Комбинация bcl-2 ингибитора и mcl-1 ингибитора, их применения и фармацевтические композиции

Авторы патента:

САНГХАВИ Снеха (US)

МИСТРИ Пракаш (CH)

ЖЕНЕСТ Оливье (FR)

ХАЛИЛОВИЧ Энсар (US)

МУДЖАЛЛЕД Дония (AU)

МАРАНЬО Ана Летисия (FR)

ПОМИЛИО Джованна (AU)

МОРРИС Эрик (US)

ПОРТЕР Дейл (US)

КЛАПЕРОН Одри (FR)

ВЭЙ Эндрю (AU)

ВАН Ючжэнь (US)

МААКЕ Хайко (CH)

A61P35/00 - Противоопухолевые средства

A61K31/5377 - не конденсированные и содержащие дополнительно гетероциклические кольца, например тимолол

A61K31/519 - орто- или пери-конденсированные с гетероциклическими кольцами

A61K31/496 - не конденсированные пиперазины, содержащие дополнительно гетероциклические кольца, например рифампин, тиотиксен

A61K2121/00 - Лекарства и медикаменты для терапевтических, стоматологических или гигиенических целей (изготовление специальных лекарственных форм A61J; химические аспекты или использование материалов для дезодорации воздуха, для дезинфекции или стерилизации или для бандажей, перевязочных средств, впитывающих прокладок или хирургических приспособлений A61L; соединения как таковые C01, C07,C08,C12N; мыла C11D; микроорганизмы как таковые C12N)

Владельцы патента RU 2746705:

ЛЕ ЛАБОРАТУАР СЕРВЬЕ (FR)
НОВАРТИС АГ (CH)

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики, а именно к комбинации для лечения злокачественного новообразования, содержащей: (a) BCL-2 ингибитор, выбранный из: (i) N-(4-гидроксифенил)-3-{6-[((3S)-3-(4-морфолинилметил)-3,4-дигидро-2(1H)-изохинолинил)карбонил]-1,3-бензодиоксол-5-ил}-N-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-1-индолизин карбоксамида, (ii) 5-(5-хлор-2-{[(3S)-3-(морфолин-4-илметил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]карбонил}фенил)-N-(5-циано-1,2-диметил-1H-пиррол-3-ил)-N-(4-гидроксифенил)-1,2-диметил-1H-пиррол-3-карбоксамида или их солей, и (iii) 4-(4-{[2-(4-хлорфенил)-4,4-диметилциклогекс-1-ен-1-ил]метил}пиперазин-1-ил)-N-[(3-нитро-4-{[(оксан-4-ил)метил]амино}фенил)сульфонил]-2-[(1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)окси]бензамида (ABT-199); и (б) MCL1 ингибитор, выбранный из: (iv) (2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-хлор-2-метил-4-[2-(4-метилпиперазин-1-ил)этокси]фенил}-6-(5-фторфуран-2-ил)тиено[2,3-d]пиримидин-4-ил]окси}-3-(2-{[1-(2,2,2-трифторэтил)-1H-пиразол-5-ил]метокси}фенил)пропионовой кислоты, и (v) (2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-хлор-2-метил-4-[2-(4-метилпиперазин-1-ил)этокси]фенил}-6-(4-фторфенил)тиено[2,3-d]пиримидин-4-ил]окси}-3-(2-{[2-(2-метоксифенил)пиримидин-4-ил]метокси}фенил)пропионовой кислоты, или их солей; а также к лекарственному средству, содержащему указанную комбинацию, и к их применению для лечения злокачественных новообразований. Группа изобретений обеспечивает синергетический эффект комбинации. 6 н. и 35 з.п. ф-лы, 17 ил., 24 табл., 13 пр.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к комбинации BCL-2 ингибитора и MCL1 ингибитора. Изобретение также относится к применению указанной комбинации для лечения злокачественного новообразования, в особенности лейкоза, лимфомы, множественной миеломы, нейробластомы и рака легкого, и более специфически острого миелоидного лейкоза, Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза, В-клеточного острого лимфобластного лейкоза, лимфомы из клеток зоны мантии, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы и мелко клеточного рака легкого. Также обеспечиваются фармацевтические препараты, подходящие для введения таких комбинаций.

Предпосылки создания изобретения

Апоптоз представляет собой строго регулируемый путь гибели клеток, который инициируется различными цитотоксическим стимулами, включая онкогенный стресс и химиотерапевтические средства. Было показано, что уклонение от апоптоза является отличительным признаком злокачественного новообразования и что эффективность многих химиотерапевтических средств зависит от активации внутреннего митохондриального пути. Три разные подгруппы белков BCL-2 семейства контролируют внутренний апоптотический путь: (I) проапоптотические ВН3 (BCL-2 гомология 3)-только белки; (II) способствующие выживанию представители, такие как сам BCL-2, BCL-XL, Bcl-w, MCL1 и BCL-2a1; и (III) проапоптотические эффекторные белки ВАХ и BAK (Czabotar и др., Nature Reviews Molecular cell biology 2014 том 15:49-63). Сверхэкспрессия анти-апоптотических представителей BCL-2 семейства наблюдается при многих злокачественных новообразованиях, в особенности при злокачественных заболеваниях системы крови, таких как лимфома из клеток зоны мантии (MCL), фолликулярная лимфома/диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома (FL/D) и множественная миелома (Adams and Cory Oncogene 2007 том 26:1324-1337). Фармакологическое ингибирование анти-апоптотических белков BCL-2, BCL-XL и Bcl-w с помощью разработанных недавно ВН3-миметических лекарственных средств, таких как АВТ-199 и АВТ-263, является терапевтической стратегией для индуцирования апоптоза и вызывает регрессию опухоли при злокачественном новообразовании (Zhang и др., Drug Resist Updat 2007 Vol 10(6):207-17). Тем не менее, проводятся наблюдения и исследования относительно механизмов резистентности к этим лекарственным средствам (Choudhary GS и др., Cell Death and Disease 2015 том 6, e1593; doi:10.1038/cddis.2014.525).

Острый миелоидный лейкоз (AML) представляет собой стремительно развивающееся смертельное злокачественное заболевание крови, возникающее при клоновой трансформации гемопоэтических стволовых клеток, что приводит к параличу нормального функционирования костного мозга и смерти вследствие осложнений от абсолютной панцитопении. AML отвечает за 25% всех лейкозов у взрослых, и самый большой коэффициент заболеваемости наблюдается в Соединенных Штатах Америки, Австралии и Европе (WHO. GLOBOCAN 2012. Estimated cancer incidence, mortality and prevalence worldwide in 2012. International Agency for Research on Cancer). Во всем мире, ежегодно диагностируется приблизительно 88 тыс. новых случаев. AML продолжает сохранять наиболее низкий коэффициент выживаемости из всех лейкозов, с предполагаемым 5-ти летним выживанием только 24%. Несмотря на то, что стандартная терапия для AML (цитарабин в комбинации с антрациклинами) была разработана более 4 десятилетий тому назад, введение успешных нацеленных терапий для этого заболевания остается труднодостижимой целью. Кроме того, остается потребность в возможности лечения без химиотерапии для пациентов с AML. Концепция нацеленной терапии при AML была приостановлена вследствие установления того, что в это заболевание вовлечена мультиклональная иерархия, с быстрым разрастанием лейкемических субклонов в качестве основной причины резистентности к лекарственным средствам и рецидивирования заболевания (Ding L и др., Nature 2012 481:506-10). В недавних клинических исследованиях была показана эффективность BCL-2 ингибиторов для лечения AML (Konopleva М и др., American Society of Hematology 2014:118). Несмотря на то, что эти ингибиторы являются клинически активными, вероятно, что другие представители BCL-2 семейства будут нуждаться в нацеливании для усиления суммарной эффективности при AML. Дополнительно к BCL-2, MCL1 также был идентифицирован в качестве важного регулятора клеточного выживания при AML (Glaser SP и др., Genes & development 2012 26:120-5).

Множественная миелома (ММ) представляет собой редкое и неизлечимое заболевание, которое характеризуется накоплением клонированных плазмоцитов в костном мозге (ВМ) и отвечает за 10% всех злокачественных заболеваний системы крови. В Европе, каждый год регистрируется приблизительно 27 тысяч 800 новых случаев. Благодаря доступности новых средств за последние годы, включая бортезомиб и леналидомид, и трансплантации аутологичных стволовых клеток (ASCT), был улучшен коэффициент выживаемости. Тем не менее, ответная реакция на эти новые средства часто является не долгосрочной и становится очевидной необходимость в новых лечения, в особенности для рецидивирующих / трудноподдающихся лечению пациентов и пациентов с неблагоприятным прогнозом (неблагоприятным цитогенетических профилем). Последние исследования подтверждают перспективную активность BCL-2 ингибиторов в подгруппе пациентов с множественной миеломой (Touzeau С, Dousset С, Le Gouill S, и др. Leukemia. 2014; 28(1):210-212). MCL1 также был идентифицирован в качестве важного регулятора клеточного выживания при множественной миеломе (Derenne S, Monia В, Dean NM, и др. Blood. 2002; 100(1):194-199; Zhang В, Gojo I, Fenton RG. Blood. 2002; 99(6):1885-1893).

Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома (DLBCL) представляет собой наиболее частый тип (25-35%) неходжкинской лимфомы с 24 тыс. новых пациентов /год. DLBCL представляет собой гетерогенное заболевание с свыше двенадцати подтипами, включая двойную-hit/MYC транслокацию, Активированные В-клетки (ABC) и Зародышевый центр В-клеток (GCB). С помощью современной иммунной химиотерапии (R-CHOP) лечат приблизительно 60% пациентов с DLBCL, но для оставшихся 40%, существует незначительный возможный метод лечения и прогноз является плохим. Следовательно, существует значительная медицинская потребность в повышении показателей эффективности лечения и клинических исходов с высоким риском DLBCL, таким как ABC подтип (35% от DLBCL), который проявляет конститутивную активацию способствующего выживанию NF-κB пути.

Нейробластома (NB) представляет собой наиболее часто встречающуюся внечерепную солидную опухоль у новорожденных и детей, составляющую 8%-10% всех опухолей у детей, которая в настоящее время классифицирована на категории низкого, промежуточного или высокого риска. На нее приходится около 15% всех смертельных исходов, связанных со злокачественными новообразованиями, у пациентов детского возраста. Частота NB составляет 10,2 случаев на миллион детей в возрасте до 15 лет, и ежегодно регистрируется около 500 новых случаев. Средний возраст постановки диагноза составляет 22 месяца. Исходы у пациентов с NB улучшаются неизменно в течение последних 30 лет с 5-ти летними коэффициентами выживаемости, возрастающими от 52% до 74%. Тем не менее, по имеющимся оценкам, предполагают, что у 50-60% пациентов в группе высокого риска развивается рецидив, и, вследствие этого, у них наблюдается только незначительное снижение смертности. Медиана времени до рецидива составляет 13,2 месяца, и 73% тех, у которых наступает рецидив, имел возраст 18 месяцев или старше. Взятые в совокупности, NB суммарные коэффициенты выживаемости остаются полностью неприемлемыми (~20% через 5 лет), несмотря на более агрессивные терапии (Colon и Chung, Adv Pediatr 2013 58:297-311). Основными видами лечения являются химиотерапия, хирургическая резекция и/или лучевая терапия. Тем не менее, у многих агрессивных NB развилась резистентность к химиотерапевтическим средствам, что сохраняет достаточно высокой вероятность рецидивирования (Pinto и др., J Clin Oncol 201533:3008-11). Стандартами лечения для NB в зависимости стратификации риска являются часто карбоплатин, цисплатин циклофосфамид, доксорубицин, этопозид, цитокины (GM-CSF и IL2), и винкристин. Ухудшение после исходной ответной реакции на химиотерапию является основной причиной неуспешного лечения, в особенности при высоком риске NB.

Химиорезистентность может развиваться вследствие активации способствующих выживанию BCL-2 белков (например, BCL-2 и MCL1 белков). NB экспрессирует высокие уровни BCL-2 и MCL1 и низкий уровень BCL-XL. Ингибирование BCL-2 сенсибилизирует клетки к гибели и индуцирует NB регрессию опухоли in vivo (Ham и др., Cancer Cell 29:159-172). Антагонизмы BCL-2 и MCL1 восстанавливают химиотерапию при высоком риске NB (Lestini и др., Cancer Biol Ther 2009 8:1587-1595; Tanos и др., ВМС Cancer 2016 16:97). Таким образом, существует сильная целесообразность комбинировать BCL-2 и MCL1 ингибиторы у не леченных ранее или резистентных пациентов.

Настоящее изобретение обеспечивает новую комбинацию BCL-2 ингибитора и MCL1 ингибитора. Полученные результаты свидетельствуют о том, что с развитием эффективных низкомолекулярных нацеленных BCL-2 и MCL1, высоко синергетическая проапоптотическая активность обнаруживается в первичных человеческих AML образцах (Фигура 2А и 17), а также в AML (Фигуры 9, 13 и 14), множественной миеломе (Пример 4), лимфоме (Фигуры 4 и 12), нейробластоме (Фигура 10), T-ALL, B-ALL клеточных линиях (Фигура 11) и в клеточных линиях мелкоклеточного рака легкого (Фигуры 15 (а)-(е)). Нами также было показано, что комбинированное BCL-2 и MCL1 нацеливание in vivo эффективно в переносимых дозах на AML и лимфомных моделях ксенотрансплантатов у мышей и крыс (Фигуры 2, 5, 6, 7, 8 и 16), и существенно повышает время до развития рецидива при AML (Фигуры 2В и 2С). Кроме того, в клоногенных исследованиях, нами было показано, что BCL-2+MCL1 нацеливание специфически токсичное для лейкозогенных клеток, но не для нормальных гемопоэтических стволовых клеток (Фигура 3), в отличие от предшествующих экспериментов нацеливания MCL1 гена у мышей. Перед разработкой этих эффективных и селективных ингибиторов, осуществимость нацеливания обеих BCL-2 и MCL1, остается неопределенной. Предшествующие модели делеций, специфические для клональных линий, указывают на потенциальный риск для сердечной (Wang X и др., Genes & development. 2013; 27(12):1351-1364; Thomas RL и др., Genes & development. 2013; 27(12):1365-1377), гранулоцито/гемопоэтической (Opferman J и др., Science's STKE. 2005; 307(5712):1101; Dzhagalov I и др., Blood. 2007; 109(4):1620-1626; Steimer DA и др., Blood. 2009; 113(12):2805-2815), тимоцитной (Dunkle А и др., Cell Death & Differentiation. 2010; 17(6):994-1002), нейронной (Arbour N и др., Journal of Neuroscience. 2008; 28(24):6068-6078) и печеночной функции (Hikita Н и др., Hepatology. 2009; 50(4):1217-1226; Vick В и др., Hepatology. 2009; 49(2):627-636), что развивается вследствие длительной абляции MCL1. Несмотря на эти потенциальные проблемы, недавно было показано, что еженедельная, два раза в неделю и даже ежедневная (в течение 5 последовательных дней) внутривенная доставка нового потенциального фармакологического ингибитора MCL1 с коротким действием хорошо переносится и активна по отношению к различным злокачественным новообразованиям in vivo, включая AML (Kotschy А и др., Nature. 2016; 538(7626):477-482; WO 2015/097123). Короткий период полужизни MCL1 белка может предоставлять достаточно времени для его регенерации в критических органах, таким образом, предоставляя возможность физиологической толерантности для MCL1 ингибиторов с коротким временем воздействия (Yang Т и др., Journal of cellular physiology. 1996; 166(3):523-536). До настоящего времени, пульсирующее ингибирование BCL-2 и MCL1 имитирует эффект, подобный к действию лекарственного средства, который не был возможен при использовании подходов генетической инженерии. Исследования с использованием BCL-2 и MCL1 ингибиторов в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает экспериментальное подтверждение концепции о том, что прерывистое воздействие для этих лекарственных средств может быть достаточным для запуска апоптоза и клинической ответной реакции для многих высоко чувствительных заболеваний, таких как AML, без сопутствующей токсичности на основные системы органов.

Синергетический эффект нацеливания обоих BCL-2 и MCL1 in vitro и in vivo и нетоксичность на нормальную функцию костного мозга при нацеливании обоих анти-апоптотических белков только была показана с помощью комбинации эффективных низкомолекулярных ингибиторов. Эти аспекты не могут быть предположены вследствие результатов экспериментов нацеливания генов, которые могут предсказать, что MCL1 делеция плохо переносится гемопоэтическими стволовыми клетками.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к комбинации, содержащей (a) BCL-2 ингибитор формулы (I):

где:

X и Y представляют собой атом углерода или атом азота, подразумевается, что они не могут одновременно представлять собой два атома углерода или два атома азота,

A₁ и А₂, вместе с атомами, которые их несут, образуют необязательно замещенный, ароматический или неароматический гетероцикл Het, состоящий из 5, 6 или 7 кольцевых членов, который может содержать, дополнительно к атому азота, представленному с помощью X или с помощью Y, от одного до 3 гетероатомов, независимо выбранных из кислорода, серы и азота, подразумевается, что указанный атом азота может быть замещен группой, представляющей собой атом водорода, линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу или группу -С(О)-O-Alk, где Alk представляет собой линейную или разветвленную (C₁-С₆)алкильную группу,

или A₁ и А₂ независимо друг от друга представляют собой атом водорода, линейный или разветвленный (С₁-С₆)полигалоалкил, линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу или циклоалкил,

Т представляет собой атом водорода, линейную или разветвленную (C₁-С₆)алкильную группу, необязательно замещенную одним - тремя атомами галогена, группу (C₁-C₄)алкил-NR₁R₂, или группу (С₁-С₄)алкил-OR₆,

R₁ и R₂ независимо друг от друга представляют собой атом водорода или линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу,

или R₁ и R₂ образуют с атомом азота, с которым они связаны, гетероциклоалкил,

R₃ представляет собой линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу, линейную или разветвленную (С₂-С₆)алкенильную группу, линейную или разветвленную (С₂-С₆)алкинильную группу, циклоалкильную группу, (С₃-С₁₀)циклоалкил-(С₁-С₆)алкильную группу, где алкильный компонент является линейным или разветвленным, гетероциклоалкильную группу, арильную группу или гетероарильную группу, подразумевается, что один или несколько атомов углерода предшествующих групп, или их возможных заместителей, могут быть дейтерированы,

R₄ представляет собой арильную группу, гетероарильную группу, циклоалкильную группу или линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу, подразумевается, что один или несколько атомов углерода предшествующих групп, или их возможных заместителей, могут быть дейтерированы,

R₅ представляет собой атом водорода или галогена, линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу, или линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкокси группу,

R₆ представляет собой атом водорода или линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу,

R_a, R_b, R_c и R_d, каждый, независимо друг от друга, представляют собой R₇, атом галогена, линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкокси группу, гидрокси группу, линейную или разветвленную (С₁-С₆)полигалоалкильную группу, трифторметокси группу, -NR₇R₇', нитро, R₇-СО-(С₀-С₆)алкил-, R₇-CO-NH-(C₀-C₆)алкил-, NR₇R₇'-CO-(C₀-C₆)алкил-, NR₇R₇'-CO-(C₀-C₆)алкил-O-, R₇-SO₂-NH-(C₀-C₆)алкил-, R₇-NH-CO-NH-(C₀-C₆)алкил-, R₇-O-CO-NH-(C₀-C₆)алкил-, гетероциклоалкильную группу, или заместители одной из частей (R_a,R_b), (R_b,R_c) или (R_c,R_d) образуют вместе с атомами углерода, с которыми они связаны, кольцо, состоящее из 5-7 кольцевых членов, которое может содержать от одного до 2 гетероатомов, выбранных из кислорода и серы, также подразумевается, что один или несколько атомов углерода кольца, определенные ранее в настоящей заявке, могут быть дейтерированы или замещены одной - 3 группами, выбранными из галогена и линейного или разветвленного (С₁-С₆)алкила,

R₇ и R₇' независимо друг от друга представляют собой водород, линейный или разветвленный (С₁-С₆)алкил, линейный или разветвленный (С₂-С₆)алкенил, линейный или разветвленный (С₂-С₆)алкинил, арил или гетероарил, или R₇ и R₇' вместе с атомом азота, с которым они связаны, образуют гетероцикл, состоящий из 5 - 7 кольцевых членов,

подразумевается, что если соединение формулы (I) содержит гидрокси группу, то эта группа необязательно может быть превращена в одну из следующих групп: -ОРО(ОМ)(ОМ'), -OPO(OM)(O^-M₁⁺), -OPO(O^-M₁⁺)(O^-M₂⁺), -ОРО(O^-)(O^-)М₃²⁺, ОРО(ОМ)(O[CH₂CH₂O]_nCH₃), или ОРО(O^-М₁⁺)(O[CH₂CH₂O]_nCH₃), где М и М' независимо друг от друга представляют собой атом водорода, линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу, линейную или разветвленную (С₂-С₆)алкенильную группу, линейную или разветвленную (С₂-С₆)алкинильную группу, циклоалкил или гетероциклоалкил, оба, состоят из 5 - 6 кольцевых членов, в то время как M₁⁺ и М₂⁺ независимо друг от друга представляют собой фармацевтически приемлемый одновалентный катион, М₃²⁺ представляет собой фармацевтически приемлемый двухвалентный катион, и n представляет собой целое число от 1 до 5,

подразумевается, что:

- "арил" обозначает фенильную, нафтильную, бифенильную или инденильную группу,

- "гетероарил" обозначает любую моно- или би-циклическую группу, состоящую из 5-10 кольцевых членов, имеющую по меньшей мере один ароматический компонент и содержащую от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из кислорода, серы и азота (включая четвертичные азоты),

- "циклоалкил" обозначает любую моно- или би-циклическую, неароматическую, карбоциклическую группу, содержащую 3-10 кольцевых членов,

- "гетероциклоалкил" обозначает любую моно- или би-циклическую, не ароматическую, конденсированную или спиро группу, состоящую из 3-10 кольцевых членов и содержащую от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из кислорода, серы, SO, SO₂ и азота,

представляется возможным для арильных, гетероарильных, циклоалкильных и гетероциклоалкильньных групп, определенных таким образом, и групп алкил, алкенил, алкинил и алкокси быть замещенными 1-3 группами, выбранными из: линейный или разветвленный (С₁-С₆)алкил, необязательно замещенный гидроксилом, морфолин, 3-3-дифторпиперидин или 3-3-дифторпирролидин; (С₃-С₆)спиро; линейный или разветвленный (С₁-С₆)алкокси, необязательно замещенный морфолином; (С₁-С₆)алкил-S-; гидроксил; оксо; N-оксид; нитро; циано; -COOR'; -OCOR'; NR'R''; линейный или разветвленный (С₁-С₆)полигалоалкил; трифторметокси; (С₁-С₆)алкилсульфонил; галоген; арил, необязательно замещенный одним или несколькими галогенами; гетероарил; арилокси; арилтио; циклоалкил; гетероциклоалкил. необязательно замещенный одним или несколькими атомами галогена или алкильными группами, где R' и R'' независимо друг от друга представляют собой атом водорода или линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу, необязательно замещенную метокси,

представляется возможным для Het группы, определенной в формуле (I), быть замещенной одной - тремя группами, выбранными из линейного или разветвленного (С₁-С₆)алкила, гидрокси, линейного или разветвленного (C₁-С₆)алкокси, NR₁'R₁'' и галогена, подразумевается, что R₁' и R₁'' имеют значения, как определено для групп R' и R'', указанных ранее в настоящей заявке,

или его энантиомеры, диастереоизомеры, или их соли присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой или основанием,

и (б) MCL1 ингибитор.

Указанные соединения формулы (I), их синтез, их применение для лечения злокачественного новообразования и их фармацевтические препараты, описаны в WO 2013/110890, WO 2015/011397, WO 2015/011399 и WO 2015/011400, содержание которых включено в качестве ссылки.

В определенных вариантах осуществления изобретения, MCL1 ингибитор выбирают из А-1210477 (Cell Death and Disease 2015 6, e1590; doi:10.1038/cddis.2014.561) и соединений, описанных в WO 2015/097123, WO 2016/207216, WO 2016/207217, WO 2016/207225,

WO 2016/207226, или в WO 2016/033486, содержание которых включено в качестве ссылки.

Настоящее изобретение также относится к комбинации, содержащей (a) BCL-2 ингибитор и

(б) MCL1 ингибитор формулы (II):

где:

А представляет собой линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу, линейный или разветвленный (С₂-С₆)алкенильную группу, линейную или разветвленную (С₂-С₆)алкинильную группу, линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкокси группу, -S-(С₁-С₆)алкильную группу, линейный или разветвленный (С₁-С₆)полигалоалкил, гидрокси группу, циано, -NW₁₀W₁₀', -Cy₆ или атом галогена,

W₁, W₂, W₃, W₄ и W₅ независимо друг от друга представляют собой атом водорода, атом галогена, линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу, линейный или разветвленный (С₂-С₆)алкенильную группу, линейную или разветвленную (С₂-С₆)алкинильную группу, линейный или разветвленный (C₁-С₆)полигалоалкил, гидрокси группу, линейный или разветвленный (С₁-С₆)алкокси группу, -S-(С₁-С₆)алкильную группу, циано, нитро группу, -алкил(C₀-C₆)-NW₈W₈', -O-Cy₁, -алкил(С₀-С₆)-Су₁, -алкенил(С₂-С₆)-Су₁, -алкинил(С₂-С₆)-Су₁, -O-алкил(С₁-С₆)-W₉, -C(O)-OW₈, -O-C(O)-W₈, -C(O)-NW₈W₈', -NW₈-C(O)-W₈', -NW₈-C(O)-OW₈', -алкил(C₁-C₆)-NW₈-C(O)-W₈', -SO₂- NW₈W₈', -SO₂-алкил(С₁-С₆),

или заместители одной из частей (W₁, W₂), (W₂, W₃), (W₁, W₃), (W₄, W₅) когда привиты на два смежных атома углерода, образуют вместе с атомами углерода, с которыми они связаны, ароматическое или неароматическое кольцо, состоящее из 5-7 кольцевых членов, которое может содержать от одного до 3 гетероатомов, выбранных из кислорода, серы и азота, подразумевается, что полученное кольцо может быть замещено группой, выбранной из линейной или разветвленной (C₁-С₆)алкильной группы, -NW₁₀W₁₀', -алкил(С₀-С₆)-Су₁ или оксо,

X' представляет собой атом углерода или азота,

W₆ представляет собой водород, линейную или разветвленную (C₁-С₈)алкильную группу, арильную, гетероарильную группу, арилалкил(С₁-С₆) группу, гетероарилалкил(С₁-С₆) группу,

W₇ представляет собой линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу, линейный или разветвленный (С₂-С₆)алкенильную группу, линейную или разветвленную (С₂-С₆)алкинильную группу, -Cy₃, -алкил(С₁-С₆)-Cy₃, -алкенил(С₂-С₆)-Cy₃, -алкинил(С₂-С₆)-Cy₃, -Cy₃-Су₄, -алкинил(С₂-С₆)-O-Cy₃, -Cy₃-алкил(С₀-С₆)-O-алкил(С₀-С₆)-Су₄, атом галогена, циано, -C(O)-W₁₁, -C(O)-NW₁₁W₁₁',

W₈ и W₈' независимо друг от друга представляют собой атом водорода, линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу, или -алкил(С₀-С₆)-Су₁,

или (W₈, W₈') образуют вместе с атомом азота, с которым они связаны, ароматическое или неароматическое кольцо, состоящее из 5-7 кольцевых членов, которое может содержать, дополнительно к атому азота, от одного до 3 гетероатомов, выбранных из кислорода, серы и азота, подразумевается, что указанный атом азота может быть замещен группой, представляющей собой атом водорода, или линейный или разветвленный (С₁-С₆)алкильную группу и, подразумевается, что один или несколько атомов углерода возможных заместителей, могут быть дейтерированы,

W₉ представляет собой -Су₁, -Су₁-алкил(С₀-С₆)-Су₂, -Су₁-алкил(С₀-С₆)-О-алкил(С₀-С₆)-Су₂, -Cy₁-алкил(C₀-C₆)-NW₈-алкил(C₀-C₆)-Cy₂, -Cy₁-Су₂-О-алкил(С₀-С₆)-Су₅, -C(O)-NW₈W₈', -NW₈W₈', -OW₈,-NW₈-C(O)-W₈', -О-алкил(С₁-С₆)-OW₈, -SO₂-W₈, -C(O)-OW₈, -NH-C(O)-NH-W₈,

представляется возможным для аммония, определенным таким образом, существовать в форме цвиттер-иона или иметь моновалентный анионный противоион,

W₁₀, W₁₀', W₁₁ и W₁₁' независимо друг от друга представляют собой атом водорода или линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу,

W₁₂ представляет собой водород или гидрокси группу,

W₁₃ представляет собой атом водорода или линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу,

W₁₄ представляет собой -O-Р(O)(O^-)(O^-) группу, -O-P(O)(O^-)(OW₁₆) группу, -O-P(O)(OW₁₆)(OW₁₆') группу, -O-SO₂-O^- группу, -O-SO₂-OW₁₆ группу, -Су₇, -O-C(O)-W₁₅ группу, -O-C(O)-OW₁₅ группу или -О-С(О)-NW₁₅W₁₅' группу,

W₁₅ и W₁₅' независимо друг от друга представляют собой атом водорода, линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу или линейную или разветвленную амино(С₁-С₆)алкильную группу,

W₁₆ и W₁₆' независимо друг от друга представляют собой атом водорода, линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу или арилалкил(С₁-С₆) группу,

Су₁, Су₂, Су₃, Су₄, Су₅, Су₆ и Су₇ независимо друг от друга, представляют собой циклоалкильную группу, гетероциклоалкильную группу, арильную или гетероарильную группу,

n представляет собой целое число, равное 0 или 1,

подразумевается, что:

- "арил" обозначает фенильную, нафтильную, бифенильную, инданильную или инденильную группу,

- "гетероарил" обозначает любую моно- или би-циклическую группу, состоящую из 5 - 10 кольцевых членов, имеющую по меньшей мере один ароматический компонент и содержащую от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из кислорода, серы и азота,

- "циклоалкил" обозначает любую моно- или би-циклическую не ароматическую карбоциклическую группу, содержащую 3-10 кольцевых членов,

- "гетероциклоалкил" обозначает любую моно- или би-циклическую не ароматическую карбоциклическую группу, содержащую 3-10 кольцевых членов, и содержащую от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из кислорода, серы и азота, которая может включать конденсированные, мостиковые или спиро кольцевые системы,

представляется возможным для арильных, гетероарильных, циклоалкильных и гетероциклоалкильньных групп, определенных таким образом, и алкила, алкенила, алкинила, алкокси, быть замещенными от 1 до 4 групп, выбранных из линейного или разветвленного (С₁-С₆)алкила, который может быть замещен группой, представляющей собой линейный или разветвленный (C₁-С₆)алкокси, который может быть замещенный линейным или разветвленным (С₁-С₆)алкокси, линейный или разветвленный (С₁-С₆)полигалоалкил, гидрокси, галоген, оксо, -NW'W'', -O-C(O)-W', или -CO-NW'W''; линейную или разветвленную (С₂-С₆)алкенильную группу; линейную или разветвленную (С₂-С₆)алкинильную группу, которая может быть замещена группой, представляющей собой линейный или разветвленный (C₁-С₆)алкокси; линейный или разветвленный (С₁-С₆)алкокси, который может быть замещен группой, представляющей собой линейный или разветвленный (С₁-С₆)алкокси, линейный или разветвленный (С₁-С₆)полигалоалкил, линейный или разветвленный (С₂-С₆)алкинил, -NW'W'', или гидрокси; (C₁-С₆)алкил-S-, который может быть замещен группой, представляющей собой линейный или разветвленный (С₁-С₆)алкокси; гидрокси; оксо; N-оксид; нитро; циано; -C(O)-OW'; -O-C(O)-W'; -CO-NW'W''; -NW'W''; -(C=NW')-OW''; линейный или разветвленный (С₁-С₆)полигалоалкил; трифторметокси; или галоген; подразумевается, что W' и W'' независимо друг от друга представляют собой атом водорода или линейную или разветвленную (C₁-С₆)алкильную группу, которая может быть замещена группой, представляющей собой линейный или разветвленный (С₁-С₆)алкокси; и, подразумевается, что один или несколько атомов углерода предшествующих возможных заместителей, могут быть дейтерированы,

его энантиомеры, диастереоизомеры или атропизомеры, или их соли присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой или основанием.

Указанные соединения формулы (II), их синтез, их применение для лечения злокачественного новообразования и их фармацевтические препараты, описаны в WO 2015/097123, содержание которой включено путем ссылки.

В определенных вариантах осуществления изобретения, BCL-2 ингибитор выбирают из следующих соединений:

4-(4-{[2-(4-хлорфенил)-4,4-диметилциклогекс-1-ен-1-ил]метил}пиперазин-1-ил)-N-[(3-нитро-4-{[(оксан-4-ил)метил]амино}фенил)сульфонил]-2-[(1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)окси]бензамид (венетоклакс или АВТ-199); 4-(4-{[2-(4-хлорфенил)-5,5-диметилциклогекс-1-ен-1-ил]метил}пиперазин-1-ил)-N-(4-{[(2R)-4-(морфолин-4-ил)-1-(фенилсульфанил)бутан-2-ил]амино}-3-(трифторметансульфонил)бензолсульфонил] бензамид (навитоклакс или АВТ-263); облимерсен (G3139); обатоклакс (GX15-070); НА14-1; (±)-госсипол (BL-193); (-)-госсипол (AT-101); апогоссипол; TW-37; антимицин А, АВТ-737 (Oltersdorf Т и др., Nature 2005 June 2; 435(7042):677-81) и соединения, описанные WO 2013/110890, WO 2015/011397, WO 2015/011399 и WO 2015/011400, содержание которых включено в качестве ссылки.

В соответствии с первым аспектом изобретения, обеспечивается комбинация, содержащая:

(a) BCL-2 ингибитор формулы (I), как описано в настоящей заявке, и

(b) MCL1 ингибитор формулы (II), как описано в настоящей заявке.

В другом варианте осуществления, изобретение обеспечивает комбинацию, содержащую:

(а) Соединение 1: N-(4-гидроксифенил)-3-{6-[((3S)-3-(4-морфолинилметил)-3,4-дигидро-2(1H)-изохинолинил)карбонил]-1,3-бензодиоксол-5-ил}-N-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-1-индолизин карбоксамид, или его фармацевтически приемлемую соль, и

(б) MCL1 ингибитор,

для одновременного, последовательного или раздельного применения.

В другом варианте осуществления, изобретение обеспечивает комбинацию, содержащую:

(а) Соединение 4: 5-(5-хлор-2-{[(3S)-3-(морфолин-4-илметил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]карбонил}фенил)-N-(5-циано-1,2-диметил-1Н-пиррол-3-ил)-N-(4-гидроксифенил)-1,2-диметил-1H-пиррол-3-карбоксамид, или его фармацевтически приемлемую соль, и

(б) MCL1 ингибитор,

для одновременного, последовательного или раздельного применения.

Альтернативно, изобретение обеспечивает комбинацию, содержащую:

(a) BCL-2 ингибитор, и

(б) Соединение 2: (2R)-2-{[(5S_a)-5-{3-хлор-2-метил-4-[2-(4-метилпиперазин-1-ил)этокси]фенил}-6-(5-фторфуран-2-ил)тиено[2,3-d]пиримидин-4-ил]окси}-3-(2-{[1-(2,2,2-трифторэтил)-1Н-пиразол-5-ил]метокси}фенил)пропионовую кислоту,

для одновременного, последовательного или раздельного применения.

В другом варианте осуществления, изобретение обеспечивает комбинацию, содержащую:

(а) BCL-2 ингибитор, и

(б) Соединение 3: (2R)-2-{[(5S_a)-5-{3-хлор-2-метил-4-[2-(4-метилпиперазин-1-ил)этокси]фенил}-6-(4-фторфенил)тиено[2,3-d]пиримидин-4-ил]окси}-3-(2-{[2-(2-метоксифенил)пиримидин-4-ил]метокси}фенил)пропионовую кислоту,

для одновременного, последовательного или раздельного применения.

В другом варианте осуществления, изобретение обеспечивает комбинацию, как описано в настоящей заявке, для применения для лечения злокачественного новообразования.

В другом варианте осуществления, изобретение обеспечивает применение комбинации, как описано в настоящей заявке, для приготовления лекарственного средства для лечения злокачественного новообразования.

В другом варианте осуществления, изобретение обеспечивает лекарственное средство, содержащее, раздельно или совместно,

(а) BCL-2 ингибитор формулы (I) и

(б) MCL1 ингибитор,

или

(а) BCL-2 ингибитор и

(б) MCL1 ингибитор формулы (II),

для одновременного, последовательного или раздельного введения, и где BCL-2 ингибитор и MCL1 ингибитор обеспечиваются в эффективных количествах для лечения злокачественного новообразования.

В другом варианте осуществления, изобретение обеспечивает способ лечения злокачественного новообразования, включающий введение совместно терапевтически эффективного количества:

(а) BCL-2 ингибитора формулы (I) и

(б) MCL1 ингибитора,

или

(а) BCL-2 ингибитора и

(б) MCL1 ингибитора формулы (II),

субъекту, который в этом нуждается.

В другом варианте осуществления, изобретение обеспечивает способ сенсибилизации пациента, который (I) рефракторный к по меньшей мере одному химиотерапевтическому лечению, или (II) имеет рецидив после лечения с применением химиотерапии, или в обоих случаях (I) и (II), где способ включает введение совместно терапевтически эффективного количества:

(а) BCL-2 ингибитора формулы (I) и

(б) MCL1 ингибитора,

или

(а) BCL-2 ингибитора и

(б) MCL1 ингибитора формулы (II),

указанному пациенту.

В особенно предпочтительном варианте осуществления, BCL-2 ингибитор представляет собой N-(4-гидроксифенил)-3-{6-[((3S)-3-(4-морфолинилметил)-3,4-дигидро-2(1H)-изохинолинил)карбонил]-1,3-бензодиоксол-5-ил}-N-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-1-индолизин карбоксамид гидрохлорид (Соединение 1, HCl).

В особенно предпочтительном варианте осуществления, BCL-2 ингибитор представляет собой 5-(5-хлор-2-{[(3S)-3-(морфолин-4-илметил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]карбонил}фенил)-N-(5-циано-1,2-диметил-1Н-пиррол-3-ил)-N-(4-гидроксифенил)-1,2-диметил-1H-пиррол-3-карбоксамид гидрохлорид (Соединение 4, HCl).

В другом варианте осуществления, BCL-2 ингибитор представляет собой АВТ-199.

В другом варианте осуществления, MCL1 ингибитор представляет собой (2R)-2-{[(5S_a)-5-{3-хлор-2-метил-4-[2-(4-метилпиперазин-1-ил)этокси]фенил}-6-(5-фторфуран-2-ил)тиено[2,3-d]пиримидин-4-ил]окси}-3-(2-{[1-(2,2,2-трифторэтил)-1H-пиразол-5-ил]метокси}фенил)пропионовую кислоту (Соединение 2).

В другом варианте осуществления, MCL1 ингибитор представляет собой (2R)-2-{[(5S_a)-5-{3-хлор-2-метил-4-[2-(4-метилпиперазин-1-ил)этокси]фенил}-6-(4-фторфенил)тиено[2,3-d]пиримидин-4-ил]окси}-3-(2-{[2-(2-метоксифенил)пиримидин-4-ил]метокси}фенил)пропионовую кислоту (Соединение 3).

Краткое описание фигур

Фигура 1. Экспрессия BCL-2 и MCL1 преобладает в AML. Образцы 7 AML клеточных линий и 13 первичных AML с >70% бластов подвергали иммуноблоттину для определения указанных белков, и было показано, что BCL-2 и MCL1 белки доминантно экспрессировались в отличие от BCL-XL, который экспрессировался в меньшем количестве образцов.

На данном чертеже, в частности, представлена экспрессия BCL-2 и MCL1 преобладает в AML. Анализ с помощью иммуноблоттинга показал экспрессию представителей BCL-2 семейства в образцах первичных AML и клеточных линий AML. BCL-2 и MCL1 белки доминантно экспрессировались в отличие от BCL-XL, который экспрессировался в меньшем количестве образцов первичных AML и клеточных линий AML.

Фигура 2. Комбинированное BCL-2/MCL1 нацеливание имеет синергическую активность в AML in vitro и in vivo. (А) 54 образца первичных AML инкубировали в диапазоне концентраций 6-log Соединения 1 (HCl соль), Соединения 2 или 1:1 концентрации в RPMI/15% FCS в течение 48 ч и определяли LC₅₀ (В) Четырем группам NSG мышей прививали MV4; 11 клетки, экспрессирующие люциферазу. Приживление опухоли верифицировали в день 10 (исходное значение) и затем осуществляли введение Соединения 1, HCl 100 мг/сутки перорально в рабочие дни (выраженного в виде свободного основания) или Соединения 2 25 мг/кг в/в два раза в неделю в течение 4 недель. О влиянии Соединения 2 и комбинации с Соединением 1 свидетельствовало уменьшение количества массы люциферазы в дни 14 и 28 после начала терапии и повышение общей выживаемости (С).

На данном чертеже, в частности, представлено комбинированное BCL-2/MCL1 нацеливание имеет синергическую активность в AML. (А) Серии образцов первичных AML инкубировали с Соединением 1 / Соед 1 (HCl соль) и Соединением 2 / Соед 2 отдельно, или в комбинации и определяли LC50 уничтожающий эффект. Это показало существенный синергетический эффект этой комбинации в большой части образцов первичных AML. В (В), группам 6 NSG мышей прививали люц-MV4;11 AML клетки и после подтвержденного прививания, мышей лечили через 10 дней с применением соединения 1, HCl (100 мг/кг п/о по рабочим дням дозировку представляли в виде свободного основания) или Соединения 2 (25 мг/кг в/в два раза в неделю) отдельно, или в комбинации в течение 4 последовательных недель. Введения только наполнителя одной группе служило в качестве контроля. При биовизуализации мышей в день 14 и 28 после прививания обнаружили заметную супрессию AML в группах, леченных Соединением 2 и Соединением 1 + Соединением 2. Тем не менее, в (С), выживание для мышей, леченных с применением Соединения 1 + Соединения 2, было существенно увеличенным, по сравнению с другими леченными группами, что подтверждает клиническое преимущество двухкомпонентной BCL-2/MCL1 нацеленной терапии in vivo.

Фигура 3. Определение токсичности комбинированного BCL-2/MCL1 нацеливания на нормальные CD34+ клетки от нормальных доноров или лейкемические бластные клетки. Сортированные нормальные CD34+ или лейкемические бластные клетки высевали и обрабатывали с помощью Соединения 1, HCl и Соединения 2 при соотношении 1:1 в указанных концентрациях. Комбинация Соединения 1 + Соединения 2 является токсичной для лейкемических, но не для нормальных CD34+ предшественников.

На данном чертеже, в частности, представлено определение токсичности BCL-2 нацеливания (с соединением 1 / Соед 1; HCl соль) в комбинации с MCL1 нацеливанием (с соединением 2 / Соед 2), на клоногенное функционирование нормальных CD34+ клеток от здоровых доноров или лейкемических бластных клеток от пациентов с AML. Лекарственные средства в указанных концентрациях инкубировали с клетками и подсчитывали колонии через 14-21 дней, используя Gelcount® анализатор. Колонии нормализовали по отношению к ДМСО контролю. Соединение 1 в комбинации с соединением 2 подавляет AML колониеобразующую активность без воздействия на функцию нормального роста CD34+ колоний.

Фигура 4. Матрицы ингибирующего влияния на рост клеток и синергизма комбинации для ингибирования роста клеток (слева) и ингибирования избытка Loewe (справа), обеспечиваемые Соединением 3 в комбинации с Соединением 1, HCl в DB клетках (А) и Toledo клетках (В). Значения в матрице влияния находятся в диапазоне от 0 (без ингибирования) до 100 (тотальное ингибирование). Значения в матрице синергизма представляют собой степень ингибирования роста свыше теоретической аддитивности, рассчитанной на основании активности отдельно взятых средств Соединения 3 и Соединения 1, HCl при тестируемых концентрациях. Синергетические эффекты проявляются для широкого диапазона концентраций отдельно взятых средств.

Фигура 5. Противоопухолевые эффекты Соединения 1, HCl, Соединения 3 и комбинации Соединения 1, HCl + Соединения 3 на модели ксенотрансплантата лимфомы Karpass422 у крыс.

Фигура 6. Изменения массы тела у животных, леченных с применением Соединения 1, HCl, Соединения 3 и комбинации Соединения 1, HCl + Соединения 3 на модели ксенотрансплантата лимфомы Karpass422 у крыс.

Фигура 7. Противоопухолевые эффекты Соединения 1, HCl, Соединения 3 и комбинации Соединения 1, HCl + Соединения 3 на DLBCL Toledo модели ксенотрансплантата у мышей.

Фигура 8. Изменения массы тела у животных, леченных с применением Соединения 1, HCl, Соединения 3 и комбинации Соединения 1, HCl + Соединения 3 на DLBCL Toledo модели ксенотрансплантата у мышей.

Фигура 9. Матрицы ингибирующего влияния на рост клеток и синергизма комбинации для ингибирования роста клеток (слева) и ингибирования избытка Loewe (справа), обеспечиваемые Соединением 3 (MCL1 ингибитор) в комбинации с Соединением 1, HCl (BCL-2 ингибитор) в AML клеточной линии OCI-AML3 в двух независимых экспериментах.

Значения в матрице влияния находятся в диапазоне от 0 (без ингибирования) до 100 (тотальное ингибирование). Значения в матрице синергизма представляют собой степень ингибирования роста свыше теоретической аддитивности, рассчитанной на основании активности отдельно взятых средств Соединения 3 и Соединения 1, HCl при тестируемых концентрациях. Синергетические эффекты проявляются для широкого диапазона концентраций отдельно взятых средств.

Фигура 10. Матрицы ингибирующего влияния на рост клеток и синергизма комбинации для ингибирования роста клеток (слева) и ингибирования избытка Loewe (справа), обеспечиваемые Соединением 3 (MCL1 ингибитор) в комбинации с Соединением 1, HCl (BCL-2 ингибитор) в NB клеточной линии LAN-6 в двух независимых экспериментах (N1: верхняя панель; N2: нижняя панель). Значения в матрице влияния находятся в диапазоне от 0 (без ингибирования) до 100 (тотальное ингибирование). Значения в матрице синергизма представляют собой степень ингибирования роста свыше теоретической аддитивности, рассчитанной на основании активности отдельно взятых средств Соединения 3 и Соединения 1, HCl при тестируемых концентрациях.

Фигура 11. Матрицы ингибирующего влияния на рост клеток и синергизма комбинации для ингибирования роста клеток (слева) и ингибирования избытка Loewe (справа), обеспечиваемые Соединением 3 (MCL1 ингибитор) в комбинации с Соединением 1, HCl (BCL-2 ингибитор) в B-ALL клеточной линии NALM-6 в двух независимых экспериментах (N1: верхняя панель; N2: нижняя панель).

Фигура 12. Матрицы ингибирующего влияния на рост клеток и синергизма комбинации для ингибирования роста клеток (слева) и ингибирования избытка Loewe (справа), обеспечиваемые Соединением 3 (MCL1 ингибитор) в комбинации с Соединением 1, HCl (BCL-2 ингибитор) в MCL клеточной линии Z-138.

Фигура 13. Матрицы ингибирующего влияния на рост клеток и синергизма комбинации для ингибирования роста клеток (слева) и ингибирования избытка Loewe (справа), обеспечиваемые Соединением 3 (MCL1 ингибитор) в комбинации с АВТ-199 (BCL-2 ингибитор) в AML клеточной линии OCI-AML3 в двух независимых экспериментах (N1: верхняя панель; N2: нижняя панель).

Фигура 14. Типичные матрицы ингибирующего влияния на рост клеток и синергизма комбинации для ингибирования роста клеток (слева) и ингибирования избытка Loewe (справа), обеспечиваемые Соединением 3 (MCL1 ингибитор) в комбинации с Соединением 4, HCl (BCL-2 ингибитор) в AML клеточных линиях (ML-2 клетки в А и OCI-AML-3 в В).

Фигуры 15 (а)-(е). Дозовые матрицы для ингибирования (слева), ингибирования избытка Loewe (посередине) и ингибирования роста, обеспечиваемые Соединением 3 (MCL1 ингибитор) в комбинации с Соединением 1, HCl (BCL-2 ингибитор) в панели SCLC клеточных линий.

Фигуры 16 (а)-(b). Противоопухолевые эффекты Соединения 1, HCl, АВТ-199, Соединения 3 и комбинации Соединения 1, HCl или АВТ-199 + Соединения 3 на полученной от пациентов первичной AML модели HAMLX5343 у мышей.

Фигура 17. Сравнение теплокарты AML чувствительности (LC₅₀) к ВН3-миметической монотерапии, или комбинациям лекарственных средств (тестированных при соотношении 1:1), относительно химиотерапии (идарубицин) после воздействия в течение 48 часов. Представлена жизнеспособность клеток каждых образцов первичных AML через 48 ч в ДМСО.

Подробное описание изобретения

Таким образом, изобретение обеспечивает в варианте осуществления Е1, комбинацию, содержащую (a) BCL-2 ингибитор формулы (I):

где:

Т представляет собой атом водорода, линейную или разветвленную (C₁-С₆)алкильную группу, необязательно замещенную одним - тремя атомами галогена, группу (С₁-С₄)алкил-NR₁R₂, или группу (С₁-С₄)алкил-OR₆,

или R₁ и R₂ образуют с атомом азота, с которым они связаны, гетероциклоалкил,

R₄ представляет собой арильную группу, гетероарильную группу, циклоалкильную группу или линейную или разветвленную (C₁-С₆)алкильную группу, подразумевается, что один или несколько атомов углерода предшествующих групп, или их возможных заместителей, могут быть дейтерированы,

R₆ представляет собой атом водорода или линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу,

R₇-CO-(C₀-C₆)алкил-, R₇-CO-NH-(C₀-C₆)алкил-, NR₇R₇'-СО-(С₀-С₆)алкил-, NR₇R₇'-CO-(C₀-C₆)алкил-O-, R₇-SO₂-NH-(C₀-C₆)алкил-, R₇-NH-CO-NH-(C₀-С₆)алкил-, R₇-O-СО-NH-(С₀-С₆)алкил-, гетероциклоалкильную группу, или заместители одной из частей (R_a,R_b), (R_b,R_c) или (R_c,R_d) образуют вместе с атомами углерода, с которыми они связаны, кольцо, состоящее из 5-7 кольцевых членов, которое может содержать от одного до 2 гетероатомов, выбранных из кислорода и серы, также подразумевается, что один или несколько атомов углерода кольца, определенные ранее в настоящей заявке, могут быть дейтерированы или замещены одной - 3 группами, выбранными из галогена и линейного или разветвленного (С₁-С₆)алкил,

подразумевается, что если соединение формулы (I) содержит гидрокси группу, то эта группа необязательно может быть превращена в одну из следующих групп: -ОРО(ОМ)(ОМ'), -OPO(OM)(O^-M₁⁺), -OPO(O^-M₁⁺)(O^-M₂⁺), -ОРО(O^-)(O^-)М₃²⁺, -ОРО(ОМ)(O[CH₂CH₂O]_nCH₃), или -ОРО(O^-М₁⁺)(O[CH₂CH₂O]_nCH₃), где М и М' независимо друг от друга представляют собой атом водорода, линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу, линейную или разветвленную (С₂-С₆)алкенильную группу, линейную или разветвленную (С₂-С₆)алкинильную группу, циклоалкил или гетероциклоалкил, оба, состоят из 5-6 кольцевых членов, в то время как M₁⁺ и М₂⁺ независимо друг от друга представляют собой фармацевтически приемлемый одновалентный катион, М₃²⁺ представляет собой фармацевтически приемлемый двухвалентный катион, и n представляет собой целое число от 1 до 5,

подразумевается, что:

- "арил" обозначает фенильную, нафтильную, бифенильную или инденильную группу,

- "циклоалкил" обозначает любую моно- или би-циклическую, не ароматическую, карбоциклическую группу, содержащую 3-10 кольцевых членов,

и (б) MCL1 ингибитор,

для одновременного, последовательного или раздельного применения.

Изобретение также обеспечивает в варианте осуществления Е2 комбинацию, содержащую (a) BCL-2 ингибитор и (б) MCL1 ингибитор формулы (II):

где:

W₁, W₂, W₃, W₄ и W₅ независимо друг от друга представляют собой атом водорода, атом галогена, линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу, линейный или разветвленный (С₂-С₆)алкенильную группу, линейную или разветвленную (С₂-С₆)алкинильную группу, линейный или разветвленный (С₁-С₆)полигалоалкил, гидрокси группу, линейный или разветвленный (С₁-С₆)алкокси группу, -S-(С₁-С₆)алкильную группу, циано, нитро группу, -алкил(С₀-С₆)-NW₈W₈', -O-Cy₁, -алкил(С₀-С₆)-Су₁, -алкенил(С₂-С₆)-Су₁, -алкинил(С₂-С₆)-Су₁, -O-алкил(С₁-С₆)-W₉, -С(О)-OW₈, -O-C(O)-W₈, -C(O)-NW₈W₈', -NW₈-C(O)-W₈', -NW₈-C(O)-OW₈', -алкил(C₁-C₆)-NW₈-C(O)-W₈', -SO₂- NW₈W₈', -SO₂-алкил(С₁-С₆),

X' представляет собой атом углерода или азота,

W₇ представляет собой линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу, линейный или разветвленный (С₂-С₆)алкенильную группу, линейную или разветвленную (С₂-С₆)алкинильную группу, -Cy₃, -алкил(С₁-С₆)-Cy₃, -алкенил(С₂-С₆)-Су₃, -алкинил(С₂-С₆)-Су₃, -Су₃-Су₄, -алкинил(С₂-С₆)-O-Cy₃, -Cy₃-алкил(С₀-С₆)-O-алкил(С₀-С₆)-Су₄, атом галогена, циано, -C(O)-W₁₁, -C(O)-NW₁₁W₁₁',

или (W₈, W₈') образуют вместе с атомом азота, с которым они связаны, ароматическое или неароматическое кольцо, состоящее из 5-7 кольцевых членов, которое может содержать, дополнительно к атому азота, от одного до 3 гетероатомов, выбранных из кислорода, серы и азота, подразумевается, что указанный атом азота может быть замещен группой, представляющей собой атом водорода, или линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу и, подразумевается, что один или несколько атомов углерода возможных заместителей, могут быть дейтерированы,

W₉ представляет собой -Cy₁, -Су₁-алкил(С₀-С₆)-Су₂, -Су₁-алкил(С₀-С₆)-O-алкил(С₀-С₆)-Су₂, -Су₁-алкил(С₀-С₆)-NW₈-алкил(С₀-С₆)-Су₂, -Cy₁-Cy₂-O-алкил(С₀-С₆)-Су₅, -C(O)-NW₈W₈', -NW₈W₈', -OW₈,-NW₈-C(O)-W₈', -О-алкил(С₁-С₆)-OW₈, -SO₂-W₈, -C(O)-OW₈, -NH-C(O)-NH-W₈,

или

W₁₂ представляет собой водород или гидрокси группу,

W₁₃ представляет собой атом водорода или линейную или разветвленную (С₁-С₆)алкильную группу,

Су₁, Су₂, Cy₃, Су₄, Су₅, Су₆ и Су₇ независимо друг от друга, представляют собой циклоалкильную группу, гетероциклоалкильную группу, арильную или гетероарильную группу,

n представляет собой целое число, равное 0 или 1,

подразумевается, что:

- "арил" обозначает фенильную, нафтильную, бифенильную, инданильную или инденильную группу,

- "гетероарил" обозначает любую моно- или би-циклическую группу, состоящую из 5-10 кольцевых членов, имеющую по меньшей мере один ароматический компонент и содержащую от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из кислорода, серы и азота,

его энантиомеры, диастереоизомеры или атропизомеры, или их соли присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой или основанием,

для одновременного, последовательного или раздельного применения.

Дополнительные пронумерованные варианты осуществления (Е) изобретения описаны в настоящей заявке. Следует принять во внимание, что характерные особенности, указанные в каждом варианте осуществления, могут быть комбинированы с другими указанными характерными особенностями, для обеспечения дальнейших характерных вариантов осуществления настоящего изобретения.

Е3. Комбинация в соответствии с Е1, где MCL1 ингибитор представляет собой соединение формулы (II), как определено в Е2.

Е4. Комбинация в соответствии с любым из Е1 - Е3, где BCL-2 ингибитор представляет собой N-(4-гидроксифенил)-3-{6-[((3S)-3-(4-морфолинилметил)-3,4-дигидро-2(1H)-изохинолинил) карбонил]-1,3-бензодиоксол-5-ил}-N-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-1-индолизин карбоксамид.

Е5. Комбинация в соответствии с любым из Е1 - Е3, где BCL-2 ингибитор представляет собой 5-(5-хлор-2-{[(3S)-3-(морфолин-4-илметил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]карбонил} фенил)-N-(5-циано-1,2-диметил-1Н-пиррол-3-ил)-N-(4-гидроксифенил)-1,2-диметил-1H-пиррол-3-карбоксамид.

Е6. Комбинация в соответствии с Е4, где N-(4-гидроксифенил)-3-{6-[((3S)-3-(4-морфолинилметил)-3,4-дигидро-2(1H)-изохинолинил)карбонил]-1,3-бензодиоксол-5-ил}-N-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-1-индолизин карбоксамид представлен в форме гидрохлоридной соли.

Е7. Комбинация в соответствии с Е5, где 5-(5-хлор-2-{[(3S)-3-(морфолин-4-илметил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]карбонил} фенил)-N-(5-циано-1,2-диметил-1H-пиррол-3-ил)-N-(4-гидроксифенил)-1,2-диметил-1H-пиррол-3-карбоксамид представлен в форме гидрохлоридной соли.

Е8. Комбинация в соответствии с Е4 или Е6, где доза N-(4-гидроксифенил)-3-{6-[((3S)-3-(4-морфолинилметил)-3,4-дигидро-2(1H)-изохинолинил)карбонил]-1,3-бензодиоксол-5-ил}-N-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-1-индолизина карбоксамида при осуществлении комбинированного лечения составляет от 50 мг до 1500 мг.

Е9. Комбинация в соответствии с любым из E1 - Е8, где BCL-2 ингибитор вводят один раз в неделю.

Е10. Комбинация в соответствии с Е6 или Е8, где N-(4-гидроксифенил)-3-{6-[((3S)-3-(4-морфолинилметил)-3,4-дигидро-2(1H)-изохинолинил)карбонил]-1,3-бензодиоксол-5-ил}-N-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-1-индолизин карбоксамид вводят при осуществлении комбинированного лечения один раз сутки.

Е11. Комбинация в соответствии с любым из E1 - Е3, где BCL-2 ингибитор представляет собой АВТ-199.

Е12. Комбинация в соответствии с любым из E1 - Е11, где MCL1 ингибитор представляет собой (2R)-2-{[(5S_a)-5-{3-хлор-2-метил-4-[2-(4-метилпиперазин-1-ил)этокси]фенил}-6-(5-фторфуран-2-ил)тиено[2,3-d]пиримидин-4-ил]окси}-3-(2-{[1-(2,2,2-трифторэтил)-1Н-пиразол-5-ил]метокси}фенил)пропионовую кислоту.

Е13. Комбинация в соответствии с любым из E1 - Е11, где MCL1 ингибитор представляет собой (2R)-2-{[(5S_a)-5-{3-хлор-2-метил-4-[2-(4-метилпиперазин-1-ил)этокси]фенил}-6-(4-фторфенил)тиено[2,3-d]пиримидин-4-ил]окси}-3-(2-{[2-(2-метоксифенил)пиримидин-4-ил]метокси}фенил)пропионовую кислоту.

Е14. Комбинация в соответствии с любым из E1 - Е13, где BCL-2 ингибитор и MCL1 ингибитор вводят перорально.

Е15. Комбинация в соответствии с любым из E1 - Е13, где BCL-2 ингибитор вводят перорально и MCL1 ингибитор вводят внутривенно.

Е16. Комбинация в соответствии с любым из E1 - Е13, где BCL-2 ингибитор и MCL1 ингибитор вводят внутривенно.

Е17. Комбинация в соответствии с любым из E1 - Е16, для применения для лечения злокачественного новообразования.

Е18. Комбинация для применения в соответствии с Е17, где BCL-2 ингибитор и MCL1 ингибитор обеспечиваются в количествах, которые совместно терапевтически эффективны для лечения злокачественного новообразования.

Е19. Комбинация для применения в соответствии с Е17, где BCL-2 ингибитор и MCL1 ингибитор обеспечиваются в количествах, которые синергетически эффективны для лечения злокачественного новообразования.

Е20. Комбинация для применения в соответствии с Е17, где BCL-2 ингибитор и MCL1 ингибитор обеспечиваются в синергетически эффективных количествах, которые способны уменьшать дозу, необходимую для каждого соединения для лечения злокачественного новообразования, обеспечивая при этом эффективное лечение злокачественного новообразования, с уменьшением в конечном итоге побочных эффектов.

Е21. Комбинация для применения в соответствии с любым из Е17 - Е20, где злокачественное новообразование представляет собой лейкоз.

Е22. Комбинация для применения в соответствии с Е21, где злокачественное новообразование представляет собой острый миелоидный лейкоз, T-ALL или В-ALL.

Е23. Комбинация для применения в соответствии с любым из Е17 - Е20, где злокачественное новообразование представляет собой миелодиспластический синдром или миелопролиферативное заболевание.

Е24. Комбинация для применения в соответствии с любым из Е17 - Е20, где злокачественное новообразование представляет собой лимфому.

Е25. Комбинация для применения в соответствии с любым из Е24, где лимфома представляет собой неходжкинскую лимфому.

Е26. Комбинация для применения в соответствии с любым из Е25, где неходжкинская лимфома представляет собой диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому или лимфому из клеток зоны мантии.

Е27. Комбинация для применения в соответствии с любым из Е17 - Е20, где злокачественное новообразование представляет собой множественную миелому.

Е28. Комбинация для применения в соответствии с любым из Е17 - Е20, где злокачественное новообразование представляет собой нейробластому.

Е29. Комбинация для применения в соответствии с любым из Е17 - Е20, где злокачественное новообразование представляет собой мелкоклеточный рак легкого.

Е30. Комбинация в соответствии с любым из E1 - Е16, которая дополнительно содержит один или несколько наполнителей.

Е31. Применение комбинации в соответствии с любым из E1 - Е16, для приготовления лекарственного средства для лечения злокачественного новообразования.

Е32. Применение в соответствии с Е31, где злокачественное новообразование представляет собой лейкоз.

Е33. Применение в соответствии с Е32, где злокачественное новообразование представляет собой острый миелоидный лейкоз, T-ALL или В-ALL.

Е34. Применение в соответствии с Е31, где злокачественное новообразование представляет собой миелодиспластический синдром или миелопролиферативное заболевание.

Е35. Применение в соответствии с Е31, где злокачественное новообразование представляет собой лимфому.

Е36. Применение в соответствии с Е35, где лимфома представляет собой неходжкинскую лимфому.

Е37. Применение в соответствии с Е36, где неходжкинская лимфома представляет собой диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому или лимфому из клеток зоны мантии.

Е38. Применение в соответствии с Е31, где злокачественное новообразование представляет собой множественную миелому.

Е39. Применение в соответствии с Е31, где злокачественное новообразование представляет собой нейробластому.

Е40. Применение в соответствии с Е31, где злокачественное новообразование представляет собой мелкоклеточный рак легкого.

Е41. Лекарственное средство, содержащее, раздельно или совместно,

(а) BCL-2 ингибитор формулы (I), как определено в Е1, и

(б) MCL1 ингибитор,

Е42. Лекарственное средство, содержащее, раздельно или совместно,

(а) BCL-2 ингибитор, и

(б) MCL1 ингибитор формулы (II), как определено в Е2,

Е43. Способ лечения злокачественного новообразования, включающий введение совместно терапевтически эффективного количества (a) BCL-2 ингибитора формулы (I), как определено в Е1, и

(б) MCL1 ингибитора,

субъекту, который в этом нуждается.

Е44. Способ лечения злокачественного новообразования, включающий введение совместно терапевтически эффективного количества (a) BCL-2 ингибитора,и

(б) MCL1 ингибитора формулы (II), как определено в Е2, субъекту, который в этом нуждается.

Е45. Способ сенсибилизации пациента, который (I) рефракторный к по меньшей мере одному химиотерапевтическому лечению, или (II) имеет рецидив после лечения с применением химиотерапии, или в обоих случаях (I) и (II), где способ включает введение совместно терапевтически эффективного количества (a) BCL-2 ингибитора формулы (I), как определено в Е1, и (б) MCL1 ингибитора, указанному пациенту.

Е46. Способ сенсибилизации пациента, который (I) рефракторный к по меньшей мере одному химиотерапевтическому лечению, или (II) имеет рецидив после лечения с применением химиотерапии, или в обоих случаях (I) и (II), где способ включает введение совместно терапевтически эффективного количества (a) BCL-2 ингибитора, и (б) MCL1 ингибитора формулы (II), как определено в Е2, указанному пациенту.

"Комбинация" относится либо к комбинации с фиксированной дозой в одной единичной дозированной форме (например, капсуле, таблетке или саше), комбинации с нефиксированной дозой, или набору для комбинированного введения, где соединение согласно настоящему изобретению и один или несколько компонентов из комбинации (например, другое лекарственное средство, как объясняется ниже, также обозначается в виде "терапевтического средстве" или "соагента") могут вводиться независимо в одно и то же время или раздельно в течение временных интервалов, в особенности, если эти временные интервалы предоставляют возможность для компонентов комбинации проявлять совместный, например, синергетический эффект.

Термины "совместное введение" или "комбинированное введение" или тому подобные, как используется в настоящей заявке, охватывают введение выбранного компонента комбинации единичному субъекту, который в этом нуждается (например, пациенту), и включают схемы лечения, при которых агенты не обязательно вводятся одним и тем же путем введения или в одно и то же время.

Термин "комбинация с фиксированной дозой" обозначает, что активные компоненты, например, соединение формулы (I) и один или несколько компонентов комбинации, оба вводятся пациенту одновременно в форме единого целого или дозировки.

Термин "комбинация с нефиксированной дозой" обозначает, что активные компоненты, например, соединение согласно настоящему изобретению и один или несколько компонентов комбинации, оба вводятся пациенту в виде раздельных составляющих либо одновременно или последовательно, без специфических временных ограничений, где такое введение обеспечивает терапевтически эффективные уровни двух соединений в организме пациента. Последнее также применяется для коктейльной терапии, например, введение трех или более активных компонентов.

"Злокачественное новообразование" обозначает класс заболеваний, в котором группа клеток проявляет неконтролируемый рост. Типы злокачественных новообразований включают гематологическую злокачественную опухоль (лимфомц и лейкоз) и солидные опухоли, включая карциному, саркому или бластому. В особенности "злокачественное новообразование" относится к лейкозу, лимфоме или множественной миеломе, и более специфически к острому миелоидному лейкозу.

Термин "совместно терапевтически эффективны" обозначает, что терапевтические средства могут вводиться раздельно (в хронологически установленном порядке, в особенности специфически к последовательности образом) в такие временные интервалы, что они могут предпочтительно, у теплокровного животного, в особенности у человека, лечить, все еще проявляя (предпочтительно синергетическое) взаимодействие (совместный терапевтический эффект). В любом случае, это может быть установлено, в частности, путем определения последующих уровней в крови, свидетельствующих о том, что оба соединения присутствуют в крове человека, подвергаемого лечению, по меньшей мере на протяжении определенных временных интервалов.

"Синергетически эффективны" или "синергизм" обозначает, что терапевтический эффект, наблюдаемые после введения двух или более агентов является больше, чем сумма терапевтических эффектов, наблюдаемых после введения каждого единичного средства.

Как используется в настоящей заявке, термин "лечить", "лечение" или "терапия" любого заболевания или нарушения относится в одном варианте осуществления, к ослаблению заболевания или нарушения (то есть, облечение или остановка или уменьшение развития заболевания или по меньшей мере одного из его клинических симптомов). В другом варианте осуществления "лечить", "лечение" или "терапия" относится к ослаблению или облегчению по меньшей мере одного физического параметра, включая те, которые могут не ощущаться пациентом. В еще другом варианте осуществления, "лечить", "лечение" или "терапия" относится к модуляции заболевания или нарушения, либо физически, (например, стабилизация различимого симптома), физиологически, (например, стабилизация физического параметра), или обоих.

Как используется в настоящей заявке, субъект "нуждается в" лечении, если такой субъект будет получать преимущества биологически, медицински или качества жизни от такого лечения.

В другом аспекте, обеспечивается способ сенсибилизации человека, который является (I) рефракторным к по меньшей мере одному химиотерапевтическому лечению, или (II) имеет рецидив после лечения с применением химиотерапии, или в обоих случаях (I) и (II), где способ включает введение BCL-2 ингибитора формулы (I) в комбинации с MCL1 ингибитором, как описано в настоящей заявке, пациенту. Пациент, который сенсибилизируется, представляет собой пациента, который отвечает на лечение, включающее введение BCL-2 ингибитора формулы (I) в комбинации с MCL1 ингибитором, как описано в настоящей заявке, или у которого не развилась резистентность к такому лечению.

"Лекарственное средство" обозначает фармацевтическую композицию, или комбинацию нескольких фармацевтических композиций, которая содержит одно или несколько активных компонентов в присутствии одного или нескольких наполнителей.

'AML' обозначает острый миелоидный лейкоз.

'T-ALL' и 'В-ALL' обозначает Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз и В-клеточный острый лимфобластный лейкоз.

'Свободное основание' относится к соединению, когда оно не представлено в форме соли.

В фармацевтических композициях в соответствии с изобретением, пропорция активных компонентов по весу (вес активных компонентов по отношению к общему весу композиции) составляет 5-50%.

В качестве фармацевтических композиций в соответствии с изобретением, более специфически используют те, которые являются подходящими для введения пероральным, парентеральным и в особенности внутривенным, через- или транскожным, назальным, ректальным, подъязычным, глазным или респираторным путем, более специфически таблетки, драже, подъязычные таблетки, твердые желатиновые капсулы, таблетки для медленного растворения под языком, капсулы, пастилки, инъецируемые препараты, аэрозоли, глазные капли или капли в нос, суппозитории, кремы, мази, кожные гели и др.

Фармацевтические композиции в соответствии с изобретением могут содержать один или несколько наполнителей или носителей, выбранных из разбавителей, смазывающих веществ, связующих, дезинтеграторов, стабилизаторов, консервантов, абсорбентов, красителей, подсластителей, ароматизаторов и др.

В качестве неограничивающего примера можно указать:

в качестве разбавителей: лактоза, декстроза, сахароза, маннит, сорбит, целлюлоза, глицерин,

в качестве смазывающих веществ: диоксид кремния, тальк, стеариновая кислота и ее магниевая и кальциевая соли, полиэтиленгликоль,

в качестве связующих: алюмосиликат магния, крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза и поливинилпирролидон,

в качестве дезинтеграторов: агар, альгиновая кислота и ее натриевая соль, шипучие смеси.

Соединения комбинации могут вводиться одновременно или последовательно. Путь введения предпочтительно представляет собой пероральный путь, и соответствующие фармацевтические композиции могут предоставлять возможность немедленного или отстроченного высвобождения активных компонентов. Соединения комбинации, кроме того, могут вводиться в форме двух раздельных фармацевтических композиций, каждая из которых содержит один из активных компонентов, или в форме единственной фармацевтической композиции, в которой активные компоненты представлены в смеси.

Предпочтительными являются фармацевтические композиции, представляющие собой таблетки.

Фармацевтическая композиция Соединения 1 HCl соли, представляющая собой покрытую пленочной оболочкой таблетку, содержащую 50 мг и 100 мг лекарственного вещества

Фармакологические данные

Материалы и методы для примеров 1-3:

Образцы первичных AML от пациентов: Образцы костного мозга или периферической крови от пациентов с AML собирали после получения информированного согласия согласно требованиям, утвержденным исследовательским комитетом по этическим вопросам Alfred Hospital Human. Мононуклеарные клетки выделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque (GE Healthcare, VIC, Aus), с последующим истощением эритроцитов в лизирующем буфере хлориде аммония (NH₄Cl) при 37°С в течение 10 минут. Затем клетки ресуспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе, содержащем 2% фетальную бычью сыворотку (Sigma, NSW, Aus). После этого мононуклеарные клетки суспендировали в RPMI-1640 (GIBCO VIC, Aus) среде, содержащей пенициллин и стрептомицин (GIBCO) и инактивированную нагреванием фетальную бычью сыворотку 15% (Sigma).

Клеточные линии, клеточные культуры и создание люцифеуазных репортерных клеточных линий: Клеточные линии MV4; 11, OCI-AML3, HL-60, HEL, K562, KG-1 и EOL-1 поддерживали при 37°С, 5% CO₂ в RPMI-1640 (GIBCO), дополненной 10% (об./об.) фетальной бычьей сывороткой (Sigma) и пенициллином и стрептомицином (GIBCO). MV4; 11 люциферазные клеточные линии создавали с помощью лентивирусной трансдукции.

Антитела: Первичные антитела, используемые для вестерн-блоттинга, представляли собой MCL1, BCL-2, Вах, Bak, Bim, BCL-XL (созданные на собственной базе WEHI) и тубулин (Т-9026, Sigma).

Жизнеспособность клеток: Только что очищенные мононуклеарные клетки из образцов AML пациентов доводили до концентрации 2,5×10⁵/мл и вносили 100 мкл аликвот клеток на лунку в планшеты на 96 лунок (Sigma). После этого клетки обрабатывали с помощью Соединения 1, HCl, Соединения 2, АВТ-199 (Active Biochem, NJ, USA) или идарубицина (Sigma), в диапазоне 6-лог концентраций от 1 нМ до 10 мкМ в течение 48 часов. Для исследования комбинаций, лекарственные средства добавляли в соотношении 1:1 от 1 нМ до 10 мкМ и инкубировали при 37°С 5% СО₂. После этого клетки окрашивали с помощью sytox синего полинуклеотидного красителя (Invitrogen, VIC, Aus) и измеряли флуоресценцию с помощью проточного цитометрического анализа, используя LSR-II Fortessa (Becton Dickinson, NSW, Aus). FACSDiva программное обеспечение использовали для сбора данных, и FlowJo программное обеспечение для анализа. Властные клетки регулировали, используя свойства прямого и бокового светорассеяния. Жизнеспособные клетки, исключая sytox синий, определяли при 6 концентрациях для каждого лекарственного средства и определяли 50% летальную концентрацию (LC₅₀, в μМ).

Определение LC₅₀ и синергизма: Graphpad Prism использовали для расчета LC₅₀, используя нелинейную регрессию. Синергизм определяли путем индекс аддитивности (ИА на основании метода Chou Talalay, как описано (Chou Cancer Res; 70(2) January 15, 2010).

Исследования колоний: Колониеобразующие исследования осуществляли на свежеприготовленных и замороженных мононуклеарных фракциях от AML пациентов. Первичные клетки культивировали в двух повторах в чашках 35 мм (Griener-bio, Germany) при концентрациях от 1×10⁴ до 1×10⁵. Клетки высевали в 0,6% агар (Difco NSW, Aus): AIMDM 2x (IMDM powder-Invitrogen), дополненный NaHCO₃, декстраном, Пен/Стрепт, В меркаптоэтанолом и аспарагином):Фетальная бычья сыворотка (Sigma) при соотношении 2:1:1. Для оптимальных условий роста, все планшеты, содержащие GM-CSF (100 нг на планшет), IL-3(100 нг/планшет R&D Systems, USA) SCF(100 нг/планшет R&D Systems) и EPO (4 Ед/планшет) (Рост происходил в течение 2-3 недель в присутствии и отсутствии лекарственного средства при 37°С при 5% СО₂ в инкубаторе с повышенной влажностью. После инкубирования планшеты фиксировали с помощью 2,5% глутаральдегид в солевом растворе и оценивали, используя GelCount от Oxford Optronix (Abingdon, United Kingdom).

Вестерн-блоттинг: Лизаты приготавливали в NP40 лизирующем буфере (10 мМ Tris-HCl рН 7,4, 137 мМ NaCl, 10% глицерин, 1% NP40), дополненном коктейлем ингибитора протеазы (Roche, Dee Why, NSW, Australia). Белковые образцы кипятили при уменьшенной нагрузке красителя перед разделением на 4-12% Бис-Трис полиакриламидных гелях (Invitrogen, Mulgrave, VIC, Australia), и переносили на Hybond С нитроцеллюлозную мембрану (GE, Rydalmere, NSW, Australia) для инкубирования со специфическими антителами. Все стадии блокирования мембран и разведения антител осуществляли, используя 5% (об./об.) обезжиренного молока в PBS, содержащем 0,1% (об./об.) Твин-20 фосфатно-солевого буферного раствора (PBST) или ТРИС-буферизированный физраствор, и стадии промывки осуществляли с PBST или TBST. Вестерн-блотинги визуализировали с помощью усиленной хемилюминесценции (GE).

Эксперименты in vivo прививания AML: Исследования на животных осуществляли согласно правилам, утвержденным Alfred Medical Research and Education Precinct Animal Ethics Committee, MV4; 11 клетки, трансдуцированные с репортером люциферазы (pLUC2), внутривенно инъецировали в количестве 1×10⁵ клеток в облученные (100 рад) не страдающим ожирением диабетическим/тяжелым комбинированные иммунодефицитным (NOD/SCID/ IL2rγnull) мышам, как было описано ранее (Jin и др., Cell Stem Cell 2 июля 2009 г., том 5, издание 1, страницы 31-42). Прижившие клетки измеряли в день 7 путем количественного определения hCD45+ клеток в РВ с помощью проточной цитометрии и с помощью IVIS визуализации биолюминесценции MV4; 11 клеток. В день 10, мыши получали ежедневно перорально принудительное кормление Соединением 1, HCl (200 мкл 100 мг/кг дозировка, выраженная в виде свободного основания), растворенным в PEG400 (Sigma), абсолютном этаноле (Sigma) и дистиллированной Н₂О 40:10:60 или Соединением 2 (200 мкл 25 мг/кг) два раза в неделю, растворенным в 50% 2-гидроксипропил)-β-циклодекстрине (Sigma) и 50% 50 мМ HCl или комбинацией лекарственных средств или наполнителя, в течение 4 недель. Подсчеты импульсов в крови осуществляли, используя гематологический анализатор (BioRad, Gladesville, NSW).

IVIS визуализация: Биолюминесцентную визуализацию осуществляли, используя систему визуализации Caliper IVIS Lumina III XR. Мышей анестезировали изофлеурином и внутрибрюшинно инъецировали 100 мкл 125 мг/кг люциферина (Perkin Elmer, Springvale, VIC).

Материалы и методы для примера 4:

Клеточные линии: Клеточные линии миеломы человека (HMCL) имели происхождение из первичных миеломных клеток, культивированных в RPMI 1640 среде, дополненной 5% фетальной телячьей сывороткой от и 3 нг/мл рекомбинантного IL-6 для IL-6 зависимых клеточных линий. HMCL были репрезентативными для фенотипической и геномной гетерогенности и изменчивости ответной реакции пациента на терапию.

МТТ исследование: Жизнеспособность клеток измеряли, используя МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид) колориметрический анализ выживания. Клетки инкубировали с соединениями в планшетах на 96 лунок, содержащих конечный объем 100 мкл/лунку во времени. (2R)-2-{[(5S_a)-5-{3-хлор-2-метил-4-[2-(4-метилпиперазин-1-ил)этокси]фенил}-6-(5-фторфуран-2-ил)тиено[2,3-d]пиримидин-4-ил]окси}-3-(2-{[1-(2,2,2-трифторэтил)-1H-пиразол-5-ил]метокси}фенил)пропионовую кислоту (Соединение 2) использовали в 9 различных концентрация в соответствии с чувствительностью к одному средству. N-(4-гидроксифенил)-3-{6-[((3S)-3-(4-морфолинилметил)-3,4-дигидро-2(1H)-изохинолинил)карбонил]-1,3-бензодиоксол-5-ил}-N-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-1-индолизин карбоксамид гидрохлорид (Соединение 1, HCl) использовали в фиксированной дозе 1 мкМ. После окончания каждого лечения, клетки инкубировали с 1 мг/мл МТТ (50 мкл МТТ раствора 2,5 мг/мл для каждой лунки) при 37°С в течение 3 часов, предоставляя возможность метаболизироваться МТТ. В каждую лунку добавляли лизирующий буфер (100 мкл Лизирующий буфер: ДМФА (2:3) /SDS (1:3)) для растворения кристаллов формазана и после инкубирования в течение 18 часов, измеряли абсорбцию жизнеспособных клеток при 570 нм, используя спектрофотометр. В качестве контроля, клетки инкубировали только со средой и со средой, содержащей 0,1% ДМСО. В качестве контроля роста миеломных клеток, абсорбцию миеломных клеток записывали каждый день (D0, D1, D2, D3 и D4). Все эксперименты повторяли 3 раза, и каждое экспериментальное условие повторяли по меньшей мере в лунках в трех повторах в каждом эксперименте. Ингибирующий эффект рассчитывали в соответствии со следующей формулой: Ингибирующий эффект (%) = (1-Значение абсорбции леченных клеток/Значение абсорбции контрольных клеток)*100

Пример 1: BCL-2 и MCL1 представляют собой доминантные способствующие выживанию белки, экспрессируемые в AML

Образцы 7 AML клеточных линий и 13 первичных AML с >70% бластами подвергали иммуноблоттингу для определения белков, как указано на Фигуре 1. Как проиллюстрировано на Фигуре 1, протеомный обзор экспрессии представителей семейства BCL-2 в AML свидетельствует о том, что дополнительно к BCL-2, большинство образцов первичных AML и AML клеточных линий совместно экспрессирует способствующий выживанию белок MCL1. BCL-XL менее часто экспрессируется в AML.

Пример 2: Комбнированное BCL-2 и MCL1 нацеливание проявляет синергетическое уничтожение в AML

54 Образца AML от пациентов инкубировали в диапазоне концентраций 6-лог Соединения 1 (HCl соль), Соединения 2 или 1:1 концентрация в RPMI/15% FCS в течение 48 ч и определяли LC₅₀ (Фигура 2А).

Приблизительно 20% образцов первичных AML были чрезвычайно чувствительны либо к Соединению 1 или Соединению 2, с летальной концентрацией лекарственного средства, необходимой для уничтожения 50% первичных AML бластов через 48 часов (LC₅₀) в нижнем наномолярном диапазоне (LC₅₀<10 нМ) (Фигура 2А). В отличие от этого, если комбинировали Соединение 1 и Соединение 2, то пропорция образцов AML, которые были чувствительны, существенно повышалась до 70%, указывая на синергетическую активность при одновременном нацеливании BCL-2 и MCL1 (Фигура 2А). Некоторые результаты представлены на Фигуре 17.

Для верификации активности этого подхода in vivo, MV4; 11 AML клетки, экспрессирующие люциферазу, прививали NSG мышам и лечили с помощью Соединения 1 (HCl соль) или Соединения 2 отдельно, или в комбинации и опухолевую нагрузку оценивали через 14 и 21 дней терапии (Фигура 2В). После завершения 28 дней терапии, за мышами наблюдали для определения выживания (Фигура 2С). Эти эксперименты указывают на то, что комбинация Соединения 1 и Соединения 2 является высокоэффективной in vivo, подтверждая чрезвычайно хорошую активность, наблюдаемую при использовании первичных AML клеток в vitro.

Данные, представленные на Фигурах 2А-2С в настоящей заявке, свидетельствуют о синергетической активности комбинации между Соединением 1, HCl и Соединением 2 на AML.

Пример 3: Комбинированное BCL-2 и MCL1 ингибирование нацеливание функцию лейкемических предшественников, но не функцию нормальных предшественников

Для оценки токсичности ингибирования BCL-2 в комбинации с ингибированием MCL1 на функцию нормальных CD34+ клеток человека или фиколлированных бластных клеток от пациентов с AML, клоногенный потенциал оценивали после воздействия в течение 2 недель для комбинированных терапий. Колонии выращивали на агаре, дополненном 10% FCS, IL3, SCF, GM-CSF и ЕРО в течение 14 дней и колонии подсчитывали с помощью автоматизированного Gelcount® анализатора. Исследования для образцов первичных AML осуществляли в двух повторах и усредняли. Погрешности для CD34+ представляют собой среднее значение +/- СП 2 независимых нормальных донорских образцов. Результаты нормировали к числу колоний, подсчитанных в ДМСО контроле. Указанные концентрации лекарственных средств помещали в планшет в D1. Следует отметить, что Соединение 1 + Соединение 2 подавляет колониеобразующую активность AML без влияния на функции роста колоний нормальных CD34+.

В совокупности, примеры 2 и 3 свидетельствуют о том, что двойственное фармакологическое ингибирование BCL-2 и MCL1 представляет собой новый подход для лечения AML без необходимости дополнительной химиотерапии и с приемлемым терапевтическим окном безопасности.

Пример 4: Оценка in vitro выживания клеток множественной миеломы в ответ на действие MCL1 ингибитора в качестве единственного средства или в комбинации с BCL-2 ингибитором

Анализировали чувствительность 27 клеточных линий множественной миеломы человека к Соединению 1, Соединению 2 или к Соединению 2 в присутствии 1 мкМ Соединения 1 путем применения МТТ исследования жизнеспособности клеток. Определяли 50% ингибирующие концентрации (IC₅₀, в нМ).

Результаты представлены в следующей таблице:

Сильная синергетическая активность была показана при комбинировании Соединения 1 и Соединения 2 в большинстве клеточных линий по сравнению с соединениями отдельно.

Пример 5: Влияние in vitro на пролиферацию комбинирования MCL1 ингибитора с BCL-2 ингибитором на панели 17 клеточных линий дффузная крупноклеточной В-клеточной лимфомы (DLBCL)

Материалы и методы

Клеточные линии получали из источников и поддерживали в основной среде, дополненной FCS (Фетальная телячья сыворотка), как указано в таблице 1. Дополнительно, все среди содержали пенициллин (100 МЕ/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и L-глутамин (2 мМ). Если специально не указано иначе, то культуральные среды и добавки получали от Amimed/Bioconcept (Allschwil, Switzerland).

Клеточные линии культивировали при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО₂ и поддерживали в Т-75 колбах. Во всех случаях, клетки размораживали из замороженных маточных растворов, проводили через ≥1 пассаж, используя подходящие разведения, подсчет и оценку жизнеспособности, используя CASY устройство для подсчета клеток (Omni Life Science, Bremen, Germany) перед высеванием по 25 мкл/лунку при плотностях, указанных в Таблице 1 в планшеты на 384 лунок (Corning). Все клеточные линии определяли как не содержащие микоплазматических загрязнений с помощью ПЦР анализа, осуществленного на Idexx Radil (Columbia, МО, USA) и исключение ошибочной идентификации проводили с помощью панели 48 полиморфизма небольших нуклеотидов (SNP) в Asuragen (Austin, ТХ, USA) или самостоятельно.

Маточные растворы соединений приготавливали при концентрации 10 мМ в ДМСО (Sigma) и хранили при -20°С. При необходимости, для получения полной кривой зависимости «доза-эффект», маточные растворы предварительно разводили в ДМСО до 1000-кратной желательной начальной концентрации (см. таблицу 2). На следующий день после высевания клеток, восемь 2,5-кратных серийных разведений каждого соединения отмеряли, либо индивидуально или во всех возможных перестановках в шахматном порядке, непосредственно в планшеты для клеточных анализов, используя бесконтактный цифровой диспенсер 300D Digital Dispenser (TECAN, Switzerland), как представлено на Фигуре 4. Конечная концентрация ДМСО составляла 0,2% во всех лунках.

Влияния единичных агентов, а также их комбинаций в шахматном порядке на жизнеспособность клеток оценивали после инкубирования в течение 2 дней при 37°С/5% CO₂ путем количественного анализа клеточных уровней АТФ, используя CellTiterGlo (Promega, Madison, WI, USA) при 25 мкл реагента/лунку и n=2 повторах планшет на условие. Люминесценцию количественно измеряли на многофункциональном планшет-ридере M1000 (TECAN, Switzerland). Количество /жизнеспособность клеток во время добавления соединения также оценивали и использовали для оценки порядка времени удвоения популяции конкретной клеточной линии.

IC₅₀ для отдельных агентов рассчитывали, используя подгонку кривых по четырем параметрам. Потенциальные синергические взаимодействия между комбинациями соединений оценивали, используя 2D матрицу избыточного ингибирования в соответствии с моделью аддитивности Loewe и описывали в виде Оценки Синергизма (Synergy Score) (Lehar и др., Nat Biotechnol. июль 2009 г.; 27(7): 659-666). Все расчеты осуществляли с использованием модуля анализа комбинаций с собственным программным обеспечением. IC₅₀ определяли в виде концентрации соединения, при которой CTG сигнал уменьшается на 50% относительно такого сигнала, измеренного для контрольного наполнителя (ДМСО).

Интерпретацию Оценки синергизма (Synergy Score) осуществляли следующим образом:

SS ~ 0 → Аддитивный

SS>1 → Слабый синергизм

SS>2 → Синергизм

"Нач. конц." обозначает начальную концентрацию.

"Абс IC₅₀" обозначает абсолютную IC₅₀.

"Макс Инг" обозначает максимальное ингибирование.

Результаты

Влияние на пролиферацию комбинирования MCL1 ингибитора Соединения 3 с BCL-2 ингибитором Соединением 1, HCl оценивали на панели 17 клеточных линий диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (DLBCL). Соединение 3 в качестве единственного средства сильно ингибировало рост большинства 17 DLBCL тестируемых линий (Таблица 1). Таким образом, 14 клеточных линий проявляли значения IC₅₀ ниже 100 нМ, и дополнительная 1 клеточная линия проявляла значения IC₅₀ в диапазоне от 100 нМ и до мкМ. Только 2 клеточные линии проявляли IC₅₀ выше 1 мкМ.

Соединение 1, HCl в качестве единственного средства также ингибировало рост большинства 17 DLBCL тестируемых линий, хотя немного менее эффективно (Таблица 2). Таким образом, 2 клеточные линии проявляли значения IC₅₀ ниже 100 нМ, и 6 клеточные линии проявляли значения IC₅₀ между 100 нМ и 1 мкМ. Девять клеточных линий проявляли IC₅₀ выше 1 мкМ (четыре из которых выше 10 мкМ).

В комбинации, лечение с применением Соединения 3 и Соединения 1, HCl вызывает синергическое ингибирование роста (то есть, Оценка синергизма выше 2 - Lehar и др., Nat Biotechnol. Июль 2009 г.; 27(7): 659-666) в 16 из 17 DLBCL тестируемых клеточных линий (Таблица 2). В 5 клеточных линиях, заметный синергетический эффект, с оценками синергизма между 5 и 10. В 4 клеточных линиях, синергетический эффект является экстраординарным, достигая оценок синергизма между 10 и 17,3. Чрезвычайно важно, что синергизм не зависит от антипролиферативных эффектов единичного агента, и в действительности, является особенно сильным при концентрациях Соединения 3 и Соединения 1, которые не проявляют антипролиферативный эффект самостоятельно. Например, в DB клетках, Соединение 3 и Соединение 1 при второй тестируемой наиболее низкой концентрации проявляет ингибирование роста только на 1 и 2%, соответственно, в то время как соответствующая комбинация из двух соединений обеспечивает ингибирование роста на 96% (Фигура 4А, левая панель), таким образом, являясь на 91% выше аддитивности, рассчитанной на основании активности отдельно взятых средств (Фигура 4А, правая панель). В качестве дополнительно примера, на Toledo клетках, в которых Соединение 3 является менее эффективным и обеспечивает только частичное ингибирование роста (46%) при наиболее высокой тестируемой концентрации, комбинация со второй наиболее низкой концентрацией Соединения 1 приводит к синергетическому ингибированию роста на 98% (Фигура 4В, левая панель), таким образом, являясь на 52% выше аддитивности, рассчитанной на основании активности отдельно взятых средств (Фигура 4В, правая панель).

Кроме того, следует отметить, что синергетические эффекты проявляются для широкого диапазона концентраций отдельно взятых средств, которые должны оказаться полезными in vivo по отношению к гибкости касательно уровней и схем дозирования.

В заключение, комбинация Соединения 3 и Соединения 1 обеспечивает от сильного до экстраординарного синергетического ингибирования роста в большинстве тестируемых DLBCL клеточных линий.

Пример 6: Эффективность in vivo на Karpas422 ксенотрансплантатах при применении комбинации MCL1 ингибитора (Соединение 3) и BCL-2 ингибитора (Соединение 1)

Материалы и методы

Культура опухолевых клеток и инокуляция клеток

Клеточную линию Karpas 422 В-клеточной неходжкинской лимфомы человека (NHL) получали из плеврального экссудата пациента с резистентным к химиотерапии NHL. Клетки получали из DSMZ клеточного банка и культивировали в RPMI-1640 среде (BioConcept Ltd. Amimed,) дополненной 10% FCS (BioConcept Ltd. Amimed), 2 мМ L-глутамином (BioConcept Ltd. Amimed), 1 мМ пируватом натрия (BioConcept Ltd. Amimed) и 10 мМ HEPES (Gibco) при 37°C в атмосфере 5% СО₂ на воздухе. Клетки поддерживали в диапазоне 0,5 и 1,5×106 клеток/мл. Для установления Karpas 422 ксенотрансплантатов, клетки собирали и ресуспендировали в HBSS (Gibco) и смешивали с матригелем (BD Bioscience) (1:1 об./об.) перед инъецированием 200 мкл содержащих 1×107 клеток подкожно в правую лапу животных, которые были анестеризированы изофлураном. За двадцать четыре часа до инокуляции клеток всех животных облучали 5 Гр в течение 2 минут, используя γ-излучатель.

Рост опухоли

За ростом опухоли наблюдали регулярно после инокуляции клеток и животных рандомизировали на леченные группы (n=5), когда размер опухоли достигал подходящего объема. Во время периода лечения, объем опухоли измеряли приблизительно два раза в неделю, используя штангенциркули. Размер опухоли, в мм³, рассчитывали на основании формулы: (L×W2×π/6). Где W = ширина и L = длина опухоли.

Лечение

Животных, несущих опухоль (крысы), разделяли на леченные группы (n=5), когда их опухоли достигали подходящего размера с образованием группы со средним объем опухоли приблизительно 450 мм³. Леченные группы представлены в Таблице 3. Наполнитель для Соединения 1, HCl или Соединение 1, HCl вводили путем перорального (по) принудительного введения за 1 ч перед наполнителем для Соединения 3 или Соединение 3, которое вводили путем 15 минутной вв инфузии. Для вв инфузии животных анестезировали с помощью изофлурана/O₂ и наполнитель или Соединение 3 вводили через канюлю в хвостовую вену. Животных взвешивали в день (и) дозирования и дозу корректировали на массу тела, дозированный объем составил 10 мл/кг для обоих соединений.

Масса тела

Животных взвешивали по меньшей мере 2 раза в неделю и исследовали более часто при проявлении признаков каких-либо побочных эффектов.

Анализ данных и статистическая оценка

Опухолевые данные анализировали статистически, используя GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software). Если вариантности в данных нормально распределены, то данные анализировали с помощью однофакторного ANOVA с апостериорным критерием Даннетта для сравнения лечения относительно контрольной группы. Тест Тьюки с апостериорным критерием использовали для межгрупповых сравнений. В других случаях, использовали критерий Крускала-Уоллиса с апостериорным тестом Данна. Если это является применимым, то данные представляли в виде среднее значение ± СПС.

В качестве критерия эффективности, рассчитывали значение %Т/С (лечение/контроль) после окончания эксперимента в соответствии с:

(Δобъема опухоли^{леченные}/Δобъема опухоли^{контроль})*100

Регрессию опухоли рассчитывали в соответствии с:

-(Δобъема опухали^{леченные}/объема опухоли^{леченные в начале лечения})*100

где Δобъема опухоли представляет собой среднее значение объема опухоли в день оценки минус среднее значение объема опухоли в начале эксперимента.

Лечения начинали, когда средний объем опухоли составлял приблизительно 450 мм³. Соединение 1, HCl приготавливали в PEG400/EtOH/Phosal 50 PG (30/10/60) и Соединение 3 помещали в раствор.

РН обозначает один раз в неделю.

Результаты

Лечение с помощью комбинации свободного основания Соединения 1 в дозе 150 мг/кг по за 1 ч до Соединения 3 в дозе 20 мг/кг вв инфузии индуцирует полную регрессию во всех Karpas422 опухолях на 30 от начала лечения (Фигура 5). Все животные в леченной группе имели ремиссию без опухоли после лечения, которая останавливалась в развитии с дня 35 вплоть до дня 90. Положительный эффект комбинации наблюдался в группе с комбинацией по сравнению с активного одного агента. В день 34 опухолевый ответ в группе с одним агентом Соединением 3 и группе с комбинацией существенно отличались от группы с наполнителем (р<0,05). Лечение с использованием комбинации хорошо переносилось на основании изменения массы тела (Фигура 6).

Пример 7: Эффективность in vivo на DLBCL Toledo ксенотрансплантате с применением комбинации MCL1 ингибитора (Соединение 3) и BCL-2 ингибитора (Соединение 1, HCl)

Материалы и методы

Имплантация клеток

Модель ксенотрансплантата устанавливали путем прямой подкожной (пк) имплантации 3 миллионов суспензии клеток Toledo с 50% матригеля в подкожную область SCID/мышам с врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров. Все процедуры осуществляли с использованием асептических техник. Мышей анестезировали на весь период осуществления процедуры.

В целом, всего 6 животных на группу включали в исследование эффективности. Для исследования действий одного агента и комбинации, животным вводили дозы путем перорального принудительного введения через зонд (по) для Соединения 1 и внутривенно (вв) через хвостовую вену для Соединения 3. Соединение 1, HCl приготавливали в виде раствора в PEG300/EtOH/воде (40/10/50), и Соединение 3 помещали в раствор. Когда опухоли достигали приблизительно 220 мм³ в день 26 после имплантации клеток, мышей, несущих опухоли, рандомизировали в леченные группы.

Схема исследования, включая схему дозирования, для всех леченных групп, обобщена в таблице ниже. Животных взвешивали в день (дни) дозирования и дозу корригировали на массу тела, дозированный объем составил 10 мл/кг. Размеры опухоли и массы тела собирали во время рандомизации и два раза в неделю после этого во время осуществления исследования. После каждого дня сбора данных получали следующие данные: частота смертности, индивидуальные и групповые средние значения массы тела, и индивидуальные и групповые средние значения объема опухоли.

Для исследования на модели Toledo, лечения начинали в день 26 после имплантации клеток, когда средний объем опухоли составлял ~218-228 мм³.

РН обозначает once-еженедельное.

Масса тела (МТ)

% изменения массы тела рассчитывали согласно формуле (МТ_{текущая} -МТ_{исходная})/(МТ_{исходная})×100. Данные представлены в виде изменения массы тела в процентах от дня начала лечения.

Объем опухоли и процент мышей, оставшихся в исследовании

Процентные значения лечение/контроль (Т/С) рассчитывали, используя следующую формулу:

% Т/С=100×ΔT/ΔС, если ΔT>0

% регрессии=100×ΔТ/Т₀, если ΔT<0

где:

Т = средний объем опухоли группы, леченной лекарственным средством, в конечный день исследования;

ΔT = средний объем опухоли группы, леченной лекарственным средством, в конечный день исследования средний объем опухоли группы, леченной лекарственным средством, в начальный день дозирования;

Т₀ = средний объем опухоли группы, леченной лекарственным средством, в день разделения на группы;

С = средний объем опухоли контрольной группы в конечный день исследования; и

ΔC = средний объем опухоли контрольной группы в конечный день исследования средний объем опухоли контрольной группы в начальный день дозирования.

Процент мышей, оставшихся в исследовании = 6- Количество мышей, достигших конечной точки/16* 100

Статистический анализ

Все данные выражали в виде среднего значения ± стандартная погрешность среднего (СПС). Разница (дельта) объема опухоли и процент изменения массы тела использовали для статистического анализа. Сравнения между группами осуществляли с помощью однофакторного ANOVA с последующим апостериорным критерием теста Тьюки. Для всех статистических оценок, уровень значимости устанавливали при р<0,05. Описывали достоверность по сравнению с контрольной группой с наполнителем, если специально не указано иначе.

Результаты

На модели Toledo, Соединение 1 в виде свободного основания в дозе 100 мг/кг продуцирует статистически достоверные противоопухолевые эффекты с 37% Т/С. Соединение 3 в дозе 25 мг/кг приводит к отсутствию противоопухолевых эффектов с 102% Т/С (Фигура 7). Комбинация Соединения 1 + Соединения 3 приводит к опухолестазу с 3% Т/С, что является статистически достоверным по сравнению с группами, которым вводили Наполнитель, Соединение 1 и Соединение 3 (р<0,05, с помощью однофакторного теста ANOVA).

Таким образом, комбинированное ингибирование BCL-2 и MCL1 в DLBCL может обеспечить терапевтическое преимущество в клинике. Дополнительно, среднее изменение массы тела для Toledo представлено на Фигуре 8. Лечение мышей с применением Соединения 1, HCl и Соединения 3 проявляет прирост массы тела (1,081% и 2,3%, соответственно). Группа, которой вводили комбинацию, проявляет незначительную потерю массы тела (-3,2%). Других признаков побочных эффектов не наблюдали в этом исследовании. Все 6 животных выживали во время проведения исследования.

Взятые в совокупности, Примеры 2, 6 и 7 показали, что комбинация MCL1 ингибитора и BCL-2 ингибитора является эффективной при переносимых дозах у мышей и крыс, несущих ксенотрансплантаты клеточных линий, имеющих происхождение из острого миелолейкоза и лимфомы человека, свидетельствуя о том, что с помощью этой комбинации достигается подходящее терапевтическое окно при этих заболеваниях.

Пример 8: Влияние in vitro на пролиферацию комбинации MCL1 ингибитора с BCL-2 ингибитором на панели 13 клеточных линий острого миелоидного лейкоза (AML).

Материалы и методы

Клеточные линии получали из источников и поддерживали в основной среде, дополненной FBS (Фетальная бычья сыворотка), как указано в Таблице 1. Дополнительно, все среды содержали пенициллин (100 МЕ/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и L-глутамин (2 мМ).

Клеточные линии культивировали при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО₂, и выращивали в Т-150 колбах. Во всех случаях, клетки размораживали из замороженных материалов, пропускали через ≥1 пассаж, используя подходящие разведения, подсчитывали и анализировали для определения жизнеспособности, используя CASY счетчик клеток перед высеванием 150 мкл/лунку при плотностях, указанных в Таблице 1, в планшеты на 96 лунок. Все клеточные линии определяли как не содержащие микоплазматических загрязнений на собственной базе.

Маточные растворы соединений приготавливали при концентрации 5 мМ в ДМСО и хранили при -20°С.

Для анализа активности соединений в качестве единственных средств, клетки высевали и обрабатывали девятью 2-кратными серийными разведениями каждого соединения, диспергированного индивидуально, непосредственно в планшеты для анализа клеток. Влияния соединений на жизнеспособность клеток оценивали через 3 дня инкубирования при 37°С/5% CO₂ путем количественного определения клеточных уровней АТФ, используя CellTiterGlo при концентрации 75 мкл реагента/лунку. Все эксперименты осуществляли в трех повторах. Люминесценцию количественно определяли на мультифункциональном планшет-ридере. IC₅₀ для единичного средства рассчитывали, используя стандартную подгонку кривой по четырем параметрам. IC₅₀ определяли как концентрацию соединения, при которой CTG сигнал уменьшается на 50% относительно такого сигнала, измеренного для контрольного наполнителя (ДМСО).

Для анализа активности соединений в комбинации, клетки высевали и лечили с применением семи или восьми 3,16-кратных серийных разведений распределенного каждого соединения, либо индивидуально или во всех возможных комбинациях в шахматном порядке, непосредственно в планшеты для анализа клеток, как показано на Фигуре 9. Эффекты агентов в виде монотерапии, а также их комбинаций в шахматном порядке на жизнеспособность клеток оценивали через 3 дня инкубирования при 37°С/5% СО₂ путем количественного определения клеточных уровней АТФ, используя CellTiterGlo при концентрации 75 мкл реагента/лунку. Осуществляли два независимых эксперимента, каждый из них проводили в двух повторах. Люминесценцию количественно определяли на мультифункциональном планшет-ридере.

Потенциальные синергические взаимодействия между комбинациями соединений оценивали, используя 2D матрицу избыточного ингибирования в соответствии с моделью аддитивности Loewe и представляли в виде Оценки Синергизма (Lehar и др., Nat Biotechnol. июль 2009 г.; 27(7): 659-666). Все расчеты осуществляли, используя Clalice™ Bioinformatics Software.

Время удвоения, указанное в Таблице 3, представляет собой среднее значение времени удвоения, полученное при различных пассажах (в Т-150 колбах), осуществленных из размороженных клеток при их высевании в планшеты на 96 лунок.

Интерпретацию Оценки синергизма (Synergy Score) осуществляли следующим образом:

SS ~ 0 → Аддитивный

SS>1 → Слабый синергизм

SS>2 → Синергизм

Результаты

Комбинация (а). Влияние на пролиферацию комбинирования MCL1 ингибитора Соединения 3 с BCL-2 ингибитором Соединением 1 оценивали на панели 13 клеточных линий острого миелоидного лейкоза (AML).

Соединение 3 в качестве единственного средства сильно ингибировало рост большинства 13 AML тестируемых линий (Таблица 4а). Таким образом, 10 клеточных линий проявляли IC₅₀ ниже 100 нМ, и дополнительные 2 клеточные линии проявляли IC₅₀ между 100 нМ и 1 мкМ. Только 1 клеточная линия проявляла IC₅₀ выше 1 мкМ.

Соединение 1, HCl в качестве единственного средства также ингибировало рост нескольких AML тестируемых линий, хотя немного менее эффективно (Таблица 4а). Таким образом, 5 клеточных линий проявляли IC₅₀ ниже 100 нМ, и 2 клеточные линии проявляли IC₅₀ между 100 нМ и 1 мкМ. Шесть клеточных линий проявляли IC₅₀ выше 1 мкМ.

В комбинации, Лечение Соединением 3 и Соединением 1, HCl вызывает синергическое ингибирование роста (то есть Оценка синергизма выше 2) во всех тестируемых 13 клеточных линий (Таблица 5а). В 2 клеточных линиях, заметный синергетический эффект, с оценками синергизма между 5 и 10. В 10 клеточных линиях, синергетический эффект является экстраординарным, достигая оценок синергизма между 10 и 19,8. Чрезвычайно важно, что синергизм не зависит от антипролиферативных эффектов единичного агента, и в действительности, является особенно сильным при концентрациях Соединения 3 и Соединения 1, которые самостоятельно не имеют антипролиферативного эффекта. Например, на OCI-AML3 клетках, Соединение 3 и Соединение 1 в третьей наиболее низкой тестируемой концентрации проявляет ингибирование роста на 5 и 1%, соответственно, в то время как соответствующая комбинация из двух соединений обеспечивает ингибирование роста на 84% (Фигура 9А, верхняя левая панель), таким образом, являясь на 79% выше аддитивности, рассчитанной на основании активности отдельно взятых средств (Фигура 9А, верхняя правая панель).

Кроме того, следует отметить, что Синергетические эффекты проявляются для широкого диапазона концентраций отдельно взятых средств, которые должны оказаться полезными in vivo по отношению к гибкости касательно уровней и схем дозирования.

В заключение, комбинация Соединения 3 и Соединения 1 обеспечивает синергетическое ингибирование роста во всех 13 AML тестируемых клеточных линиях. Чрезвычайно важно, экстраординарное синергетическое ингибирование роста наблюдали в большинстве тестируемых AML клеточных линий (10/13).

Комбинация (б). Влияние на пролиферацию комбинирования MCL1 ингибитора Соединения 3 с BCL-2 ингибитором АВТ-199 оценивали на панели 8 клеточных линий острого миелоидного лейкоза (AML).

Соединение 3 в качестве единственного средства сильно ингибировало рост большинства из 8 AML тестируемых линий (Таблица 4а). Таким образом, 5 клеточных линий проявляли IC₅₀ ниже 100 нМ, и дополнительные 2 клеточные линии проявляли IC₅₀ между 100 нМ и 1 мкМ. Только 1 клеточная линия проявляла IC₅₀ выше 1 мкМ.

АВТ-199 в качестве единственного средства также ингибировал рост AML линий, хотя с меньшей эффективностью (Таблица 4а). Таким образом, только одна клеточная линия проявляла IC₅₀ ниже 100 нМ, и 2 клеточные линии проявляли IC₅₀ между 100 нМ и 1 мкМ. Пять клеточных линий проявляли IC₅₀ выше 1 мкМ.

В комбинации, лечение MCL1 ингибитором и АВТ-199 вызывает синергическое ингибирование роста (то есть Оценка синергизма выше 2) на всей панели 8 тестируемых клеточных линий (Таблица 5b). В большинстве клеточных линий, синергетический эффект является экстраординарным, достигая оценок синергизма между 10 и 17,6. Чрезвычайно важно, что синергизм не зависит от антипролиферативных эффектов единичного агента, и в действительности, является особенно сильным при концентрациях MCL1 ингибитора и АВТ-199, которые самостоятельно не имеют антипролиферативного эффекта. Например, в OCI-AML3 клетках, MCL1 и АВТ-199 в третьей наиболее низкой тестируемой концентрации проявляет ингибирование роста на 26% и 18%, соответственно, в то время как соответствующая комбинация из двух соединений обеспечивает ингибирование роста на 91% (Фигура 13, верхняя левая панель).

В заключение, комбинация Соединения 3 и АВТ-199 обеспечивает синергетическое ингибирование роста во всех 8 тестируемых AML клеточных линиях. Чрезвычайно важно, экстраординарное синергетическое ингибирование роста наблюдали в большинстве тестируемых AML клеточных линий (7/8).

Комбинация (с). Влияние на пролиферацию комбинирования MCL1 ингибитора Соединения 3 с BCL-2 ингибитором Соединением 4 оценивали на панели 5 клеточных линий острого миелоидного лейкоза (AML).

Соединение 3 в качестве единственного средства сильно ингибировало рост 5 AML тестируемых линий (Таблица 4b). Таким образом, все клеточные линии проявляли IC₅₀ ниже 200 нМ. Соединение 4, HCl в качестве единственного средства также ингибировало рост 4 из 5 тестируемых клеточных линий с IC₅₀ ниже или равным 40 нМ, одна клеточная линия является резистентной к Соединению 4 с IC₅₀ 10 мкМ. В комбинации, лечение Соединением 3 и Соединением 4, HCl вызывает синергическое ингибирование роста (то есть Оценка синергизма выше 2) во всех 5 тестируемых клеточных линиях (Таблица 5с). В 2 клеточных линиях, заметный синергетический эффект, с оценками синергизма между 5 и 10. В 1 клеточной линии, синергетический эффект является экстраординарным, обеспечивая оценку синергизма 16,5. Чрезвычайно важно, что синергизм не зависит от антипролиферативных эффектов единичного агента, и в действительности, является особенно сильным при концентрациях Соединения 4, HCl и Соединения 3, которые самостоятельно не имеют или имеют низкий антипролиферативный эффект. Например, в OCI-AML3 клетках, Соединение 4, HCl и Соединение 3 в третьей наиболее низкой тестируемой концентрации проявляет ингибирование роста на 1 и 40%, соответственно, в то время как соответствующая комбинация из двух соединений обеспечивает ингибирование роста на 98% (Фигура 1А, левая панель; характерно для двух независимых экспериментов), таким образом, являясь на 53% выше аддитивности, рассчитанной на основании активности отдельно взятых средств (Фигура 14А, правая панель). В ML-2, Соединение 4, HCl и Соединение 3 в пятой наиболее низкой тестируемой концентрации проявляет ингибирование роста на 18 и 26%, соответственно, в то время как соответствующая комбинация из двух соединений обеспечивает ингибирование роста на 100% (Фигура 14В, левая панель; характерно для двух независимых экспериментов), таким образом, являясь на 51% выше аддитивности, рассчитанной на основании активности отдельно взятых средств (Фигура 15, правая панель)

В заключение, комбинация Соединения 4 и Соединение 3 обеспечивает синергетическое ингибирование роста во всех 5 тестируемых AML клеточных линиях.

Пример 9: Эффект in vitro на пролиферацию комбинирования MCL1 ингибитора с BCL-2 ингибитором на панели 12 клеточных линий нейробластомы (NB)

Материалы и методы

Клеточные линии получали из источников и поддерживали в основной среде, дополненной FBS, как указано в Таблице 1. Дополнительно, все среды содержали пенициллин (100 МЕ/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и L-глутамин (2 мМ). Клеточные линии культивировали при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO₂, и выращивали в Т-150 колбах. Во всех случаях, клетки размораживали из замороженных материалов, пропускали через ≥1 пассаж, используя подходящие разведения, подсчитывали и анализировали для определения жизнеспособности, используя CASY счетчик клеток перед высеванием 150 мкл/лунку при плотностях, указанных в Таблице 6 в планшеты на 96 лунок. Все клеточные линии определяли как не содержащие микоплазматических загрязнений на собственной базе.

Маточные растворы соединений приготавливали при концентрации 5 мМ в ДМСО и хранили при -20°С. Для анализа активности соединений в качестве единственных средств, клетки высевали и лечили с применением девяти 3,16-кратных серийных разведений каждого соединения, диспергированного индивидуально, непосредственно в планшеты для анализа клеток. Влияния соединений на жизнеспособность клеток оценивали через 2 или 3 дня инкубирования (как указано в Таблице 6) при 37°С/5% CO₂ путем количественного определения клеточных уровней АТФ, используя CellTiterGlo в количестве 150 мкл реагента/лунку. Проводили два независимых эксперимента, каждый из них осуществляли в двух повторах. Все эксперименты осуществляли в трех повторах. Люминесценцию количественно определяли на многофункциональном планшет-ридере. IC₅₀ для отдельных агентов в качестве монотерапии рассчитывали, используя стандартную подгонку кривой по четырем параметрам. IC₅₀ определяли как концентрацию соединения, при которой CTG сигнал уменьшается на 50% относительно такого сигнала, измеренного для контрольного наполнителя (ДМСО).

Осуществляли идентичные эксперименты для оценки потенциальных синергических взаимодействий между комбинациями соединений. Проводили оценку синергизма, используя 2D матрицу избыточного ингибирования в соответствии с моделью аддитивности Loewe (Lehar и др., Nat Biotechnol. июль 2009 г.; 27(7): 659-666). Все расчеты осуществляли, используя программное обеспечение Chalice ТМ Bioinformatics.

Время удвоения, указанное в Таблице 6, представляет собой среднее значение времени удвоения, полученное при различных пассажах (в Т-150 колбах), осуществленных из размороженных клеток при их высевании в планшеты на 96 лунок.

Интерпретацию Оценки синергизма (Synergy Score) осуществляли следующим образом:

SS ~ 0 → Аддитивный

SS>1 → Слабый синергизм

SS>2 → Синергизм

Результаты

Влияние на пролиферацию комбинирования MCL1 ингибитора Соединения 3 с BCL-2 ингибитором Соединением 1 оценивали на панели 12 клеточных линий нейробластомы. Три из 12 тестируемых клеточных линий являются чувствительными к Соединению 3 в качестве единственного средства (Таблица 7). Одна клеточная линия проявляла IC₅₀ ниже 100 нМ, и дополнительные 2 клеточные линии проявляли IC₅₀ между 100 нМ и 1 мкМ.

Все клеточные линии являются резистентными к Соединению 1, HCl в качестве единственного средства, где все тестируемые клеточные линии проявляют IC₅₀ выше 1 мкМ. В комбинации, лечение с применением Соединения 3 и Соединения 1 вызывает синергическое ингибирование роста (то есть Оценка синергизма выше 2 - Lehar и др., Nat Biotechnol. июль 2009 г.; 27(7): 659-666) в 11 из 12 NB тестируемых клеточных линий (Таблица 8). В 5 клеточных линиях, синергетический эффект является экстраординарным, достигая оценок синергизма между 10 и 17,81. Чрезвычайно важно, что синергизм не зависит от антипролиферативных эффектов единичного агента, и в действительности, является особенно сильным при концентрациях Соединения 3 и Соединения 1, HCl, которые самостоятельно не имеют антипролиферативного эффекта. Например, в LAN-6 клетках, Соединение 3 и Соединение 1, HCl при 630 нМ проявляет ингибирование роста только на 12% и 0%, соответственно, в то время как соответствующая комбинация из двух соединений обеспечивает ингибирование роста на 95% (Фигура 10, верхняя левая панель), таким образом, являясь на 76% выше аддитивности, рассчитанной на основании активности отдельно взятых средств (Фигура 10, верхняя правая панель). В заключение, комбинация Соединения 3 и Соединения 1 обеспечивает от сильного до экстраординарного синергетического ингибирования роста в большинстве тестируемых нейробластомных клеточных линиях.

Пример 10: Эффект in vitro на пролиферацию комбинирования MCL1 ингибитора с BCL-2 ингибитором на панели 8 клеточных линий В-клеточного острого лимфобластного лейкоза (B-ALL) и 10 клеточных линий Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза (T-ALL).

Материалы и методы

Клеточные линии получали из источников и поддерживали в основной среде, дополненной FBS, как указано в Таблице 1. Дополнительно, все среды содержали пенициллин (100 МЕ/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и L-глутамин (2 мМ). Клеточные линии культивировали при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО₂, и выращивали в Т-150 колбах. Во всех случаях, клетки размораживали из замороженных материалов, пропускали через ≥1 пассаж, используя подходящие разведения, подсчитывали и анализировали для определения жизнеспособности, используя CASY счетчик клеток перед высеванием 150 мкл/лунку при плотностях, указанных в Таблице 9 в планшеты на 96 лунок. Все клеточные линии определяли как не содержащие микоплазматических загрязнений на собственной базе.

Маточные растворы соединений приготавливали при концентрации 5 мМ в ДМСО и хранили при -20°С. Для анализа активности соединений в качестве единственных средств, клетки высевали и обрабатывали девятью 2-кратными серийными разведениями каждого соединения, диспергированного индивидуально, непосредственно в планшеты для анализа клеток. Влияния соединений на жизнеспособность клеток оценивали через 3 дня инкубирования при 37°С/5% СО₂ путем количественного определения клеточных уровней АТФ, используя CellTiterGlo при концентрации 75 мкл реагента/лунку. Все условия тестировали в трех повторах. Люминесценцию количественно определяли на мультифункциональном планшет-ридере. Рассчитывали IC₅₀ для единичных агентов в качестве монотерапии, используя стандартную подгонку кривой по четырем параметрам. IC₅₀ определяли как концентрацию соединения, при которой CTG сигнал уменьшается на 50% относительно такого сигнала, измеренного для контрольного наполнителя (ДМСО).

Для анализа активности соединений в комбинации, клетки высевали и лечили с применением семи или восьми 3,16-кратных серийных разведений распределенного каждого соединения, либо индивидуально или во всех возможных комбинациях в шахматном порядке, непосредственно в планшеты для анализа клеток, как показано на Фигуре 1. Эффекты агентов в виде монотерапии, а также их комбинаций в шахматном порядке на жизнеспособность клеток оценивали через 3 дня инкубирования при 37°С/5% СО₂ путем количественного определения клеточных уровней АТФ, используя CellTiterGlo при концентрации 75 мкл реагента/лунку. Для B-ALL клеточных линий, осуществляли два независимых эксперимента, каждый из них проводили в двух повторах. Для Т-ALL клеточных линий, один осуществленный эксперимент проводили в трех повторах. Люминесценцию количественно определяли на мультифункциональном планшет-ридере.

Время удвоения, указанное в Таблице 9, представляет собой среднее значение времени удвоения, полученное при различных пассажах (в Т-150 колбах), осуществленных из размороженных клеток при их высевании в планшеты на 96 лунок.

Интерпретацию Оценки синергизма (Synergy Score) осуществляли следующим образом:

SS ~ 0 → Аддитивный

SS>1 → Слабый синергизм

SS>2 → Синергизм

Результаты

Влияние на пролиферацию комбинирования MCL1 ингибитора с BCL-2 ингибитором оценивали на панели 8 В-ALL и 10 T-ALL клеточных линий. MCL1 ингибитор в качестве единственного средства сильно ингибировал рост большинства тестируемых ALL клеточных линий (Таблица 10). Таким образом, 13 ALL клеточных линий проявляли IC₅₀ ниже 100 нМ, и дополнительные 2 ALL клеточные линии проявляли IC₅₀ между 100 нМ и 1 мкМ. Только 3 ALL клеточные линии проявляли IC₅₀ выше 1 мкМ.

BCL-2 ингибитор в качестве единственного средства также ингибировал рост нескольких тестируемых ALL клеточных линий, хотя он был менее эффективным (Таблица 10). Таким образом, 5 клеточных линий проявляли IC₅₀ ниже 100 нМ, и 2 клеточные линии проявляли IC₅₀ между 100 нМ и 1 мкМ. Одиннадцать ALL клеточных линий проявляли IC₅₀ выше 1 мкМ. В комбинации, лечение с применением MCL1 ингибитора и BCL-2 ингибитора вызывает синергическое ингибирование роста (то есть Оценка синергизма выше 2 - Lehar и др., Nat Biotechnol. июль 2009 г.; 27(7): 659-666) во всех тестируемых 17/18 ALL клеточных линиях (Таблица 11). В 6 клеточных линиях, заметный синергетический эффект, с оценками синергизма между 5 и 10. В 5 клеточных линиях, синергетический эффект является экстраординарным, достигая оценок синергизма между 10 и 15,9. Чрезвычайно важно, что синергизм не зависит от антипролиферативных эффектов единичного агента, и в действительности, является особенно сильным при концентрациях MCL1 ингибитора и BCL-2 ингибитора, которые самостоятельно не имеют антипролиферативного эффекта. Например, в NALM-6 клетках, MCL1 ингибитор и BCL-2 ингибитор в четвертой наиболее низкой тестируемой концентрации проявляет ингибирование роста на 6 и 8%, соответственно, в то время как соответствующая комбинация из двух соединений обеспечивает ингибирование роста на 61% (Фигура 11, верхняя левая панель).

В заключение, комбинация MCL1 ингибитора и BCL-2 ингибитора обеспечивает синергетическое ингибирование роста в большинстве (17/18) тестируемы ALL клеточных линиях. Чрезвычайно важно, экстраординарное синергетическое ингибирование роста наблюдали в 5/18 тестируемых ALL клеточных линиях.

Пример 11: Влияние in vitro на пролиферацию комбинирования MCL1 ингибитора с BCL-2 ингибитором на панели 5 клеточных линий лимфомы из клеток зоны мантии (MCL).

Материалы и методы

Клеточные линии получали из источников и поддерживали в основной среде, дополненной FBS, как указано в Таблице 12. Дополнительно, все среды содержали пенициллин (100 МЕ/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и L-глутамин (2 мМ).

Клеточные линии культивировали при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО₂, и выращивали в Т-150 колбах. Во всех случаях, клетки размораживали из замороженных материалов, пропускали через ≥1 пассаж, используя подходящие разведения, подсчитывали и анализировали для определения жизнеспособности, используя CASY счетчик клеток перед высеванием 150 мкл/лунку при плотностях, указанных в Таблице 12 в планшеты на 96 лунок. Все клеточные линии определяли как не содержащие микоплазматических загрязнений на собственной базе.

Маточные растворы соединений приготавливали при концентрации 5 мМ в ДМСО и хранили при -20°С. Для анализа активности соединений в качестве единственных средств или в комбинации, клетки высевали и лечили с применением семи или восьми 3,16-кратных серийных разведений распределенного каждого соединения, либо индивидуально или во всех возможных комбинациях в шахматном порядке, непосредственно в планшеты для анализа клеток. Эффекты агентов в виде монотерапии, а также их комбинаций в шахматном порядке на жизнеспособность клеток оценивали после инкубирования в течение 2 дней при 37°С/5% CO₂ путем количественного определения клеточных уровней АТФ, используя CellTiterGlo в количестве 150 мкл реагента/лунку. Все условия тестировали в трех повторах. Люминесценцию количественно определяли на мультифункциональном планшет-ридере.

Рассчитывали IC₅₀ для единичных агентов в качестве монотерапии, используя стандартную подгонку кривой по четырем параметрам. IC₅₀ определяли как концентрацию соединения, при которой CTG сигнал уменьшается на 50% относительно такого сигнала, измеренного для контрольного наполнителя (ДМСО).

Время удвоения, указанное в Таблице 12, представляет собой среднее значение времени удвоения, полученное при различных пассажах (в Т-150 колбах), осуществленных из размороженных клеток при их высевании в планшеты на 96 лунок.

Оценка синергизма

SS ~ 0 → Аддитивный

SS>1 → Слабый синергизм

SS>2 → Синергизм

Результаты

Влияние на пролиферацию комбинирования MCL1 ингибитора с BCL-2 ингибитором оценивали на панели 5 клеточных линий лимфомы из клеток зоны мантии.

В качестве единственного средства, MCL1 ингибиторы проявляли более высокую активность по сравнению с BCL-2 ингибитором. Таким образом, 3 клеточные линии проявляли IC₅₀ ниже 100 нМ для MCL1 ингибитора, в то время как только одна клеточная линия проявляла IC₅₀ ниже 100 нМ для BCL-2 ингибитора (Таблица 13).

В комбинации, лечение с применением MCL1 ингибитора и BCL-2 ингибитора вызывает синергическое ингибирование роста (то есть Оценка синергизма выше 2 - Lehar и др., Nat Biotechnol. июль 2009 г.; 27(7): 659-666) во всех тестируемых клеточных линиях (Таблица 14), как проиллюстрировано на Фигуре 12. Чрезвычайно важно, в 4/5 клеточных линиях, заметный синергетический эффект, с Оценками синергизма выше 5.

Пример 12: Влияние in vitro на пролиферацию комбинирования MCL1 ингибитора с BCL-2 ингибитором на панели 5 клеточных линий мелкоклеточного рак легкого (SCLC).

Все клеточные линии получали от АТСС.Культуральную среду, содержащую RPMI1640 (Invitrogen), дополненную 10% FBS (HyClone), использовали для COR-L95, NCI-H146, NCI-H211, SHP-77, SW1271, NCI-H1339, NCI-H1963, и NCI-H889. Культуральную среду, содержащую Waymouth MB 752/1 (Invitrogen) с 10% FBS, использовали для DMS-273. Культуральную среду, содержащую DMEM/F12 (Invitrogen), содержащую 5% FBS, и дополненную 0,005 мг/мл инсулина, 0,01 мг/мл трансферрина, и 30 нМ раствора селенита натрия (Invitrogen), 10 нМ гидрокортизона (Sigma), 10 нМ бета-эстрадиола (Sigma), и 2 мМ L-глутамина (HyClone), использовали для NCI-H1105.

Клеточные линии культивировали при 37°С и 5% CO₂ инкубаторе и выращивали в Т-75 колбах. Во всех случаях, клетки размораживали из замороженных материалов, пропускали через ≥1 пассаж, используя 1:3 разведения, подсчитывали и анализировали для определения жизнеспособности, используя ViCell счетчик (Beckman-Coulter), перед высеванием в 384-лунки. Для размножения и выращивания клеточные линии, клетки отсоединяли от колб, используя 0,25% Трипсин-EDTA (GIBCO). Все клеточные линии определяли как не содержащие микоплазматические загрязнения, что определяли с помощью методологии ПЦР обнаружения, анализируя на Idexx Radil (Columbia, МО, USA) и корректно идентифицировали путем обнаружения панели SNP.

Пролиферация клеток измеряли в течение 72 часов в CellTiter-Glo((CTG) анализах (Promega G7571) и все представленные результаты выражали результат измерений по меньшей мере в трех повторах. Для анализов CellTiter-Glo™, клетки распределяли в культуру леченных тканей в планшетах на 384 лунки (Corning 3707) с конечным объемом 35 мкл среды и при плотности 5000 клеток на лунку. Через 24 часа после высевания, по 5 мкл серий разведений каждого соединения переносили в планшеты, содержащие клетки, что приводило к получению концентраций соединений в интервале 0-10 мкМ и конечной концентрации ДМСО (Sigma D8418) 0,16%. Планшеты инкубировали в течение 72 часов и влияние соединений на пролиферацию клеток определяли, используя люминесцентный анализ жизнеспособности клеток CellTiter-Glo((Promega G7571) и Envision планшет-ридер (Perkin Elmer).

Люминесцентный анализ жизнеспособности клеток CellTiter-Glo(представляет собой гомогенный метод для определения количества жизнеспособных клеток в культуре на основании количественного определения присутствующего АТФ, что сигнализирует о присутствии метаболически активных клеток. Метод подробно описан в Technical Bulletin, ТВ288 Promega. Вкратце, клетки высевали в многолуночный планшет со светонепроницаемыми стенками в культуральную среду, как описано выше. Также приготавливали контрольные лунки, содержащие среду без клеток, для получения значения фоновой люминесценции. После этого добавляли 15 мкл CellTiter-Glo® реагента и содержимое смешивали в течение 10 минут на орбитальном встряхивателе на индуцирования лизиса клеток. После этого записывали люминесценцию, используя планшет-ридер.

Процент ингибирования роста и избыточное ингибирование анализировали, используя программное обеспечение Chalice (CombinatoRx, Cambridge MA). Процентное значение ингибирования роста относительно ДМСО проявляли на панели меченного ингибирования, и количество ингибирования в избытке рассчитанного количества на панели меченного ADD избыточного ингибирования (Фигуры 15 (а)-(е)). Концентрации Соединения 1, HCl представлены в нижней строке слева направо и возрастающие концентрации Соединения 3 в крайней слева колонке снизу вверх. Все оставшиеся точки в системе данных представляют собой результаты действия комбинации двух ингибиторов, что соответствуют концентрациям отдельных агентов, представленных на двух осях. Анализ данных пролиферации клеток осуществляли, используя анализатор Chalice, как описано в Lehar и др., Nat Biotechnol. июль 2009 г.; 27(7): 659-666. Избыточное ингибирование рассчитывали, используя модель синергизма Loewe, которая измеряет влияние на рост относительно тех значений, которые предполагают получить, если два лекарственных средства ведут себя аддитивным образом в зависимости от дозы. Положительные числа представляют собой площади возрастающего синергизма.

Оценка синергизма

SS ~ 0 → Аддитивная доза

SS>2 → Синергизм

SS>1 → Слабый синергизм

Результаты

В комбинации, лечение с применением Соединения 1 и Соединения 3 вызывает синергическое ингибирование роста (то есть Оценка синергизма выше 2) в 8/10 клеточных линий мелкоклеточный рак легкого. Чрезвычайно важно, в 6 клеточных линиях, заметный синергетический эффект, с Оценками синергизма выше 6.

Пример 13: Влияние in vivo на модели имеющих происходение от пациента первичных AML HAMLX5343 с применением комбинации MCL1 ингибитора (Соединение 3) и BCL-2 ингибитора (Соединение 1, HCl или АВТ-199)

Материалы и методы

Материалы

Животные

NOD scid гамма (NSG) самкам мышей весом 17-27 грамм (Jackson Laboratories) предоставляли возможность акклиматизироваться с доступом к корму и воде ad libitum в течение 3 дней перед манипуляциями.

Первичные модели опухолей

Имеющие происхождение от пациента первичные AML модели HAMLX5343 несущие KRAS мутацию и дикий тип FLT3 получали из Dana Farber Cancer Institute.

Тестируемые соединения, препараты

Соединение 1, HCl приготавливали в 5% Этаноле, 20% Dexolve-7 в виде раствора для внутривенного введения или приготавливали в PEG300/EtOH/воде (40/10/50) для перорального введения. АВТ-199 приготавливали в PEG300/EtOH/воде (40/10/50) для перорального введения. Все они были стабильными по меньшей мере в течение одной недели при 4°С.Соединение 3 приготавливали в липосомальном препарате в виде раствора для внутривенного препарата, который является стабильным в течение трех недель при 4°С.Наполнитель и дозированные растворы соединений приготавливали при необходимости. Всем животным вводили дозу 10 мл/кг Соединения 1 (выраженного в виде свободного основания) или АВТ-199, или 5 мл/кг для Соединения 3.

Методы

Схема эксперимента

Восемь леченных групп использовали в исследовании 7844HAMLX5343-XEF, как обобщено в Таблице 15. Все лечения начинали при достижении средней опухолевой нагрузки (%CD-45 положительных клеток) в интервале от 8% до 15%.

В этом исследовании, Соединение 1 вводили путем перорального принудительного введения (по) или внутривенного введения в дозе 50 мг/кг один раз в неделю, АВТ-199 вводили в дозе 25 мг/кг путем перорального принудительного введения (ро) один раз в неделю, либо в качестве единичного средства или в комбинации с Соединением 3 в дозе 12,5 мг/кг один раз в неделю, соответственно, в течение 18 дней.

Оба, как Соединение 1 (выраженное в виде свободного основания), так и АВТ-199 вводили в дозе 10 мл/кг. Соединение 3 вводили в дозе 5 мл/кг. Дозу корректировали на массу тела. Массу тела записывали два раза в неделю и опухолевую нагрузку записывали один раз в неделю.

Первичная модель AML

Для этого эксперимента, 32 мышам имплантировали первичную AML линию HAMLX5343. Мышам инъецировали внутривенно 2,0 миллиона лейкозных клеток. Когда опухолевая нагрузка достигала 8%-15%, животных рандомизировали на восемь групп по четыре животных в каждую для наполнителя, Соединения 1 (по), Соединения 1 (вв), АВТ-199, Соединения 3, или комбинированного лечения. После осуществления лечения в течение 18 дней, исследование останавливали, если опухолевая нагрузка достигала 99%. Опухолевую нагрузку определяли с помощью FACS анализа. Наблюдения за животными

Состояние и поведение животных, включая уход за внешним видом и способность передвигаться, мониторили два раза в день. Наблюдали за общим состоянием здоровья мышей и записывали смертность ежедневно. Любых умирающих животных умертвляли.

Измерение опухоли

У мышей отбирали образцы крови путем надреза хвоста один раз в неделю. Кров вносили в IgG контрольную лунку и CD33/CD45 лунку планшета на 96 лунок. Кровь лизировали с помощью 200 мкл RBC лизирующего буфера два раза при КТ, затем промывали один раз с помощью FACS буфера (5% FBS в PBS). После этого образцы инкубировали в течение 10-30 минут при 4С в 100 мкл блокирующего буфера (5% мышиного Fc Block+5% человеческого Fc Block+90% FACS буфера). 20 мкл контрольной смеси IgG (2,5 мкл мышиного igG1 K изотипного контроля -РЕ+2,5 мкл мышиного igG1 K изотипного контроля-АРС+15 мкл FACS буфера) добавляли в IgG контрольные лунки и 20 мкл CD33/CD45 смеси (2,5 мкл мышиных античеловеческих CD33-PE+2,5 мкл мышиных античеловеческих CD45-APC+15 мкл FACS буфера). Образцы инкубировали в течение 30-60 минут при 4С, затем промывали два раза перед проведением анализа. Образцы прогоняли на Canto с помощью FACSDiva программного обеспечения. Анализ осуществляли с помощью FloJo программного обеспечения. Процент CD45-положительных, живых, единичных клеток описывали в виде опухолевой нагрузки.

Анализ данных

Процентное значение лечение /контроль (T/С) рассчитывали, используя следующую формулу:

%Т/С=100 × ΔT/ΔС, если ΔT>0

% Регрессии = 100 × ΔТ/Т_{начальное}, если ΔT<0

где:

Т = средняя опухолевая нагрузка группы, леченной лекарственным средством, в конечный день исследования;

ΔT = средняя опухолевая нагрузка группы, леченной лекарственным средством, в конечный день исследования средняя опухолевая нагрузка группы, леченной лекарственным средством, в начальный день дозирования;

Т_{начальное} = средняя опухолевая нагрузка группы, леченной лекарственным средством, в начальный день дозирования;

С = средняя опухолевая нагрузка контрольной группы в конечный день исследования; и

ΔC = средняя опухолевая нагрузка контрольной группы в конечный день исследования средняя опухолевая нагрузка контрольной группы в начальный день дозирования.

Все данные выражали в виде среднего значения ± СПС. Разницу (дельта) опухолевой нагрузки и массы тела использовали для статистического анализа. Осуществляли сравнения между группами для конечных измерений, используя ANOVA с критерием Тьюки. Статистический анализ осуществляли, используя GraphPad Prism.

Статистический анализ

Все данные выражали в виде среднего значения ± стандартная погрешность среднего (СПС). Разницу (дельта) объема опухоли и массы тела использовали для статистического анализа. Осуществляли сравнения между группами, используя Kruskal-Wallis ANOVA с последующим апостериорным критерием Данна или критерием Тьюки. Для всех статистических оценок, уровень значимости устанавливали при р<0,05. Описывали достоверность по сравнению с контрольной группой с наполнителем, если специально не указано иначе. Стандартные протоколы, используемые в фармакологических исследованиях, предварительно не проводили для демонстрации статистически достоверных преимуществ комбинаций по сравнению с соответствующих лечением агентами в виде монотерапий. Статистическая мощность часто ограничивается эффективность ответа единичного средства и/или вариабельностью модели. Тем не менее, представлены р-значения для комбинаций относительно лечения единичными средствами в виде монотерапий.

Результаты

Синергический противоопухолевый эффект комбинированного MCL1 и BCL-2 ингибирования

В 7844HAMLX5343-XEF исследовании, Соединение 1, АВТ-199 или Соединение 3 отдельно не проявляют противоопухолевой активности на HAMLX5343 модели, несущей KRAS мутацию, при введении в дозе 50 мг/кг (перорально или ее), 25 мг/кг (перорально) или 12,5 мг/кг (ее) один раз в неделю, соответственно (%Т/С 98, 92, 98 или 99%, соответственно, р>0,05).

При пероральном введении, Соединение 1 в дозе 50 мг/кг или АВТ-199 в дозе 25 мг/кг в комбинации с Соединением 3 (12,5 мг/кг вв) один раз в неделю приводит к опухолестазу (%Т/С 3% или 6%, соответственно, р<0,05) на этой модели. С другой стороны, комбинация внутривенно вводимого Соединения 1 с Соединением 3 индуцирует практически полную регрессию опухоли (% регрессии 100%), что достоверно отличается от любого единичного средства (р<0,05) или комбинации Соединение 1/Соединение 3 по/вв. Среднюю опухолевую нагрузку для каждой леченной группы представляли графически в динамике во времени для периода лечения продолжительностью 18 дней, как представлено на Фигуре 1. Изменение опухолевой нагрузки, %Т/С или % регрессии представлено в Таблице 16 и на Фигурах 16 (а)-(в).

Вывод

AML представляет собой агрессивное и гетерогенное злокачественное заболевание системы крови, вызываемое трансформацией гематологических клеток-предшественников вследствие приобретенных генетических перестроек (Patel и др., New England Journal of Medicine 2012 366:1079-1089). 5-ти летний коэффициент выживаемости при AML является низким вследствие отсутствия эффективных терапий. Обход апоптоза является характерным отличительным признаком злокачественного новообразования (Hanahan и др., Cell 2000 100:57-70). Одним из первичных средств, с помощью которых раковые клетки избегают апоптоза, является повышенное регулирование способствующих выживанию белков семейства BCL-2, таких как BCL-2, BCL-xL и MCL1.

MCL1 ген является наиболее часто амплифицированным геном у пациентов со злокачественным новообразованием (Beroukhim и др., Nature 2010 463:899-905). Кроме того, оба BCL-2 и MCL1 высоко экспрессируются при AML. Следовательно, комбинация Соединения 1 (BCL-2i) и Соединения 3 (MCL1) может обеспечивать синергизм путем усиления проапоптотических сигналов в качестве основного механизма против AML.

В настоящей заявке нами было показано, что BCL-2 ингибитор Соединение 1 или АВТ-199 в комбинации с Соединением 3 (MCL1 ингибитор) имеют ярко выраженный синергетический эффект при лечении AML на AML модели ксенотрансплантата с KRAS мутацией (дт FLT3). Комбинация вв/вв Соединение 1/Соединение 3 имеет преимущества по сравнению с лечением по/вв комбинацией на одном и том же уровне дозирования. Полученные результаты указывают на то, что комбинация и MCL1 ингибиторов будет являться эффективной терапией для AML.

1. Комбинация для лечения злокачественного новообразования, содержащая:

(a) BCL-2 ингибитор, выбранный из: (i) N-(4-гидроксифенил)-3-{6-[((3S)-3-(4-морфолинилметил)-3,4-дигидро-2(1H)-изохинолинил)карбонил]-1,3-бензодиоксол-5-ил}-N-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-1-индолизин карбоксамида или его соли присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой или основанием, (ii) 5-(5-хлор-2-{[(3S)-3-(морфолин-4-илметил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]карбонил}фенил)-N-(5-циано-1,2-диметил-1H-пиррол-3-ил)-N-(4-гидроксифенил)-1,2-диметил-1H-пиррол-3-карбоксамида или его соли присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой или основанием, и (iii) 4-(4-{[2-(4-хлорфенил)-4,4-диметилциклогекс-1-ен-1-ил]метил}пиперазин-1-ил)-N-[(3-нитро-4-{[(оксан-4-ил)метил]амино}фенил)сульфонил]-2-[(1H-пирроло[2,3-b]пиридин-5-ил)окси]бензамида (ABT-199);

и (б) MCL1 ингибитор, выбранный из: (iv) (2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-хлор-2-метил-4-[2-(4-метилпиперазин-1-ил)этокси]фенил}-6-(5-фторфуран-2-ил)тиено[2,3-d]пиримидин-4-ил]окси}-3-(2-{[1-(2,2,2-трифторэтил)-1H-пиразол-5-ил]метокси}фенил)пропионовой кислоты или ее соли присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой или основанием, и (v) (2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-хлор-2-метил-4-[2-(4-метилпиперазин-1-ил)этокси]фенил}-6-(4-фторфенил)тиено[2,3-d]пиримидин-4-ил]окси}-3-(2-{[2-(2-метоксифенил)пиримидин-4-ил]метокси}фенил)пропионовой кислоты или ее соли присоединения с фармацевтически приемлемой кислотой или основанием, для одновременного, последовательного или раздельного применения.

2. Комбинация по п. 1, где BCL-2 ингибитор представляет собой N-(4-гидроксифенил)-3-{6-[((3S)-3-(4-морфолинилметил)-3,4-дигидро-2(1H)-изохинолинил)карбонил]-1,3-бензодиоксол-5-ил}-N-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-1-индолизин карбоксамид.

3. Комбинация по п. 1, где BCL-2 ингибитор представляет собой 5-(5-хлор-2-{[(3S)-3-(морфолин-4-илметил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]карбонил}фенил)-N-(5-циано-1,2-диметил-1H-пиррол-3-ил)-N-(4-гидроксифенил)-1,2-диметил-1H-пиррол-3-карбоксамид.

4. Комбинация по п. 2, где N-(4-гидроксифенил)-3-{6-[((3S)-3-(4-морфолинилметил)-3,4-дигидро-2(1H)-изохинолинил)карбонил]-1,3-бензодиоксол-5-ил}-N-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-1-индолизин карбоксамид представлен в форме гидрохлоридной соли.

5. Комбинация по п. 3, где 5-(5-хлор-2-{[(3S)-3-(морфолин-4-илметил)-3,4-дигидроизохинолин-2(1H)-ил]карбонил}фенил)-N-(5-циано-1,2-диметил-1H-пиррол-3-ил)-N-(4-гидроксифенил)-1,2-диметил-1H-пиррол-3-карбоксамид представлен в форме гидрохлоридной соли.

6. Комбинация по п. 1, где BCL-2 ингибитор представляет собой ABT-199.

7. Комбинация по п. 1, где MCL1 ингибитор представляет собой (2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-хлор-2-метил-4-[2-(4-метилпиперазин-1-ил)этокси]фенил}-6-(5-фторфуран-2-ил)тиено[2,3-d]пиримидин-4-ил]окси}-3-(2-{[1-(2,2,2-трифторэтил)-1H-пиразол-5-ил]метокси}фенил)пропионовую кислоту.

8. Комбинация по п. 1, где MCL1 ингибитор представляет собой (2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-хлор-2-метил-4-[2-(4-метилпиперазин-1-ил)этокси]фенил}-6-(4-фторфенил)тиено[2,3-d]пиримидин-4-ил]окси}-3-(2-{[2-(2-метоксифенил)пиримидин-4-ил]метокси}фенил)пропионовую кислоту.

9. Комбинация по любому из пп. 1-8 для применения для лечения злокачественного новообразования.

10. Комбинация для применения по п. 9, где BCL-2 ингибитор и MCL1 ингибитор обеспечиваются в количествах, которые совместно терапевтически эффективны для лечения злокачественного новообразования.

11. Комбинация для применения по п. 9, где BCL-2 ингибитор и MCL1 ингибитор обеспечиваются в количествах, которые синергетически эффективны для лечения злокачественного новообразования.

12. Комбинация для применения по п. 9, где BCL-2 ингибитор и MCL1 ингибитор обеспечиваются в синергетически эффективных количествах, которые способны уменьшать дозу, необходимую для каждого соединения для лечения злокачественного новообразования, обеспечивая при этом эффективное лечение злокачественного новообразования, с уменьшением в конечном итоге побочных эффектов.

13. Комбинация для применения по любому из пп. 9-12, где злокачественное новообразование представляет собой лейкоз.

14. Комбинация для применения по п. 13, где лейкоз представляет собой острый миелоидный лейкоз, T-ALL или B-ALL.

15. Комбинация для применения по любому из пп. 9-12, где злокачественное новообразование представляет собой миелодиспластический синдром или миелопролиферативное заболевание.

16. Комбинация для применения по любому из пп. 9-12, где злокачественное новообразование представляет собой лимфому.

17. Комбинация для применения по п. 16, где лимфома представляет собой неходжкинскую лимфому.

18. Комбинация для применения по п. 17, где неходжкинская лимфома представляет собой диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому или лимфому из клеток зоны мантии.

19. Комбинация для применения по любому из пп. 9-12, где злокачественное новообразование представляет собой множественную миелому.

20. Комбинация для применения по любому из пп. 9-12, где злокачественное новообразование представляет собой нейробластому.

21. Комбинация для применения по любому из пп. 9-12, где злокачественное новообразование представляет собой мелкоклеточный рак лёгкого.

22. Комбинация по любому из пп. 1-8, которая дополнительно содержит один или несколько наполнителей.

23. Применение комбинации по любому из пп. 1-8 для приготовления лекарственного средства для лечения злокачественного новообразования.

24. Применение по п. 23, где злокачественное новообразование представляет собой лейкоз.

25. Применение по п. 24, где лейкоз представляет собой острый миелоидный лейкоз, T-ALL или B-ALL.

26. Применение по п. 23, где злокачественное новообразование представляет собой миелодиспластический синдром или миелопролиферативное заболевание.

27. Применение по п. 23, где злокачественное новообразование представляет собой лимфому.

28. Применение по п. 27, где лимфома представляет собой неходжкинскую лимфому.

29. Применение по п. 28, где неходжкинская лимфома представляет собой диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому или лимфому из клеток зоны мантии.

30. Применение по п. 23, где злокачественное новообразование представляет собой множественную миелому.

31. Применение по п. 23, где злокачественное новообразование представляет собой нейробластому.

32. Применение по п. 23, где злокачественное новообразование представляет собой мелкоклеточный рак лёгкого.

33. Лекарственное средство, содержащее, раздельно или совместно,

(a) BCL-2 ингибитор, как определено в п. 1, и

(б) MCL1 ингибитор, как определено в п. 1,

34. Применение терапевтически эффективного количества (a) BCL-2 ингибитора, как определено в п. 1, и

(б) MCL1 ингибитора, как определено в п. 1,

для приготовления лекарственного средства, полезного при лечении злокачественного новообразования.

35. Применение по п. 34, где BCL-2 ингибитор представляет собой N-(4-гидроксифенил)-3-{6-[((3S)-3-(4-морфолинилметил)-3,4-дигидро-2(1H)-изохинолинил)карбонил]-1,3-бензодиоксол-5-ил}-N-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-1-индолизин карбоксамид, где BCL-2 ингибитор применяют при комбинированном лечении в дозе от 50 до 1500 мг.

36. Применение по п. 34, где BCL-2 ингибитор вводят один раз в неделю.

37. Применение по п. 34, где BCL-2 ингибитор представляет собой N-(4-гидроксифенил)-3-{6-[((3S)-3-(4-морфолинилметил)-3,4-дигидро-2(1H)-изохинолинил)карбонил]-1,3-бензодиоксол-5-ил}-N-фенил-5,6,7,8-тетрагидро-1-индолизин карбоксамид, где BCL-2 ингибитор вводят при осуществлении комбинированного лечения один раз сутки.

38. Применение по п. 34, где BCL-2 ингибитор и MCL1 ингибитор вводят перорально.

39. Применение по п. 34, где BCL-2 ингибитор вводят перорально и MCL1 ингибитор вводят внутривенно.

40. Применение по п. 34, где BCL-2 ингибитор и MCL1 ингибитор вводят внутривенно.

41. Применение терапевтически эффективного количества (a) BCL-2 ингибитора, как определено в п. 1, и (б) MCL1 ингибитора, как определено в п. 1, для приготовления лекарственного средства, полезного для сенсибилизации пациента, который (i) рефракторный к по меньшей мере одному химиотерапевтическому лечению, или (ii) имеет рецидив после лечения с применением химиотерапии, или в обоих случаях (i) и (ii).

Изобретение относится к области органической химии, а именно к гетероциклическому соединению формулы (I) или к его фармацевтически приемлемой соли, где L представляет собой (CH2)5, который необязательно замещен одной метильной группой; R1 представляет собой водород; R2 представляет собой галоген, CN, C1–C4-галогеналкил, C1–C4-галогеналкокси или фуранил; R3 представляет собой С1-C4-галогеналкил, -CN или галоген.

Конъюгированное с пальмитиновой кислотой производное gnrh пролонгированного действия и фармацевтическая композиция, содержащая его // 2746566

Группа изобретений относится к новому конъюгированному с пальмитиновой кислотой производному гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH) пролонгированного действия и фармацевтической композиции, содержащей его.

Антитело, специфически связывающееся с muc1, и его применение // 2746413

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающиеся с муцином 1 (MUC1).

Антитела к pd1 и способы их применения // 2746409

Группа изобретений относится к иммунологии и медицине, в частности к антителам к PD1 и к способам их применения. Предложено выделенное антитело, которое специфично связывается с человеческим PD1 и содержит HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71; HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72; HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73; HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74; HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, и FR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77 (RDN) в положениях 71, 72 и 73 согласно нумерации Kabat.

Способ ингибирования опухолевых клеток новыми производными 3-трифторметилхиноксалин 1,4-диоксида // 2746395

Изобретение относится к новым производным 3-трифторметилхиноксалин 1,4-диоксида, содержащим остаток диамина в бензольном фрагменте хиноксалинового цикла, а также его фармакологически приемлемые соли, гидраты, соответствующим формуле: .

Способы и композиции для лечения персистирующих инфекций // 2746383

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения или предотвращения лимфомы Ходжкина. Для этого вводят композицию, содержащую ингибитор активности PD-1 или экспрессии PD-1.

Фторированное соединение циклопропиламина, способ получения, фармацевтическая композиция и ее использование // 2746323

Изобретение относится к соединению формулы I, которое является ингибитором лизинспецифической деметилазы 1 (ЛСД1) его рацемату, R-изомеру, S-изомеру, фармацевтической соли и их смеси, способам их получения, фармацевтической композиции на их основе, их применению для лечения и способу лечения злокачественного опухолевого заболевания, связанного с активностью ЛСД1, ингибитору ЛСД1.

Способы получения цитотоксических производных бензодиазепина // 2746322

Изобретение относится к новым способам получения димерных индолинобензодиазепиновых соединений, например, формулы 18А и IA и их синтетических предшественников. Технический результат: разработаны новые улучшенные способы получения димеров индолинобензодиазепина, которые являются более эффективными и пригодными для крупномасштабного производственного процесса.

Антитела анти-tnfrsf25 // 2746314

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к антителу против члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли 25 (TNFRSF25) или его антигенсвязывающему фрагменту, а также к композиции и изделию, его содержащему.

Фармацевтическая композиция для лечения и/или предотвращения злокачественных опухолей // 2746123

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения злокачественной опухоли, которая содержит, в качестве активного ингредиента, антитело или его фрагмент, обладающие иммунологической реактивностью с белком MRAP2, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID № 2, 4, 6 или 8, или аминокислотную последовательность, обладающую 80% или большей идентичностью последовательностей с аминокислотной последовательностью или с фрагментом белка MRAP2, содержащим 7 или больше последовательных аминокислот.

Кристалл пирролопиримидина для получения jak-ингибитора // 2746045

Изобретение относится к кристаллу A и кристаллу B ацетонитрилата соединения, представленного формулой I, фармацевтическим композициям на их основе, их применению для получения лекарственного средства для лечения или профилактики опосредованного янус-киназой заболевания.