Способ выявления и лабораторного подтверждения наследуемого хромосомно-интегрируемого вируса герпеса человека 6a/b

Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии и предназначено для выявления и лабораторного подтверждения наследуемого хромосомно-интегрированного вируса герпеса человека 6А/В. Выявление в образце цельной крови ДНК ВГЧ-6А/В в концентрации от 4,77 до 5,37 lg копий/10⁵ клеток, а также выявление в образце ногтевых пластин ДНК ВГЧ-6А/В в концентрации не менее 4,91 lg копий/10⁵ клеток, в образце волосяных фолликулов - не менее 4,70 lg копий/10⁵ клеток позволяет судить о наличии наследуемого хромосомно-интегрированного вируса герпеса человека 6А/В. Выявление в образце цельной крови ДНК ВГЧ-6А/В в концентрации менее 4,77 или более 5,37 lg копий/10⁵ клеток, а также выявление в образце ногтевых пластин ДНК ВГЧ-6А/В в концентрации менее 4,91 lg копий/10⁵ клеток, в образце волосяных фолликулов - менее 4,70 lg копий/10⁵ клеток позволяет исключить наличие наследуемого хромосомно-интегрированного вируса герпеса человека 6А/В. Изобретение обеспечивает повышение точности метода диагностики наследуемого хромосомно-интерированного ВГЧ-6А или ВГЧ-6В. 1 з.п. ф-лы, 6 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии и может быть использовано в клинической практике для выявления и лабораторного подтверждения наследуемого хромосомно-интегрированного вируса герпеса человека 6А/В (хиВГЧ-6А/В).

Human betaherpesvirus 6А (вирус герпеса человека 6А, ВГЧ-6А) и Human betaherpesvirus 6 В (вирус герпеса человека 6 В, ВГЧ-6В) широко распространены во всем мире. Основные различия между ВГЧ-6А и ВГЧ-6В складываются за счет вариации в проценте схожести ортологичных генов (2-31%), реактивности с моноклональными антителами, клеточному тропизму in vitro, а также ассоциации с различными заболеваниями. На текущий момент для ВГЧ-6А и ВГЧ-6В сохраняется общее название - вирус герпеса человека 6 (ВГЧ-6, ВГЧ-6А/В).

Установлено, что ВГЧ-6А и ВГЧ-6В являются уникальными среди всех представителей семейства Herpesviridae, патогенных для человека: они способны эффективно интегрировать в теломеры хромосом клетки-хозяина как in vivo, так и in vitro, благодаря особенностям организации генома. Уникальная область генома ВГЧ-6А/В, представленного линейной двухцепочной ДНК, фланкируется двумя областями, которые содержат совершенные и несовершенные повторы, комплементарные теломерным повторам хромосом человека. Это позволяет вирусу встраивать свой геном или его участки в субтеломерную / теломерную область хромосом клетки-хозяина посредством гомологичной рекомбинации, в результате чего формируется хромосомно-интегрированная форма ВГЧ-6А/В. Интеграция вируса в половые клетки может привести к наследованию от поколения к поколению: от одного или обоих родителей с 50% вероятностью на каждого новорожденного. При этом 86% врожденных ВГЧ-6А/В-инфекций обусловлены именно наследственной передачей хиВГЧ-6А или хиВГЧ-6В.

В настоящее время показано, что от 0,2 до 2% населения в мире, в зависимости от географического региона в котором проводилась выборка, являются носителями хиВГЧ-6А или хиВГЧ-6В, передаваемого по наследству.

Выявление хиВГЧ-6А/В-статуса невозможно на основании клинических признаков и требует обязательного лабораторного подтверждения. Основные трудности в верификации данного состояния связаны с необходимостью проведения дифференциальной диагностики с острой инфекцией, вызванной ВГЧ-6А/В. Значение данного подтверждения увеличивается в связи с активным внедрением в диагностику различных инфекционных заболеваний методов амплификации нуклеиновых кислот. Так, на текущий момент основным критерием лабораторного подтверждения активной ВГЧ-6А/В-инфекции (острой, реактивированной формы заболевания или реинфекции), требующей назначения противовирусной терапии, является обнаружение высокой концентрации ДНК вируса в крови. Однако при лабораторном обследовании лиц с хиВГЧ-6А/В-статусом данный подход может приводить к диагностическим ошибкам, необоснованному назначению им специфической противовирусной терапии.

Считается, что диагноз хиВГЧ-6А/В вероятен, когда уровень ДНК вируса составляет больше 500 000 (>5,5 lg) копий/мл цельной крови, или больше 3,5 lg копий/мл сыворотки, или больше 4 lg копий/мл ликвора [Ward K.N., Leong H.N., Nacheva Е.Р., Howard J., Atkinson C.E., Davies N.W., Griffiths P.D., Clark D.A. Human herpesvirus 6 chromosomal integration in immunocompetent patients results in high levels of viral DNA in blood, sera, and hair follicles. J. Clin. Microbiol., 2006, Vol. 44, №4, Р. 1571-1574].

У людей с хиВГЧ-6А/В-статусом пожизненно выявляется очень высокое количество ДНК ВГЧ-6А/В в крови и во всех других биологических жидкостях и тканях организма, что сильно затрудняет правильную диагностику острой ВГЧ-6А/В-инфекции. При этом лица с хиВГЧ-6А/В-статусом имеют значительно более высокие вирусные нагрузки ДНК в цельной крови, чем лица без хиВГЧ-6А/В, передаваемым по наследству, и лица с первичной ВГЧ-6А/В-инфекцией.

Известен способ определения показаний к проведению противогерпетической терапии при инфекции ВГЧ-6 у детей с острыми респираторными заболеваниями, согласно которому при количестве копий ДНК ВГЧ-6 равном или более 100 копий/10⁵ клеток крови является показанием к проведению противогерпетической терапии [Патент RU 2641609, дата приоритета 10.04.2017].

ПЦР-тестирование волосяных фолликулов или ногтей может подтвердить хиВГЧ-6-статус, потому что только лица с хиВГЧ-6 имеют ВГЧ-6 в этих тканях [Хромосомно-интегрированный вирус герпеса человека 6 типа. Никольский М.А., Голубцова B.C. Инфекция и иммунитет, 2015, т. 5, №1, С. 11].

Известно, что хромосомно-интегрированный вирус герпеса человека 6А может быть диагностирован при обнаружении ДНК ВГЧ-6А одновременно в нескольких биологических образцах в следующих концентрациях (lg копий/10⁵ клеток): цельная кровь - 5,25±0,04; плазма крови - 4,83±0,19; мазок из ротоглотки - 5,49±0,15; моча - 5,49±0,16; волосяные фолликулы - 5,59±0,23; ногтевые пластины - 6,03±0,41 [Первый случай выявления и лабораторного подтверждения наследственной передачи хромосомно-интегрированной передачи Human betaherpesvirus 6А в Российской Федерации. Домонова Э.А., Сильвейстрова О.Ю., Гоптарь И.А., Кулешов К.В., Пасхина И.Н., Никифорова А.В., Шипулина О.Ю., Маркелов М.Л., Шипулин Г.А., Малеев В.В. Инфекционные болезни, 2019, т. 17, №3, С. 5-14].

Данный способ разработан на основании анализа результатов двух клинических случаев, что свидетельствует о неподтвержденности полученных данных и не может быть применимо в клинической практике. Кроме того указанный способ предполагает одновременный скрининг в широком наборе биологических образцов, а именно в цельной крови / плазме крови / мазке из ротоглотки / моче / волосяных фолликулах / ногтевых пластинах, что делает его трудоемким и затратным.

Наиболее явные проблемы, связанные с установлением хиВГЧ-6А/В-статуса, касаются диагностики:

- сложность дифференциальной диагностики острой ВГЧ-6А/В-инфекции и носительства хиВГЧ-6А/В, передаваемого по наследству;

- сложность диагностики заболеваний, связанных с активной ВГЧ-6А/В-инфекцией у пациентов с наследуемым хиВГЧ-6А или хиВГЧ-6В (эндогенными), и, соответственно, решения вопроса о необходимости проведения противовирусной терапии,

что, в свою очередь, является следствием отсутствия ясности в клинической интерпретации результатов специфических методов амплификации нуклеиновых кислот и четком представлении о диагностическом значении концентрации ДНК ВГЧ-6А/В в биологическом материале.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка лабораторного способа выявления и подтверждения наследуемого хиВГЧ-6А/В, то есть верификации хиВГЧ-6А-статуса и хиВГЧ-6В-статуса как у детей, так и взрослых.

Технический результат заключается в повышении точности метода диагностики и установлении клинически значимых пороговых концентраций ДНК ВГЧ-6А/В в уникальном сочетании биологических образцов пациента, что позволяет качественно ускорить выявление и лабораторное подтверждение хромосомно-интерированного ВГЧ-6А или ВГЧ-6В, передаваемого по наследству, у детей и взрослых, а также исключить гипердиагностику ВГЧ-6А/В-инфекции и назначение необоснованной противовирусной терапии. Своевременная верификация хиВГЧ-6А/В-статуса незамедлительно приводит к снижению излишней лекарственной нагрузки на пациента, стоимости проводимого курса комплексной терапии, сокращению длительности амбулаторного или стационарного лечения.

Технический результат достигается за счет определения концентрации ДНК ВГЧ-6А/В в различных типах биологического материала пациента, а именно в образцах цельной крови, ногтевых пластин и/или волосяных фолликулов, с помощью метода полимеразно-цепной реакции (ПНР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов анализа в режиме «реального времени». При определении концентрации ДНК ВГЧ-6А/В в образце цельной крови в пределах от 4,77 до 5,37 lg копий/10⁵ клеток, а также в образце ногтевых пластин - не менее 4,91 lg копий/10⁵ клеток и/или в образце волосяных фолликулов - не менее 4,70 lg копий/10⁵ клеток верифицируют наследуемый хромосомно-интегрированный вирус герпеса человека 6А/В. Выявление в образце цельной крови ДНК ВГЧ-6А/В в концентрации менее 4,77 или более 5,37 lg копий/10⁵ клеток, а также в образцах ногтевых пластин и/или волосяных фолликулов менее 4,91 и 4,70 lg копий/10⁵ клеток, соответственно, позволяет исключить наличие наследуемого хромосомно-интегрированного вируса герпеса человека 6А/В. Исключение хиВГЧ-6А/В-статуса обследуемого является основанием для дальнейшего диагностического поиска, направленного на уточнение стадии развития инфекционного процесса, а также решения вопроса о необходимости проведения противовирусной терапии.

В настоящем способе может быть использовано сочетание как двух, так и трех образцов биологического материала, одним из которых обязательно является цельная кровь.

Лабораторное подтверждение наследственной передачи хиВГЧ-6А/В выполняется с помощью современных методов исследования. В основе способа обнаружения и количественной оценки ДНК вируса с помощью ПЦР лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида возбудителя инфекционного заболевания. ПЦР является прямым методом выявления ДНК вируса и имеет высокую степень чувствительности. Метод ПЦР-РВ имеет целый ряд преимуществ, таких как быстрота выполнения (2 часа для комбинированной амплификации и считывания), широкий диапазон линейности сигнала (меньше чем 10 к 10⁸ геномных копий), получение всех флуоресцентных сигналов во время амплификации происходит без открывания реакционной пробирки, стабильность флуоресцентного зонда, наличие 96 лунок, что позволяет производить большие серии тестов [Human Herpesviruses HHV-6A, HHV-6B, and HHV-7. Diagnosis and Clinical Management / Edited by L. Flamand [et al.]. - Amsterdam, Elsevier, 2014.-341].

В основе создания предложенного изобретения лежит исследование, проведенное в ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора за период с февраля 2017 года по февраль 2020 года. Обследовано 104 человека в возрасте от 7 дней до 83 лет (медиана возраста 27 лет): 51 пациент с высокими концентрациями ДНК ВГЧ-6А/В в крови (более 3,5 lg копий/10⁵ клеток) и/или других типах биологического материала и 53 ближайших родственников пациентов с подозрением на хиВГЧ-6А/В-статус. Среди которых: 51,9% мужчин (54/104) и 48,1% женщин (50/104). Обследование проводилось в соответствии с законодательством РФ, международными этическими нормами и нормативными документами ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора при наличии письменного согласия пациентов. Длительность клинико-лабораторного наблюдения составляла от 1 до 13 месяцев.

Клиническое обследование, общее лабораторное (общий клинический анализ крови, общий анализ мочи, биохимический анализ крови) и инструментальное (УЗИ) исследование проводили стандартными общепринятыми методами. В динамике проанализированы уровни вирусной нагрузки ВГЧ-6А/В в образцах цельной крови (n=703), ногтевых пластин (n=150), волосяных фолликулов (n=120), а так же маркеров ВГЧ-6А/В-инфекции - специфических антител класса IgG (AT-IgG) к антигенам (АГ) ВГЧ-6А/В (суммарные к АГ ВГЧ-6 обоих видов) в образцах сыворотки крови (n=208) обследуемых.

Взятие образцов крови производили натощак одноразовой иглой (диаметр 0,8-1,1 мм) в пробирки объемом 4,0 мл с 6% ЭДТА (для ПЦР-исследования) и активатором свертывания и гелем (для ИФА-исследования) после обработки места пункции кожным антисептиком путем пункции периферической вены. Допускалось хранение образцов крови для ПЦР-исследования: при температуре 18-250С - в течение 2 ч., при температуре 2-80С - в течение 72 ч. с момента взятия биологического материала; а для ИФА-исследования: при температуре 18-250С - в течение 2 ч. с момента взятия биологического материала. Сбор образцов ногтевых пластин производили после удаления декоративного лака или гель-лака (при наличии покрытия ногтевой пластины), тщательного мытья рук, включая подногтевые пространства. Ножницами обрезали свободный край ногтевой пластины, используя одноразовый стерильный инструментарий. Из расчета на одно тестирование - 2 образца размером ~2×10 мм. Сбор образцов волосяных фолликулов осуществлялся с волосистой поверхности головы из расчета 2-3 волосяных фолликула на одно тестирование. Предназначенные для ПЦР-исследования образцы ногтевых пластин и волосяных фолликулов помещали в одноразовые стерильные пластиковые контейнеры с крышкой или пробирки типа «Эппендорф» с возможностью длительного хранения при температуре 18-250С.

Экстракцию тотальной ДНК из анализируемых образцов биологического материала осуществляли при помощи комплекта реагентов «АмплиСенс® РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, РФ). Концентрацию ДНК ВГЧ-6А/В в различных образцах биологического материала определяли методом ПЦР-РВ с учетом результатов анализа в количественном формате («АмплиСенс^® HHV6-скрин-титр-FL», ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, РФ). Постановку и анализ результатов амплификации проводили на приборе с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» «Rotor-Gene Q» (Qiagen, ФРГ) в соответствии с инструкцией производителя. Расчет концентрации вируса выполняли в логарифмах копий специфической ДНК вируса на стандартное количество (10⁵) клеток человека, оцененное по β-глобиновому гену, учитывая копийность искомых генов-мишеней: однокопийный для специфической мишени вируса (участок ДНК генома ВГЧ-6А/В) и двухкопийный для β-глобинового гена (участок ДНК генома человека).

Выявление и количественное определение вирусоспецифических AT-IgG в образцах сыворотки крови, взятой с интервалом 14 дней, выполняли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора реагентов «BeKToHHV-6-IgG» (ЗАО «Вектор-Бест», РФ). Постановку ИФА и последующий анализ полученных результатов осуществляли с использованием автоматического иммуноферментного анализатора «Freedom EVOlyzer 200» («ТЕСAN Schweiz AG», Швейцария), согласно инструкции производителя. Концентрацию вирусоспецифических AT-IgG оценивали исходя из коэффициента позитивности: положительный результат ≥1,0; пограничный - от ≥0,8 до <1,0; отрицательный - <0,80.

Видовую идентификацию вирусов проводили на основании данных, полученных с помощью метода массового параллельного секвенирования («MiSeq», Illumina).

Для подтверждения или опровержения наследственной передачи хиВГЧ-6А/В клинико-лабораторно обследовали биологических родителей и других ближайших родственников пациентов в том же объеме.

Статистический анализ полученных результатов исследования, включающий обработку данных методами описательной статистики, проводили с использованием программного пакета Microsoft Excel (Windows ХР) и SPSS 16. Проверку исследуемых признаков на нормальность выполняли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова.

Наследуемый хиВГЧ-6А/В лабораторно подтвержден у 12/51 (23,5%) обследованных пациентов с высокими концентрациями ДНК ВГЧ-6А/В в крови и 22/53 (41,5%) их ближайших родственников.

Специфические AT-IgG к АГ ВГЧ-6А/В в сыворотке крови обследованных с хиВГЧ-6А/В-статусом обнаружены у 10/34 (29,4%) с коэффициентом позитивности: 1,19-12,39 (медиана 3,71) без увеличения в динамике. Определение вирусоспецифических AT не позволило установить хиВГЧ-6А/В-статус, а указывало лишь на то, что на текущий момент произошло инфицирование экзогенным ВГЧ-6А/В, их отсутствие, в свою очередь, свидетельствовало об обратном.

В целом, расшифровано 10 случаев наследственной передачи хиВГЧ-6В: 7 (70,0%) в двух поколениях и 3 (30,0%) в трех поколениях, а также 2 случая наследственной передачи хиВГЧ-6А: 1 (50,0%) в двух поколениях и 1 (50,0%) в трех поколениях. Распределение концентраций ДНК ВГЧ-6А/В в различных типах биологического материала пациентов с хиВГЧ-6А/В-статусом представлены в Таблице 1. Распределение концентраций ДНК ВГЧ-6А/В в различных типах биологического материала пациентов с хиВГЧ-6А/В-статусом.

Проведенный ретроспективно анализ анамнестических данных показал, что среди обследованных с клиническими признаками, сходными с острой первичной ВГЧ-6А/В-инфекцией было 29,4%, без клинических признаков активной инфекции - 70,6% человек. Специфическую противовирусную терапию до установления хиВГЧ-6А/В-статуса проводили 70% пациентам с высокими концентрациями ДНК ВГЧ-6А/В в крови, в том числе 60% - более 3-4 курсов лечения без положительного эффекта.

В результате проведенного исследования выявлен и подтвержден хиВГЧ-6А/В-статус у 34 из 104 обследованных человек, среди которых пациенты с высокими концентрациями ДНК ВГЧ-6А/В в крови и их ближайшие родственники. Проведенное исследование позволило определить граничные значения концентрации ДНК ВГЧ-6А/В в образцах цельной крови, ногтевых пластин, волосяных фолликулов, с 99% вероятностью свидетельствующие о наличии наследуемой хромосомно-интегрированной эндогенной формы существования вируса. А именно:

- концентрация ДНК ВГЧ-6А/В в образце цельной крови в пределах значений от 4,77 до 5,37 lg копий/10⁵ клеток;

- концентрация ДНК ВГЧ-6А/В в образце ногтевых пластин в значении не менее 4,91 lg копий/10⁵ клеток

и/или

- концентрация ДНК ВГЧ-6А/В в образце волосяных фолликулов в значении не менее 4,70 lg копий/10⁵ клеток.

Соблюдение требований к технике сбора образцов ногтевых пластин, волосяных фолликулов у обследуемых лиц и критериев трактовки определяемой концентрации ДНК ВГЧ-6А/В в данных типах биологического материала позволили избежать затруднений в интерпретации результатов ПЦР-анализа, связанных с получением ложноположительных (контаминация исследуемых образцов другим типом биологического материала, например, слюной) и ложноотрицательных результатов (несоблюдение условий при сборе биологического материала).

В 100% случаев своевременное установление хиВГЧ-6А-статуса или хиВГЧ-6 В-статуса являлось обоснованием для исключения активной инфекции, вызываемой ВГЧ-6А/В, отмены проведения специфической противовирусной терапии (при ее наличии) и своевременного выбора оптимальной тактики ведения пациента.

Клинические примеры:

Пример 1. Пациентка (девочка, 2 года 2 месяца) с выявленным и лабораторно подтвержденным хиВГЧ-6В-статусом впоследствии, имеющая значения концентрации ДНК вируса в образцах цельной крови - 5,26 lg копий/10⁵ клеток, ногтевых пластин - 5,67 lg копий/10⁵ клеток, волосяных фолликулов - 5,35 lg копий/10⁵ клеток.

На амбулаторный прием врача-инфекциониста обратились родители с ребенком (2017 г. р.) с жалобами на сохраняющиеся изменения в анализах крови девочки (нейтропения, абсолютное количество нейтрофилов 900 клеток/мкл) после острого респираторного заболевания, перенесенного 5 месяцев назад.

Из анамнеза известно, что пациентка в возрасте 1 год 9 месяцев перенесла острую респираторную вирусную инфекцию (ОРВИ), характеризующуюся лихорадкой (максимальное повышение температуры до 39°С) в течение 5 дней, явлениями бронхита, ринита. При лабораторном обследовании ребенка методом ПЦР выявлена в цельной крови ДНК ВГЧ-6А/В в концентрации 5,26 lg копий/10⁵ клеток, респираторном мазке - ДНК Human adenovirus и ДНК ВГЧ-6А/В в концентрации 4,94×10⁵ копий/мл. Проведена комплексная терапия, включающая интерферон альфа-2b человеческий рекомбинантный ректально курсом в течение 2 месяцев в соответствии с инструкцией по применению. На фоне которой самочувствие девочки нормализовалось, в крови абсолютное количество нейтрофилов 900-1000 кг/мкл. Однако, при повторном лабораторном обследовании пациентки, проведенном через 21 день после окончания курса комплексной терапии, в крови ДНК ВГЧ-6 А/В сохранялась на высоком уровне (концентрация 5,28 lg копий /10⁵ клеток).

При осмотре: состояние удовлетворительное, девочка правильного телосложения, удовлетворительного питания (рост 94 см, вес 15 кг). Кожные покровы обычной окраски, чистые, сухие по задней поверхности бедер. Язык чистый. Видимые слизистые чистые, задняя стенка глотки умеренно зерниста, обычной окраски. Миндалины не увеличены, рыхлые, чистые. Лимфоузлы шейных, подмышечных, надключичных, паховых групп не увеличены, единичные, мягкой, плотно-эластичной консистенции, безболезненные. Дыхание через нос свободное, над легкими пуэрильное, хрипов нет. Сердечные тоны, звучные, ритмичные. Живот мягкий, безболезненный при пальпации. Печень +2 см из-под края реберной дуги, селезенка не пальпируется. Стул 1 раз/сутки, ежедневный или через день, оформленный, мягкой консистенции. Риноскопия: без особенностей. Отоскопия: без особенностей.

Результаты клинического анализа крови пациентки при обращении за амбулаторной помощью к врачу-инфекционисту представлены в Таблице 2. Результаты клинического анализа крови девочки (2 года 2 месяца) при обращении. Результаты общего анализа мочи в тот же период времени - без патологии.

На основании данных о длительно сохраняющейся ДНКемии ВГЧ-6А/В у девочки после купирования клинических проявлений острого заболевания и проведения противовирусной терапии, принято решение о необходимости исключения хиВГЧ-6А/В-статуса пациентки. Для этого выполнено ее дополнительное лабораторное обследование, результаты которого приведены в Таблице 3. Результаты выявления и количественного определения специфических маркеров ВГЧ-6А/В-инфекции у членов семьи с наследственной передачей хиВГЧ-6 В.

Так, ДНК ВГЧ-6В методом ПЦР-РВ обнаружена в образцах цельной крови, ногтевых пластин и волосяных фолликулов девочки в концентрации 5,26; 5,67 и 5,35 lg копий/10⁵ клеток, что позволило подтвердить хиВГЧ-6В-статус обследованной. Для расшифровки случая наследственной передачи хиВГЧ-6В проведено обследование пяти условно-здоровых ближайших родственников ребенка с хиВГЧ-6В-статусом (биологических родителей, бабушки и дедушки по материнской линии, бабушки по отцовской линии). На момент клинико-лабораторного обследования все пациенты жалоб не предъявляли, клинических симптомов активной инфекции у них не выявлено. Показатели общего и биохимического анализов крови - в пределах диапазона референсных значений, общий анализ мочи - без патологии. Наследуемый хиВГЧ-6В верифицирован у отца девочки на основании обнаружении ДНК ВГЧ-6В в образцах цельной крови, ногтевых пластин, волосяных фолликулов методом ПЦР-РВ в концентрациях: 5,29; 5,66; 5,32 lg копий/10⁵ клеток, соответственно. У остальных членов семьи (матери ребенка, бабушки и дедушки по материнской линии, бабушки по отцовской линии) хиВГЧ-6А/В-статус не подтвержден. Видовая идентификация вируса (ВГЧ-6 В) определена на основании данных, полученных при использовании метода массового параллельного секвенирования. В сыворотке крови у 4/6 пациентов методом ИФА обнаружены AT-IgG к АГ ВГЧ-6А/В (коэффициент позитивности варьировал от 1,97 до 4,75) без увеличения в динамике, косвенно свидетельствующие о перенесенной ВГЧ-6В-инфекции и отсутствии активного процесса на момент обследования. При этом в образцах сыворотки крови девочки (2 года 2 месяца) и ее отца AT-IgG к АГ ВГЧ-6А/В не обнаружены (коэффициент позитивности 0,15 и 0,25, соответственно), что указывало на отсутствие данных, лабораторно подтверждающих инфицирование пациентов экзогенным ВГЧ-6А/В.

Данный пример демонстрирует выявление и подтверждение хиВГЧ-6В-статуса у девочки (возраст 2 года 2 месяца), впервые заподозренного на фоне течения ОРВИ, вероятно аденовирусной этиологии, сопровождающейся лихорадочным состоянием. В ходе динамического наблюдения (3 месяца) пациентки зафиксировано ее полное клиническое выздоровление. Наследуемый хиВГЧ-6В обнаружен и подтвержден в двух поколениях: отец-дочь. На момент установления хиВГЧ-6В-статуса пациенты в специфической противовирусной терапии не нуждались.

Пример 2. Пациентка (женщина, 31 год) с выявленным и лабораторно подтвержденным хиВГЧ-6А-статусом впоследствии, имеющая значения ДНК вируса в образцах цельной крови - 5,23 lg копий/10⁵ клеток, ногтевых пластин - 5,63 lg копий/10⁵ клеток, волосяных фолликулов - 5,00 lg копий/10⁵ клеток.

Женщина (1986 г.р.) соматически здорова, жалоб не предъявляла, при клиническом осмотре симптомов активной инфекции не выявлено, показатели общего и биохимического анализов крови в пределах диапазона референсных значений, в крови методом ПЦР-РВ выявлена ДНК ВГЧ-6А/В в концентрации 5,23 lg копий/10⁵ клеток. Пациентка клинико-лабораторно обследована совместно с сыном в возрасте 2 мес. (2016 г.р.) с предварительным диагнозом «Острая инфекция, вызванная вирусом герпеса человека 6». Мальчик от I беременности, протекавшей: I триместр - ретрохориальная гематома, повышение Д-димера, II триместр - без особенностей, III триместр - анемия беременных. Роды I самопроизвольные в срок. Ребенок родился с весом 3570 г, длиной тела 54 см, окружностью головы - 36 см, окружностью груди - 36 см. Оценка по шкале Апгар - 8/9 баллов. Неонатальный период - без особенностей. При лабораторном обследовании ребенка на фоне клинического здоровья в возрасте 1,5 месяцев выявлены изменения: в гемограмме анемия (Нв 85 г/л), относительная нейтропения (12,6%), тромбоцитоз (506 тыс.); в крови ДНК ВГЧ-6А/В в концентрации 5,14 lg копий/10⁵ клеток (ПЦР-РВ) при отсутствии специфических AT-IgG к АГ ВГЧ-6А/В (ИФА) в сыворотке крови. По данным УЗИ - тимомегалия III степени. Рассматривался вопрос о назначении пациенту специфической противовирусной терапии.

Несоответствие между клинической симптоматикой (отсутствие клинических признаков активной инфекции) и результатами лабораторного исследования явилось основанием для подозрения на хиВГЧ-6А/В-статус обследуемых.

ХиВГЧ-6А-статус пациентов установлен при обнаружении ДНК ВГЧ-6А методом ПЦР-РВ в концентрации:

- в образцах цельной крови (lg копий/10⁵) - 5,23 у женщины и 5,24 у ее сына, без увеличения значений в динамике;

- в образцах ногтевых пластин (lg копий/10⁵)-5,63 у женщины и 5,37 у ее сына;

- в образцах волосяных фолликулов (lg копий/10⁵) - 5,00 у женщины и 5,15 у ее сына.

Видовая идентификация вируса - ВГЧ-6А - определена на основании данных, полученных при использовании метода массового параллельного секвенирования. В образцах сыворотки крови обследуемых специфические AT-IgG к АГ ВГЧ-6А/В методом ИФА в динамике не обнаружили, что указывало на отсутствие данных, свидетельствующих об инфицировании пациентов экзогенным ВГЧ-6 А/В.

Для расшифровки случая наследственной передачи хиВГЧ-6А проведено обследование трех условно-здоровых ближайших родственников женщины с хиВГЧ-6А-статусом (биологических родителей, родной сестры), а также супруга. На момент клинико-лабораторного обследования пациенты жалоб не предъявляли, клинических симптомов активной инфекции у них не выявлено. Показатели общего и биохимического анализов крови - в пределах диапазона референсных значений, общий анализ мочи - без патологии. Наследуемый хиВГЧ-6А верифицирован у отца женщины на основании обнаружении ДНК ВГЧ-6А методом ПЦР-РВ в образцах цельной крови в концентрации 5,03 lg копий/10⁵ клеток, ногтевых пластин - 5,84 lg копий/10⁵ клеток, волосяных фолликулов - 5,01 lg копий/10⁵. У остальных членов семьи (матери женщины, ее родной сестры, супруга) хиВГЧ-6А/В-статус не подтвержден. В сыворотке крови у 3/4 обследуемых методом ИФА обнаружены AT-IgG к АГ ВГЧ-6А/В (коэффициент позитивности варьировал от 1,55 до 6,40) без увеличения в динамике, косвенно свидетельствующие о перенесенной ВГЧ-6В-инфекции и отсутствии активного процесса на момент обследования. При этом в образцах сыворотки крови отца женщины AT-IgG к АГ ВГЧ-6А/В не обнаружены (коэффициент позитивности 0,15), что указывало на отсутствие данных, лабораторно подтверждающих инфицирование его экзогенным ВГЧ-6А/В.

Результаты исследования приведены в Таблице 4. Результаты выявления и количественного определения специфических маркеров ВГЧ-6А-инфекции у членов семьи с наследственной передачей хиВГЧ-6А.

За время динамического наблюдения (13 месяцев) при повторных клинических обследованиях отклонения в состоянии здоровья женщины, ее сына и отца не выявлены. Лабораторных данных, подтверждающих реактивацию наследуемого хиВГЧ-6А или первичное заражение экзогенным ВГЧ-6А/В, не получено. У мальчика: психомоторное развитие за первый год жизни соответствовало возрастной норме; в крови: длительно абсолютная нейтропения, тромбоцитоз, не имевшие клинических эквивалентов. Значение нейтрофилов, тромбоцитов и размер тимуса нормализовались самостоятельно к 11-и месячному возрасту. Специфической противовирусной терапии пациенты не получали. За весь период наблюдения хронические соматические или инфекционные заболевания у них не зафиксированы. Зарегистрированы лишь острые респираторные заболевания, протекавшие без осложнений, и с частотой, не превышающей популяционную.

Данный пример демонстрирует случай выявления и лабораторного подтверждения хиВГЧ-6А-статуса у членов одной семьи в трех поколениях (от отца дочери и внуку).

ХиВГЧ-6А, передаваемый по наследству, верифицирован на основании определения ДНК вируса методом ПЦР-РВ в образцах цельной крови, ногтевых пластин и волосяных фолликулов в концентрациях, соответствующих референсным значениям, а именно: в образцах цельной крови - от 4,77 до 5,37 lg копий ДНК ВГЧ-6А/В/10⁵ клеток; в образцах ногтевых пластин - не менее 4,91 lg копий ДНК ВГЧ-6А/В/10⁵ клеток, в образцах волосяных фолликулов - не менее 4,70 lg копий ДНК ВГЧ-6А/В/10⁵ клеток.

Лабораторное подтверждение хиВГЧ-6А-статуса явилось обоснованием для исключения активной инфекции, вызванной ВГЧ-6А и проведения излишней противовирусной терапии.

Пример. 3. Пациент (мальчик, 2 года 5 месяцев) с лабораторно неподтвержденным хиВГЧ-6А/В-статусом впоследствии, имеющий значения концентрации ДНК ВГЧ-6 В в образцах цельной крови - 3,75 lg копий/10⁵ клеток, ногтевых пластин и волосяных фолликулов - не обнаружено.

Ребенок (2016 г.р.) поступил в инфекционное отделение с жалобами на повышение температуры до 39,7°С в течение двух дней, насморк, судороги. На вторые сутки лихорадки на фоне 39,5°С отмечались тонико-клонические судороги на протяжении нескольких минут, купировавшиеся самостоятельно, выраженная мраморность кожи.

При клиническом осмотре: состояние средней тяжести, вялый, аппетит снижен, кожные покровы чистые, бледные; температура 40,6°С, полилимфадения. Зев гиперемирован, небные миндалины увеличены до 1-2 размера, чистые. Лимфоузлы шейных групп (задне- и передне-шейные), надключичные, подмышечные увеличены до 12 мм, до 2-3 в группе, мягкой, эластичной консистенции, безболезненные при пальпации. Дыхание через нос умеренно затруднено, выделений нет. Над легкими - жесткое, хрипов нет, ЧДД 28 уд./мин. Тоны сердца звучные, ритмичные, ЧСС 120 уд./мин. Язык умеренно обложен белым налетом, живот мягкий, безболезненный при пальпации по ходу кишечника. Печень выступает из-под края реберной дуги на 2 см по средне-ключичной линии, край мягкий острый, селезенка не увеличена. Стул 1 раз в день оформленный, мочеиспускание не нарушено.

Результаты клинического анализа крови мальчика при поступлении представлены в Таблице 5. Результаты клинического анализа крови мальчика (2 года 5 месяцев) при поступлении в инфекционное отделение. Общий анализ мочи при поступлении - без патологии.

При обследовании выявлена ДНК ВГЧ-6В методом ПЦР-РВ в цельной крови в концентрации 3,75 lg копий/10⁵ клеток (лабораторный маркер активной ВГЧ-6А/В-инфекции) при отсутствии AT-IgG к AT ВГЧ-6А/В в сыворотке крови.

Принято решение о необходимости исключении хиВГЧ-6А/В-статуса у пациента. Для этого дополнительно исследованы образцы ногтевых пластин и волосяных фолликулов ребенка методом ПЦР-РВ в количественном формате. А также проведено клинико-лабораторное обследование его четырех ближайших родственников: биологических родителей, родных сестры и брата (условно здоровы, жалоб не предъявляли, показатели общего и биохимического анализов крови - в пределах диапазона референсных значений, общий анализ мочи - без патологии), включающее выявление ДНК ВГЧ-6А/В в образцах цельной крови, ногтевых пластин и волосяных фолликулов методом ПЦР-РВ в количественном формате. Результаты лабораторного обследования представлены в Таблице 6. Результаты выявления и количественного определения специфических маркеров ВГЧ-6А/В-инфекции у членов семьи без наследственной передачи хиВГЧ-6А/В.

Видовая идентификация вируса - ВГЧ-6В - определена на основании данных, полученных при использовании метода массового параллельного секвенирования.

На третьи сутки пребывания в отделении у пациента после нормализации температуры тела отмечалось появление на теле обильной пятнисто-папулезной сыпи. На фоне проводимой в отделении комплексной терапии самочувствие ребенка улучшилось, выписан на 7-й день заболевания в удовлетворительном состоянии.

При повторном лабораторном обследовании мальчика (через 21 день после окончания проведенного курса комплексной терапии): ДНК ВГЧ-6А/В (ПЦР-РВ) в образцах цельной крови, ногтевых пластин и волосяных фолликулов не выявлена, в сыворотке крови обнаружены AT IgG к АГ ВГЧ-6А/В методом ИФА (коэффициент позитивности 4,36).

Данный пример демонстрирует развитие у мальчика в возрасте 2 года 5 месяцев характерной клинической формы первичной инфекции (внезапная экзантема, ринит, фебрильный судорожный приступ), вызванной ВГЧ-6В, подтвержденной лабораторно с применением прямых (выявление ДНК вируса (ПЦР-РВ) в цельной крови) и косвенных (обнаружение сероконверсии AT IgG к АГ ВГЧ-6А/В (ИФА) при исследовании парных образцов сыворотки крови) методов диагностики.

Несмотря на выявление высокой концентрации ДНК вируса (3,75 lg копий/10⁵ клеток) в цельной крови при первичном обследовании хиВГЧ-6А/В-статус не подтвержден, что обосновано отсутствием ДНК вируса в образцах ногтевых пластин и волосяных фолликулов, а также снижением ее концентрации в крови до неопределяемого уровня. Учтено, что у ближайших родственников ребенка (4 человека) хиВГЧ-6А/В-статус не выявлен. Своевременное исключение хиВГЧ-6В-статуса у ребенка и верификация у него острой (первичной) ВГЧ-6В-инфекции явились основанием для назначения адекватной противовирусной терапии, приведшей к полному клиническому выздоровлению пациента.

Таким образом, заявляемый способ позволяет своевременно и точно выявить и лабораторно подтвердить хромосомно-интегрированный ВГЧ-6А или ВГЧ-6В, передаваемый по наследству, как у детей, так и взрослых.

1. Способ выявления и лабораторного подтверждения наследуемого хромосомно-интегрированного вируса герпеса человека 6А/В, включающий количественное определение ДНК вируса герпеса человека 6А/В (ВГЧ-6А/В) в образцах биологического материала пациента, при котором определяют концентрацию ДНК ВГЧ-6А/В в образце цельной крови и по меньшей мере в одном из образцов ногтевых пластин или волосяных фолликулов, где:

(a) выявление в образце цельной крови ДНК ВГЧ-6А/В в концентрации от 4,77 до 5,37 lg копий/10⁵ клеток, а также

выявление в образце ногтевых пластин ДНК ВГЧ-6А/В в концентрации не менее 4,91 lg копий/10⁵ клеток, в образце волосяных фолликулов - не менее 4,70 lg копий/10⁵ клеток позволяет судить о наличии наследуемого хромосомно-интегрированного вируса герпеса человека 6А/В;

(b) выявление в образце цельной крови ДНК ВГЧ-6А/В в концентрации менее 4,77 или более 5,37 lg копий/10⁵ клеток, а также

выявление в образце ногтевых пластин ДНК ВГЧ-6А/В в концентрации менее 4,91 lg копий/10⁵ клеток, в образце волосяных фолликулов - менее 4,70 lg копий/10⁵ клеток позволяет исключить наличие наследуемого хромосомно-интегрированного вируса герпеса человека 6А/В.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что определение концентрации ДНК ВГЧ-6А/В в образцах биологического материала пациента производят методом полимеразно-цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов анализа в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ).