Штамм бактерий escherichia coli jm 109 4-162 - продуцент рекомбинантной плазмиды pwnv4protc, несущей последовательность участка гена полипротеина west nile virus 4 генотипа, кодирующего капсидный белок

Изобретение относится к области генной инженерии, микробиологии, вирусологии. Предложен рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli JM 109 4-162, предназначенный для использования в качестве положительного контроля при оценке эффективности амплификации кДНК West Nile virus 4 генотипа и являющийся продуцентом рекомбинантной плазмиды pWNV4protC. Указанная плазмида pWNV4protC несет фрагмент генома West Nile virus 4 генотипа размером 162 п.н., представляющий собой участок гена полипротеина West Nile virus, кодирующего капсидный белок. Предложенный штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» Роспотребнадзора под номером КМ 2051. Изобретение может использоваться для конструирования и производственного изготовления наборов реагентов для выявления и дифференциации генотипов West Nile virus. Изобретение обеспечивает эффективную репликацию и выделение рекомбинантной плазмиды pWNV4protC с высоким выходом. 2 ил., 3 пр.

 

Изобретение относится к области генной инженерии, микробиологии, вирусологии и заключается в конструировании рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli JM 109 4-162, являющегося продуцентом рекомбинантной плазмиды pWNV4protC, несущей последовательность участка гена полипротеина West Nile virus 4 генотипа, кодирующего капсидный белок. Штамм предназначен для получения рекомбинантной плазмиды pWNV4protC, используемой в качестве положительного контроля для оценки эффективности амплификации кДНК West Nile virus 4 генотипа методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора под номером КМ 2051.

Вирус Западного Нила West Nile virus) принадлежит семейству Flaviviridae, роду Flavivirus, антигенному комплексу вируса японского энцефалита (Japanese encephalitis virus group). По принятой в Российской Федерации классификации патогенных биологических агентов West Nile virus с относится к вирусам II группы патогенности.

West Nile virus является возбудителем природно-очаговой арбовирусной инфекции с трансмиссивным механизмом передачи, называемой лихорадкой Западного Нила (ЛЗН). Клинические проявления ЛЗН варьируют от гриппоподобного синдрома до развития тяжелых осложнений в форме менингита и менингоэнцефалита. Летальность при ЛЗН, в зависимости от иммунного статуса заболевших, составляет до 10%. С 1999 года лабораторно подтвержденные случаи ЛЗН на территории России регистрируют ежегодно. Ареалы West Nile virus занимают огромные территории в пределах экваториального, тропического и умеренного климатических поясов в Африке, Европе, Америке, Азии и Австралии. В России ареал распространения West Nile virus охватывает территории юга европейской части, регионы Сибири и Дальнего Востока.

По современным данным штаммы ВЗН разделены на 9 генотипов (генетических линий). В России достоверно зарегистрирована циркуляция 1, 2 и 4 генотипов ВЗН, имеющих разное эпидемическое значение. Так, штаммы ВЗН генотипов 1 и 2 являются высокопатогенными для человека, а патогенность ВЗН 4 генотипа для млекопитающих пока не установлена. Варианты ВЗН 4 генотипа распространены на территории юга Восточно-Европейской равнины. Природными резервуарми ВЗН 4 генотипа являются озерные лягушки Rana ridibunda, а в качестве переносчиков выступают комары Uranotaenia unguiculata. Известны единичные находки ВЗН 4 генотипа в комарах Anopheles hurcanus, Anopheles messeae и клещах Dermacentor marginatus. Для ВЗН 4 генотипа прототипным является штамм LEIV-Krd88-190, выделенный от иксодовых клещей Dermacentor marginatus, собранных в 1988 году в предгорных районах Северного Кавказа.

Генотипирование - комплексный анализ уникального для каждого живого организма генотипа на основе изучения его генома. Циркуляция разных генетических линий вируса на территории Российской Федерации диктует необходимость разработки и совершенствования диагностических методов и тест-систем для выявления и дифференциации штаммов возбудителя лихорадки Западного Нила. Установление генотипа West Nile virus является важной составляющей эпидемиологического мониторинга для изучения путей распространения вируса и выявления связей между его генетическими вариантами и клиническими формами ЛЗН.

Одним из перспективных подходов выявления генотипа West Nile virus в пробах биологического материала с высокой чувствительностью и специфичностью является использование полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР). Метод ОТ-ПЦР является прямым методом выявления РНК West Nile virus. В основе метода ОТ-ПЦР лежит последовательное осуществление двух процессов: реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. Реакция обратной транскрипции представляет собой синтез цепи комплементарной ДНК (кДНК) по матрице РНК посредством фермента ревертазы. Метод ПЦР заключается в амплификации целевых участков полученной кДНК посредством фермента ДНК-полимеразы и праймеров, фланкирующих участки уникальных кДНК-мишеней, существующих только у определенных генотипов вируса.

Для контроля эффективности амплификации, а, следовательно, и объективной оценки результатов исследования, необходимо использование положительных контрольных образцов. Положительный контроль позволяет удостовериться, что все компоненты, входящие в состав реакционной смеси, обеспечивают нормальное прохождение ПЦР. Если на этапе учета результатов ПЦР выявляют отсутствие накопления ампликонов положительного контроля, результаты для всех проб в исследуемой серии считают недостоверными, а отрицательные пробы являются потенциально ложноотрицательными.

В качестве положительного контроля применяют препарат нуклеиновой кислоты, содержащей мишени для отжига праймеров. Один из подходов заключается в использовании РНК или ДНК искомого возбудителя. Однако, в случае патогенных вирусов такой подход связан с высокой биологической опасностью. Так, геном West Nile virus представлен одноцепочечной молекулой (+) РНК (положительной полярности). Молекула (+) РНК непосредственно способна к участию в трансляции в качестве матричной, а, следовательно, может являться инфекционным биологическим агентом находясь вне вирусной частицы. Кроме того, молекулы РНК в силу особенностей химической структуры являются менее стабильными, чем ДНК. В связи с этим, применяют другой подход, заключающийся в конструировании положительных контрольных образцов с помощью генно-инженерных методов. Например, клонированием специфичных участков генома вирусов в составе векторов, в качестве которых используют плазмиды или бактериофаги Е. coli. Такие образцы отвечают требованиям биологической безопасности, стабильны при хранении и используются в производстве диагностических наборов.

В литературе описан подход конструирования экспрессирующих векторов на основе плазмид с клонированными в их составе фрагментами геномов вирусов энцефалита Сент-Луис и Западного Нила [Lorch М., Collado М., М. et al. Production of recombinant NS1 protein and its possible use in encephalitic flavivirus differential diagnosis // Protein Expression and Purification 153 (2019) 18-25]. В данной работе авторы использовали для клонирования нуклеотидную последовательность West Nile virus, кодирующую неструктурный белок (NS1). Однако локус NS1 является высококонсервативным для большинства штаммов West Nile virus и больше подходит для идентификации вируса, а не для его типирования.

Наиболее близким аналогом является генетически модифицированный штамм Е. coli TGI pWNAp^R, сконструированный Красовской Т.Ю. и депонированный в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора под номером KM 201 [Красовская, Т.Ю. Разработка и апробация тест-системы для выявления РНК вируса Западного Нила методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции: автореферат дис. … кандидата медицинских наук: 03.00.06 / Красовская Татьяна Юрьевна. - Кольцово: Гос. науч. центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», 2007. - 24 с.]. На основе данного штамма был создан положительный контрольный образец к разработанной автором ПЦР-тест-системе и стандартный образец предприятия, используемый для стандартизации процедуры контроля чувствительности и специфичности диагностического препарата «ГенНил-РЭФ» (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора, Россия) в условиях производства. Известны и другие зарегистрированные на территории РФ в качестве медицинских изделий диагностические наборы реагентов для обнаружения РНК West Nile virus, в состав которых входят положительные контрольные образцы: «АмплиСенс WNV-FL» (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), «ОМ-скрин ЛЗН/ЛДР-РВ» (ЗАО «СИНТОЛ», Россия). Однако все указанные выше наборы и используемые в их составе контрольные образцы применимы только для выявления West Nile virus, а не для дифференциации его генотипов.

Целью настоящего изобретения является конструирование штамма бактерий Esherichia coli JM 109 4-162, являющегося продуцентом рекомбинантной плазмиды pWNV4protC, несущей последовательность участка гена полипротеина West Nile virus 4 генотипа, кодирующего капсидный белок, для использования в качестве положительного контроля при оценке эффективности амплификации кДНК West Nile virus 4 генотипа.

Цель достигается созданием рекомбинантного штамма бактерий Esherichia coli JM 109 4-162 (Государственная коллекция патогенных бактерий ФКУЗ Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» Роспотребнадзора, номер КМ 2051), предназначенного для использования в качестве положительного контроля при оценке эффективности амплификации кДНК West Nile virus 4 генотипа, являющегося продуцентом рекомбинантной плазмиды pWNV4protC, несущей фрагмент генома West Nile virus 4 генотипа размером 162 п. н., представляющий собой участок гена полипротеина West Nile virus, кодирующего капсидный белок.

Характеристика штамма бактерий Escherichia coli JM 109 4-162

Штамм Е. coli JM 109 4-162 получен посредством трансформации клеток штамма Е. coli JM109 рекомбинантной плазмидой pWNV4protC, несущей фрагмент генома West Nile virus 4 генотипа размером 162 п. н., представляющий собой участок гена полипротеина West Nile virus, кодирующий капсидный белок. Полученный рекомбинантный штамм E. coli JM 109 4-162 сохраняет основные свойства, характерные для вида E. coli.

При посеве в LB-бульон (рН 7,2) через 24 часа при 37°С рекомбинантный штамм Е. coli JM109 4-162 дает рост в виде равномерного помутнения питательной среды с образованием небольшого легко разбивающегося сероватого осадка, а также пристеночного кольца. На LB-агаре (рН 7,2) образует полупрозрачные колонии цвета среды, легко сливающиеся между собой. На среде Эндо образует бесцветные (лактозонегативные) колонии. В мазках из бульонных и агаровых культур клетки штамм Е. coli JM 109 4-162 имеют вид грамотрицательных палочек.

Рекомбинантный штамм Е. coli JM109 4-162 имеет следующий спектр биохимической активности: ферментирует глюкозу с образованием кислоты и газа, не ферментирует лактозу и мочевину; не утилизирует из минимальной среды цитрат натрия; не обладает декарбоксилазой орнитина, а также дезаминазой фенилаланина; образует индол, но не образует сероводород.

Рекомбинантный штамм Е. coli JM109 4-162 чувствителен к моновалентному бактериофагу коли и пиобактериофагу поливалентному «Секстафагу».

Рекомбинантный штамм Е. coli JM109 4-162 не обладает гемолитической активностью, не вирулентен для белых мышей и золотистых хомячков (LD₅₀ штамма > 1×10⁷ м.к.), является устойчивым к антибиотику ампициллину.

Рекомбинантный штамм E. coli JM109 4-162 хранят в лиофилизированном состоянии или на полужидком агаре LB под слоем вазелинового масла.

Полученный рекомбинантный штамм E. coli JM109 4-162 обладает новым (приобретенным) свойством - является продуцентом рекомбинантной плазмиды pWNV4protC. Копийность рекомбинантной плазмиды pWNV4protC составляет до 200 геномных копий на клетку. Плазмида pWNV4protC несет в своем составе Ori репликации, маркер резистентности к антибиотику ампициллину (Amp^R), промотор lacZ, расположенный непосредственно перед областью вставки, и участок генома West Nile virus 4 генотипа размером 162 п.н., представляющий собой фрагмент гена полипротеина, кодирующий капсидный белок West Nile virus 4 генотипа.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Конструирование штамма бактерий E. coli JM109 4-162 - продуцента рекомбинантной плазмиды pWNV4protC, несущей фрагмент генома West Nile virus 4 генотипа.

Конструирование штамма бактерий E. coli JM109 4-162 осуществляли генно-инженерными методами посредством клонирования в клетках E. coli JM109 фрагмента генома West Nile virus 4 генотипа в составе плазмидного вектора pUC19. В качестве фрагмента для встраивания в клонирующий вектор была выбрана последовательность участка гена полипротеина West Nile virus 4 генотипа, кодирующего капсидный белок. Расчетная длина фрагмента для встраивания составила 162 п.н. Клонируемый фрагмент занимает позицию с 130 по 291 нуклеотид в геноме West Nile virus 4 генотипа (GenBank NCBI, Accession number: FJ159129).

Нуклеотидную последовательность фрагмента генома West Nile virus 4 генотипа, необходимого для встраивания в плазмидный вектор, получали путем химического синтеза с последующей амплификацией методом ПЦР. Для синтеза была предварительно сконструирована in silico одноцепочечная последовательность ДНК размером 212 нуклеотидов на основе полногеномной последовательности West Nile virus 4 генотипа, GenBank NCBI, Accession number: FJ159129). Данная последовательность ДНК включала в себя 5 основных участков: адаптерную последовательность на 5'-конце (5'-CTCAGTCCTACAGTCCACA-3'); сайт рестрикции для эндонуклеазы XbaI (5'-TCTAGA-3'); клонируемый участок размером 162 нуклеотида, представленный фрагментом гена полипротеина West Nile virus 4 генотипа, кодирующего капсидный белок (с 130 по 291 нуклеотид в геноме GenBank NCBI, Accession number: FJ159129); сайт рестрикции для эндонуклеазы EcoRI (5'-GAATTC-3'); адаптерную последовательность на 3'-конце (5'-ACTGTGGACTTCTGATCTG-3'). Адаптерные последовательности на концах синтезируемой молекулы были необходимы для ее последующей амплификации посредством ПЦР, а сайты рестрикции - для получения липких концов ДНК-вставки. Синтез данной генно-инженерной конструкции осуществляли фосфитамидным методом на автоматическом синтезаторе ДНК ASM-800 (ООО «Биоссет», Россия). Синтезированную одноцепочечную ДНК амплифицировали методом ПЦР с оригинальными праймерами, имеющими следующую структуру:

5'-CTCAGTCCTACAGTCCAC-3' - AdapterS212-F

5'-CAGATCAGAAGTCCACAG-3' - AdapterS212-R

Для получения клонируемого фрагмента ПЦР-смесь объемом 25 мкл включала в себя следующие компоненты: праймеры AdapterS212-F / AdapterS212-R, эквимолярную смесь четырех дНТФ (Amersham Biosciences, США), хлорид магния (Thermo Scientific, Литва), Taq буфер с сульфатом аммония (Thermo Scientinc, Литва), Taq-F-полимеразу (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), синтезированную одноцепочечную ДНК длиной 212 нуклеотидов. При проведении ПЦР использовали следующий режим: предварительная денатурация 95°С - 15 мин; цитирование (95°С - 10 с, 55°С - 15 с, 72°С - 15 с) × 50 циклов. ПЦР проводили на приборе С1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad, Сингапур).

Полученные ампликоны подвергали рестрикции с целью получения липких концов. Одновременно осуществляли рестрикцию вектора, в качестве которого использовали плазмиду pUC19 (Thermo Scientific, США). В качестве эндонуклеаз использовали ферменты XbaI и EcoRI (Thermo Scientific, США). Лигирование ампликона с вектором осуществляли в соотношении 3:1 с помощью лигазы фага Т4 (Invitrogen, США). Полученной рекомбинантной плазмидой pWNV4protC трансформировали компетентные клетки E. coli JM109 (Promega, США).

В результате проведенных генно-инженерных манипуляций получен клон рекомбинантного штамма E. coli JM 109 4-162, стабильно реплицирующий плазмиду pWNV4protC. Для достижения эффективной репликации и выделения рекомбинантной плазмиды pWNV4protC с высоким выходом штамм E. coli JM109 4-162 культивировали на среде LB (Lysogeny broth) по Ленноксу (Becton Dickinson, США) с содержанием ампициллина (ОАО «Синтез», Россия) в концентрации 100 мкг/мл при температуре 37°С.

Рекомбинантная плазмида pWNV4protC может быть выделена из клеток рекомбинантного штамма E. coli JM109 4-162 и использована в качестве положительного контроля при конструировании диагностических наборов реагентов для выявления штаммов West Nile virus 4 генотипа методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.

Пример 2. Идентификация фрагмента генома West Nile virus 4 генотипа в составе плазмиды pWNV4protC рекомбинантного штамма E. coli JM109 4-162 методами ПЦР и секвенирования.

Для подтверждения присутствия клонированной последовательности участка генома West Nile virus 4 генотипа в составе рекомбинантной плазмиды pWNV4protC и определения ее размера полученные трансформанты E. coli исследовали методом ПЦР с последующей электрофоретической детекцией.

Из выросшей на LB-arape суточной культуры полученного рекомбинантного штамма Е. coli JM109 4-162 готовили суспензию в 6 мл 0,9% стерильного раствора натрия хлорида (ООО МОСФАРМ, Россия), рН 7,2±0,1 эквивалентную по концентрации 1×10⁹ м.к./мл по отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц ФГБУ «НЦ ЭСМП» Минздрава России (ОСО 42-28-85-П (10МЕ)). Затем проводили десятикратные разведения подготовленной суспензии в 0,9% растворе натрия хлорида до конечной концентрации 1×10⁴ м.к./мл.

Далее к 6 мл полученной взвеси клеток E. coli в концентрации 1×10⁴ м.к./мл добавляли мертиолят натрия (Panreac, Испания) до конечной концентрации 1:10000 (0,01%) и прогревали его при 56°С в течение 30 минут с целью инактивации клеток E. coli JM109 4-162. Затем 100 мкл инактивированной взвеси клеток Е. coli JM109 4-162 переносили в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и осуществляли выделение ДНК с использованием коммерческого набора реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией к набору.

Далее образец выделенной ДНК в объеме 10 мкл использовали для амплификации методом ПЦР. Реакционная смесь объемом 25 мкл для проведения ПЦР включала в себя следующие компоненты: универсальные прямой и обратный праймеры Universal М13, фланкирующие полилинкер вектора pUC19 (Invitrogen, США), эквимолярную смесь четырех дНТФ (Amersham Biosciences, США), хлорид магния (Thermo ScientiRc, Литва), Taq буфер с сульфатом аммония (Thermo ScientiRc, Литва), Taq-F-полимеразу (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), ДНК-пробу. ПЦР проводили на приборе С1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad, Сингапур) при следующем режиме: удерживание температуры 95°С - 15 мин; циклирование (×40), включающее: денатурацию при температуре 95°С - 10 с, отжиг при температуре 55°С - 15 с, элонгацию при температуре 72°С - 25 с. Результаты ПЦР учитывали методом электрофореза в 2% агарозном геле. Аналогично исследовали образец сравнения, в качестве которого использовали 10 мкл ДНК плазмиды pUC19.

На рисунке 1 представлена электрофореграмма результатов амплификации с помощью универсальных праймеров Universal М13 фрагмента исходного плазмидного вектора pUC19 и сконструированной рекомбинантной плазмиды pWNV4protC. Цифрой 1 указан отрицательный контроль. Цифрой 2 обозначен ампликон размером 103 п.н., соответствующий фрагменту плазмиды pUC19 без вставки. Цифрой 3 обозначен ампликон размером 244 п.н., соответствующий фрагменту плазмиды pWNV4protC, в составе которого находится фрагмент генома West Nile virus 4 генотипа (162 п.н.), фланкированный участками полилинкера исходной плазмиды pUC19. Цифрой 4 отмечен маркер молекулярных масс (100-1000 п.н.). Размеры специфичных ампликонов свидетельствовали о наличии у рекомбинантной плазмиды pWNV4protC, продуцируемой штаммом E. coli JM109 4-162, вставки соответствующей длины (162 п. н.).

Определение последовательности нуклеотидов встроенного участка генома West Nile virus 4 генотипа в составе рекомбинантной плазмиды pWNV4protC проводили посредством секвенирования ампликонов, полученных с помощью универсальных праймеров Universal М13. Пробоподготовку и постановку ПЦР осуществляли, как описано выше. Ампликоны, полученные с использованием ДНК плазмиды pWNV4protC, очищали с помощью хроматографических колонок CENTRI-SEP (Princeton Separations, США) в соответствии с инструкцией производителя. Для проведения реакции циклического секвенирования использовали набор BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Секвенирование проводили на автоматическом генетическом анализаторе ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, США). Результаты секвенирования анализировали с помощью компьютерной программы MEGA 7 (Pennsylvania State University, США).

Нуклеотидная последовательность, полученная в результате секвенирования участка рекомбинантной плазмиды pWNV4protC, выделенной из клеток штамма E. coli JM 109 4-162, показала 100%-ную гомологию с аналогичной последовательностью РНК West Nile virus 4 генотипа, представляющей собой фрагмент гена полипротеина West Nile virus 4 генотипа, кодирующего капсидный белок. Это подтверждало наличие фрагмента генома West Nile virus 4 генотипа в составе рекомбинантной плазмиды pWNV4protC, продуцируемой штаммом E. coli JM109 4-162.

Пример 3. Использование рекомбинантной плазмиды pWNV4protC, продуцируемой штаммом E. coli JM109 4-162, в качестве положительного контроля при выявлении РНК West Nile virus 4 генотипа методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

Возможность применения рекомбинантной плазмиды pWNV4protC, продуцируемой штаммом E. coli JM109 4-162, в качестве положительного контроля оценивали с использованием набора специфичных олигонуклеотидных праймеров WNV-4type-F/WNV-4type-R и флуоресцентно-меченого зонда WNV-4type-P, сконструированного специалистами ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора для идентификации West Nile virus 4 генотипа.

Пробоподготовку осуществляли, как описано в примере 2. Обратную транскрипцию и ПЦР проводили в одной пробирке. В состав реакционной смеси, помимо ДНК плазмиды pWNV4protC, входили: разработанные праймеры WNV-4type-F / WNV-4type-R и флуоресцентно-меченый зонд WNV-4type-P, а также эквимолярная смесь четырех дНТФ (Amersham Biosciences, США), ПЦР-буфер (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), раствор хлорида магния (Thermo Scientific, Литва), фермент ревертаза MMlv (Thermo Scientific, США) и фермент Taq-F-ДНК-полимераза (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия). Объем реакционной смеси составлял 25 мкл. В качестве отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили равный объем дистиллированной воды. В качестве образца сравнения использовали РНК Wast Nile virus 4 генотипа, полученную из Референс-центра по мониторингу за возбудителем лихорадки Западного Нила, функционирующего на базе ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.

ПЦР проводили на приборе Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия). Условия проведения реакции: этап обратной транскрипции при 50°С - 30 мин; этап предварительной денатурации при 95°С - 15 мин; первое циклирование (5 повторений) - денатурация при 95°С - 5 с; отжиг праймеров при 56°С - 25 с; элонгация цепи при 72°С - 15 с; второе циклирование (40 повторений) - денатурация при 95°С - 5 с; отжиг праймеров при 56°С - 25 с; элонгация цепи при 72°С - 15 с. Детекцию накопления продуктов реакции осуществляли по каналу Yellow на этапе второго циклирования при температуре 56°С.

При анализе данных ОТ-ПЦР в режиме реального времени положительный результат был получен как для образца ДНК рекомбинантной плазмиды pWNV4protC, выделенной из штамма E. coli JM109 4-162, так и для образца сравнения, представляющего собой РНК Wast Nile virus 4 генотипа, что свидетельствовало о возможности применения рекомбинантной плазмиды pWNV4protC в качестве положительного контроля ОТ-ПЦР. На рисунке 2 представлен график кривых нарастания флуоресценции, полученный при проведении ОТ-ПЦР. Цифрой 1 обозначен образец ДНК рекомбинантной плазмиды pWNV4protC, выделенной из штамма E. coli JM109 4-162. Цифрой 2 отмечен образец РНК West Nile virus 4 генотипа. Отрицательный контроль располагается ниже пороговой линии.

Таким образом, сконструированный штамм бактерий Escherichia coli JM 109 4-162 является продуцентом рекомбинантной плазмиды pWNV4protC, которая может быть использована в качестве положительного контроля для оценки эффективности амплификации кДНК West Nile virus 4 генотипа в клинической лабораторной диагностике. Сконструированный штамм бактерий Escherichia coli JM 109 4-162 может найти применение в качестве сырья для конструирования и производственного изготовления наборов реагентов для выявления и дифференциации генотипов West Nile virus.

Штамм бактерий Escherichia соli JM 109 4-162 (Государственная коллекция патогенных бактерий ФКУЗ Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» Роспотребнадзора, номер КМ 2051), предназначенный для использования в качестве положительного контроля при оценке эффективности амплификации кДНК West Nile virus 4 генотипа, являющийся продуцентом рекомбинантной плазмиды pWNV4protC, несущей фрагмент генома West Nile virus 4 генотипа размером 162 п.н., представляющий собой участок гена полипротеина West Nile virus, кодирующего капсидный белок.