Способ выделения лектина бобов солодки гладкой
Владельцы патента RU 2746424:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Астраханский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к способу выделения лектина бобов солодки гладкой, в котором высушенные и измельченные бобы солодки смешивают с буфером Трис-HCl и инкубируют полученную смесь при постоянном перемешивании, затем центрифугируют указанную смесь с получением осадка и надосадочной жидкости, отбрасывают полученный осадок и используют надосадочную жидкость для преципитации лектина бобов солодки гладкой 75-80% насыщения сульфата аммония с получением осадка, который подвергают гидрофобной хроматографии и высокоэффективной хроматографии на обращено-фазном носителе силисорб С-8 в градиенте ацетонитрила, и при концентрации ацетонитрила от 35 до 39% получают чистый препарат лектина бобов солодки гладкой. 4 ил., 2 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно биохимии, и может быть использовано, в частности, для выделения лектина бобов солодки гладкой.
В практике известен способ получения обогащенной лектином бобов солодки гладкой фракции, основанный на экстракции растительного сырья специальным кальциево-магниевым буфером. Этим буферным раствором заливали приготовленное и высушенное растительной сырье в соотношение 1 : 5 в темные склянки, смесь постоянно перемешивали при температуре 20°С в течение 10 дней для экстракции биологически активных веществ (Сухенко Л.Т. Дикорастущие растения флоры юга России как источник ценных фитокомпонентов с противомикробными и биорегуляторными свойствами Дисс. доктора биол.наук. Астрахань 2012).
Недостатками этого способа являются:
- низкая чистота продукта,
- низкая эффективность и невысокий выход продукта;
- длительность проведения;
Целью представленного изобретения является повышение степени очистки и ускорение способа очистки лектина бобов солодки гладкой.
Указанный технический результат достигается тем, что выделение проводят, используя водно-солевой экстракт измельченных бобов солодки гладкой, а на последующих стадиях проводят преципитацию 75-80% сульфатом аммония, гидрофобную хроматографию и высокоэффективную хроматографию на обращеннофазном носителе силосорб С-8 в градиенте ацетонитрила и при концентрации ацетонитрила от 35 до 39% получают чистый препарат лектина бобов солодки гладкой.
Степень очистки лектина составила 117, а выход более 52 %. Всего из 1кг сухого порошка бобов солодки гладкой получено 523,0мг лектина, который до дальнейшего использования хранился при -24°С.
В доступной нам литературе способа очистки лектина бобов солодки гладкой до гомогенного состояния не известно.
Для выделения лектина собирали плоды солодки гладкой, которые созревают в конце августа, сентябре. Именно бобы солодки гладкой, по аналогии с горохом, фасолью и др. растениями наиболее богаты углеводсвязывающими протеинами [Гаммерман, А.Ф. Лекарственные растения. /А.Ф. Гаммерман. - М.: Высшая школа. - 1990. - 453с.], как показали гемагглютинационные тесты. Использовалось 1000 г высушенной и измельченной массы бобов солодки, собранной в сентябре 2017 г. в Красноярском районе Астраханской области. Химикаты и реагенты, используемые в работе, были аналитической степени чистоты. На первой стадии очистки высушенные и измельченные бобы солодки гладкой смешивали с 10 mM Tris-HCl, буфер pH 7,4 в соотношении 1:1, и инкубировали в течение 560-600 минут, при постоянном перемешивании. Далее указанную смесь центрифугировали в течение 20-30 минут при 8000 об/мин. Образовавшийся осадок отбрасывали. Полученную надосадочную жидкость использовали на следующей стадии очистки.
На второй стадии выделения лектина бобов солодки гладкой использовали надосадочную жидкость. Нами обнаружена способность лектина бобов солодки гладкой преципитировать в растворе сульфата аммония при 75-80% насыщения. Осадок проявлял гемагглютинирующую активность а надосадочная жидкость нет. Сущность поясняется рисунками, где:
Фиг.1. Гемагглютинационная активность лектина бобов солодки гладкой. Концентрация белка в лунках Ц выровнена до уровня 160 мкг / мл.
К(вертикальный ряд)-отрицательный контроль. Ряд 1-надосадочная жидкость после преципитации 80% насыщения сульфата аммония;
Ряд 2- осадок после преципитации 80% насыщения сульфата аммония;
Ряд 3 – очищенный препарат лектина бобов солодки гладкой;
Ряд 4 – исходный водно-солевой экстракт бобов солодки гладкой.
Фиг.2. Очистка лектина солодки гладкой. Гидрофобная хроматография бутирил-Toyoperl. Фракция 1 проявляет гемагглютинирующую активность.
Фиг.3. Обращеннофазная высокоэффективная жидкостная хроматография лектина бобов солодки гладкой. Колонка силосорб С-8 115,0х3,5 мм Элюцтя 0.1% ТФУ и градиент ацетонитрила от 0 до 60%. Пик 5 проявляет гемагглютинирующую активность.
Фиг.4. Электрофорез в полиакриламидном геле. А – водно-солевой экстракт бобов солодки гладкой; Б – фракция после осаждения сульфатом аммония из водно-солевого экстракта; В – Очищенный препарат лектина бобов солодки гладкой.
На третьей стадии осадок, полученный осаждением 75-80% сульфатом аммония подвергали гидрофобной хроматографии на бутирил-тойоперле в линейном градиенте сульфата аммония от 2М до 0 и далее промывка 0,1% тритоном Х-100. Фракции, проявлявшие гемагглютинационную активность, собирали и объединяли
На четвертой, заключительной стадии осуществлялась окончательная очистка лектина бобов солодки гладкой высокоэффективной жидкостной хроматографией на обращено-фазном носителе силосорб С8 в градиенте ацетонитрила. Лектин солодки гладкой, обладающий гемагглютинирующей активностью выходит во фракциях, соответствующих концентрации ацетонитрила от 35до 39%.
Далее в таблице 1. показаны этапы очистки лектина бобов солодки гладкой. Предложенный нами способ дает возможность получить электрофоретически чистый препарат лектина бобов солодки гладкой, повышает эффективность (повышает выход конечного продукта на 63,5%), сокращает время и упрощает очистку лектина бобов солодки гладкой по сравнению со способом (Сухенко Л.Т. Дикорастущие растения флоры юга России как источник ценных фитокомпонентов с противомикробными и биорегуляторными свойствами Дисс. доктора биол. наук, Астрахань 2012). В прототипе лектин бобов солодки гладкой получают в виде обагощенного экстракта, содержащего массу белковых примесей. Главное преимущество предлагаемого способа заключается в получении гомогенного препарата лектина бобов солодки гладкой с высокой степенью чистоты и высокой гемагглютинирующей способностью.
На фиг.4 показано, что препарат лектин бобов солодки гладкой гомогенен при электрофоретическом контроле чистоты.
Ниже приводятся результаты апробации.
Пример №1.
На первой стадии очистки высушенные и измельченные бобы солодки гладкой смешивали с 10 mM Tris-HCl, буфер pH 7,4 в соотношении 1:1, и инкубировали в течение 600 минут, при постоянном перемешивании. Далее указанную смесь центрифугировали в течение 30 минут при 8000 об/мин. Образовавшийся осадок отбрасывали. Надосадочную жидкость использовали на следующей стадии очистки.
На второй стадии выделения лектина бобов солодки гладкой использовали объединенную надосадочную жидкость. Нами обнаружена способность лектина бобов солодки гладкой преципитировать в растворе сульфата аммония при 75% насыщения. Осадок проявлял гемагглютинирующую активность, а надосадочная жидкость нет.
На третьей стадии осадок, полученный осаждением 75% сульфатом аммония подвергали гидрофобной хроматографии на бутирил-тойоперле в линейном градиенте сульфата аммония от 2М до 0 и далее промывка 0,1% тритоном Х-100. Фракции, проявлявшие гемагглютинационную активность, собирали и объединяли.
На четвертой, заключительной стадии осуществлялась окончательная очистка лектина бобов солодки гладкой высокоэффективной жидкостной хроматографией на обращеннофазном носителе силосорб С8 в градиенте ацетонитрила. Лектин солодки гладкой, обладающий гемагглютинирующей активностью выходит во фракциях, соответствующих концентрации ацетонитрила 35%. Полученный элюат диализовали и концентрировали до приемлемого объема (18 мл).
Пример №2
На первой стадии очистки высушенные и измельченные бобы солодки гладкой смешивали с 10 mM Tris-HCl, буфер pH 7,4 в соотношении 1:1, и инкубировали в течение 560 минут, при постоянном перемешивании. Далее указанную смесь центрифугировали в течение 20 минут при 8000 об/мин. Образовавшийся осадок отбрасывали. Надосадочную жидкость использовали на следующей стадии очистки.
На второй стадии выделения лектина бобов солодки гладкой использовали объединенную надосадочную жидкость. Нами обнаруженна способность лектина бобов солодки гладкой преципитировать в растворе сульфата аммония при 80% насыщения. Осадок проявлял гемагглютинирующую активность, а надосадочная жидкость нет.
На третьей стадии осадок, полученный осаждением 80% сульфатом аммония подвергали гидрофобной хроматографии на бутирил-тойоперле в линейном градиенте сульфата аммония от 2М до 0 и далее промывка 0,1% тритоном Х-100. Фракции, проявлявшие гемагглютинационную активность, собирали и объединяли.
На четвертой, заключительной стадии осуществлялась окончательная очистка лектина бобов солодки гладкой высокоэффективной жидкостной хроматографией на обращеннофазном носителе силосорб С8 в градиенте ацетонитрила. Лектин солодки гладкой, обладающий гемагглютинирующей активностью выходит во фракциях, соответствующих концентрации ацетонитрила 39%. Полученный элюат диализовали и концентрировали до приемлемого объема (16 мл).
Предложенный нами способ:
- позволяет получить электрофоретически гомогенный препарат лектина бобов солодки;
- повышает эффективность (повышает выход конечного продукта на 45%),
- сокращает время.
Способ выделения лектина бобов солодки гладкой, в котором высушенные и измельченные бобы солодки смешивают с буфером Трис-HCl и инкубируют полученную смесь при постоянном перемешивании, затем центрифугируют указанную смесь с получением осадка и надосадочной жидкости, отбрасывают полученный осадок и используют надосадочную жидкость для преципитации лектина бобов солодки гладкой 75-80% насыщения сульфата аммония с получением осадка, который подвергают гидрофобной хроматографии и высокоэффективной хроматографии на обращенно-фазном носителе силисорб С-8 в градиенте ацетонитрила, и при концентрации ацетонитрила от 35 до 39% получают чистый препарат лектина бобов солодки гладкой.
