Способ определения полиморфизма гена рецептора меланокортина 4 (mc4r), ассоциированного с мясными и откормочными качествами свиней
Владельцы патента RU 2745902:
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста" (RU)
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам определения полиморфизма генов, в частности гена рецептора меланокортина 4 (MC4R), ассоциированного с мясными и откормочными качествами свиней. Технический результат предлагаемого изобретения достигается тем, что предложен способ определения полиморфизма G→А G→A в позиции 2207 гена MC4R (Asp298Asn)(номер GenBank FJ357500), ассоциированного с мясными и откормочными качествами свиней, включающий ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени, где аллелю G соответствуют кривые флуоресценции на канале FAM, а аллелю А - кривые флуоресценции на канале R6G. 2 ил., 1 пр.
Изобретение относится к молекулярной генетике, а именно к способам определения полиморфизма генов, в частности гена рецептора меланокортина 4 (MC4R), ассоциированного с мясными и откормочными качествами свиней, и может быть использовано в рамках проведения маркерной селекции.
Поиск и идентификация ДНК-маркеров, ассоциированных с показателями продуктивности сельскохозяйственных животных, приобретает особую актуальность в связи с интенсификацией отраслей животноводства [Молекулярные методы в диагностике заболеваний и наследственных дефектов сельскохозяйственных животных / Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., Костюнина О.В., Быкова А.С, Банникова А.Д., Кудина Е.П., Брем Г. // Зоотехния. - 2009. - №8. - с. 26-27; Роль ДНК-маркеров признаков продуктивности сельскохозяйственных животных / Зиновьева Н.А., Костюнина О.В., Гладырь Е.А., Банникова А.Д., Харзинова В.Р., Ларионова П.В., Шавырина К.М., Эрнст Л.К. // Зоотехния. - 2010. - №1. - с. 8-10]. Один из главных генов, определяющих уровень развития продуктивных признаков свиней, - ген рецептора меланокортина 4 (MC4R), представляющий собой один из пяти идентифицированных рецепторов меланокортина, которые являются семидоменными трансмембранными рецепторами, сопряженными с G-белками, расположенными в ядрах гипоталамуса [Molecular cloning of anovel melanocortin receptor / I. Gantz, Y. Konda, T. Tashiro et al. // Journal of Biological Chemistry. - 1993. - V. 268 (11). - P. 8246-8250].
Ген рецептора меланокортина 4 у свиней расположен на хромосоме 1 (SSCI) в участке q22-q27. Влияние полиморфизма гена MC4R широко изучалось на признаках: потребление корма, рост, развитие и упитанность свиней. Экспрессия рецептора MC4R происходит в той области мозга, которая регулирует аппетит, влияет на потребление корма и баланс энергии. Мутация G→A, обуславливающая замену Asp298Asn в аминокислотной последовательности впервые была выявлена Kim K.S. с соавторами [А missense variant of porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene is associated with fatness, growth, and feed intake traits / K.S. Kim, N. Larsen, T. Short, G. Plastow, M.F. Rothschild // Mammalian Genome. - 2000. - V. 11. - P. 131-135].
Функциональный анализ этой мутации показал дефектную передачу сигнала мутантного белка MC4R (298 Asn) к аденилатциклазе в мембране нейтральных клеток, что обуславливает пониженный внутриклеточный уровень АМФ после корректного связывания лиганда с рецептором [Functional and phylogenetic analyses of a melanocortin-4 receptor mutation in domestic pigs / K.S. Kim, J.M. Reecy, W.H. Hsu, L.L. Anderson, M.F. Rothschild // Domestic Animal Endocrinology. - 2004. - V. 26. - P. 75-86]. Последствием мутации в гене MC4R является нарушение проведения лептинового сигнала, который посредством обратной отрицательной связи регулирует секрецию клеток жировой ткани, что в свою очередь приводит к нарушению липидного обмена и изменению процесса формирования признаков, характеризующих мясные и откормочные качества свиней [Степень влияния гена MC4R на фенотип организма / Л.В. Гетманцева / Тезисы докладов XVIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2011». -Москва. - 2011. - С. 89].
В качестве экономически значимой в свиноводческой промышленности данная мутация стала рассматриваться в Бельгии, где в качестве отцовской породы часто используется медленно растущая порода свиней пьетрен.
Изучение зависимости между полиморфизмом MC4R и выходом мяса в тушах, потреблением корма и увеличением живой массы свиней, Chen М. и соавторы [Different allele frequencies of MC4R gene variants in Chinese pig breeds / M. Chen, A. Wang, J. Fu, N. Li // Archiv fuer Tierzucht Dummerstorf. - 2004. - V. 47(5). - P. 463-468], Kim K.S. и соавторы [Association of melanocortin 4 receptor (MC4R) and high mobility group AT -hook 1 (HMGA1) polymorphisms with pig growth and fat deposition traits / K.S. Kim, J.J. Lee, H.Y. Shin, B.H. Choi, C.K. Lee, J.J. Kim, B.W. Cho, Т.Н. Kim // Animal Genetics. - 2006. - V. 37(4). - P. 419-421] и Meidther K. и коллеги [Association of the melanocortin 4 receptor with feed intake and daily gain in F2 Mangalitsa × Pietrain pigs / K. Meidther, A.K. Wermter, A. Hinney, H. Remschmidt, J. Hebebrand, R. Fries // Animal Genetics. - 2006. - V. 37(3). - P. 245-247] показали, что ген MC4R может быть использован в качестве генетического маркера для этих признаков в селекции животных. Van den Maagdenberg K. и коллеги [The Asp298Asn missense mutation in the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene can be used to affect growth and carcass traits without an effect on meat quality / K. Van den Maagdenberg, A. Stinckens, E. Claeys, M. Seynaeve, A. Clinquart, M. Georges, N. Buys, S. De Smet // Animal. - 2007. - V. 1 (8). - P. 1089-1098] обнаружили, что мутация в гене рецептора меланокортина влияет на увеличение массы туши и упитанности свиней, но не оказывает влияния на качество мяса.
и коллеги [Effect of mutation in MC4R gene on carcass quality in Pulawska pig included in conservation breeding programmer / 
M. Tyra, T. Blicharski, K. Piorkowska // Animal Science Papers and Reports. - 2010. - Vol. 28 (1). - P. 37-45] сообщали, что свиньи с генотипом АА гена MC4R характеризуются большим количеством жира по сравнению со свиньями с генотипом GG гена MC4R. Было описано значительное влияние аллеля А гена MC4R на повышение упитанности туш у ландраса, крупной белой породы, помесей крупная белая × дюрок [А missense variant of porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene is associated with fatness, growth, and feed intake traits / K.S. Kim, N. Larsen, T. Short, G. Plastow, M.F. Rothschild // Mammalian Genome. - 2000. - V. 11. - P. 131-135; Candidate gene analysis for quantitative traits using the transmission disequilibrium test: the example of the melanocortin-4 receptor in pigs / J. Hernandez-Sanchez, P. Visscher, G. Plastow, C. Haley // Genetics. - 2003. - V. 164. - P. 637-644], ландрас × лантанг [Different allele frequencies of MC4R gene variants in Chinese pig breeds / M. Chen, A. Wang, J. Fu, N. Li // Archiv fuer Tierzucht Dummerstorf. - 2004. -V. 47(5). - P. 463-468] и гемпшир × ландрас [Evaluation of the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene as a positional candidate for a fatness QTL in a cross between Landrace and Hampshire / C.S. Bruun, C.B. Jorgensen, V.H. Nielsen, L. Andersson, M. Fredholm // Animal Genetics. - 2006. - V. 37(4). - P. 359-362]. Влияние полиморфизма гена рецептора меланокортина 4 на увеличение упитанности туш было также обнаружено у свиней породы дюрок [Association of melanocortin 4 receptor (MC4R) and high mobility group AT -hook 1 (HMGA1) polymorphisms with pig growth and fat deposition traits / K.S. Kim, J.J. Lee, H.Y. Shin, B.H. Choi, C.K. Lee, J.J. Kim, B.W. Cho, Т.Н. Kim // Animal Genetics. - 2006. - V. 37(4). - P. 419-421], и у шести линий свиней крупной белой породы английского происхождения [A melanocortin-4 receptor (MC4R) polymorphism is associated with performance traits in divergently selected Large White pig populations / R.D. Houston, N.D. Cameron, K.A. Rance // Animal Genetics. - 2004. - V. 35(5). - P. 386-390]. Исследование Van den Maagdenberg K. и соавторов [The Asp298Asn missense mutation in the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene can be used to affect growth and carcass traits without an effect on meat quality / K. Van den Maagdenberg, A. Stinckens, E. Claeys, M. Seynaeve, A. Clinquart, M. Georges, N. Buys, S. De Smet // Animal. - 2007. - V. 1 (8). - P. 1089-1098] на помесных свиньях крупной белой × пьетрен, ландрас × крупная белая подтвердили, что мутация в гене рецептора меланокортина 4 оказывает существенное влияние на упитанность. Анализ влияния аллеля А гена MC4R показал, что этот аллель связан с меньшим количеством мяса в области шеи и затылка [Effect of mutation in MC4R gene on carcass quality in Pulawska pig included in conservation breeding programmer / M. Tyra, T. Blicharski, K. Piorkowska // Animal Science Papers and Reports. - 2010. - Vol. 28 (1). - P. 37-45].
Литературные данные о влиянии полиморфизма MC4R на продуктивные показатели неоднозначны. Однако, выявлено довольно заметное влияние данного полиморфизма на среднесуточный прирост живой массы, потребление корма, рост мышц, содержание жира в туше и длину туши [Melanocortin-4 receptor (MC4R) genotypes have no major effect on fatness in a Large White × Wild Boar intercross / H.B. Park, 
L. Marklund, L. Andersson // Animal Genetics. - 2002. - V. 33. - P. 155-157; Candidate gene analysis for quantitative traits using the transmission disequilibrium test: the example of the melanocortin-4 receptor in pigs / J. Hernandez-Sanchez, P. Visscher, G. Plastow, C. Haley // Genetics. - 2003. -V. 164. - P. 637-644; A melanocortin-4 receptor (MC4R) polymorphism is associated with performance traits in divergently selected Large White pig populations / R.D. Houston, N.D. Cameron, K.A. Rance // Animal Genetics. - 2004. - V. 35(5). - P. 386-390; An effect of a missense mutation in the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene on production traits in Polish pig breeds is doubtful / M. Stachowiak, M. Szydlowski, M. Obarzanek -Fojt, 
// Animal Genetics. - 2006. - V. 37(1). - P. 55-57; Evaluation of the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene as a positional candidate for a fatness QTL in a cross between Landrace and Hampshire / C.S. Bruun, C.B. Jorgensen, V.H. Nielsen, L. Andersson, M. Fredholm // Animal Genetics. - 2006. -V. 37(4). - P. 359-362; Association of a melanocortin 4 receptor (MC4R) polymorphism with performance traits in Lithuanian White pigs / R. Jokubka, S. Maak, S. Kerziene, H.H. Swalve // Journal of Animal Breeding and Genetics. - 2006. - V. 123. - P. 12-22].
Результаты некоторых исследователей показывают, что аллель А является желательным для повышения откормочных и мясных качеств свиней, но в случае, когда целью селекции является снижение толщины шпика предпочтителен аллель G [Effect of mutation in MC4R gene on carcass quality in Pulawska pig included in conservation breeding programmer / M. Tyra, T. Blicharski, K. Piorkowska // Animal Science Papers and Reports. - 2010. - Vol. 28 (1). - P. 37-45].
Доказан существенный эффект мутации в данном гене на потребление корма, что в свою очередь оказывало влияние на толщину шпика и скорость роста: различия составили 5-8%. Причем, действие полиморфизма на указанные признаки проявлялось практически во всех изученных коммерческих линиях. Полученные результаты позволяют предположить, что аллель, связанный с высокой скоростью роста, обуславливает повышенную мраморность [A missense variant of porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene is associated with fatness, growth, and feed intake traits / K.S. Kim, N. Larsen, T. Short, G. Plastow, M.F. Rothschild // Mammalian Genome. - 2000. - V. 11. - P. 131-135].
Коллектив авторов под руководством Kim K.S. [Association of melanocortin 4 receptor (MC4R) and high mobility group AT -hook 1 (HMGA1) polymorphisms with pig growth and fat deposition traits / K.S. Kim, J.J. Lee, H.Y. Shin, В.Н. Choi, C.K. Lee, J.J. Kim, B.W. Cho, Т.Н. Kim // Animal Genetics. - 2006. - V. 37(4). - P. 419-421] изучали комплексное действие полиморфизмов в генах рецептора меланокортина 4 (MC4R) и высокомобильной группы белков 1 (HMGA1) у свиней породы дюрок и для обоих генов установили аддитивное действие на признаки среднесуточного прироста и мясности. Максимальные различия от эффекта комплексных генотипов составили: по толщине шпика 2 мм, по среднесуточному приросту 70 г/день и по содержанию мяса в туше 2%.
Лядский И.К. и сотрудники [Связь Asp298Asn полиморфизма гена MC4R с толщиной спинного сала у свиней крупной белой породы / И.К. Лядский, А.А. Гетя, К.Ф. Почерняев // Цитология и генетика. - 2011. - V. 45. - №2. - С. 52-56] исследовали связь Asp298Asn-полиморфизма гена MC4R с развитием такого признака, как толщина хребтового шпика у свиней крупной белой породы популяции АФ «Оржицкая» (Украина). Ими обнаружена тенденция формирования более тонкого хребтового шпика у животных с генотипом AG. Достоверной разницы по его толщине у групп животных с различным генотипом гена MC4R, обусловленным Asp298Asn-полиморфизмом, установлено не было.
Salajpal K. с соавторами [Effect of MC4R polymorphism on physsiological stress response in pigs / K. Salajpal, 
D. Karoly, 
B. Liker // Agriculture: Scientific and Professional Review. - 2007. - V. 1. - P. 46-50] изучали влияние полиморфизма MC4R на свиньях двух кроссов: (дюрок×шведский ландрас)×пьетрен (n=25) и (шведский ландрас×крупная белая)×пьетрен (n=21). Ими установлено, что генотип по MC4R оказывал существенное влияние на толщину шпика, измеренную в области m. gluteus medius, а также на мясность туши в процентах (р<0,05). Гомозиготные GG особи характеризовались меньшей толщиной шпика и более высокой мясностью по сравнению с гетерозиготными особями, что полностью согласуется с ранее полученными результатами эффекта аллеля G гена MC4R на толщину шпика [A missense variant of porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene is associated with fatness, growth, and feed intake traits /K.S. Kim, N. Larsen, T. Short, G. Plastow, M.F. Rothschild // Mammalian Genome. - 2000. - V. 11. - P. 131-135; Candidate gene analysis for quantitative traits using the transmission disequilibrium test: the example of the melanocortin-4 receptor in pigs / J. Hernandez-Sanchez, P. Visscher, G. Plastow, C. Haley // Genetics. - 2003. - V. 164. - P. 637-644; A melanocortin-4 receptor (MC4R) polymorphism is associated with performance traits in divergently selected Large White pig populations / R.D. Houston, N.D. Cameron, K.A. Rance // Animal Genetics. - 2004. - V. 35(5). - P. 386-390] и статистически значимом снижении толщины шпика в ряду GG>AG>AA [Association of a melanocortin 4 receptor (MC4R) polymorphism with performance traits in Lithuanian White pigs / R. Jokubka, S. Maak, S. Kerziene, H.H. Swalve // Journal of Animal Breeding and Genetics. - 2006. - V. 123. - P. 12-22]. При этом сила влияния генотипа по MC4R носит породоспецифичный характер.
В подавляющем большинстве исследований, выполненных как на чистопородных животных, синтетических линиях свиней, так и на двух-, трех- и четырехпородных кроссах, имеет место следующее соотношение генотипов MC4R по скорости роста: AA>GG [Изучение полиморфизма ДНК-маркеров и их влияния на показатели мясной и откормочной продуктивности свиней различных пород и кроссов / А.Н. Левитченков // Дисс. канд. биол. наук. - Дубровицы. - ВИЖ. - 2009. - 108 с]. По толщине шпика рядом авторов установлена зависимость AA>GG и AG>GG. В некоторых исследованиях обнаружена обратная связь (AA<GG) или не выявлено каких-либо зависимостей между генотипами по MC4R и уровнем развития данного признака. Таким образом, влияние генотипа по MC4R проявляется по-разному в зависимости от породной принадлежности свиней.
В качестве прототипа заявленного способа, наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату, можно считать выявление полиморфизма MC4R с использованием метода ПЦР с последующим рестрикционным гидролизом образующегося фрагмента (анализа ПДРФ - полиморфизма длин амплифицированных фрагментов) [Kim, K.S. Rapid communication: Linkage and physical mapping of the porcine melanocortin-4 receptor (MC4R) gene / K.S. Kim, N.J. Larsen, M.F. Rothshild // J.Anim. Sci. - 2000. - V. 78. - P. 791-792], использование которого подразумевает проведение ПЦР-ПДРФ анализа, что сопряжено с использованием эндонуклеаз рестрикции и последующее разделение продуктов в агарозном геле. Несмотря на относительную дешевизну данного способа, данный способ характеризуется большей трудоемкостью и продолжительностью генотипирования. Отличие нашего способа заключается в выявлении полиморфизма MC4R с использованием метода ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на приборе QuantStudio 5 («Thermo Fisher Scientific», США). Данный способ характеризуется меньшей трудоемкостью и позволяет идентифицировать генотипы в течение 2 часов.
Следует отметить, что простота нашего способа определения полиморфизма MC4R на основе ПЦР-РВ, позволит использовать его в селекционной практике с целью идентификации животных, являющихся носителями благоприятных генетических вариантов.
Суть разработанной тест-системы основана на использовании двух специфических праймеров MC4R-TM-F и MC4R-TM-R и двух аллель-специфичных зондов, помеченных флуоресцентными метками. Зонд, предназначенный для идентификации аллеля А, ассоциированного с мясными и откормочными качествами у свиней, помечен красителем R6G, а зонд для идентификации аллеля G помечен красителем FAM.
Способ отличается тем, что с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, затрат сил и времени методов, возможно выявление желательного аллеля А гена MC4R, что позволит применить данный метод в селекции животных.
При создании настоящего изобретения задача состояла в разработке способа обнаружения аллеля А гена MC4R, ассоциированного с мясными и откормочными качествами у свиней, с целью идентификации носителей желательных генетических вариантов и разработки программ их использования в селекции.
Задача нашего изобретения - создание способа идентификации полиморфизма в гене MC4R, ассоциированного с мясными и откормочными качествами свиней, и может быть использовано в рамках проведения маркерной селекции.
Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ диагностики полиморфизма в гене MC4R, ассоциированного с мясными и откормочными качествами свиней, для использования в селекции свиней, включающий метод полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Система основана на использовании двух специфических праймеров MC4R-TM-F и MC4R-TM-R и двух аллель-специфичных зондов, помеченных флуоресцентными метками. Зонд, предназначенный для идентификации аллеля А, ассоциированного с мясными и откормочными качествами у свиней, помечен красителем R6G, а зонд для идентификации аллеля G помечен красителем FAM. Это обеспечит снижение трудоемкости, увеличение производительности, возможности использования реагентов отечественного производства, относительно невысокую стоимость разрабатываемого способа.
Способ отличается тем, что с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, затрат сил и времени методов, возможно выявление желательного аллеля А гена MC4R, что позволит применить данный метод в селекции животных.
Сущность изобретения - определение полиморфизма гена MC4R, ассоциированного с мясными и откормочными качествами свиней, методом ПЦР-РВ.
Разрабатываемый способ базируется на определении нуклеотидной замены G→А в позиции 2207 гена MC4R (Asp298Asn). С этой целью был выбран участок гена MC4R с мутацией, обуславливающей желательный генетический вариант. В электронной базе была найдена нуклеотидная последовательность интересующего нас участка ДНК (номер GenBank FJ357500).
Тест-система предусматривает амплификацию в режиме реального времени фрагмента длиной 226 п.о., содержащего область мутации, с использованием двух специфических праймеров MC4R-TM-F ТТС ССС TGA ТТТ ТТТ ССТ CAG ТТС TTG GCT СС и MC4R-TM-R ATT АСС CTG АСС АТС TTG ATT G и двух аллель-специфичных зондов, окрашенных красителями FAM MC4R-ТМ - TCG ATG ATG GAA ТТА САС AT и R6G MC4R-ТМ - TTG ATG ATG GAA ТТА САС AT.
Дизайн тест-системы представлен на Фиг. 2А.
Для создания серии референтных образцов с известными генотипами по MC4R, (n=96) из проб ткани (ушной выщип, n=48 (хряки) и n=.48 (свиноматки) выделяли ДНК: по 24 образца каждого из видов биоматериала методом экстракции перхлоратом с использованием магнитных частиц (ООО «Изоген», Россия) и по .24 образца - с использованием колонок Nexttec (Nexttec Biotechnologie GmbH, Германия) в соответствии с рекомендациями производителей. Референтные генотипы генерировали посредством прямого определения последовательности в области мутации методом пиросеквенирования, предусматривающего амплификацию фрагмента длиной 226 п.о., содержащего область мутации, с использованием двух специфических праймеров P-MC4R For (5' - ТАС ССТ GAC CAT СТТ GAT TG - 3') и P-MC4R Rev (5' - ATA GCA АСА GAT GAT CTC ТТТ G - 3', биотинилирован на 3'-конце) с последующим пиросеквенированием с использованием секвенирующего праймера Seq MC4R (5' - GTG ТАА ТТС CAT CAT С - 3').
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - теоретическая модель тест-системы определения полиморфизма гена рецептора меланокортина 4 - MC4R на основе метода ПЦР с последующим пиросеквенированием (А) и результаты генотипирования референтных образцов (В).
На фиг. 1А представлены теоретически смоделированные гистограммы возможных генотипов MC4R, где на верхнем рисунке гистограмма соответствует генотипу АА, на среднем - AG и на нижнем - GG. На фиг. 1В представлены результирующие пикограмма последовательности гена GBP1 в области исследуемой мутации соответствующая генотипу ТТ, на фиг. 1В - результирующие пикограммы последовательности MC4R в области исследуемой мутации, где на верхнем рисунке пикограмма соответствует генотипу АА, на среднем - AG и на нижнем - GG.
В результате проведенного генотипирования была создана серия референтных образцов (n=96), в том числе 23 образца с генотипом GG (нежелательный по мясным и откормочным качествам), 32 образца с генотипом AG (гетерозиготный), 40 образцов с генотипом АА (желательынй по мясным и откормочным качествам).
Определение полиморфизма MC4R предложенным способом выполняли следующим образом:
1. исходя из локализации мутации были подобраны два специфических праймера:
MC4R-TM-F ТТС ССС TGA ТТТ ТТТ ССТ CAG ТТС TTG GCT СС
MC4R-TM-R АТТ АСС CTG АСС АТС TTG ATT G.
2. исходя из последовательности гена, были подобраны два аллель-специфичных зонда, окрашенные красителями:
MC4R-ТМ - /6-FAM/- TCG ATG ATG GAA ТТА САС AT -/BHQ-1/
MC4R-ТМ - /R6G/- TTG ATG ATG GAA ТТА САС AT -/BHQ-1/.
Фиг. 2А иллюстрирует описанный выше вариант настоящего изобретения.
3. реакции проводили в 15 мкл реакционной смеси следующего состава: 1×ПЦР буфер (16.6 мМ (NH4)2SO4, 67.7 мМ Трис-HCl, рН=8.8, 0.1% (v/v) Tween 20, 1.5 мМ MgCl2), 0,2 мМ дНТФ, 10 пмоль каждого из праймеров, 2 мМ MgCl2, 1 Ед Taq-полимеразы и 1 мкл ДНК при следующем температурно-временном режиме: 1 цикл - 95°С 5 мин, 44 цикла последовательно - 94°С -45 с., 62°С - 45 с., 72°С - 45 с., заключительная элонгация при 72°С - 8 мин;
4. определение аллелей А и G гена MC4R осуществляли методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени, где аллелю G соответствуют кривые флуоресценции на канале FAM, а аллелю А - кривые флуоресценции на канале R6G. (Фиг. 2Б);
5. Результативность разработанной тест-системы оценивали посредством сравнения результатов генотипирования референтных образцов.
Пример. Контрольное использование предложенного способа определения полиморфизма гена MC4R было апробировано на 250 свиньях породы крупная белая. Исследование выявило частоту генотипов АА, AG и GG - 42,8; 40,3 и 16,9%%, соответственно. Таким образом, разработанный способ может быть использован для выявления животных, являющихся носителями желательного аллеля А гена MC4R, ассоциированного с мясными и откормочными качествами свиней.
Предложенный способ применим в генетике сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма гена MC4R свиней, ассоциированного с мясными и откормочными качествами, с целью последующего использования полученных результатов в разведении и селекции свиней.
Способ диагностики полиморфизма гена MC4R, ассоциированного с мясными и откормочными качествами свиней методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени, где аллелю G соответствуют кривые флуоресценции на канале FAM, а аллелю A – кривые флуоресценции на канале R6G, суть которого заключается в определении нуклеотидной замены G→A в позиции 2207, номер GenBank FJ357500, гена MC4R посредством амплификации фрагмента, содержащего область мутации, с использованием двух специфичных праймеров: ТТС ССС TGA ТТТ ТТТ ССТ CAG ТТС TTG GCT СС и ATT АСС CTG АСС АТС TTG ATT G и двух аллель-спецефичных зондов, окрашенных красителями FAM и R6G в режиме реального времени.
