у пациентов с частичной липодистрофией Myalept® имел более разнообразный и ослабленный ответХотя все пациенты с генерализованной липодистрофией имели низкие уровни лептина [среднее (СД):1,3 (1,1) нг/мл], пациенты с частичной липодистрофией имели более широкий диапазон начальных значений лептина [среднее (СД):4.9 (3.1) нг/мл]. У пациентов с частичной липодистрофией более выраженное улучшение метаболических показателей наблюдалось у пациентов с низкой начальной концентрацией лептина. Например, в то время как среднее изменение по сравнению с исходным уровнем HbAlc на 12 месяце составляло -0,9% для пациентов с частичной липодистрофией и низкими уровнями лептина, для пациентов с частичной липодистрофией и более высокими уровнями лептина оно составляло только -0,1% (Myalept®, FDA Briefing Document, 2013).

Из-за соображений безопасности Myalept® доступен только через программу оценки рисков и стратегии смягчения последствий (REMS), которая требует сертификации по рецепту и фармации и специальной документации (Myalept®, FDA Briefing Document, 2013; Chan et al., Endocr Pract, 2011, 17(6):922-932). Три случая Т-клеточной лимфомы были отмечены у пациентов с приобретенной генерализованной липодистрофией, принимающих Myalept®. Большинство пациентов, подвергшихся лечению Myalept®, вырабатывали антитела к лекарству, имеющие нейтрализующую активность по отношению к эндогенному лептину или Myalept®; это потенциально может привести к серьезным инфекциям или потере эффективности лечения.

В настоящее время не существует специфического фармакологического лечения неятрогенных форм частичной липодистрофии.

Соответственно существует необходимость в обеспечении пациентов новыми возможностями лечения липодистрофии.

Известно, что ингибирование АроСIII снижает уровни ТГ, снижает уровни HbAlc и/или повышает уровни ЛПВП у субъектов. Снижение уровней ТГ, HbAlc и/или повышение уровня ЛПВП, ингибирование АроСIII соединениями и композициями, описанными в данном документе, может предупреждать, лечить, замедлять или улучшать липо дистрофию или ее симптомы у пациента. Снижение уровней ТГ, HbAlc и/или повышение уровня ЛПВП, ингибирование АроСIII соединениями и композициями, описанными в данном документе, может предупреждать, лечить, замедлять или улучшать заболевание, расстройство или его симптом, связанный с липодистрофией. Ингибирование АроСIII с помощью описанных в данном документе соединений и композиций может предупреждать, лечить, замедлять, облегчать или снижать риск сердечно-сосудистого заболевания у пациентов с липодистрофией. Ингибирование АроСIII с помощью описанных в данном документе соединений и композиций может предупреждать, лечить, замедлять, облегчать или снижать риск метаболического заболевания у пациентов с липодистрофией. Ингибирование АроСIII с помощью описанных в данном документе соединений и композиций может предупреждать, лечить, замедлять, облегчать или снижать риск панкреатита у пациентов с липодистрофией. Ингибирование АроСIII с помощью описанных в данном документе соединений и композиций может улучшить метаболический профиль пациентов с липодистрофией. Ингибирование АроСIII с помощью описанных в данном документе соединений и композиций может предупреждать, лечить, замедлять, облегчать или уменьшать количество и/или тяжесть осложнений, связанных с диабетом, у пациентов с липодистрофией. Ингибирование АроСIII с помощью описанных в данном документе соединений и композиций может предупреждать, лечить, замедлять, облегчать или уменьшать количество и/или тяжесть осложнений, связанных с диабетом, у пациентов с липодистрофией. Ингибирование АроСIII с помощью описанных в данном документе соединений и композиций может улучшить чувствительность к инсулину у пациентов с липодистрофией. Ингибирование АроСIII с помощью описанных в данном документе соединений и композиций может предупреждать, лечить, замедлять, облегчать или уменьшать стеатоз печени, НАЖБП, НАСГ и/или цирроз печени у пациентов с липодистрофией.

Некоторые соединения

Ранее нами были описаны композиции, содержащие антисмысловые соединения, нацеленные на АроСIII, и способы ингибирования АроСIII антисмысловыми соединениями в US 20040208856 (патент США 7598227), US 20060264395 (патент США 7750141), WO 2004/093783 и WO 2012/149495, все включены в данный документ посредством ссылок. В этих заявках была разработана серия антисмысловых соединений для нацеливания на различные области РНК АроСIII человека с использованием опубликованных последовательностей (нуклеотиды 6238608-6242565 номера доступа GenBank NT_035088. 1, представляющие собой геномную последовательность, включенную в данный документ как SEQ ID NO: 4, и номера доступа GenBank NM_000040. 1, включенную в данный документ как SEQ ID NO:1). Соединения представляли собой химерные олигонуклеотиды ("гэпмеры") длиной 20 нуклеотидов, включающие центральную "гэп" область, состоящую из десяти 2'-дезоксинуклеотидов, фланкированных с двух сторон (в 5 'и в 3' направлении) пятинуклеотидными "крыльями". Крылья состоят из 2'-O-(2-метоксиэтил) нуклеотидов, также известных как (2'-МОЕ) нуклеотиды. Межнуклеозидные (каркасные) связи являются тиофосфатными (Р=S) во всем олигонуклеотиде. Все остатки цитозина представляют собой 5-метилцитозины.

Антисмысловые соединения анализировали на их влияние на уровни мРНК АроСIII человека в клетках HepG2 с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Несколько соединений продемонстрировали ингибирование по меньшей мере 45% мРНК АроСIII и поэтому являются предпочтительными. Несколько соединений продемонстрировали ингибирование по меньшей мере 50% мРНК АроСIII человека и поэтому являются предпочтительными. Несколько соединений продемонстрировали ингибирование по меньшей мере 60% мРНК АроСIII человека и поэтому являются предпочтительными. Несколько соединений продемонстрировали ингибирование по меньшей мере 70% мРНК АроСIII человека и поэтому являются предпочтительными. Несколько соединений продемонстрировали ингибирование по меньшей мере 80% мРНК АроСIII человека и поэтому являются предпочтительными. Несколько соединений продемонстрировали ингибирование по меньшей мере 90% мРНК АроСIII человека и поэтому являются предпочтительными.

Области мишени, к которым эти предпочтительные антисмысловые соединения комплементарны, называются "предпочтительными сегментами-мишенями" и поэтому являются предпочтительными для нацеливания антисмысловыми соединениями.

ПРИМЕРЫ

Неограничивающее описание и включение посредством ссылки

Хотя некоторые соединения, композиции и способы, описанные в данном документе, были описаны в соответствии с некоторыми вариантами реализации изобретения, следующие примеры служат только для иллюстрации соединений, описанных в данном документе, и не подразумевают его ограничения. Каждая ссылка, упоминаемая в настоящей заявке, включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

Пример 1: ISIS 304801 Клиническое исследование частичной липодистрофии

Как описано в данном документе, многоцентровое, рандомизированное, двойное слепое плацебо-контролируемое исследование будет проводиться на пациентах с частичной липодистрофией для оценки ответа и фармакодинамического эффекта исследуемого препарата ISIS 304801. Пациенты с частичной липодистрофией имеют диабет и другие нарушения обмена веществ, включая повышенные уровни триглицеридов, что увеличивает риск развития панкреатита. ISIS 304801 был ранее описан в патенте США 7,598,227 и имеет последовательность 5'-AGCTTCTTGTCCAGCTTTAT-3' (SEQ ID NO: 3) начиная с положения 508 в SEQ ID NO: 1 (номер доступа GENBANKNM_000040. 1) или начиная с положения 3139 в SEQ ID NO: 2 (номер доступа GENBANK NT_033899. 8, укороченная от нуклеотида 20262640 до 20266603). ISIS 304801 имеет гэпмерный мотив 5-10-5 МОЕ, содержащий сегмент гэпа, состоящий из 10 связанных дезоксинуклеозидов, сегмент 5' крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов, сегмент 3' крыла, состоящий из пяти связанных нуклеозидов, причем сегмент гэпа расположен непосредственно рядом с и между сегментом 5' крыла и сегментом 3' крыла, и при этом каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтильный сахар, при этом каждый цитозин представляет собой 5'-метилцитозин, и при этом по меньшей мере одна межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь. Было показано, что ISIS 304801 является сильным ингибитором АроС-III и является переносимым при введении субъектам.

Группа пациентов

В этом клиническом исследовании будет зарегистрировано до 60 пациентов, отвечающих следующим критериям.

A. Клинический диагноз липодистрофии, основанный на неполном дефиците подкожных жировых отложений, оценивается с помощью физического обследования, и по меньшей мере 1 основного критерия и 1 второстепенного критерия (ниже):

Основные критерии

a) Малая толщина кожной складки в передней части бедра, измеренная с помощью каверномера: мужчины (≤10 мм) и женщины (≤22 мм) или

b) Генетическая диагностика семейной ЧЛ (например, мутации в генах LMNA, PPAR-γ, АКТ2, CIDEC или PLIN1)

Второстепенные критерии

a) Резистентность к инсулину, определяемая как уровень тощакового инсулина ≥20 мкЕ/мл

b) Сахарный диабет

c) Папиллярно-пигментная дистрофия кожи

d) Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) или СПКЯ-подобные симптомы (гирсутизм, олигоменорея и/или поликистоз яичников)

e) Наличие в анамнезе панкреатита, связанного с гипертриглицеридемией

f) Стеатоз печени или стеатогепатит в анамнезе

g) Подобное распределение жира и/или история потери жировой ткани у родственника первой степени

h) Выраженная мускулатура и флебомегалия (расширенные вены) в конечностях

i) Диспропорциональная гиперфагия

B. Тощаковые уровни ТГ ≥500 мг/дл (≥5,7 ммоль/л) при скрининге и первоначальном визите. Если тощаковое значение ТГ при скрининге и/или первоначальном визите составляет <500 мг/дл (<5,7 ммоль/л), но ≥350 мг/дл (≥4,0 ммоль/л), может быть проведено до двух дополнительных тестов для оценки.

План клинического исследования

Пациенты будут рандомизированы 1:1 (ISIS 304801: плацебо) и стратифицированы уровнем ALT (>2х верхняя граница нормального диапазона [ULN] vs. ≤2х ULN). Для каждого пациента период участия состоит из периода скрининга ≤8 недель, который включает в себя 6-недельный период стабилизации диеты, в течение которого пациентам будет предложено продолжить свое текущее питание. Исходные оценки будут проводиться с недели -2 по неделю -1 в течение скринингового периода и в 1-й день исследования (день введения первой дозы препарата пациенту).

После стабилизации диеты до 60 подходящих пациентов будут рандомизированы в соотношении 1:1, чтобы получать 300 мг ISIS 304801 или плацебо один раз в неделю в течение 52 недель. Пациенты будут обучены самостоятельному введению препарата. В течение периода лечения пациенты будут отчитываться перед исследовательским центром о посещении клиники минимум 10 раз в течение недель 1-52 (около или в неделю 1,4, 8, 12, 13, 19, 25, 26, 32, 38, 44, 51 и 52). Исследуемый препарат будет вводится один раз в неделю. Сбор и измерение жизненных показателей, результаты физикального обследования, обхват талии, измерения кожной складки, ДЭРА сканирования, электрокардиограммы (ЭКГ), МРТ печени, эхокардиограммы, клинические лабораторные параметры (включая гематологию, биохимический анализ крови, липидную панель, глюкозу плазмы, инсулин, С-пептид и СРБ, анализ мочи и другие аналиты), минимальные концентрации ISIS 304801 в плазме, тестирование иммуногенности, 7-балльный СКГК, сбор результатов СКГК и дневника голодания, нежелательные явления (НЯ), сопутствующая информация о медикаментах/процедурах и оценки качества жизни будут проводиться в соответствии с графиком процедур. Нежелательные явления (НЯ) в месте инъекции следует собирать как НЯ. Консультации по диете/алкоголю начнутся в начале периода стабилизации диеты и будут усиливаться с интервалами в течение всего периода лечения и последующего наблюдения.

Пациенты будут голодать до того, как будут отобраны все образцы липидов, а образцы, отобранные локально, должны быть отправлены в центральную лабораторию для анализа. Отбор проб крови для липидных панелей в неделях 12, 25 и 51 может проводиться медсестрой на дому, если это является более удобным для пациента. Необходимо приложить все усилия, чтобы доза на предыдущей неделе была дана за 7 дней до запланированного посещения клиники. Инструкции о дозировании и обучение будут предоставлены пациенту, где это применимо.

Все визиты будут иметь интервал для проведения визита по меньшей мере ±2 дня. Все разумные попытки должны быть предприняты для обеспечения соблюдения графика визитов. Однако в случае, если визит не происходит или задерживается, все последующие посещения будут рассчитываться на основе времени, прошедшего с 1-го дня исследования, а не с даты предыдущего посещения.

После завершения оценок во время визита на недели 52, пациенты войдут в 13-недельный период оценки после лечения. Этот период состоит из двух посещений исследовательского центра на неделях 58 и 65. В альтернативном варианте, после завершения оценок визита на неделе 52, пригодные пациенты могут по собственному выбору получать ISIS 304801 в открытом расширенном исследовании (ОРИ), до утверждения исследования комитетом по этике IRB/IEC и соответствующим регулирующим органом. В этом случае пациенты не будут участвовать в периоде оценки после лечения.

Сопутствующие медикаменты и НЯ будут регистрироваться на протяжении всех периодов исследования.

Исследуемый препарат

Будет предоставлен раствор исследуемого препарата ISIS 304801 (200 мг/мл, 1,5 мл), содержащийся в предварительно заполненных шприцах (ПЗШ). Квалифицированный специалист будет вводить или пациент будет самостоятельно вводить 300 мг исследуемого препарата в виде одной инъекции подкожно в живот, бедро или переднюю область плеча каждый день приема.

Результаты

Будет выполнен первичный анализ эффективности, чтобы сравнить процентные изменения тощакового уровня ТГ в группе приема ISIS 304801 и группе плацебо от исходного уровня до временной точки первичного анализа в популяции полного анализа (ППА). Первичный анализ эффективности будет проводиться после завершения визита на неделе 52 последним пациентом и закрытия базы данных, и будет основан на процентном изменении тощакового уровня ТГ от исходного уровня до точки первичного анализа (конец месяца 3).

Второстепенные критерий оценки, подлежащие анализу, включают: абсолютное изменение тощакового ТГ на 3, 6 и 12 месяцах; доля пациентов, которые достигают снижения тощакового ТГ на ≥40% на 3, 6 и 12 месяцах; изменение HbAlc на 6, 9 и 12 месяцах; изменение тощакового уровня глюкозы в плазме на 6, 9 и 12 месяцах; и изменение объема печени и стеатоза печени (по данным МРТ) на 6 и 12 месяцах.

Третичные/эксплоративные конечные точки, которые могут быть оценены, включают следующее:

Гликемический индекс

- Процент пациентов с HbAlc< 7%

- Процент пациентов с уменьшением HbAlc >1% от исходного уровня

- Изменение 24-часовой глюкозы (с использованием 7-бального СКГК)

- Изменение HOMA-IR

- Изменение тощакового инсулина и С-пептида

- Сокращение потребления инсулина Липиды

- Изменения других показателей тощаковых липидов: ХС-ЛПВП, ХС-ЛПНП, общего холестерина, ХС-ЛПОНП, ХС-не-ЛПВП, ароВ (например, ароВ-48 или ароВ-100), apoAl, ароС-III (общих, хиломикрон, ЛОНП, ЛПНП и ЛПВП) и свободных жирных кислот (СЖК)

- Изменение размера/количества липопротеиновых частиц

Жировая ткань

- Изменение толщины кожной складки и ДЭРА

- Изменение объемов VAT (висцеральной абдоминальной жировой ткани) и SAT (подкожной абдоминальной жировой ткани).

- Изменение адипонектина и лептина

- Изменение массы тела и окружности талии

Анкета в рамках клинического исследования с оценками результатов, полученными от пациента

- Изменение качества жизни (EQ-5D, SF36)

- Изменение шкалы голода

- Изменение широко распространенной боли

Прочие

- Изменение тестостерона

Результаты будут опубликованы, после того, как они будут получены.

Фармакокинетический (ФК), фармакодинамический анализ (ФД) и анализ иммуногенности (ИГ)

Фармакокинетические (ФК), фармакодинамические (ФД) и иммуногенные свойства ISIS 304801 будут оцениваться и будут опубликованы, после того, как они будут получены.

Оценка безопасности

Конечные точки безопасности, подлежащие оценке, или методы оценки безопасности включают следующее:

- НЯ, включая подтвержденные случаи панкреатита и ТНССЯ

- Показатели жизнедеятельности и вес

- Физикальный осмотр

- Клинические лабораторные исследования (биохимический анализ крови, гематология, коагуляция, анализ мочи)

- Эхокардиография

- ЭКГ

- Использование сопутствующих препаратов

- МРТ

Оценки безопасности будут опубликованы, после того, как они будут получены.

1. Применение антисмыслового соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, имеющего последовательность нуклеиновых оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из последовательности нуклеиновых оснований из SEQ ID NO: 3, для предупреждения, замедления или облегчения частичной липодистрофии у животного.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность SEQ ID NO: 3.

3. Применение по п. 1, отличающееся тем, что последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или на 100%, комплементарна последовательности нуклеиновых оснований из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4.

4. Применение по п. 1, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид состоит из одноцепочечного модифицированного олигонуклеотида.

5. Применение по п. 1, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов.

6. Применение по п. 5, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов.

7. Применение по п. 1 или 6, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, сахарный фрагмент или нуклеиновое основание.

8. Применение по п. 7, отличающееся тем, что по меньшей мере одна модифицированная межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида представляет собой тиофосфатную межнуклеозидную связь, по меньшей мере один модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар или 2'-O-метиоксиэтил, и по меньшей мере одно модифицированное нуклеиновое основание представляет собой 5-метилцитозин.

9. Применение по п. 1, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид содержит:

(a) сегмент гэпа, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов;

(b) сегмент 5'-крыла, состоящий из связанных нуклеозидов;

(c) сегмент 3'-крыла, состоящий из связанных нуклеозидов;

причем сегмент гэпа расположен непосредственно рядом и между сегментом 5'-крыла и сегментом 3'-крыла, и при этом каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит модифицированный сахар.

10. Применение по п. 1, отличающееся тем, что модифицированный олигонуклеотид содержит:

(a) сегмент гэпа, состоящий из 10 связанных дезоксинуклеозидов;

(b) сегмент 5'-крыла, состоящий из 5 связанных нуклеозидов;

(c) сегмент 3'-крыла, состоящий из 5 связанных нуклеозидов;

причем сегмент гэпа расположен расположен непосредственно рядом и между сегментом 5'-крыла и сегментом 3'-крыла, при этом каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтильный сахар, и при этом каждый цитозин представляет собой 5'-метилцитозин, и при этом по меньшей мере одна межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь.

11. Применение по любому из пп. 1-6 или 8-10, отличающееся тем, что соединение вводят парентерально.

12. Применение по п. 11, отличающееся тем, что парентеральное введение представляет собой подкожное введение.

13. Применение по любому из пп. 1-6, 8-10 или 12, дополнительно включающее второй агент.

14. Применение по п. 13, отличающееся тем, что второй агент выбран из лептин-заместительной терапии, агента, снижающего уровень ApoCIII, агента, снижающего уровень холестерина, агента, снижающего уровень не-ЛПВП липидов, агента, снижающего уровень ЛПНП, агента, снижающего уровень ТГ, агента, повышающего уровень ЛПВП, рыбьего жира, ниацина, фибрата, статина, DCCR (соль диазоксида), агента, снижающего уровень глюкозы или антидиабетических агентов.

15. Применение по п. 13, отличающееся тем, что второй агент вводят совместно или последовательно с соединением.

16. Применение по любому из пп. 1-6, 8-10, 12, 14 или 15, отличающееся тем, что соединение представляет собой солевую форму.

17. Применение по любому из пп. 1-6, 8-10, 12, 14 или 15, дополнительно содержащее фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

18. Применение по любому из пп. 1-6, 8-10, 12, 14 или 15, отличающееся тем, что соединение является конъюгированным.

19. Применение по любому из пп. 1-6, 8-10, 12, 14 или 15, отличающееся тем, что пациент с частичной липодистрофией идентифицирован с помощью генетического скрининга.