Набор для определения ccr5delta32 мутации в геноме человека

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к средствам для определения CCR5delta32 мутации в геноме человека, и может быть использовано для определения и подсчета количества мутантных CCR5delta32 аллелей в исследуемом генетическим материале при генетическом скрининге и определении эффективности редактирования генома при использовании инновационных методов лечения ВИЧ-инфекций. Предложен набор для определения CCR5delta32 мутации в геноме человека при проведении цифровой капельной мультиплексной ПЦР в режиме реального времени, включающий прямой и обратный праймеры, флуоресцентный зонд CCR5-78-MT-FAM с ковалентно пришитой к 5'-концу последовательности молекулой флуоресцентного красителя 5(6)-карбоксифлуоресцеина (FAM) и ковалентно пришитой к 3'-концу последовательности молекулой гасителя флуоресценции BHQ1 и флуоресцентный зонд CCR5-78-WT-R6G с ковалентно пришитой к 5'-концу последовательности молекулой флуоресцентного красителя Rhodamine 6G (R6G) и ковалентно пришитой к 3'-концу последовательности молекулой гасителя флуоресценции BHQ2. Изобретение обеспечивает высокоточный подсчет копийности CCR5-Δ32 мутантных аллелей с разрешением до 0.1% за счет высокой специфичности реагентов предлагаемого набора. 1 табл., 4 ил.

 

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии, молекулярной биологии, может быть использовано для определения и подсчета количества мутантных CCR5delta32 аллелей в исследуемом генетическим материале при генетическом скрининге и определении эффективности редактирования генома при использовании инновационных методов лечения ВИЧ-инфекций.

На сегодняшний день одной из самых крупных нерешенных биомедицинских проблем является вирус иммунодефицита человека, вызывающий синдром приобретенного иммунного дефицита (СПИД). По данным объединенной программы Организации Объединенных Наций по ВИЧ/СПИД (UNAIDS) общее количество людей, инфицированных ВИЧ, в мире постоянно растет и на данный момент составляет более 36 миллионов человек, из которых более миллиона человек проживает в России.

Вирус иммунодефицита человека поражает CD4+ клетки иммунной системы: Т-хелперы, моноциты, макрофаги, дендритные клетки, а также клетки Лангерганса, клетки микроглии и другие. Антиретровирусные препараты, употребляемые пациентами в течение всей дальнейшей жизни, подавляют размножение ВИЧ, препятствуя внедрению вирионов в клетки и затрудняя сборку новых вирусных частиц, однако имеют высокий риск развития побочных эффектов и высокую стоимость (Samji Н., Cescon А., Hogg R.S., Modur S.P., Althoff K.N., Buchacz K., Burchell A.N., Cohen M., Gebo K.A., Gill M.J., Justice A., Kirk G., Klein M.B., Korthuis P.T., Martin J., Napravnik S., Rourke S.B., Sterling T.R., Silverberg M.J., Deeks S., Jacobson L.P., Bosch R.J., Kitahata M.M., Goedert J.J., Moore R., Gange S.J., American N., 2013. Closing the Gap: Increases in Life Expectancy among Treated HIV-Positive Individuals in the United States and Canada // PLoS One. V. 8. P. 6-13).

В 1998 году исследователи обнаружили, что в ряде случаев воздействие ВИЧ не приводит к заражению клеток. Выяснилось, что некоторые люди имеют естественную сопротивляемость к ВИЧ-инфекции, связанную с мутацией главного ко-рецептора вируса - CCR5 (Zagury D., Lachgar А., Chams V., Fall L.S., Bernard J., Zagury J.-F., Bizzini В., Gringeri A., Santagostino E., Rappaport J., Feldman M., O'Brien S.J., Burny A., Gallo R.C., 1998. C-C chemokines, pivotal in protection against HIV type 1 infection // PNAS. V. 95. P. 3857-3861).

На данный момент описана популяция людей с мутацией CCR5-Δ32, заключающейся в делеции 32-х нуклеотидов в последовательности гена, кодирующего CCR5 и приводящая к сдвигу рамки считывания. Данная мутация в гетерозиготном состоянии значительно снижает риск инфицирования ВИЧ, в гомозиготном - заражение становится практически невозможным (G., Nowak D., Mossner M., Ganepola S., A., Alters K., Ph D., Schneider Т., Hofmann J., Kucherer C, Blau O., Blau I.W., Hofmann W.K., Thiel E., Ph D., Hofmann J., Ph D., Kucherer C, Blau O., Blau I.W., Hofmann W.K., Thiel E., 2009. Long-Term Control of HIV by // N. Engl. J. Med. V. 360. P. 692-697).

Частота встречаемости аллеля с мутацией CCR5-Δ32 может достигать до 14% в Европе, тогда как данная мутация не выявлена у коренных африканцев, американцев и восточноазиатских этнических групп.

Обнаружение естественной невосприимчивости к ВИЧ подвигло ученых на создание нового революционного метода лечения заболевания - трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, имеющих мутацию в CCR5. Существуют, по крайней мере, три прецедента трансплантации костного мозга от донора с CCR5-Δ32 к иммуносовместимому больному с ВИЧ-инфекцией, закончившиеся полным выздоровлением пациентов (Allers K., Hu G., Loddenkemper С., Rieger K., Thiel Е., Schneider Т., 2011. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5 DELTA 32 / DELTA 32 stem cell transplantation // Blood. V. 117. P. 2791-2799; Gupta R.K., Abdul-jawad S., Mccoy L.E., Mok H.P., Peppa D., Salgado M., Martinez-picado J., Nijhuis M., Wensing A.M.J., Lee H., Grant P., Nastouli E., Lambert J., Pace M., Salasc F., Monit C., Innes A.J., Muir L., Waters L., 2019. HIV-1 remission following CCR5Δ32/Δ32 haematopoietic stem-cell transplantation // Nature. V. 568. P. 244-248).

Однако по очевидным причинам найти таких совместимых доноров для подавляющего большинства инфицированных весьма сложно, поэтому существует запрос на создание сверхточных высокопроизводительных систем генетического скрининга на предмет поиска CCR5-Δ32 мутантных аллелей.

Также, другим революционным подходом можно считать попытки оптимизации системы редактирования генома CRISPR/Cas9 для получения клеток человека с искусственным нокаутом CCR5 и созданием искусственной CCR5-Δ32 мутации.

В ряде работ удалось получить индуцированные стволовые клетки с делециями в последовательности гена CCR5, продемонстрировавшие устойчивость к заражению ВИЧ (Kang X., Не W., Huang Y., Yu Q., Chen Y., 2016. Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR / Cas-mediated genome editing // J. Assist. Reprod. Genet; Ye L., Wang J., Beyer A.I., Teque F., Cradick T.J., Qi Z., Chang J.C., Bao G., Muench M.O., Yu J., Levy J.A., Kan Y.W., 2014. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Δ32 mutation confers resistance to HIV infection. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.V. 111. P. 9591-9596).

Данный подход можно применять как для нокаута CCR5 в постнатальных гемопоэтических стволовых клетках, предназначенных для трансплантации пациентам с ВИЧ (Xu L, Yang Н, Gao Y, Chen Z, Xie L, Liu Y, Liu Y, Wang X, Li H, Lai W, He Y, Yao A, Ma L, Shao Y, Zhang B, Wang C, Chen H, Deng H. CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo. Mol Ther. 2017 Aug 2; 25(8):1782-1789. doi: 10.1016/j.ymthe. 2017.04.027. Epub 2017 May 17. PMID: 28527722; PMCID: PMC5542791), так и для целенаправленного создания CCR5-Δ32 мутации в геноме эмбриона человека (Т.А. Кодылева, А.О. Кириллова, Е.А. Тыщик, В.В. Макаров, А.В. Хромов, В.А. Гущин, А.Н. Абубакиров Д.В. Ребриков, Г.Т. Сухих. Эффективность создания делеции CCR5Ddelta32 методом CRISPR-Cas9 в эмбрионах человека. Вестник РГМУ; 2018(4):80-84; DOI: 10.24075/vrgmu.2018.052; Kang X., Не W., Huang Y., Yu Q., Chen Y., 2016. Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR / Cas-mediated genome editing // J. Assist. Reprod. Genet).

Поскольку эффективность редактирования генома человека при помощи CRISPR/Cas9 систем по-прежнему является одним из самых спорных аргументов противников трансляции данного метода в медицину и в клинику, по-прежнему актуальными являются разработки методов поиска CCR-Δ32 мутации и высокоточного измерения доли мутантных аллелей.

На момент подачи заявки из открытых источников было известно о следующих наиболее близких аналогах:

В патенте RU 2563172, С1 описан способ специфической детекции аллельного полиморфизма CCR5 delta 32 в образце пуповинной крови, что может быть использовано для проведения скринингового обследования образцов пуповинной крови, поступающих в банк пуповинной крови. Однако известная тест-система базируется на примитивном анализе результатов ПЦР при помощи гель-электрофореза, который не предоставляет количественной оценки содержания мутантных аллелей в анализируемой смеси.

В заявке RU 2003111838, А описывается способ одновременной специфической детекции аллельных полиморфизмов CCR5delta32 и CCR5M303, что также может быть использовано для проведения скрининговых обследований. Данная тест-система также базируется на примитивном анализе результатов ПЦР и рестрикционного анализа ампликонов при помощи гель-электрофореза, что также не предоставляет количественной оценки содержания мутантных аллелей в анализируемой смеси.

Известен способ одновременной детекции CCR5delta32 мутации и HLA-B*5701 аллельного полиморфизма при помощи мультиплексного ПЦР с анализом по конечной точке, то есть при помощи гель-электрофореза (Rosi A, Meini G, Materazzi A, Vicenti I, Saladini F, Zazzi M. Low-cost simultaneous detection of CCR5-delta32 and HLA-B*5701 alleles in human immunodeficiency virus type 1 infected patients by selective multiplex endpoint PCR. J Virol Methods. 2015 Nov; 224:102-4. doi: 10.1016/j.jviromet.2015.08.020. Epub 2015 Sep 2. PMID: 26341061). Данный аналог также не позволяет осуществить количественную оценку содержания мутантных аллелей в анализируемой смеси.

В качестве прототипа нами выбран способ полуколичественной детекции CCR5delta32 мутации при помощи двух праймеров и двух флуоресцентных зондов, один из которых написан на последовательность «дикого типа», а другой написан на последовательность с CCR5delta32 мутацией ( L, Hodek J, Machala L, M, Weber J. Prevalence and the role of CCR5Δ32 heterozygosity in disease progression in HIV positive patients in the Czech Republic. Epidemiol Mikrobiol Imunol. 2019 Winter; 68(3):138-143. English. PMID: 31914779).

В способе-прототипе ПЦР проходит в амплификаторе с функцией измерения флуоресценции в режиме реального времени (Real-Time PCR), при этом в случае нахождения аллели дикого типа детектируется амплификационная кривая с флуоресценцией FAM, в случае нахождения гомозиготной аллели с CCR5delta32 мутацией детектируется амплификационная кривая с флуоресценцией ROX. В случае нахождения обоих аллелей, будут детектированы обе кривые в обоих каналах.

Данный способ предполагает только условно количественное определение копийности аллели с CCR5delta32 мутацией, поскольку точность данного метода ограничена возможностью разделения двух групп амплификационных кривых и составляет не более 33%.

Проблемой, на решение которой направлено данное изобретение, является создание набора, позволяющего проводить точное определение с измерением доли мутантных аллелей CCR5-Δ32 мутации в представленном генетическом материале по отношению к аллелям «дикого типа».

Технический результат, достигаемый при использовании предлагаемого набора, заключается в обеспечении высокоточного подсчета копийности CCR5-Δ32 мутантных аллелей в представленном генетическом материале с разрешением до 0.1% (детекция 1 копии мутантного аллеля на 1000 копий аллелей «дикого типа», способность достоверно отличать результат измерения одной копии мутантного аллеля на 1000 копий аллеля «дикого типа» от двух копий мутантного аллеля на 1000 копий аллеля «дикого типа») за счет высокой специфичности реагентов предлагаемого набора.

Предложены оригинальные олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды, позволяющие отличить разные аллели гена CCR5: мутантные CCR5-Δ32 аллели от здоровых аллелей «дикого типа» при проведении цифровой капельной мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Сущность изобретения заключается в следующем.

Предложен набор для определения CCR5delta32 мутации в геноме человека при проведении цифровой капельной мультиплексной ПЦР, включающий прямой праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1; обратный праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO: 2; флуоресцентный зонд CCR5-78-MT-FAM, имеющий последовательность SEQ ID NO: 3, с ковалентно пришитой к 5 '- концу последовательности молекулой флуоресцетного красителя 5(6)-карбоксифлуоресцеина (FAM) и ковалентно пришитой к 3' - концу последовательности молекулой гасителя флуоресценции BHQ1; и флуоресцентный зонд CCR5-78-WT-R6G, имеющий последовательность SEQ ID NO: 4, с ковалентно пришитой к 5'- концу последовательности молекулой флуоресцетного красителя Rhodamine 6G (R6G) и ковалентно пришитой к 3' - концу последовательности молекулой гасителя флуоресценции BHQ2.

Таким образом, возможность точного подсчета копийности CCR5-Δ32 мутации достигается за счет использования двух праймеров, фланкирующих локус, содержащий CCR5-Δ32 делецию:

FW-Primer: 5'-CCCAGGAATCATCTTTACCA-3'

RV-Primer: 5'-GACACCGAAGCAGAGTTT-3'

и двух флуоресцентных зондов, комплементарных последовательности ампликона, один из которых детектирует участок гена, в котором возникает CCR5-Δ32 мутация, а второй детектирует консервативную часть ампликона и служит для нормировки:

CCR5-78-MT-FAM: [FAM]-5'-CAGTCAGTATCAATTCTGGAAGA-3'-[BHQ1]

CCR5-78-WT-R6G: [R6G]-5'-TCATCTGCTACTCGGGAAT-3'-[BHQ2].

При этом прямой праймер FW-Primer для амплификации фрагмента гена CCR5, который может содержать CCR5delta32 мутацию, имеет последовательность SEQ ID NO: 1.

Обратный праймер RV-Primer для амплификации фрагмента гена CCR5, который может содержать CCR5delta32 мутацию, имеет последовательность SEQ ID NO: 2.

Флуоресцентный зонд CCR5-78-MT-FAM с флуоресцентным красителем FAM и гасителем BHQ1 для детекции участка гена CCR5, который может содержать CCR5delta32 мутацию, имеет последовательность SEQ ID NO: 3.

Флуоресцентный зонд CCR5-78-WT-R6G с флуоресцентным красителем R6G и гасителем BHQ2 детектирует консервативный участок гена CCR5 для нормировки и имеет последовательность SEQ ID NO: 4.

Для дизайна праймеров и зондов был проведен биоинформатический анализ, где в качестве исходной информации использовали последовательность гена CCR5 из базы данных National Center for Biotechnology Information U.S. National Library of Medicine (Gene ID: 1234, updated on 3-Dec-2017). Нуклеотидная последовательность делеции Δ32 была взята из этой же базы данных.

Далее, для реализации изобретения необходимо осуществить серию ПЦР-реакций с помощью системы (установки) для цифрового капельного ПЦР, например, Bio-Rad QX200 Droplet Digital PCR System, с использованием реагентов, предназначенных для конкретной системы (мастермикс, содержащий необходимые компоненты ПЦР реакций, такие как Taq-полимераза, dNTP, растворы солей и т.д.). Приготовление смеси для цифровой ПЦР идет по следующему протоколу:

Состав смеси на одну лунку:

1. 2х ddPCR supermix for probes (Bio-Rad)	11 мкл
2. Праймер прямой FW-Primer 10 мкМ	2 мкл
3. Праймер обратный RV-Primer 10 мкМ	2 мкл
4. Флуоресцентный зонд CCR5-78-MT-FAM 10 мкМ	0,6 мкл
5. Флуоресцентный зонд CCR5-78-WT-R6G 10 мкМ	0,6 мкл
6. Вода	0,8 мкл
7. Раствор ДНК (анализируемый генетический материал)	5 мкл

Общий объем должен быть 22 мкл, конечная концентрация праймеров 900 нМ, конечная концентрация зондов 250 нМ, раствор ДНК рекомендуется готовить так, чтобы в 5 мкл содержалось от 50 нг до 350 нг ДНК. Далее, с использованием прибора для генерации капель необходимо приготовить эмульсию капель. После завершения генерации капель планшет с каплями запаивается фольгой в течение 5 секунд при 180 градусах. Запаянное плато помещается в любой амплификатор, поддерживающий формат 96-луночных планшетов «с юбкой» (например, С1000 Thermal Cycler, Bio-Rad). Протокол термоциклирования представлен в таблице.

После амплификации плато переносится в прибор, детектирующий флуоресценцию в каплях, по каналах FAM и R6G(HEX). Анализ результатов проводится с помощью программы, поставляемой с прибором - QuantaSoR SoAware Bio-Rad. В качестве типового результата программа выдает два графика флуоресценции (FAM и R6G) в формате 1D и совмещенный мультиплексный плот в формате 2D.

На фиг. 1 представлен пример анализа результата цифрового капельного ПЦР в виде графиков в формате 1D; верхний график - измерение флуоресценции в канале FAM; нижний график - измерение флуоресценции в канале R6G; каждая точка на графиках - проанализированная капля; по шкале ординат - интенсивность флуоресценции, по шкале абсцисс - порядковый номер проанализированной капли; нижний кластер капель (бесцветный) - капли без матрицы; верхние кластеры - положительные капли, где прошла ПЦР; в данном случае мы видим анализ матрицы «дикого типа», поскольку все капли флуоресцируют в обоих каналах.

На фиг. 2 представлен пример анализа результата цифрового капельного ПЦР в виде 2D плота: по шкале ординат - интенсивность флуоресценции в канале FAM, по шкале абсцисс - интенсивность флуоресценции в канале R6G; негативный кластер капель (бесцветный) - слева внизу; позитивный кластер капель (оранжевый), где прошла ПЦР - справа вверху; в данном случае мы видим анализ матрицы «дикого типа», поскольку все капли флуоресцируют в обоих каналах.

На фиг. 3 представлен пример анализа результата цифрового капельного ПЦР в виде графиков в формате 1D: верхний график - измерение флуоресценции в канале FAM; нижний график - измерение флуоресценции в канале R6G; каждая точка на графиках - проанализированная капля; по шкале ординат - интенсивность флуоресценции, по шкале абсцисс -порядковый номер проанализированной капли; нижний кластер капель (бесцветный) - капли без матрицы; верхние кластеры - положительные капли, где прошла ПЦР; в данном случае мы видим анализ матрицы, содержащей гомозиготную мутацию CCR5-Δ32, поскольку все капли флуоресцируют в канале R6G, но не в канале FAM.

На фиг. 4 представлен пример анализа результата цифрового капельного ПЦР в виде 2D плота; по шкале ординат - интенсивность флуоресценции в канале FAM; по шкале абсцисс - интенсивность флуоресценции в канале R6G; негативный кластер капель (бесцветный) -слева внизу; позитивный кластер капель (зеленый), где прошла ПЦР - справа внизу; в данном случае мы видим анализ матрицы, содержащей гомозиготную мутацию CCR5-Δ32, поскольку все капли флуоресцируют в канале R6G, но не в канале FAM.

Таким образом, при анализе графиков в формате 1D (фиг. 1) видно два кластера капель, нижний - негативный, куда не попала матрица (ДНК) для амплификации, и верхний - позитивный, куда матрица (ДНК) попала, где успешно прошла ПЦР и появился сигнал флуоресценции. Программа автоматически разделяет оба кластера и подсчитывает значения.

При анализе графиков в формате 2D (фиг. 2) оба кластера клеток отчетливо различимы, и также автоматически разделяются. В случае если ДНК не содержит мутации в анализируемом локусе CCR5 мы видим одинаковое свечение всех капель в каналах FAM и R6G (примеры для ДНК «дикого типа» приведены на фиг. 1 и фиг. 2).

В случае если ДНК содержит CCR5-Δ32 мутацию, мы видим свечение капель в R6G, но не видим свечение в канале FAM (примеры для ДНК с гомозиготной мутацией CCR5-Δ32 приведены на фиг. 3 и фиг. 4).

Поскольку формат цифровой капельной ПЦР проводит количественный анализ содержания матрицы в изначальной смеси в штуках, это позволяет осуществлять высокоточное измерение соотношения мутантных аллелей по сравнению с диким типом (до 0,1%).

Основу способа с предлагаемым набором для измерения копийности CCR5-Δ32 мутантных аллелей составляют синтезированные короткие ДНК олигонуклеотиды и приборная база для проведения цифрового капельного ПЦР. Технология синтеза ДНК-олигонуклеотидов достаточно хорошо освоена биохимической промышленностью. Приборы для проведения цифрового капельного ПЦР широко доступны, могут быть приобретены или могут быть использованы в Центрах коллективного пользования.

Описание настоящего изобретения является иллюстративным и не ограничивает сферы действия формулы изобретения. Для квалифицированных специалистов является очевидным, что возможны варианты и модификации изобретения, связанные с конкретной его реализацией, не выходящие за рамки формулы изобретения.

Фигуры в заявке представлены в виде, достаточном для понимания принципов изобретения специалистами в данной области, и ни в какой мере не ограничивают объема настоящего изобретения.

Перечень последовательностей

<110>Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Federalnoe gosudarstvennoe autonomnoe obrazovatelnoe uchrezhdenie vysshego obrazovaniya «Rossijskij natsionalnyj issledovatelskij meditsinskij universitet imeni N.I. Pirogova» Ministerstva zdravookhraneniya Rossijskoj Federatsii)

<120> Набор для определения CCR5delta32 мутации в геноме человека

<160>4

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Прямой праймер FW-Primer для амплификации фрагмента гена CCR5, который может содержать CCR5delta32 мутацию

<400>1

cccaggaatc atctttacca 20

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Обратный праймер RV-Primer для амплификации фрагмента гена CCR5, который может содержать CCR5delta32 мутацию

<400>2

gacaccgaag cagagttt 18

<210> SEQ ID NO: 3

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Флуоресцентный зонд CCR5-78-MT-FAM с флуоресцентным красителем FAM и гасителем BHQ1 для детекции участка гена CCR5, который может содержать CCR5delta32 мутацию

<400>3

cagtcagtat caattctgga aga 23

<210> SEQ ID NO: 4

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Флуоресцентный зонд CCR5-78-WT-R6G с флуоресцентным красителем R6G и гасителем BHQ2 детектирует консервативный участок гена CCR5, для нормировки

<400>4

tcatctgcta ctcgggaat 20

Набор для определения CCR5delta32 мутации в геноме человека при проведении цифровой капельной мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени, включающий прямой праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1, обратный праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO: 2, флуоресцентный зонд CCR5-78-MT-FAM, имеющий последовательность SEQ ID NO: 3, с ковалентно пришитой к 5'-концу последовательности молекулой флуоресцентного красителя 5(6)-карбоксифлуоресцеина (FAM) и ковалентно пришитой к 3'-концу последовательности молекулой гасителя флуоресценции BHQ1, флуоресцентный зонд CCR5-78-WT-R6G, имеющий последовательность SEQ ID NO: 4, с ковалентно пришитой к 5'-концу последовательности молекулой флуоресцентного красителя Rhodamine 6G (R6G) и ковалентно пришитой к 3'-концу последовательности молекулой гасителя флуоресценции BHQ2.