Жидкая композиция, содержащая ботулотоксин и стабилизирующий агент, и способ её получения

Настоящее изобретение относится к жидкой композиции для стабилизации ботулотоксина, содержащей ботулотоксин, первый стабилизирующий агент и второй стабилизирующий агент, где первым стабилизирующим агентом является аргинин с концентрацией, равной 50 мМ, вторым стабилизирующим агентом является глютаминовая кислота или аспарагиновая кислота, при этом концентрация второго стабилизирующего агента составляет от 10 до 50 мМ. Также настоящее изобретение относится к способу получения жидкой композиции для стабилизации ботулотоксина по п.1, содержащему стадии: (a) очистки ботулотоксина; и (b) добавления первого стабилизирующего агента и второго стабилизирующего агента к указанному ботулотоксину, где первым стабилизирующим агентом является аргинин с концентрацией, равной 50 мМ, вторым стабилизирующим агентом является глютаминовая кислота или аспарагиновая кислота, при этом концентрация второго стабилизирующего агента составляет от 10 до 50 мМ. Техническим результатом настоящего изобретения является создание жидкой фармацевтической композиции, содержащей ботулотоксин и стабилизирующий агент, где стабилизирующий агент предотвращает денатурацию белка в ходе его получения и распределения в виде жидкой композиции ботулотоксина, а также при его хранении, распределении и обращении с ним. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 2 пр., 5 табл., 12 ил.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к жидкой композиции, содержащей ботулотоксин и стабилизирующий агент, и к способу ее получения.

Предшествующий уровень техники

Большое количество штаммов Clostridium sp., секретирующих токсины, обладающих нейротоксическим действием, было обнаружено, начиная с 1890 года и до настоящего времени, а изучение характеристик токсинов, которые секретируются этими штаммами, проводилось в течение последних 70 лет (Schant, Е. J. и др., Microbiol. Rev., 56:80, 1992). Среди этих токсинов, ботулотоксин ингибирует экзоцитоз ацетилхолина в холинэргических пресинапсах нервномышечных соединений у животных, имеющих неврологический статус, что в результате вызывает астению. Таким образом, в последнее время было сделано множество исследований для использования нейротоксичности ботулотоксина для косметических или терапевтических целей. Были предложены и опробованы технологии использования ботулотоксина для лечения заболеваний глаз (патент США №6,265,379), боли (патент США №6,113,915), различных нарушений вегетативной нервной системы, включая заболевания потовых желез (патент США №5,766,605), головной боли типа мигрени (патент США №5,714,468), послеоперационной боли и боли внутренних органов (патент США №6,464,986), псориаза и дерматита (патент США №5,670,484), различных раковых заболеваний (патенты США №№6,139,845 и 6,063,768), нейрогенных воспалений (патент США №6,063,768) и т.д. Однако, в отношении ботулотоксина, как белкового агента, возникают трудности при включении его в фармацевтические композиции, а также при его хранении, распределении и обращении с ним. Это обусловлено нестабильностью этого белка, и указанная проблема становится более существенной в случае таких белковых агентов, как ботулотоксин, которые включают в фармацевтические композиции в очень маленьких количествах. Белок ботулотоксина имеет способность к прилипанию в твердой поверхности, и по этой причине, когда указанный белок вводят в контейнер, часть указанного белка может прилипать к внутренней стенке указанного контейнера, что приводит к потерям активного ингредиента, и указанный белок может легко окисляться или расщепляться на мелкие фрагменты. По этой причине, для того, чтобы предотвратить денатурацию ботулотоксина в максимально возможной степени, ботулотоксин, очищенный в процессе его получения, распределяют в виде лиофилизированного порошка, который разводят в физиологическом растворе непосредственно перед его применением в клинических целях и вводят пациентам в форме жидкости. Однако, в этом случае, также существует проблема в том, что вырастает вероятность медицинских несчастных случаев ввиду человеческого фактора, такого как ошибки разведения, совершаемые пользователями, или загрязнение физиологического раствора для разведения. Поэтому существует срочная необходимость в разработке стабилизирующих агентов, которые могут предотвращать денатурацию белка даже в ходе его получения и распределения в виде жидкой композиции ботулотоксина.

В предшествующем уровне техники в качестве стабилизирующего агента для поддержания активности ботулотоксина активно использовался альбумин. Однако, ввиду риска перекрестных инфекций и побочных эффектов компонентов, полученных из животных, потребовалась разработка композиций неживотного происхождения. В ответ на эту необходимость, в опубликованной патентной заявке США №2007-0134199 раскрыта композиция ботулотоксина, содержащая такие аминокислоты, как либо глютамин и глютаминовая кислота, либо аспарагин и аспарагиновая кислота, а в патенте Кореи №1087017 раскрыта композиция ботулотоксина, содержащая метионин в качестве стабилизирующего агента. Однако, решения из этих патентных документов не позволяют достичь существенных эффектов в необходимых условиях, соответствующих температуре и рН тела человека.

Поэтому, настоящее изобретение направлено на создание жидкой композиции, содержащей ботулотоксин и стабилизирующий агент, и способ ее получения. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению, содержащая ботулотоксин, может содержать аргинин, глютаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту в качестве стабилизирующего агента, или может содержать глюконолактоновый буфер, или буфер на основе винной кислоты в качестве буфера, стабилизирующего ботулотоксин. Был показан существенный эффект стабилизации ботулотоксина в необходимых условиях, соответствующих температуре и рН тела человека. Таким образом, ожидается, что указанная фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению внесет существенный вклад в безопасное и удобное медицинское применение ботулотоксина.

Техническая проблема

Настоящее изобретение было выполнено для решения вышеуказанных проблем, встречающихся в решениях из предшествующего уровня техники, и целью согласно настоящего изобретения является предоставление жидкой композиции, содержащей ботулотоксин и стабилизирующий агент, и способа ее получения.

Однако, цель, которая достигается посредством настоящего изобретения не ограничивается указанной выше целью, и другие цели, не упомянутые выше, могут быть легко понятны специалисту в данной области техники из последующего описания.

Решение технической проблемы

В дальнейшем различные варианты осуществления, описанные в данном документе, будут описаны со ссылкой на чертежи. В последующем описании изложены многочисленные конкретные детали, такие как конкретные конфигурации, композиции, способы и т.д., чтобы обеспечить полное понимание настоящего изобретения. Однако некоторые варианты осуществления могут быть реализованы на практике без одной или нескольких из этих конкретных деталей или в сочетании с другими известными способами и конфигурациями. В других случаях известные процессы и способы приготовления не были описаны подробно, чтобы излишне не препятствовать пониманию настоящего изобретения. Ссылка в настоящем описании на термин «один вариант осуществления» или «вариант осуществления» означает, что конкретный признак, конфигурация, композиция или характеристика, описанные в связи с вариантом осуществления, включены, по меньшей мере, в один вариант осуществления настоящего изобретения. Таким образом, появление фразы «в одном варианте осуществления» или «варианте осуществления» в различных местах в данном описании не обязательно относится к одному и тому же варианту осуществления настоящего изобретения. Кроме того, конкретные признаки, конфигурации, композиции или характеристики могут комбинироваться любым подходящим образом в одном или нескольких вариантах осуществления.

Если в описании не указано иное, все научные и технические термины, используемые в описании, имеют те же значения, которые обычно понимаются специалистами в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, «ботулотоксин» представляет собой нейротоксичный белок, продуцируемый бактерией Clostridium botulinum. Род Clostridium насчитывает более 127 видов, сгруппированных по их морфологии и функциям. Анаэробные грамположительные бактерии Clostridium botulinum продуцируют мощный полипептид нейротоксин, ботулотоксин, который вызывает нейропаралитическую болезнь у людей и животных, называемых ботулизмом. Споры Clostridium botulinum обнаружены в почве и могут разрастаться в неправильно стерилизованных и запечатанных пищевых контейнерах для домашних консервных консервов, что является причиной многих случаев ботулизма. Симптомы ботулизма обычно появляются через 18-36 часов после употребления продуктов, зараженных культурой или спорами Clostridium botulinum. Ботулотоксин, по-видимому, может проходить без ослабления его активности через слизистую оболочку кишечника и демонстрирует высокое сродство к холинергическим моторным нейронам. Симптомы интоксикации ботулотоксином могут прогрессировать от затруднений при ходьбе, глотании, а также при разговоре с параличом дыхательных мышц и смертью.

Ботулотоксин типа А известен как самый смертоносный природный биологический агент для человека. Около 50 пикограмм коммерчески доступного ботулотоксина типа А (очищенный комплекс нейротоксина) представляет собой ЛД₅₀ (то есть, 1 единица). Интересно, что в молярном отношении ботулотоксин типа А примерно в 1,8 миллиарда раз более летален, чем дифтерия, примерно в 600 миллионов раз более летален, чем цианид натрия, примерно в 30 миллионов раз более летален, чем токсин кобры и примерно в 12 миллионов раз летальнее холеры. Одна единица (U) ботулотоксина определяется как ЛД₅₀ при внутрибрюшинном введении самкам мышей Swiss Webster весом от 18 до 20 грамм каждая.

Иммунологически отличные 7 ботулинических нейротоксинов обычно характеризуются как ботулинический нейротоксин серотипов А, В, C1, D, Е, F и G, каждый из которых отличается нейтрализацией специфичными для типа антителами. Различные серотипы ботулотоксина различаются по видам животных, на которых они влияют, а также по степени тяжести и продолжительности паралича, который они вызывают. Например, было определено, что ботулотоксин типа А в 500 раз более эффективен, что измеряется скоростью паралича, продуцируемого у крысы, чем ботулотоксин типа В. Кроме того, ботулотоксин типа В не токсичен у приматов при дозе 480 Ед/кг, что примерно в 12 раз больше, чем ЛД₅₀ у приматов для ботулотоксина типа А. Ботулотоксин, по-видимому, связывается с высокой аффинностью с холинергическими моторными нейронами, транслоцируется в нейрон и блокирует высвобождение ацетилхолина. Дополнительное поглощение может происходить через рецепторы с низким сродством, а также через фагоцитоз и пиноцитоз.

Независимо от серотипа, молекулярный механизм интоксикации токсинами, по-видимому, одинаков и включает как минимум 3 этапа. На первом этапе процесса токсин связывается с пресинаптической мембраной нейрона-мишени посредством специфического взаимодействия между тяжелой цепью (Н-цепь или НС) и рецептором клеточной поверхности. Считается, что рецептор различен для каждого типа ботулотоксина и токсина столбняка. Карбоксильный концевой сегмент НС, по-видимому, важен для нацеливания ботулотоксина на клеточную поверхность.

На втором этапе ботулотоксин проникает через плазматическую мембрану клетки-мишени. Ботулотоксин сначала поглощается клеткой через рецептор-опосредованный эндоцитоз, и образуется эндосома, которая содержит ботулотоксин. Затем токсин выходит из эндосомы в цитоплазму клетки. Считается, что эта стадия опосредована аминоконцевым сегментом тяжелой цепи, HN, который запускает конформационное изменение токсина в ответ на рН около 5,5 или ниже. Известно, что эндосомы обладают протонным насосом, который снижает внутриэндосомный рН. Конформационный сдвиг приводит к экспозиции гидрофобных остатков в токсине, что позволяет ботулотоксину встраиваться в эндосомальную мембрану. Ботулотоксин (или, по крайней мере, легкая цепь ботулотоксина) затем перемещается через эндосомальную мембрану в цитоплазму.

Последний этап механизма активности ботулотоксина, по-видимому, включает в себя восстановление дисульфидной связи, соединяющей тяжелую цепь и легкую цепь. Вся токсическая активность ботулинических и столбнячных токсинов содержится в легкой цепи холотоксина; легкая цепь представляет собой эндопептидазу цинка (Zn++), которая селективно расщепляет белки, необходимые для распознавания и связывания нейротрансмиттер-доступных пузырьков с цитоплазматической поверхностью плазматической мембраны, а также слияния пузырьков с плазматической мембраной. Нейротоксин столбняка, ботулотоксин типов В, D, F и G вызывают деградацию синаптобревина (также называемого мембранным белком, ассоциированным с пузырьками (VAMP)), синаптосомного мембранного белка. Большая часть VAMP, присутствующего на цитоплазматической поверхности синаптического пузырька, удаляется в результате любого из этих событий расщепления. Серотип А и Е расщепляют SNAP-25. Первоначально считалось, что серотип С1 расщепляет синтаксин, но было обнаружено, что он расщепляет синтаксин и SNAP-25. Каждый из ботулотоксинов специфически расщепляет различные связи, кроме типа В (и токсина столбняка), которые расщепляют ту же связь. Каждое из этих расщеплений блокирует процесс связывания везикулярной мембраны, тем самым предотвращая экзоцитоз содержимого везикулы.

Ботулотоксины использовались в клинических условиях для лечения нервно-мышечных расстройств, характеризующихся гиперактивными скелетными мышцами (то есть, двигательными расстройствами). В 1989 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США одобрило комплекс ботулотоксин типа А для лечения блефароспазма, косоглазия и гемифациального спазма. Впоследствии ботулотоксин типа А был также одобрен Управлением по санитарному надзору для лечения дистонии шейки матки и для лечения глабеллярных линий, а ботулотоксин типа В был одобрен для лечения дистонии шейки матки. Серотипы ботулотоксина, не относящегося к типу А, по-видимому, имеют более низкую активность и/или более короткую продолжительность активности по сравнению с ботулотоксином типа А. Клинические эффекты периферического внутримышечного введения ботулотоксина типа А обычно наблюдаются в течение одной недели после инъекции. Типичная продолжительность симптоматического облегчения при однократном внутримышечном введении ботулотоксина типа А составляет в среднем около 3 месяцев, хотя сообщалось о значительно более длительных периодах терапевтической активности.

Хотя все серотипы ботулотоксинов, по-видимому, ингибируют высвобождение нейротрансмиттера ацетилхолина в нервно-мышечном соединении, они делают это, воздействуя на разные нейросекреторные белки и расщепляя эти белки в разных местах. Например, ботулинические типы А и Е расщепляют ассоциированный синаптосомный белок 25 кДа (SNAP-25), но они нацелены на различные аминокислотные последовательности в этом белке. Ботулотоксин типа В, D, F и G действует на мембранный белок, ассоциированный с везикулами (VAMP, также называемый синаптобревин), при этом каждый серотип расщепляет белок в своем месте. Наконец, ботулотоксин типа С1, по-видимому, расщепляет как синтаксин, так и SNAP-25. Эти различия в механизме действия могут влиять на относительную активность и/или продолжительность действия различных серотипов ботулотоксина. В частности, субстрат для ботулотоксина может быть найден в различных типах клеток.

Молекулярная масса ботулотоксина для всех семи известных серотипах ботулотоксина составляет около 150 кДа. Интересно, что ботулотоксины высвобождаются клостридиальной бактерией в виде комплексов, содержащих молекулы белка ботулотоксина с молекулярной массой 150 кДа вместе с соответствующими нетоксиновыми белками. Таким образом, комплекс ботулотоксина типа А может продуцироваться клостридиальной бактерией в форме 900 кДа, 500 кДа или 300 кДа. Ботулотоксин типа В и С1, по-видимому, продуцируется только в виде комплекса 700 кДа или 500 кДа. Ботулотоксин типа D продуцируется в виде комплексов 300 кДа или 500 кДа. Наконец, ботулотоксин типов Е и F вырабатывается в виде комплексов с массой примерно 300 кДа. Считается, что комплексы (т.е. соединения с молекулярной массой более примерно 150 кДа) содержат нетоксиновые белки гемагглютинина, нетоксиновый и нетоксичный негемагглютининовый белок. Эти два нетоксиновых белка (которые вместе с молекулой ботулотоксина составляют соответствующий комплекс нейротоксина) могут присутствовать для обеспечения устойчивости к денатурации молекулы ботулотоксина и защиты от пищеварительных кислот при проглатывании ботулотоксина. Кроме того, возможно, что более крупные (с молекулярной массой более 150 кДа) комплексы ботулотоксина обладают более медленной скоростью диффузии ботулотоксина от места внутримышечного введения комплекса ботулотоксина.

Исследования in vitro показали, что ботулотоксин ингибирует индуцированное катионами калия высвобождение как ацетилхолина, так и норадреналина из первичных клеточных культур ткани ствола мозга. Кроме того, сообщалось, что ботулотоксин ингибирует вызванное высвобождение как глицина, так и глутамата в первичных культурах нейронов спинного мозга и что в препаратах синаптосом головного мозга ботулотоксин ингибирует высвобождение каждого из нейротрансмиттеров ацетилхолина, дофамина, норэпинефрина, CGRP, вещества Р и глутамата. Таким образом, когда используются адекватные концентрации, вызванное стимулом высвобождение большинства нейротрансмиттеров может блокироваться ботулотоксином.

Ботулотоксин типа А может быть получен путем получения и выращивания культур Clostridium botulinum в ферментере, а затем сбора и очистки ферментированной смеси в соответствии с известными процедурами. Все серотипы ботулотоксина первоначально синтезируются в виде неактивных одноцепочечных белков, которые должны быть расщеплены или разрезаны протеазами, чтобы стать нейроактивными. Штаммы бактерий, которые продуцируют ботулотоксин серотипов А и G, обладают эндогенными протеазами, поэтому серотипы А и G могут быть выделены из бактериальных культур преимущественно в их активной форме. Напротив, ботулотоксин серотипов C1, D и Е синтезируется непротеолитическими штаммами и поэтому обычно инактивируется при извлечении из культуры. Серотипы В и F продуцируются как протеолитическими, так и непротеолитическими штаммами, и, таким образом, могут быть восстановлены в активной или неактивной форме. Однако даже протеолитические штаммы, которые продуцируют, например, ботулотоксин серотипа типа В, расщепляют только часть продуцируемого токсина. Точная пропорция расщепленных и не расщепленных молекул зависит от продолжительности инкубации и температуры культуры. Следовательно, определенный процент любого препарата, например, ботулотоксин типа В, вероятно, неактивен, возможно, из-за известной значительно более низкой активности ботулотоксина типа В по сравнению с ботулотоксином типа А. Наличие неактивных молекул ботулотоксина в клиническом препарате будет вносить вклад в общую белковую нагрузку препарата, что связано с повышенной антигенностью, не влияя на его клиническую эффективность. Кроме того, известно, что ботулотоксин типа В при внутримышечной инъекции имеет более короткую продолжительность активности и также менее эффективен, чем ботулотоксин типа А при том же уровне дозы.

Высококачественный кристаллический ботулотоксин типа А может быть получен из штамма Hall A Clostridium botulinum с характеристиками ≥3×10⁷ U/мг, А₂₆₀/А₂₇₈ менее 0,60 и четкой картиной полос при гель-электрофорезе. Известный процесс Шанца может быть использован для получения кристаллического ботулотоксина типа А. Как правило, комплекс ботулотоксина типа А может быть выделен и очищен из среды анаэробной ферментации путем культивирования Clostridium botulinum типа А в подходящей среде. Известный способ также может быть использован после отделения нетоксиновых белков для получения чистых ботулотоксинов, таких как, например: очищенный ботулотоксин типа А с молекулярной массой приблизительно 150 кДа с удельной активностью 1-2×10⁸ ЛД₅₀. U/мг или более; очищенный ботулотоксин типа В с молекулярной массой приблизительно 156 кДа с удельной активностью 1-2×10⁸ ЛД₅₀ U/мг или более; и очищенный ботулотоксин типа F с молекулярной массой приблизительно 155 кДа с удельной активностью 1-2×10⁷ ЛД₅₀ U/мг или более.

Комплексы ботулотоксинов коммерчески доступны от производителей соединений, известных в данной области техники, и чистый ботулотоксин также может быть использован для приготовления фармацевтической композиции.

Как и в случае с ферментами, биологическая активность ботулотоксинов (которые являются внутриклеточными пептидазами) зависит, по крайней мере частично, от их трехмерной конформации. Таким образом, ботулотоксин типа А теряет токсичность под воздействием тепла, различных химических веществ, растягивающих поверхность и высушивающих поверхность. Кроме того, известно, что разбавление ботулотоксинового комплекса, полученного с помощью известного культивирования, ферментации и очистки, до очень низких концентраций токсина, используемых для приготовления фармацевтической композиции, приводит к быстрой потере токсичности токсина, если отсутствует подходящий стабилизирующий агент. Разбавление токсина от миллиграммовых количеств до раствора, содержащего нанограммы на миллилитр, представляет значительные трудности из-за быстрой потери специфической токсичности при таком большом разведении. Поскольку ботулотоксин может использоваться через месяцы или годы после того, как получена содержащая токсин фармацевтическая композиция, указанный токсин должен быть стабилизирован подходящим стабилизирующим агентом. Таким образом, как это раскрыто в настоящем изобретении, разработка технологии с оптимальным стабилизирующим агентом необходима для контроля высвобождения ботулотоксина in vivo в форме с замедленным высвобождением.

Сообщалось, что ботулотоксин типа А использовался в клинических условиях следующим образом:

Обычная продолжительность внутримышечной инъекции ботулотоксина, вводимого in vivo, обычно составляет от 3 до 4 месяцев. Однако в некоторых случаях ботулотоксин подтипа А может иметь эффективность до 12 месяцев (European J. Neurology 6 (Supp. 4): S111-S1150: 1999), а в некоторых случаях вплоть до 27 месяцев, когда он используется для лечения желез, например, при лечении гипергидроза.

В дополнение к фармакологическим действиям на периферических участках, ботулотоксины могут также оказывать ингибирующее действие на центральную нервную систему. Работы Вейганда и др., Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1976; 292, 161-165, и Хаберманн, Nauny-Schmiedeb erg's Arch. Pharmacol. 1974; 281, 47-56 показали, что ботулотоксин способен проникать в область позвоночника путем ретроградного транспорта. Таким образом, ботулотоксин, введенный в периферическое место, например внутримышечно, может быть ретроградно перенесен в спинной мозг.

Ботулотоксин также был предложен или использовался для лечения ран кожи, костей и сухожилий (патент США №6,447,787); интратекальной боли (см. патент США №6,113,915); различных вегетативных нервных расстройств, включая расстройства потовых желез (см., например, патент США №5,766,605 и Goldman (2000), (Aesthetic Plastic Surgery July-August 24 (4): 280-282); напряженной головной боли (патент США №6,458,365); головной боли от мигрени (патент США №5,714,468); послеоперационной боли и висцеральной боли (патент США №6,464,986); роста волос и задержки роста волос (патент США №6,299,893); псориаза и дерматита (патент США №5,670,484); поврежденных мышц (патент США №6,423,319); различных видов рака (патенты США №6,139,845 и 6,063,768), нарушений в гладких мышцах (патент США №5,437,291); синдрома нервного захвата (заявка на патент США 2003-0224019); прыщей (WO 03/011333); нейрогенного воспаления (патент США №6,063,768); нарушения зрения (см. патент США №6,265,379); расстройства поджелудочной железы (см. патенты США №6,143,306 и 6,261,572); расстройства предстательной железы, включая гиперплазию предстательной железы, рак предстательной железы и недержание мочи (см. патенты США №6,365,164 и 6,667,041 и Doggweiler R., и др. (Botulinum toxin type A causes diffuse and highly selective atrophy of rat prostate, Neurourol Urodyn 1998; 17 (4): 363); фибромиалгии (патент США №6,623,742) и мышечного синдрома грушевидной мышцы (см. Childers и др. (2002), American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation, 81: 751-759).

В патенте США №5,989,545 раскрывается, что модифицированный клостридиальный нейротоксин или его фрагмент, предпочтительно ботулотоксин, химически конъюгированный или рекомбинантно слитый с конкретным нацеливающим фрагментом, можно использовать для лечения боли путем введения агента в спинной мозг. Кроме того, было раскрыто, что нацеленные ботулотоксины (то есть, с ненативным связывающим фрагментом) можно использовать для лечения различных состояний (см. WO 96/33273; WO 99/17806; WO 98/07864; WO 00/57897; WO 01/21213; WO 00/10598).

Кроме того, ботулотоксин был введен в грудную мышцу для контроля грудного спазма (Senior М., Botox and the management of pectoral spasm after subpectoral implant insertion, Plastic and Recon Surg, July 2000, 224-225). Известны имплантаты с токсином с контролируемым высвобождением (см. патенты США №6,306,323 и 6,321,208) при трансдермальном введении ботулотоксина (заявка на патент США, серийный номер 10/194805). Известно, что ботулотоксин может быть использован для: ослабления жевательной или кусающей мышцы рта, чтобы можно было залечить раны, нанесенные самим собой, и возникающие в результате язвы (Payne М., и др., Botulinum toxin as а novel treatment for self mutilation in Lesch-Nyhan syndrome, Ann Neurol 2002 Sep.; 52 (3 Supp 1):S157); заживления доброкачественных кистозных поражений или опухолей (Blugerman G., и др., Multiple eccrine hidrocystomas: A new therapeutic option with botulinum toxin, Dermatol Surg 2003 May; 29 (5): 557-9); лечения анальной трещины (Jost W., Ten years' experience with botulinum toxin in anal fissure, Int J Colorectal Dis 2002 September; 17 (5): 298-302); и лечения некоторых видов атопического дерматита (Heckmann М., др., Botulinum toxin type A injection in the treatment of lichen simplex: An open pilot study, J Am Acad Dermatol 2002 April; 46 (4): 617-9).

Кроме того, ботулотоксин может оказывать эффект уменьшения индуцированной воспалительной боли на формалиновой модели у крыс (Aoki K., и др. Mechanisms of the antinociceptive effect of subcutaneous Botox: Inhibition of peripheral and central nociceptive processing, Cephalalgia 2003 September; 23(7):649). Кроме того, сообщалось, что блокада нервов ботулотоксином может вызывать уменьшение толщины эпидермиса (Li Y, и др., Sensory and motor denervation influences epidermal thickness in rat foot glabrous skin, Exp Neurol 1997; 147: 452-462). Наконец, известно введение ботулотоксина в стопу для лечения чрезмерного потоотделения стопы (Кацамбас А., и др. Cutaneous diseases of the foot: Unapproved treatments, Clin Dermatol 2002, November-December; 20(6):689-699; Sevim S., и др., Botulinum toxin-A therapy for palmar and plantar hyperhidrosis, Acta Neurol Belg 2002 Dec.; 102 (4): 167-70), спастических пальцев (Suputtitada, A., Local botulinum toxin type A injections in the treatment of spastic toes, Am J Phys Med Rehabil 2002 October 81 (10): 770-5), идиопатической ходьбы пальцев ног (Tacks, L., и др., Idiopathic toe walking: Treatment with botulinum toxin A injection, Dev Med Child Neurol 2002; 44 (Suppl 91): 6) и дистонии стопы (Rogers J., др., Injections of botulinum toxin A in foot dystonia, Neurology 1993 Apr; 43 (4 Suppl 2)).

Токсин столбняка, а также его производные (то есть, с ненативным нацеливающим фрагментом), их фрагменты, гибриды и химеры также могут иметь терапевтическое применение. Токсин столбняка имеет много общего с ботулотоксинами. Таким образом, и столбнячный токсин, и ботулотоксины являются полипептидами, полученными близкородственными видами Clostridium (Clostridium tetani и Clostridium botulinum, соответственно). Кроме того, и столбнячный токсин, и ботулотоксины представляют собой двухцепочечные белки, состоящие из легкой цепи (молекулярный вес: около 50 кДа), ковалентно связанной одной дисульфидной связью с тяжелой цепью (молекулярный вес: около 100 кДа). Следовательно, молекулярная масса столбнячного токсина и каждого из 7 ботулотоксинов (не комплексных) составляет около 150 кДа. Кроме того, как у токсина столбняка, так и у ботулотоксинов, легкая цепь несет домен, который проявляет внутриклеточную биологическую (протеазную) активность, в то время как тяжелая цепь включает рецепторсвязывающий (иммуногенный) домен и транслокационный по отношению к клеточной мембране домен.

Кроме того, как столбнячный токсин, так и ботулотоксины проявляют высокое специфическое сродство к ганглиозидным рецепторам на поверхности пресинаптических холинергических нейронов. Рецептор-опосредованный эндоцитоз столбнячного токсина в периферических холинергических нейронах приводит к ретроградному аксональному транспорту, блокируя высвобождение ингибиторных нейротрансмиттеров из центральных синапсов и вызывая спастический паралич. В противоположность этому, считается, что рецептор-опосредованный эндоцитоз ботулотоксина в периферических холинергических нейронах едва ли приводит к ретроградному транспорту, ингибированию экзоцитоза ацетилхолина из центральных синапсов и вялому параличу. Тем не менее, в недавнем сообщении высказано предположение, что ботулотоксин также может подвергаться ретроградному транспорту вдоль аксонов и, возможно, ингибировать высвобождение ацетилхолина в центральном синапсе (Bomba-Warczak и др., Interneuronal Transfer and Distal Action of Tetanus Toxin and Botulinum Нейротоксиш A and D in Central Neurons, Cell Reports, 2016 August; 16, 1974-1987).

Наконец, токсин столбняка и ботулотоксины похожи друг на друга как в биосинтезе, так и в молекулярной архитектуре. Таким образом, существует общая 34%-ная идентичность между белковыми последовательностями токсина столбняка и ботулотоксина типа А, а идентичность последовательностей для некоторых функциональных доменов достигает 62% (Binz Т. и др., The Complete Sequence of Botulinum Neurotoxin Type A and Comparison with Other Clostridial Neurotoxins, J Biological Chemistry 265(16); 9153-9158:1990).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, «ацетилхолин» - это сложный эфир холина и уксусной кислоты, который является первым известным нейротрансмиттером. Он распределен по нейронам, имеет химическую формулу C₇H₁₆NO₂ и молекулярную массу 146,21 кДа.

Как правило, только один тип низкомолекулярного нейротрансмиттера высвобождается каждым типом нейрона в нервной системе млекопитающего, хотя есть свидетельства того, что несколько нейромодуляторов могут высвобождаться одним и тем же нейроном. Нейротрансмиттер ацетилхолин секретируется нейронами во многих областях мозга, особенно крупными пирамидными клетками моторной коры, несколькими различными нейронами в базальных ганглиях, моторными нейронами, которые иннервируют скелетные мышцы, преганглионарными нейронами вегетативной нервной системы, (как симпатические, так и парасимпатические), волокнами bag1 мешочного волокна мышечного веретена, постганглионарными нейронами парасимпатической нервной системы и некоторыми постганглионарными нейронами симпатической нервной системы. По сути, только постганглионарные симпатические нервные волокна, идущие к потовым железам, мышцы пилоэктора и несколько кровеносных сосудов являются холинергическими, поскольку большинство постганглионарных нейронов симпатической нервной системы секретируют нейротрансмиттер норэпинефин. В большинстве случаев ацетилхолин оказывает возбуждающее действие. Однако известно, что ацетилхолин оказывает ингибирующее действие на некоторые периферические парасимпатические нервные окончания (например, ингибирование сердечного ритма блуждающим нервом).

Эфферентные сигналы вегетативной нервной системы передаются в организм через симпатическую нервную систему или парасимпатическую нервную систему. Преганглионарные нейроны симпатической нервной системы выходят из преганглионарных тел симпатических нейронных клеток, расположенных в промежуточном латеральном роге спинного мозга. Преганглионарные симпатические нервные волокна, простирающиеся от тела клетки, образуют синапсы с постганглионарными нейронами, расположенными либо в паравертебральном симпатическом ганглии, либо в превертебральном ганглии. Поскольку преганглионарные нейроны как симпатической, так и парасимпатической нервной системы являются холинергическими, применение ацетилхолина в ганглиях возбуждает как симпатические, так и парасимпатические постганглионарные нейроны.

Ацетилхолин активирует два типа рецепторов, мускариновые и никотиновые рецепторы. Мускариновые рецепторы обнаружены во всех эффекторных клетках, стимулируемых постганглионарными нейронами парасимпатической нервной системы, а также в стимуляторах постганглионарных холинергических нейронов симпатической нервной системы. Никотиновые рецепторы обнаружены в мозговом веществе надпочечников, а также в вегетативных ганглиях, которые находятся на клеточной поверхности постганглионарного нейрона в синапсе между преганглионарным и постганглионарным нейронами симпатической и парасимпатической систем. Никотиновые рецепторы также обнаруживаются во многих неавтономных нервных окончаниях, например в мембранах скелетных мышечных волокон в нервно-мышечном соединении.

Ацетилхолин высвобождается из холинергических нейронов, когда маленькие прозрачные внутриклеточные пузырьки сливаются с пресинаптической мембраной нервных клеток. Широкий спектр не нейрональных секреторных клеток, таких как мозговое вещество надпочечников (а также клеточная линия PC12) и островковые клетки поджелудочной железы, выделяют катехоламины и паратиреоидный гормон, соответственно, из больших пузырьков с плотным ядром. Клеточная линия PC12 представляет собой клон клеток феохромоцитомы крысы, широко используемый в качестве модели культуры ткани для исследований развития симпатоадреналового канала. Ботулотоксин ингибирует высвобождение обоих типов соединений из обоих типов клеток in vitro, когда денервированные клетки проницаемы (например, путем электропорации) или непосредственно инъецированы токсином. Также известно, что ботулотоксин блокирует высвобождение нейротрансмиттера глутамата из клеточных культур корковых синаптосом.

Нервно-мышечное соединение образуется в скелетных мышцах из-за близости аксонов к мышечным клеткам. Сигнал, передаваемый через нервную систему, приводит к появлению потенциала действия в терминальном аксоне с активацией ионных каналов и, как следствие, высвобождением нейротрансмиттера ацетилхолина из интранейрональных синаптических везикул, например, в моторную концевую пластину нервно-мышечного соединения. Ацетилхолин пересекает внеклеточное пространство, связываясь с белками рецептора ацетилхолина на поверхности концевой пластинки мышцы. Как только происходит достаточное связывание, потенциал действия мышечной клетки вызывает специфические изменения мембранного ионного канала, что приводит к сокращению мышечной клетки. Затем ацетилхолин высвобождается из мышечных клеток и метаболизируется холинэстеразами во внеклеточном пространстве. Метаболиты возвращаются в конечный аксон для дальнейшей переработки в ацетилхолин.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, термин «стабилизирующий агент» означает любую добавку, которую добавляют для повышения стабильности активного ингредиента и предотвращения окисления, кристаллизации активного ингредиента и не ограничивается каким либо образом при условии, что он фармацевтически приемлем. Оценка стабилизирующего эффекта стабилизирующего агента может быть выполнена без ограничения температуры, но следует понимать, что стабилизирующий эффект сохраняется в течение более длительного периода при более низкой температуре, чем при высокой температуре. Поэтому оценку эффективности долгосрочной стабилизации при низкой температуре можно заменить «испытанием на ускорение», которое выполняется при высокой температуре в течение короткого времени. Например, результат оценки эффекта стабилизации конкретного стабилизирующего агента при 37°С в течение 9 дней, был таким же, как и результат при 4°С в течение 3 месяцев, а в результате оценка эффекта стабилизации конкретного стабилизирующего агента при 37°С в течение 74 дня, была той же самой, что и при 24°С в течение 24 месяцев (http://iso-inc.com/medical-package-testing/accelerated-aging.html).

В настоящем изобретении, стабилизирующий агент добавляют для сохранения или поддержания биологической активности белка нейротоксина клостридиального типа, который включает ботулотоксин, и который предпочтительно выбирают из аргинина, метионина, аспарагиновой кислоты, глютаминовой кислоты, глюконолактона, винной кислоты или гипосульфата натрия и более предпочтительно аргинина, аспарагиновой кислоты или глютаминовой кислоты, но не ограничивается ими.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, термин «стабилизирующий буфер» или «стабилизирующий буферный агент» означает как стабилизирующий агент, так и эффект в качестве буфера. Его можно приготовить путем добавления вещества, обладающего стабилизирующим эффектом, к общему буферу, также можно ожидать получения стабилизирующего синергетического эффекта, путем добавления дополнительных стабилизирующих агентов. В настоящем изобретении стабилизирующий буфер предпочтительно представляет собой глюконолактоновый буфер или буфер на основе винной кислоты, но не ограничивается ими.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, «аргинин» является разновидностью основной аминокислоты, имеет молекулярную формулу C₆H₁₄N₄O₂ и молекулярный вес 174,21, и является водорастворимым. Этот остаток сокращенно обозначен как «Arg» и обозначается одной буквой «R». Впервые он был выделен из проростков люпина (разновидности бобов) М.Дж.С. Шульце и Э. Штайгер. Аргинином был назван потому, что его нитрат имеет серебристый цвет. L-аргинин присутствует в белках качестве одной из аминокислот и содержится в белке протамин, присутствующем в сперматозоидах рыбы. Около 70% аминокислот в сельди и лососе составляют аргинины. В семенах растений аргинин присутствует в свободном состоянии. Остатки аргинина являются сильно основными из-за их гуанидиновой группы. Его можно определить количественно, поскольку он образует своеобразный красный цвет при взаимодействии с α-нафтолом и щелочным гипохлоритом. В метаболических путях in vivo аргинин является компонентом орнитинового пути, открытого Х.А. Кребсом и др., и расщепляется до мочевины и орнитина под действием аргиназы. Аргинин производится из цитруллина и аспарагиновой кислоты. Он не является незаменимой аминокислотой у взрослых, но является незаменимой аминокислотой у детей. Он обеспечивает защиту от токсичности аммиака или большого количества аминокислот. Аргиназа присутствует в головном мозге и контролирует количество аргинина, который является предшественником γ-гуанидиномасляной кислоты. У беспозвоночных животных аргинин, присутствующий в форме аргининфосфата, играет важную роль в мышечном сокращении с помощью фосфагена, а также широко присутствует в качестве предшественника особого основания ханидина (магматина, октопина).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, «глютаминовая кислота» является одной из аминокислот, и также упоминается как «глютаминовая кислота», и представлена остатками «Glu» или «Е», и имеет молекулярную формулу C₅H₉NO₄. Впервые он был обнаружен в гидролизате пшеничного глютена. Это одна из самых распространенных белковых аминокислот, особенно в пшеничном глиадине, позволяющая 43,7% белка. Можно выделить ее гидрохлорид насыщенным хлористым водородом из гидролизата белка пшеницы, сои и др.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, «аспарагиновая кислота» является одной из аминокислот, и также упоминается как «аспарагиновая кислота», и представлена остатками «Asp» или «D», и имеет молекулярную формулу C₄H₇NO₄. Это одна из аминокислот, составляющих белок. Это кислотная аминокислота, имеющая две карбоксильные группы (-СООН) в молекуле, и классифицируется как аминокислота, не являющаяся незаменимой. Как и глютамин, известно, что она играет центральную роль в переаминировании аминокислот in vivo.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, «глюконолактон» означает белые кристаллы или кристаллический порошок, который не имеет или почти не имеет запаха, сначала обладает сладким вкусом, а затем слегка кисловатым. Его формула С₆Н₁₀О₆. Это синтетический пекарский агент, который хорошо растворяется в воде и слабо растворяется в этаноле, но не растворяется в эфире. Водный раствор медленно гидролизуется с образованием равновесного состояния между глюконовой кислотой, δ-лактоном и γ-лактоном, и чем выше температура и рН, тем быстрее происходит гидролиз. Примерно через 2 часа при комнатной температуре 25°С он полностью гидролизуется до раствора 55-60% глюконовой кислоты и 40-50% лактона. Хотя глюконо-δ-лактон не является кислотой, он гидролизуется при растворении в воде и проявляет кислотность. Поэтому предпочтительно использовать его в качестве агента -модификатора кислотности, вызывающего набухание, и даже если он смешан с гидрокарбонатом натрия (бикарбонат натрия), никакой реакции не происходит. Кроме того, поскольку гидролиз происходит медленно, при использовании в качестве модификатора кислотности для агента, вызывающего набухание, он может вступать в реакцию с гидрокарбонатом натрия, чтобы получить продукт, имеющий очень тонкую текстуру. Кроме того, он обладает антиоксидантной способностью, поскольку образует комплекс с металлом. Хотя это не кислота, она используется для понижения рН размягченного продукта, поскольку при нагревании водный раствор демонстрирует кислотность.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, «винная кислота» представляет собой органическое соединение, полученное обработкой серной кислоты осадком, образованным добавлением карбоната кальция к олову. Она также называется диоксисукциновой кислотой, потому что она содержится в олове, осажденном при изготовлении вина. Представляется формулой C₄H₆O₆. Существует несколько изомеров правовращающейся L-винной кислоты, левовращающейся D-винной кислоты, рацемической винной кислоты (также называемой виноградной кислотой), которые представлены в равной степени, и м-винной кислоты, которые не обладают оптической активностью. При естественном присутствии L-винная кислота является преобладающей, и она широко распространена в системе растений в виде свободной кислоты, соли кальция и соли калия.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, термин «фармацевтическая композиция» относится к композиции, которую вводят пациенту для определенной цели. Для целей настоящего изобретения, указанной фармацевтической композицией согласно настоящему изобретение является композиция, содержащая ботулотоксин, и содержащая в качестве стабилизирующего агента аргинин, глютаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту, или буфер на основе глюконолактоновой кислоты или буфер на основе винной кислотой в качестве стабилизирующего буфера, который может содержать белок и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель, которые используются при данном введении Термин «фармацевтически приемлемый носитель» или наполнитель означает носитель или наполнитель, одобренный регулирующим органом правительства или включенный в Фармакопею или другую общепризнанную фармакопею для использования у млекопитающих и, в частности, у людей. Для парентерального введения указанная фармацевтическая композиция согласно настоящему количеству может быть в форме суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных носителях и может быть приготовлена в форме твердого или полутвердого вещества. Более предпочтительно, это может быть жидкая форма. Кроме того, указанная фармацевтическая композиция согласно настоящему результату может содержать формулирующие агенты, такие как суспендирующие агенты, стабилизирующие агенты, солюбилизирующие агенты и/или диспергирующие агенты, и могут быть стерилизована. Указанная фармацевтическая композиция может быть стабильной в условиях производства и хранения, а также может быть предохранена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии или грибы. В качестве альтернативы, композиция ботулотоксина, имеющая в своем составе аргинин в качестве стабилизирующего агента, согласно согласно настоящему изобретению, может быть в форме стерильного порошка для разведения подходящими носителями перед ее использованием. Указанная фармацевтическая композиция может присутствовать в форме единичных доз, пластырях с микроиглами, в ампулах или других контейнерах с единичными дозами или в контейнерах с множественными дозами. В качестве альтернативы, указанная фармацевтическая композиция может храниться в лиофилизированных (лиофилизированных) условиях, требующих только добавления стерильного жидкого носителя, например воды для инъекций, непосредственно перед использованием. Инъекционные растворы и суспензии для немедленного введения могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул или таблеток.

В некоторых неограничивающих вариантах осуществления, композиция ботулотоксина, содержащая аргинин в качестве стабилизирующего агента, согласно настоящему изобретению может быть сформулирована в виде жидкости или может содержаться в форме микросфер в жидкости. В любых неограничивающих вариантах осуществления композиция ботулотоксина, содержащая аргинин в качестве стабилизирующего агента, может содержать ботулотоксин или фармацевтически приемлемое соединение и/или их смесь в концентрации 0,001-100000 ед/кг. В любых неограничивающих вариантах осуществления, наполнители, подходящие для композиции ботулотоксина, доступные в качестве стабилизирующего агента, включают консерванты, суспендирующие агенты, стабилизирующие агенты, красители, буферы, антибактериальные агенты, противогрибковые агенты, изотонические агенты (например, сахара или хлорид натрия), и дополнительный стабилизирующий агент. Используемый здесь термин «дополнительный стабилизирующий агент» относится к дополнительно содержащемуся стабилизирующему агенту, за исключением уже присутствующего в нем стабилизирующего агента (аргинина, глютаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты) или стабилизационного буфера (буфер глюконолактона или буфер на основе винной кислоты). Этот «дополнительный стабилизирующий агент» может использоваться без ограничений, если он общеизвестен в данной области. Также указанная фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может содержать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых носителей включают воду, физиологический раствор, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль), масла и их подходящие смеси. Неограничивающие примеры методов стерилизации, которые применяются к указанным фармацевтическим композициям согласно этому критерию, включают фильтрацию через удерживающий бактерии фильтр, терминальную стерилизацию, введение стерилизующих агентов, облучение, обработка стерильным газом, нагревание, вакуумную сушку и лиофильную сушку.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, термин «введение» означает введение композиции согласно настоящему показанию пациенту любым подходящим способом. Композиция согласно настоящему изобретению может быть введена любым обычным путем, если он позволяет достигать ткани-мишени. Композиция согласно настоящему изобретению может вводиться перорально, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрикожно, интраназально, внутрилегочно, интраректально или интратекально. Однако композицию ботулотоксина согласно настоящему изобретению наиболее предпочтительно вводить внутримышечно в виде жидкой композиции, но указанное введение не ограничивается этим.

Способ лечения согласно настоящему изобретению может включать введение фармацевтически эффективного количества указанной фармацевтической композиции. В настоящем изобретении эффективное количество может варьироваться в зависимости от различных факторов, включая вид заболевания, степень тяжести заболевания, виды и содержание активных ингредиентов и других ингредиентов, содержащихся в композиции, вид препарата, возраст пациента, вес, общее состояние здоровья, пол и диета, время введения, способ введения, скорость секреции композиции, период лечения и препараты, применяемые одновременно.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, предоставляется фармацевтическая композиция, содержащая нейротоксин и стабилизирующий агент. В указанной фармацевтической композиции указанный нейротоксин может быть любым одним или несколькими, выбранными из группы, состоящей из ботулотоксина, токсина столбняка, токсина холеры и токсина коклюша. Ботулотоксин может быть выбран из группы, состоящей из ботулотоксина типа А, В, С, D, Е, F и G. Ботулотоксин предпочтительно представляет собой ботулотоксин типа А. Кроме того, ботулотоксин может быть либо в форме, не имеющей комплексообразующего белка, либо в виде комплекса, содержащего комплексообразующий белок. В указанной фармацевтической композиции стабилизирующий агент представляет собой любой один или несколько элементов, выбранных из аргинина, глютаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, и стабилизирующий агент предоставляется в форме стабилизирующего буфера, где стабилизирующий буфер представляет собой любой один или несколько элементов, выбранных из глюконолактонового буфера и буфера на основе винной кислоты. Кроме того, стабилизирующий агент может содержаться в концентрации 0,01-1000 мМ на 100 единиц ботулотоксина. Фармацевтическая композиция может иметь рН 5,5-7,0. Кроме того, указанная фармацевтическая композиция может дополнительно содержать местный анестетик. В фармацевтической композиции местным анестетиком может быть лидокаин, и он может содержаться в количестве 0,1-1 мас. % в расчете на общую массу фармацевтической композиции. Кроме того, фармацевтическая композиция может дополнительно содержать полисорбат. Кроме того, фармацевтическая композиция может быть жидкой.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предоставлен способ получения фармацевтической композиции, содержащий следующие стадии: (а) очистка нейротоксина; и (б) добавление стабилизирующего агента к указанному нейротоксину. В указанном способе указанный нейротоксин может предпочтительно представлять собой ботулотоксин типа А. В указанном способе стабилизирующий агент представляет собой любой один или несколько агентов, выбранных из аргинина, глютаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, при этом стабилизирующий агент предоставляется в форме стабилизирующего буфера, где стабилизирующий буфер представляет собой любой один или несколько элементов, выбранных из глюконолактонового буфера и буфера на основе винной кислоты. Кроме того, указанная фармацевтическая композиция может быть жидкой.

Далее каждый шаг согласно настоящему значению будет описан более подробно.

Преимущественные эффекты

Ботулотоксин ингибирует экзоцитоз ацетилхолина в холинергическом пресинапсе нервно-мышечного соединения у животных, имеющих неврологическую функцию, вызывая тем самым астению. Ботулотоксин оказывает большое терапевтическое воздействие на различные заболевания благодаря своей нейротоксической функции, но смертелен даже в очень небольшом количестве из-за его сильной токсичности. По этой причине, когда ботулотоксин должен использоваться в живом организме, необходимо тщательно контролировать концентрацию ботулотоксина. Однако доступные в настоящее время фармацевтические композиции, содержащие ботулотоксин, имеют проблемы с денатурацией белка. Из-за таких проблем современные фармацевтические композиции готовятся и распространяются в форме лиофилизированных составов и готовятся разбавлением в жидком солевом растворе пользователем непосредственно перед использованием в клинических целях. По этой причине в случае существующих фармацевтических композиций существовала проблема, заключающаяся в том, что риск несчастных случаев на производстве, вызванных человеческими ошибками, такими как ошибка фактора разбавления или загрязнение солевого раствора, является достаточно высоким.

А фармацевтическая композиция, содержащая ботулотоксин, согласно настоящему изобретению может содержать аргинин, глютаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту в качестве стабилизирующего агента, или может содержать глюконолактоновый буфер или буфер на основе винной кислоты в качестве стабилизирующего буфера для ботулотоксина. При этом композиция согласно настоящему изобретению демонстрировала заметный эффект на стабилизацию ботулотоксина даже тогда, когда она распространялась в виде жидкой композиции. Таким образом, ожидается, что композиция согласно настоящему изобретению будет в значительной степени способствовать безопасному и удобному медицинскому применению ботулотоксина.

Описание чертежей

На Фиг. 1 изображены результаты измерения остаточной активности ботулотоксина после инкубирования ботулотоксина вместе с аргинином или метионин в течение 28-56 суток.

На Фиг. 2 изображены результаты измерения остаточной активности ботулотоксина после инкубирования композиции ботулотоксина, содержащей аргинин или метионин при рН от 6,0 до 7,0 в течение 56 суток. Более точно, рН 6,0 на Фиг. 2а, рН 6,5 на Фиг. 26, рН 7,0 на Фиг. 2в.

На Фиг. 3 изображены результаты измерения остаточной активности ботулотоксина после инкубирования композиции ботулотоксина, содержащей различные антиоксиданты в течение 28 суток.

На Фиг. 4 изображены результаты измерения остаточной активности ботулотоксина после инкубирования композиции ботулотоксина, содержащей различные буферы в течение 28 суток.

На Фиг. 5 изображена каждая стадия методики DESCR для измерения активности ботулотоксина согласно одному из примеров согласно настоящему изобретению.

На Фиг. 6 изображены результаты сравнения влияния аргинина и метионина на стабилизацию жидких ботулинических композиций согласно одному из примеров настоящего изобретения. В частности, на Фиг. 6а показаны результаты сравнения для композиций, не содержащих местные анестетики, а на Фиг. 6б показаны результаты сравнения для композиций, содержащих местный анестетик (0,3% лидокаин).

На Фиг. 7 изображены результаты оценки влияния материала контейнера для жидкой композиции на стабилизацию активности BoNT/A. В частности, на Фиг. 7а показаны результаты сравнения для композиций, не содержащих местные анестетики, а на Фиг. 7б показаны результаты сравнения для композиций, содержащих местный анестетик (0,3% лидокаин).

На Фиг. 8 изображены результаты сравнения стабилизирующего влияния аргинина на композиции, содержащие винную кислоту или глюконолактон в качестве буфера, при использовании стеклянного контейнера согласно одному из примеров настоящего изобретения. В частности, на Фиг. 8а показаны результаты сравнения для композиций, не содержащих местные анестетики, а на Фиг. 8б показаны результаты сравнения для композиций, содержащих местный анестетик (0,3% лидокаин).

На Фиг. 9 изображены результаты оценки влияния аргинина в качестве стабилизирующего агента для композиций, содержащих глютаминовую кислоту в дополнение к винной кислоте или глюконолактоновому буферу согласно одному из примеров настоящего изобретения. В частности, на Фиг. 9а показаны результаты сравнения для композиций, не содержащих местные анестетики, а на Фиг. 9б показаны результаты сравнения для композиций, содержащих местный анестетик (0,3% лидокаин).

На Фиг. 10 изображены результаты определения оптимальной концентрации глютаминовой кислоты, которая вносит вклад в стабилизирующее влияние аргинина, для композиций, содержащих глюколактон в качестве буфера согласно одному из примеров настоящего изобретения. В частности, на Фиг. 10а показаны результаты сравнения для композиций, не содержащих местные анестетики, а на Фиг. 10б показаны результаты сравнения для композиций, содержащих местный анестетик (0,3% лидокаин).

На Фиг. 11 изображены результаты оценки влияния аспарагиновой кислоты на стабилизирующее влияние аргинина в отношении BoNT/A согласно одному из примеров настоящего изобретения. В частности, на Фиг. 11а показаны результаты сравнения для композиций, не содержащих местные анестетики, а на Фиг. 11б показаны результаты сравнения для композиций, содержащих местный анестетик (0,3% лидокаин).

На Фиг. 12 изображены результаты сравнения стабильности продукта BoNT/A, полученного на основе жидкой композиции, имеющей новый состав, в который добавлены аргинин или метионин, согласно одному из примеров настоящего изобретения.

Наилучший способ осуществления настоящего изобретения

Результаты эксперимента, проведенного в настоящем исследовании, показали, что стабилизирующее действие аргинина и метионина на ботулотоксин зависело от рН. На основании этих результатов рН жидких композиций BoNT/A был установлен равным 6,0, а концентрацию аргинина в жидких композициях BoNT/A изменяли до различных концентраций. BoNT/A добавляли к составам до начальной активности 80 единиц/мл, а затем составы инкубировали при 37°С в течение 8 недель, и измеряли активность BoNT/A с помощью анализа DESCR. В результате было показано, что остаточная активность BoNT/A в контрольной группе, не содержащей стабилизирующий агент, составлял 10% после 2 недель, а экспериментальная группа, содержащая 50 мМ метионин, показала остаточные активности 67%, 47% и 27% после 2 недель, 4 недель и 8 недель, соответственно. Это продемонстрировало, что метионин обладает значительным стабилизирующим эффектом. Между тем, аргинин продемонстрировал стабилизирующий эффект, больший, чем метионин, в концентрации от 50 до 100 мМ, а остаточная активность BoNT/A в композиции, содержащей метионин, составляла от 31 до 65% даже после 8 недель.

Вариант осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что эти примеры предназначены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Источники всех реагентов, использованных в примерах в соответствии с настоящим значением, перечислены ниже (*).

* Глюконолактон (Sigma G2164); L(+)-винная кислота (Merck 100804); лидокаина гидрохлорид моногидрат (Sigma L5647); октановая кислота (Sigma С2875); L-метионин (Merck K45023607 414); L-аргинин (Merck K45895542 534); глицин (Bioshop GLN001-1); L-глютаминовая кислота (Merck 100291); аспарагиновая кислота (Merck K45895542 534); малеиновая кислота (Merck S6858580 534); битулированный гидроксианизол (Sigma SLBM1210V); пропилгаллат (Sigma Р3130); бисульфит натрия (Sigma MKBR6468V); тиогликолевая кислота (Sigma Т3758); L-цистеин гидрохлорид (K46446495 513); янтарная кислота (Merck K46618782 533); одноосновный фосфат натрия (Sigma S5011); двухосновный фосфат натрия (Sigma S7907); хлорид натрия (Merck K47013904 548); полисорбат (Sigma Р7949); и DL-дитиотреитол (Sigma D0632).

Сокращения и состав буферов, использованных в примерах согласно настоящему изобретению, приведены ниже (**).

** L-метионин (Met, или "М"), L-аргинин (Arg, или "R"), L-глютаминовая кислота (Glu, или "Е"), аспарагиновая кислота (Asp, или "D"), буфер Р (10 мМ NaH₂PO₄, рН 6,0, 45 мМ NaCl, и 0,05% полисорбат), буфер G (10 мМ глюконолактон, рН 6,0, 45 мМ NaCl, и 0,05%) полисорбат), буфер R (буфер G с добавлением 50 мМ аргинина).

Пример 1: Разработка агента, стабилизирующего ботулотоксин, с использованием BoTest

Пример 1-1: Подготовка эксперимента

Ботулотоксин, использованный в настоящем изобретении, был произведен Hugel Pharma Co., Ltd. (Korea) и его концентрацию доводили до 0,1 мг/мл и активности 1,529 единиц/мкл (основываясь на BoTest). Во всех экспериментах по выявлению добавок, имеющих стабилизирующий эффект, ботулотоксин использовали после разведения до 50 единиц/мкл с помощью "буфера для разведения белков", имеющего следующий состав (50 мМ NaH₂PO₄, рН 7,0, 1 мМ DTT, 0,05 вес. % полисорбата, и 20 вес. % глицерина).

Для идентификации кандидатов добавок, обладающих стабилизирующим эффектом, каждую экспериментальную группу (100 мкл) готовили путем разбавления 200 единиц ботулотоксин и добавки кандидата на роль стабилизирующего агента в «стабилизирующую жидкую композицию (10 мМ NaH₂PO₄ (рН 5,5-7,0), 0,01 вес. % полисорбата, 130 мМ NaCl)". Затем каждую экспериментальную группу инкубировали при температуре 37°С в течение 1-11 недель, и часть ее (25%) использовали для измерения остаточной активности. Активность ботулотоксина измеряли с помощью BoTest® Botulinum Neurotoxin Detection Kit (BioSentinel, USA). Для этого друг с другом смешивали 5 мМ HEPES-NaOH (рН 7,1), 0,1 вес. % полисорбат, 10 мкМ ZnCl₂ (Sigma 229997), 0,2 мкМ репортера BoTest А/Е и 25 мкл стабилизирующей экспериментальной группы для получения конечного реакционного раствора (100 мкл), а реакционный раствор инкубировали при 37°С в течение 21 часов. Соотношение CFP/FRET в инкубируемой реакционной смеси измеряли с использованием системы Synergy Neo2 Multi-Mode Reader (BioTek, USA) и соотносили со стандартной кривой, определяя таким образом остаточную активность ботулотоксина. В дополнение, все реагенты, использованные в исследовании стабилизации ботулотоксина согласно настоящему изобретению растворяли в воде тройной дистилляции и доводили до рН 5,5-7,0 посредством добавления соляной кислоты и гидроксида натрия.

Пример 1-2: Сравнение стабилизирующих эффектов аргинина или метионина при различных рН

Было изучено сравнительное влияние аргинина и метионина в качестве стабилизирующих агентов на стабилизацию ботулотоксина при рН в диапазоне от 5,5 до 7,0.

Для этого ботулотоксин добавляли к стабилизирующей жидкой композиции, описанной в Примере 1, и к полученной жидкой композиции дополнительно добавляли 50 мМ аргинина или метионина. Полученную композицию инкубировали при 37°С в течение 28-56 суток, а затем измеряли остаточную активность ботулотоксина. Результаты измерений приведены в Таблице 1 ниже и на Фиг. 1.

Как видно из результатов эксперимента, в группе отрицательного контроля, не имеющей стабилизирующего агента, ботулотоксин был нестабильным при всех значениях рН, и, таким образом, остаточная активность ботулотоксина практически не обнаруживалась через 28 суток. Остаточная активность в экспериментальной группе, содержащей метионин в качестве стабилизирующего агента, составляла около 10% при рН от 5,5 до 7,0, тогда как остаточная активность в экспериментальной группе, содержащей аргинин, составляла до 30%. Кроме того, было установлено, что влияние аргинина на стабилизацию ботулотоксина было выше при рН в диапазоне от 5,5 до 6,0, чем при рН в диапазоне от 6,5 до 7,0.

Пример 1-3: Сравнительное изучение стабилизирующих эффектов аргинина или метионина

Чтобы проверить влияние аргинина или метионина на стабилизацию ботулотоксина, композицию ботулотоксина, содержащую аргинин (50 мМ) или метионин (50 мМ) в качестве стабилизирующей добавки, инкубировали в течение 56 суток, а остаточную активность ботулотоксина измеряли в трех независимых экспериментах. Результаты измерения были обработаны статистически, что позволило проверить сравнительное влияние аргинина и метионина. В качестве контрольной группы использовали образец, не содержащий добавок. Для определения статистической значимости между тремя экспериментальными группами использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA. Когда статистическая вероятность значимости (р-значение) составляла 0,05 или менее, считалось, что разница между тремя экспериментальными группами была статистически значимой, а последующий анализ выполнялся методом LSD (метод наименьшей значимой разности). Результаты измерения показаны в Таблице 2 ниже и на Фиг. 2.

Результаты, полученные в этом Примере, показывают, что аргинин и метионин показывают высокий стабилизирующий эффект при рН 6,0, и эти экспериментальные результаты согласуются с вышеописанными экспериментальными результатами. Однако при тех же условиях рН аргинин показал более высокий стабилизирующий эффект по сравнению с метионином во всех экспериментальных группах. Например, в контрольной группе, не содержащей стабилизирующий агент, активность ботулотоксина не обнаруживалась при всех условиях после 56 суток инкубации, но в экспериментальной группе, содержащей метионин, остаточная активность 22,6% была получена при рН 6,0, а в экспериментальной группе, содержащей аргинин, остаточная активность 69,1% была измерена в тех же условиях.

Статистическую значимость относительного стабилизирующего эффекта аргинина и метионина исследовали с использованием однофакторного анализа ANOVA, и в результате было показано, что при рН 6,0 значения стабилизирующего эффекта были статистически значимыми во всех экспериментальных группах, кроме экспериментальной группы после инкубирования в течение 14 суток. Для таких результатов был проведен последующий анализ методом LSD (метод наименьшей значимой разности), и в результате было показано, что стабилизирующий эффект аргинина был значительно выше, чем у метионина на уровне р<0,05 до р<0,001. Например, сравнение значений, измеренных после 28 суток инкубации при рН 7,0, показало, что экспериментальная группа, содержащая метионин, показала остаточную активность 17,1%, а экспериментальная группа, содержащая аргинин, показала остаточную активность 55,8%, и, таким образом, была показана статистически значимая разница р<0,001 в стабилизирующем эффекте между двумя группами. Кроме того, сравнение значений, измеренных после 56 суток инкубации при рН 6,0, показало, что экспериментальная группа, содержащая метионин, показала остаточную активность 22,6%, а экспериментальная группа, содержащая аргинин, показала остаточную активность 69,1%, и, таким образом, была показана статистически значимая разница р<0,01 в стабилизирующем эффекте между двумя группами.

Авторы настоящего изобретения исследовали влияние поверхностно-активного свойства полисорбата на стабилизирующее действие в отношении ботулотоксина при добавлении метионина или аргинина. Для этого ботулотоксин и 50 мМ аргинина или метионина добавляли в стабилизирующую жидкую композицию с 0-0,05 мас. % полисорбата, и полученную композицию инкубировали при 37°С в течение 28-56 суток, после чего измеряли остаточную активность ботулотоксина. Исходя из результатов эксперимента, в случае стабилизирующей композиции, содержащей метионин, при рН в диапазоне от 5,5 до 6,0 стабилизирующий эффект показал тенденцию к увеличению пропорционально концентрации полисорбата, а при рН в диапазоне от 6,5-7,0, эффект от полисорбата не обнаруживался. В случае экспериментальной группы, содержащей аргинин, при рН в диапазоне от 5,5 до 6,5 добавление полисорбата показало тенденцию к увеличению вклада в стабилизирующий эффект, но эффект полисорбата был не столь значительным. Такие результаты позволяют предположить, что добавление полисорбата к жидкой композиции ботулотоксина, доступной аргинин в качестве стабилизирующего агента, не является существенным.

Пример 1-4: Обнаружение новых стабилизирующих агентов для жидкой композиции ботулотоксина

Результаты Примеров 1-2 и 1-3 показывают, что аргинин оказывает лучший эффект на стабилизацию жидкой композиции ботулотоксина по сравнению с метионином. Однако обнаружение новых добавок, проявляющих эффекты, подобные эффекту аргинина, позволяет разрабатывать различные продукты. Для этого авторы настоящего изобретения исследовали сравнительные ботулотоксин-стабилизирующие эффекты различных кандидатов на стабилизирующие агенты, показанные в Таблице 3 ниже. Результаты экспериментов показаны на Фиг. 3 и на Фиг. 4.

На Фиг. 3 изображены результаты измерения остаточной активности ботулотоксина через 28 суток после культивирования композиции ботулотоксина, содержащей антиоксиданты, показанные в Таблице 3 выше. Результаты измерения показали, что все антиоксидантные добавки, использованные в настоящем исследовании, показали стабилизирующий эффект ниже, чем у контрольного метионина. Однако в случае использования буферов, глюконолактон показал значительный стабилизирующий эффект при рН 6,5, а винная кислота показала стабилизирующий эффект при рН в диапазоне от 5,5 до 6,5 (см. Фиг. 4). Такие результаты предполагают возможность разработки новых добавок, имеющих значительные эффекты.

Пример 2. Разработка агента, стабилизирующего ботулотоксин, с использованием DESCR

Пример 2-1. Подготовка экспериментов

В Примере 1 образец жидкой композиции, содержащий ботулотоксин, имеющий относительно высокую активность (200 единиц/0,1 мл), приготавливали в полипропиленовой пробирке, а остаточную активность ботулотоксина измеряли с использованием методики BoTest. Однако эта концентрация ботулотоксина значительно отличается от концентрации ботулотоксина, которая коммерчески доступна для клинического применения. Следовательно, в настоящем изобретении, исследования составов для стабилизации ботулотоксина осуществляли с использованием составов, имеющих составы, подобные составам коммерчески доступных в настоящее время продуктов ботулина, то есть составов, в которых начальная активность ботулотоксина составляет от 40 до 80 единиц/мл. Поскольку для методики BoTest требуется эффективность не менее 50 единиц, с его помощью невозможно измерить остаточную активность ботулотоксина в жидкой композиции, приготовленной в описанных выше условиях. Поэтому авторы настоящего изобретения разработали методику DESCR (прямой ELISA в сочетании с реакцией расщепления SNAP25 in vitro), способную количественно измерять активность BoNT/A, присутствующую в следовых количествах. Способ DESCR будет подробно описан в Примере 2-2 ниже.

Вкратце, несмотря на то, что 200 единиц BoNT/A добавляли к 100 мкл каждого образца жидкой композиции, а остаточную активность во всех образцах состава измеряли с помощью метода BoTest, описанного в Примере 1, от 40 до 80 единиц/мл BoNT/A добавляли к от 0,1 до 1 мл каждого образца жидкой композиции и его остаточную активность во всех образцах композиции измеряли методом DESCR (недавно разработанным авторами настоящего изобретения) в Примере 2.

Для выявления добавок-кандидатов, обладающих стабилизирующим эффектом, образец из каждой экспериментальной группы, который содержал 10 мМ NaH₂PO₄ (рН 6,0), 10 мМ винной кислоты (рН 6,0) или 10 мМ глюконолактона (рН 6,0) в виде буфера, использовали в качестве отрицательного контроля, и все образцы состава обычно содержали 0,05% полисорбата, 45-130 мМ NaCl, ботулотоксин и добавку-кандидат в стабилизирующие агенты. Эти образцы препаратов инкубировали при 37°С в течение 2-8 недель, и для измерения остаточной активности ботулотоксина использовали 10 мкл (0,4 единицы) каждого образца препарата. Экспериментальные способы, подробное описание которых было опущено, были такими, как описано в Примере 1 выше.

Пример 2-2. Разработка способа измерения DESCR

DESCR (прямой ELISA в сочетании с реакцией расщепления SNAP25 in vitro) состоит из двух следующих стадий:

(1) проведение ферментативной реакции in vitro между BoNT/A и высокочистым рекомбинантным белком (GST-SNAP25) в качестве субстрата (реакция расщепления SNAP25 in vitro); и

(2) количественное измерение степени ферментативной реакции с помощью иммуноферментного анализа (ELISA).

Степень реакции определяется по цветной реакции. В частности, ее можно обнаружить с помощью цветной реакции с использованием первичного антитела, которое специфически реагирует с формой (SNAP25197), расщепленной BoNT/A, и вторичным антителом, конъюгированным с HRP (пероксидазой хрена). Каждый из этапов выполняется следующим образом.

(1) Реакция расщепления SNAP25 in vitro

Используемый в эксперименте ботулотоксин разбавляли до различных концентраций (0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,2 и 1,6 ед.) и подвергали ферментативной реакции в 20 мкл буферного раствора (20 мМ HEPES-NaOH (рН 7,1), 0,1% Твин 20, 10 мкМ ZnCl₂ и 1 мкг GST-SNAP25) при 37°С в течение 21 часа.

(2) ELISA

80 мкл RSB (буфер для остановки реакции; 125 мМ карбоната (рН 9,6, Sigma S6014) и 6,25 мМ ЭДТА) добавляли к реакционному раствору, чтобы остановить реакцию BoNT/A, и реакционный раствор переносили в иммунологический планшет Maxisorp (NUNC, кат. №170-6531) с последующим нанесением покрытия при 37°С в течение 2 часов. Каждую лунку трижды промывали буфером WB (промывочный буфер; 1xPBS, содержащий 0,05% Твин-20 и 0,2 М NaCl), а затем блокировали раствором BS (блокирующий раствор; 5% обезжиренного молока в 1xPBS) при 37°С в течение 15 минут. Затем каждую лунку промывали один раз с помощью буфера WB, и в каждую лунку помещали 100 мкл SNAP25197-специфического антитела (разведение 1:250, R&D), разведенного в растворе BS, и давали возможность прореагировать при 37°С в течение 1 часа. После трехкратного промывания буфером WB в каждую лунку помещали 100 мкл вторичного антитела, конъюгированного с HRP (разведение 1:1000, AbFrontier, LF-SA8001), разведенного в растворе BS, и давали возможность прореагировать при 37°С в течение 1 часа. После трехкратного промывания буфером WB в каждую лунку вносили 100 мкл субстрата ТМВ (Thermo-fisher, кат. №34028), чтобы вызвать цветную реакцию. Реакцию останавливали, добавляя такое же количество 2 М серной кислоты (Sigma, кат. №258105), и измеряли поглощение при 450 нм с использованием системы анализатора поглощения (Multi-Mode Reader Synergy Neo2, BioTek) и рассчитывали значение AU. Эти стадии схематично показаны на Фиг. 5.

Пример 2-3. Сравнение влияния аргинина и метионина на стабилизацию жидкой композиции ботулотоксина

Результаты Примера 1 показали, что стабилизирующее действие аргинина и метионина на ботулотоксин было зависимым от рН. В частности, в экспериментальной группе, содержащей метионин в качестве стабилизирующего агента, ботулотоксин показал остаточную активность вплоть до примерно 10% в диапазоне рН от 5,5 до 7,0, но в экспериментальной группе, содержащей аргинин, измеренная остаточная активность была вплоть до примерно 30%. Кроме того, было показано, что влияние аргинина на стабилизацию BoNT/A было выше при рН от 5,5 до 6,0, чем при рН от 6,5 до 7,0. В группе отрицательного контроля, содержащего добавку-кандидат в стабилизирующие агенты, BoNT/A имел тенденцию быть нестабильным при всех условиях рН, и, таким образом, остаточная активность BoNT/A не было обнаруживалась через 28 суток.

На основании этих результатов, рН жидких композиций BoNT/A был установлен равным 6,0, а концентрация аргинина в жидких композициях BoNT/A была различной. BoNT/A добавляли к составам до начальной активности 80 единиц/мл, а затем составы инкубировали при 37°С в течение 8 недель, и активность BoNT/A измеряли с помощью метода DESCR. Результаты измерений приведены на Фиг. 6.

В результате было показано, что остаточная активность BoNT/A в контрольной группе, не содержащей стабилизирующий агент, составляла 10% через 2 недели, а в экспериментальной группе, содержащей 50 мМ метионина, остаточная активность составляла 67%, 47% и 27% через 2 недели, 4 недели и 8 недель, соответственно. Это продемонстрировало, что метионин обладает значительным стабилизирующим эффектом. Между тем, аргинин показал стабилизирующую эффективность выше, чем метионин, в концентрации от 50 до 100 мМ, а остаточная активность BoNT/A в препарате, содержащем аргинин, была на уровне от 31 до 65% даже через 8 недель.

Разница в относительных стабилизирующих эффектах метионина и аргинина также наблюдалась в композициях, содержащих 0,3% лидокаина. Другими словами, через 8 недель экспериментальная группа, содержащая метионин, показала остаточную активность 27%, а экспериментальная группа, содержащая аргинин, показала остаточную активность от 44 до 62%.

Приведенные выше результаты показывают, что: (1) стабилизирующий эффект аргинина подтверждается вне зависимости от различных методов измерения, включая анализ BoTest и анализ DESCR; (2) аргинин проявляет стабилизирующий эффект даже в условиях композиций, содержащих ботулотоксин, имеющих активность, аналогичную активности продуктов, которые фактически готовятся/распространяются для клинического применения; и (3) стабилизирующее действие аргинина сохраняется даже в композициях, содержащих лидокаин.

Пример 2-4. Оценка влияния материала контейнера для жидкой композиции на эффективность стабилизации BoNT/A

В приведенном выше примере 2-3 представлены результаты, полученные при приготовлении составов, содержащих ботулотоксин, в полипропиленовых пробирках. Однако, поскольку жидкие композиции ботулотоксина, которые фактически распространяются для клинического применения, готовят в стеклянных контейнерах, стабилизирующее действие метионина и аргинина на остаточную активность ботулотоксина было вновь оценено с использованием стеклянных контейнеров. В частности, BoNT/A готовили в виде жидкой композиции, имеющей начальную эффективность 40 единиц/мл, и содержащей 20 мг метионина или 100 мМ аргинина, а остаточную активность BoNT/A в указанных композициях измеряли с помощью метода DESCR, после того как композиции инкубировали при 37°С в течение 8 недель. Результаты измерений приведены на Фиг. 7.

В результате, остаточная активность BoNT/A в композиции, содержащей метионин, составляло 41%, 15% и 8% через 2 недели, 4 недели и 8 недель, соответственно. В то время как, остаточная активность BoNT/A в композиции, содержащей аргинин, как было измерено, составляла 84%, 64% и 43% после тех же периодов, и показала большое отличие от остаточной активности BoNT/A в препарате, содержащем метионин.

Даже когда жидкая композиция содержала лидокаин, как метионин, так и аргинин демонстрировали стабилизирующий эффект. Конкретно, измеренная остаточная активность BoNT/A в композиции, содержащей метионин, составляла 47%, 21% и 16% через 2 недели, 4 недели и 8 недель, соответственно, а остаточная активность BoNT/A в композиции, содержащей аргинин, составляла 79%, 71% и 55%, что указывает на то, что стабилизирующий эффект аргинина значительно отличается от эффекта метионина.

Приведенные выше результаты показывают, что: (1) активность BoNT/A в образце композиции, приготовленной в полипропиленовой пробирке, остается более стабильной, чем активность BoNT/A в образце композиции, приготовленной в стеклянном контейнере, даже если составы имеют один и тот же состав; и (2) стабилизирующее действие аргинина в отношении жидкой композиции BoNT/A, приготовленной в стеклянной таре, лучше, чем у метионина.

Пример 2-5. Оценка влияния буфера и глютаминовой кислоты на стабилизирующее действие аргинина

Приведенный выше Пример 1-4 показал, что винная кислота и глюконолактон в качестве буферов оказывали стабилизирующее действие, и все они демонстрировали оптимальный эффект при рН около 6,0. Соответственно, стабилизирующее действие аргинина на композиции BoNT/A, содержащие винную кислоту или глюконолактон в качестве буфера, было исследовано с использованием стеклянного контейнера. Буфером, используемым в качестве отрицательного контроля, был фосфат натрия (NaH₂PO₄, рН 6,0), который используется наиболее широко. Результаты сравнения приведены на Фиг. 8.

В результате было показано, что стабилизирующий эффект аргинина продемонстрировал сходные закономерности во всех жидких композициях, а остаточная активность BoNT/A в композициях, содержащих аргинин, составляла от 57 до 70% даже через 8 недель. Стабилизирующий эффект аргинина в композиции, содержащей глюконолактон, среди всех буферов, использованных в эксперименте, было значительно более высоким, а остаточная активность BoNT/A в этом препарате была примерно на 10% выше, чем в других образцах композиций. Эта тенденция также проявляется в композициях, содержащих лидокаин.

Кроме того, был оценен эффект аргинина как стабилизирующего агента в композициях, содержащих глютаминовую кислоту, в дополнение к буферу на основе винной кислоты или глюконолактона. Результаты оценки приведены на Фиг. 9. В приведенном выше Примере 2-3 было показано, что, когда 50 мМ глютаминовой кислоты добавляли к жидкой композиции BoNT/A, содержащей натрий-фосфатный буфер и 50 мМ аргинина, остаточная активность BoNT/A в композиции составляла 65% после 8 недель. Когда глютаминовую кислоту не добавляли в указанную композицию, остаточная активность BoNT/A в композиции составляла 32%. Аналогичный результат был получен и для композиции, содержащей лидокаин, и, в частности, измеренная остаточная активность BoNT/A в этой композиции составляла 71% через 8 недель. В этом случае, когда композиция не содержала глютаминовую кислоту, измеренная остаточная активность составляла 45% (см. Фиг. 6).

На основании указанных результатов эксперимента, с целью выбора оптимального буфера для стабилизации жидкой композиции BoNT/A, содержащей как аргинин, так и глютаминовую кислоту, активность BoNT/A в композициях, содержащих фосфат натрия, винную кислоту или глюконолактон, сравнивали с использованием стеклянных контейнеров. В результате было показано, что остаточная активность DESCR, измеренной методом DESCR через 2 недели, 4 недели и 8 недель, была значительно выше в композиции, содержащей глюконолактон в качестве буфера. В частности, когда композиция не содержала лидокаин, остаточная активность через 2 недели, 4 недели и 8 недель достигла 96%, 87% и 71% соответственно, а когда состав содержал лидокаин, измеренная остаточная активность была на уровне 96%, 86% и 68%.

Наконец, для оценки оптимальной концентрации глютаминовой кислоты, которая способствует стабилизирующему действию аргинина, в композицию, содержащую глюконолактон в качестве буфера, добавляли 50 мМ аргинина и 10-50 мМ глютаминовой кислоты, а эффективность BoNT/A в указанных композициях измеряли в полипропиленовых пробирках. Результаты измерений приведены на Фиг. 10. В результате, значительный уровень активности BoNT/A был также обнаружен в препаратах, содержащих только глютаминовую кислоту без аргинина, и указанная активность была более выраженной в композициях, содержащих лидокаин. В частности, остаточная активность, измеренная через 8 недель инкубации при 37°С, была 15% в отрицательном контроле и 41% в композиции, содержащей только глютаминовую кислоту. Однако когда использовалась одна глютаминовая кислота, ее влияние на стабилизацию BoNT/A было ниже, чем у аргинина. Конкретно, композиция, содержащая только аргинин, показала остаточную активность 61% через 8 недель инкубации при 37°С. Была измерена активность BoNT/A в композиции, содержащей 10-50 мМ глютаминовой кислотой вместе с 50 мМ аргинина, и в результате было показано, что остаточные активности, измеренные через 2-8 недель, были очень похожи на те, что в композициях, содержащих только аргинин, практически во всех экспериментальных группах. Эта тенденция также проявлялась в композициях, содержащих лидокаин. В частности, остаточная активность, измеренная после 8 недель инкубации, составляла 61% в композиции, содержащей только аргинина, и около 57-65% в композиции, содержащей как аргинин, так и глютаминовую кислоту, без существенной связи с концентрацией.

Приведенные выше результаты свидетельствуют о следующем важном факте. Глютаминовая кислота обладает эффектом стабилизации BoNT/A в жидких композициях, но влияние одной глютаминовой кислоты незначительно по сравнению с влиянием одного аргинина. Композиция, содержащая как глютаминовую кислоту, так и аргинин, не проявляет синергетического эффекта даже после относительно длительного периода хранения 8 недель, а остаточная активность BoNT/A в этой композиции поддерживается на постоянном уровне (от 60 до 80%).

Пример 2-6. Оценка влияния аспарагиновой кислоты на стабилизирующее действие аргинина как стабилизирующего агента

Было исследовано влияние аспарагиновой кислоты, которая является кислой аминокислотой, такой как глютаминовая кислота, на эффект аргинина в стабилизации BoNT/A, и полученные результаты показаны на Фиг. 11. BoNT/A в препаратах, содержащих только аспарагиновую кислоту, показывает относительно высокую остаточную активность после 2-8 недель инкубации, и этот стабилизирующий эффект аспарагиновой кислоты замечательно проявляется в композициях, содержащих лидокаин. В группе отрицательного контроля измеренная остаточная эффективность составила 73%, 30% и 15% через 2 недели, 4 недели и 8 недель, соответственно, но в экспериментальной группе, содержащей аспарагиновую кислоту, остаточная активность составила 88%, 73% и 52%. Измеряли остаточную активность BoNT/A через 8 недель в композиции, содержащей 10-50 мМ аспарагиновой кислоты вместе с 50 мМ аргинина, и в результате было показано, что остаточная активность в композиции, содержащей только аргинин, составляла 61%, а в композиции, содержащей аспарагиновую кислоту в дополнение к аргинину, остаточная активность составляла 58-73%, не показывая значительной связи с концентрацией. В отличие от остаточных активностей, измеренных через 8 недель, остаточные активности BoNT/A, измеренные через 2-4 недели, показали статистически значимое различие. В частности, в композиции, содержащей только аргинин, измеренная остаточная активность составила 82% и 76% через 2 недели и 4 недели, соответственно, но когда в состав добавили аспарагиновую кислоту, измеренное значение остаточной активности составило от 92 до 100% и от 85 до 94%. Кроме того, в композициях, содержащих глютаминовую кислоту, аналогичный стабилизирующий эффект проявлялся в течение того же периода, но степень влияния была относительно низкой, а измеренная остаточная активность составляла от 83 до 98% и от 76 до 88%. Результаты измерений для композиций, содержащих аспарагиновую кислоту, показаны в Таблице 4 ниже, а результаты измерений для композиций, содержащих глютаминовую кислоту, показаны в Таблице 5 ниже.

Пример 2-7. Подтверждение стабильности продукта BoNT/A, приготовленного на основании новой жидкой композиции

Новая жидкая композиция для BoNT/A, созданная на основе результатов систематического и сравнительного анализа различных жидких инъекционных добавок, безопасность которых была подтверждена авторами настоящего изобретения, содержит 10 мМ глюконолактона (рН 6,0), от 45 до 130 мМ хлорида натрия, 50 мМ аргинина, 50 мМ аспарагиновой кислоты и 0,05% полисорбата. Чтобы проверить безопасность жидкой композиции с помощью анализа ЛД₅₀ на мышах, композицию BoNT/A, имеющую вышеописанный состав, готовили с использованием стеклянного контейнера, чтобы иметь начальную активность 40 единиц/мл. В качестве контроля использовали жидкую композицию продукта, в которой вместо аргинина использовали метионин, и стабильность продуктов была изучена в сравнении. Результаты эксперимента приведены на Фиг. 12. В результате было показано, что стабильность продукта BoNT/A, полученного из новой жидкой композиции, очень похожа на результат, полученный в исследовании in vitro. В частности, остаточные активности, измеренные для этого продукта BoNT/A через 2 недели, 4 недели и 8 недель, составили 96%, 84% и 66%, соответственно, а остаточные активности для контроля через 2 недели, 4 недели и 8 недель составили 41%, 15% и 8%, соответственно.

Промышленная применимость

Ботулотоксин ингибирует экзоцитоз ацетилхолина в холинергическом пресинапсе нервно-мышечного соединения у животных, имеющих неврологическую функцию, вызывая тем самым астению. Таким образом, недавно были предприняты попытки использовать нейротоксичность ботулотоксина в косметических или терапевтических целях. Однако, использование ботулотоксина, белкового агента, сопряжено с такой проблемой, что нелегко приготавливать фармацевтические композиции с ним, а также нелегко их хранить, распространять и обращаться с ними. Это обусловлено нестабильностью белка, и указанная проблема является серьезной в случае белковых агентов, таких как ботулотоксин, которые используются в фармацевтических композициях в очень низкой концентрации.

Жидкая композиция, содержащая ботулотоксин и стабилизирующий агент, согласно настоящему изобретению может легко храниться и распространяться. И был доказан существенный эффект на стабилизацию ботулотоксина в подходящих условиях соответствующих температур и рН тела человека. Таким образом, ожидается, что указанная фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению будет в значительной степени способствовать безопасному и удобному медицинскому применению ботулотоксина.

1. Жидкая композиция для стабилизации ботулотоксина, содержащая ботулотоксин, первый стабилизирующий агент и второй стабилизирующий агент, где первым стабилизирующим агентом является аргинин с концентрацией равной 50 мМ, вторым стабилизирующим агентом является глютаминовая кислота или аспарагиновая кислота, при этом концентрация второго стабизирующего агента составляет от 10 до 50 мМ.

2. Жидкая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанным ботулотоксином является ботулотоксин типа A.

3. Жидкая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанным ботулотоксином является форма, не содержащая комплексообразующий белок, либо форма в виде комплекса, содержащая комплексообразующий белок.

4. Жидкая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит глюколактон или винную кислоту.

5. Жидкая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит местный анестетик.

6. Жидкая композиция по п. 5, отличающаяся тем, что указанным местным анестетиком является лидокаин.

7. Жидкая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит полисорбат.

8. Способ получения жидкой композиции для стабилизации ботулотоксина по п. 1, содержащий стадии:

(a) очистки ботулотоксина; и

(b) добавления первого стабилизирующего агента и второго стабилизирующего агента к указанному ботулотоксину, где первым стабилизирующим агентом является аргинин с концентрацией, равной 50 мМ, вторым стабилизирующим агентом является глютаминовая кислота или аспарагиновая кислота, при этом концентрация второго стабилизирующего агента составляет от 10 до 50 мМ.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что к названной композиции дополнительно добавляют глюколактон или винную кислоту.

10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что к названной композиции дополнительно добавляют местный анестетик.

11. Способ по п.8, отличающийся тем, что к названной композиции дополнительно добавляют полисорбат.