Способ получения стволовых клеток

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению стволовых клеток. Способ включает извлечение сразу после ампутации костного мозга из прижизненно ампутированной конечности пациента механическим путем, с применением ложки Фолькмана или вакуумного аспиратора, для чего после обработки краев места ампутации при применении вакуумного аспиратора вводят канюлю через канал полости бедренной кости, к ней присоединяют вакуумный аспиратор, если он не был соединен заранее, затем отжимают кнопки на клапане вакуумного аспиратора для начала отсоса через канюлю, при этом вращают канюлю и перемещают ее на себя. При наполнении вакуумного аспиратора и прекращении отсоса нажимают кнопки клапана и отсоединяют канюлю от аспиратора, оставляя при этом канюлю внутри костномозговой полости. Затем вакуумный аспиратор заменяют или опорожняют, поле чего снова создают вакуум и подсоединяют аспиратор к канюле. По завершении извлечения вакуумный аспиратор отсоединяют от канюли и вытаскивают канюлю из бедренной полости, опорожняют содержимое вакуумного аспиратора в емкость. Сразу после извлечения костного мозга из него выделяют как гемопоэтические, так и мезенхимальные стволовые клетки. Изобретение позволяет получить путем механического извлечения гемопоэтические и мезенхимальные стволовые клетки из костного мозга ампутированной конечности пациента в количестве (в сравнении с пункцией), достаточном для проведения успешной клеточной терапии пациента с вынужденно ампутированной конечностью без иммунологического конфликта и необходимости культивирования СК. 1 табл.

 

Изобретение относится к клеточным технологиям, а именно к способам получения стволовых клеток из костного мозга бедренной кости ампутированной конечности человека прижизненно.

Ни один из существующих на данный момент источников стволовых клеток (СК) человека или способов их получения не может полностью обеспечить потребности исследователей и требования клиницистов. Получение взрослых СК ассоциировано с применением инвазивных, травмирующих, болезненных для донора (не без риска осложнений у пациента) и, что немаловажно, дорогостоящих процедур. Все это, безусловно, ограничивает экспериментальные исследования СК человека и тормозит внедрение клеточных технологий в клиническую практику. Ампутированную конечность, полученную в результате вынужденной операции, можно рассматривать как один из наиболее доступных источников стволовых клеток, как гемопоэтических (ГСК), так и мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Способность к дифференцировке в различные клеточные типы делает МСК перспективными с точки зрения возможного использования для клеточной терапии целого ряда приобретенных и наследственных заболеваний. При введении в системный кровоток МСК способны целенаправленно мигрировать в участок поражения.

Известно, что универсальным источником стволовых клеток является костный мозг. Для получения стволовых клеток из костного мозга необходима пункция костного мозга, как правило, используют пункцию подвздошных костей (Руководство по лабораторной гематологии / Б. Сисла; пер. с англ. под общ. ред. А.И. Воробьева - М.: Практическая медицина, 2011. - 352 с.).

Однако пункция костного мозга у больных связана с определенными трудностями: небольшой объем полученного материала; низкое содержание стволовых клеток (не более 0,001%); нежелание пациента подвергаться данной процедуре; возможные осложнения в результате пункции.

Наиболее близким к заявленному решению (прототипом) является способ получения стволовых клеток из костного мозга путем его извлечения из человеческой ткани, описанный в статье Machalinski В., et al. Morphological analysis of the bone and after disconnecting from respirator // Annals of transplantation. Vol. 6, №4, 2001. P. 48-52, abstract, PudMed. В указанной статье описан метод забора гемопоэтических клеток из костного мозга, полученного пункцией из подвздошных костей трупов человека.

Недостатками прототипа являются следующее:

1. Исследование проводилось на подвздошных (плоских) костях трупов человека. Использование извлеченного из костного мозга трупов стволовых клеток для трансплантации и/или генной терапии может быть осуществлено только на основании иммунологической совместимости донора и реципиента. Как показывает клиническая практика, реципиенты после такой трансплантации вынуждены на протяжении всей жизни применять препараты, подавляющие иммунные реакции; их отмена приводит к развитию реакций отторжения чужеродных органов или тканей в любые сроки после операции. Таким образом, костный мозг, извлеченный из органов трупов, по вышеназванным причинам в терапии таких больных использовать нежелательно - это может привести к необратимым реакциям и гибели больного.

2. Низкое количество стволовых клеток для проведения клеточной терапии. В следствии чего, для их увеличения проводилось культивирование клеток (длительностью до 2-3 недель). Получение СК, как правило, связано с необходимостью наращивания клеточной массы. Культивирование стволовых клеток, часто приводит к снижению их качества и, следовательно, к нежелательным побочным эффектам.

3. Костный мозг длительно находился в состоянии гипоксии от 3 часов и больше, это приводит к уменьшению количества клеток, началу их деструкции и снижению качества клеток.

4. Исследование проводилось только на гемопоэтических стволовых клетках.

Для заявленного способа выявлены основные общие с прототипом существенные признаки, такие как: способ получения стволовых клеток, включающий извлечение костного мозга из человеческой ткани с последующим выделением из него гемопоэтических стволовых клеток.

Техническими проблемами изобретения являются:

1. Сокращение времени способа получения стволовых клеток;

2. Повышение безопасности для жизни пациента;

3. Достижение максимально полного извлечения костного мозга и получения из него достаточного количества гемопоэтических и мезенхимальных стволовых клеток для клеточной терапии.

Поставленные технические проблемы решаются способом получения стволовых клеток, включающим извлечение костного мозга из человеческой ткани с последующим выделением из него гемопоэтических стволовых клеток. После ампутации костный мозг сразу извлекают из прижизненно ампутированной конечности пациента механическим путем, с применением ложки Фолькмана или вакуумного аспиратора, для чего после обработки краев места ампутации при применении вакуумного аспиратора вводят канюлю через канал полости бедренной кости, к ней присоединяют вакуумный аспиратор, если он не был соединен заранее, затем отжимают кнопки на клапане вакуумного аспиратора для начала отсоса через канюлю. При этом вращают канюлю и перемещают ее на себя. При наполнении вакуумного аспиратора и прекращении отсоса нажимают кнопки клапана и отсоединяют канюлю от аспиратора, оставляя при этом канюлю внутри костномозговой полости. Затем вакуумный аспиратор заменяют или опорожняют, поле чего снова создают вакуум и подсоединяют аспиратор к канюле. По завершении извлечения вакуумный аспиратор отсоединяют от канюли и вытаскивают канюлю из бедренной полости. Опорожняют содержимое вакуумного аспиратора в емкость. Сразу после извлечения костного мозга из него выделяют как гемопоэтические, так и мезенхимальные стволовые клетки.

Способ осуществляется следующим образом.

После вынужденной ампутации (например, у пациентов с гангреной стопы на фоне сахарного диабета, после ДТП и прочее) нижней конечности пациента в операционной необходимо сразу получить костный мозг. В условиях операционной обеспечивается необходимая стерильность. Для чего из просвета прижизненно ампутированной конечности (например, бедренной кости), сразу после ампутации, например, ложкой Фолькмана (если ампутируется конечность на уровне нижней трети части бедра) в стерильную емкость извлекают костный мозг, который сразу транспортируется в лабораторию, где из костного мозга в течение не более 1 часа выделяют гемопоэтические и мезенхимальные стволовые клетки.

При ампутации на уровне средней или верхней трети части бедра сложно извлечь костный мозг в полном объеме. Чтобы достигнуть максимально полного извлечения костного мозга используется мануальный вакуумный аспиратор (например, модель Ipas MVA Plus и ему подобные). Данный аспиратор используется в гинекологии при аспирации содержимого матки, но его механизм действия позволяет использовать его для извлечения костного мозга из бедренной кости в следующей последовательности:

1. После обработки краев бедренной кости (место ампутации) осторожно вводят канюлю через канал полости бедренной кости не повреждая ткань костного мозга. Осторожное надавливание вглубь совместно с вращением канюли облегчает ее введение. Затем производят последующее медленное введение канюли, пока она не коснется костной ткани эпифиза бедренной кости, затем канюлю слегка вытаскивают;

2. Надежно и неподвижно удерживая канюлю за основание одной рукой, к ней присоединяют (с адаптером, если необходимо) заранее приготовленный вакуумный аспиратор, в котором уже создан вакуум. Необходимо убедится, что канюля не продвинулась вглубь в процессе присоединения аспиратора. Второй рукой удерживают вакуумный аспиратор за тело клапана. Затем основание канюли осторожно сдвигают в вакуумный аспиратор, при этом слегка его вращая. В качестве альтернативного варианта канюля может быть присоединена к вакуумному аспиратору до введения канюли в полость бедренной кости;

3. Отжимают кнопки на клапане вакуумного аспиратора для начала отсоса через канюлю. Кровь, костная ткань и пузырьки должны начать проходить через канюлю;

4. Для эвакуации содержимого бедренной кости вращают канюлю перемещая поршень вакуумного аспиратора на себя, усиливая вакуумное давление;

5. Если при проведении эвакуации содержимого полости бедренной кости вакуумный аспиратор наполнился и отсос прекратился, нажимают кнопки клапана и отсоединяют канюлю от аспиратора. Оставляют канюлю внутри костномозговой полости. Заменяют вакуумный аспиратор или опорожняют его, затем снова создают вакуум и подсоединяют аспиратор к канюле. По завершении операции вращая вакуумный аспиратор отсоединяют его от канюли;

6. После завершения операции по эвакуации содержимого бедренной кости, когда полость опорожнена, нажимают кнопки на клапане и вытаскивают канюлю из бедренной полости. Отсоединяют канюлю от вакуумного аспиратора. Канюля может быть вытащена и без нажимания кнопок клапана;

7. Для опорожнения содержимого вакуумного аспиратора в соответствующую емкость отжимают кнопки клапана, сжимают распорные плечи поршня и продвигают его внутрь цилиндра до конца.

При этом пациент не подвергается дополнительным процедурам, в частности, пункции.

Объем костного мозга зависит от уровня ампутации, которая может быть на уровне нижней трети бедра, средней или на уровне верхней трети бедра. Соответственно, наибольшее количество костного мозга и, соответственно, клеточного материала можно получить при ампутации конечности на уровне верхней трети бедра (Machalinski В., et al. Morphological analysis of the bone and after disconnecting from respirator // Annals of transplantation. Vol. 6, №4, 2001. P. 48-52, abstract, PudMed). Например, у больного сахарным диабетом терапия направлена на сохранение второй конечности и компенсации сахарного диабета, для чего требуются значительные терапевтические дозы стволовых клеток, содержащихся в костном мозге.

Процентное содержание ГСК и МСК в костном мозге показано в таблице 1. (на основании исследования 40 образцов костного мозга из ампутированной конечности).

Применение для клеточной терапии ГСК и МСК является наиболее перспективным на данном этапе развития клинической науки, так как оно позволяет избежать этических и иммунных проблем, связанных с трансплантацией клеток от донора к реципиенту. Гемопоэтические и мезенхимальные стволовые клетки уже на протяжении трех десятилетий используются для лечения пациентов с онкологическими, гематологическими и другими заболеваниями. Активно разрабатываются подходы к применению трансплантации СК при лечении заболеваний, которые до последнего времени считались неизлечимыми с помощью традиционных подходов. Применение клеточных технологий в клиническую практику является актуальной задачей современной медицины.

Первые трансплантации (гемопоэтических клеток костного мозга) провели еще в середине прошлого века, и многие пациенты живы до сих пор. В последние годы особенно важны для клеточной терапии МСК, так как они универсальны, практически не отторгаются и могут применяться для различных пациентов. Сейчас такие трансплантации исчисляются тысячами в год, и их эффективность доказана. В том числе, ежегодно появляются новые результаты клинических исследований, в которых демонстрируется эффективность использования стволовых клеток при лечении различных заболеваний.

Техническими результатами заявленного способа являются:

1. Получение путем механического извлечения гемопоэтических и мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга ампутированной конечности пациента в количестве (в сравнении с пункцией), достаточном для проведения успешной клеточной терапии пациента с вынужденно ампутированной конечностью без иммунологического конфликта и необходимости культивирования СК;

2. Техническая простота и скорость взятия материала;

3. Более полное извлечение костного мозга из ампутированной конечности;

4. Исключение нежелательных побочных эффектов при клеточной терапии пациента.

Способ получения стволовых клеток, включающий извлечение костного мозга из человеческой ткани с последующим выделением из него гемопоэтических стволовых клеток, отличающийся тем, что после ампутации сразу костный мозг извлекают из прижизненно ампутированной конечности пациента механическим путем, с применением ложки Фолькмана или вакуумного аспиратора, для чего после обработки краев места ампутации при применении вакуумного аспиратора вводят канюлю через канал полости бедренной кости, к ней присоединяют вакуумный аспиратор, если он не был соединен заранее, затем отжимают кнопки на клапане вакуумного аспиратора для начала отсоса через канюлю, при этом вращают канюлю и перемещают ее на себя; при наполнении вакуумного аспиратора и прекращении отсоса нажимают кнопки клапана и отсоединяют канюлю от аспиратора, оставляя при этом канюлю внутри костномозговой полости; затем вакуумный аспиратор заменяют или опорожняют, поле чего снова создают вакуум и подсоединяют аспиратор к канюле, по завершении извлечения вакуумный аспиратор отсоединяют от канюли и вытаскивают канюлю из бедренной полости; опорожняют содержимое вакуумного аспиратора в емкость, сразу после извлечения костного мозга из него выделяют как гемопоэтические, так и мезенхимальные стволовые клетки.