Способ и фармацевтическая комбинация для устранения иммуносупрессии в микроокружении опухоли или стимуляции активности иммунной системы против раковых клеток

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и касается лечения рака. Для этого вводят комбинацию, содержащую ингибитор гистондеацетилазы (HDAC) и нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек. Это обеспечивает эффективное лечение рака за счет синергетического действия компонентов комбинации в отношении устранения иммуносупрессии в микроокружении опухоли и стимуляции активности иммунной системы против раковых клеток. 2 н. и 18 з.п. ф-лы, 13 пр., 13 ил.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области иммунотерапии. В частности, настоящее изобретение относится к созданию фармацевтической комбинации и к области ее применения для регуляции микроокружения опухоли и иммунотерапии рака.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Иммунная терапия рака представляет собой быстро развивающуюся область, в которой сделаны впечатляющие и многообещающие открытия. Открытие существования антигенов, ассоциированных с опухолями, в настоящее время предоставляет возможность использования системы организма-хозяина для вмешательства в рост опухоли. В настоящее время ведутся исследования различных механизмов использования как гуморального, так и клеточного звена иммунной системы для иммунотерапии рака.

Было предложено несколько стратегий разрушения иммунной толерантности, включая адоптивный перенос иммунных эффекторов, иммуномодулирующую терапию и вакцинацию. Однако эти стратегии по-прежнему не позволяют предотвратить ускользание от иммунного ответа. Основным путями ускользания от иммунного ответа, используемыми раковыми клетками, являются механизмы, связанные с активацией антиапоптозных сигнальных путей, митоген-активируемой протеинкиназой (МАПК) и циклическим аденозинмонофосфатом (цАМФ). Микроокружение опухоли представляет собой важное поле для исследований, поскольку она динамически основана на прогрессировании опухоли. Опухоли развивают механизмы, позволяющие избежать иммунного контроля, за счет процесса, называемого иммунным редактированием, обеспечивающим селективное давление в микроокружении опухоли, способное привести к злокачественному прогрессированию. В фазе стимулирования опухоли, называемой "ускользанием от иммунного ответа", иммунная система может способствовать дальнейшему прогрессированию опухоли путем отбора раковых клеток, которые в большей степени способны к выживанию в условиях иммунологической активности организма-хозяина или путем изменения микроокружения опухоли таким образом, чтобы оно способствовало росту опухоли.

Гомеостаз иммунной системы включает присутствие как стимулирующих, так и ингибирующих механизмов, предназначенных для контроля баланса иммунного ответа. Ингибирующие механизмы включают цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный антиген-4 (CTLA-4, гомолог CD28), и белок программируемой клеточной смерти-1 (PD-1) или его лиганд (PD-L1), TIM-3 (Т-клеточный иммуноглобулин-3), BTLA (аттенюатор В- и Т-лимфоцитов), VISTA (V-доменный Ig-супрессор активации Т-клеток) и LAG-3 (ген активации лимфоцитов 3). В настоящее время многие моноклональные антитела, являющиеся ингибиторами иммунных контрольных точек, включая антитела к CTLA-4, антитела к PD-1 и антитела к PD-L1, были зарегистрированы FDA США и ЕМА для терапевтического применения по нескольким онкологическим показаниям. Однако, при применении этих ингибиторов иммунных контрольных точек приблизительно у 20%-30% пациентов с раком наблюдается ответ опухоли на монотерапию. Эффективность по-прежнему остается неудовлетворительной.

Патентная заявка США 20180244783 предлагает ингибиторы пути Wnt в сочетании с иммунотерапевтическими агентами для терапии рака и других заболеваний. Патентная заявка США 20180355042 предлагает комбинации, которые содержат HDACi и ингибитор PD-1, которые применимы для лечения рака, включая сокращение и/или предотвращение появления раковых метастазов. Тем не менее, по-прежнему сохраняется необходимость в разработке терапевтического решения, позволяющего достигнуть более выраженной противоопухолевой активности.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В рамках настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что комбинация, содержащая ингибитор гистондеацетилазы (далее - «ингибитор HDAC») и нестероидные противовоспалительные препараты (далее - «НПВП») может влиять на микроокружение опухоли, указывая на то, что такая комбинация в сочетании с ингибиторами иммунных контрольных точек заметно повышает противораковую активность. Согласно настоящему изобретению, лечение с применением фармацевтической комбинации в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек значительно увеличивает противораковую активность по сравнению с применением только одного ингибитора иммунных контрольных точек. Комбинированная терапия с применением фармацевтической комбинации в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек обеспечивает более высокую эффективность в ингибировании роста опухоли, по сравнению с применением ингибитора HDAC в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек. Кроме того, сочетание фармацевтической комбинации и ингибитора иммунных контрольных точек в значительной степени уничтожает опухоль и увеличивает выживаемость примерно до 70-80%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается способ устранения иммуносупрессии в микроокружении опухоли или стимуляции активности иммунной системы против раковых клеток, включающий введение субъекту комбинации из ингибитора HDAC и НПВП в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек. Способ может обеспечить ингибирование или лечение рака посредством иммунотерапии. В одном из вариантов осуществления изобретения, количества ингибитора HDAC и НПВП в комбинации находятся в интервале значений от приблизительно 5% до приблизительно 40% (вес.) и от приблизительно 5% до приблизительно 40% (вес.), соответственно.

В другом варианте осуществления изобретения комбинация дополнительно содержит бигуанидное соединение. Количество бигуанидного соединения находится в интервале значений от приблизительно 40% до 80% (вес.).

В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор HDAC представляет собой селективный ингибитор HDAC класса I. В частности, ингибитор HDAC представляет собой ингибитор HDAC класса бензамидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор HDAC выбирают из группы, состоящей из хидамида, энтиностата, вориностата, ромидепсина, панобиностата, белиностата, панобиностата, вальпроевой кислоты, моцетиностата, абексиностата, энтиностата, прациностата, резминостата, гивиностата и квизиностата.

В некоторых вариантах осуществления изобретения НПВП выбирают из группы, состоящей из аспирина, ибупрофена, индометацина, напроксена или ингибитора ЦОГ-2. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор ЦОГ-2 выбирают из группы, состоящей из целекоксиба, рофекоксиба и эторикоксиба.

В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор иммунных контрольных точек выбирают из группы, состоящей из антитела к CTLA-4, антитела к PD-1 или антитела к PD-L1. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор иммунных контрольных точек выбирают из группы, состоящей из ламбролизумаба, пидилизумаба, ниволумаба, дурвалумаба, авелумаба, атезолизумаба и MIH1.

В некоторых вариантах осуществления изобретения раковое заболевание выбирают из группы заболевания, состоящей из глиобластомы, рак печени, колоректальной карциномы, глиобластомы, рака желудка, колоректального рака, рака пищевода, рака легких, рака поджелудочной железы, почечноклеточной карциномы, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, рака предстательной железы, рака яичников, меланомы, рака молочной железы, хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), карциномы из клеток Меркеля, неходжкинской лимфомы, острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), рака желчного пузыря, холангиокарциномы, рака мочевого пузыря и рака матки.

В одном из вариантов осуществления изобретения способ дополнительно включает введение одного или нескольких дополнительных противораковых агентов.

В одном из вариантов осуществления изобретения предлагается фармацевтическая комбинация, содержащая ингибитор HDAC, НПВП и ингибитор иммунных контрольных точек. Варианты осуществления ингибитора HDAC, NSAID и ингибитора иммунных контрольных точек описаны в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая комбинация дополнительно содержит бигуанидное соединение. В одном из вариантов осуществленя изобретения в фармацевтической комбинации количество бигуанидного соединения находится в интервале значений от приблизительно 30% до приблизительно 70% (вес.).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1, участки с А по D демонстрируют терапевтический ответ на хидамид или энтиностат в сочетании с антителами к PD-1 у мышей, несущих опухоль СТ26. Мыши BALB/c, несущие опухоль толстого кишечника СТ26, получали различные терапевтические воздействия, указанные ниже. IgG, контрольные антитела к IgG (основа-носитель, 10 мг/кг); PD-1, моноклональные антитела к PD-1 (10 мг/кг); CD, хидамид (25 мг/кг); Е, MS-275 (энтиностат, 20 мг/кг). Регистрировали общие значения объема опухоли (участок А), индивидуальные значения объема опухоли (участок В), массу тела мышей, несущих опухоль СТ26 (участок С), выживаемость животных (участок D). Мышей, несущих опухоль СТ26, подвергали указанной терапии и умерщвляли при достижении опухолью объема 3000 мм³ после имплантации опухоли. Указаны средние значения и стандартные отклонения. Также указаны число животных в каждой экспериментальной группе и значения Р. *Р<0,05. Значения Ρ были вычислены с использованием t-критерия Стьюдента, для сравнения размеров опухоли в группе терапии и в группе IgG.

Фиг.2, участки с А по D демонстрируют терапевтический ответ на хидамид плюс метформин в сочетании с антителами к PD-1 у мышей, несущих опухоль СТ26. Мыши BALB/c, несущие опухоль толстого кишечника СТ26, получали различные терапевтические воздействия, указанные ниже. IgG, контрольные антитела к IgG (основа-носитель, 10 мг/кг); PD-1, моноклональные антитела к PD-1 (10 мг/кг); CD, хидамид (12,5, 25 или 50 мг/кг); Е, MS-275 (энтиностат, 20 мг/кг); М, метформин (100 мг/кг). Регистрировали общие значения объема опухоли (участок А), индивидуальные значения объема опухоли (участок В), массу тела мышей, несущих опухоль СТ26 (участок С), выживаемость животных (участок D). Мышей, несущих опухоль СТ26, подвергали указанной терапии и умерщвляли при достижении опухолью объема 3000 мм³ после имплантации опухоли. Указаны средние значения и стандартные отклонения. Также указаны число животных в каждой экспериментальной группе и значения Р. *Р<0,05. Значения Ρ были вычислены с использованием t-критерия Стьюдента, для сравнения размеров опухоли в группе терапии и в группе IgG.

Фиг.3, участки с А по D демонстрируют терапевтический ответ на хидамид или энтиностат плюс метформин и целекоксиб в сочетании с антителами к PD-1 у мышей, несущих опухоль СТ26. Мыши BALB/c, несущие опухоль толстого кишечника СТ26, получали различные терапевтические воздействия, указанные ниже. IgG, контрольные антитела к IgG (основа-носитель, 10 мг/кг); PD-1, моноклональные антитела к PD-1 (10 мг/кг); CD, хидамид (12,5 мг/кг); Е, MS-275 (энтиностат, 20 мг/кг); С, целекоксиб (25 мг/кг); М, метформин (100 мг/кг). Регистрировали общие значения объема опухоли (участок А), индивидуальные значения объема опухоли (участок В), массу тела мышей, несущих опухоль (участок С), выживаемость животных (участок D). Мышей, несущих опухоль СТ26, подвергали указанной терапии и умерщвляли при достижении опухолью объема 3000 мм³ после имплантации опухоли. Указаны средние значения и стандартные отклонения. Также указаны число животных в каждой экспериментальной группе и значения Р. *Р<0,05. Значения Ρ были вычислены с использованием t-критерия Стьюдента, для сравнения размеров опухоли в группе терапии и в группе IgG.

Фиг.4, учестки с А по D демонстрируют терапевтический ответ на хидамид плюс метформин и целекоксиб в различных дозах в сочетании с антителами к PD-1 у мышей, несущих опухоль СТ26. Мыши BALB/c, несущие опухоль толстого кишечника СТ26, получали различные терапевтические воздействия, указанные ниже. IgG, контрольные антитела к IgG (основа-носитель, 10 мг/кг); PD-1, моноклональные антитела к PD-1 (10 мг/кг); CD, хидамид (12,5, 25 или 50 мг/кг); С, целекоксиб (25 или 50 мг/кг); М, метформин (100 или 200 мг/кг). Регистрировали общие значения объема опухоли (участок А), индивидуальные значения объема опухоли (участок В), массу тела мышей, несущих опухоль СТ26 (участок С), выживаемость животных (участок D). Мышей, несущих опухоль СТ26, подвергали указанной терапии и умерщвляли при достижении опухолью объема 3000 мм³ после имплантации опухоли. Указаны средние значения и стандартные отклонения. Также указаны число животных в каждой экспериментальной группе и значения Р. *Р<0,05. Значения Ρ были вычислены с использованием t-критерия Стьюдента, для сравнения размеров опухоли в группе терапии и в группе IgG.

Фиг.5, участки с А по D демонстрируют терапевтический ответ на хидамид плюс метформин и целекоксиб в сочетании с антителами к PD-L1 у мышей, несущих опухоль СТ26. Мыши BALB/c, несущие опухоль толстого кишечника СТ26, получали различные терапевтические воздействия, указанные ниже. IgG, контрольные антитела к IgG (основа-носитель, 10 мг/кг); PD-L1, моноклональные антитела к PD-L1 (10 мг/кг); CD, хидамид (50 мг/кг); С, целекоксиб (50 мг/кг); М, метформин (100 мг/кг). Регистрировали общие значения объема опухоли (участок А), индивидуальные значения объема опухоли (участок В), массу тела мышей, несущих опухоль СТ26 (участок С), выживаемость животных (участок D). Мышей, несущих опухоль СТ26, подвергали указанной терапии и умерщвляли при достижении опухолью объема 3000 мм³ после имплантации опухоли. Указаны средние значения и стандартные отклонения. Также указаны число животных в каждой экспериментальной группе и значения Р. *Р<0,05. Значения Ρ были вычислены с использованием t-критерия Стьюдента, для сравнения размеров опухоли в группе терапии и в группе IgG.

Фиг.6, участки с А по D демонстрируют терапевтический ответ на хидамид плюс метформин и целекоксиб в сочетании с антителами к PD-1 у мышей, несущих опухоль JC. Мыши BALB/c, несущие опухоль молочной железы JC, получали различные терапевтические воздействия, указанные ниже. IgG, контрольные антитела к IgG (основа-носитель, 10 мг/кг); PD-1, моноклональные антитела к PD-1 (10 мг/кг); CD, хидамид (50 мг/кг); С, целекоксиб (50 мг/кг); М, метформин (100 мг/кг). Регистрировали общие значения объема опухоли (участок А), индивидуальные значения объема опухоли (участок В), массу тела мышей, несущих опухоль JC (участок С), выживаемость животных (участок D). Мышей, несущих опухоль JC, подвергали указанной терапии и умерщвляли при достижении опухолью объема 3000 мм³ после имплантации опухоли. Указаны средние значения и стандартные отклонения. Также указаны число животных в каждой экспериментальной группе и значения Р. *Р<0,05. Значения Ρ были вычислены с использованием t-критерия Стьюдента, для сравнения размеров опухоли в группе терапии и в группе IgG.

Фиг.7, участки с А по Ε демонстрируют терапевтический ответ на хидамид (в различных дозах) плюс метформин и целекоксиб в сочетании с антителами к PD-L1 (в различных дозах) или без них у мышей, несущих опухоль СТ26. Мыши BALB/c, несущие опухоль толстого кишечника СТ26, получали различные терапевтические воздействия, указанные ниже. IgG, контрольные антитела к IgG (основа-носитель, 10 мг/кг); PD-L1, моноклональные антитела к PD-L1 (2,5 и 10 мг/кг); CD, хидамид (6,25, 12,5 или 50 мг/кг); С, целекоксиб (50 мг/кг); М, метформин (100 мг/кг). Были зарегистрированы общие значения объема опухоли после терапии антителами к PD-L1 (2,5 или 10 мг/кг) и хидамидом (6,25 или 50 мг/кг) плюс целекоксиб (50 мг/кг) и метформин (100 мг/кг) (участок А), общие значения объема опухоли после терапии хидамидом (6,25, 12,5 или 50 мг/кг) плюс целекоксиб (50 мг/кг) и метформин (100 мг/кг) при отсутствии антител к PD-L1 (участок В), индивидуальные общие значения объема опухоли после терапии хидамидом (6,25, 12,5 или 50 мг/кг) плюс целекоксиб (50 мг/кг) и метформин (100 мг/кг) в присутствии (2,5 или 10 мг/кг) или при отсутствии антител к PD-L1 (участок С), масса тела мышей, несущих опухоль СТ26 (участок D) и выживаемость животных (участок Е). Мышей, несущих опухоль СТ26, подвергали указанной терапии и умерщвляли при достижении опухолью объема 3000 мм³ после имплантации опухоли. Указаны средние значения и стандартные отклонения. Также указаны число животных в каждой экспериментальной группе и значения Р. *Р<0,05. Значения Ρ были вычислены с использованием t-критерия Стьюдента, для сравнения размеров опухоли в группе терапии и в группе IgG.

Фиг.8, участки с А по Ε демонстрируют терапевтический ответ на антитела к PD-1 или антитела к PD-L1 в сочетании с хидамидом плюс целекоксибом, с метформином или без него, у мышей, несущих опухоль СТ26. Мыши BALB/c, несущие опухоль толстого кишечника СТ26, получали различные терапевтические воздействия, указанные ниже. IgG, контрольные антитела к IgG (основа-носитель, 2,5 мг/кг); PD-1, моноклональные антитела к PD-1 (2,5 мг/кг); PD-L1, моноклональные антитела к PD-L1 (2,5 мг/кг); CD, хидамид (50 мг/кг); С, целекоксиб (50 мг/кг); М, метформин (100 мг/кг). Были зарегистрированы общие значения объема опухоли после терапии хидамидом (50 мг/кг) плюс целекоксибом (50 мг/кг) с метформином (100 мг/кг) или без него в присутствии или отсутствии антител к PD-1/PD-L1 (участок А), общие значения объема опухоли после терапии антителами к PD-1 или к PD-L1 в сочетании с хидамидом (50 мг/кг) плюс целекоксибом (50 мг/кг) и метформином (100 мг/кг), в сравнении со значениями в контрольных группах для антител к PD-1 или к PD-L1 (участок В), индивидуальные значения объема опухоли после различных терапевтических воздействий, в соответствии с указанным (участок С), масса тела мышей, несущих опухоль СТ26 (участок D) и выживаемость животных (участок Е). Мышей, несущих опухоль СТ26, подвергали указанной терапии и умерщвляли при достижении опухолью объема 3000 мм³ после имплантации опухоли. Указаны средние значения и стандартные отклонения. Также указаны число животных в каждой экспериментальной группе и значения Р. *Р<0,05. Значения Ρ были вычислены с использованием t-критерия Стьюдента, для сравнения размеров опухоли в группе терапии и в группе IgG.

Фиг.9, участки с А по Η демонстрируют терапевтический ответ на хидамид плюс целекоксиб в различных режимах дозировки в сочетании с антителами к PD-1 у мышей, несущих опухоль СТ26. Мыши BALB/c, несущие опухоль толстого кишечника СТ26, получали различные терапевтические воздействия, указанные ниже. IgG, контрольные антитела к IgG (основа-носитель, 2,5 мг/кг); PD-1, моноклональные антитела к PD-1 (2,5 мг/кг); CD, хидамид (12,5, 25 или 50 мг/кг); С, целекоксиб (12,5, 25 или 50 мг/кг). Были зарегистрированы общие значения объема опухоли после терапии антителами к PD-1 в сочетании с хидамидом 12,5 мг/кг плюс целекоксибом в различных дозах (12,5, 25,0 или 50 мг/кг) (участок А), общие значения объема опухоли после терапии антителами к PD-1 в сочетании с хидамидом 25 мг/кг плюс целекоксибом в различных дозах (12,5, 25,0 или 50 мг/кг) (участок В), общие значения объема опухоли после терапии антителами к PD-1 в сочетании с хидамидом 50 мг/кг плюс целекоксибом в различных дозах (12,5, 25,0 или 50 мг/кг) (участок С), индивидуальные значения объема опухоли после различных терапевтических воздействий, в соответствии с указанным (участок D), масса тела мышей, несущих опухоль СТ26 (участок Е) и выживаемость животных (участки с F по Н). Мышей, несущих опухоль СТ26, подвергали указанной терапии и умерщвляли при достижении опухолью объема 3000 мм³ после имплантации опухоли. Указаны средние значения и стандартные отклонения. Также указаны число животных в каждой экспериментальной группе и значения Р. *Р<0,05. Значения Ρ были вычислены с использованием t-критерия Стьюдента, для сравнения размеров опухоли в группе терапии и в группе IgG.

Фиг.10, участки с А по Η демонстрируют терапевтический ответ на ингибиторы HDAC (хидамид и моцетиностат) плюс ингибиторы ЦОГ-2 (целекоксиб, аспирин и ибупрофен) в сочетании с антителами к PD-1 или антителами к CTLA-4 у мышей, несущих опухоль СТ26. Мыши BALB/c, несущие опухоль толстого кишечника СТ26, получали различные терапевтические воздействия, указанные ниже. IgG, контрольные антитела к IgG (основа-носитель, 2,5 мг/кг); PD-1, моноклональные антитела к PD-1 (2,5 мг/кг); CTLA4, моноклональные антитела к CTLA4 (2,5 мг/кг); CD, хидамид (50 мг/кг); Мос, моцетиностат (30 мг/кг); С, целекоксиб (50 мг/кг); Asp, аспирин (50 мг/кг); Ibu, ибупрофен (50 мг/кг). Были зарегистрированы общие значения объема опухоли после терапии антителами к PD-1 в сочетании с хидамидом (50 мг/кг) плюс ингибитором ЦОГ-2 (целекоксиб 50 мг/кг, аспирин 50 мг/кг или ибупрофен 50 мг/кг), в сравнении со значениями для контрольных групп (только антитела к PD-1 и комбинация без антител к PD-1) (участок А), общие значения объема опухоли после терапии антителами к PD-1 в сочетании с целекоксибом 50 мг/кг плюс ингибитором HDAC (хидамид 50 мг/кг или моцетиностат 30 мг/кг) (участок В), общие значения объема опухоли после терапии антителами к CTLA4 или антителами к PD-1 в сочетании с хидамидом 50 мг/кг плюс целекоксибом 50 мг/кг (участок С), индивидуальные значения объема опухоли после различных терапевтических воздействий, в соответствии с указанным (участок D), масса тела мышей, несущих опухоль СТ26 (участок Е) и выживаемость животных (участки с F по Н). Мышей, несущих опухоль СТ26, подвергали указанной терапии и умерщвляли при достижении опухолью объема 3000 мм³ после имплантации опухоли. Указаны средние значения и стандартные отклонения. Также указаны число животных в каждой экспериментальной группе и значения Р. *Р<0,05. Значения Ρ были вычислены с использованием t-критерия Стьюдента, для сравнения размеров опухоли в группе терапии и в группе IgG.

Фиг.11, участки с А по D демонстрируют терапевтический ответ на хидамид плюс целекоксиб в фиксированных дозах в сочетании с антителами к PD-1 у мышей, несущих опухоль СТ26. Мыши BALB/c, несущие опухоль толстого кишечника СТ26, получали различные терапевтические воздействия, указанные ниже. IgG, контрольные антитела к IgG (основа-носитель, 2,5 мг/кг); PD-1, моноклональные антитела к PD-1 (2,5 мг/кг); CD, хидамид (50 мг/кг); С, целекоксиб (50 мг/кг). Были зарегистрированы общие значения объема опухоли после терапии хидамидом плюс целекоксибом в сочетании с антителами PD-1 или без них (участок А), индивидуальные значения объема опухоли после различных терапевтических воздействий, в соответствии с указанным (участок В), масса тела мышей, несущих опухоль СТ26 (участок С) и выживаемость животных (участок D). Мышей, несущих опухоль СТ26, подвергали указанной терапии и умерщвляли при достижении опухолью объема 3000 мм³ после имплантации опухоли. Указаны средние значения и стандартные отклонения. Число животных каждой экспериментальной группе было увеличено, также указаны значения Р. *Р<0,05. Значения Ρ были вычислены с использованием t-критерия Стьюдента, для сравнения размеров опухоли в группе терапии и в группе IgG.

Фиг.12, участки с А по Ε демонстрируют терапевтический ответ на хидамид плюс метформин и целекоксиб в фиксированных дозах в сочетании с антителами к PD-L1 у голых мышей, несущих опухоль СТ26. Голые мыши BALB/c, несущие опухоль толстого кишечника СТ26, получали различные терапевтические воздействия, указанные ниже. IgG, контрольные антитела к IgG (основа-носитель, 2,5 мг/кг); PD-L1, моноклональные антитела к PD-L1 (2,5 мг/кг); CD, хидамид (50 мг/кг); С, целекоксиб (50 мг/кг); М, метформин (100 мг/кг). Были зарегистрированы общие значения объема опухоли после терапии антителами к PD-L1 в сочетании с хидамидом плюс целекоксибом и метформином, по сравнению со значениями для контрольных групп (участок А), индивидуальные значения объема опухоли после различных терапевтических воздействий, в соответствии с указанным (участок В), масса тела мышей, несущих опухоль СТ26 (участок С), масса опухоли (участок D) и сравнение противоопухолевой активности у нормальных и голых мышей (участок Е).

Фиг.13, участки с А по F демонстрируют терапевтический ответ иммунных клеток после терапии антителами к PD-1 и хидамидом в сочетании с целекоксибом. Мыши BALB/c, несущие метастатические опухоли СТ26, получали терапию в указанных терапевтических режимах, и были проведены анализы путем сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS) для оценки циркулирующих и инфильтрирующих опухоль иммунных клеток. Указаны средние значения и стандартные отклонения, с указанием значений P. IgG, контрольные антитела к IgG (основа-носитель, 2,5 мг/кг); PD-1, моноклональные антитела к PD-1 (2,5 мг/кг); CD, хидамид (50 мг/кг); С, целекоксиб (50 мг/кг). На Фиг.13, участкок А показаны результаты анализов FACS для клеток CD4, CD8, PMN-MDSC, M-MDSC и Tre. Репрезентативные данные анализов FACS показывают процент клеток Ly6G⁺Ly6C^low (PMN-MDSC) и клеток Ly6C⁺Ly6G^- (M-MDSC) в общем массиве циркулирующих клеток CD45⁺CD11b⁺. Мыши, не несущие опухоль, n=6; мыши, несущие опухоль, n=11. На Фиг.13, участок В показаны результаты анализов FACS для циркулирующих клеток M-MDSC для различных указанных терапевтических режимов у мышей, несущих опухоль, в сравнении с мышами, не несущими опухоль. На Фиг.13, участок С показаны результаты анализов FACS для циркулирующих клеток Ly6C⁺Ly6G^- (M-MDSC) на день 12, демонстрирующие корреляцию с соответствующими значениями объема опухоли на день 23 после проведения указанной терапии у мышей, как показано на Фиг.13, участок В. На Фиг.13, участок D показаны результаты анализов FACS для циркулирующих клеток FoxP3⁺ Tregs для указанных режимов терапии, на день 8 и день 12. Репрезентативные данные FACS демонстрируют процент двойных положительных клеток по FoxP3 и CD25 среди циркулирующих лейкоцитов. На Фиг.13, участок Ε показаны результаты анализов FACS для инфильтрирующих опухоль миелоидных клеток (CD11b⁺), клеток ТАМ и клеток M-MDSC для указанных режимов терапии на день 8. На Фиг.13, участок F показаны результаты анализов FACS для инфильтрирующих опухоль клеток CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ Tregs, CD4⁺ Т-клеток и CD8⁺ Т-клеток для указанных режимов терапии на день 8. На Фиг.13, участок G показано соотношение CD4⁺ Т-клеток и клеток Treg в опухолевых тканях, взятых мышей, у несущих опухоль СТ26, после различных режимов терапии, по результатам аналита путем проточной цитометрии. На Фиг.13, участок Η показано соотношение CD8⁺ Т-клеток и клеток Treg в опухолевых тканях, взятых мышей, у несущих опухоль СТ26, после различных режимов терапии, по результатам аналита путем проточной цитометрии. *Р<0,05. Анализ данных для циркулирующих иммунных клеток в каждой группе n=6, анализ данных для инфильтрующих опухоль иммунных клеток в каждой группе n=2.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в настоящем документе, имеют общепринятые значения, понятные обычному специалисту в области техники, к которой относится изобретение. Хотя при практическом применении или испытании изобретения могут быть использованы любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, предпочтительные способы и материалы описаны в настоящее время. Все публикации, упомянутые в настоящем документе, включены в настоящий документ посредством ссылок.

Применение термина в единственном числе означает один или более одного (т.е., по меньшей мере один) грамматического объекта, о котором идет речь. Например, "элемент" означает один элемент или более одного элемента. Использование "или" означает "и/или", если специально не указано иное.

В контексте настоящего документа термины "субъект", "индивидуум" и "пациент" используются взаимозаменяемо и обозначают позвоночный организм, предпочтительно, млекопитающее, и более предпочтительно, человека. К млекопитающим относятся (не ограничиваясь приведенным списком) мышиные, обезьяны, человек, сельскохозяйственные животные, спортивные животные и домашние питомцы. Также включаются ткани, клетки биологического организма и их потомство, полученные in vitro или культивируемые in vitro.

В контексте настоящего документа термин "терапевтически эффективное количество" обозначает количество, достаточное для лечения субъекта, пораженного заболеванием (например, нейродегенеративным заболеванием), или для уменьшения симптомов или осложнений, связанных с заболеванием.

В контексте настоящего документа термины "лечить", "лечение", "терапия" и им подобные обозначают уменьшение или устранение нарушения и/или симптомов, связанных с заболеванием. Следует иметь в виду, что, хотя это и не исключается, лечение нарушения или состояния не требует полного устранения нарушения, состояния или симптомов, связанных с ним.

В контексте настоящего документа термин "иммунотерапия" обозначает терапию субъекта, пораженного или имеющего риск поражения или рецидива заболевания, с использованием способа, включающего усиление, подавление или другую модификацию иммунного ответа.

В контексте настоящего документа термин "белок программируемой клеточной смерти-1 (PD-1)" обозначает иммуноингибирующий рецептор, принадлежащий к семейству CD28. PD-1 экспрессируется преимущественно в ранее активированных Т-клетках in vivo, и связывается с двумя лигандами, PD-L1 и PD-L2. Термин "PD-1", в контексте настоящего документа, включает человеческий PD-1 (hPD-1), варианты, изоформы и гомологи hPD-1, принадлежащие определенным биологическим видам, а также аналоги, имеющие, по меньшей мере, один общий эпитоп с hPD-1. Полная последовательность hPD-1 находится в базе данных GenBank, учетный номер U64863.

В контексте настоящего документа термин "лиганд белка программируемой клеточной смерти 1 (PD-L1)" обозначает один из двух располагающихся на поверхности клеток гликопротеиновых лигандов белка PD-1 (второй представляет собой PD-L2), который оказывает понижающее воздействие на активацию Т-клеток и секрецию цитокинов после связывания с PD-1. Термин "PD-L1", в контексте настоящего документа, включает человеческий PD-L1 (hPD-L1), варианты, изоформы и гомологи hPD-L1, принадлежащие определенным биологическим видам, а также аналоги, имеющие, по меньшей мере, один общий эпитоп с hPD-L1. Полная последовательность hPD-L1 находится в базе данных GenBank, учетный номер Q9NZQ7.

В контексте настоящего документа термин "антитела" и "антигенсвязывающий фрагмент последних" включает иммуноглобулины естественного происхождения (например, IgM, IgG, IgD, IgA, IgE и т.д.), а также иммуноглобулины, не имеющие естественного происхождения, включая, например, одноцепочечные антитела, химерные антитела (например, гуманизированные мышиные антитела), гетероконъюгатные антитела (например, биспецифические антитела), Fab', F(ab').sub.2, Fab, Fv и rIgG. В контексте настоящего документа термин "антигенсвязывающий фрагмент" обозначает часть молекулы антител полной длины, которая сохраняет способность к специфическому распознаванию антигена, а также различные комбинации таких частей.

В контексте настоящего документа термин "рак" обозначает широкую группу различных заболеваний, характеризующихся неконтролируемым ростом имеющих отклонения от нормы клеток в организме. Неконтролируемое деление и рост клеток приводят к образованию злокачественных опухолей, которые вторгаются в соседние ткани, а также могут метастазировать в удаленные части организма через лимфатическую или кровеносную систему. Термин "рак", в контексте настоящего документа, обозначает первичный, метастатический или рецидивирующий рак.

В настоящем изобретении описана разработка способов, которые направлены на обеспечение регуляции компонентов микроокружения опухоли, и, таким образом, на устранение иммунной супрессии в микроокружении опухоли или на стимуляцию действия иммунной системы против раковых клеток. Микроокружение опухоли является важным аспектом биологии рака и вносит вклад в возникновение опухоли, прогрессирование опухоли и развитие ответа на терапию. Микроокружение опухоли состоит из гетерогенной клеточной популяции, которая включает злокачественные клетки и клетки, поддерживающие пролиферацию, инвазию и метастатический потенциал опухоли за счет разнообразных взаимодействий. Опухолевые клетки часто индуцируют формирование иммуносупрессивного микроокружения, которое благоприятствует развитию иммуносупрессивных популяций иммунных клеток, таких как супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSC) и регуляторные Т-клетки (Tregs). Поэтому в микроокружении опухоли были открыты мишени, которые могут помочь направлять и улучшать действие различных средств противораковой терапии, в частности, иммунотерапии, которая работает за счет потенцирования противоопухолевых иммунных ответов организма-хозяина.

Соответственно, в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предлагается способ устранения иммуносупрессии в микроокружении опухоли или стимуляции активности иммунной системы против раковых клеток, включающий введение субъекту фармацевтической комбинации из ингибитора HDAC и НПВП в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек. В качестве альтернативного варианта, в соответствии с настоящим изобретением предлагается использование фармацевтической комбинации из ингибитора HDAC и НПВП в производстве медикамента, предназначенного для устранения иммунной супрессии в микроокружении опухоли или для стимуляции действия иммунной системы против раковых клеток, при этом фармацевтическая комбинация вводится в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек. В качестве альтернативного варианта, в соответствии с настоящим изобретением предлагается фармацевтическая комбинация, предназначенная ля устранения иммунной супрессии в микроокружении опухоли или для стимуляции действия иммунной системы против раковых клеток, при этом фармацевтическая комбинация содержит ингибитор HDAC и НПВП и вводится в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек.

В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения предлагается фармацевтическая комбинация, включающая ингибитор HDAC, НПВП и ингибитор иммунных контрольных точек.

В одном варианте осуществления изобретения количество ингибитора HDAC, НПВП, такого как ингибитор ЦОГ-2 и ингибитора иммунных контрольных точек в фармацевтической комбинации составляет от приблизительно 10% до приблизительно 70% (вес.), от приблизительно 10% до приблизительно 70% (вес.) и от приблизительно 0,5% до приблизительно 20%, соответственно.

В некоторых вариантах осуществления изобретения количество ингибитора HDAC в фармацевтической комбинации находится в интервале значений от приблизительно 20% (вес.) до приблизительно 70% (вес.), от приблизительно 30% до приблизительно 70% (вес.), от приблизительно 40% до приблизительно 70% (вес.), от приблизительно 20% до приблизительно 60% (вес.), от приблизительно 30% до приблизительно 60% (вес.), от приблизительно 40% до приблизительно 60% (вес.) или от приблизительно 35% до приблизительно 60% (вес.).

В некоторых вариантах осуществления изобретения количество НПВП в фармацевтической комбинации находится в интервале значений от приблизительно 20% до приблизительно 70% (вес.), от приблизительно 30% до приблизительно 70% (вес.), от приблизительно 40% до приблизительно 70% (вес.), от приблизительно 20% до приблизительно 60% (вес.), от приблизительно 30% до приблизительно 60% (вес.), от приблизительно 40% до приблизительно 60% (вес.) или от приблизительно 35% до приблизительно 60% (вес.).

Было показано, что HDAC участвуют в онкогенной трансформации за счет опосредованной экспрессии генов, которые влияют на прогрессирование клеточного цикла, пролиферацию и апоптоз. HDAC являются объектом исследований в качестве возможных мишеней при лечении рака, паразитарных и воспалительных заболеваний. На основании гомологии акцессорных доменов доменам гистондеацетилаз дрожжей 18 известных в настоящее время гистондеацетилаз человека разделены на четыре группы (I-IV). Класс I, который включает HDAC1, -2, -3 и -8, родственен гену дрожжей RPD3; класс IIА включает HDAC4, -5, -7 и -9; класс ИВ -6 и -10, и родственен гену дрожжей Hda1; класс III, также известный как сиртуины, родственен гену Sir2 и включает SIRT1-7; и класс IV, который включает только HDAC11, характеризуется чертами классов I и II.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ингибитор HDAC представляет собой ингибитор HDAC класса I. Предпочтительно, ингибитор HDAC представляет собой селективный ингибитор HDAC класса I. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор HDAC представляет собой ингибитор гистондеацетилазы (HDAC) класса бензамидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор HDAC выбирают из группы, состоящей, помимо прочего, из хидамида, вориностата, ромидепсина, панобиностата, белиностата, панобиностата, вальпроевой кислоты, моцетиностата, абексиностата, энтиностата, прациностата, резминостата, гивиностата и квизиностата. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор HDAC выбирают из группы, состоящей из хидамида, энтиностата или моцетиностата.

НПВП представляют собой класс лекарственных препаратов, которые уменьшают боль, снижают повышенную температуру тела и, в высоких дозах, уменьшают воспаление. Большинство НПВП ингибируют активность циклооксигеназы-1 (ЦОГ-1) и циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2), и, таким образом, синтез тромбоксанов и простагландинов. Считается, что ингибирование ЦОГ-2 приводит к противовоспалительному, обезболивающему и жаропонижающему эффектам, тогда как те НПВП, которые также ингибируют ЦОГ-1, в частности, аспирин, в больших дозах могут вызывать желудочно-кишечные кровотечения и изъязвления. Ингибиторы ЦОГ-2 широко используют для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Циклооксигеназа (ЦОГ), которая имеет две изоформы, ЦОГ-1 и ЦОГ-2, является ферментом, ответственным за определяющую скорость стадию синтеза биоактивных липидов простаноидов, состоящих из простагландина D2 (PGD2), PGE2, PGF2α, простациклина PGI2 и тромбоксана ТХА2. ЦОГ-1 конститутивно экспрессируется в тканях организма для поддержания уровня гомеостатических простаноидов и участвует в реализации нескольких биологических функций, таких как ангиогенез, вазодилатация и обеспечение жизнедеятельности тканей. Однако в нормальном состоянии уровень экспрессии ЦОГ-2 является низким. Происходит быстрая индукция ЦОГ-2 под воздействием таких стимулов как инфекция, травма и боль, что приводит к запуску провоспалительных процессов. Селективные ингибиторы ЦОГ-2 представляют собой тип нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП).

В некоторых вариантах осуществления изобретения НПВП выбирают из группы, состоящей, помимо прочего, из аспирина, ибупрофена, индометацина, напроксена и ингибитора ЦОГ-2. В некоторых вариантах осуществления изобретения НПВП представляет собой ингибитор ЦОГ-2. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор ЦОГ-2 выбирают из группы, состоящей, помимо прочего, из Целебрекса (название генерика целекоксиб), Рофекоксиба и Эторикоксиба. Предпочтительно, ингибитор ЦОГ-2 представляет собой целекоксиб.

В одном из вариантов осуществления изобретения ингибитор иммунных контрольных точек может быть использован в сочетании с фармацевтической комбинацией, описанной в настоящем документе, с целью стимуляции активности иммунной системы против раковых клеток и лечения рака. Ингибиторы иммунных контрольных точек, подходящие для использования при осуществлении настоящего изобретения, включают антагонисты ингибирующих рецепторов, которые ингибируют PD-1, CTLA-4, Т-клеточный иммуноглобулин-3, аттенюатор В- и Т-лимфоцитов, V-доменный Ig-супрессор активации Т-клеток или путь гена активации лимфоцитов 3, такие как антитела к PD-1, антитела к PD-L1, антитела к CTLA-4, антитела к TIM-3 (Т-клеточному иммуноглобулину-3), антитела к BTLA (аттенюатору В- и Т-лимфоцитов), антитела к VISTA (V-доменному Ig-супрессору активации Т-клеток) и антитела к LAG-3 (гену активации лимфоцитов 3). Примеры ингибиторов PD-1 или PD-L1 включают, не ограничиваясь приведенным списком, гуманизированные антитела, блокирующие PD-1 человека, такие как ламбролизумаб (антитела к PD-1, торговое название Кейтруда) или пидилизумаб (антитела к PD-1), Бавенсио (антитела к PD-L1, авелумаб), Имфинзи (антитела к PD-L1, дурвалумаб) и Тецентрик (антитела к PD-L1, атезолизумаб), а также полностью человеческие антитела, такие как ниволумаб (антитела к PD-1, Опдиво) и семиплимаб-рвлс (антитела к PD-1, торговое название Либтайо). Прочие ингибиторы PD-1 могут включать препараты растворимого лиганда PD-1, включая, но не ограничиваясь приведенным списком, гибридный белок PD-L2 Fc, также известный как B7-DC-Ig и АМР-244, и другие ингибиторы PD-1, в настоящее время находящиеся в стадии исследований и/или разработки в качестве средств, предназначенных для использования в терапии. Помимо этого, ингибиторы иммунных контрольных точек могут включать, не ограничиваясь приведенным списком, гуманизированные или полностью человеческие антитела, блокирующие PD-L1, такие как дурвалумаб и MIH1 и другие ингибиторы PD-L1, в настоящее время находящиеся в стадии исследований. В некоторых вариантах осуществления изобретения количество ингибитора иммунных контрольных точек находится в интервале значений от приблизительно 0,5% (вес.) до приблизительно 15% (вес.), от 0,5% (вес.) до приблизительно 10% (вес.), от 0,5% (вес.) до приблизительно 5% (вес.), от 1,0% (вес.) до приблизительно 20% (вес.), от 1,0% (вес.) до приблизительно 15% (вес.), от 1,0% (вес.) до приблизительно 10% (вес.) или от 1,0% (вес.) до приблизительно 5% (вес.).

В одном из вариантов осуществления изобретения описанная здесь комбинация дополнительно содержит бигуанидное соединение. В некоторых вариантах осуществления изобретения количество бигуанидного соединения находится в интервале значений от приблизительно 30% до приблизительно 70% (вес.), от приблизительно 30% до приблизительно 60% (вес.), от приблизительно 30% до приблизительно 50% (вес.), от приблизительно 50% до приблизительно 80%) (вес.), от приблизительно 60% до приблизительно 80% (вес.) или от приблизительно 60% до приблизительно 70% (вес.), от 40% до приблизительно 70% (вес.), от приблизительно 40%) до приблизительно 60%) (вес.) или от приблизительно 40% до приблизительно 50% (вес.)

Бигуанид представляет собой органическое соединение, описываемое формулой HN(C(NH)NH₂)₂. Широкое разнообразие производных бигуанида используют в составе фармацевтических препаратов. Термин "бигуанидин" часто относится конкретно к классу лекарственных средств, которые действуют как оральные антигипергликемические лекарственные средства, используемые для лечения сахарного диабета или преддиабета.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения бигуанидное соединение включает, помимо прочего, следующие соединения: метформин, фенформин, прогуанил и хлорпрогуанил. Предпочтительно, бигуанидное соединение представляет собой метформин.

В одном варианте осуществления изобретения фармацевтическую комбинацию ингибитора HDAC и НПВП вводят вместе с ингибитором иммунных контрольных точек, одновременно или последовательно, в любом порядке, или поочередно. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ингибитор HDAC, НПВП, ингибитор иммунных контрольных точек и бигуанидное соединение вводят одновременно. В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитор HDAC, НПВП, ингибитор иммунных контрольных точек и бигуанидное соединение вводят последовательно, в любом порядке, или поочередно.

В другом варианте осуществления изобретения способ дополнительно включает введение одного или нескольких дополнительных противораковых агентов. Дополнительный противораковый агент представляет собой любой противораковый агент, описанный в настоящем документе или известных специалистам в соответствующей области. В одном варианте осуществления изобретения дополнительный противораковый агент представляет собой химиотерапию или двухкомпонентную химиотерапия на основе препаратов платины. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительный противораковый агент представляет собой ингибитор тирозинкиназы (TKI). В одном варианте осуществления изобретения дополнительный противораковый агент представляет собой антитела к VEGF. В других вариантах осуществления изобретения противораковый агент выбирают из группы, состоящей из агента на основе платины (например, цисплатин, карбоплатин), ингибитора митоза (например, паклитаксел, альбумин-связанный паклитаксел, доцетаксел, таксотер, доцекад), фторированный алкалоид барвинка (например, винфлунин, жавлор), винорелбина, винбластина, этопозида или пеметрекседа гемцитабина. В одном варианте осуществления изобретения дополнительный противораковый агент представляет собой 5-фторурацил (5-ФУ). В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительный противораковый агент представляет собой любой другой противораковый агент, известный специалистам в соответствующей области.

В состав фармацевтической комбинации, предлагаемой в настоящем изобретении, может входить "носитель". В контексте настоящего документа термин "носитель" включает любой растворитель, дисперсионную среду, основу-носитель, покрытие, разбавитель, антибактериальный и/или противогрибковый агент, изотонический агент, агент, замедляющий абсорбцию, буфер, раствор носителя, суспензию, коллоид и тому подобное. Применение подобных сред и/или агентов для фармацевтических активных субстанций известно специалистам в соответствующей области. Например, фармацевтическая комбинация может быть приготовлена в форме, специально предназначенной для введения в твердой или жидкой форме, включая формы, адаптированные для следующих способов введения: (1) введение внутрь, например, в виде жидких лекарственных форм (водные или неводные растворы или суспензии), таблеток для рассасывания, драже, капсул, пилюль, таблеток (например, таблеток, предназначенных для трансбуккального, сублингвального или системного применения), болюсов, порошков, гранул, паст для нанесения на язык; (2) парентеральное введение, например, путем подкожной, внутримышечной, внутривенной или эпидуральной инъекции, например, в виде стерильного раствора или суспензии, либо препарата с замедленным высвобождением; (3) местное применение, например, в виде крема, лосьона, геля, мази или пластыря с контролируемым высвобождением, либо спрея, наносимого на кожу; (4) вагинальное или ректальное введение, например, в виде пессария, крема, суппозитория или пены; (5) сублингвальное введение; (6) введение через глаза; (7) трансдермальное введение; (8) чресслизистое введение; или (9) интраназальное введение.

В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения предлагается способ лечения рака у субъекта, способ, включающий введение субъекту фармацевтической комбинации, предлагаемой в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления изобретения раковое заболевание выбирают, помимо прочего, из группы, состоящей из глиобластомы, рака печени (такой как печеночноклеточная карцинома), колоректальной карциномы, глиобластомы, рака желудка, колоректального рака, рака пищевода, рака легких (такой как немелкоклеточный рак легких (НМРЛ) и мелкоклеточный рак легких), рака поджелудочной железы, почечноклеточной карциномы, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, рак предстательной железы, рак яичников, меланома, рак молочной железы, хронический лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), карциномы из клеток Меркеля, неходжкинской лимфомы, острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), рака желчного пузыря, холангиокарциномы, рака мочевого пузыря и рака матки.

В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая комбинация, предлагаемая в настоящем изобретении, может быть выпущена в виде единого препарата. В других вариантах осуществления изобретения фармацевтическая комбинация, предлагаемая в настоящем изобретении, может быть выпущена в виде раздельных препаратов. Фармацевтическая комбинация может быть составлена в различных и/или множественных формах, предназначенных для одного или нескольких предпочтительных путей введения. Так, фармацевтическая комбинация может вводиться с использованием одного или более известных путей, включая, например, введение внутрь, парентеральное введение (например, интрадермальное, чрескожное, подкожное, внутримышечное, внутривенное, интраперитонеальное и т.д.) или местное применение (например, интраназальное, внутрилегочное, интрамаммарное, вагинальное, внутриматочное, интрадермальное, чрескожное, ректальное и.т.д.). Фармацевтическая комбинация, или ее часть, может вводиться через поверхность слизистой оболочки, путем нанесения, например, на слизистую оболочку носа или дыхательных путей (например, в виде спрея или аэрозоля). Фармацевтическая комбинация, или ее часть, также может вводиться в виде формы с замедленным или отсроченным высвобождением.

Комбинация может быть для удобства выпущена в виде лекарственной формы с единичными дозами или может быть приготовлена с использованием способов, известных специалистам в области фармацевтики. Способы приготовления комбинации с использованием фармацевтически приемлемого носителя включают этап объединения фармацевтической комбинации, предлагаемой в соответствии с настоящим изобретением, с носителем, который состоит из одного или более вспомогательных ингредиентов. В целом, препарат может быть приготовлен путем однородного и/или равномерного объединения активного компонента с жидким носителем, мелкораздробленным твердым носителем, или обоими, и затем, при необходимости, придания препарату требуемой формы.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способ может включать введение достаточного количества фармацевтической комбинации для введения субъекту дозы, например, от приблизительно 10 мг/кг до приблизительно 1000 мг/кг.

Настоящее изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами. Следует понимать, что конкретные примеры, материалы, количества и процедуры должны интерпретироваться в широком смысле в соответствии с объемом и сущностью изобретения, изложенными в настоящем документе.

Примеры

Материалы и методы

Реактивы. Культуральные среды Gibco RPMI 1640 и DMEM с L-глутамином были закуплены в компании Invitrogen Life Technologies. Фетальная бычья сыворотка (ФБС) HyClone была закуплена в компании Thermo Scientific. Хидамид был предоставлен компанией GNTbm. Энтиностат, моцетиностат, аспирин, ибупрофен, целекоксиб и метформин были закуплены в компании Cayman Chemical (Анн-Арбор, Мичиган). В экспериментах на животных были использованы следующие антитела и реактивы: мышиные моноклональные антитела к PD-L1 (В7-Н1) (10F.9G2; Bio X Cell), мышиные моноклональные антитела к PD-1 (CD279) (RMP1-14; Bio X Cell), мышиные моноклональные антитела к CTLA4 (CD152) (ВЕ0164; Bio X Cell) и изотипические контрольные крысиные моноклональные антитела IgG2a (2A3; Bio X Cell).

Клеточные линии. Клетки JC (CRL-2116; клетки мышиной опухоли молочной железы) и СТ26 (CRL-2638; клетки мышиной колоректальной аденокарциномы) были закуплены из Американской коллекции типовых культур (АТСС). Клетки обеих опухолевых клеточных линий выращивали на среде МакКоя 5А с добавлением 10% (объем/объем) ФБС при температуре 37°С, 5% CO₂.

Противораковая активность в моделях на животных. Исследование на животных было одобрено и подвергнуто контролю Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Тайбейского медицинского университета (The Taipei Medical University Institutional Animal Care and Use Committee, TMU IACUC). Для всех экспериментов использовали самцов мышей BALB/C в возрасте от шести до восьми недель (BioLASCO, Тайвань). Инокуляцию раковых клеток JC (1×10⁷) или СТ26 (5×10⁶ ~ 1×10⁷) проводили путем подкожного введения в правый бок каждой мыши. Опухоли росли в течение 11 дней (объем опухоли приблизительно 200-300 мм³) перед началом рандомизации и терапии. Мыши, несущие опухоль СТ26, и мыши, несущие опухоль JC, получали 10 или 2,5 мг/кг антител к IgG, антител к PD-1 и/или антител к PD-L1 и антител к CTLA-4 (2,5 мг/кг) интраперитонеально в дни 11, 14, 17, 20, 23 и 26 после имплантации опухоли, все антитела разводили до соответствующих значений концентрации в 100 мкл стерильного фосфатного буферного раствора (ФБР) (рН 7,4) (Invitrogen Life Technologies). Целекоксиб, хидамид, метформин, моцетиностат, энтиностат, аспирин и ибупрофен вводили внутрь в день 11 после имплантации опухоли. Ежедневное введение целекоксиба (12,5, 25,0 и 50 мг/кг) или метформина (100 или 200 мг/кг) проводили с дня 11 по день 26. Хидамид вводили мышам, несущим опухоль, в дозах 6,25, 12,5, 25 и 50 мг/кг или однократно. Хидамид вводили внутрь ежедневно с дня И по день 26. Энтиностат вводили внутрь в дозе 20 мг/кг каждые два дня с дня 11 по день 25. Моцетиностат вводили внутрь в дозе 30 мг/кг ежедневно с дня 11 по день 26. Аспирин и ибупрофен вводили внутрь в дозе 50 мг/кг ежедневно с дня 11 по день 26. Противораковую активность измеряли с начала терапии, направленной на уменьшение роста опухоли, до момента достижения опухолью объема 3000 мм³. Объем опухоли высчитывали как длина × ширина² × 0,5.

Выживаемость в модели на животных. Введение антител или лекарственных средств проводили с дня 11 по день 25 или 26. Опухоль продолжала расти в организме мышей, несущих опухоль. Объем опухоли у мышей измеряли каждые три дня. Мышей, несущих опухоль, считали мертвыми после того, как опухоль достигала объема 3000 мм³. Данные для всех групп терапии регистрировали и подвергали анализу.

Эксперимент с ксенотрансплантатом in vivo Исследование на животных было одобрено и подвергнуто контролю Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Тайбейского медицинского университета (The Taipei Medical University Institutional Animal Care and Use Committee, TMU IACUC). Голые мыши BALB/c (возраст 6 недель, самки, масса тела 20 г) были закуплены в компании BioLASCO, Тайвань, и содержались в условиях отсутствия патогенов. Модель ксенотрансплантата опухоли СТ26 на мышах была создана путем введения 5×10⁶ клеток, 150 мкл клеток СТ26. Инокуляцию раковых клеток СТ26 проводили путем подкожного введения в правый бок каждой мыши. Опухолевые клетки росли в течение 2 недель, до момента достижения опухолью объема 350-400 мм³, перед началом рандомизации и терапии. Девятнадцать голых мышей были распределены по пяти группам и подвергнуты терапии. Испытуемые животные получали антитела к IgG 2,5 мг/кг в качестве контроля, антитела к PD-L1 2,5 мг/кг в сочетании с хидамидом 50 мг/кг плюс целекоксибом 50 мг/кг и метформином 100 мг/кг, хидамид 50 мг/кг в сочетании с целекоксибом 50 мг/кг и метформином 100 мг/кг, хидамид 50 мг/кг, и целекоксиб 50 мг/кг. Процесс терапии был сходным для всех мышей BALB/C. Противораковую активность измеряли с начала терапии, направленной на уменьшение роста опухоли, до дня 29, когда проводили умерщвление мышей и взвешивание опухоли. Объем опухоли высчитывали как длина × ширина² × 0,5.

Проточная цитометрии. Следующие антитела и реактивы были использованы для поточной цитометрии: CD3 АРС (17А2; Biolegend), CD4 РЕ (GK1.5; Biolegend), CD8a PerCP (53-6.7;; Biolegend), CD25 PerCP (PC61; Biolegend), Foxp3 PE (MF-14; Biolegend), CD11b APC (M1/70; Biolegend), Ly-6C PerCP (HK1.4; Biolegend), Ly-6G ΡΕ (1A8; BioLegend), CD45 FITC (30-F11; Biolegend), МНСП (M5/114.15.2; eBioscience). Проточную цитометрию проводили с использованием системы BD FACSCalibur™ (BD Biosciences), анализ данных проводили с применением программного обеспечения FACSDiva (BD Biosciences). Для оценки численности популяции циркулирующих супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC) и Т-клеток лимфоидного происхождения у мышей брали образцы крови на день 8 и день 12 после начала терапии антителами к PD-1 (2,5 мг/кг) с хидамидом (50 мг/кг) плюс целекоксибом (50 мг/кг) или без них. По сто пятьдесят микролитров крови из правой или левой лицевой вены отбирали в пробирки типа Эппендорф. Эритроциты из антикоагулированных образцов крови подвергали немедленному лизису с использованием 2 мл реактива 1 × BD FACS Lyse (BD Biosciences) в течение 3 минут, затем образцы дважды промывали охлажденным на льду буфера BD FACS (BD Biosciences). Образцы были подвергнуты окрашиванию соответствующими антителами. Для анализа мы использовали ранее установленные фенотипические критерии этих клеток, PMN-MDSC: клетки CD45⁺CD11b⁺Ly6G⁺Ly6C^low, М-MDSC: клетки CD45⁺CD11b⁺Ly6G-Ly6C⁺, CD4⁺ Т-клетки: клетки CD45⁺CD3⁺CD4⁺, CD8⁺ Т-клетки: клетки CD45⁺CD3⁺CD8⁺, клетки Treg: клетки CD45⁺CD3⁺CD25⁺FOXP3⁺, клетки ТАМ: клетки CD45⁺CD11b⁺MHCII⁺, и общее число клеток CD45⁺ использовали в качестве общего знаменателя. С другой стороны, для оценки численности популяций внутриопухолевых клеток CD8⁺ и регуляторных Т-клеток (Treg) вначале лимфоциты были отделены от образцов опухолевых тканей, взятых у мышей через 8 дней после начала терапии антителами к PD-1 (2,5 мг/кг) с хидамидом (50 мг/кг) плюс целекоксибом (50 мг/кг) или без них. Вкратце, первичные опухолевые ткани были отобраны, взвешены и измельчены до мелких фрагментов. Был использован набор для диссоциации клеток опухолей мышей "Mouse tumor Dissociation Kit" (номер по каталогу 130-096-730). К каждому образцу добавляли три фермента в соотношении 1 мл на 200 мг опухолевой ткани. Образцы инкубировали в переворачивающемся шейкере в течение 120 минут при температуре 37°С. Полученные тканевые гомогенаты фильтровали через фильтр с размером пор 0,4 мкм и трижды промывали охлажденным на льду ФБР, 1×10⁶ клеток на образец использовали для маркировки антителами. CD8⁺ Т-клетки оценивали с использованием ранее установленных фенотипических критериев CD45⁺CD3⁺CD8⁺, общее число клеток CD45⁺CD3⁺ использовали в качестве общего знаменателя. Клетки Treg оценивали с использованием ранее установленных фенотипических критериев CD45⁺CD3⁺CD25⁺FOXP3⁺, общее число клеток CD45⁺CD3⁺ использовали в качестве общего знаменателя.

Статистические показатели. Были вычислены средние значения и стандартные ошибки для всех точек данных, полученных, как минимум, в четырех независимых экспериментах. Были проведены попарные сравнения объема опухоли между каждым из вариантов экспериментальных условий и контрольной группой, к IgG, с использованием t-критерия Стьюдента для двух образцов (Systat Software, Сан-Хосе, Калифорния, США).

Пример 1 Эффекты антител к PD-1

Для изучения противораковой активности антител к PD-1 у мышей BALB/c, несущих клетки раковой опухоли толстого кишечника СТ-26, мышам, несущим опухоль СТ26, вводили антитела к PD-1 и/или антитела к IgG в дозе 10 мг/кг интраперитонеально в дни 11, 14, 17, 20, 23 и 26 после имплантации опухоли. Эксперимент был начат, когда объем опухоли достигал приблизительно 200-300 мм³. Была проведена оценка частоты ответа с использованием нескольких анализов. В этом исследовании мы определяли частичный ответ (ЧО, рост опухоли в 2 раза у мышей, несущих опухоль, на момент окончания терапии); стабилизацию заболевания (СЗ, рост опухоли в два-пять раза у мышей, несущих опухоль, на момент окончания терапии); прогрессирование заболевания (ПЗ, рост опухоли в пять и более раз у мышей, несущих опухоль, на момент окончания терапии). Как правило, в контрольной группе наблюдался рост опухоли в десять-пятнадцать раз (около 3000 мм³). Антитела к PD-1 значимо ингибировали рост опухоли, по сравнению с контрольной группой (группа, получавшая антитела к IgG) (см. Фиг.1, участок А). В то время как объем опухоли в контрольной группе достигал приблизительно 3000 мм³, объем опухоли в группе, получавшей антитела к PD-1 достигал приблизительно 1200 мм³ (Фиг.1, участок А). Однако антитела к PD-1 ингибировали рост опухоли только на непродолжительное время; после этого опухоль продолжала расти. В группе, получавшей антитела к PD-1, СЗ наблюдалось у 3 мышей, и ПЗ наблюдалось у 3 мышей (см. Фиг.1, участок В).

Пример 2. Эффекты эпигенетического модулятора в сочетании с антителами к PD-1

Была проведена оценка противораковой активности хидамида или энтиностата в сочетании с антителами к PD-1 у мышей, несущих опухоль из клеток СТ26. Мыши, несущие опухоль СТ26, получали внутрь хидамид или энтиностат в дозе 25 мг/кг и 20 мг/кг, соответственно. Хидамид вводили ежедневно, энтиностат вводили каждые два дня. Хидамид или энтиностат в сочетании с антителами к PD-1 демонстрировали более сильную противораковую активностью, по сравнению с антителами к PD-1, применяемыми отдельно (Фиг.1, участок А). Хидамид в сочетании с антителами к PD-1 был более эффективным в отношении ингибирования роста опухоли, по сравнению с хидамидом, применяемым отдельно. Наши результаты показывают, что у одной мыши был достигнут ЧО, СЗ наблюдалось у трех мышей и ПЗ наблюдалось у одной мыши в группе, получавшей хидамид в сочетании с антителами к PD-1 (Фиг.1, участок В). Однако в группе, получавшей энтиностат в сочетании с антителами к PD-1, наблюдалась более сильное ингибирование роста опухоли, по сравнению с группой, получавшей хидамид в сочетании с антителами к PD-1 (Фиг.1, участок В). Во всех группах масса тела мышей не уменьшалась (Фиг.1, участок С). Была проведена оценка выживаемости в модели на мышах, несущих опухоль. Выживаемость оценивали после достижения объема опухоли приблизительно 3000. Все лекарственные средства вводили с 11 по 26 день. Результаты показывают, что в группе, получавшей хидамид в сочетании с антителами к PD-1 выживаемость составляла 40% на день 42, тогда как в группе, получавшей антитела к PD-1, и в группе, получавшей энтиностат в сочетании с антителами к PD-1, выживаемость составляла приблизительно 33% и 71%, соответственно (Фиг.1, участок D).

Пример 3 Эффекты хидамида в сочетании с метформином и с антителами к PD-1

Мышам, несущим опухоль, вводили внутрь 100 мг/кг метформина. Результаты показывают, что наблюдалось заметное ингибирование роста опухоли, по сравнению с контрольной группой (см. Фиг.2, участок А). В группе, получавшей метформин, СЗ наблюдалось у одной мыши, и ПЗ наблюдалось у пяти мышей (см. Фиг.2, участок В). В группе, получавшей энтиностат в сочетании с антителами к PD-1 (положительный контроль), у трех мышей был достигнут ЧО, у одной мыши наблюдалось СЗ и у трех мышей наблюдалось ПЗ (Фиг.2, участок В). Как показано на Фиг.2, участок А, более высокая доза (50 мг/кг) хидамида в сочетании с антителами к PD-1 имела меньшую противораковую активность, по сравнению с низкой дозой (12,5 мг/кг) хидамида в сочетании с антителами к PD-1. Терапия хидамидом в дозе 12,5 мг/кг в сочетании с антителами к PD-1 оказывала более сильное ингибирующее воздействие на рост опухоли, по сравнению с хидамидом в дозе 25 или 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-1 (Фиг.2, участок В). В группе, получавшей хидамид в дозе 12,5 мг/кг в сочетании с антителами к PD-1, СЗ наблюдалось у двух мышей, и ПЗ наблюдалось у четырех мышей. Однако увеличение дозы хидамида не приводило к усилению противораковой активности (Фиг.2, участок В). Были проведены испытания в двух группах, получавших хидамид (50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1, и хидамид (50 мг/кг) плюс метформин (100 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1, результаты показаны на Фиг.2, участок В. Результаты показывают, что терапия хидамидом в сочетании с метформином и антителами к PD-1 оказывает более сильное ингибирующее воздействие на рост опухоли, по сравнению терапией хидамидом в сочетании с антителами к PD-1. Как показано на Фиг.2, участок В, у двух мышей был достигнут ЧО, СЗ наблюдалось у одной мыши и ПЗ наблюдалось у двух мышей. У мышей в группах терапии не наблюдалось уменьшение массы тела (см. Фиг.2, участок С). Далее, была определена выживаемость мышей в группах терапии на день 58. Как показано на Фиг.2, участок D, лекарственную терапию прекратили на день 30. Терапия хидамидом (50 мг/кг) в сочетании с метформином и антителами к PD-1 оказывала более сильное ингибирующее воздействие на рост опухоли и значимо увеличивала выживаемость, по сравнении с другими режимами комбинированной терапии. В группе, получавшей хидамид (50 мг/кг) в сочетании с метформином и антителами к PD-1, выживаемость увеличилась до 60%, тогда как в группе положительного контроля (энтиностат в сочетании с антителами к PD-1) выживаемость составляла лишь приблизительно 20%. Хидамид (50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 (10 мг/кг) не мог остановить рост опухоли; однако после добавления в комбинацию метформина (100 мг/кг) ингибирующая активность и выживаемость увеличивались. Полученные результаты указывают на то, что метформин может оказывать влияние на углеводные метаболиты опухоли в микроокружении опухоли и, таким образом, повышает противораковую активность ингибитора иммунных контрольных точек (Фиг.2, участок D).

Пример 4 Эффекты хидамида или энтиностата + метформина + целекоксиба в сочетании с антителами к PD-1

Терапия в режиме хидамид + метформин + целекоксиб + антитела к PD-1 или энтиностат + метформин + целекоксиб + антитела к PD-1 оказывала более сильное ингибирующее воздействие на рост опухоли, по сравнению с режимами без целекоксиба (Фиг.3, участок А). В группе, получавшей энтиностат, это воздействие было сильнее, чем в группе, получавшей хидамид. Однако, при отсутствии эпигенетического модулятор, в группе, получавшей метформин + целекоксиб в сочетании с антителами к PD-1, наблюдалась пониженная противораковая активность. Ни у одной мыши в группах терапии не наблюдалось какое-либо уменьшение массы тела (см. Фиг.3, участок С). Далее, на Фиг.3, участок В приведены данные о росте опухоли у всех мышей в группах терапии. Наши результаты показывают, что режимы терапии энтиностат + метформин в сочетании с антителами к PD-1 и энтиностат + целекоксиб в сочетании с антителами к PD-1 являются очень сильными в отношении достижения высокого процента ЧО. Целекоксиб играет более важную роль в противоопухолевой активности в отношении микроокружения опухоли, чем метформин (Фиг.3, участок В). Режимы терапии хидамид + метформин в сочетании с антителами к PD-1 или хидамид + целекоксиб в сочетании с антителами к PD-1 демонстрируют сходные результаты, заключающиеся в достижении высокого процента ЧО. Однако, в отсутствии хидамида или энтиностата противораковая активность в группе, получавшей терапию ингибитором иммунных контрольных точек, снижалась (Фиг.3, участок В). Эти результаты указывают на то, что ингибиторы иммунных контрольных точек необходимо сочетать с эпигенетическим модулятором для повышения противораковой активности. Улучшение может быть следствием контроля углеводного метаболита и продукции PGE2 в микроокружении опухоли за счет метформина и целекоксиба, таким образом, такая терапия будет приводить к значимому увеличению частоты ответа у мышей, несущих опухоль СТ26. Помимо этого, выживаемость в группе, получавшей энтиностат или хидамид + метформин + целекоксиб в сочетании с антителами к PD-1 увеличилась до приблизительно 60-80%. Однако, в отсутствии хидамида/энтиностата выживаемость снижается (см. данные по группе, получавшей метформин плюс целекоксиб в сочетании с антителами к PD-1 на Фиг.3, участок D). Что касается выживаемости, целекоксиб демонстрирует повышенные показатели выживаемости, по сравнению с метформином (Фиг.3, участок D). Мы обнаружили, что целекоксиб, применяемый отдельно, или целекоксиб в сочетании с метформином являются важными факторами достижения синергетического эффекта при применении ингибитора HDAC класса I в сочетании с антителами к PD-1, в отношении усиления противораковой активности. Комбинация ингибитор HDAC класса I + метформин + целекоксиб в сочетании с ингибиторами иммунных контрольных точек показывает многообещающие результаты в отношении способности к лечению рака в модели на мышах, несущих опухоль.

Далее, была определена оптимальная доза хидамида для достижения ответа. Как показано на Фиг.4, участок А, мыши, несущие опухоль из клеток СТ26, получали терапию в различных режимах, с фиксированной дозой антител к PD-1 (10 мг/кг), различными дозами хидамида (12,5, 25,0 и 50 мг/кг), различными дозами целекоксиба (25 и 50 мг/кг) и различными дозами метформина (100 и 200 мг/кг). Рост опухоли у всех мышей в этих группах терапии был значимо ингибирован, по сравнению с группой, получавшей антитела к PD-1, или группой, получавшей основу-носитель (группа, получавшая антитела к IgG). Как показано на Фиг.4, участок В, рост опухоли был ингибирован во всех группах терапии. В группе, получавших хидамид в сочетании с антителами к PD-1, наблюдалось более сильное ингибирование роста опухоли, чем в группе, получавшей только антитела к PD-1. Далее, при режиме с применением хидамида (12,5 мг/кг) плюс целекоксиба (25 мг/кг) и метформина (100 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 была достигнута доля ЧО около 33% (ЧО был достигнут у двух мышей), этот режим был более активным в отношении подавления роста опухоли, в сравнении с режимом применения хидамида (12,5 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1. Однако, в группе, получавшей хидамид (12,5 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1, не было достигнуто ни одного случая ЧО. Эти результаты указывают на то, что целекоксиб и метформин играют важную роль в усиления ответа на терапию ингибиторами иммунных контрольных точек. Были проведены испытания различных доз хидамида в сходных режимах, с целью анализа частоты ответа у мышей, несущих опухоль из клеток СТ26. Результаты показывают, что доза 50 мг/кг является оптимальной для хидамида в отношении ингибирования роста опухоли, и позволяет достигать высокой частоты ЧО (приблизительно 50%) и СЗ (приблизительно 33%) в группе, получавшей терапию в режиме хидамид (50 мг/кг) плюс целекоксиб (25 мг/кг) и метформина (100 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1. Полученные результаты указывают на то, что хидамид является ключевым фактором достижения терапевтического эффекта. Далее, была определена оптимальная доза целекоксиба. Полученные результаты показывают, что целекоксиб в дозе 50 мг/кг является более активным, чем в дозе 25 мг/кг, в отношении подавления роста опухоли у каждой мыши в группе терапии (Фиг.4, участок В). Однако ингибитор иммунных контрольных точек характеризуется очень низкой частотой ответа. Мы неожиданно обнаружили, что целекоксиб в дозе 50 мг/кг может повышать частоту ответа на иммунотерапию. Помимо этого, была определена оптимальная доза метформина. Было показано, что между режимами 100 или 200 мг/кг метформина нет никаких различий в противораковой активности (Фиг.4, участок В). Эти данные указывают на то, что хидамид и целекоксиб являются более важными, чем метформин, в комбинации с ингибитором иммунных контрольных точек. Как показано на Фиг.4, участок С, ни у одной мыши во всех группах терапии не наблюдалось никакого уменьшения массы тела. На Фиг.4, участок D приведены показатели выживаемости мышей в группах терапии. Эти данные указывают на то, что режим хидамид (50 мг/кг) плюс целекоксиб (25 мг/кг) и метформин (100 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 (10 мг/кг) является наилучшей комбинацией, которая имеет высокую способность к подавлению роста опухоли и увеличивает выживаемость приблизительно до 50%. Выживаемость в других группах также повысилась, по сравнению с группой, получавшей только антитела к PD-1. Хотя режим хидамид (50 мг/кг) плюс целекоксиб (25 мг/кг) и метформин (100 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 (10 мг/кг) является оптимальным режимом в этом эксперименте in vivo, целекоксиб 50 мг/кг также может вносить более значимый вклад в противораковую активность и также увеличивать выживаемость у мышей, несущих опухоль СТ26.

Пример 5. Эффекты хидамида + метформина + целекоксиба в сочетании с антителами к PD-L1

Мы продемонстрировали, что хидамид плюс метформин и целекоксиб в сочетании с антителами к PD-1 обеспечивает значимое ингибирование роста опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26 (см. Фиг.4). Как показано на Фиг.5, участок А, хидамид (50 мг/кг) плюс метформин (100 мг/кг) и целекоксиб (50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-L1 (10 мг/кг) вводили мышам, несущим опухоль СТ26. Хидамид, метформин и целекоксиб вводили ежедневно. Однако антитела к PD-L1 вводили интраперитонеально каждые 3 дня. Наши данные показывают, что хидамид плюс метформин и целекоксиб обладают высокой активностью в отношении ингибирования роста опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26 (см. Фиг.5, участок А). Мы неожиданно обнаружили, что хидамид плюс метформин и целекоксиб при отсутствии антител к PD-L1 значительно ингибируют рост опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26 (Фиг.5, участок А). Терапия антителами к PD-L1 (10 мг/кг), применяемыми отдельно, приводила к слабому ингибированию роста опухоли (Фиг.5, участок А). Эти результаты показывают, что хидамид плюс метформин и целекоксиб обладают высокой способностью к ингибированию роста опухоли. Фиг.5, участок В показывает, что в группе, получавшей хидамид плюс метформин в сочетании с целекоксибом, а также в группе, получавшей хидамид плюс метформин в сочетании с антителами к PD-L1, наблюдалось значимое ингибирование роста опухоли и высокий процент достижения ЧО. Как показано на Фиг.5, участок С, все режимы терапии не приводили к какому-либо уменьшению массы тела. Как показано на Фиг.5, участок D, хидамид в сочетании с метформином и целекоксибом значительно повышал выживаемость, приблизительно до 80%. Этот результат показывает, что хидамид в сочетании с метформином и целекоксибом обладал высокой эффективностью в отношении контроля микроокружения опухоли и запуска иммунотерапии. Более того, хидамид плюс метформин и целекоксиб в сочетании с антителами к PD-L1 обеспечивали более сильное ингибирование роста опухоли и достижение 100% выживаемости на день 53. В день 53 показатели выживаемости были сходными между этими двумя режимами. Полученные результаты показывают, что хидамид в сочетании с метформином и целекоксибом обладают высокой активностью в отношении ингибирования роста опухоли. Сочетание с антителами к PD-L1 увеличивала ингибирование роста опухоли и выживаемость (Фиг.5, участок D).

Пример 6. Эффекты хидамида + метформина + целекоксиба в сочетании с антителами к PD-1 у мышей, несущих опухоль JC

Клеточная линия JC была получена из злокачественных новообразований молочной железы мышей. Нас интересовала оценка того, можно ли обнаружить ингибирование опухоли у мышей, несущих опухоль JC. Как показано на Фиг.6, клетки JC у мышей росли медленнее, чем клетки СТ26; поэтому объем опухоли у мышей, несущих опухоль JC, достигал приблизительно 300-400 мм³ на день 20. Хидамид плюс метформин и целекоксиб значимо ингибируют рост опухоли у мышей, несущих опухоль JC (Фиг.6, участок А). Однако, хидамид плюс метформин и целекоксиб в сочетании с антителами к PD-1 являются даже более эффективными в отношении ингибирования роста опухоли у мышей, несущих опухоль JC (см. Фиг.4). Такой режим обеспечивает значимое ингибирование роста опухоли как у мышей, несущих опухоль СТ26, так и у мышей, несущих опухоль JC. Во-первых, мы обнаружили, что хидамид в сочетании с метформином плюс целекоксибом обладают высокой иммунотерапевтической активностью в отношении ингибирования опухоли у мышей с нормальным иммунитетом, несущих опухоль. Более того, как показано на Фиг.6, участок В, антитела к PD-1 обладали лишь слабой противораковой активностью, и СЗ наблюдалось только у одной мыши. Режим хидамид плюс метформин и целекоксиб оказывает сильное ингибирующее воздействие на рост опухоли; однако он оказывает меньшее ингибирующее воздействие, чем режим хидамид плюс метформин и целекоксиб в сочетании с антителами к PD-1. В группе, получавшей хидамид плюс метформин и целекоксиб, у трех мышей был достигнут ЧО и у четырех мышей наблюдалось СЗ. Однако в группе, получавшей хидамид плюс метформин и целекоксиб в сочетании с антителами к PD-1, у пяти мышей был достигнут ЧО и у одной мыши наблюдалось СЗ. Учитывая вышесказанное, режим хидамид плюс метформин и целекоксиб обладает сильным противоопухолевым действием. После сочетания с антителами к PD-1 или к PD-L1, ингибирование роста опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26 или опухоль JC, увеличивалось (Фиг.5, участок В и Фиг.6, участок В). Как показано на Фиг.6, участок С, ни у одной мыши во всех группах терапии не наблюдалось никакого уменьшения массы тела. Как показано на Фиг.6, участок D, хидамид в сочетании с метформином и целекоксибом значимо увеличивает выживаемость приблизительно до 28%, в сравнении с группой, получавшей антитела PD-1, в модели на мышах, несущих опухоль JC. Полученные результаты подтверждают, что режим хидамид плюс метформин и целекоксиб представляет собой хорошую комбинацию для терапии против рака. Этот режим позволяет контролировать микроокружение опухоли и усиливать эффект иммунотерапии. Более того, хидамид плюс метформин и целекоксиб в сочетании с антителами к PD-1 обеспечивали более сильное ингибирование роста опухоли и увеличивали выживаемость приблизительно до 83%). После прекращения терапии на день 35, в контрольной группе IgG рост опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26, и у мышей, несущих опухоль JC, ускорился. Однако, режим хидамид плюс метформин и целекоксиб, в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек, оказывал очень сильное ингибирующее воздействие на рост опухоли и, таким образом, значимо повышал выживаемость (Фиг.6, участок D).

Пример 7. Эффекты хидамида плюс метформина и целекоксиба в сочетании с антителами к PD-L1 (в низкой дозе или высокой дозе) или без них у мышей, несущих опухоль СТ26

Мы были заинтересованы в оценке того, будет ли после уменьшения дозировки ингибитора иммунных контрольных точек, антител к PD-L1, по-прежнему наблюдаться ингибирование опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26. Как показано на Фиг.7, объем опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26, достигал приблизительно 250-300 мм³ на день 15. Хидамид 50 мг/кг плюс метформин 100 мг/кг и целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-L1 (2,5 или 10 мг/кг) оказывают значимое ингибирующее воздействие на рост опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26 (Фиг.7, участок А). Не было выявлено значимых различий в ингибировании роста опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26, между группами, получавшими антитела к PD-L1 в дозе 2,5 мг/кг и 10 мг/кг. С другой стороны, хидамид в низкой дозировки 6,25 мг/кг или в высокой дозировке 50 мг/кг плюс метформин 100 мг/кг и целекоксиб 50 мг/кг, в сочетании с антителами к PD-L1 (2,5 или 10 мг/кг), оказывают значимое ингибирующее воздействие на рост опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26 (Фиг.7, участок А). Между группами, получавшими хидамид в дозе 6,25 и 50 мг/кг, не было выявлено статистически значимых различий в ингибировании роста опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26, независимо от присутствия низкой или высокой дозы антител к PD-L1 (2,5 или 10 мг/кг). Однако, хидамид в различных дозах 6,25, 12,5 и 50 мг/кг плюс метформин 100 мг/кг и целекоксиб 50 мг/кг при отсутствии антител к PD-L1 также проявляли заметную ингибирующую активность в отношении роста опухоли, как показано на Фиг.7, участок В. Результаты показывают, что в группе, получавшей хидамид 50 мг/кг плюс метформин 100 мг/кг и целекоксиб 50 мг/кг, наблюдалось значимое ингибирование роста опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26, по сравнению с контрольной группой IgG (Фиг.7, участок В). Этот результат также показывает, что хидамид в различных дозах в сочетании с целекоксибом 50 мг/кг плюс метформином 100 мг/кг обладает уникальным иммуномодулирующим действием, которое может оказывать заметное влияние на микроокружение опухоли и приводить к реактивации цитотоксических Т-лимфоцитов, заставляя их атаковать клетки опухоли, и, в конечном счете, приводить к ингибированию роста опухоли (Фиг.7, участок В). Помимо этого, результаты, полученные для всех мышей, получавших терапию в различных режимах, показаны на Фиг.7, участок С. Было показано, что терапия с использованием 2,5 мг/кг антител к PD-L1 не обладала достаточной силой для реактивации цитотоксических Т-лимфоцитов для уничтожения ими опухолевых клеток. Для групп, получавших хидамид плюс целекоксиб и метформин, результаты показывают, что для реактивации цитотоксических Т-лимфоцитов для уничтожения ими опухолевых клеток была необходима высокая доза (50 мг/кг) хидамида. Терапия антителами к PD-L1 в высокой дозе (10 мг/кг) или в низкой дозе (2,5 мг/кг) в сочетании с хидамидом плюс целекоксибом и метформином значимо ингибировала рост опухоли. Было показано, что терапия антителами к PD-L1 (2,5 мг/кг) в сочетании с хидамидом 50 мг/кг плюс целекоксибом 50 мг/кг и метформином 100 мг/кг, обладала наиболее сильной противораковой активностью, как видно на Фиг.7, участок С.Не было выявлено значимых различий противораковой активности между низкой (2,5 мг/кг) и высокой (10 мг/кг) дозой при терапии антителами к PD-L1. Эти результаты указывают на то, что для достижения сильной противоопухолевой активности в модели на мышах, несущих опухоль СТ26, требуется комбинация, содержащая хидамид плюс целекоксиб и метформин плюс антитела к PD-L1. Как показано на Фиг.7, участок D, ни у одной мыши во всех группах терапии не наблюдалось никакого уменьшения массы тела. Результаты оценки выживаемости показаны на Фиг.7, участок Е. Во-первых, терапия с использованием режима хидамид 50 мг/кг плюс метформин 100 мг/кг и целекоксиб 50 мг/кг значимо увеличивает выживаемость приблизительно до 20%, в сравнении с терапией с применением только антител к PD-L1. Полученные результаты подтверждают, что режим хидамид плюс метформин и целекоксиб представляет собой хорошую комбинацию и обладает иммуномодулирующей активностью. Этот режим позволяет контролировать микроокружение опухоли и повышать терапевтическую эффективность. Во-вторых, терапия с использованием режима хидамид 50 мг/кг плюс метформин 100 мг/кг и целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-L1 2,5 мг/кг обеспечивала более сильное ингибирование роста опухоли и увеличивала выживаемость приблизительно до 75%. Сходный результат был получен при терапии с использованием режима хидамид 50 мг/кг плюс метформин 100 мг/кг и целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-L1 10 мг/кг (выживаемость приблизительно 80%). В-третьих, терапия с использованием режима хидамид 6,25 мг/кг плюс метформин 100 мг/кг и целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-L1 10 мг/кг обеспечивала заметное ингибирование роста опухоли и увеличивала выживаемость приблизительно до 40%. Однако терапия с использованием режима хидамид 6,25 мг/кг плюс метформин 100 мг/кг и целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-L1 2,5 мг/кг обеспечивает более сильное ингибирование роста опухоли и увеличивает выживаемость приблизительно до 100%. После прекращения терапии на день 30, в контрольной группе IgG рост опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26, ускорился. Однако, режимы хидамид 50 мг/кг плюс метформин 100 мг/кг и целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с антителами PD-L1 (2,5 или 10 мг/кг) оказывали очень сильное ингибирующее воздействие на рост опухоли и, таким образом, значимо увеличивали выживаемость, по сравнению с режимом хидамид 50 мг/кг в сочетании с целекоксибом 50 мг/кг плюс метформином 100 мг/кг, как показано на Фиг.7, участок Е.

Пример 8. Параллельное сравнение эффекта антител к PD-1 и антител к PD-L1 в сочетании с хидамидом плюс целекоксибом, с метформином или без него, у мышей, несущих опухоль СТ26.

Далее, мы были заинтересованы в оценке терапевтических эффектов антител к PD-1 и антител к PD-L1 в сочетании с хидамидом плюс целекоксибом, с метформином или без него, у мышей, несущих опухоль СТ26. Как показано на Фиг.8, объем опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26, достигал приблизительно 200-250 мм³ на день 10. Во-первых, комбинация хидамид 50 мг/кг плюс целекоксиб 50 мг/кг без метформина оказывала значимое ингибирующее воздействие на рост опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26, по сравнению с группой IgG (Фиг.8, участок А). Во-вторых, хидамид 50 мг/кг плюс целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-1 2,5 мг/кг являются даже более эффективными в отношении ингибирования роста опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26 (Фиг.8, участок А). В-третьих, сходный результат также был получен при применении терапии в режиме хидамид 50 мг/кг плюс целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-L1 2,5 мг/кг. Фиг.8, участок А и 8, участок В показывают, что хидамида 50 мг/кг в сочетании с целекоксибом 50 мг/кг было достаточно для оказания влияния на микроокружение опухоли и реактивации цитотоксических Т-лимфоцитов для уничтожения ими опухолевых клеток. С другой стороны, параллельное сравнение противораковых эффектов низких доз (2,5 мг/кг) антител PD-1 и антител к PD-L1 в сочетании с хидамидом 50 мг/кг плюс целекоксибом 50 мг/кг продемонстрировало активность в отношении ингибирования опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26, как показано на Фиг.8, участок А и участок В. Эти результаты, полученные в исследовании, посвященном параллельному сравнению, указывают на то, что ингибитор иммунных контрольных точек, антитела к PD-1 или PD-L1, являются необходимыми в комбинированной терапии хидамидом плюс целекоксибом для достижения сильной противоопухолевой активности в модели на мышах, несущих опухоль СТ26. Эти данные также продемонстрировали, что дозировка антител к PD-1 или антител к PD-L1 может быть уменьшена до 1/4 (2,5 мг/кг) от рекомендованной дозы 10 мг/кг, при применении в сочетании с хидамидом 50 мг/кг плюс целекоксибом 50 мг/кг для достижения сильной реактивации цитотоксических Т-лимфоцитов в микроокружении опухоли, с целью ингибирования роста опухоли, как показано на Фиг.8, участок А и участок В. Проведенное исследование подтвердило, что режим применения антител к PD-1 или антител к PD-L1 в сочетании с хидамидом плюс целекоксибом был достаточным для достижения сильной противоопухолевой активности. На основании этих результатов можно заключить, что метформин играет незначительную роль в регуляции иммунитета в микроокружении опухоли. Подходящим режимом является режим хидамид плюс целекоксиб в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек, таких как антитела к PD-1 или антитела к PD-L1. Противораковые эффекты различных терапевтических режимов, достигнутые у всех мышей, показаны на Фиг.8, участок С.Терапия с применением только антител к PD-1 обладала лишь слабой противораковой активностью, только у трех мышей был достигнут ЧО (частота ответа 37,5%). Режим хидамид плюс целекоксиб продемонстрировал более высокую противоопухолевую активность, у пяти мышей был достигнут ЧО (частота ответа 55,5%); однако этот режим продемонстрировал более низкий ингибирующий эффект, по сравнению с режимом хидамид 50 мг/кг плюс целекоксиб 50 мг/кг, с метформином 100 мг/кг или без него, в сочетании с антителами к PD-1. В группе, получавшей хидамид плюс целекоксиб в сочетании с антителами к PD-1, у восьми мышей был достигнут ЧО (частота ответа 88%). В группе, получавшей антитела к PD-L1, была отмечена слабая противораковая активность, только у четырех мышей был достигнут ЧО (частота ответа 50%). В группе, получавшей хидамид 50 мг/кг плюс метформин 100 мг/кг и целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-L1 2,5 мг/кг, у девяти мышей был достигнут ЧО (частота ответа 100%)). В группе, получавшей хидамид 50 мг/кг плюс целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-L1 2,5 мг/кг, у восьми мышей был достигнут ЧО (частота ответа 88%). Учитывая вышесказанное, режим хидамид плюс целекоксиб также обладает сильным противоопухолевым эффектом. При сочетании хидамида плюс целекоксиба с антителами к PD-1 или антителами к PD-L1 ингибирование роста опухоли в модели на мышах, несущих опухоль СТ26, было значимо повышено (Фиг.8, участок С). Как показано на Фиг.8, участок D, ни у одной мыши во всех группах терапии не наблюдалось никакого уменьшения массы тела. Как показано на Фиг.8, участок Е, в группе, получавшей хидамид в сочетании с целекоксибом, значимо увеличилась выживаемость приблизительно до 55,5%, в сравнении с контрольной группой, получавшей антитела к IgG, в модели на мышах, несущих опухоль СТ26. Также и показатели выживаемости были выше, чем в группах, получавшей антитела PD-1 (37,5%) или антитела к PD-L1 (50%).

Полученные результаты подтверждают, что режим хидамид плюс целекоксиб представляет собой умеренно хорошую комбинацию для противораковой терапии. Этот режим позволяет контролировать и регулировать микроокружение опухоли и усиливать эффект иммунотерапии до некоторой степени. Более того, хидамид плюс метформин и целекоксиб в сочетании с антителами к PD-1 обеспечивали более сильное ингибирование роста опухоли и увеличивали выживаемость приблизительно до 80%. Был получен сходный результат, демонстрирующий, что хидамид плюс метформин и целекоксиб в сочетании с антителами к PD-1 обеспечивали сильное ингибирование роста опухоли и увеличивали выживаемость приблизительно до 88%. Хидамид плюс метформин и целекоксиб в сочетании с антителами к PD-L1 обеспечивали более сильное ингибирование роста опухоли и увеличивали выживаемость приблизительно до 100%. Был получен сходный результат, демонстрирующий, что хидамид плюс метформин и целекоксиб в сочетании с антителами к PD-L1 обеспечивали сильное ингибирование роста опухоли и увеличивали выживаемость приблизительно до 88%. После прекращения терапии на день 26, в контрольной группе IgG рост опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26, ускорился. Однако, режим хидамид плюс целекоксиб, с метформином или без него, в присутствии ингибитора иммунных контрольных точек, оказывал очень сильное ингибирующее воздействие на рост опухоли и, таким образом, значимо повышал выживаемость (Фиг.8, участок Е). В этом исследовании было показано, что метформин играет незначительную роль во влиянии на микроокружение опухоли и в усилении эффекта иммунотерапии. Это исследование также подтвердило, что режим хидамид плюс целекоксиб в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек был достаточным для усиления противоракового иммунного ответа. С другой стороны, параллельное сравнение между антителами к PD-1 и антителами к PD-L1 в сочетании с хидамидом плюс целекоксибом показало, что противораковая активность комбинированного режима с применением антител к PD-L1 превышает противораковую активность комбинированного режима с применением антител к PD-1.

Пример 9. Для подтверждения оптимальной терапевтической дозы хидамида плюс целекоксиба в сочетании с антителами к PD-1 у мышей, несущих опухоль СТ26

Мы были заинтересованы в оценке того, какое соотношение доз хидамида и целекоксиба, применяемых в сочетании с антителами к PD-1, является оптимальным для ингибирования опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26. Как показано на Фиг.9, объем опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26, достигал приблизительно 400-500 мм³ на день 15. Комбинация хидамида (12,5 мг/кг) плюс целекоксиба (12,5, 25 или 50 мг/кг) с антителами к PD-1 (2,5 мг/кг) оказывала значимое ингибирующее воздействие на рост опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26 (Фиг.9, участок А). Только в группах терапии, получавших целекоксиб в дозе 25 мг/кг, наблюдалась более слабая противораковая активность. Далее, в группах терапии, получавших хидамид (12,5 мг/кг) плюс целекоксиб (12,5, 25 или 50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 (2,5 мг/кг), наблюдалось значимое ингибирующее воздействие на рост опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26 (Фиг.9, участок В). Комбинация хидамида (50 мг/кг) плюс целекоксиба (12,5, 25 или 50 мг/кг) с антителами к PD-1 (2,5 мг/кг) оказывала значимое ингибирующее воздействие на рост опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26 (Фиг.9, участок С). Полученные данные еще раз подтвердили, что хидамид 50 мг/кг плюс целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-1 являются даже более эффективными в отношении ингибирования роста опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26 (Фиг.9, участок С). Эти результаты указывают на то, что хидамид 50 мг/кг плюс целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек, антителами к PD-1, обладают сильной противоопухолевой активностью в модели на мышах, несущих опухоль СТ26. С другой стороны, эти результаты также демонстрируют, что соотношение доз хидамида/целекоксиба имеет важное значение. Противораковые эффекты различных терапевтических режимов, достигнутые у всех мышей, показаны на Фиг.9, участок D. Терапия с применением хидамида 12,5 мг/кг плюс целекоксиб в различных дозах (12,5, 25 или 50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 продемонстрировала лишь слабую противораковую активность, только у одной или двух мышей был достигнут ЧО (частота ответа 25-40%). Терапия с применением хидамида 25 мг/кг плюс целекоксиб в различных дозах (12,5, 25 или 50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 продемонстрировала лишь слабую противораковую активность, только у одной или двух мышей был достигнут ЧО (частота ответа 20-40%). Терапия с применением хидамида 50 мг/кг плюс целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-1 продемонстрировала сильную противораковую активность, у трех мышей был достигнут ЧО (частота ответа 75%). Как показано на Фиг.9, участок Е, ни у одной мыши во всех группах терапии не наблюдалось никакого уменьшения массы тела. Как показано на Фиг.9, участок F, хидамид в более низкой дозировке (12,5 мг/кг) плюс целекоксиб в дозировке 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-1 увеличивали выживаемость приблизительно до 40%, в сравнении с контрольной группой, получавшей антитела к IgG, в модели на мышах, несущих опухоль СТ26. Полученный результат демонстрирует, что режим хидамид 12,5 мг/кг плюс целекоксиб в высокой дозировке (50 мг/кг) имеет более сильный противораковый эффект. Помимо этого, как показано на Фиг.9, участок G, промежуточная дозировка хидамида (25 мг/кг) плюс целекоксиб в дозировке от 12,5 до 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-1 не приводили к повышению выживаемости. Наконец, как показано на Фиг.9, участок Н, высокая дозировка хидамида (50 мг/кг) плюс высокая дозировка целекоксиба (50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 демонстрировали сильное ингибирующее воздействие на рост опухоли и увеличивали выживаемость до приблизительно 50% на день 58. После прекращения терапии на день 30, в контрольной группе IgG рост опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26, ускорился. В этом исследовании терапию начинали после достижения объема опухоли приблизительно 400-500 мм. Это должно было привести к более низкой частоте ответа и более низкой выживаемости во всех группах терапии. Однако, режим хидамид 50 мг/кг плюс целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-1 по-прежнему оказывал очень сильное ингибирующее воздействие на рост опухоли и, таким образом, значимо повышал выживаемость (Фиг.9, участки F-H).

Пример 10. Для прояснения механизмов противоракового действия ингибиторов HDAC плюс ингибиторов ЦОГ-2 в сочетании с антителами к PD-1 или антителами к CTLA-4 у мышей, несущих опухоль СТ26

Далее, имелась заинтересованность в оценке того, будут ли другие ингибиторы HDAC и ингибиторы ЦОГ-2, в присутствии антител, являющихся ингибиторами иммунных контрольных точек, также оказывать ингибирующее воздействие на опухоль у мышей, несущих опухоль СТ26. Как показано на Фиг.10, объем опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26, достигал приблизительно 250-300 мм³ на день 10. Во-первых, были проведены испытания различных ингибиторов ЦОГ-2 плюс хидамид в сочетании с антителами к PD-1 у мышей, несущих опухоль СТ26. Комбинации хидамид плюс целекоксиб (селективный ингибитор ЦОГ-2, 50 мг/кг), аспирин (неселективный ингибитор ЦОГ-2, 50 мг/кг) или ибупрофен (неселективный ингибитор ЦОГ-2, 50 мг/кг), в присутствии антител к PD-1, продемонстрировали значимое ингибирование роста опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26 (Фиг.10, участок А). Во-вторых, хидамид 50 мг/кг плюс целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-1 2,5 мг/кг или без них являются даже более эффективными в отношении ингибирования роста опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26, по сравнению с другими группами (Фиг.10, участок А). Неожиданно, в группе, получавшей хидамид 50 мг/кг в сочетании с целекоксибом 50 мг/кг, наблюдалось очень значительное ингибирование роста опухоли, как показано на Фиг.10, участок А. Ингибиторы ЦОГ-2 в одинаковой дозировке демонстрировали противораковую активность, убывающую в следующем ряду (от большей активности к меньшей): целекоксиб > аспирин > ибупрофен. Далее, мы провели оценку различных ингибиторов HDAC, таких как хидамид, энтиностат и моцетиностат, в сочетании с целекоксибом и антителами к PD-1. Было показано, что режим энтиностат плюс целекоксиб в сочетании с антителами к PD-1 обладает сильной противораковой активностью, как показано на Фиг.3, участок В. В этом исследовании мы провели оценку режима моцетиностат (ингибитор HDAC класса I, 30 мг/кг) плюс целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-1 2,5 мг/кг, для определения его противораковой активности. Не было выявлено никаких значимых различий между режимами хидамид плюс целекоксиб и моцетиностат плюс целекоксиб, в сочетании с антителами к PD-1 (Фиг.10, участок В). Помимо этого, мы также выяснили, что комбинация с ингибитором иммунных конечных точек, антителами к CTLA-4, оказывает ингибирующее воздействие на опухоль у мышей, несущих опухоль СТ26. Полученные результаты показали, что режимы хидамид плюс целекоксиб в сочетании с антителами к PD-1 или антителами к CTLA-4 оказывают значимое ингибирующее воздействие на рост опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26 (Рис.10, участок С). Не было выявлено никаких значимых различий между терапией с применением антител к PD-1 и с применением антител к CTLA-4, в сочетании с хидамидом и целекоксибом. Эти результаты указывают на то, что ингибиторы HDAC плюс ингибиторы ЦОГ-2 в сочетании с ингибиторами иммунных контрольных точек обладают сильной противоопухолевой активностью в модели на мышах, несущих опухоль СТ26. Терапевтические ответы, полученные для всех мышей, получавших терапию в различных режимах, показаны на Фиг.10, участок D. В группе, получавшей только антитела к PD-1, наблюдалась лишь слабая противораковая активность, только у двух мышей был достигнут ЧО (частота ответа 25%). Режим терапии хидамид 50 мг/кг плюс целекоксиб 50 мг/кг продемонстрировал сильное ингибирующее воздействие на рост опухоли, у шести мышей был достигнут ЧО (частота ответа 75%); однако, этот режим обладал менее сильным ингибирующим воздействием, чем режим хидамид плюс целекоксиб в сочетании с антителами к PD-1, на котором у семи мышей был достигнут СО (частота ответа 88%). С другой стороны, мы провели оценку комбинации с аспирином 50 мг/кг и ибупрофеном 50 мг/кг, в отношении их противораковой активности. Терапия хидамидом плюс аспирином или ибупрофеном в сочетании с антителами к PD-1 продемонстрировала меньшую противораковую активность, по сравнению с противораковой активностью терапии с применением целекоксиба, только у четырех и трех мышей был достигнут ЧО (частота ответа 50%, 38%), соответственно). По-видимому, целекоксиб оказывал более сильное ингибирующее воздействие на рост опухоли, чем аспирин и ибупрофен. Далее, было проведено сравнение противораковой активности хидамида и моцетиностата. В группе, получавшей моцетиностат 30 мг/кг или хидамид 50 мг/кг плюс целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-1 2,5 мг/кг, у семи мышей был достигнут ЧО (частота ответа 88%). Этот результат показывает, что хидамид, энтиностат и моцетиностат обладают сходной противораковой активностью. Эти соединения относят к ингибиторам HDAC класса I. Далее, мы были заинтересованы в определении того, обладают ли антитела к CTLA-4 такой же активностью, как и другие ингибиторы иммунных контрольных точек, такие как антитела к PD-1 или антитела к PD-L1. В группах, получавших хидамид 50 мг/кг плюс целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с антителами к CTLA-4 2,5 мг/кг или антителами к PD-1 2,5 мг/кг, у семи мышей был достигнут ЧО (частота ответа 88%). Учитывая вышесказанное, режим ингибиторы HDAC (хидамид, энтиностат, моцетиностат) плюс целекоксиб обладает сильной активностью против роста опухолей. И далее, при сочетании с антителами к PD-1 или антителами к CTLA-4 ингибирование роста опухоли в модели на мышах, несущих опухоль СТ26, было значимо повышено (Фиг.10, участок D). Как показано на Фиг.10, участок Е, ни у одной мыши во всех группах терапии не наблюдалось никакого уменьшения массы тела. Как показано на Фиг.10, участок F, режим хидамид плюс целекоксиб в сочетании с антителами PD-1 или без них обладает сильной противораковой активностью и значимо повышает выживаемость приблизительно до 75%, по сравнению с контрольной группой, получавшей антитела к PD-1 (приблизительно 20%), в модели на мышах, несущих опухоль СТ26. Полученные результат подтвердил, что режим применения ингибиторов HDAC плюс ингибиторов ЦОГ-2, особенно в сочетании с ингибиторами иммунных контрольных точек, представляет собой хорошую комбинацию для противораковой терапии. Этот режим позволяет контролировать микроокружение опухоли и усиливать эффект иммунотерапии. Этот результат также продемонстрировал, что режимы, включающие аспирин или ибупрофен, обладают противораковой активностью и увеличивают выживаемость, однако демонстрировали меньшую активность, чем режим, включающих целекоксиб, как показано на Фиг.10, участок F. Помимо этого, как показано на Фиг.10, участок G, режим хидамид плюс целекоксиб в сочетании с антителами к PD-1 был более сильным, чем режим, включающий моцетиностат, в отношении ингибирования роста опухоли и увеличения выживаемости (75% в сравнении с 62,5%). Наконец, как показано на Фиг.10, участок Н, хидамид плюс целекоксиб в сочетании с антителами к CTLA-4 обеспечивали более сильное ингибирование роста опухоли и увеличивали выживаемость приблизительно до 100%. Этот результат показывает, что комбинированный режим, включающий антитела к CTLA-4, был более сильным, чем комбинированный режим, включающий антитела к PD-1 (выживаемость 75%), в отношении выживаемости в модели на мышах, несущих опухоль СТ26. После прекращения терапии на день 26, в контрольной группе IgG рост опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26, ускорился. Однако, сильное ингибирование роста опухоли и повышенная выживаемость могут быть достигнуты за счет следующих комбинированных режимов: хидамид плюс аспирин, ибупрофен или целекоксиб, или дополнительно в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек; моцетиностат плюс целекоксиб в сочетании с ингибиторами контрольных точек; антитела к CTLA-4 в сочетании с хидамидом плюс целекоксибом (Фиг 10, участки F-H). В общей сложности, режимы, включающие ингибиторы иммунных контрольных точек, включая PD-1, антитела к PD-L1 и антитела к CTLA-4, в сочетании с хидамидом плюс целекоксибом, могут эффективно влиять на число или активность основных компонентов микроокружения опухоли, таких как Treg (регуляторные Т-клетки), MDSC (супрессорные клетки миелоидного происхождения), ТАМ (опухоль-ассоциированные макрофаги), NK (Т-клетки-натуральные киллеры) и CTL (цитотоксические Т-лимфоциты). Наконец, эти режимы были эффективными в отношении усиления эффекта иммунотерапии. Эти результаты дополнительно подтверждают, что ингибитор HDAC (в частности, ингибитор HDAC класса I) плюс ингибиторы ЦОГ-2 (в частности, селективные ингибиторы ЦОГ-2) эффективно усиливают противораковую активность ингибиторов иммунных контрольных точек, в отношении частоты ответа и выживаемости.

Пример 11. Для подтверждения наилучшего комбинированного режима - хидамид с целекоксибом в сочетании с антителами к PD-1, у мышей, несущих опухоль СТ26

Проводилась оценка противоракового эффекта с использованием большего количества мышей в каждой терапевтической группе с целью подтверждения того, что режим хидамид и целекоксиб в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек, антителами к PD-1, обеспечивает сильное ингибирование опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26. Как показано на Фиг.11, объем опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26, достигал приблизительно 250-300 мм³ на день 9. Комбинация хидамид плюс целекоксиб с антителами к PD-1 оказывала значимое ингибирующее воздействие на рост опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26 (Фиг.11, участок А). Комбинация хидамид 50 мг/кг плюс антитела к PD-1 2,5 мг/кг также оказывала значимое ингибирующее воздействие на рост опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26 (Фиг.11, участок А). Сходный результат также был получен для комбинации хидамид 50 мг/кг плюс целекоксиб 50 мг/кг (Фиг.11, участок А). Однако, хидамид 50 мг/кг плюс целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-1 2,5 мг/кг являются даже более эффективными в отношении ингибирования роста опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26, по сравнению с другими группами (Фиг.11, участок А). Эти результаты указывают на то, что хидамид плюс целекоксиб в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек обладают сильной противоопухолевой активностью в модели на мышах, несущих опухоль СТ26. Противораковые эффекты различных терапевтических режимов, достигнутые у всех мышей, показаны на Фиг.11, участок В. В группе, получавшей только антитела к PD-1, наблюдалась лишь слабая противораковая активность, только у трех мышей был достигнут ЧО (частота ответа 25%). Комбинация хидамид плюс целекоксиб демонстрировала слабую противораковую активность, только у четырех мышей был достигнут ЧО (частота ответа 33%). Комбинация хидамид плюс антитела к PD-1 также демонстрировала повышенную противораковую активность, у пяти мышей был достигнут ЧО (частота ответа 41%). Комбинация хидамид плюс целекоксиб и антитела к PD-1 демонстрировала наилучшую противораковую активность, у восьми мышей был достигнут ЧО (частота ответа 72%). Как показано на Фиг.11, участок С, ни у одной мыши во всех группах терапии не наблюдалось никакого уменьшения массы тела. Как показано на Фиг.11, участок D, хидамид 50 в сочетании с антителами к PD-1 2,5 мг/кг или только антитела к PD-1 2,5 мг/кг увеличивали выживаемость до приблизительно 33% и 16%, соответственно. Однако вновь было подтверждено, что режим хидамид 50 мг/кг плюс целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-1 2,5 мг/кг является сильной комбинацией, эффективно ингибирующей рост опухоли и повышающей выживаемость до приблизительно 72% в модели на мышах, несущих опухоль СТ26. Режим хидамид в сочетании с целекоксибом при отсутствии антител к PD-1 не повышал выживаемость, по сравнению с контрольным режимом, включавшим антитела к IgG. Режим, в котором отсутствовал целекоксиб, продемонстрировал лишь слабое увеличение выживаемости. В общей сложности, эти данные демонстрируют, что хидамид плюс целекоксиб в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек были очень сильной и эффективной комбинацией в отношении ингибирования роста опухоли и, таким образом, значимо увеличивали выживаемость при иммунотерапии (Фиг.11, участок D). Этот комбинированный режим может играть важную роль в усилении Т-клеточной памяти за счет синергетических механизмов, действующих в микроокружении опухоли.

Пример 12 Для прояснения механизмов противоракового действия хидамида плюс целекоксиба в сочетании с антителами к PD-L1, за счет использования голых мышей, несущих опухоль СТ26

Мы были заинтересованы в оценке того, обеспечивает ли комбинация хидамид плюс метформин и целекоксиб в сочетании с антителами к PD-L1 ингибирование опухоли за счет активации цитотоксических Т-лимфоцитов у мышей, несущих опухоль СТ26 (с нормальным иммунным статусом). Для проверки этой теории мы использовали модель на иммунодефицитных бестимусных голых мышах (с дефицитом цитотоксических Т-лимфоцитов) Голые мыши представляли собой лабораторных мышей, полученных из линии с генетической мутацией, которая вызывает дефект развития тимуса. Этот дефект должен вызывать значимое снижение численности Т-клеток и отсутствие клеточно-опосредованного иммунитета. Как показано на Фиг.12, объем опухоли у голых мышей, несущих опухоль СТ26, достигал приблизительно 350-400 мм³ на день 15. Была проведена оценка противоракового эффекта в нескольких группах терапии. Ни в одной из групп не было достигнуто эффективное ингибирование роста опухоли в модели на голых мышах, несущих опухоль СТ26, как показано на Фиг.12, участок А. Режимы хидамид 50 мг/кг плюс метформин 100 мг/кг и целекоксиб 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-L1 2,5 мг/кг или без них имели слабую противораковую активность, по сравнению с другими режимами. Однако, как показывают предыдущие данные, такие же режимы терапии демонстрировали противораковую активность у мышей с нормальным иммунитетом (мышей дикого типа), несущих опухоль СТ26. Эти результаты указывают на то, что нормальный иммунитет требуется для проявления сильной противоопухолевой активности комбинированной терапии ингибиторами иммунных контрольных точек плюс хидамид и целекоксиб, в присутствии или отсутствии метформина, в модели на мышах, несущих опухоль СТ26. Противораковые эффекты различных терапевтических режимов, достигнутые у всех мышей, показаны на Фиг.12, участок В. Ни в одной из групп терапии не был достигнут ответ ЧО. Эти результаты показывают, что все режимы не могут проявлять значимую противораковую активность у иммунодефицитных голых мышей Режимы хидамид плюс целекоксиб и метформин в сочетании с антителами к PD-L1 или без них продемонстрировали слабую противораковую активность, по сравнению с другими группами. Как показано на Фиг.12, участок С, ни у одной мыши во всех группах терапии не наблюдалось никакого уменьшения массы тела. Масса опухоли у голых мышей, несущих опухоль СТ26, достигала приблизительно 2,7-3,3 г на день 29, как показано на Фиг.12, участок D. Только комбинация хидамид 50 мг/кг плюс метформин 100 мг/кг и целекоксиб 50 мг/кг продемонстрировала слабое ингибирование роста опухоли, на основании массы опухоли, однако не наблюдалось значимого ингибирования на основании объема опухоли, как показано на Фиг.12, участок D. На основании результатов этого исследования, в сравнении с данными, полученными для мышей BALB/c дикого типа (Фиг.1-11), был сделан вывод о том, что противоопухолевая активность комбинации хидамид плюс метформин и целекоксиб в сочетании с антителами к PD-L1 или антителами к PD-1 требует нормального иммунитета (Фиг.12, участок Е). Таким образом, эти результаты подтверждают наше предположение о том, что комбинированная терапия, включающая хидамид плюс метформин и целекоксиб в сочетании с антителами к PD-1/PD-L1 оказывает синергетический противоопухолевый эффект за счет реактивации цитотоксических Т-лимфоцитов для уничтожения ими опухолевых клеток.

В общей сложности, эти данные демонстрируют, что комбинация хидамид плюс целекоксиб является очень важной комбинацией, обеспечивает эффективный контроль микроокружения опухоли и обладает иммуномодулирующей активностью. При сочетании этой комбинации с ингибитором иммунных контрольных точек, таким как антитела к PD-1, антитела к PD-L1 или антитела к CTLA-4, она обладала большей эффективностью в отношении усиления противораковой активности и увеличения выживаемости в модели на животных с нормальным иммунитетом. Мы можем прогнозировать, что комбинация хидамид плюс целекоксиб в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек будет оказывать значимое воздействие, усиливающее эффективность иммунотерапии у пациентов с раком.

Пример 13. Для анализа циркулирующих и инфильтрующих опухоль иммунных клеток после терапии хидамидом плюс целекоксибом в сочетании с антителами к PD-1 у мышей BALB/c, несущих опухоль СТ26

Исследовался вопрос о том, оказывает ли эпигенетический модулятор хидамид в сочетании с ингибитором ЦОГ-2 влияние на популяцию иммунных клеток как циркулирующих в крови, так и присутствующих в микроокружении опухоли. Используя проточную цитометрию, вначале мы проанализировали популяцию циркулирующих иммунных клеток (CD4⁺ Т-клетки, CD8⁺ Т-клетки, PMN-MDSC и M-MDSC, а также клетки Treg) у нормальных мышей (без опухоли) и у мышей, несущих опухоль. Мы обнаружили, что у мышей, несущих опухоль СТ26, наблюдалось увеличение числа циркулирующих гранулоцитарных клеток MDSC (клетки PMN-MDSC; определяемые как CD11b⁺Ly6G⁺Ly6C^low) в 4,7 раза и увеличение числа циркулирующих моноцитарных клеток MDSC (клетки М-MDSC; определяемые как CD11b⁺Ly6G^-Ly6C⁺) на 25%, по сравнению с нормальными мышами (Фиг.13, участок А). С другой стороны, мы также обнаружили, что у мышей, несущих опухоль, наблюдается заметное уменьшение числа CD4⁺ Т-клеток, CD8⁺ Т-клеток и клеток Treg, по сравнению с нормальными мышами, как показано на Фиг.13, участок А. Клетки MDSC (супрессорные клетки миелоидного происхождения) представляют собой гетерогенную популяцию клеток, размножающихся во время развития рака, воспаления и инфекции и обладающих способностью подавлять функции Т-клеток. Наше исследование было направлено на оценку эффекта режимов терапии на клетки М-MDSC, как показано на Фиг.13, участок В. У мышей, несущих опухоль, число клеток M-MDSC было значимо повышено при отсутствии какой-либо терапии. Однако их число значимо снижалось после терапии антителами к PD-1 отдельно либо хидамидом плюс целекоксибом или хидамидом плюс целекоксибом в сочетании с антителами к PD-1. Терапия приводила к выраженному снижению числа циркулирующих клеток M-MDSC до уровня, сходного с уровнем, наблюдавшимся у нормальных мышей при отсутствии какой-либо терапии (Фиг.13, участок В). Полученный результат также показывает, что число клеток PMN-MDSC значимо не изменялось при отсутствии какой-либо терапии (данные не приведены). Помимо этого, мы проанализировали циркулирующие клетки М-MDSC у мышей, несущих опухоль, на день 12 и объем опухоли на день 23 после терапии, как показано на Фиг.13, участок С.Результаты показывают, что число циркулирующих клеток M-MDSC на день 12 значимо коррелировало с объемом опухоли на день 23 после терапии. Число других иммунных клеток не демонстрировало значимой корреляции с объемом опухоли (данные не приведены). Эти результаты указывают на то, что, возможно, циркулирующие клетки M-MDSC могут служить основой для прогноза развития опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26. С другой стороны, мы обнаружили, что число циркулирующих клеток Treg было значимо понижено после терапии хидамидом плюс целекоксибом в сочетании с антителами к PD-1 на день 8 и хидамидом плюс целекоксибом без антител к PD-1 на день 12 (Рис.13, участок D). Далее мы провели анализ инфильтрирующих опухоль иммунных клеток. Терапия только антителами к PD-1 приводила к заметному снижению числа миелоидных клеток и клеток M-MDSC. Сходные результаты были получены также в группах, получавших антитела к PD-1 в сочетании с хидамидом плюс целекоксибом или хидамид плюс целекоксиб, как показано на Фиг.13, участок Е. Число клеток ТАМ заметно не изменялось после любой терапии, за исключением терапии хидамидом плюс целекоксибом. Число клеток Tregs было заметно пониженным после терапии антителами к PD-1 в сочетании с хидамидом плюс целекоксибом, и умеренно пониженным после терапии только антителами к PD-1 или хидамидом плюс целекоксибом, как показано на Фиг.13, участок F. Мы обнаружили, что соотношение числа CD4⁺ Т-клеток к числу клеток Tregs было немного повышенным в опухолевых тканях в группе терапии, получавшей комбинацию антител к PD-1 с хидамидом плюс целекоксибом, по сравнению с другими группами (Фиг.13, участок G). В этой группе терапии также наблюдалось повышенное соотношение числа CD8⁺ Т-клеток к клеткам Tregs, по сравнению с другими группами (Фиг.13, участок Н). В общей сложности, терапия хидамидом плюс целекоксибом приводила к снижению числа инфильтрирующих опухоль миелоидных клеток (CD45⁺CD11b⁺), клеток M-MDSC (Фиг.13, участок Е) и клеток Tregs (Фиг.13, участок F). Эти результаты указывают на то, что хидамид плюс целекоксиб играют важную роль в подавлении циркулирующих и инфильтрирующих опухоль супрессорных клеток, что, в свою очередь, вносит вклад в противоопухолевую активность в сочетании с антителами к PD-1, наблюдаемую у мышей, несущих опухоль СТ26.

1. Способ устранения иммуносупрессии в микроокружении опухоли или стимуляции активности иммунной системы против раковых клеток, включающий введение субъекту комбинации, содержащей ингибитор гистондеацетилазы (HDAC) и нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек.

2. Способ по п. 1, который может обеспечить ингибирование или лечение раковых заболеваний посредством иммунотерапии.

3. Способ по п. 1, в котором указанные раковые заболевания выбирают из группы, состоящей из глиобластомы, рака печени, колоректальной карциномы, рака желудка, колоректального рака, рака пищевода, рака легких, рака поджелудочной железы, почечноклеточной карциномы, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, рака предстательной железы, рака яичников, меланомы, рака молочной железы, хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), карциномы из клеток Меркеля, неходжкинской лимфомы, острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), рака желчного пузыря, холангиокарциномы, рака мочевого пузыря и рака матки.

4. Способ по п. 1, в котором в комбинацию дополнительно включают бигуанидное соединение.

5. Способ по п. 1, в котором ингибитор HDAC представляет собой селективный ингибитор HDAC класса I.

6. Способ по п. 1, в котором ингибитор HDAC представляет собой ингибитор HDAC класса бензамидов.

7. Способ по п. 1, в котором ингибитор HDAC выбирают из группы, состоящей из хидамида, энтиностата, вориностата, ромидепсина, панобиностата, белиностата, вальпроевой кислоты, моцетиностата, абексиностата, прациностата, резминостата, гивиностата или квизиностата.

8. Способ по п. 1, в котором ингибитор HDAC выбирают из группы, состоящей из

хидамида, энтиностата или моцетиностата.

9. Способ по п. 1, в котором НПВП выбирают из группы, состоящей из аспирина, ибупрофена, индометацина, напроксена или ингибитора ЦОГ-2.

10. Способ по п. 9, в котором ингибитор ЦОГ-2 выбирают из группы, состоящей из целекоксиба, рофекоксиба или эторикоксиба.

11. Способ по п. 1, в котором ингибитор иммунных контрольных точек выбирают из группы, состоящей из антитела к CTLA-4, антитела к PD-1, антитела к PD-L1, антитела к TIM-3, антитела к BTLA, антитела к VISTA или антитела к LAG-3.

12. Способ по п. 1, в котором ингибитор иммунных контрольных точек выбирают из группы, состоящей из ламбролизумаба, пидилизумаба, ниволумаба, дурвалумаба, авелумаба, атезолизумаба и MIH1.

13. Способ по п. 4, в котором бигуанидное соединение выбирают из группы, состоящей из метформина, фенформина, прогуанила и хлорпрогуанила.

14. Способ по п. 1, в котором количества ингибитора HDAC, НПВП и ингибитора иммунных контрольных точек в комбинации находятся в интервале значений от приблизительно 10% (вес.) до приблизительно 70% (вес.), от приблизительно 10% (вес.) до приблизительно 70% (вес.) и от приблизительно 0,5% (вес.) до приблизительно 20% (вес.) соответственно.

15. Способ по п. 4, в котором количество бигуанидного соединения находится в интервале значений от приблизительно 30 до 70% (вес.).

16. Способ по п. 1, который дополнительно включает введение по меньшей мере одного дополнительного противоракового агента.

17. Фармацевтическая комбинация для устранения иммуносупрессии в микроокружении опухоли или стимуляции активности иммунной системы против раковых клеток, содержащая ингибитор HDAC, НПВП и ингибитор иммунных контрольных точек.

18. Комбинация по п. 17, в которой количества ингибитора HDAC, НПВП и ингибитора иммунных контрольных точек находятся в интервале значений от 10% (вес.) до 70% (вес.), от 10% (вес.) до 70% (вес.) и от 0,5% (вес.) до 20% (вес.) соответственно.

19. Комбинация по п. 17, которая дополнительно содержит бигуанидное соединение.

20. Комбинация по п. 19, в которой количество бигуанидного соединения находится в интервале значений от приблизительно 30% (вес.) до приблизительно 70% (вес.).