Способ скрининга потенциальных лекарственных средств для лечения болезни паркинсона на основе анализа повреждений митохондриальной днк мух дрозофил (drosophila melanogaster)
Владельцы патента RU 2743138:
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ скрининга потенциальных лекарственных средств для лечения болезни Паркинсона на основе анализа повреждений митохондриальной ДНК мух дрозофил, включающий забор биологического материала, выделение ДНК, определение количественного уровня повреждений митохондриальной ДНК методом ПЦР в реальном времени при температуре элонгации 66,1±0,5°С с использованием Encyclo-полимеразы, соответствующего ей Encyclo-буфера, сравнение количественного уровня повреждений митохондриальной ДНК опытных и контрольной групп, отличающийся тем, что предварительно осуществляют содержание в течение 7 дней двух опытных групп D. melanogaster на питательной среде, включающей ротенон в концентрации 100 мкМ, для одной из опытных групп, получавшей также испытуемое лекарственное средство в течение 7 дней, содержание в питательной среде лекарственного средства определяют экспериментально, так, чтобы количество ротенон-индуцированных повреждений мтДНК было снижено не менее чем на 70%, содержание контрольной группы осуществляют на питательной среде без добавления ксенобиотика, а также лекарственного средства, умерщвление испытуемых мух реализуют по истечении 7 дней эксперимента, ДНК выделяют из гомогената мух, ПЦР проводят в течение 4,5 минут с парами праймеров, имеющими последовательности согласно Перечню последовательностей - SEQ ID NO: 1-16, выявляют генопротекторные свойства испытуемого вещества при снижении числа повреждений мтДНК по меньшей мере на 30% у опытной группы, принимающей испытуемое лекарственное средство, чем у опытной группы, содержавшейся на питательной среде с ротеноном. 3 ил., 1 пр.
Настоящее изобретение относят к биотехнологии. Данное изобретение может быть использовано для исследования генопротекторных свойств различных химических веществ, потенциально обладающих терапевтическим эффектом в лечении болезни Паркинсона.
На сегодняшний день основным подходом к лечению болезни Паркинсона является симптоматическое лечение, поскольку еще не было разработано тех средств, которые способны в полной мере устранить причину возникновения этой патологии. Единственным примером препарата, используемого в современной клинической практике, является леводопа. Опыт использования леводопы в лечении болезни Паркинсона показывает его недостаточную эффективность.
В связи с этим, существует необходимость в разработке новых и более эффективных лекарственных средств, направленных на устранение непосредственных причин этой патологии. Болезнь Паркинсона, являясь нейродегенеративным заболеванием, происходит преимущественно за счет накопления клетками активных форм кислорода, что в конечном итоге приводит к нарушению митохондриального биогенеза, и, как следствие, гибели нейронов. Способность лекарственного средства поддерживать митохондриальных баланс, защищая клетки от окислительного стресса, - лежит в основе разработки современных лекарственных препаратов, направленных на лечение данной патологии. Для того, чтобы оценить степень влияния того или иного вещества на митохондриальный биогенез и оценить фармакологическую эффективность данного вещества, необходимо разработать способы скрининга широкого спектра соединений на доступном модельном объекте. Таковым является D. melanogaster. Их экономическим преимуществом является существенно более низкая стоимость в сравнении с другими модельными объектами. Стоимость тысячи особей D. melanogaster является существенно более низкой в сравнении со стоимостью меньшего количества особей других классических модельных объектов, таких как мыши линии C57BL/6 и крысы линии Wistar.
При всей доступности и простоте своего содержания D. melanogaster обладают гемато-энцефалическим барьером и проявляют схожую с болезнью Паркинсона симптоматику, обусловленную разрушением дофаминэргических нейронов. Это делает использование данного модельного объекта более рациональным и по сравнению с клеточными культурами, недостатком которых является невозможность корректно воспроизвести реальные процессы транспорта веществ в живом организме.
Показательным маркером окислительного стресса является митохондриальная ДНК. Классическими методами определения повреждений в ДНК является саузерн блоттинг и высокоэффективная жидкостная хроматография, имеющие ряд ограничений. В частности, эти методы требуют высокого количества ДНК в исследуемом фрагменте (Furda, A.M., Bess, A.S., Meyer, J.N., Van Houten, B. (2012). Analysis of DNA damage and repair in nuclear and mitochondrial DNA of animal cells using quantitative PCR. Methods Mol. Biol. 920, 111-132), это также затрудняет проведение анализа для дрозофил в силу того, что выделение необходимого количества ДНК для данного вида является проблематичным. Альтернативой данному методу является определение повреждений путем проведения ПЦР длинных фрагментов (Chan, S.W., Chen, J.Z. (2009). Measuring mtDNA damage using a supercoilingsensitive qPCR approach. Methods Mol. Biol. 554, 183-197; Maslov, A.Y., Ganapathi, S., Westerhof, M., Quispe-Tintaya, W., White, R.R., Van Houten, В., Reiling, E., Dolle, M.E., van Steeg, H., Hasty, P., Hoeijmakers, J.H., Vijg,J. (2013). DNA damage in normally and prematurely aged mice. Aging Cell 12, 467-477). Тем не менее, проведение анализа на основе данной методики также имеет ряд трудностей.
Во-первых, использование только одного или двух ампликонов не позволяет с точностью определить, какие из фрагментов митохондриального генома более подвержены повреждениям. Во-вторых, затруднен подсчет количества повреждений, поскольку данный метод предусматривает обнаружение одного повреждения на 10-кб фрагмент одной копии мтДНК, даже если этот фрагмент поврежден неоднократно. Существует также вариант оценки повреждений ДНК с использованием rTth-полимеразы и Трицин-буфера (патент №РФ 2213782 (C12Q1/68, опубл. 10.10.2003), но данный способ возможен при использовании фрагментов ДНК длиной более 5000 пн, что также нерационально применять к D. melanogaster. Эти трудности могут быть преодолены при использовании Encyclo-полимеразы для амплификации фрагментов длиной не более 2334 пн (Rothfuss, О., Gasser, Т., Patenge, N. (2010). Analysis of differential DNA damage in the mitochondrial genome employing a semi-long run real-time PCR approach. Nucleic Acids Res. 38, e24). Прототипом данного изобретения является способ определения генотоксичности ксенобиотиков на основе анализа повреждений митохондриальной ДНК земляного шмеля (Bombus terrestris) (патент №РФ 2663719 (C12Q1/68, опубл. 08.08.2018)), предусматривающий следующие стадии:
1. Проведение кормления земляных В. terrestris тестируемым ксенобиотиком на протяжении суток;
2. Забор биологического материала и выделение ДНК из грудных мышц шмеля;
3. Определение количественного уровня повреждений митохондриальной ДНК методом ПЦР в реальном времени при температуре элонгации 66,1±0,5°С в течение 5 минут с использованием Encyclo-полимеразы, соответствующего Encyclo-буфера и других стандартных компонентов реакции с парами праймеров, имеющих определенные последовательности;
4. Сравнение количественного уровня повреждений митохондриальной ДНК экспериментальной и контрольной группы.
Данный метод был оптимизирован для митохондриальной ДНК D. melanogaster, поскольку АТ-состав их мтДНК составляет 82,2%, в то время, как у В. terrestris он составляет 85,0%. Кроме того, длина митохондриального генома D. melanogaster составляет 19524 п. н., а у В. terrestris он составляет 17400 п. н. Также в предложенном способе выше процент покрытия праймерами генома составляет 57,0%, в то время, как в методике, рассматриваемой для В. terrestris этот показатель составляет 35,7%.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа скрининга генопротекторных свойств веществ, потенциально являющихся эффективными для лечения болезни Паркинсона, на основе анализа повреждений митохондриальной ДНК.
Технический результат заключается в возможности скрининга генопротекторных свойств потенциальных лекарственных средств для лечения болезни Паркинсона при сравнительно недорогой и высокочувствительной методике анализа повреждений митохондриальной ДНК мух дрозофил D. Melanogaster методом ПЦР в реальном времени.
Технический результат достигается тем, что в способе скрининга потенциальных лекарственных средств для лечения болезни Паркинсона на основе анализа повреждений митохондриальной ДНК мух дрозофил, включающем забор биологического материала, выделение ДНК, определение количественного уровня повреждений митохондриальной ДНК методом ПЦР в реальном времени при температуре элонгации 66,1±0,5°С с использованием Encyclo-полимеразы, соответствующего ей Encyclo-буфера, сравнение количественного уровня повреждений митохондриальной ДНК опытных и контрольной группы, согласно изобретению, предварительно осуществляют содержание в течение семи дней двух опытных групп D. melanogaster на питательной среде, включающей ротенон в концентрации 100 мкМ, для одной из опытных групп, получавшей также испытуемое лекарственное средство в течение 7 дней, содержание в питательной среде лекарственного средства определяют экспериментально, так, чтобы количество ротенон-индуцированных повреждений мтДНК было снижено не менее, чем на 70%, содержание контрольной группы осуществляют на питательной среде без добавления ксенобиотика, а также лекарственного средства, умерщвление испытуемых мух реализуют по истечении 7 дней эксперимента, ДНК выделяют из гомогената мух, ПЦР проводят в течение 4,5 минут с парами праймеров, имеющими последовательности согласно Перечню последовательностей - SEQ ID NO: 1-16, выявляют генопротекторные свойства испытуемого вещества при снижении числа повреждений мтДНК по меньшей мере на 30% у опытной группы, принимающей испытуемое лекарственное средство, чем у опытной группы, содержавшейся на питательной среде с ротеноном.
Последовательности праймеров SEQ ID NO: 1-16 для определения количества повреждений в митохондриальной ДНК D. melanogaster и числа ее копий приведены в Перечне последовательностей.
На фиг. 1. приведена электрофореграмма ПЦР-продукта, где по оси абсцисс темным шрифтом выделены номера исследуемых фрагментов, 1К и 2К - короткие фрагменты. Светлым шрифтом указана температура элонгации. Длина ПЦР-продукта приведена по оси ординат. По оси абсцисс приведены исследуемые фрагменты. По оси ординат приведено количество повреждений.
На фиг. 2 представлен состав реакционной среды для проведения полимеразной цепной реакции.
На фиг. 3 представлено количество повреждений в шести фрагментах мтДНК D. melanogaster, индуцированных 100 мкМ ротенона.
Метод ПЦР длинных фрагментов основывается на том, что наличие повреждений в ДНК (одноцепочечных разрывов, модифицированных оснований или их аддуктов) препятствует работе ДНК-полимеразы, тем самым препятствуя накоплению ПЦР-продукта. Исходя из этого, скорость накопления ПЦР-продукта обратно пропорциональна числу молекул с повреждениями. В основе метода лежит подбор оптимального набора праймеров и последующей амплификации интересующего участка молекулы ДНК для выявления повреждений в их структуре. Критерием оптимального подбора праймеров является полная специфичность к таргентному участку мтДНК. При этом, геном исследуемого объекта имеет высокий АТ-состав, в связи с чем при подборе праймеров возникают трудности. В результате был разработан набор праймеров, включающий в себя шесть пар праймеров длиной от 1689 до 2087 п. н. Также были подобраны две пары праймеров длиной 167 и 171 п. н.
В связи с тем, что митохондриальный геном D. melanogaster обладает повышенным АТ-составом, оптимальная температура элонгации составляет 66,1±0,5°С. Температура элонгации выше этого значения приводит к накоплению неспецифических продуктов реакции и общему снижению эффективности ПЦР.
Пример.
В исследовании задействованы три испытуемые группы:
1. Опытная группа, на которую воздействовали ротеноном, предполагаемым лекарственным средством.
2. Опытная группа, на которую воздействовали только ротеноном.
3. Контрольная группа.
Изобретение реализуется следующим образом:
Для инициации митохондриальных повреждений кормили группу из 10 мух дрозофила ротеноном, вносимым в их питательную среду, содержащей 1 литр воды, 8,9 г агара, 60 г дрожжевой биомассы, 20 г манной крупы, 20 г сахарозы, 2 мл пропионовой кислоты. Ротенон является слабо токсичным для человека и млекопитающих, но является чрезвычайно токсичным для насекомых. Ротенон вносился в среду в концентрации 100 мкМ, не являющейся летальной, но повреждающий генетический аппарат митохондрий исследуемого объекта. Для группы испытуемых, получавшей также лекарственное средство, его дозировка устанавливается экспериментально. Критерием оптимальной концентрации действующего вещества является такой, при котором количество ротенон-индуцированных повреждений мтДНК снижается как минимум на 70%.
Испытуемых мух умерщвляли спустя одну неделю после начала эксперимента. Выделение ДНК осуществлялось из гомогената мух путем его последовательной очистки с использованием коммерческого набора при помощи сорбционных колонок.
При проведении ПЦР в реальном времени использовалась реакционная среда, имеющая состав, приведенный на фиг. 2. Данные приведены из расчета на одну реакцию.
Протокол реакции:
Предварительная денатурация - 95°С, 3 минуты;
Денатурация в начале цикла - 95°С, 15 секунд;
Отжиг праймеров - 59°С, 30 секунд;
Элонгация - 66°С, 4 минуты 30 секунд;
Количество циклов - 35.
Расчет количества повреждений митохондриальной ДНК был произведен по формуле, приведенной ниже:
где, 10 Kb - 10000 пар нуклеотидов, Cq - значение порогового цикла ПЦР, Δкор=Cq короткого таргетного фрагмента - Cq короткого контрольного фрагмента, Δдлин=Cq длинного таргетного фрагмента - Cq длинного контрольного фрагмента.
Смертность дрозофил в группах, получавших ротенон, отсутствовала.
Наибольшее количество (4,6±0,4/10 кб) повреждений было отмечено в гене ND2, который связан с первым комплексом ЭТЦ (электрон-транспортной цепи). В меньшей степени отмечались (1,8±0,2/10 кб) повреждения генов 16S и 12S, связанных с рРНК, а также 0,7±0,2/10 кб повреждений на участке работы праймера, покрывающего гены ND4L, ND5 и CytB. На других участках мтДНК повреждений отмечено не было (фиг. 3). Данный метод позволяет проводить скрининг веществ, обладающих генопротекторными свойствами, потенциально являющимися эффективными для лечения болезни Паркинсона, на основе анализа ротенон-индуцированных повреждений митохондриальной ДНК.
Отрицательное значение количества повреждений может быть связано с расслаблением суперспиральной конформации мтДНК, в результате чего она становится более доступной для полимеразы, в результате чего увеличивается эффективность ПЦР и при перерасчете возникает отрицательное количество повреждений.
В качестве лекарственного препарата использовали метиленовый синий. Он является одним из наиболее перспективных лекарств для терапии нейродегенеративных заболеваний. Это возможно благодаря высокой липофильности метиленового синего, которая позволяет ему проникать через гематоэнцефалический барьер и мембраны митохондрий (J.С. Neurometabolic mechanisms for memory enhancement and neuroprotection of methylene blue / J.C. Rojas A.K. Bruchey, F. GonzalezLima // Prog. Neurobiol - 2012. - Vol. 96. - P. 32-45.), где он проявляет свойства редокс-компонента электрон-транспортной цепи за счет того, что может окислять NADH и переносить электроны на нижестоящие компоненты ЭТЦ.
Испытуемой группе вносили раствор метиленового синего в количестве 100 мкМ. Так, в гене ND2 количество повреждений снизилось на 59%, а в генах 16S и 12S - на 7%.
Для реализации предложенного анализа необходим термоциклер с системой детекции флюоресценции для ПЦР в реальном временем, центрифуга, камера для электрофореза и сопутствующие реактивы, и расходные материалы.
Способ является высокочувствительным, хорошо воспроизводимым и сравнительно недорогим.
Способ скрининга потенциальных лекарственных средств для лечения болезни Паркинсона на основе анализа повреждений митохондриальной ДНК мух дрозофил, включающий забор биологического материала, выделение ДНК, определение количественного уровня повреждений митохондриальной ДНК методом ПЦР в реальном времени при температуре элонгации 66,1±0,5°С с использованием Encyclo-полимеразы, соответствующего ей Encyclo-буфера, сравнение количественного уровня повреждений митохондриальной ДНК опытных и контрольной групп, отличающийся тем, что предварительно осуществляют содержание в течение 7 дней двух опытных групп D. melanogaster на питательной среде, включающей ротенон в концентрации 100 мкМ, для одной из опытных групп, получавшей также испытуемое лекарственное средство в течение 7 дней, содержание в питательной среде лекарственного средства определяют экспериментально, так, чтобы количество ротенон-индуцированных повреждений мтДНК было снижено не менее чем на 70%, содержание контрольной группы осуществляют на питательной среде без добавления ксенобиотика, а также лекарственного средства, умерщвление испытуемых мух реализуют по истечении 7 дней эксперимента, ДНК выделяют из гомогената мух, ПЦР проводят в течение 4,5 минут с парами праймеров, имеющими последовательности согласно Перечню последовательностей - SEQ ID NO: 1-16, выявляют генопротекторные свойства испытуемого вещества при снижении числа повреждений мтДНК по меньшей мере на 30% у опытной группы, принимающей испытуемое лекарственное средство, чем у опытной группы, содержавшейся на питательной среде с ротеноном.
