Набор синтетических олигонуклеотидов для одновременного генотипирования 63 днк-маркеров, ассоциированных с группой крови ав0, основными гаплогруппами y-хромосомы, цветом радужной оболочки глаза, волос, кожи и половой принадлежностью, методом пцр с последующей гибридизацией
Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой набор синтетических олигонуклеотидных праймеров для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также синтетических олигонуклеотидных ДНК-зондов для последующей гибридизации. Изобретение может быть использовано для исследования ДНК с целью вероятностного определения фенотипа по признакам: группа крови АВ0, гаплогруппа Y-хромосомы, цвет радужной оболочки глаза, цвет волос, цвет кожи и половая принадлежность. Изобретение относится также к способу генотипирования ДНК-маркеров, ассоциированных с фенотипическими признаками, имеющими значение в практической криминалистике. Набор для генотипирования включает композицию, образованную парами праймеров для 63 локусов в геноме человека, позволяющую проводить мультиплексную ПЦР (последовательность праймеров приведена в SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 107). Также в композицию для генотипирования входят аллель-специфичные олигонуклеотидные зонды для гибридизационного анализа (SEQ ID NO: 108-SEQ ID NO: 229). Праймеры подобраны таким образом, чтобы ПЦР-продукт имел минимальную длину, что позволяет успешно анализировать деградированные образцы ДНК. Композиция праймеров и олигонуклеотидных зондов подходит для различных технологических платформ, базирующихся на генотипировании с помощью амплификации ДНК с последующей гибридизацией. 3 пр., 2 табл., 3 ил.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области молекулярной генетики, биотехнологии, молекулярной биологии, судебной медицины и криминалистики, относится к набору синтетических олигонуклеотидных праймеров для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также синтетических олигонуклеотидных ДНК-зондов для последующей гибридизации. Изобретение может быть использовано для исследования ДНК с целью вероятностного определения фенотипа по признакам: группа крови АВ0, гаплогруппа Y-хромосомы, цвет радужной оболочки глаза, цвет волос, цвет кожи и половая принадлежность.
Уровень техники
Актуальной проблемой криминалистики и судебно-медицинской экспертизы является поиск преступника по биологическим следам, оставленным на месте преступления. Одним из направлений ведения поиска является определение фенотипических признаков, связанных с внешностью (пол, цвет глаз, волос, кожи, форма носа, ушей, черепа, рост, вес, возраст и прочие), этносом и другими признаками, облегчающими оперативно-следственную работу (группа крови АВ0). Для части из перечисленных фенотипических признаков уже известны генетические детерминанты, в высокой степени с ними ассоциированные. Большая часть этих генетических детерминант представляет собой однонуклеотидные полиморфизмы, инсерции и делеции.
В настоящее время существует ряд методов, позволяющих генотипировать однонуклеотидные и инсерционно-делеционные полиморфизмы. Вот наиболее распространенные из них:
- аллель-специфичная ПЦР с последующим электрофоретическим разделением продукта;
- аллель-специфичная ПЦР в реальном времени;
- ПЦР в реальном времени с последующим плавлением продукта (HRM – high resolution melting);
- секвенирование по Сэнгеру;
- секвенирование следующего поколения (NGS);
- ПЦР с последующей гибридизацией.
Известен ряд наборов синтетических олигонуклеотидов для генотипирования ДНК-маркеров, ассоциированных с фенотипическими признаками человека.
1. В патенте RU 2582216 C2 «БИОЛОГИЧЕСКИЙ МИКРОЧИП С НАБОРОМ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА В ГЕНАХ AB0, HLA-DQA1, AMEL, DARC, NAT2» заявлен набор дифференцирующих олигонуклеотидов и ПЦР-праймеров для анализа полиморфизма в генах АВ0, HLA-DQA1, AMEL, DARC, NAT2 с помощью технологии гидрогелевых ДНК-микрочипов (биочипов). Данное изобретение предназначено для определения двух фенотипических признаков: половой принадлежности и группы крови. Кроме того, при исследовании подозреваемых лиц, оно позволяет сузить круг за счет трех полиморфных локусов: HLA-DQA1, DARC и NAT2. Способ генотипирования, заявленный в изобретении, представляет собой двухстадийную «гнездную» ПЦР с последующей гибридизацией на биологических микрочипах. Двустадийная «гнездная» ПЦР требует переноса амплифицированного в первом раунде продукта в пробирку со смесью для амплификации второго раунда; этот перенос создает высокие риски кросс-контаминации между анализируемыми образцами. По этой причине предлагаемый способ применим (со всеми мерами предосторожности) для научных исследований, но малопригоден для ответственной повседневной работы, в частности связанной с поимкой опасных преступников. Кроме того, из значимых поисковых признаков изобретение позволяет определять только пол и группу крови. Учитывая, что эффективность генотипирования деградированной ДНК находится в обратной зависимости от длины ампликонов, анализ таких образцов будет затруднен в связи с тем, что авторы изобретения подбирали праймеры в широких пределах: «Ампликоны всех локусов должны варьировать по длине в пределах 250-600 п.н. для первого раунда» (RU 2582216 C2, стр.7, строка 45).
2. Известен также патент RU 0002539733 «НАБОР ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИХ НУКЛЕОТИДОВ И БИОЧИП ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В СПОСОБЕ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ МАРКЕРОВ ГАПЛОГРУПП Y-ХРОМОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА: M130 (C), M145 (DE), P257 (G), M69 (H), U179 (I), M304 (J), M185 (L), M231 (N), M175 (O), P224 (R). В изобретении предложена структура дифференцирующих олигонуклеотидов, биочип и способ его использования для генотипирования маркеров ряда гаплогрупп Y-хромосомы. Данное изобретение ограничено только гаплогруппами Y-хромосомы и не позволяет получать иную информацию о фенотипе. С методической точки зрения изобретение обладает тем же недостатком, что и описанное в п.1: способ генотипирования связан с применением двухстадийной «гнездной» ПЦР, создающей высокие риски контаминации, что недопустимо для рутинного использования. Дифференцирующие олигонуклеотиды, описанные в патенте, по своим термодинамическим характеристикам имеют достаточно высокую температуру плавления, что снижает специфичность гибридизации и точность определения гаплогруппы. Выбранный перечень маркеров гаплогрупп Y-хромосомы также неполноценен, т.к. отсутствует разделение гаплогрупп D и E (они детектируются одним общим маркером) и отсутствует маркер для гаплогруппы B. Вероятно, это связано с методическими ограничениями мультиплексности анализа, которые авторы данного изобретения не смогли преодолеть. Также данное изобретение позволяет определять только один тип значимых поисковых признаков – гаплогруппу Y-хромосомы.
3. Известно изобретение «Способ, тест-система и праймеры для определения гаплогрупп Y-хромосомы и этнической принадлежности человека», патент RU 2558231 C2. Предлагаемый в нем способ включает проведение мультиплексной полимеразной цепной реакции в два этапа: по основным гаплогруппам N, J, I, Q, С, Е, D, G, О Y-хромосомного древа и затем по субгаплогруппам. Предлагаемый способ обладает рядом существенных методических недостатков. Во-первых, протокол исследования состоит из шести этапов, каждый из которых создает риски кросс-контаминации. Кроме того, такой многостадийный протокол слишком сложен для применения в рутинной практике. Во-вторых, способ предполагает амплификацию слишком длинных, для криминалистической практики, продуктов: до 527 п.н. (в среднем, более 350 п.н.); при исследовании высокодеградированной ДНК большинство таких локусов не будет успешно амплифицировано.
Ближайшим аналогом настоящего изобретения является инструмент, описанный в п.1, и он был принят за прототип изобретения. Первым, по значимости, недостатком прототипа, является недостаточный объем получаемой фенотипической поисковой информации. Одной из особенностей судебно-генетической экспертизы является малое количество ДНК в экспертных образцах. Вследствие этого необходимо получить как можно больше информации из этого ограниченного геномного материала. Оптимальным решением является получение всей возможной фенотипической информации в ходе одной мультиплексной ПЦР. Из признаков, значимых для поиска преступника, прототип позволяет определять только пол и группу крови. Такая ограниченность, возможно, связана с тем, что на момент создания прототипа не были известны генетические маркеры, ассоциированные с другими поисковыми признаками. К другим существенным недостаткам прототипа можно отнести высокий риск кросс-контаминации при применении данного изобретения на практике, вследствие двухстадийности ПЦР и значительную длину амплифицируемых продуктов в связи с применением «гнездной» ПЦР (область отжига праймеров занимает более 80 п.н., обычно 130-200 п.н.), что вносит ограничения в исследования деградированной ДНК.
Для устранения указанных недостатков, в предлагаемом изобретении не только расширен объем получаемой поисковой информации, но и решены методические проблемы прототипа. А именно, выбраны 63 генетических маркера, ассоциированные с группой крови АВ0, 13 основными гаплогруппами У-хромосомы, цветом радужной оболочки глаза, волос, кожи и половой принадлежностью [1,2]. Для одновременной амплификации всех 63-х маркеров разработан и сбалансирован набор ПЦР-праймеров, позволяющий выполнить реакцию в одну стадию, что решает проблему кросс-контаминации, которая присуща прототипу. Одновременная амплификация всех значимых локусов позволяет получать поисковую информацию с минимального количества геномного материала, что особенно актуально для криминалистических экспертиз.
Раскрытие сущности изобретения
Задачей настоящего изобретения является:
Создание для 63 маркеров, ассоциированных с вышеуказанными фенотипическими признаками, набора синтетических олигонуклеотидных праймеров для проведения ПЦР, а также синтетических олигонуклеотидных ДНК-зондов для последующей гибридизации. Причем, праймеры должны быть подобраны таким образом, чтобы обеспечивать проведение ПЦР в одну стадию и в одной реакции для всех маркеров. Олигонуклеотидные ДНК-зонды должны быть подобраны таким образом, чтобы обеспечивать достоверное генотипирование методом гибридизации.
Поставленная задача технически решена следующим образом. Для преодоления присущих прототипу недостатков, и достижения требуемых эксплуатационных характеристик, в большей мере удовлетворяющих потребностям судебно-медицинской и криминалистической экспертизы, в заявляемом техническом решении были введены следующие усовершенствования. Были выбраны 63 маркера, для которых установлена достоверная ассоциация с заявленными фенотипическими признаками [1,2]. Для этих маркеров был подобран набор синтетических праймеров таким образом, чтобы получаемый ПЦР-продукт имел минимальную длину, что позволило бы повысить результативность при исследовании деградированной ДНК. Праймеры подобраны таким образом, чтобы эффективно амплифицировать все целевые локусы в ходе одной мультиплексной ПЦР, причем обратный праймер для каждого локуса имеет универсальную вставку по 3`-концу. Протяженность амплифицируемых фрагментов прототипа составляет от 58 до 139 нуклеотидов, среднее значение длины 72,8 нуклеотида, медиана 77,5 нуклеотида. В качестве способа генотипирования (определения присутствующих в образце аллелей всех маркеров) выбран гибридизационный анализ. Принцип гибридизационного анализа состоит в проведении реакции комплементарного взаимодействия между исследуемым продуктом мультиплексной ПЦР и набором олигонуклеотидных зондов (предварительно закрепленным на поверхности подложки, в микрокаплях геля, на микросферах и т.д.), каждый из которых соответствует определенной аллели маркера. Для детекции результата гибридизации могут быть использованы любые подходящие метки (флуоресцентные, радиоактивные, ферментативные и проч.), предварительно введенные в ПЦР-продукт посредством меченых дезоксинуклеотидтрифосфатов в ходе элонгации, либо путем использования предварительно меченого праймера, или иным способом. В приведенных далее примерах для введения метки мы использовали ПЦР с флуоресцентно меченным праймером.
Таким образом, заявляемым техническим решением устранены следующие недостатки прототипа:
- малый объем получаемой поисковой фенотипической информации;
- высокий риск кросс-контаминации вследствие двухстадийности ПЦР;
- высокая протяженность амплифицируемых фрагментов.
Основными аспектами данного изобретения являются синтетические олигонуклеотиды, приведенные в Таблицах 1 и 2, а также Перечне последовательностей (SEQ ID NО: 1–SEQ ID NЩ: 251).
Предлагаемый набор синтетических олигонуклеотидов для амплификации целевых локусов, содержащих генотипируемые маркеры, характеризуется тем, что содержит 1) локус-специфичные праймеры следующего нуклеотидного состава (SEQ ID NО: 1-SEQ ID NО: 107):
Таблица 1. ПЦР-праймеры для амплификации локусов, содержащих генотипируемые полиморфизмы
| SEQ ID NO: | Номер полиморфизма | Название праймера |
Последовательность 5’-3’ |
| 1 | rs6119471 | ASIP_F | AGAAGTAGCTGTACTAGACGGGATCC |
| 2 | rs6119471 | ASIP_R | CACTTGAGAGGAGGCTAACCCGA |
| 3 | rs3114908 | ANKRD_F | AGCAGGAAGGAGAACAGAGAAGGG |
| 4 | rs3114908 | ANKRD_R | CTAGGCCATGCGTCCCTTTCT |
| 5 | rs10756819 | BNC_F | ACTTCACTGGACCAGTTATTTTGGGTTTG |
| 6 | rs10756819 | BNC_R | GTCTTCCTAGACATCCCGTCATGAC |
| 7 | rs8051733 | DEF_F | GTGGTCTCTCTCTCGGCCTCAG |
| 8 | rs8051733 | DEF_R | GGCCCCTCTTCCACCCTGCCT |
| 9 | rs2238289 | HERC89_F | GATTCAGGTCTGCTGTCACTGCTCA |
| 10 | rs2238289 | HERC89_R | CATGAAGATTTCCCAGTTGTAGAGATT |
| 11 | rs6497292 | HERC92 | TGCCACAGGAACCAAAAAGTCAC |
| 12 | rs6497292 | HERC92 | ACAGGTTGTCTCCTGTGTCTTCA |
| 13 | rs1129038 | HERC038 | ACCAGGCAGCCTACAGTCTACACA |
| 14 | rs1129038 | HERC038 | AACGTCCTCGTGAGATGAGAGCC |
| 15 | rs12913832 | HERC832 | GCGAGGCCAGTTTCATTTGAG |
| 16 | rs12913832 | HERC832 | CCCTGATGATGATAGCGTGCAGA |
| 17 | rs1667394 | HERC94 | AGACGCAGCAATTCAAAACGTGCA |
| 18 | rs1667394 | HERC94 | CCTTTCAGTTCTATTCATTGTTTCTTTGTTTGTT |
| 19 | rs12203592 | IRF592 | GTGAATGACAGCTTTGTTTCATCCACT |
| 20 | rs12203592 | IRF592 | GTCATATGGCTAAACCTGGCACC |
| 21 | rs12821256 | KITLG | CAGGTGTGAAGTTGTGTGGCAGAAG |
| 22 | rs12821256 | KITLG | TGGAGCCAAGGGCATGTTACTACG |
| 23 | rs12896399 | LOC105370627 | GGCGATCCAATTCTTTGTTCTTT |
| 24 | rs12896399 | LOC105370627 | GGAAGGTTAATCTGCTGTGACA |
| 25 | rs4959270 | LOC105374875 | ACATGAGATCTGGGTGAGGAACAC |
| 26 | rs4959270 | LOC105374875 | AAGAACCACCATGTCAGTGTTCTTACC |
| 27 | rs3212355 | MC1R55 | AAGATGCCTGCAGTGGGTGCCAG |
| 28 | rs3212355 | MC1R55 | GCGTGGCCCCGAAGCCCAGCA |
| 29 | rs796296176 | MC1R176 | TCAACTCCACCCCCACAGCCAT |
| 30 | rs796296176 | MC1R176 | CCTCCAGGCACCGGGCTCCTG |
| 31 | rs1805005 | MC1R05 | CTGGTGAGCTTGGTGGAGAAC |
| 32 | rs1805005 | MC1R05 | GGTTCCGGTTCTTGGCGATG |
| 33 | rs1805006; rs2228479 | 2MCR06_F | CACTCACCCATGTACTGCTTCATCTG |
| 34 | rs1805006; rs2228479 | 2MC8479_R | GGAGGATGACGGCCGTCTCCA |
| 35 | rs11547464; rs1805007; rs201326893; rs1110400; rs1805008; rs885479 | 6MC464_F | AGCCTCTGCTTCCTGGGCGCCA |
| 36 | rs11547464; rs1805007; rs201326893; rs1110400; rs1805008; rs885479 | 6MC5479_R | TGCTGAAGACGACACTGGCCAC |
| 37 | rs1805009 | MC1R09 | ACCTCTTTCTCGCCCTCATCAT |
| 38 | rs1805009 | MC1R09 | CATGTCAGCACCTCCTTGAGC |
| 39 | rs1800407 | OCA407 | GCCGCGATGAGACAGAGCATGA |
| 40 | rs1800407 | OCA407 | GTGTGTGTGTGTGGCCAGGCA |
| 41 | rs1800414 | OCA414 | GGCATTTGGCGAGCAGAATCCCGT |
| 42 | rs1800414 | OCA414 | GCAGAGTAAATGAGCTGTGGTTTCT |
| 43 | rs1470608 | OCA608 | TGTTAGGGTTGATGGTAACCTTTGTT |
| 44 | rs1470608 | OCA608 | ACAGTTTGTAGACATTCTCTTAAAAATATTAATTTG |
| 45 | rs1545397 | OCA397 | GGATACTGACAATGGTTGTACAACTTTG |
| 46 | rs1545397 | OCA397 | TCATGGGGGAGAGAGAATGACTCA |
| 47 | rs12441727 | OCA727 | TCCCTGCCCCTTGGCTTGGCTCA |
| 48 | rs12441727 | OCA727 | GGTACCTCAAGGAGGATAAGGCTTT |
| 49 | rs2378249 | PIGU | AGCTAACTAAGGGCACAAGTCTA |
| 50 | rs2378249 | PIGU | CTTTTCAGCCCACACCTCTCCTCA |
| 51 | rs6059655 | RALY | TGTGAGGAAATCGAGGCTCAGAA |
| 52 | rs6059655 | RALY | TCCCTACGAGCTGATGCCCTGA |
| 53 | rs17128291 | SLC291 | GCCAGCACTGCCAAAATAACAAT |
| 54 | rs17128291 | SLC291 | CAGTAAAGAATCTGACAATGTGCAC |
| 55 | rs2402130 | SLC130 | TGCTGTATGGAAGTATTTGAACCA |
| 56 | rs2402130 | SLC130 | ATGATGATGATGATGATGATGGCAGC |
| 57 | rs1426654 | SLC654 | TCAGCCCTTGGATTGTCTCAGG |
| 58 | rs1426654 | SLC654 | ATTCAGGAGCTGAACTGCCCGC |
| 59 | rs28777 | SLC777 | CAGTTGATTTCATGTGATCCTCACA |
| 60 | rs28777 | SLC777 | CCCCTCCAAGAGTCGCATAGGAC |
| 61 | rs16891982 | SLC982 | GAGAAAGACTTACAAGAATAAAGTGAGGA |
| 62 | rs16891982 | SLC982 | GCCCTATAGTGCACACAACTCCAC |
| 63 | rs1042602 | TYR602 | TGCATTATTATGTGTCAATGGATGCA |
| 64 | rs1042602 | TYR602 | TCATGGGCAAAATCAATGTCTCT |
| 65 | rs1393350 | TYR350 | CTACTCTTCCTCAGTCCCTTCTCT |
| 66 | rs1393350 | TYR350 | GGGAAGGTGAATGATAACACGAACAGAT |
| 67 | rs1126809 | TYR809 | CCTTTTCCTCTGCAGTATTTTTGAG |
| 68 | rs1126809 | TYR809 | TGGGTGCATTGGCTTCTGG |
| 69 | rs683 | TYRP | TGAGTTATTAACTGTATTTTCTTTCACTTTATT |
| 70 | rs683 | TYRP | TCCCAGCTTTGAAAAGTATGCCTAGA |
| 71 | rs2032623 | YB_F | ACATACAGACTCTGTCTTTACATTTCAAAA |
| 72 | rs2032623 | YB_R | CAACATTGAGTAACCACTGTGT |
| 73 | rs35284970 | YC_F | CTGTACTTACTTTTATCTCCTCTTCTATTG |
| 74 | rs35284970 | YC_R | GTAAGTCGAATGCCCTTTCC |
| 75 | rs202084622 | YD_F | TGGTTTTCTGTCCCATTTGGGCC |
| 76 | rs202084622 | YD_R | TCGTGGGTTTTCTGGAATGAG |
| 77 | rs9786534 | YE_F | CACAACAAAAAAATAGATGGCTGGGT |
| 78 | rs9786534 | YE_R | CTCAAGCACTCCATCTGCCTA |
| 79 | rs2740980 | YG_F | CTCCGATTCCTTAATTATCCCAC |
| 80 | rs2740980 | YG_R | GTAAATCTTTCATCTCCAACCCC |
| 81 | rs576940616 | YH_F | TCCCTGTATTCTTGTGTCTACTG |
| 82 | rs576940616 | YH_R | TGCTCTCCTGAGGTGGTTTCT |
| 83 | rs2319818 | YI_F | GATCAATAACAAGTTCTGAAATTAAGGCTG |
| 84 | rs2319818 | YI_R | TTGCCAGCTCCTCTTTTCA |
| 85 | rs13447352 | YJ_F | GTGGGATTTTTTTAGATGTGTTCAAT |
| 86 | rs13447352 | YJ_R | ACGTCTTATACCAAAATATCACC |
| 87 | rs2032607 | YL_F | CCAAAGAGCCTCTCTAGCCGCA |
| 88 | rs2032607 | YL_R | CCCTCTGGTTAACATTTACAATTGC |
| 89 | rs9341278 | YN_F | CTAAAAAACAACATTTACTGTTTCTACTG |
| 90 | rs9341278 | YN_R | GACACCACAGAAATTACAGGTATGA |
| 91 | rs2032678 | YO_F | CCAGTGATTTAAACTCTCTGAATCA |
| 92 | rs2032678 | YO_R | TCTACTGATACCTTTGTTTCTGTTCATTCT |
| 93 | rs563604826 | YQ_F | TCTGCTGAGAAGCCTGCATAGC |
| 94 | rs563604826 | YQ_R | TCTTAAAGGCAGCTAGAGAGA |
| 95 | rs17307398 | YR_F | TGAATTCAGATTCTCTGGAATCTTGT |
| 96 | rs17307398 | YR_R | GGAAAGTTAGTGGTTTCAGTCA |
| 97 | rs9341308 | YT_F | TGGGCATTACTCTTTGCTCTC |
| 98 | rs9341308 | YT_R | AAACCTTATTATACACACAACCCG |
| 99 | rs8176719; rs8176720 | ABO6_F | CACGCCTCTCTCCATGTGCAGTAGGA |
| 100 | rs8176719; rs8176720 | ABO6_R | GAATGGTGGTGTTCTGGAGC |
| 101 | rs8176741; rs8176742 | ABO7_F | TGGTGTGCGTGGACGTGGACA |
| 102 | rs8176741; rs8176742 | ABO7_R | GGGGTGCAGGGTGCCGA |
| 103 | - | DYS14_F | TGTTGTATCCTTCTCAGTGTTTCT |
| 104 | - | DYS14_R | GGTCACTTACACTTCCCCGA |
| 105 | - | AMELXY_F | ACCCCTTTGAAGTGGTACCAGAG |
| 106 | - | AMELX_R | TCCCATTAATGTCTGCATGTGGAGT |
| 107 | - | AMELY_R | TTCCCATTAGTGTCTGTATGTGGAGT |
2) дополнительно, каждый обратный праймер (праймер, в названии которого указано «_R»,) с четным номером «Seq ID» (Seq ID NO:2, 4, 6 … 106), а также Seq ID NO: 107 имеет со стороны 5`-конца универсальную олигонуклеотидную вставку, например 5`-TCATTGGATCTCATTA-3`, или любую иную. Таким образом, каждый локус-специфичный обратный праймер имеет следующую последовательность: 5`-TCATTGGATCTCATTANNN…NNN-3` , где “NNN…NNN” – его специфичная составляющая, а “TCATTGGATCTCATTA” – универсальная.
Локус-специфичные праймеры добавляют в количестве, обеспечивающем их конечную концентрацию от 1 нМ до 0,5 мкМ. Помимо приведенных праймеров, в реакционную смесь для амплификации вносят универсальный праймер, имеющий последовательность, идентичную универсальной вставке обратных праймеров, например, 5`-TCATTGGATCTCATTA-3`. В случае применения флуоресцентного маркирования, используют универсальный праймер с флуорофором (например, Су5, Су7, Су7.5 и т.д.) по 5`-концу. Концентрация универсального праймера должна составлять от 0,1 мкМ до 100 мкМ. Также, в реакционную смесь для амплификации входят следующие компоненты:
- смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов (dATP, dTTP, dGTP, dCTP);
- полимераза (Taq-, HotTaq-, или иная);
- реакционный буфер, оптимизированный для работы соответствующей полимеразы, например: 70 mM Tris-HCl (pH 8.8 при 25°C); 17 mM (NH4)2SO4; 0.01% Tween-20. 2 ммоль MgCl2;
- для флуоресцентного маркирования посредством встраивания флуоресцентно меченных дезоксинуклеотидтрифосфатов в растущую цепь ПЦР-продукта, в реакционную смесь вносят соответствующий меченый дезоксинуклеотидтрифосфат в концентрации, обеспечивающей эффективное мечение (например, 0,05 мМ дУТФ-Су5). Флуоресцентное маркирование может осуществляться как одним из способов, так и их сочетанием.
Подготовленная смесь для амплификации также должна содержать исследуемую ДНК в количестве не менее 1 пкг. В качестве исследуемого образца могут быть использованы образцы ДНК, выделенные из любого биологического материала, содержащего геномную ДНК (кровь, слюна, волосяная луковица, потожировые следы, сперма, мазки со слизистой и другие). Максимальное количество вносимой ДНК регламентируется лишь вязкостью ее раствора: при очень высоких концентрациях (более 1 мкг/мкл) возрастает вязкость раствора, что затрудняет его перенесение микродозатором. В этом случае рекомендуется разбавить раствор. Внесение компонентов в смесь для амплификации может происходить в любом порядке.
Амплификацию следует проводить в пробирках, стрипах, планшетах или иных емкостях, предназначенных для этой цели. После приготовления, смесь для амплификации помещают в прибор (амплификатор), обеспечивающий циклическую смену температур по заданной программе, например:
| № | Температура | Время | Количество циклов |
| 1 | 95°С | 1 мин | 1 |
| 2 | 95°С | 30 сек | 50 |
| 3 | 60°С | 60 сек | |
| 4 | 72°С | 20 сек | |
| 5 | 95°С | 20 сек | 50 |
| 6 | 50°С | 10 сек | |
| 7 | 72°С | 30 сек | |
| 8 | 72°С | 5 мин | 1 |
Амплификатор должен быть снабжен крышкой, нагреваемой до температуры, исключающей скопление конденсата в верхней части пробирки (стрипа, планшета), обычно 100-110ºС. Если используется прибор, не имеющий нагревающейся крышки, то при приготовлении смеси реагентов, в нее необходимо добавить минеральное масло для исключения испарения водной части смеси.
В ходе температурного циклирования на первом этапе (№№2-4) происходит симметричная амплификация всех входящих в набор локусов. Универсальный праймер имеет меньшую температуру отжига, чем локус-специфичные праймеры, поэтому на этой стадии он не участвует в реакции. Задача первой стадии – максимально эффективно амплифицировать локус в виде двуцепочечного фрагмента ДНК. Т.к. гибридизационный анализ требует присутствия одной цепи, комплементарной иммобилизованному ДНК-зонду (а в результате симметричной ПЦР первого этапа обе цепи связаны друг с другом), требуется стадия асимметричной амплификации. Это происходит на втором этапе: вследствие понижения температуры отжига, в реакцию вступает универсальный праймер. Т.к. он берется в существенно большей концентрации, чем локус-специфичные праймеры, на второй стадии происходит асимметричный синтез той цепи, которая комплементарна соответствующему ДНК-зонду. В итоге такой амплификации образуется смесь преимущественно одноцепочечных меченых ампликонов.
Разработанные нами зонды для генотипирования предлагаемой в данном изобретении панели маркеров приведены в Таблице 2 и перечне SEQ ID NО: 108-SEQ ID NО: 229.
Таблица 2. Аллель-специфичные ДНК-зонды для гибридизации
| SEQ ID NO: | Номер полиморфизма | Название зонда | Последовательность 5’-3’ |
| 108 | rs6119471 | ASIP9471_C | TCCCAGGTCTTACGC |
| 109 | rs6119471 | ASIP9471_G | CCAGGTgTTACGCA |
| 110 | rs3114908 | ANKRD_C | GCACTTCGTAGTGG |
| 111 | rs3114908 | ANKRD_T | GCACTTtGTAGTGG |
| 112 | rs10756819 | BNC_G | GGGTTTGGAGATCATA |
| 113 | rs10756819 | BNC_A | GGGTTTGGAAATCATAC |
| 114 | rs8051733 | DEF_RA | GAARGGCACGAGAC |
| 115 | rs8051733 | DEF_G | AAGGCgCGAGACA |
| 116 | rs2238289 | HERC89_A | TTCCCAGGCTCCAA |
| 117 | rs2238289 | HERC89_G | AATTCCCgGGCTC |
| 118 | rs6497292 | HERC92_A | CATGCAGCAAGGATG |
| 119 | rs6497292 | HERC92_G | GCAGCgAGGATGAA |
| 120 | rs1129038 | HERC038_C | CAGCGAGCGCTCTG |
| 121 | rs1129038 | HERC038_T | CGAGTGCTCTGCT |
| 122 | rs12913832 | HERC832_A | TGAGCATTAAATGTCAA |
| 123 | rs12913832 | HERC832_G | AGCATTAAGTGTCAAG |
| 124 | rs1667394 | HERC94_T | CGTGCATATACCAAA |
| 125 | rs1667394 | HERC94_C | CGTGCATAcACCAA |
| 126 | rs12203592 | IRF592_C | AGAAGGCAAATTCC |
| 127 | rs12203592 | IRF592_T | AGAAGGTAAATTCCCC |
| 128 | rs12821256 | KITLG_T | TTTAGTGTGCCGT |
| 129 | rs12821256 | KITLG_C | CCTTTAGcGTGCCG |
| 130 | rs12896399 | LOC399_G | TTTTGGGGTCTCTTTG |
| 131 | rs12896399 | LOC399_T | TTTGGGTTCTCTTTGTC |
| 132 | rs4959270 | LOC270_C | ACACTATGCCACTTC |
| 133 | rs4959270 | LOC270_A | CACTATGaCACTTCCA |
| 134 | rs3212355 | MC55_C | CACCGTCCCTGC |
| 135 | rs3212355 | MC55_T | ACCGTtCCTGCT |
| 136 | rs796296176 | MC176_Del | GCTGCCAACCAGAC |
| 137 | rs796296176 | MC176_In | CTGCCAAACCAGACA |
| 138 | rs1805005 | MC05_G | CTGGTGGTGGCCA |
| 139 | rs1805005 | MC05_T | TGGTGtTGGCCAC |
| 140 | rs1805006 | MC06_C | TTGTCGGACCTGCTG |
| 141 | rs1805006 | MC06_A | TGTCGGAACTGCTG |
| 142 | rs2228479 | MC8479_G | AGCAACGTGCTGGA |
| 143 | rs2228479 | MC8479_A | GAGCAACaTGCTGGA |
| 144 | rs11547464 | MC464_G | GACCGCTACATCTC |
| 145 | rs11547464 | MC464_A | GACCACTACATCTCC |
| 146 | rs1805007 | MC07_C | GACTGCGCTACCA |
| 147 | rs1805007 | MC07_T | GCACTGTGCTACCA |
| 148 | rs201326893 | MC893_C | GYGCTACCACAGCAT |
| 149 | rs201326893 | MC893_A | GYGCTAaCACAGC |
| 150 | rs1110400 | MC400_T | CACAGCATCGTGA |
| 151 | rs1110400 | MC400_C | CACAGCAcCGTGA |
| 152 | rs1805008 | MC08_C | CCTGCCGCGGGCGC |
| 153 | rs1805008 | MC08_T | CCCTGCCGTGGGCG |
| 154 | rs885479 | MC5479_G | CGGCGAGCCGT |
| 155 | rs885479 | MC5479_A | CGCGGCaAGCCG |
| 156 | rs1805009 | MC09_G | CATCGACCCCCTCAT |
| 157 | rs1805009 | MC09_C | ATCATCCACCCCCTC |
| 158 | rs1800407 | OCA407_C | CGTCCCCGGGAGAGC |
| 159 | rs1800407 | OCA407_T | CCGTCCCTGGGAGA |
| 160 | rs1800414 | OCA414_T | TATCCTATGCTGTAAGA |
| 161 | rs1800414 | OCA414_C | ATCCTAcGCTGTAAGAG |
| 162 | rs1470608 | OCA608_T | TCATTACAGATGGTGC |
| 163 | rs1470608 | OCA608_C | TTACAGAgGGTGCAA |
| 164 | rs1545397 | OCA397_A | TACTAAAATACACTGAATGA |
| 165 | rs1545397 | OCA397_T | TAAAATACtCTGAATGATATA |
| 166 | rs12441727 | OCA727_G | GCCTTGGGCAAAA |
| 167 | rs12441727 | OCA727_A | GGCCTTaGGCAAAA |
| 168 | rs2378249 | PIGU_A | GCACAGTAATGGGC |
| 169 | rs2378249 | PIGU_G | CACAGTAgTGGGCT |
| 170 | rs6059655 | RALY_G | TGGCGTGCTCAG |
| 171 | rs6059655 | RALY_A | TGAGTGGCaTGCT |
| 172 | rs17128291 | SLC291_A | TGAACTTTCCAGACTTTT |
| 173 | rs17128291 | SLC291_G | AACTTTCCgGACTTTT |
| 174 | rs2402130 | SLC130_G | CCCGTGGTAGCT |
| 175 | rs2402130 | SLC130_A | CCCGTGaTAGCTG |
| 176 | rs1426654 | SLC654_G | TGCAGGCGCAAC |
| 177 | rs1426654 | SLC654_A | GCAGGCaCAACTTTC |
| 178 | rs28777 | SLC777_C | ACAGCAGCCTCTGA |
| 179 | rs28777 | SLC777_A | CACAGCAGaCTCTGA |
| 180 | rs16891982 | SLC982_C | TGATGCACAAGCCCC |
| 181 | rs16891982 | SLC982_G | TGATGCAGAAGCCCC |
| 182 | rs1042602 | TYR602_C | TGGGGGATCTGAAAT |
| 183 | rs1042602 | TYR602_A | TTGGGGGATaTGAAAT |
| 184 | rs1393350 | TYR350_G | GCAACGAAATCTGTG |
| 185 | rs1393350 | TYR350_A | CTCTGCAACAAAATCTGT |
| 186 | rs1126809 | TYR809_G | GCTCCGAAGGCA |
| 187 | rs1126809 | TYR809_A | TGGCTCCaAAGGCA |
| 188 | rs683 | TYRP_C | ATATGTTAGCATTAAAGTTC |
| 189 | rs683 | TYRP_A | GCATATGTTAGaATTAAAGT |
| 190 | rs2032623 | B_Del | TGACTTAAAGATCAGGC |
| 191 | rs2032623 | B_In | ACTTAAAGTATCAGGCAC |
| 192 | rs35284970 | YC_C | TTGGATTTCCCTGCC |
| 193 | rs35284970 | YC_T | GGATTTCTCTGCCCA |
| 194 | rs202084622 | YD_G | GCCAGGCGTTCCT |
| 195 | rs202084622 | YD_A | GGCCAGGCaTTCCTT |
| 196 | rs9786534 | YЕ.2_A | CCTGTAATCCCAG |
| 197 | rs9786534 | YЕ.2_T | CCTGTTATCCCAG |
| 198 | rs2740980 | YG_M257_G | ATTTCTGGTGGCCC |
| 199 | rs2740980 | YG_M257_A | ATTTCTGATGGCCCA |
| 200 | rs576940616 | YH_G | CGGCGATGAAAGTTC |
| 201 | rs576940616 | YH_T | ACGGCGATtAAAGTTC |
| 202 | rs2319818 | YI_U179_G | ATGAAAGCCCAGGAC |
| 203 | rs2319818 | YI_U179_A | TGAAAACCCAGGACC |
| 204 | rs13447352 | YJ_M304_A | TTGTGAAACAACTGGTG |
| 205 | rs13447352 | YJ_M304_C | GTGACACAACTGGTG |
| 206 | rs2032607 | YL_M185_C | GAGGCCGCATGGT |
| 207 | rs2032607 | YL_M185_T | GAGGCTGCATGGTC |
| 208 | rs9341278 | YN_M231_G | CTACTGCTTTCGAATTGGG |
| 209 | rs9341278 | YN_M231_A | TACTGCTTTCAAATTGGG |
| 210 | rs2032678 | YO_M175_IN | CTCACTTCTCTTCTCAAGAAT |
| 211 | rs2032678 | YO_M175_DEL | CTCACTTCTCAAGAATGA |
| 212 | rs563604826 | YQ_G | TGTAGGTGACCTACCCT |
| 213 | rs563604826 | YQ_A | GTAGGTaACCTACCCT |
| 214 | rs17307398 | YR_P224_C | TGACATCTTCCCCTGCTG |
| 215 | rs17307398 | YR_P224_T | ACATCTTTCCCTGCTG |
| 216 | rs9341308 | YT_A | CCGAAAACCCACTAA |
| 217 | rs9341308 | YT_G | TCCCGAAgACCCAC |
| 218 | rs8176719 | ABO6ex261w | CTCGTGGTGACCCCT |
| 219 | rs8176719 | ABO6ex261m | CTCGTGGTACCCCTTG |
| 220 | rs8176720 | ABO6ex297w | AGGGCACATTCAACATC |
| 221 | rs8176720 | ABO6ex297m | AGGGCACGTTCAACAT |
| 222 | rs8176741 | ABO7ex681w | CTGACTCCGCTGTTC |
| 223 | rs8176741 | ABO7ex681m | CTGACTCCACTGTTCG |
| 224 | rs8176742 | ABO7ex657w | CGCGACCACGTGGGCG |
| 225 | rs8176742 | ABO7ex657m | GCGACCATGTGGG |
| 226 | - | DYS_V1 | TCTTCGGCCTTTCTAGTGGAGA |
| 227 | - | DYS_Olig | TCTAGTGGAGAGGTGCTCT |
| 228 | - | AMELX | CAGAGCATAAGGCCA |
| 229 | - | AMELY | CAGAGCATGATAAGACCA |
Для генотипирования с помощью гибридизации, аллель-специфичные ДНК-зонды закрепляются любым известным способом на подложке. Для этого наиболее применима технология биочипов, как двумерных, с креплением зондов к плоскости, так и трехмерных, с иммобилизацией в массе пористого полимерного носителя. Для закрепления ДНК-зондов, к ним может быть привита соответствующая химическая группа, или любое иное соединение, способствующее реализации данной цели. ДНК-зонды располагают на подложке согласно заданной схеме. Схема расположения ячеек может быть произвольной, мы использовали схему, приведенную на Фиг.1. Для проведения гибридизации ПЦР-продукт обычно смешивают с буферным раствором, который также может содержать денатурирующие агенты (формамид, диметилсульфоксид, гуанидин и другие), и наносят на биочип. Условия гибридизации подбираются таким образом, чтобы флуоресцентно меченные одноцепочечные фрагменты ДНК специфично связывались с полностью комплементарными им ДНК-зондами, локально иммобилизованными на биочипе. Для того чтобы определить генотип образца, необходимо зарегистрировать флуоресцентное изображение биочипа. ДНК-зонды, образовавшие совершенные дуплексы с исследуемым фрагментом ДНК, будут флуоресцировать в соответствующем флуорофору диапазоне длин волн. Для регистрации флуоресцентного изображения могут быть использованы сканеры, широкопольные микроскопы, или иные подходящие для этого средства. Флуоресцентное изображение анализируется и обсчитывается с помощью программного обеспечения. Пример такого изображения приведен на Фиг. 2. На Фиг. 3 приведены варианты гибридизационного изображения в зависимости от аллельного состояния маркера в образце. Интерпретация результатов генотипирования проводится экспертом исходя из общеизвестных генетических принципов наследования биаллельных маркеров.
Список литературы:
1. S.Walsh, F.Liu A.Wollstein, L.Kovatsi, A.Ralf, A.Kosiniak-Kamysz, W.Branicki, M.Kayser. The HIrisPlex system for simultaneous prediction of hair and eye colour from DNA. Forensic Science International: Genetics, 2013, Vol.7, Issue 1, P. 98-115.
2. F. Monteiro, G. Tavares, M. Ferreira, A. Amorim, P. Bastos, C. Rocha, F. Araújo, L. M. Cunha-Ribeiro. Technologies involved in molecular blood group genotyping. ISBT Science Series, 2011, V.6, P. 1–6.
Описание чертежей
На Фигуре 1 приведен один из множества возможных вариантов схемы расположения ячеек с олигонуклеотидными ДНК-зондами, который мы использовали для иллюстрации осуществления данного изобретения. Номера на схеме соответствуют номерам олигонуклеотидов в Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 108-229). Данная схема не является принципиальной, и дизайн ее может быть произвольным.
На Фигуре 2 приведено флуоресцентное изображение биочипа после проведения гибридизации.
На Фигуре 3 показано три варианта аллельного состояния маркера: два варианта гомозиготного состояния (А) и (В
Осуществление изобретения
Пример 1. Олигонуклеотидный биочип для генотипирования 63 ДНК-маркеров, ассоциированных с группой крови АВ0, основными гаплогруппами Y-хромосомы, цветом радужной оболочки глаза, волос, кожи и половой принадлежностью.
Олигонуклеотидные ДНК-зонды синтезировали согласно перечню SEQ ID NО: 108-SEQ ID NО: 229 (Таблица №2) таким образом, что 3’-конец олигонуклеотидов содержит спейсер со свободной аминогруппой. Биочип изготавливали методом сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле аналогично описанному ранее (Патент на изобретение N 2175972 «Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микрочипа» Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В., Чернов Б.К. Приоритет от 28.12.1999), а именно, готовили полимеризационную смесь, соответствующую 5% полиакриламидному гелю: 5% акриламид-бисакриламид (19:1), 40% глицерин, 2% ацетон, 1,2% ТЕМЕД, 0,1 М натрий фосфатный буфер, pH 7,0. Концентрация ДНК-зондов составляла 200 мкМ. Капли наносили с помощью роботизированной станции QArray 2 (Genetix Ltd, New Milton, Hampshire, UK) на пластиковую подложку. Ячейки наносили рядами, согласно схеме на Фиг.1. Диаметр капли 100-150 мкм. Полимеризацию проводили под УФ лампой в атмосфере азота. Время экспозиции 40 мин при длине волны 254 нм. После проведения сополимеризации проводили отмывку от непрореагировавших реагентов в дистиллированной воде. Биочип высушивали при комнатной температуре и помещали на хранение в темное сухое место.
Пример 2. Мультиплексная амплификация локусов, содержащих 63 генотипируемых ДНК-маркера методом ПЦР с целью наработки одноцепочечных флуоресцентно меченных фрагментов.
Из слюны испытуемых выделяли ДНК набором Lumipure (ООО «Биотех-индустрия», Москва). Для мультиплексной наработки всех анализируемых генов использовали ПЦР-праймеры SEQ ID NO: 1-107 в концентрации от 1 нМ до 0,5 мкМ, отличающиеся тем, что каждый обратный праймер с четным номером «Seq ID» (Seq ID NO:2, Seq ID NO:4… Seq ID NO:106) и Seq ID NO:107, имел со стороны 5`-конца универсальную олигонуклеотидную вставку, с последовательностью 5`-TCATTGGATCTCATTA-3`. Флуоресцентно меченный (Су5-, возб./исп.: 640/657 нм) универсальный праймер Су5-TCATTGGATCTCATTA-3`добавляли в конечной концентрации 6 мкМ. ПЦР проводили на амплификаторе T-100 (Bio-Rad laboratories, США) в объеме 25 мкл реакционной смеси, составом: 1× буфер (67 мМ Трис-HCl, pH 8,6, 166 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Тритон Х-100), 2,0 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого из dNTP («Силекс», Россия), ПЦР-праймеры (SEQ ID NO: 1-107) в концентрации от 1 нМ до 0,5 мкМ, 1 мкл геномной ДНК и 2,5 ед. акт. HotTaq-полимеразы («Сибэнзим», Россия). Амплификацию проводили по программе:
| № | Температура | Время | Количество циклов |
| 1 | 95°С | 1 мин | 1 |
| 2 | 95°С | 30 сек | 50 |
| 3 | 64°С | 60 сек | |
| 4 | 72°С | 20 сек | |
| 5 | 95°С | 20 сек | 50 |
| 6 | 50°С | 10 сек | |
| 7 | 72°С | 30 сек | |
| 8 | 72°С | 5 мин | 1 |
Пример 3. Гибридизация флуоресцентно меченного ПЦР-продукта на биочипе и регистрация результатов.
ПЦР-продукт, полученный в Примере 2, использовали для гибридизации на биочипе, полученном в Примере 1, в буфере следующего состава: 25% формамид (GibcoBRL), 5хSSPE. 30 мкл смеси вносили в гибридизационную камеру биочипа. Гибридизацию проводили в течение 5 ч при температуре 37°С. Отмывку выполняли в буфере 1х SSPE при комнатной температуре в течение 10 мин.
Регистрацию гибридизационной картины производили с помощью универсального аппаратно-программного комплекса (УАПК), производства ООО «БИОЧИП-ИМБ» (Москва). На Фиг.2 приведено флуоресцентное изображение биочипа после гибридизации и отмывки. На Фиг.3 приведены три возможных типичных флуоресцентных изображения маркера, отражающих его аллельное состояние. Описание алгоритма автоматического анализа изображения с помощью программного обеспечения выходит за рамки настоящего изобретения.
--->
Перечень последовательностей
<110> Fesenko, Denis O
Ivanovskii, Ivan D
<120> Набор синтетических олигонуклеотидов для одновременного генотипирования
63 ДНК-маркеров, ассоциированных с группой крови АВ0, основными гаплогруппами
Y-хромосомы, цветом радужной оболочки глаза, волос, кожи и половой
принадлежностью, методом ПЦР с последующей гибридизацией.
<130> HP 1.0
<160> 229
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_007_F
<400> 1
agaagtagct gtactagacg ggatcc 26
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_007_R
<400> 2
cacttgagag gaggctaacc cga 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_031_F
<400> 3
agcaggaagg agaacagaga aggg 24
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_031_R
<400> 4
ctaggccatg cgtccctttc t 21
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_041_F
<400> 5
acttcactgg accagttatt ttgggtttg 29
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_041_R
<400> 6
gtcttcctag acatcccgtc atgac 25
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_059_F
<400> 7
gtggtctctc tctcggcctc ag 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_059_R
<400> 8
ggcccctctt ccaccctgcc t 21
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_083_F
<400> 9
gattcaggtc tgctgtcact gctca 25
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_083_R
<400> 10
catgaagatt tcccagttgt agagatt 27
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_101_F
<400> 11
tgccacagga accaaaaagt cac 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_101_R
<400> 12
acaggttgtc tcctgtgtct tca 23
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_119_F
<400> 13
accaggcagc ctacagtcta caca 24
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_119_R
<400> 14
aacgtcctcg tgagatgaga gcc 23
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_154_F
<400> 15
gcgaggccag tttcatttga g 21
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_154_R
<400> 16
ccctgatgat gatagcgtgc aga 23
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_170_F
<400> 17
agacgcagca attcaaaacg tgca 24
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_170_R
<400> 18
cctttcagtt ctattcattg tttctttgtt tgtt 34
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_192_F
<400> 19
gtgaatgaca gctttgtttc atccact 27
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_192_R
<400> 20
gtcatatggc taaacctggc acc 23
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_208_F
<400> 21
caggtgtgaa gttgtgtggc agaag 25
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_208_R
<400> 22
tggagccaag ggcatgttac tacg 24
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_223_F
<400> 23
ggcgatccaa ttctttgttc ttt 23
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_223_R
<400> 24
ggaaggttaa tctgctgtga ca 22
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_233_F
<400> 25
acatgagatc tgggtgagga acac 24
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_233_R
<400> 26
aagaaccacc atgtcagtgt tcttacc 27
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_240_F
<400> 27
aagatgcctg cagtgggtgc cag 23
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 01_240_R
<400> 28
gcgtggcccc gaagcccagc a 21
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 02_011_F
<400> 29
tcaactccac ccccacagcc at 22
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 02_011_R
<400> 30
cctccaggca ccgggctcct g 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 02_036_F
<400> 31
ctggtgagct tggtggagaa c 21
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 02_036_R
<400> 32
ggttccggtt cttggcgatg 20
<210> 33
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 02_042_F
<400> 33
cactcaccca tgtactgctt catctg 26
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 02_042_R
<400> 34
ggaggatgac ggccgtctcc a 21
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 02_061_F
<400> 35
agcctctgct tcctgggcgc ca 22
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 02_061_R
<400> 36
tgctgaagac gacactggcc ac 22
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 02_080_F
<400> 37
acctctttct cgccctcatc at 22
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 02_080_R
<400> 38
catgtcagca cctccttgag c 21
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 02_101_F
<400> 39
gccgcgatga gacagagcat ga 22
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 02_101_R
<400> 40
gtgtgtgtgt gtggccaggc a 21
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 02_113_F
<400> 41
ggcatttggc gagcagaatc ccgt 24
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 02_113_R
<400> 42
gcagagtaaa tgagctgtgg tttct 25
<210> 43
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 02_150_F
<400> 43
tgttagggtt gatggtaacc tttgtt 26
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 02_150_R
<400> 44
acagtttgta gacattctct taaaaatatt aatttg 36
<210> 45
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 02_215_F
<400> 45
ggatactgac aatggttgta caactttg 28
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 02_215_R
<400> 46
tcatggggga gagagaatga ctca 24
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 02_231_F
<400> 47
tccctgcccc ttggcttggc tca 23
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 02_231_R
<400> 48
ggtacctcaa ggaggataag gcttt 25
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 03_016_F
<400> 49
agctaactaa gggcacaagt cta 23
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 03_016_R
<400> 50
cttttcagcc cacacctctc ctca 24
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 03_030_F
<400> 51
tgtgaggaaa tcgaggctca gaa 23
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 03_030_R
<400> 52
tccctacgag ctgatgccct ga 22
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 03_063_F
<400> 53
gccagcactg ccaaaataac aat 23
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 03_063_R
<400> 54
cagtaaagaa tctgacaatg tgcac 25
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 03_082_F
<400> 55
tgctgtatgg aagtatttga acca 24
<210> 56
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 03_082_R
<400> 56
atgatgatga tgatgatgat ggcagc 26
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 03_100_F
<400> 57
tcagcccttg gattgtctca gg 22
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 03_100_R
<400> 58
attcaggagc tgaactgccc gc 22
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 03_107_F
<400> 59
cagttgattt catgtgatcc tcaca 25
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 03_107_R
<400> 60
cccctccaag agtcgcatag gac 23
<210> 61
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 03_124_F
<400> 61
gagaaagact tacaagaata aagtgagga 29
<210> 62
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 03_124_R
<400> 62
gccctatagt gcacacaact ccac 24
<210> 63
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 03_162_F
<400> 63
tgcattatta tgtgtcaatg gatgca 26
<210> 64
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 03_162_R
<400> 64
tcatgggcaa aatcaatgtc tct 23
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 03_182_F
<400> 65
ctactcttcc tcagtccctt ctct 24
<210> 66
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 03_182_R
<400> 66
gggaaggtga atgataacac gaacagat 28
<210> 67
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 03_194_F
<400> 67
ccttttcctc tgcagtattt ttgag 25
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 03_194_R
<400> 68
tgggtgcatt ggcttctgg 19
<210> 69
<211> 33
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 04_008_F
<400> 69
tgagttatta actgtatttt ctttcacttt att 33
<210> 70
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 04_008_R
<400> 70
tcccagcttt gaaaagtatg cctaga 26
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 04_027_F
<400> 71
acatacagac tctgtcttta catttcaaaa 30
<210> 72
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 04_027_R
<400> 72
caacattgag taaccactgt gt 22
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 04_045_F
<400> 73
ctgtacttac ttttatctcc tcttctattg 30
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 04_045_R
<400> 74
gtaagtcgaa tgccctttcc 20
<210> 75
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 04_056_F
<400> 75
tggttttctg tcccatttgg gcc 23
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 04_056_R
<400> 76
tcgtgggttt tctggaatga g 21
<210> 77
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 04_065_F
<400> 77
cacaacaaaa aaatagatgg ctgggt 26
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 04_065_R
<400> 78
ctcaagcact ccatctgcct a 21
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 04_085_F
<400> 79
ctccgattcc ttaattatcc cac 23
<210> 80
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 04_085_R
<400> 80
gtaaatcttt catctccaac ccc 23
<210> 81
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 04_112_F
<400> 81
tccctgtatt cttgtgtcta ctg 23
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 04_112_R
<400> 82
tgctctcctg aggtggtttc t 21
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 04_137_F
<400> 83
gatcaataac aagttctgaa attaaggctg 30
<210> 84
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 04_137_R
<400> 84
ttgccagctc ctcttttca 19
<210> 85
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 04_154_F
<400> 85
gtgggatttt tttagatgtg ttcaat 26
<210> 86
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 04_154_R
<400> 86
acgtcttata ccaaaatatc acc 23
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 04_177_F
<400> 87
ccaaagagcc tctctagccg ca 22
<210> 88
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 04_177_R
<400> 88
ccctctggtt aacatttaca attgc 25
<210> 89
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_003_F
<400> 89
ctaaaaaaca acatttactg tttctactg 29
<210> 90
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_003_R
<400> 90
gacaccacag aaattacagg tatga 25
<210> 91
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_013_F
<400> 91
ccagtgattt aaactctctg aatca 25
<210> 92
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_013_R
<400> 92
tctactgata cctttgtttc tgttcattct 30
<210> 93
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_065_F
<400> 93
tctgctgaga agcctgcata gc 22
<210> 94
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_065_R
<400> 94
tcttaaaggc agctagagag a 21
<210> 95
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_074_F
<400> 95
tgaattcaga ttctctggaa tcttgt 26
<210> 96
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_074_R
<400> 96
ggaaagttag tggtttcagt ca 22
<210> 97
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_087_F
<400> 97
tgggcattac tctttgctct c 21
<210> 98
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_087_R
<400> 98
aaaccttatt atacacacaa cccg 24
<210> 99
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_096_F
<400> 99
cacgcctctc tccatgtgca gtagga 26
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_096_R
<400> 100
gaatggtggt gttctggagc 20
<210> 101
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_115_F
<400> 101
tggtgtgcgt ggacgtggac a 21
<210> 102
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_115_R
<400> 102
ggggtgcagg gtgccga 17
<210> 103
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_119_F
<400> 103
tgttgtatcc ttctcagtgt ttct 24
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_119_R
<400> 104
ggtcacttac acttccccga 20
<210> 105
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_132_F
<400> 105
acccctttga agtggtacca gag 23
<210> 106
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_132_R
<400> 106
tcccattaat gtctgcatgt ggagt 25
<210> 107
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_141_F
<400> 107
ttcccattag tgtctgtatg tggagt 26
<210> 108
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_141_R
<400> 108
tcccaggtct tacgc 15
<210> 109
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_151_F
<400> 109
ccaggtgtta cgca 14
<210> 110
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_151_R
<400> 110
gcacttcgta gtgg 14
<210> 111
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_180_F
<400> 111
gcactttgta gtgg 14
<210> 112
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 05_180_R
<400> 112
gggtttggag atcata 16
<210> 113
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_007_F
<400> 113
gggtttggaa atcatac 17
<210> 114
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_007_R
<400> 114
gaarggcacg agac 14
<210> 115
<211> 13
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_016_F
<400> 115
aaggcgcgag aca 13
<210> 116
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_016_R
<400> 116
ttcccaggct ccaa 14
<210> 117
<211> 13
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_031_F
<400> 117
aattcccggg ctc 13
<210> 118
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_031_R
<400> 118
catgcagcaa ggatg 15
<210> 119
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_057_F
<400> 119
gcagcgagga tgaa 14
<210> 120
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_057_R
<400> 120
cagcgagcgc tctg 14
<210> 121
<211> 13
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_071_F
<400> 121
cgagtgctct gct 13
<210> 122
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_071_R
<400> 122
tgagcattaa atgtcaa 17
<210> 123
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_077_F
<400> 123
agcattaagt gtcaag 16
<210> 124
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_077_R
<400> 124
cgtgcatata ccaaa 15
<210> 125
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_087_F
<400> 125
cgtgcataca ccaa 14
<210> 126
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_087_R
<400> 126
agaaggcaaa ttcc 14
<210> 127
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_096_F
<400> 127
agaaggtaaa ttcccc 16
<210> 128
<211> 13
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_096_R
<400> 128
tttagtgtgc cgt 13
<210> 129
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_113_F
<400> 129
cctttagcgt gccg 14
<210> 130
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_113_R
<400> 130
ttttggggtc tctttg 16
<210> 131
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_125_F
<400> 131
tttgggttct ctttgtc 17
<210> 132
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_125_R
<400> 132
acactatgcc acttc 15
<210> 133
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_135_F
<400> 133
cactatgaca cttcca 16
<210> 134
<211> 12
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_135_R
<400> 134
caccgtccct gc 12
<210> 135
<211> 12
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_143_F
<400> 135
accgttcctg ct 12
<210> 136
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_143_R
<400> 136
gctgccaacc agac 14
<210> 137
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_153_F
<400> 137
ctgccaaacc agaca 15
<210> 138
<211> 13
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_153_R
<400> 138
ctggtggtgg cca 13
<210> 139
<211> 13
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_158_F
<400> 139
tggtgttggc cac 13
<210> 140
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_158_R
<400> 140
ttgtcggacc tgctg 15
<210> 141
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_167_F
<400> 141
tgtcggaact gctg 14
<210> 142
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 06_167_R
<400> 142
agcaacgtgc tgga 14
<210> 143
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 07_010_F
<400> 143
gagcaacatg ctgga 15
<210> 144
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 07_010_R
<400> 144
gaccgctaca tctc 14
<210> 145
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 07_023_F
<400> 145
gaccactaca tctcc 15
<210> 146
<211> 13
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 07_023_R
<400> 146
gactgcgcta cca 13
<210> 147
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 07_040_F
<400> 147
gcactgtgct acca 14
<210> 148
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 07_040_R
<400> 148
gygctaccac agcat 15
<210> 149
<211> 13
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 07_062_F
<400> 149
gygctaacac agc 13
<210> 150
<211> 13
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 07_062_R
<400> 150
cacagcatcg tga 13
<210> 151
<211> 13
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 07_082_F
<400> 151
cacagcaccg tga 13
<210> 152
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 07_082_R
<400> 152
cctgccgcgg gcgc 14
<210> 153
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 07_097_F
<400> 153
ccctgccgtg ggcg 14
<210> 154
<211> 11
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 07_097_R
<400> 154
cggcgagccg t 11
<210> 155
<211> 12
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 07_112_F
<400> 155
cgcggcaagc cg 12
<210> 156
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 07_112_R
<400> 156
catcgacccc ctcat 15
<210> 157
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 07_126_F
<400> 157
atcatccacc ccctc 15
<210> 158
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 07_126_R
<400> 158
cgtccccggg agagc 15
<210> 159
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 07_140_F
<400> 159
ccgtccctgg gaga 14
<210> 160
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 07_140_R
<400> 160
tatcctatgc tgtaaga 17
<210> 161
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 07_153_F
<400> 161
atcctacgct gtaagag 17
<210> 162
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 07_153_R
<400> 162
tcattacaga tggtgc 16
<210> 163
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 08_002_F
<400> 163
ttacagaggg tgcaa 15
<210> 164
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 08_002_R
<400> 164
tactaaaata cactgaatga 20
<210> 165
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 08_013_F
<400> 165
taaaatactc tgaatgatat a 21
<210> 166
<211> 13
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 08_013_R
<400> 166
gccttgggca aaa 13
<210> 167
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 08_033_F
<400> 167
ggccttaggc aaaa 14
<210> 168
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 08_033_R
<400> 168
gcacagtaat gggc 14
<210> 169
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 08_058_F
<400> 169
cacagtagtg ggct 14
<210> 170
<211> 12
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 08_058_R
<400> 170
tggcgtgctc ag 12
<210> 171
<211> 13
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 08_064_F
<400> 171
tgagtggcat gct 13
<210> 172
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 08_064_R
<400> 172
tgaactttcc agactttt 18
<210> 173
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 08_082_F
<400> 173
aactttccgg actttt 16
<210> 174
<211> 12
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 08_082_R
<400> 174
cccgtggtag ct 12
<210> 175
<211> 13
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 08_103_F
<400> 175
cccgtgatag ctg 13
<210> 176
<211> 12
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 08_103_R
<400> 176
tgcaggcgca ac 12
<210> 177
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 08_125_F
<400> 177
gcaggcacaa ctttc 15
<210> 178
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 08_125_R
<400> 178
acagcagcct ctga 14
<210> 179
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 08_139_F
<400> 179
cacagcagac tctga 15
<210> 180
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 08_139_R
<400> 180
tgatgcacaa gcccc 15
<210> 181
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 09_000_F
<400> 181
tgatgcagaa gcccc 15
<210> 182
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 09_000_R
<400> 182
tgggggatct gaaat 15
<210> 183
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 09_021_F
<400> 183
ttgggggata tgaaat 16
<210> 184
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 09_021_R
<400> 184
gcaacgaaat ctgtg 15
<210> 185
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 09_064_F
<400> 185
ctctgcaaca aaatctgt 18
<210> 186
<211> 12
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 09_064_R
<400> 186
gctccgaagg ca 12
<210> 187
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 09_072_F
<400> 187
tggctccaaa ggca 14
<210> 188
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 09_072_R
<400> 188
atatgttagc attaaagttc 20
<210> 189
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 09_084_F
<400> 189
gcatatgtta gaattaaagt 20
<210> 190
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 09_084_R
<400> 190
tgacttaaag atcaggc 17
<210> 191
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 09_109_F
<400> 191
acttaaagta tcaggcac 18
<210> 192
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 09_109_R
<400> 192
ttggatttcc ctgcc 15
<210> 193
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 09_117_F
<400> 193
ggatttctct gccca 15
<210> 194
<211> 13
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 09_117_R
<400> 194
gccaggcgtt cct 13
<210> 195
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 09_132_F
<400> 195
ggccaggcat tcctt 15
<210> 196
<211> 13
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 09_132_R
<400> 196
cctgtaatcc cag 13
<210> 197
<211> 13
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 10_001_F
<400> 197
cctgttatcc cag 13
<210> 198
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 10_001_R
<400> 198
atttctggtg gccc 14
<210> 199
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 10_026_F
<400> 199
atttctgatg gccca 15
<210> 200
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 10_026_R
<400> 200
cggcgatgaa agttc 15
<210> 201
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 10_035_F
<400> 201
acggcgatta aagttc 16
<210> 202
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 10_035_R
<400> 202
atgaaagccc aggac 15
<210> 203
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 10_047_F
<400> 203
tgaaaaccca ggacc 15
<210> 204
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 10_047_R
<400> 204
ttgtgaaaca actggtg 17
<210> 205
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 10_071_F
<400> 205
gtgacacaac tggtg 15
<210> 206
<211> 13
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 10_071_R
<400> 206
gaggccgcat ggt 13
<210> 207
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 10_085_F
<400> 207
gaggctgcat ggtc 14
<210> 208
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 10_085_R
<400> 208
ctactgcttt cgaattggg 19
<210> 209
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 10_117_F
<400> 209
tactgctttc aaattggg 18
<210> 210
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 10_117_R
<400> 210
ctcacttctc ttctcaagaa t 21
<210> 211
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 10_128_F
<400> 211
ctcacttctc aagaatga 18
<210> 212
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 10_128_R
<400> 212
tgtaggtgac ctaccct 17
<210> 213
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 11_006_F
<400> 213
gtaggtaacc taccct 16
<210> 214
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 11_006_R
<400> 214
tgacatcttc ccctgctg 18
<210> 215
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 11_020_F
<400> 215
acatctttcc ctgctg 16
<210> 216
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 11_020_R
<400> 216
ccgaaaaccc actaa 15
<210> 217
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 11_034_F
<400> 217
tcccgaagac ccac 14
<210> 218
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 11_034_R
<400> 218
ctcgtggtga cccct 15
<210> 219
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 11_059_F
<400> 219
ctcgtggtac cccttg 16
<210> 220
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 11_059_R
<400> 220
agggcacatt caacatc 17
<210> 221
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 11_084_F
<400> 221
agggcacgtt caacat 16
<210> 222
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 11_084_R
<400> 222
ctgactccgc tgttc 15
<210> 223
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 11_094_F
<400> 223
ctgactccac tgttcg 16
<210> 224
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 11_094_R
<400> 224
cgcgaccacg tgggcg 16
<210> 225
<211> 13
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 11_111_F
<400> 225
gcgaccatgt ggg 13
<210> 226
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 11_111_R
<400> 226
tcttcggcct ttctagtgga ga 22
<210> 227
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 11_135_F
<400> 227
tctagtggag aggtgctct 19
<210> 228
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 11_135_R
<400> 228
cagagcataa ggcca 15
<210> 229
<211> 18
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 12_013_F
<400> 229
cagagcatga taagacca 18
<---
1. Набор для генотипирования 63 ДНК-маркеров, ассоциированных с группой крови АВ0, основными гаплогруппами Y-хромосомы, цветом радужной оболочки глаза, волос, кожи и половой принадлежностью, методом ПЦР с последующей гибридизацией, состоящий из композиции ПЦР-праймеров SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 107 для амплификации указанных полиморфизмов, и аллель-специфичных олигонуклеотидных зондов SEQ ID NO: 108-SEQ ID NO: 229 для генотипирования соответствующих полиморфизмов методом гибридизации.
2. Набор по п.1, отличающийся тем, что может быть составлен в сокращенном виде, путем исключения части праймеров и соответствующих олигонуклеотидных зондов.
3. Набор по п.1, отличающийся тем, что мечение ПЦР-продукта осуществляется с использованием флуорофора.
4. Набор по п.3, отличающийся тем, что флуоресцентное мечение ПЦР-продукта осуществляется с помощью праймера, имеющего соответствующую флуоресцентную метку по 5’-концу.
5. Набор по п.3, отличающийся тем, что флуоресцентное мечение ПЦР-продукта осуществляется с помощью флуоресцентно-меченного дезоксинуклеотидтрифосфата, встраивающегося в растущую цепь ДНК в ходе ПЦР.
6. Набор по п.3, отличающийся тем, что каждый локус-специфичный обратный праймер с четным номером «Seq ID» (Seq ID NO: 2, Seq ID NO: 4… Seq ID NO: 324), имеет со стороны 5`-конца универсальную олигонуклеотидную вставку, с последовательностью 5`-TCATTGGATCTCATTA-3`, и универсальный ПЦР-праймер также имеет последовательность 5`-TCATTGGATCTCATTA-3`.
7. Набор по п.6, отличающийся тем, что аллель-специфичные олигонуклеотидные зонды иммобилизованы на поверхности подложки.
8. Набор по п.6, отличающийся тем, что аллель-специфичные олигонуклеотидные зонды иммобилизованы в объеме полимерного носителя.
