Клеточный препарат, включающий жировые клетки
Группа изобретений относится к области медицины, а именно к клеточному препарату для лечения остеоартроза и восстановления мышц, содержащему: смесь, включающую тонко измельченную жировую клетку и жировую стволовую клетку, где указанные тонко измельченную жировую клетку и жировую стволовую клетку получают посредством стадий: разделения жировой ткани, взятой от субъекта, на клеточную фракцию и жидкую фракцию с получением клеточной фракции; удаления примесей из клеточной фракции с получением концентрата жировой клетки и жировой стволовой клетки; и тонкого измельчения жировой клетки в концентрате жировой клетки и жировой стволовой клетки, где в 1 мл указанного клеточного препарата содержится от 100 тысяч до 400 тысяч жировых стволовых клеток, и где указанная жировая ткань подвергается тонкому измельчению для придания клетке размера, достаточного для прохождения через иглу калибра от 18 до 30, относится к способу лечения остеоартроза и восстановления мышц и применению клеточного препарата для лечения остеоартроза и восстановления мышц, относится к способу получения клеточного препарата для лечения остеоартроза и восстановления мышц, включающему стадии: разделения жировой ткани, взятой от субъекта, на клеточную фракцию и жидкую фракцию с получением клеточной фракции; удаления примесей из клеточной фракции с получением концентрата жировой клетки и жировой стволовой клетки; и тонкого измельчения жировой клетки в концентрате жировой клетки и жировой стволовой клетки с получением смеси, включающей тонко измельченную жировую клетку и жировую стволовую клетку, где указанный клеточный препарат содержит смесь, включающую тонко измельченную жировую клетку и жировую стволовую клетку, где в 1 мл указанного клеточного препарата содержится от 100 тысяч до 400 тысяч жировых стволовых клеток, и где указанная жировая ткань подвергается тонкому измельчению для придания клетке размера, достаточного для прохождения через иглу калибра от 18 до 30, относится к клеточному препарату для лечения остеоартроза, содержащему: смесь, включающую жировую клетку и жировую стволовую клетку, где указанные жировую клетку и жировую стволовую клетку получают посредством стадий: разделения жировой ткани, взятой от субъекта, на клеточную фракцию и жидкую фракцию с получением клеточной фракции; удаления примесей из клеточной фракции с получением концентрата жировой клетки и жировой стволовой клетки; и тонкого измельчения жировой клетки в концентрате жировой клетки и жировой стволовой клетки с получением смеси, включающей тонко измельченную жировую клетку и жировую стволовую клетку; отделения жировой стволовой клетки от смеси тонко измельченной жировой клетки и жировой стволовой клетки с получением жировой стволовой клетки; и смешивания отделенной жировой стволовой клетки с концентратом жировой клетки и жировой стволовой клетки, где в 1 мл указанного клеточного препарата содержится от 100 тысяч до 400 тысяч жировых стволовых клеток, и где указанная жировая ткань подвергается тонкому измельчению для придания клетке размера, достаточного для прохождения через иглу калибра от 18 до 30, и его способу получения. Группа изобретений обеспечивает более благоприятный терапевтический эффект при введении жировых стволовых клеток и тонко измельченных жировых клеток при лечении остеоартроза, в отличие от введения только жировых стволовых клеток. 10 н. и 2 з.п. ф-лы, 3 табл., 5 пр., 3 ил.
Область техники
Настоящее изобретение относится к клеточному препарату, пригодному для уменьшения боли, вызванной заболеванием межкостных суставов, и для лечения заболевания. Кроме того, настоящее изобретение относится к клеточному препарату, пригодному для восстановления вырожденных или поврежденных мышц.
Предшествующий уровень техники
Инъекция гиалуроновой кислоты, трансплантация жировых клеток и т.п. известны как средства увеличения объема мягких тканей у человека и часто применяются в области косметической хирургии, пластической хирургии и подобных областях, таких как удаление лицевых морщин, лечение полостей и пластика молочной железы. Однако в то время как лечение инъекцией гиалуроновой кислоты является простым, существует проблема, заключающаяся в том, что гиалуроновая кислота адсорбируется приблизительно за полгода и поэтому продолжительность эффекта является низкой. Кроме того, также как и в случае трансплантации жировых клеток, жировые клетки иногда подвергаются некрозу или адсорбируются организмом после трансплантации. Таким образом, недостатком является вероятная необходимость проведения повторной операции или возможность появления шрама в некоторых случаях.
Для устранения этих недостатков была предложена трансплантация жировых стволовых клеток, и был разработан способ эффективного выделения жировых стволовых клеток (например, см. Патентные документы 1 и 2). При трансплантации жировых стволовых клеток улучшается уровень фиксации клеток после трансплантации и наблюдается определенный эффект регенерации мягких тканей. Однако жировые стволовые клетки, полученные таким способом, могут в некоторых случаях включать примеси, и существует вероятность того, что эти примеси могут вызывать некроз жировых клеток или образование уплотнений (кальцификацию) после трансплантации. Жировые клетки обычно получают посредством липосакции, и отобранная жировая ткань представляет собой смесь, включающую примеси помимо жировых клеток и жировых стволовых клеток. Примеси, которые необходимо удалить из такой смеси, включают кровь (особенно эритроциты), мертвые/живые клетки, старые клетки и подобное. В то же время в Патентном документе 3 предложен способ инъекции клеточного препарата (Концентрированный обогащенный жир, CRF (зарегистрированная торговая марка)), включающего здоровые концентрированные жировые клетки и жировые стволовые клетки, приготовленные посредством удаления примесей, которые вызывают кальцификацию и некроз жировой ткани, из смеси, полученной посредством липосакции и включающей жировые клетки и жировые стволовые клетки, с помощью центрифугирования с применением шприца, снабженного взвешивающим фильтром. С помощью данного способа улучшается уровень фиксации клеток, и такая проблема, как развитие уплотнения, возникает редко. Таким образом, данный способ становится широко распространенным.
Как описано выше, разрабатывается большое разнообразие техник выделения и концентрирования жировых клеток и жировых стволовых клеток, и скоро будут предоставлены жировые клетки и жировые стволовые клетки, являющиеся безопасными и обладающие превосходной способностью к фиксации. Однако трансплантация жировых клеток и жировых стволовых клеток уже применяется для регенерации мягких тканей в большинстве случаев, и эффективность данных клеток в отношении, например, уменьшения артралгии или регенерации ткани в суставе, не была изучена в достаточной степени. Кроме того, не известно, восстанавливается ли мышца при введении жировых клеток и жировых стволовых клеток в поврежденную мышцу.
Документы, относящиеся к предшествующему уровню техники
Патентные документы
Патентный документ 1: JP 2005-519883 W.
Патентный документ 2: JP 2007-509601 W.
Патентный документ 3: JP 2007-533396 W.
Краткое содержание изобретения
Проблемы, которые предстоит решить изобретению
Основной целью настоящего изобретения является предоставление клеточного препарата, пригодного для уменьшения боли, вызванной заболеванием межкостных суставов, и для лечения заболевания. Кроме того, настоящее изобретение относится к клеточному препарату, пригодному для восстановления вырожденных или поврежденных мышц.
Решения проблем
Настоящий изобретатель провел серьезные исследования для решения вышеупомянутых проблем и обнаружил, что инъекция жировых клеток пациенту с жалобами на артралгию быстро уменьшает симптом и что эффект является продолжительным. Более того, настоящий изобретатель также обнаружил, что инъекция комбинации жировых клеток и жировых стволовых клеток приводит к эффективной регенерации костной ткани или хрящевой ткани в суставе в дополнение к вышеупомянутому уменьшению артралгии. Кроме того, настоящий изобретатель обнаружил, что поврежденная мышца восстанавливается после введения клеточного препарата, включающего жировую клетку и мезодермальную стволовую клетку, в место повреждения мышцы. По результатам продолжающихся исследований на основании данных открытий было завершено настоящее изобретение.
Таким образом, настоящее изобретение представляет клеточный препарат, способ уменьшения боли в межкостном суставе, способ регенерации ткани в межкостном суставе, способ восстановления мышцы и подобные из следующих аспектов:
Пункт 1. Клеточный препарат для лечения заболевания межкостного сустава, включающий жировую клетку.
Пункт 2. Клеточный препарат по п. 1, включающий кроме того мезодермальную стволовую клетку.
Пункт 3. Клеточный препарат по п. 1, в котором мезодермальная стволовая клетка представляет собой жировую стволовую клетку.
Пункт 4. Клеточный препарат по п. 1, включающий от 1 до 10 мезодермальных стволовых клеток на одну жировую клетку.
Пункт 5. Клеточный препарат по п. 1, в котором жировая клетка представляет собой клетку, которую подвергли гамма-облучению.
Пункт 6. Клеточный препарат по п. 1, в котором заболевания межкостных суставов представляют собой заболевание любого вида, выбранного из группы, состоящей из заболевания позвоночника, заболевания суставов, аутоиммунного заболевания и остеонекроза.
Пункт 7. Применением препарата клеток, включающего жировую клетку, для производства терапевтического агента для заболевания межкостного сустава.
Пункт 8. Клеточный препарат для применения в лечении заболевания межкостного сустава, включающий жировую клетку.
Пункт 9. Способ уменьшения боли в межкостном суставе, включающий стадию введения клеточного препарата, включающего жировую клетку, в межкостный сустав пациента с заболеванием межкостного сустава.
Пункт 10. Способ регенерации межкостного сустава, включающий стадию введения клеточного препарата, включающего жировую клетку и мезодермальную стволовую клетку, в межкостный сустав пациента с заболеванием межкостного сустава.
Пункт 11. Клеточный препарат для восстановления мышцы, включающий жировую клетку и мезодермальную стволовую клетку.
Пункт 12. Клеточный препарат по п. 11, в котором мезодермальная стволовая клетка представляет собой жировую стволовую клетку.
Пункт 13. Клеточный препарат по п. 11, включающий от 1 до 10 мезодермальных стволовых клеток на одну жировую клетку.
Пункт 14. Клеточный препарат по п. 11, в котором жировая клетка представляет собой клетку, которую подвергли гамма-облучению.
Пункт 15. Применение клеточного препарата, включающего жировую клетку и мезодермальную стволовую клетку, для получения препарата для восстановления мышцы.
Пункт 16. Клеточный препарат, включающий жировую клетку и мезодермальную стволовую клетку, для восстановления мышцы.
Пункт 17. Способ восстановления мышцы, включающий стадию введения клеточного препарата, включающего жировую клетку и мезодермальную стволовую клетку, в место повреждения мышцы пациента с поврежденной мышцей.
Эффекты изобретения
В соответствии с клеточным препаратом, включающим жировую клетку, являющимся предметом настоящего изобретения, можно улучшить скольжение сустава или ему подобного посредством жировых клеток, ВКМ (внеклеточного матрикса), окружающего жировые клетки или подобные им, таким образом обеспечив быстрое уменьшение артралгии, и достичь превосходного эффекта уменьшения боли, вызванной заболеванием межкостного сустава. Кроме того, например, при инъекции клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения, в межпозвоночный диск или подобное, клеточный препарат служит в качестве уплотнения и оказывает положительный эффект на движение тела позвонка (улучшение). Более того, эффект уменьшения артралгии, оказываемый препаратом, являющимся предметом настоящего изобретения, продолжается в течение длительного времени.
Кроме того, в соответствии с клеточным препаратом, включающим жировую клетку и мезодермальную стволовую клетку, являющимся предметом настоящего изобретения, боль, вызванная заболеванием межкостного сустава, уменьшается под действием жировых клеток, и при этом уменьшается время регенерации ткани в суставе, такой как костная ткань, хрящевая ткань или мягкие ткани, под действием мезодермальных стволовых клеток. Кроме того, при применении комбинации жировых клеток и мезодермальных стволовых клеток можно не только уменьшить вышеупомянутую боль, но также за счет доли мезодермальных стволовых клеток можно еще больше повысить эффективность регенерации ткани, поскольку мезодермальные клетки удерживаются в поврежденной области за счет действия жировых клеток. Таким образом, клеточный препарат, являющийся предметом настоящего изобретения, включающий жировую клетку и мезодермальную стволовую клетку, является также эффективным для лечения заболевания межкостного сустава.
Кроме того, клеточный препарат, являющийся предметом настоящего изобретения, включающий жировую клетку и мезодермальную стволовую клетку, обладает превосходным восстановительным действием на мышцу, поврежденную в результате дегенерации мышцы или удаления мышцы хирургическим путем. Кроме того, в соответствии с клеточным препаратом, включающим жировую клетку, являющимся предметом настоящего изобретения, боль, вызванную повреждением мышцы, можно быстро уменьшить, и таким образом клеточный препарат также способствует улучшению качества жизни пациента.
Обычно при применении способа восстановления ткани посредством культивирования мезодермальных стволовых клеток, таких как жировые стволовые клетки, существует вероятность загрязнения во время культивирования и подобного и развития инфекционного заболевания после трансплантации. Однако поскольку жировые клетки и мезодермальные стволовые клетки, включенные в клеточный препарат, являющийся предметом настоящего изобретения, можно напрямую выделить и сконцентрировать из отобранной жировой ткани или подобного без применения стадии культивирования, жировые клетки и мезодермальные стволовые клетки можно приготовить без контакта с открытым воздухом. Таким образом, нет угрозы инфекционного заболевания и подобного. Кроме того, поскольку клеточный препарат, являющийся предметом настоящего изобретения, обычно готовят с применением жировых клеток и мезодермальных стволовых клеток, отобранных у самого пациента/пациентки, который требует лечения заболевания межкостного сустава или восстановления мышцы, клеточный препарат не связан с проблемой иммуноотторжения и является высоко безопасным.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1(а) показывает рентгенограмму, показывающую левый коленный сустав объекта А перед введением клеточного препарата, и Фиг. 1(б) показывает рентгенограмму, показывающую левый коленный сустав объекта А приблизительно через 1 месяц после введения клеточного препарата.
Фиг. 2(а) показывает рентгенограмму, показывающую правый коленный сустав объекта В перед введением клеточного препарата, и Фиг. 2(б) показывает рентгенограмму, показывающую левый коленный сустав объекта В приблизительно через 1 месяц после введения клеточного препарата.
Фиг. 3 показывает характерный пример магнитно-резонансных изображений, показывающих, что регенерация костной ткани и остеонекроз улучшаются или исчезают при введении клеточного препарата.
Варианты применения настоящего изобретения
1. Клеточный препарат
Настоящее изобретение представляет клеточный препарат для лечения заболевания межкостных суставов и клеточный препарат для восстановления мышц, описанные ниже.
(1-1) Клеточный препарат для лечения заболевания межкостного сустава
Настоящее изобретение представляет клеточный препарат для лечения заболевания межкостного сустава, характеризующегося тем, что препарат включает жировую клетку.
Жировая клетка представляет собой клетку, к функциям которой относятся синтез, запасание и высвобождение жира и которая образует жировую ткань. Кроме того, поскольку жировая клетка является полностью дифференцированной, эта клетка не делится. Жировые клетки подразделяются на клетки белой жировой ткани и бурой жировой ткани. Любую из клеток можно применять в настоящем изобретении, или можно применять смесь обоих типов клеток. В настоящем изобретении происхождение жировых клеток специально не ограничивают и, например, применяют жировые клетки млекопитающих, предпочтительно жировые клетки приматов, более предпочтительно жировые клетки человека. В настоящем изобретении в качестве жировых клеток можно применять только жировые клетки или можно применять смесь внеклеточного матрикса (ВКМ), окружающего жировые клетки, и жировых клеток. В частности, в настоящем изобретении отобранные жировые клетки можно применять сами по себе или можно применять жировые клетки, приготовленные посредством удаления внеклеточного матрикса из отобранных жировых клеток.
Жировые клетки отбирают из жировой ткани. Способ отбора жировой ткани специально не ограничивают и выбирают соответствующим образом из традиционно известных способов, включающих, например, липосакцию, липэктомию и иссечение подкожно-жирового слоя. Сбор посредством липосакции предпочтителен, поскольку липосакция является относительно простой и минимально инвазивной. Способ получения жировых клеток из отобранного жира специально не ограничивают, и предпочтительным является способ 2. Способ приготовления клеточного препарата описан ниже.
Кроме того, клеточный препарат для лечения заболевания межкостного сустава, являющийся предметом настоящего изобретения, может кроме того включать мезодермальную стволовую клетку. При включении мезодермальной стволовой клетки улучшается регенерация ткани в межкостном суставе и еще больше усиливается терапевтический эффект клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения.
Мезодермальные стволовые клетки, применяемые для клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения, в основном означают промежуточные стволовые клетки, которые должны дифференцироваться в клетки, относящиеся к мезодермальной ткани, такой как кость, хрящ, миокард и жир. Происхождение жировых клеток специально не ограничивают и, например, применяют жировые клетки млекопитающих, предпочтительно жировые клетки приматов, более предпочтительно жировые клетки человека.
В качестве примера мезодермальных стволовых клеток специально указывают жировые стволовые клетки, стволовые клетки костного мозга, кроветворные стволовые клетки и подобные, и эти стволовые клетки можно получить из каждой ткани в зависимости от типа клеток в соответствии с традиционно известными способами.
В настоящем изобретении в качестве примера мезодермальных стволовых клеток предпочтительно указывают жировые стволовые клетки. Жировые стволовые клетки можно отобрать из жировой ткани. Жировую ткань, применяемую в качестве источника жировых стволовых клеток, также можно отобрать при помощи любого способа, такого как липосакция, липэктомия и иссечение подкожно-жирового слоя, как и в случае с вышеупомянутыми жировыми клетками, и предпочтительным способом является липосакция с точки зрения предотвращения расхода или повреждения жировых стволовых клеток и с точки зрения более безопасного отбора. Кроме того, предпочтительный пример способа получения жировых стволовых клеток из отобранного жира представляет собой способ, описанный в разделе 2. «Способ приготовления клеточного препарата», описанном ниже.
Когда клеточный препарат, являющийся предметом настоящего изобретения, включает мезодермальную стволовую клетку, предпочтительно применять мезодермальные стволовые клетки в виде смеси с жировыми клетками. Когда клеточный препарат, являющийся предметом настоящего изобретения, включает мезодермальную стволовую клетку, содержание мезодермальных стволовых клеток в клеточном препарате специально не ограничивают, пока можно получить терапевтический эффект в отношении заболевания межкостного сустава. В то время как можно считать, что чем выше содержание мезодермальных стволовых клеток, тем более выраженный терапевтический эффект можно получить, содержание составляет, например, по крайней мере 1, предпочтительно 5 или более, более предпочтительно от 1 до 10, еще более предпочтительно от 5 до 10 мезодермальных стволовых клеток на одну жировую клетку. Кроме того, в случае клеточного препарата, приготовленного при помощи способа (в), описанного ниже, включающего стадии (1в) и (2в), количество мезодермальных клеток, содержащихся в 1 мл клеточного препарата, обычно составляет 100 тысяч или более, предпочтительно 150 тысяч или более, еще более предпочтительно от 150 до 200 тысяч.
В клеточном препарате, являющемся предметом настоящего изобретения, применение аутологичных жировых клеток (и аутологичных мезодермальных стволовых клеток) с целью аутологичной трансплантации, может предотвратить иммуноотторжение и наряду с этим обеспечить улучшение симптома. Однако приготовление клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения, с применением жировых клеток (и мезодермальных стволовых клеток), полученных от другого человека не ограничивают описанным выше. При применении клеток, полученных от другого человека, предпочтительно проводить обработку для удаления антигенности, такую как, например, гамма-облучение жировых клеток (включая внеклеточный матрикс (ВКМ), окружающий жировые клетки), отобранных у другого человека перед трансплантацией. В то время как мезодермальные стволовые клетки представляют собой клетки, обычно не обладающие иммуногенностью, при необходимости можно применять мезодермальные стволовые клетки, прошедшие вышеупомянутую обработку.
В качестве предпочтительного примера клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения, можно указать клеточный препарат, включающий жировую клетку и жировую стволовую клетку. Обычно жировая ткань включает жировые клетки и жировые стволовые клетки. Таким образом, в качестве клеточного препарата, включающего жировые клетки и жировые стволовые клетки, можно применять отобранную жировую ткань или клеточный препарат, приготовленный посредством удаления примесей (например, анестезирующего раствора, инъецируемого при отборе жира (так называемой тумесцентной жидкости), старых жировых клеток, крови и тканевой жидкости) из отобранной жировой ткани, клеточный препарат, приготовленный посредством удаления примесей, и часть жировых клеток из отобранной жировой ткани и подобные. Предпочтительные примеры способа приготовления клеточного препарата включают способы от (а) до (в), описанные ниже.
Кроме того, традиционно известный фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество, противовоспалительное средство, обезболивающее вещество, иммуносупрессор или подобные вещества можно при необходимости добавлять к клеточному препарату, являющемуся предметом настоящего изобретения. Кроме того, коллаген, фибробласты, фактор роста, пролифератор, цитокин или подобные можно добавлять, пока это не снижает эффективность настоящего изобретения.
Кроме того, например, другой клеточный препарат, для которого известно действие в отношении регенерации ткани, такой как тромбоцитарно-обогащенная плазма (ТОП), можно применять в комбинации с клеточным препаратом, являющимся предметом настоящего изобретения. Более того, добавлением антагониста рецептора ангиотензина II, такого как лозартан, к ТОП, можно усилить эффект восстановления хрящевой ткани. Однако с точки зрения улучшения эффективности регенерации ткани, например, предпочтительно удалять факторы роста эндотелия сосудов (VEGF, vascular endothelial growth factors) из ТОП перед применением в случае, когда ожидается регенерация хрящевой ткани, и предпочтительно удалять костные морфогенетические белки (BMP, bone morphogenetic proteins) перед применением в случае, когда ожидается регенерация костной ткани.
Клеточный препарат для лечения заболевания межкостного сустава, являющийся предметом настоящего изобретения, обладает отличными терапевтическим эффектом на заболевание межкостного сустава. Межкостный сустав означает место сочленения костей и включает хрящевой сустав, соединенный хрящом, или сочетанием хряща и фиброзной соединительной ткани, синовиальный сустав, соединенный хрящом и синовиальной мембраной, покрывающей суставную капсулу, и фиброзный сустав, соединенный фиброзной соединительной тканью. В настоящем изобретении межкостный сустав специально означает часть, обладающую подвижностью, соединенную хрящевым суставом и синовиальным суставом. В качестве примера межкостного сустава можно специально указать межпозвоночный сустав, коленный сустав, сустав стопы, сустав пальца стопы, тазобедренный сустав, сустав кисти, локтевой сустав, плечевой сустав, сустав пальца руки, акромиально-ключичный сустав, крестцово-подвздошный сустав и подобные. Кроме того, например, в случае коленного сустава мягкие ткани, такие как сухожилие и мениск, включены в вышеупомянутый межкостный сустав, а в случае межпозвоночного сустава диск (межпозвоночный диск) и подобные включены в вышеупомянутый межкостный сустав.
Кроме того, примеры заболеваний межкостных суставов включают грыжу (пролапс), деформацию, дегенерацию и воспаление и в особенности включают заболевания позвоночника, такие как смещение межпозвоночных дисков и деформирующий спондилез; болезни суставов, такие как остеоартроз (включая остеоартроз бедра и остеоартроз колена) и хронический артроз; аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит; и остеонекроз, такой как идиопатический остеонекроз коленного сустава или остеонекроз головки большеберцовой кости. Предпочтительно можно указать смещение межпозвоночных дисков, остеоартроз, хронический артроз, идиопатический остеонекроз коленного сустава или остеонекроз головки большеберцовой кости.
Дозу клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения, специально не ограничивают, пока доза может оказывать терапевтический эффект в отношении заболевания межкостных суставов, и дозу можно соответствующим образом подобрать в зависимости от размера места введения, локализации заболевания, степени выраженности заболевания, пола, физического состояния или подобных характеристик пациента. Например, доза составляет от 100 тысяч до 4 миллионов клеток, предпочтительно от 200 тысяч до 2 миллионов клеток, еще более предпочтительно от 200 тысяч до 1 миллиона клеток в пересчете на количество жировых клеток. Например, при получении клеточного препарата по способу (в), описанному ниже, включающему стадии (1в) и (2в), доза составляет от 0,5 до 20 мл, предпочтительно от 1 до 10 мл, еще более предпочтительно от 1 до 5 мл. Кроме того, например, в случае коленного сустава можно вводить от 1 до 20 мл, предпочтительно от 1 до 10 мл, еще более предпочтительно от 5 до 10 мл клеточного препарата. Кроме того, в случае межпозвоночного диска можно вводить от 0,5 до 20 мл, предпочтительно от 1 до 15 мл, еще более предпочтительно от 1 до 2 мл клеточного препарата.
Примеры способа введения включают, но не ограничиваются способом инъекции в место локализации заболевания межкостного сустава (например, в суставную щель и межпозвоночный диск) с помощью шприца, канюли или подобного. Кроме того, при инъекции можно получить еще более выраженный терапевтический эффект за счет стимулирования участка инъекции с помощью наконечника иглы или канюли. Примеры способа стимулирования включают, но специально не ограничиваются способом стимулирования места инъекции посредством поворачивания канюли, конец которой срезан под углом, во всех направлениях при инъекции клеточного препарата.
При введении клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения, пациентам с данными заболеваниями при необходимости клеточный препарат можно вводить после проведения лечения известными способами. Например, в случае смещения межпозвоночных дисков клеточный препарат, являющийся предметом настоящего изобретения, можно вводить (инъецировать) после удаления ущемленного межпозвоночного диска посредством традиционно известного способа, такого как чрескожная лазерная декомпрессия диска. Под действием жировых клеток, включенных в клеточный препарат, являющийся предметом настоящего изобретения, боль, вызванная заболеванием межкостных суставов (артралгия), уменьшается и затем при включении мезодермальных стволовых клеток костная ткань, хрящевая ткань, мягкие ткани или подобные ткани межкостного сустава регенерируют под действием клеток.
(1-2) Клеточный препарат для восстановления мышц
Настоящее изобретение представляет клеточный препарат, способный восстанавливать мышцу в месте повреждения мышцы, характеризующийся тем, что клеточный препарат включает жировую клетку и мезодермальную стволовую клетку.
Жировая клетка и мезодермальная стволовая клетка, применяемые в клеточном препарате для восстановления мышц, являющемся предметом настоящего изобретения, и содержание обоих типов клеток в клеточном препарате и подобное описано в разделе «(1-1) Клеточный препарат для лечения заболевания межкостных суставов». Кроме того, в качестве предпочтительного аспекта клеточного препарата для восстановления мышц, являющегося предметом настоящего изобретения, можно указать клеточный препарат, включающий жировую клетку и жировую стволовую клетку, являющиеся мезодермальными стволовыми клетками. Примеры способа получения жировых стволовых клеток включают способ, описанный в разделе «2. Способ приготовления клеточного препарата», описанном ниже.
Кроме того, как и с клеточным препаратом для восстановления мышц, традиционно известный фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество, противовоспалительное средство, обезболивающее вещество, иммуносупрессор или подобные вещества можно при необходимости добавлять в дополнение к жировым клеткам и мезодермальным стволовым клеткам. Кроме того, коллаген, фибробласты, фактор роста, пролифератор, цитокин или подобные можно добавлять, пока это не снижает эффективность настоящего изобретения.
Кроме того, например, другой клеточный препарат, для которого известно действие в отношении регенерации ткани, такой как тромбоцитарно-обогащенная плазма (ТОП), можно применять в комбинации с клеточным препаратом, являющимся предметом настоящего изобретения, пока это не снижает эффективность настоящего изобретения. Однако с точки зрения дальнейшего улучшения эффективности регенерации мышечной ткани предпочтительно удалять трансформирующий фактор роста β1 (TGF β1, transforming growth factor β1) перед применением.
Клеточный препарат для восстановления мышц, являющийся предметом настоящего изобретения, обладает превосходным эффектом на восстановление мышц при применении в месте повреждения мышцы. Повреждение мышцы включает случаи, в которых мышца была удалена хирургическим путем, в результате повреждения или подобного, в дополнение к миодегенерации, миофиброзу, разрушению или некрозу мышечного волокна, амиотрофии, мышечному параличу, мышечной слабости и подобному. Кроме того, примеры места или типа мышц, к которым можно применять клеточный препарат, являющийся предметом настоящего изобретения, включают, но специально не ограничиваются скелетными мышцами, такими как мышцы туловища (включая мышцы верхней или нижней конечности и большую грудную мышцу); гладкую мускулатуру, такую как сфинктер мочевого пузыря; и миокард. Например, введением клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения, в место повреждения мышцы верхней конечности можно быстро уменьшить боль, обусловленную повреждением мышцы, и восстановить мышцу, таким образом увеличив степень подвижности или улучшив двигательную функцию верхней конечности. Кроме того, введением клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения, в сфинктер мочевого пузыря пациента с признаками нарушения мочеиспускания, такого как непроизвольное мочеиспускание или частое мочеиспускание из-за слабости мышц, повреждения или подобных нарушений сфинктера мочевого пузыря, можно безопасно и просто решить проблему непроизвольного мочеиспускания, недержания или подобного за счет увеличения силы мышц сфинктера мочевого пузыря. Кроме того, клеточный препарат, являющийся предметом настоящего изобретения, также можно применять в месте повреждения мышц у пациента с заболеванием мышц, таким как инфаркт миокарда, ишемически-реперфузионное повреждение, мышечная дистрофия (например, мышечная дистрофия Дюшена (МДД)) или миозит (миопатия).
Кроме того, мышечное повреждение обычно является болезненным, но боль можно быстро уменьшить посредством введения клеточного препарата для восстановления мышц, являющегося предметом настоящего изобретения, в место повреждения мышцы. Не желая ограничивать интерпретацию настоящего изобретения, считается, что такой эффект уменьшения боли обусловлен жировыми клетками, включенными в клеточный препарат для восстановления мышц.
Дозу клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения, при применении с целью восстановления мышцы специально не ограничивают, пока доза может обеспечить эффект восстановления мышцы, и дозу можно подобрать соответствующим образом в зависимости от размера места введения, локализации заболевания, степени выраженности заболевания, пола, физического состояния или подобных характеристик пациента. Например, доза на единицу объема поврежденной мышцы равного 10 мл составляет от 100 тысяч до 4 миллионов клеток, предпочтительно от 200 тысяч до 2 миллионов клеток, еще более предпочтительно от 200 тысяч до 1 миллиона клеток в пересчете на количество жировых клеток. Кроме того, при получении клеточного препарата по способу (в), описанному ниже, включающему стадии (1в) и (2в), доза на единицу объема поврежденной мышцы равного 10 мл составляет от 0,5 до 20 мл, предпочтительно от 1 до 10 мл, еще более предпочтительно от 1 до 5 мл.
Способ введения клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения, при применении с целью восстановления мышц специально не ограничивают, и можно применять традиционно известный способ. Например, можно указать способ инъекции в место повреждения мышцы при помощи шприца, канюли или подобного.
2. Способ приготовления клеточного препарата
В настоящем изобретении можно отбирать жировые клетки и при необходимости выделять и концентрировать для приготовления клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения. Кроме того, при приготовлении клеточного препарата, включающего жировые клетки и мезодермальные стволовые клетки, можно применять жировые клетки, отобранные в виде смеси этих клеток, или можно отбирать каждый тип клеток по отдельности, а затем смешивать с другими клетками для получения клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения. Например, когда мезодермальные стволовые клетки являются жировыми стволовыми клетками, поскольку жировые стволовые клетки можно одновременно и просто получить из той же ткани, что и жировые клетки, предпочтительно получить смесь жировых клеток и жировых стволовых клеток из жировой ткани для получения клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения. Кроме того, что проще, можно применять жировую ткань, включающую эти клетки.
При приготовлении клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения, из жировой ткани можно указать описанные ниже способы от (а) до (в) в качестве предпочтительных способов. Однако данные способы не ограничивают приготовление клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения, из ткани, отличной от жировой, и клеточный препарат, являющийся предметом настоящего изобретения, можно также приготовить, подобрав соответствующим образом условия, учитывая тип или свойства клеток в соответствии со способом, описанным ниже, даже когда клеточный препарат, являющийся предметом настоящего изобретения, готовят из ткани, отличной от жировой ткани (например, из крови, аспирата костного мозга или мышц). Каждый из способов от (а) до (в) будет подробно описан ниже.
Способ (а)
Способ (а) приготовления клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения, включает стадию (1а) удаления жидкой фракции из отобранного жира для получения клеточной фракции.
Здесь отобранный жир означает смесь клеточной фракции и жидкой фракции, полученную из жировой ткани, которую отбирают из жировой ткани посредством липосакции, липэктомии, иссечения подкожно-жирового слоя или подобного. Клеточная фракция включает жировые клетки, жировые стволовые клетки и примеси (гемоциты, мертвые/живые клетки, старые клетки и подобные). Кроме того, жидкая фракция включает тумесцентную жидкость, клеточную жидкость или подобные.
Отделение жидкой фракции от клеточной фракции можно легко провести при помощи осаждения клеточной фракции при отстаивании отобранного жира. Примеры способа удаления жидкой фракции включают, но специально не ограничиваются отстаиванием и аспирацией. Кроме того, при необходимости можно провести центрифугирование, фильтрацию или подобные.
Условия центрифугирования и фильтрации специально не ограничивают, пока жировые клетки и жировые стволовые клетки не повреждаются и пока можно удалить примеси. Примеры условий включают условия от 700 до 2500 × g в течение от 1 до 15 минут, предпочтительно условия от 2000 до 2200 × g в течение от 5 до 10 минут.
Кроме того, при фильтровании, например, удаляют тканевую жидкость, анестетик, введенный в ту часть тела, из которой отбирают жир (тумесцентную жидкость), и подобные посредством пропускания отобранного жира через сетчатый фильтр с порами размером от 10 до 300 мкм, предпочтительно от 10 до 150 мкм, более предпочтительно от 10 до 100 мкм, еще более предпочтительно от 15 до 20 мкм для получения смеси жировых клеток и жировых стволовых клеток на фильтре. Кроме того, можно наполнить контейнер, снабженный таким сетчатым фильтром, отобранным жиром, содержащим примеси и провести центрифугирование жира.
Таким образом можно получить жировую ткань, включающую жировые клетки (включая внеклеточный матрикс) и жировые стволовые клетки, из которой удалена жидкая фракция, и можно применять жировую ткань в качестве клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения.
Способ (б)
Способ (б) для приготовления клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения, характеризуется наличием следующих стадий:
(1б) удаление жидкой фракции из отобранного жира для получения клеточной фракции; и
(2б) отделение жировых клеток и жировых стволовых клеток из по крайней мере части клеточной фракции, полученной на стадии (1б).
Здесь стадия (1б) описана в вышеупомянутой стадии (1а). На стадии (2б) при приготовлении клеточного препарата, включающего жировые клетки, можно обработать всю клеточную фракцию, полученную на стадии (1б), как описано для стадии (2б), и можно применять только отделенные жировые клетки. Кроме того, при приготовлении клеточного препарата, включающего жировые клетки и жировые стволовые клетки, можно получить клеточный препарат, включающий жировые клетки и жировые стволовые клетки, посредством отделения жировых стволовых клеток из по крайней мере части, а предпочтительно из половины клеточной фракции, полученной на стадии (1б), и последующего добавления жировых стволовых клеток к клеточной фракции, полученной на стадии (1б).
Здесь примеры способа отделения жировых стволовых клеток включают способ, описанный в Патентном документе 1. В частности, для улучшения отделения жировых клеток и жировых стволовых клеток посредством разрушения межклеточных контактов в клеточную фракцию добавляют протеазу. Примеры протеазы включают коллагеназу, трипсин и липазу. Можно применять один вид протеаз из перечисленных выше, или можно применять два или более видов протеаз в комбинации.
Способ выделения жировых клеток и жировых стволовых клеток из клеточной фракции, обработанной ферментом, специально не ограничен и может быть соответствующим образом выбран из числа традиционно известных способов. Например, способ может представлять собой центрифугирование, фильтрацию или подобные. Условия центрифугирования специально не ограничивают, пока жировые клетки и жировые стволовые клетки можно отделить без повреждения клеток. Примеры условий включают условия от 100 до 500 × g в течение от 1 до 20 минут, предпочтительно условия от 100 до 300 × g в течение от 5 до 10 минут. Центрифугирование клеточной фракции позволяет получить жировые стволовые клетки в виде осадка и жировые клетки, сконцентрированные в супернатанте. Кроме того, при проведении фильтрования жировые стволовые клетки можно получить на фильтре, пропуская клеточную фракцию или их суспензию через сетчатый фильтр с порами размером от 10 до 100 мкм, предпочтительно от 10 до 50 мкм, более предпочтительно от 15 до 20 мкм, а жировые клетки можно получить в фильтрате.
Жировые клетки и жировые стволовые клетки, обработанные ферментом, предпочтительно промывать после отделения, промывку можно проводить фосфатно-солевым буфером, физиологическим раствором, раствором Рингера, декстраном или подобными. Промывку можно повторять много раз при необходимости или при необходимости можно центрифугировать клетки для сбора клеток после промывки. Условия центрифугирования могут быть такими же, как для отделения жировых клеток и жировых стволовых клеток из клеточной фракции, обработанной ферментом.
После промывки жировые клетки, выделенные на данной стадии (2б), можно применять в качестве клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения. Клеточный препарат, являющийся предметом настоящего изобретения, полученный с применением жировых клеток, полученных настоящим способом (б), оказывает превосходное действие на уменьшение боли, вызванной заболеванием межкостных суставов.
Более того, настоящий способ (б) может включать стадию (3б) смешивания клеточной фракции, полученной на стадии (1б), с жировыми стволовыми клетками, полученными на стадии (2б), после стадии (2б). На данной стадии (3б) клеточный препарат, включающий жировые клетки и жировые стволовые клетки, можно получить посредством смешивания клеточной фракции, полученной на стадии (1б), с жировыми стволовыми клетками, полученными на стадии (2б). Приготовленный таким образом клеточный препарат включает жировые стволовые клетки в высокой концентрации, и является не только эффективным в отношении уменьшения боли, вызванной заболеванием межкостных суставов, но также оказывает превосходный эффект на регенерацию ткани межкостного сустава. Кроме того, такой клеточный препарат, включающий жировую клетку и жировую стволовую клетку, оказывает превосходное действие на восстановление мышцы в поврежденной мышце и одновременно оказывает превосходное действие на уменьшение боли, вызванной повреждением мышцы.
Способ (в)
Способ (в) приготовления клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения, включает следующие стадии:
(1в) удаление жидкой фракции из отобранного жира для получения клеточной фракции; и
(2в) удаление примесей из клеточной фракции, полученной на стадии (1в), для получения концентрата жировых клеток и жировых стволовых клеток.
Здесь стадия (1в) описана в стадии (1а). На стадии (2в) клеточную фракцию концентрируют, удаляя из нее примеси. Способ удаления примесей и способ концентрирования специально не ограничены и могут быть соответствующим образом выбраны и числа традиционно известных способов. В качестве простого способа, например, с помощью шприца, снабженного взвешивающим фильтром, описанным в Патентном документе 3, удаляют примеси, такие как свободный жидкий жир, выделяющийся из разрушенных жировых клеток, мертвых/живых клеток и старых клеток, получая концентрат здоровых жировых клеток и жировых стволовых клеток. Такой шприц является коммерчески доступным, и частным примером является шприц, выпускаемый для LIPOMAX-SC (производство Medikan International Inc., Сеул, Корея).
В более частном случае шприц, снабженный фильтром, заполняют отобранным жиром, и жир разделяют на жидкую фракцию и клеточную фракцию посредством центрифугирования. Затем свободный жидкий жир (дренажный жидкий жир) отделяют при помощи фильтра. Жидкая фракция, отделенная здесь, представляет собой жидкость, которая не была полностью отделена от клеточной фракции и смешана с ней на стадии (1в). Иными словами, в шприце свободный жидкий жир, концентрат жировых клеток и жировых стволовых клеток и жидкая фракция разделяются на верхний слой, промежуточный слой и нижний слой, соответственно. Удаляя все слои, кроме промежуточного слоя, можно получить концентрат здоровых жировых клеток и жировых стволовых клеток, и концентрат можно применять в качестве клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения. Поскольку здоровые жировые клетки и жировые стволовые клетки отбирают и концентрируют, полученный таким образом клеточный препарат вряд ли вызывает некроз, кальцификацию или подобное после трансплантации и является еще более подходящим для уменьшения и лечения симптомов заболевания межкостных суставов, восстановления поврежденной мышцы и уменьшения боли, вызванной повреждением мышцы.
Условия центрифугирования для разделения жира на жидкую фракцию и клеточную фракцию специально не ограничивают, пока жировые клетки и жировые стволовые клетки не повреждаются и примеси отделяются от жировых и жировых стволовых клеток. Примеры условий включают условия от 700 до 2500 × g в течение от 1 до 15 минут, предпочтительно условия от 2000 до 2200 × g в течение от 5 до 10 минут.
Кроме того, размеры пор фильтра специально не ограничивают, пока жировые клетки и жировые стволовые клетки не проходят через поры и примеси проходят через поры. Размер, например, может составлять от 10 до 300 мкм, предпочтительно от 10 до 150 мкм, более предпочтительно от 10 до 100 мкм, еще более предпочтительно от 15 до 20 мкм.
Кроме того, настоящий способ (в) может включать стадию (3в’) выделения жировых клеток и жировых стволовых клеток по крайней мере из части концентрата, полученного на стадии (2в), и последующего смешивания полученных жировых стволовых клеток с концентратом, полученным на стадии (2в). Способ отделения жировых стволовых клеток описан в стадии (2б) вышеупомянутого способа (б). На данной стадии (3в’) при отделении жировых стволовых клеток с применением протеазы обычно можно получить около 700 тысяч или более, предпочтительно около 1,5 миллионов или более, еще более предпочтительно около 2 миллионов или более жировых стволовых клеток на 1 см3 концентрата, полученного на стадии (2в). Поскольку здоровые жировые клетки отбирают и концентрируют и более того включают жировые стволовые клетки в более высокой концентрации, клеточный препарат, приготовленный через данную стадию (3в’) оказывает еще более выраженный эффект на лечение заболевания межкостных суставов и восстановление поврежденной мышцы.
Кроме того, жировые клетки, отделенные на данной стадии (3в’) можно промыть и впоследствии применять в качестве клеточного препарата, являющегося предметом настоящего изобретения. Поскольку здоровые жировые клетки отбирают и концентрируют, полученные здесь жировые клетки оказывают еще более выраженный эффект на уменьшение заболевания межкостных суставов или боли, вызванной повреждением мышцы.
Кроме того, настоящий способ может включать стадию (3в”) тонкого измельчения жировых клеток в полученном после стадии (2в) концентрате и отделения смеси тонко измельченных жировых клеток и жировых стволовых клеток. Тонкое измельчение жировых клеток можно осуществить с помощью способа, широко применяемого в данной области техники, и этот способ специально не ограничивают. При проведении данной стадии (3в”) после стадии (2в) можно провести тонкое измельчение и центрифугирование концентрата, в то время как концентрат остается в шприце. Поскольку свободный жидкий жир отделяется от смеси тонко измельченных жировых клеток и жировых стволовых клеток после центрифугирования, свободный жидкий жир можно удалить, получив смесь тонко измельченных жировых клеток и жировых стволовых клеток.
Проводя такую стадию разделения, можно приготовить клеточный препарат, включающий более мелкие жировые клетки и жировые стволовые клетки в более высокой концентрации. Здесь мелкой жировой клеткой считается жировая клетка такого размера, что она может пройти через иглу калибра от 26 до 30, предпочтительно от 18 до 30. На данной стадии (3в”) обработку с целью тонкого измельчения жировых клеток можно проводить по меньшей мере один раз, предпочтительно от одного до нескольких раз, более предпочтительно один или два раза. Проводя тонкое измельчение жировых клеток, можно повысить концентрацию жировых стволовых клеток в единице объема клеточного препарата и можно сделать еще более выраженным эффект уменьшения заболевания межкостных суставов или боли, вызванной повреждением мышцы, эффект регенерации ткани внутри межкостного сустава и эффект восстановления мышцы.
Кроме того, можно включить стадию (4в”) выделения жировых стволовых клеток по крайней мере из части смеси тонко измельченных жировых клеток и жировых стволовых клеток, полученной на стадии (3в”), и смешивания полученных жировых стволовых клеток с концентратом, полученным на стадии (2в). Способ выделения жировых стволовых клеток описан в соответствии со стадией (2б) способа (б).
Жировые клетки, полученные в результате отделения жировых стволовых клеток на данной стадии (4в”), можно промыть и впоследствии применять в качестве клеточного препарата, включающего жировые клетки, являющиеся предметом настоящего изобретения. Промывку можно проводить при помощи такого же способа, как упомянутая выше промывка жировых стволовых клеток. Поскольку здоровые, тонко измельченные жировые клетки отбирают и концентрируют, полученные здесь жировые клетки оказывают еще более выраженный эффект на уменьшение боли, вызванной заболеванием межкостных суставов или повреждением мышцы.
В настоящем способе (в), применяя шприц, описанный в Патентном документе 3, все стадии можно выполнить без контакта клеток с открытым воздухом. Например, можно присоединить канюлю или подобное устройство к шприцу, описанному в Патентном документе 3, шприц можно заполнить жиром, отобранным при липосакции, и из жира можно удалить примеси и провести концентрирование для получения клеточного препарата. Впоследствии при введении клеточного препарата, поскольку клеточный препарат можно напрямую переносить из шприца в шприц для инъекции клеточного препарата и введения в поврежденную область, также можно получить высоко безопасный клеточный препарат без такой проблемы, как загрязнение. В качестве простого способа, можно осуществлять данный способ (в), применяя коммерчески доступный набор реактивов, например, частным примером такого набора реактивов является LIPOMAX-SC (производство Medikan International Inc.).
Клеточный препарат, являющийся предметом настоящего изобретения, можно получить любым из вышеупомянутых способов, и предпочтительно, чтобы клеточный препарат был клеточным препаратом, включающим тонко измельченные жировые клетки, приготовленные по способу (б) или (в), более предпочтительно по способу (в), еще более предпочтительно по способу (3”) или (4”) способа (в). Поскольку примеси были удалены и тонко измельчены, а здоровые жировые клетки включены в высокой концентрации, клеточный препарат, включающий тонко измельченные жировые клетки, полученные через стадию (4”) способа (в), оказывает выраженный эффект на лечение заболевания межкостных суставов (особенно на уменьшение боли). Клеточный препарат, включающий тонко измельченные жировые клетки и жировые стволовые клетки, полученные через стадию (3”) способа (в), включает жировые стволовые клетки в высокой концентрации в дополнение к тонко измельченным здоровым жировым клеткам. Такой клеточный препарат оказывает еще более выраженный положительный эффект на лечение заболевания межкостных суставов и восстановление мышцы.
3. Способ уменьшения боли, вызванной заболеванием межкостных суставов
Настоящее изобретение также представляет способ уменьшения боли в межкостном суставе, характеризующийся наличием стадии введения клеточного препарата, включающего жировую клетку, в межкостный сустав пациента с заболеванием межкостного сустава.
Способ отбора жира, который применяют в способе уменьшения боли, являющемся предметом настоящего изобретения, способ выделения жировых клеток, способ приготовления клеточного препарата, способ введения пациенту и подобное описано в разделе «1. Клеточный препарат» и «2. Способ приготовления клеточного препарата». В способе уменьшения боли, являющемся предметом настоящего изобретения, терапевтически эффективное количество клеточного препарата вводят пациенту, нуждающемуся в уменьшении боли в межкостном суставе. Лекарственная форма специально не ограничена и может быть соответствующим образом подобрана из числа традиционно известных способов в зависимости от локализации и уровня ожидаемого уменьшения боли, возраста пациента и подобного.
4. Способ регенерации ткани межкостного сустава
Настоящее изобретение предлагает способ регенерации ткани межкостного сустава, характеризующийся наличием стадии введения клеточного препарата, включающего жировую клетку и мезодермальную стволовую клетку, в межкостный сустав пациента с заболеванием межкостного сустава.
Способ отбора жира, который применяется в способе регенерации ткани межкостного сустава, являющемся предметом настоящего изобретения, способ отделения мезодермальных стволовых клеток, способ приготовления клеточного препарата, способ введения пациенту и подобное описано в разделе «1. Клеточный препарат» и «2. Способ приготовления клеточного препарата». В способе регенерации ткани межкостного сустава, являющемся предметом настоящего изобретения, терапевтически эффективное количество клеточного препарата вводят пациенту, нуждающемуся в регенерации ткани межкостного сустава. Лекарственная форма специально не ограничена и может быть соответствующим образом подобрана из числа традиционно известных способов в зависимости от локализации и уровня ожидаемой регенерации, возраста пациента и подобного.
6. Прочее
Настоящее изобретение представляет применение клеточного препарата, включающего жировые клетки, для производства терапевтического агента для заболевания межкостных суставов и клеточный препарат, включающий жировые клетки, применяющийся для лечения заболевания межкостных суставов. Более того, настоящее изобретение представляет применение клеточного препарата, включающего жировую клетку и мезодермальную стволовую клетку, для производства агента для восстановления мышцы и клеточный препарат, включающий жировую клетку и мезодермальную стволовую клетку, применяющийся для восстановления мышцы. Жировые клетки, мезодермальные стволовые клетки, клеточный препарат, заболевание межкостных суставов, повреждение мышцы и подобное описано выше.
Примеры
Приготовление клеточного препарата
Для приготовления клеточного препарата применяли набор реактивов LIPOMAX-C (производство Medikan International Inc., Сеул, Корея). На стадии приготовления настоящего клеточного препарата была возможность провести стадию без контакта клеток с открытым воздухом. Конкретный способ следующий.
(i) Липосакцию с помощью шприца (шприц, выпускаемый для LIPOMAX-SC: производство Medikan International Inc., Сеул, Корея) проводили у каждого объекта. Шприц, содержащий отобранный жир, оставляли отстаиваться при комнатной температуре (около 25°С) в течение 10 минут для разделения жира на клеточную фракцию и жидкую фракцию, и выливали жидкую фракцию, содержащую тумесцентную жидкость. Оставшуюся клеточную фракцию применяли в Тестовом примере 2 в качестве жировой ткани. Затем шприц центрифугировали при 2200 × g в течение 8 минут. Посредством центрифугирования клеточную фракцию разделяли на три слоя: верхний слой (свободный жидкий жир), промежуточный слой (жировые клетки и жировые стволовые клетки) и нижний слой (жидкая фракция, такая как клеточная тканевая жидкость). Затем в шприце оставляли только промежуточный слой, верхний и нижний слои выливали, получая таким образом концентрат жировых клеток и жировых стволовых клеток. Гелеобразование проводили с концентратом для тонкого измельчения относительно крупных жировых клеток. Гелеобразование проводили от одного до трех раз. Сверло (измельчитель Filler-Geller, производство Medikan International Inc.) применяли при гелеобразовании для разрезания жировых клеток с целью тонкого измельчения, и затем центрифугировали жировые клетки при 2200 × g в течение 5 минут, получая таким образом смесь, включающую тонко измельченные жировые клетки и жировые стволовые клетки. Полученную таким образом смесь применяли в Тестовых примерах от 2 до 5, описанных ниже, в качестве препарата, включающего тонко измельченные жировые клетки и жировые стволовые клетки.
(ii) Затем проводили экстрагирование жировых стволовых клеток. К смеси жировых клеток и жировых стволовых клеток, полученной на стадии (i), добавляли 0,4% водный раствор протеазы (торговое название: Коллагеназа; произведенная Worthington Biochemical Corp.) в количестве равном количеству смеси, и слегка перемешивали смесь. Затем инкубировали смесь при 38°С в течение 45 минут.
(iii) После инкубации проводили центрифугирование при 200 × g в течение 5 минут и собирали супернатант. Жировые клетки были сконцентрированы в супернатанте, а жировые стволовые клетки были сконцентрированы в осадке.
(iv) Затем добавляли около 50 мл декстрана (произведенного Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) к 2-3 мл осадка (концентрата жировых стволовых клеток), полученного на стадии (iii), и слегка перемешивали смесь. Затем проводили центрифугирование при 200 × g в течение 5 минут и выливали супернатант, промывая таким образом жировые стволовые клетки. Процедуру повторяли три раза. Концентрат жировых стволовых клеток, полученный на данной стадии, применяли в контрольной группе в Тестовом примере 1, описанном ниже. Кроме того, супернатант, включающий жировые клетки, полученные на стадии (iii), подвергали такой же процедуре промывки и затем применяли в Тестовом примере 1, описанном ниже, в качестве жировых клеток (и внеклеточного матрикса).
Далее, поскольку жировые клетки и жировые стволовые клетки получали от каждого пациента, указанные выше процедуры проводили для каждого пациента.
Тестовый пример 1. Эффект уменьшения боли, вызванной остеоартрозом (1)
Жировые клетки (включая внеклеточный матрикс), полученные на вышеуказанной стадии (iv), вводили пациентам с остеоартрозом колена и наблюдали изменение симптомов.
Объектами были 2 женщины (4 случая (у обоих объектов было заболевание в обоих коленных суставах); средний возраст: 68,5 лет). Применяемый жир отбирали из нижней части живота каждого объекта. Количество отобранного жира составляло 102 м и 95 мл, соответственно. Жировые клетки (включая внеклеточный матрикс) получали из отобранного жира в соответствии с вышеуказанным способом приготовления клеточного препарата, 7 мл жировых клеток инъецировали в каждый коленный сустав каждого объекта. Кроме того, в контрольной группе инъецировали гиалуроновую кислоту (Suvenyl (производство CHUGAI PHARMACEUTICAL CO., LTD.: 2,5 мл) или 7 мл жировых стволовых клеток, полученных на вышеуказанной стадии (iv) (у обоих объектов местом отбора жира была нижняя часть живота; количество отобранного жира составляло 102 м и 95 мл, соответственно), в коленный сустав других 2 объектов с остеоартрозом колена. В настоящем Тестовом примере 1 при инъекции в коленный сустав не проводили процедуру стимуляции места инъекции посредством поворачивания наконечника канюли во всех направлениях.
В результате у объекта, которому была сделана инъекция жировых клеток, боль в коленном суставе снижалась с первого дня инъекции и эффект продолжался в течение приблизительно 1 месяца. Кроме того, по сравнению с объектами, которым была сделана инъекция гиалуроновой кислоты или жировых стволовых клеток, эффект уменьшения боли в коленном суставе также явно развивался с более ранней стадии, и эффект уменьшения боли был также выраженным.
Тестовый пример 2. Эффект уменьшения боли, вызванной остеоартрозом (2)
Жировую ткань, полученную на вышеупомянутой стадии (i), вводили объектам с остеоартрозом колена и наблюдали изменение симптомов. Объектами были 3 женщины (6 случев (у каждого объекта было заболевание в обоих коленных суставах); средний возраст: 69,7 лет). Применяемый жир отбирали из нижней части живота каждого объекта. Количество отобранного жира составляло 95 мл, 100 м и 105 мл, соответственно. Жировую ткань получали из отобранного жира в соответствии со стадией (i) вышеупомянутого способа приготовления клеточного препарата и 7 мл жировой ткани инъецировали в каждый коленный сустав каждого объекта. Кроме того, в контрольной группе инъецировали гиалуроновую кислоту (Suvenyl (производство CHUGAI PHARMACEUTICAL CO., LTD.: 2,5 мл) в коленный сустав другого объекта с остеоартрозом колена. В настоящем Тестовом примере 2 при инъекции в коленный сустав не проводили процедуру стимуляции места инъекции посредством поворачивания наконечника канюли во всех направлениях.
В результате у всех 3 объектов, которым была сделана инъекция жировой ткани, эффект уменьшения боли в коленном суставе развивался раньше, чем у объекта, которому была сделана инъекция гиалуроновой кислоты, и эффект продолжался в течение приблизительно 1 месяца или более.
Тестовый пример 3. Эффект регенерации ткани при остеоартрозе
Клеточный препарат, включающий тонко измельченные жировые клетки и жировые стволовые клетки, приготовленный на вышеупомянутой стадии (i) (от 5 до 10 мл, включая от 750 тысяч до 2 миллионов жировых стволовых клеток), инъецировали в коленный сустав 9 женщин (14 случаев; средний возраст: 68,7 лет) с остеоартрозом при помощи канюли, конец которой срезан под углом. Локализация заболевания, специфичное место липосакции, количество отобранного жира, количество инъецированного клеточного препарата, наличие или отсутствие процедуры стимуляции места инъекции посредством поворачивания канюли во всех направлениях показаны ниже в Таблице 1. Лечение каждого пациента, результаты измерений суставной щели коленного сустава и результаты оценки на основании классификации Келгрена и Лоуренса, представляющей собой стандарт оценки остеоартроза колена по рентгенологическим данным, приведены ниже в Таблице 1.
| Таблица 1 | |||||||||||||||
| Объект А | Объект B |
Объект C | Объект D | Объект E | Объект F | Объект G | Объект H | Объект I | |||||||
| Остеоартроз колена | Левое | Правое | Левое | Правое | Правое | Левое | Правое | Левое | Левое | Правое | Левое | Правое | Левое | Левое | |
| Место, из которого отбирали жир |
Нижняя часть живота | Нижняя часть живота | Нижняя часть живота | Бедро | Нижняя часть живота | Нижняя часть живота | Нижняя часть живота | Нижняя часть живота | Бедро | ||||||
| Количество отобранного жира | 50 мл | 82 мл | 90 мл | 80 мл | 94 мл | 76 мл | 76 мл | 96 мл | 102 мл | ||||||
| Наличие или отсутствие процедуры стимуляции места инъекции канюлей |
+ | + | + | + | ++ | ++ | + | + | + | + | - | - | + | + | |
| Количество инъецированного клеточного препарата | 5 мл | 7 мл | 7 мл | 8 мл | 7 мл | 8 мл | 6 мл | 7 мл | 7 мл | 8 мл | 6 мл | 6 мл | 8 мл | 9 мл | |
| Суставная щель (мм) | До лечения |
2 | 0 | 0 | - | - | - | - | - | 1,6 | 0 | * | * | 2,4 | - |
| После лечения | 3,3 | 2,6 | 2,6 | - | - | - | - | - | 3 | 1,8 | 4,4 | - | |||
| Классификация Келгрена и Лоуренса (степень) | Коли-чество дней после лечения |
3,5 недели | 5 недель | 13 недель | 12 недель | 7 недель | 11 недель | 7,5 недель | 8 недель | 2 недели | |||||
| До лечения |
IV | IV | IV | II | III | IV | II | II | IV | III | II | III | IV | - | |
| После лечения | II | II | II | I | II | III | I | I | II | II | I | II | III | - | |
| * В таблице в отношении остеоартроза колена «левое» указывает на то, что у пациента есть заболевание левого колена, и «правое» указывает на то, что у пациента есть заболевание правого колена. * В таблице в отношении наличия или отсутствия процедуры стимуляции места инъекции канюлей + указывает на наличие стимуляции, ++ указывает на наличие сильной стимуляции и - указывает на отсутствие стимуляции. * В таблице в отношении размера суставной щели - указывает на то, что размер не измеряли и * указывает на то, что размер оставался почти неизменным после лечения. * В таблице количество дней после лечения указывает на количество дней, прошедших после лечения до изменения степени по классификации Келгрена и Лоуренса. * В таблице в отношении классификации Келгрена и Лоуренса - указывает на то, что оценку не проводили, поскольку количество дней после лечения было малым. |
Кроме того, специфичные параметры оценки и стандарты оценки по классификации Келгрена и Лоуренса следующие:
| Таблица 2 | ||||
| Степень | Сужение суставной щели | Образование остеофита | Консолидация | Деформация наружной поверхности сустава |
| I | Сомнительное | Возможное | Нет | Нет |
| II | Возможное | Явное | Нет | Нет |
| III | Явное | Умеренное | Умеренное | Возможное |
| IV | Умеренное | Полное | Полное | Явное |
Характерные примеры рентгенограмм коленных суставов объектов А и В приведены на Фиг. 1 и 2.
Объект А
Возраст на момент лечения: 72 года, женщина.
Анамнез: Остеоартроз колена (левого колена).
В левый коленный сустав инъецировали 5 мл клеточного препарата. Рентгенограммы суставной щели снаружи левого коленного сустава объекта А, сделанные перед инъекцией клеточного препарата и приблизительно через 1 месяц после инъекции, показаны на Фиг. 1.
Объект В
Возраст на момент лечения: 60 лет, женщина.
Анамнез: Остеоартроз колена (оба колена, левое и правое).
В левый и правый коленные суставы инъецировали по 7 мл клеточного препарата. Рентгенограммы суставной щели снаружи правого и левого коленного сустава объекта В, сделанные перед инъекцией клеточного препарата и приблизительно через 1 месяц после инъекции, показаны на Фиг. 2.
Результаты
За 5 дней после дня лечения (в среднем: за 2 дня) боль в коленном суставе значительно уменьшилась у всех объектов, и улучшенное состояние продолжалось даже после вышеуказанного периода. Кроме того, 2 объекта, которые ходили с тростью, смогли ходить без трости. Более того, 2 объекта, которым было трудно вставать, смогли вставать, и ходьба стала значительно легче для всех объектов.
В соответствии с данными рентгенограмм репрезентативных объектов А и В было показано улучшение остеоартроза колена и увеличение суставной щели. Иными словами, как показано на Фиг. 1, в то время как суставная щель в левом коленном суставе объекта А была равной 2,0 мм до лечения (Фиг. 1(а)), суставная щель увеличилась до 3,3 мм приблизительно через 1 месяц после лечения (Фиг. 1(б)). В частности, в то время как степень по классификации Келгрена и Лоуренса была IV до лечения, степень улучшилась до II приблизительно через 1 месяц после лечения. Кроме того, как показано на Фиг. 2, в то время как суставная щель в правом и левом коленных суставах объекта В была равной 0 до лечения (Фиг. 2(а)), суставная щель увеличилась до 2,6 мм приблизительно через 1 месяц после лечения (Фиг. 2(б)). В частности, в то время как степень по классификации Келгрена и Лоуренса была IV до лечения, степень улучшилась до II приблизительно через 1 месяц после лечения.
В соответствии с результатами настоящего Тестового примера 3 было показано, что регенерация ткани в коленом суставе улучшилась при инъекции клеточного препарата, включающего тонко измельченные жировые клетки и жировые стволовые клетки, в коленный сустав объекта с остеоартрозом колена. Вместе с тем, в соответствии с данными рентгенограмм объектов, которым была сделана инъекция жировых стволовых клеток в контрольной группе вышеупомянутого Тестового примера 1, несмотря на то, что регенерация ткани была обнаружена, скорость улучшения регенерации ткани и улучшения симптома была явно меньше таковой у объектов А и В.
Тестовый пример 4. Эффект регенерации ткани при остеонекрозе
Клеточный препарат, включающий тонко измельченные жировые клетки и жировые стволовые клетки, приготовленный на вышеупомянутой стадии (i) (от 5 до 10 мл, включая от 750 тысяч до 2 миллионов жировых стволовых клеток), инъецировали в место остеонекроза 3 объектов у объектов А, В и J в Тестовом примере 3, у которых дополнительно развивался остеонекроз в сочетании с остеоартрозом колена. Что касается объекта J, локализация заболевания, специфичное место липосакции, количество отобранного жира и количество инъецированного клеточного препарата показаны ниже в Таблице 3. Кроме того, магнитно-резонансное изображение коленного сустава объекта А показано на Фиг. 3 в качестве характерного примера.
| Таблица 3 | |||
| Объект J | |||
| Остеоартроз колена | Правое | Левое | |
| Место, из которого отбирали жир | Нижняя часть живота, оба бедра | ||
| Количество отобранного жира | 212 мл | ||
| Наличие или отсутствие процедуры стимуляции места инъекции канюлей | + | + | |
| Количество инъецированного клеточного препарата | 10 мл | 9 мл | |
| Наличие или отсутствие изображения остеонекроза до лечения | Наличие | Наличие | |
| Классификация Келгрена и Лоуренса (степень) | Количество дней после лечения | 12 недель | 12 недель |
| До лечения | IV | IV | |
| После лечения | III | III |
У каждого объекта симптомы, такие как трудность при ходьбе и боль, значительно улучшились за 2 дня после инъекции клеточного препарата в сустав. Кроме того, что касается объекта J, как показано в Таблице 3, в то время как степень по классификации Келгрена и Лоуренса была IV до лечения, симптом улучшился до III приблизительно через 3 месяца после лечения. Более того, как показано на магнитно-резонансном изображении коленного сустава объекта А (Фиг. 3), было обнаружено значительное улучшение в изображении остеонекроза приблизительно через 1 месяц после инъекции клеточного препарата в сустав, остеонекроз исчез через 3 месяца после инъекции. При получении магнитно-резонансных изображений коленных суставов объектов А и В было обнаружено улучшение или исчезновение изображений остеонекроза и отека кости через 1-3 месяца после инъекции клеточного препарата у любого из объектов.
Тестовый пример 5. Эффект восстановления мышцы
Клеточный препарат, включающий тонко измельченные жировые клетки и жировые стволовые клетки, приготовленный на вышеупомянутой стадии (i) (от 5 до 10 мл, включая от 750 тысяч до 2 миллионов жировых стволовых клеток), инъецировали в место повреждения мышцы объектов с повреждением четырехглавой мышцы бедра, с повреждением дельтовидной мышцы плеча или с повреждением большой грудной мышцы (4 мужчины; средний возраст: 37,8 лет, 20 женщин; средний возраст: 33,8 лет). Для приготовления клеточного препарата применяли жир, отобранный из нижней части живота или из бедра объектов (количество отобранного жира: от 50 до 200 мл).
Что касается уменьшения боли, вызванной повреждением мышцы, после инъекции клеточного препарата, результаты были следующими: очень слабая боль чувствовалась после инъекции (8 объектов: женщины); слабая боль чувствовалась после инъекции (4 объекта: мужчины); боль исчезла через 1 день после инъекции (10 объектов: женщины); боль исчезла через 2-3 дня после инъекции (2 объекта: женщины). Иными словами, было показано, что боль, вызванная повреждением мышцы, уменьшалась с ранней стадии при инъекции клеточного препарата, включающего жировые клетки и жировые стволовые клетки.
Кроме того, степень подвижности (СП: степень подвижности) суставов верхних конечностей увеличивалась у всех объектов в течение периода от 3 недель до 1 месяца после инъекции клеточного препарата, и было обнаружено улучшение двигательной функции. Иными словами, было показано, что мышца восстанавливается при введении клеточного препарата в место повреждения мышцы.
3. Заключение
Как описано выше, было показано, что боль, вызванная заболеванием межкостных суставов, можно быстро уменьшить посредством инъекции жировых клеток в поврежденную область у пациента с остеоартрозом колена, и, более того, эффект продолжается на протяжении длительного времени (Тестовый пример 1). Кроме того, при инъекции жировой ткани боль быстро уменьшалась, как в Тестовом примере 1, и эффект продолжался на протяжении еще более длительного времени (Тестовый пример 2). Более того, инъекция клеточного препарата, включающего тонко измельченные жировые клетки и мезодермальные стволовые клетки (жировые стволовые клетки) в высокой концентрации, в поврежденную часть усиливала регенерацию ткани поврежденной части в дополнение к вышеупомянутому эффекту уменьшения боли (Тестовый пример 3). Более того, при сравнении случая, когда инъецировали только жировые стволовые клетки (контрольная группа Тестового примера 1), со случаем, когда инъецировали клеточный препарат, включающий тонко измельченные жировые клетки и жировые стволовые клетки (Тестовый пример 3), эффект регенерации ткани синергически усиливался при инъекции клеточного препарата, включающего тонко измельченные жировые клетки и жировые стволовые клетки. Кроме того, когда инъецировали клеточный препарат, включающий тонко измельченные жировые клетки и жировые стволовые клетки, в место остеонекроза (Тестовый пример 4), обнаружили регенерацию костной ткани в области некроза. Более того, было показано, что мышца восстанавливается при введении жировых клеток и мезодермальных стволовых клеток в место повреждения мышцы (Тестовый пример 5). Можно подумать, что при применении жировых клеток и мезодермальных стволовых клеток, таких как жировые стволовые клетки, в сочетании мезодермальные стволовые клетки удерживаются в пораженном участке под действием жировых клеток (включая внеклеточный матрикс), таким образом эффективность приживления мезодермальных стволовых клеток и эффективность регенерации ткани увеличиваются.
В соответствии с тестовыми примерами, описанными выше, было показано, что клеточный препарат, являющийся предметом настоящего изобретения, оказывает превосходный эффект на лечение заболевания межкостных суставов и восстановление мышцы.
1. Клеточный препарат для лечения остеоартроза, содержащий:
смесь, включающую тонко измельченную жировую клетку и жировую стволовую клетку, где указанные тонко измельченную жировую клетку и жировую стволовую клетку получают посредством стадий:
разделения жировой ткани, взятой от субъекта, на клеточную фракцию и жидкую фракцию с получением клеточной фракции;
удаления примесей из клеточной фракции с получением концентрата жировой клетки и жировой стволовой клетки; и
тонкого измельчения жировой клетки в концентрате жировой клетки и жировой стволовой клетки,
где в 1 мл указанного клеточного препарата содержится от 100 тысяч до 400 тысяч жировых стволовых клеток, и где указанная жировая ткань подвергается тонкому измельчению для придания клетке размера, достаточного для прохождения через иглу калибра от 18 до 30.
2. Клеточный препарат для лечения остеоартроза, содержащий:
смесь, включающую жировую клетку и жировую стволовую клетку, где указанные жировую клетку и жировую стволовую клетку получают посредством стадий:
разделения жировой ткани, взятой от субъекта, на клеточную фракцию и жидкую фракцию с получением клеточной фракции;
удаления примесей из клеточной фракции с получением концентрата жировой клетки и жировой стволовой клетки; и
тонкого измельчения жировой клетки в концентрате жировой клетки и жировой стволовой клетки с получением смеси, включающей тонко измельченную жировую клетку и жировую стволовую клетку;
отделения жировой стволовой клетки от смеси тонко измельченной жировой клетки и жировой стволовой клетки с получением жировой стволовой клетки; и
смешивания отделенной жировой стволовой клетки с концентратом жировой клетки и жировой стволовой клетки,
где в 1 мл указанного клеточного препарата содержится от 100 тысяч до 400 тысяч жировых стволовых клеток, и где указанная жировая ткань подвергается тонкому измельчению для придания клетке размера, достаточного для прохождения через иглу калибра от 18 до 30.
3. Клеточный препарат для лечения остеоартроза по п. 1 или 2, где жировая клетка представляет собой клетку, которую подвергли гамма-облучению.
4. Способ лечения остеоартроза, где в указанном способе используется клеточный препарат по любому из пп. 1-3.
5. Применение клеточного препарата по любому из пп. 1-3 лечения остеоартроза.
6. Способ получения клеточного препарата для лечения остеоартроза, включающий стадии:
разделения жировой ткани, взятой от субъекта, на клеточную фракцию и жидкую фракцию с получением клеточной фракции;
удаления примесей из клеточной фракции с получением концентрата жировой клетки и жировой стволовой клетки; и
тонкого измельчения жировой клетки в концентрате жировой клетки и жировой стволовой клетки с получением смеси, включающей тонко измельченную жировую клетку и жировую стволовую клетку, где:
указанный клеточный препарат содержит смесь, включающую тонко измельченную жировую клетку и жировую стволовую клетку,
в 1 мл указанного клеточного препарата содержится от 100 тысяч до 400 тысяч жировых стволовых клеток, и где указанная жировая ткань подвергается тонкому измельчению для придания клетке размера, достаточного для прохождения через иглу калибра от 18 до 30.
7. Способ получения клеточного препарата для лечения остеоартроза, включающий стадии:
разделения жировой ткани, взятой от субъекта, на клеточную фракцию и жидкую фракцию с получением клеточной фракции;
удаления примесей из клеточной фракции с получением концентрата жировой клетки и жировой стволовой клетки; и
тонкого измельчения жировой клетки в концентрате жировой клетки и жировой стволовой клетки с получением смеси, включающей тонко измельченную жировую клетку и жировую стволовую клетку;
отделения жировой стволовой клетки от смеси тонко измельченной жировой клетки и жировой стволовой клетки с получением жировой стволовой клетки; и
смешивания отделенной жировой стволовой клетки с остатком концентрата жировой клетки и жировой стволовой клетки с получением смеси, включающей жировую клетку и жировую стволовую клетку в высокой концентрации, где
в 1 мл указанного клеточного препарата содержится от 100 тысяч до 400 тысяч жировых стволовых клеток, и где указанная жировая ткань подвергается тонкому измельчению для придания клетке размера, достаточного для прохождения через иглу калибра от 18 до 30.
8. Способ получения клеточного препарата для лечения остеоартроза по п. 6 или 7, где клетку, которую подвергли гамма-облучению, используют в качестве жировой клетки.
9. Клеточный препарат, используемый для восстановления мышцы, содержащий смесь, включающую тонко измельченную жировую клетку и жировую стволовую клетку, где указанные тонко измельченную жировую клетку и жировую стволовую клетку получают посредством стадий:
разделения жировой ткани, взятой от субъекта, на клеточную фракцию и жидкую фракцию с получением клеточной фракции;
удаления примесей из клеточной фракции с получением концентрата жировой клетки и жировой стволовой клетки; и
тонкого измельчения жировой клетки в концентрате жировой клетки и жировой стволовой клетки,
где в 1 мл указанного клеточного препарата содержится от 100 тысяч до 400 тысяч жировых стволовых клеток, и где указанная жировая ткань подвергается тонкому измельчению для придания клетке размера, достаточного для прохождения через иглу калибра от 18 до 30.
10. Способ восстановления мышцы с использованием клеточного препарата по п. 9.
11. Применение клеточного препарата по п. 9 для восстановления мышцы.
12. Способ получения клеточного препарата, используемого для восстановления мышцы, где указанный способ включает стадии:
разделения жировой ткани, взятой от субъекта, на клеточную фракцию и жидкую фракцию с получением клеточной фракции;
удаления примесей из клеточной фракции с получением концентрата жировой клетки и жировой стволовой клетки; и
тонкого измельчения жировой клетки в концентрате жировой клетки и жировой стволовой клетки с получением смеси, включающей тонко измельченную жировую клетку и жировую стволовую клетку, где:
указанный клеточный препарат содержит смесь, включающую тонко измельченную жировую клетку и жировую стволовую клетку,
в 1 мл указанного клеточного препарата содержится от 100 тысяч до 400 тысяч жировых стволовых клеток, и где указанная жировая ткань подвергается тонкому измельчению для придания клетке размера, достаточного для прохождения через иглу калибра от 18 до 30.
