Способ получения молочного продукта, ферментированного с помощью молочнокислых бактерий и бактерий bacillus, бактериальная композиция и ее применение в данном способе

Группа изобретений относится к молочной промышленности. Ферментируют молоко млекопитающего в течение 3-48 ч с помощью 10⁴-10¹² КОЕ/мл инокулированных молочнокислых бактерий (LAB) и 10⁴-10¹² КОЕ/мл инокулированных бактерий Bacillus в подходящих условиях при температуре от 22 до 45°С до тех пор, пока ферментированное молоко не достигнет желательного значения рН от 3,5 до 5,5. LAB и бактерии Bacillus вносят одновременно. Бактерии Bacillus представляют собой по меньшей мере одну Bacillus, выбранную из группы, состоящей из: Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus aryabhattai, Bacillus atrophaeus, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus flexus, Bacillus fusiformis, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus methylotrophicus, Bacillus mojavensis, Bacillus pumilus, Bacillus safensis, Bacillus siamensis, Bacillus sonorensis, Bacillus simplex, Bacillus subtilis, Bacillus tequilensis и Bacillus vallismortis. Представлена композиция и применение бактерии Bacillus для получения молочного продукта. Группа изобретений обеспечивает улучшение подкисляющей активности, молочнокислые бактерии быстрее достигают желаемый пониженный уровень рН, также обеспечивает получение высококачественного продукта без разделения фаз и нежелательного цвета с улучшенной консистенцией и/или повышенным содержанием витамина К. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 9 пр.

 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способу получения молочного продукта, ферментированного молочнокислыми бактериями, включающий ферментацию молока с помощью инокулированных молочнокислых бактерий (LAB) и инокулированных бактерий Bacillus.

Предшествующий уровень техники

Молочнокислые бактерии (LAB) интенсивно используются в молочной промышленности для изготовления различных ферментированных молочных продуктов, таких как, например, йогурт, сыр и т.д.

Молочнокислые бактерии (LAB) имеют статус общепризнанно безопасных (GRAS) бактерий.

"Общепризнанно безопасное" (GRAS) представляет собой определение Управления по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами США (FDA), согласно которому химический агент и вещество, добавленные в пищу, считаются специалистами безопасными.

Молочнокислые бактерии представляют собой грамположительные, микроаэрофильные или анаэробные бактерии, которые ферментируют сахара с образованием кислот, включающих молочную кислоту в качестве преимущественно продуцируемой кислоты, уксусной кислоты и пропионовой кислоты. Наиболее полезные в промышленности молочнокислые бактерии принадлежат к отряду "Lactobacillales", который включает Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp.и Enterococcus spp. и к отряду "Actinomycetales" который включает Brevibacterium spp. и Propionibacterium spp.

Бактерии Bacillus как таковые не считаются молочнокислыми бактериями.

В предшествующем уровне технике описано использование бактерий Bacillus как таковых (то есть без добавления заквасочной культуры LAB - такой как, например, Lactobacillus или Lactococcus) для изготовления ферментированных молочных продуктов, таких как, например, йогурт - примером является, например, US 2009/0011081 A1 (см. ниже).

В US 2009/0011081 A1 описано применение штамма Bacillus subtilis var. natto для получения йогурта. Штамм В. subtilis var. natto не считается патогеном человека и классифицирован как GRAS. Штамм В. subtilis var. natto способен подавлять пролиферацию некоторых нежелательных бактерий (например нежелательных Е. coli) и может образовывать гигиеническое соединение, Наттокиназу, которое считается эффективным при терапии тромбозов, так что йогурт, сделанный с помощью штамма В. subtilis var. natto, может обеспечить эффективность в предотвращении сердечно-сосудистых заболеваний.

В US 5077063 описано применение штамма Bacillus subtilis для получения ферментированного молочного продукта. В нем описано, что антибактериальные вещества, продуцируемые бактериальным штаммом Bacillus, обеспечивают получение продукта с длительным сроком годности и обладающего активными терапевтическими и профилактическими свойствами.

Кратко говоря, предшествующий уровень техники описывает применение бактерий Bacillus как таковых, благодаря, например, положительным антибактериальным и терапевтическим свойствам бактерий Bacillus как таковых.

В CN 103300147 A описан способ получения ферментированного молока посредством использования двухступенчатого способа. На первой стадии молоко ферментируют с помощью Bacillus subtilis для расщепления белков в обезжиренном молоке до аминокислот или полипептидов при помощи образуемых Bacillus протеаз. На второй стадии добавляют молочнокислые бактерии (Lactobacillus plantarum) к ранее полученному с помощью Bacillus ферментированному молоку и затем выполняют ферментацию при помощи молочнокислых бактерий (то есть понижают рН - подкисление). В реферате сказано, что эта двухступенчатая процедура обеспечивает преимущества для роста Lactobacillus plantarum.

На первой стадии молоко ферментируют с помощью Bacillus subtilis в течение 48 часов (см., например, [0018]) и после этого (стадия два) добавляют Lactobacillus plantarum.

Статья Rossland et al. (Influence of controlled lactic fermentation on growth and sporulation of Bacillus cereus in milk. International journal of food microbiology, 103(1), pp. 69-77 (2005)) относится к исследованию способности Lactobacillus или Lactococcus ингибировать рост и спорообразование Bacillus cereus. В. cereus считается нежелательным патогеном и легко загрязняет многие виды пищевых продуктов и поэтому он, очевидно, не имеет статуса GRAS. Для проведения анализа молоко инокулировали небольшим количеством (10² колониеобразующих единиц (KOE)/мл) штаммов В. cereus и Lactobacillus или Lactococcus и совместно культивировали/ферментировали. Только инокуляция небольшим количеством В. cereus соответствует цели данной статьи, которая относится к исследованию способности Lactobacillus или Lactococcus ингибировать рост патогена Bacillus cereus и как таковая не имеет отношения к получению коммерчески значимого ферментированного молочного продукта (например йогурта или сыра). Очевидно, что эта статья как таковая не имеет отношения к получению коммерчески значимого ферментированного молочного продукта (например йогурта или сыра) как такового, поскольку ни один квалифицированный специалист не будет инокулировать молоко патогенным Bacillus cereus для получения, например, йогурта.

В CN 103190478 A описан способ получения йогурта, содержащего леван, включающий следующие стадии: 1) культивирование левансахараза-продуцирующего бактериального штамма с получением ферментационного бульона, содержащего левансахаразный фермент, выделенный штаммом, 2) центрифугирование ферментационного бульона, полученного на стадии (1) для разделения супернатанта и бактериальных клеток, 3) добавление сульфата аммония к супернатанту для осаждения ферментного белка и центрифугирование для получения белкового осадка и очистка белкового осадка с получением чистой левансахаразы и 4) добавление сахарозы и очищенной левансахаразы, полученной на стадии (3) к сырому молоку и инокуляция молочнокислыми бактериями и ферментация смеси с получением йогурта с леванами. Левансахараза-продуцирующий бактериальный штамм может, например, представлять собой Bacillus licheniformis АТСС14580 и Bacillus subtilis АТСС6051. Молочнокислые бактерии могут, например, представлять собой Lactobacillus bulgaricus CICC6046 и Streptococcus thermophilus CICC6038 или их смесь.

В KR 20090039941 A раскрыт способ получения функционального ферментированного продукта с использованием смеси Rubus coreanus Miq (Bokbunja) и хлореллы с использованием смеси молочнокислых бактерий и Bacillus.

В US-A-3674508 в Примерах раскрыт способ получения ферментированного молочного продукта со вкусом сыра с использованием комбинации S. thermophilus и В. stereothermophilus с получением продукта со вкусом сыра.

Краткое изложение сущности изобретения

Задача, решаемая настоящим изобретением, заключается в предложении способа получения ферментированного молочного продукта с помощью молочнокислых бактерий (например молочного пищевого продукта, такого как йогурт), где молочнокислое брожение быстрее достигает желательного пониженного уровня рН (например рН примерно 4,5).

В данной области техники известно, что бактерии Bacillus обычно не растут оптимально при низких значениях рН.

Соответственно, двухстадийный способ из предшествующего уровня техники CN 103300147 A (рассмотренный выше) можно рассматривать как, на первый взгляд, предпочтительный для специалиста, поскольку первая стадия ферментации только с помощью Bacillus в течение примерно 48 часов перед второй стадией добавления заквасочной культуры LAB, на первый взгляд, гарантирует достаточное время для правильной работы Bacillus при естественном рН молока, составляющем примерно рН 6.

Авторы настоящего изобретения протестировали такой двухстадийный способ из предшествующего уровня техники.

Как видно из рабочего Примера 1 в данном документе протестированный двухстадийный способ из предшествующего уровня техники не работает должным образом для Bacillus pumilus.

Предварительная инкубирование и ферментация с Bacillus pumilus в течение 24 часов (то есть первая стадия в двухстадийном способе из предшествующего уровня техники) с последующей ферментацией с S. thermophilus (то есть вторая стадия в двухстадийном способе из предшествующего уровня техники) дает ферментированное молоко, разделенное на две фазы (см. рисунок 1 - верхнее изображение) и с нежелательным желтым цветом (см. рисунок 1 - нижнее изображение). Такое разделение фаз и развитие цвета приводят к значительным проблемам при применении концепции предварительной инкубации с Bacillus (то есть двухстадийного способа из предшествующего уровня техники).

Как далее обсуждается в Примере 1 в данном документе (см. также Фиг. 2 в данном документе) - для тестируемого двухстадийного способа из предшествующего уровня техники не наблюдалось никакого улучшения подкисляющей активности по сравнению только со штаммами_S. thermophilus.

Результат примера 2 в данном описании изобретения продемонстрировал по существу то же самое для Bacillus subtilis, что и для Bacillus pumilus в примере 1, поскольку для Bacillus subtilis двухстадийный способ из предшествующего уровня техники также не работал должным образом.

Как обсуждалось здесь - авторы настоящего изобретения протестировали другой одностадийный способ ферментации (то есть только одну стадию молочнокислого брожения с использованием и Bacillus, и молочнокислых бактерий).

В отличие от протестированного двухстадийного способа из предшествующего уровня техники - одностадийный способ ферментации (например только одна стадия молочнокислого брожения и с Bacillus, и с молочнокислыми бактериями) по настоящему изобретению работал очень хорошо - то есть было получено значительное улучшение подкисляющей активности (см. многочисленные рабочие Примеры здесь).

Кроме того, и как обсуждается в рабочем примере в данном документе, одностадийный способ ферментации по настоящему изобретению дает коммерчески приемлемый высококачественный ферментированный молочный продукт (то есть, например, без нежелательного разделения фаз и развития цвета - см., например, рабочий пример 6 в данном описании изобретения).

В приведенной ниже таблице показаны различные Bacillus и молочнокислые бактерии, которые, как было показано в разных рабочих примерах данном описании изобретения, правильно работают в одностадийном способе ферментации по настоящему изобретению - то есть молочнокислое брожение быстрее достигает желательного пониженного уровня рН (например рН примерно 4,5):

Соответственно, было показано, что одностадийный способ ферментации по настоящему изобретению работает для ряда разных видов Bacillus и для 3 разных LAB разных родов.

Без ограничения теорией, следовательно, нет никаких существенных технических причин полагать, что это является так называемым класс-специфическим эффектом - то есть, что настоящее изобретение не должно работать для по существу всех релевантных настоящему изобретению комбинаций клеток Bacillus и клеток LAB.

Кроме того, как показано, например, в рабочем Примере 6 здесь - для конкретного, представляющего интерес LAB (например Streptococcus), относительно легко установить мелкомасштабный (например 1 мл молока) скрининговый анализ для определения подходящих хороших рабочих штаммов Bacillus.

Соответственно, первый аспект изобретения относится к способу получения ферментированного молочного продукта с помощью молочнокислых бактерий, включающему следующую стадию:

(а): ферментация молока с помощью 10⁴-10¹² КОЕ/мл инокулированных молочнокислых бактерий (LAB) и 10⁴-10¹² КОЕ/мл инокулированных бактерий Bacillus в подходящих условиях при температуре от 22 до 45°C, пока ферментированное молоко не достигнет желательного значения рН от 3,5 до 5,5 и когда начало ферментации с бактериями Bacillus в молоке приходится на временной интервал от пяти часов до и до четырех часов после начала ферментации молока при помощи LAB; и

где инокулированные бактерии Bacillus на стадии (а) представляют собой по меньшей мере одну бактерию Bacillus, выбранную из группы, состоящей из: Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus aryabhattai, Bacillus atrophaeus, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus flexus, Bacillus fusiformis, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus methylotrophicus, Bacillus mojavensis, Bacillus pumilus, Bacillus safensis, Bacillus siamensis, Bacillus simplex, Bacillus sonorensis, Bacillus subtilis, Bacillus tequilensis и Bacillus vallismortis.

Все перечисленные непосредственно выше типы бактерий Bacillus считаются безопасными и поэтому непатогенными.

Как обсуждалось выше, Bacillus cereus считается патогенным и применение такого патогенного Bacillus как таковое не представляет коммерческого интереса в контексте настоящего получения, например, пищевых/кормовых продуктов.

Например, в научном заключении группы по биологической опасности (BIOHAZ) Европейской комиссии по безопасности пищевых продуктов (EFSA) Европейского союза (EU) о поддержании перечня QPS (квалифицированное мнение о безопасности) биологических агентов, намеренно добавляемых к пищевым продуктам и кормам (обновление 2013 года), можно прочитать в отношении перечисленных в способе по первому аспекту бактериальных типов Bacillus: "Отсутствие токсикогенной активности".

В том же отчете EFSA 2013 можно прочитать в отношении Bacillus cereus: "Имеется все больше доказательств патогенности".

Ссылка для цитирования указанного выше отчета EFSA 2013 - "EFSA Journal 2013; 11(11):3449 [108 pp.]. doi:10.2903/j.efsa.2013.3449" и на дату подачи настоящей заявки его можно загрузить по следующей ссылке: http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/3449.pdf

Как обсуждается, например, в рабочем Примере 7, представленном здесь, считается, что способ по первому аспекту не будет работать на коммерчески приемлемом уровне при использовании менее чем примерно 10⁴ КОЕ/мл (предпочтительно примерно 10⁵ КОЕ/мл) бактерий Bacillus на стадии (а) способа по первому аспекту, как описано здесь.

Как обсуждалось выше - в статье Rossland et al. (2005) молоко инокулировали небольшим количеством (10² КОЕ/мл) В. cereus, что связано с целью этой статьи, которая относится к исследованию способности Lactobacillus или Lactococcus ингибировать рост патогена Bacillus cereus, а не к производству коммерчески значимого ферментированного молочного продукта (например, йогурта или сыра) как таковому. Соответственно, в рабочих Примерах в данном описании изобретения протестированные непатогенные бактерии Bacillus не работают должным образом при использовании небольшого количества (10² КОЕ/мл) бактерий Bacillus, как описано в статье Rossland et al. (2005).

Как обсуждалось выше, основная цель стадии (а) первого аспекта заключается в одностадийном одновременном ферментировании в присутствии обеих бактерий LAB и Bacillus. Очевидно, что это достигается при одновременном инокулировании бактерий LAB и Bacillus в молоко.

Однако, как понятно специалисту в данной области техники, в контексте данного изобретения можно инокулировать бактерии LAB и Bacillus в молоко в разные моменты времени в пределах относительно короткого диапазона времени - этот факт отражен на стадии (а) первого аспекта, где указано "и где начало ферментации молока с помощью бактерий Bacillus находится в диапазоне времени от пяти часов до и до четырех часов после начала ферментации молока с помощью LAB".

Для квалифицированного специалиста является обычной работой определить «начало ферментации молока с помощью LAB» (например путем измерения увеличения количеств молочной кислоты в молоке и/или путем измерения подкисления рН) и, следовательно, конечно обычная работой для специалиста является определение необходимого момента времени для начала ферментации молока с помощью бактерий Bacillus (например посредством правильного выбора момента времени инокуляции бактерий Bacillus), для того чтобы соответствовать вышеуказанному параметру диапазона для временного периода.

Что касается стадии (а), в контексте настоящего изобретения очевидно, что "начало ферментации молока при помощи бактерий Bacillus" и "начало ферментации молока при помощи LAB" не может быть осуществлено до того как молоко достигло подходящей температуры для бактериальной ферментации, и понятно, что практически все указанные здесь коммерчески значимые бактериальные штаммы не имеют существенной ферментации при температуре ниже 22°C и выше 45°C.

Соответственно, если, например, бактерии Bacillus вводили в молоко в 1 сутки и затем хранили при 5°C в течение, например, 24 часов, то не осуществлялось "начало ферментации молока при помощи бактерий Bacillus" в отношении стадии (а) в течение периода хранения при 5°C - по существу из-за того, что клетки Bacillus являются по существу неактивными при 5°C и поэтому не ферментируют молоко как таковое.

Следовательно, если на 2-е сутки молочнокислые бактерии вводят в содержащее Bacillus и хранящееся при 5°C молоко и затем повышают температуру до подходящей величины (например 37°C) - тогда очевидно, что "начало ферментации при помощи бактерий Bacillus" и "начало ферментации молока при помощи LAB" в этом примере будет происходить в одно и то же время (то есть время, когда температура молока достигает подходящей температуры для бактерий и фактически начинается значительная Bacillus/LAB-ферментация).

Как обсуждается в рабочих примерах в данном описании изобретения, ферментация с помощью клеток Bacillus как таковых (только одних) существенно не снижает рН.

Соответственно и без ограничения теорией, приведенные здесь экспериментальные результаты показывают, что Bacillus в какой-то степени увеличивает/усиливает рН-понижающую способность LAB как такового при совместном культивировании в соответствии с одностадийным способом ферментации по первому аспекту, как описано здесь.

Как показано в рабочем Примере 1 здесь - в отношении одностадийного способа, описанного здесь, представляется, что не происходило значительного роста тестируемых штаммов Bacillus pumilus на стадии ферментации (а) по первому аспекту изобретения. Фактически, они по существу погибали во время процесса ферментации (возможно из-за снижения рН). Это можно рассматривать как преимущество, так как в этом случае в конечном ферментированном молочнокислыми бактериями молочном продукте клетки Bacillus могут отсутствовать или может присутствовать только незначительное количество клеток Bacillus.

Как обсуждается в рабочем Примере 5 данного описания изобретения, авторы настоящего изобретения провели эксперименты, чтобы проверить теорию из предшествующего уровня техники (см., например, обсуждаемый выше CN 103300147 А), касающуюся того, что протеолитическая система штаммов Bacillus отвечает за эффект стимуляции роста со стороны LAB.

Протеиназо-отрицательные штаммы Lactococcus lactis сравнивали с нормальными штаммами Lactococcus lactis, и, если бы протеолитическая система штаммов Bacillus была главным фактором, то можно было бы ожидать относительно более высокого эффекта снижения рН для протеиназо-отрицательных LAB по сравнению с нормальными LAB.

Однако в экспериментах из Примера 5 рост протеиназо-отрицательных штаммов Lactococcus lactis не был значительно увеличен по сравнению с другими тестируемыми нормальными штаммами Lactococcus lactis.

Соответственно, и без ограничения теорией, представляется, что протеолитическая система клеток Bacillus не является единственным важным фактором, ответственным за обсуждаемый здесь позитивный синергетический эффект улучшения/усиления роста LAB.

Кратко говоря, на основании экспериментальных результатов, раскрытых здесь, представляется, что клетки Bacillus делают что-то положительное для клеток LAB во время их одновременного совместного культивирования.

Кроме того, можно полагать, что положительные влияния бактериальных клеток Bacillus имеют большое значение, в частности в начале молочнокислого брожения молока с помощью LAB.

Как обсуждается, например, в рабочем Примере 9 данного описания изобретения, путем, например, использования подходящих выбранных клеток Bacillus можно получить ферментированный молочный продукт с дополнительными коммерчески значимыми свойствами, такими как, например, улучшенные характеристики консистенции и/или повышенные количества витамина К.

Настоящее изобретение также относится к композиции для получения ферментированного при помощи молочнокислых бактерий молочного продукта, содержащей заквасочную культуру, содержащую по меньшей мере одну молочнокислую бактерию и по меньшей мере одну бактерию Bacillus, выбранную из группы, состоящей из: Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus aryabhattai, Bacillus atrophaeus, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus flexus, Bacillus fusiformis, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus methylotrophicus, Bacillus mojavensis, Bacillus pumilus, Bacillus safensis, Bacillus siamensis, Bacillus simplex, Bacillus sonorensis, Bacillus subtilis, Bacillus tequilensis и Bacillus vallismortis.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к применению бактерий Bacillus для получения ферментированного молочнокислыми бактериями молочного продукта, включающему ферментацию молока с 10⁴-10¹² КОЕ/мл инокулированных молочнокислых бактерий (LAB) и 10⁴-10¹² КОЕ/мл инокулированных бактерий Bacillus в подходящих условиях, при температуре от 22°C до 45°C до тех пор, пока ферментированное молоко не достигнет желательного значения рН от 3,5 до 5,5, и где начало ферментации молока при помощи бактерий Bacillus приходится на временной период от пяти часов до и до четырех часа после начала ферментации молока с помощью LAB; и где бактерии Bacillus представляют собой по меньшей мере одну бактерию Bacillus, выбранную из группы, состоящей из: Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus aryabhattai, Bacillus atrophaeus, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus flexus, Bacillus fusiformis, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus methylotrophicus, Bacillus mojavensis, Bacillus pumilus, Bacillus safensis, Bacillus siamensis, Bacillus simplex, Bacillus sonorensis, Bacillus subtilis, Bacillus tequilensis и Bacillus vallismortis.

Определения

Все определения релевантных здесь терминов соответствуют тем, которые подразумеваются специалистом в данной области применительно к релевантному здесь техническому контексту.

Термин "бактерии" в данном контексте применяют во множественном числе, поскольку нет смысла говорить здесь о релевантном в данном случае ферментированном молочнокислыми бактериями молочном продукте, содержащем только одну единственную бактерию.

Под "ферментацией" подразумевается биохимическая реакция, которая включает высвобождение энергии из органического субстрата под действием микроорганизмов.

Термин "ферментированный молочный продукт" относится к продуктам, которые предназначены для потребления животными, более конкретно человеком, и которые получают посредством ферментации молочного субстрата бактериями. Такие продукты могут содержать второстепенные ингредиенты, такие как фрукты, овощи, сахара, корригенты и т.д.

При использовании здесь термин "молочнокислая бактерия" означает грамположительную, микроаэрофильную или анаэробную бактерию, которая сбраживает сахара с образованием кислот, включающих молочную кислоту в качестве преимущественно продуцируемой кислоты, уксусную кислоту и пропионовую кислоту. Промышленно наиболее полезные молочнокислые бактерии относятся к роду "Lactobacillales", который включает Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp.и Enterococcus spp. и роду "Actinomycetales", который включает Brevibacterium spp. и Propionibacterium spp. Кроме того, бактерии, производящие молочную кислоту и принадлежащие к группе строгих анаэробных бактерий, бифидобактерий, то есть Bifidobacterium spp., обычно включают в группу молочнокислых бактерии. Их часто используют в качестве пищевых культур отдельно или в сочетании с другими молочнокислыми бактериями.

Термин "молочнокислое брожение" означает анаэробный или микроаэробный процесс потребления, среди прочего, лактозы ферментами бактерий, что вызывают образование молочной кислоты и, возможно, уксусной кислоты и снижение рН.

Термин "ферментированный молочнокислыми бактериями молочный продукт" относится к продуктам, которые предназначены для потребления животными и более конкретно человеком и которые получают при подкисляющем молочнокислом брожении молочного субстрата с помощью молочнокислых бактерий. Такие продукты могут содержать второстепенные ингредиенты, такие как фрукты, овощи, сахара, корригенты и т.д.

В данном контексте термин "молоко" включает молоко млекопитающего или растительное молоко. Примерами молока являются коровье молоко (молоко крупного рогатого скота), верблюжье молоко, буйволиное молоко, козье молоко, овечье молоко и соевое молоко. Молоко может быть подкислено, например, добавлением кислоты (таким как лимонная, уксусная или молочная кислота) или смешано, например с водой. Молоко может быть сырым или обработанным, например посредством фильтрования, стерилизации, пастеризации, гомогенизации и т.д., или оно может представлять собой восстановленное сухое молоко. Важным примером "коровьего молока" по настоящему изобретению является пастеризованное коровье молоко. Очевидно, что молоко можно подкислять, смешивать или обрабатывать до, во время и/или после инокуляции бактериями.

В данном контексте "заквасочная культура" ферментированного молока представляет собой бактериальную культуру, которая содержит по меньшей мере один штамм молочнокислых бактерий, выбранный из группы, состоящей из Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и Streptococcus thermophilus. В соответствии с этим ферментированный молочный продукт можно получить путем инокуляции молока и ферментации молока с добавленными штаммами. Как правило, заквасочная культура для йогурта содержит Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и в большинстве стран йогурт определен законодательно, как ферментированный молочный продукт, произведенный с использованием заквасочной культуры, содержащей эти два указанных штамма.

Воплощения настоящего изобретения описаны ниже только посредством примеров.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1: Молоко, полученное с предварительно инкубированным штаммом Bacillus pumilus СНСС5042, разделено на две фазы (см. Фиг. 1 - верхнее изображение). Молоко с предварительно инкубированным штаммом Bacillus pumilus СНСС16735 было желтым (см. Фиг. 1 - нижнее изображение). Более подробную информацию см. в рабочем примере 1 описания изобретения.

Фиг. 2: Результаты эксперимента по подкислению с В. pumilus и S. thermophilus. Более подробную информацию см. в рабочем примере 1 описания изобретения.

Фиг. 3: Результаты эксперимента по подкислению с В. subtilis, В. pumilus и S. thermophilus. Более подробную информацию см. в рабочем примере 3 описания изобретения.

Фиг. 4: Результаты экспериментов, связанных со стимуляцией роста S. thermophilus СНСС4460 разными концентрациями Bacillus pumilus СНСС16735. Более подробную информацию см. в рабочем примере 7 описания изобретения.

Фиг. 5: Результаты экспериментов, связанных с предварительным совместным культивированием ST и Bacillus. Более подробную информацию см. в рабочем примере 8 описания изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как понятно специалисту в данной области техники, комбинация настоящих предпочтительных воплощений будет пониматься как еще более предпочтительная, например применение предпочтительных молочнокислых бактерий (LAB) вместе с предпочтительными бактериями Bacillus следует понимать как еще более предпочтительное.

Ферментация молока обоими бактериями LAB и Bacillus - Стадия (а) первого аспекта

Как обсуждалось выше, стадия (а) первого аспекта относится к ферментации молока 10⁴-10¹² КОЕ/мл инокулированных молочнокислых бактерий (LAB) и 10⁴-10¹² КОЕ/мл инокулированных бактерий Bacillus в подходящих условиях при температуре от 22°C до 45°C вплоть до достижения ферментированным молоком желательного значения рН от 3,5 до 5,5, и когда начало ферментации молока при помощи бактерий Bacillus приходится на временной интервал от пяти часов до и до четыре часа после начала ферментации молока LAB.

Как очевидно специалисту в данном контексте - термин "инокулированный" на стадии (а) относится к активному добавлению молочнокислых бактерий и бактерий Bacillus к молоку.

На стадии (а) может быть добавлена смесь разных типов бактерий Bacillus - но эти разные типы должны быть из перечня для первого аспекта или его предпочтительных воплощений.

Например, на стадии (а) может быть инокулировано, например, 10⁵ КОЕ/мл Bacillus pumilus и 10⁵ КОЕ/мл Bacillus subtilis, что в сумме дает добавление/инокуляцию на стадии (а) 2×10⁵ КОЕ/мл бактерий Bacillus.

В предпочтительном воплощении изобретения инокулированная бактерия Bacillus на стадии (а) представляет собой по меньшей мере одну бактерию Bacillus, выбранную из группы, состоящей из Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus fusiformis, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus mojavensis, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis и Bacillus vallismortis.

Предпочтительно, инокулированные бактерии Bacillus на стадии (а) представляют собой по меньшей мере одну бактерию Bacillus, выбранную из группы, состоящей из Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus и Bacillus subtilis.

Предпочтительно, инокулированные бактерии Bacillus на стадии (а) представляют собой по меньшей мере одну бактерию Bacillus выбранную из группы, состоящей из Bacillus pumilus и Bacillus subtilis.

Предпочтительным Bacillus subtilis может быть В. subtilis var. natto.

Предпочтительно, инокулированные молочнокислые бактерии на стадии (а) представляют собой по меньшей мере одну молочнокислую бактерию, выбранную из группы, состоящей из: Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., и Enterococcus spp., Brevibacterium spp.и Propionibacterium spp.

Аналогично бактериям Bacillus, на стадии (а) может быть добавлена смесь разных типов молочнокислых бактерий - например смесь Streptococcus spp и Lactobacillus spp.

Более предпочтительно, инокулированные молочнокислые бактерии на стадии (а) представляют собой по меньшей мере один тип молочнокислых бактерий, выбранных из группы, состоящей из: Lactococcus spp., Streptococcus spp. и Lactobacillus spp.

Еще более предпочтительно молочнокислые бактерии выбраны из группы, состоящей из: Lactococcus spp., Streptococcus spp. и Lactobacillus spp. и бактерии Bacillus выбраны из группы, состоящей из: Bacillus pumilus и Bacillus subtilis.

Еще более предпочтительно, инокулированные молочнокислые бактерии на стадии (а) представляют собой молочнокислые бактерии, выбранные из группы, состоящей из: S. thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus и Lactococcus lactis.

В рабочих примерах в данном описании изобретения был установлен особенно хороший положительный эффект для S. thermophilus.

Соответственно, может быть предпочтительно, чтобы инокулированные молочнокислые бактерии на стадии (а) представляли собой S. thermophilus.

Может быть особенно предпочтительным, чтобы инокулированные молочнокислые бактерии на стадии (а) представляли собой S. thermophilus и инокулированные бактерии Bacillus на стадии (а) первого аспекта представляли собой по меньшей мере один тип бактерий Bacillus, выбранный из группы, состоящей из: Bacillus pumilus и Bacillus subtilis.

Предпочтительно, на стадии (а) использовали от 10⁵ до 10¹¹ КОЕ/мл инокулированных молочнокислых бактерий (LAB), более предпочтительно на стадии (а) использовали от 10⁶ до 10¹⁰ КОЕ/мл инокулированных молочнокислых бактерий (LAB).

Предпочтительно на стадии (а) использовали от 2×10⁴ до 10¹⁰ КОЕ/мл инокулированных бактерий Bacillus, более предпочтительно на стадии (а) использовали от 10⁵ до 10⁹ КОЕ/мл инокулированных бактерий Bacillus и еще более предпочтительно на стадии (а) использовали от 10⁶ до 10⁸ КОЕ/мл инокулированных бактерий Bacillus.

Для специалиста является обычной работой определение подходящих условий ферментации для получения желательного значения рН, это, как правило, зависит от конкретных используемых бактерий LAB и Bacillus.

Подходящие условия могут включать:

(1): температуру от 22°C до 45°C (предпочтительно от 32°C до 42°C, например от 36°C до 38°C);

(2): период ферментации от 2 часов до 100 часов, например от 3 часов до 48 часов или от 10 часов до 30 часов.

В целом и, как известно специалисту, предпочтительная/оптимальная температура ферментации зависит от используемой LAB. Например, некоторые LAB имеют оптимальный рост примерно при 25°C, а другие LAB имеют оптимальный рост примерно при 37°C.

В зависимости от интересующего ферментированного молочного продукта, желательное значение рН может быть от 4 до 5, например от 4,4 до 4,6.

Предпочтительно, начало ферментации молока при помощи бактерий Bacillus приходится на временной период от 3 часов до начала LAB-ферментации молока до двух часов после начала LAB-ферментации молока, например, начало ферментации молока при помощи бактерий Bacillus приходится на временной период от 2 часов до начала LAB-ферментации молока и до одного часа после начала LAB-ферментации молока.

Более предпочтительно, начало ферментации молока при помощи бактерий Bacillus приходится на временной период между 1 часом до и 30 минутами после начала LAB-ферментации молока.

Еще более предпочтительно, начало ферментации молока при помощи бактерий Bacillus приходится на временной период между 30 минутами до и 15 минутами после начала LAB-ферментации молока.

Наиболее предпочтительно, начало ферментации молока при помощи бактерий Bacillus приходится на временной период между 5 минутами до и 5 минутами после начала LAB-ферментации молока.

Как понятно специалисту в данном контексте, если бактерии Bacillus на стадии (а) инокулируют в молоко в подходящих для ферментации молока условиях (например при температуре 37°C и т.д.), то начало ферментации молока при помощи бактерий Bacillus на практике будет происходить в то же самое время, что и инокуляция молока.

То же самое касается молочнокислых бактерий, то есть если LAB на стадии (а) инокулируют в молоко в подходящих для ферментации молока условиях (например при температуре 37°C и т.д.), тогда начало LAB-ферментации молока на практике будет происходить в то же самое время, что и инокуляция молока.

Как обсуждалось выше, основная цель стадии (а) первого аспекта заключается в одновременной одностадийной ферментации в присутствии как LAB, так и Bacillus бактерий.

Очевидно, это получается, если бактерии LAB и Bacillus инокулируют в молоко примерно в одно и то же время.

Соответственно, предпочтительным воплощением способа по первому аспекту и описанными здесь его воплощениями является то, что на стадии (а) молочнокислые бактерии и бактерии Bacillus инокулируют в молоко в течение периода времени менее пяти часов (предпочтительно менее двух часов, более предпочтительно менее одного часа, еще более предпочтительно менее 20 минут и наиболее предпочтительно менее 5 минут).

Как понятно специалисту в данной области, применительно к абзацу, приведенному непосредственно выше, если, например, сначала инокулируют в молоко бактерии Bacillus, тогда молочнокислые бактерии следует инокулировать в молоко в пределах требуемого предпочтительного временного диапазона (например, через 5 минут после этого).

То же самое, конечно, применимо, если сначала инокулируют в молоко молочнокислые бактерии, и затем бактерии следует инокулировать в молоко Bacillus в течение требуемого предпочтительного временного интервала.

Предпочтительным воплощением способа по первому аспекту и описанных здесь его воплощений является такое, где ферментированное молоко на стадии (а) достигает рН=4,5 быстрее, чем в сравнительном способе, осуществляемом в условиях, идентичных способу по первому аспекту, за исключением того, что в сравнительном способе не производят инокулирование молока бактериями Bacillus на стадии (а).

Для квалифицированного специалиста является стандартной работой осуществление такого действительно сравнительного анализа - он был, например, проведен в рабочем примере 1 данного описания изобретения. В конкретном воплощении изобретения сравнительный способ выполняют следующим образом:

Штамм Bacillus инокулировали в MRS бульон и инкубировали при 37°C в течение ночи. Ночную культуру центрифугировали и осадок ресуспендировали в 1 объеме В-молока (9,5% обезжиренного молока, прокипяченного в течение 30 мин при 99°C). Штамм S. thermophilus предварительно выращивали в М17 с 2% лактозы при 37°C, центрифугировали и ресуспендировали в 1 объеме В-молока.

Для эксперимента по подкислению ресуспендированные штаммы Bacillus и S. termophilus инокулировали по 1% каждого в 200 мл В-молока (9,5% обезжиренного молока, прокипяченного в течение 30 мин при 99°C). За подкислением следили при 37°C на водяной бане путем измерения рН с помощью компьютерного записывающего устройства в течение ночи.

Как очевидно специалисту в данной области, сравнительный способ должен быть идентичным (за исключением того, что не производится инокуляция молока бактериями Bacillus), т.е. все остальное (например количество молока (например 200 мл или 100 л), ферментируемого на стадии (а); температура и т.д.) должны быть идентичны способу по первому аспекту (т.е. с инокуляцией LAB на этапе (а)).

В предпочтительном воплощении ферментированное молоко на стадии (а) достигает рН=4,5 на 30 минут (более предпочтительно на 1 час и еще более предпочтительно на 2 часа) быстрее, чем в сравнительном способе, выполняемом в условиях, идентичных условиям способа по первому аспекту, за исключением того, что в сравнительном способе не производится инокуляция молока бактериями Bacillus на стадии (а).

В конкретном воплощении изобретения ферментированное молоко, полученное на стадии (а), имеет улучшенную текстуру по сравнению с ферментированным молоком, полученным на стадии (а), выполненной в идентичных условиях за исключением того, что бактерии Bacillus не инокулировали, при измерении посредством метода сравнения текстуры. Указанный сравнительный способ текстуры может представлять собой способ измерения напряжения сдвига, выполняемым следующим образом:

На следующий день после инкубации ферментированное молоко доводили до 13°C и осторожно перемешивали с помощью палочки, снабженной перфорированным диском, до гомогенности образца. Реологические свойства образца оценивали на реометре (Anton Paar Physica Rheometer with ASC, Automatic Sample Changer, Anton Paar® GmbH, Austria). Установленные параметры были следующими:

Время ожидания (для воссоздания до некоторой степени оригинальной структуры)

5 минут без колебаний и вращения

Колебания (для измерения G' и G'' для вычисления G*)

y=0,3%, частота (f)=[0.5…8] Гц

6 точек измерения в течение 60 с (одна точка каждые 10 с)

Вращение (для измерения напряжения сдвига при 300 1/с)

и

21 точка измерения в течение 210 с (каждые 10 с) повышения до 300 1/с. и

21 точка измерения в течение 210 с (каждые 10 с) снижения до 0,3 1/с.

Для дополнительного анализа было выбрано напряжение сдвига 300 1/с.

Предпочтительно, молоко на стадии (а) по первому аспекту представляет собой коровье молоко, верблюжье молоко, буйволиное молоко, козье молоко или овечье молоко - более предпочтительно, молоко на стадии (а) по первому аспекту представляет собой коровье молоко.

Может быть предпочтительно, чтобы способ по первому аспекту, как описано здесь, был коммерчески значимым, относительно крупномасштабным способом производства.

Соответственно, может быть предпочтительным, чтобы количество молока на стадии (а) по первому аспекту представляло собой количество молока по меньшей мере 100 л, более предпочтительно количество молока по меньшей мере 1000 л и еще более предпочтительно количество молока по меньшей мере 10000 л.

Может быть предпочтительным изготовить композицию заквасочной культуры, содержащей необходимые здесь количества как молочнокислых бактерий (LAB), так и бактерии Bacillus, а затем использовать эту композицию заквасочной культуры для инокуляции молока на стадии (а) по первому аспекту.

Соответственно, предпочтительным воплощением является инокуляция молока на стадии (а) по первому аспекту, выполненная путем использования одной композиции заквасочной культуры, содержащей и молочнокислые бактерии (LAB), и бактерии Bacillus в нужных количествах.

Может быть предпочтительным, чтобы композиция одной заквасочной культуры была получена посредством предварительного совместного культивирования LAB и бактерий Bacillus.

Дополнительные стадии способа получения ферментированного молочного продукта

Специалисту известно, как получать молочнокислые бактерии ферментированного молочного продукта (например йогурта или сыра) - соответственно, нет необходимости описывать дополнительные стадии после стадии (а), то есть стадию ферментации, во всех деталях в данном контексте.

Дополнительные стадии могут включать стадию простой упаковки ферментированного молочного продукта в подходящую тару. Таким образом, подходящей тарой может быть бутылка, картонка или что-то подобное и подходящее количество может составлять, например, от 10 мл до 5000 мл или от 50 мл до 1000 мл.

Когда ферментированный молочный продукт представляет собой сыр, дополнительные стадии могут включать стадии разрезания коагулята на частицы сырного сгустка для отделения сыворотки от сырного сгустка.

В зависимости от типа интересующего ферментированного молочного продукта, дополнительные стадии могут включать, например, добавление других релевантных бактерий или, например, использование соответствующих молокосвертывающих ферментов, таких как химозин и пепсин.

Предпочтительно, молочный продукт, ферментированный с помощью молочнокислых бактерий, представляет собой молочный пищевой продукт.

Предпочтительно, молочный продукт, ферментированный с помощью молочнокислых бактерий, представляет собой ферментированный молочный продукт, выбранный из группы, состоящей из: кефира, йогурта, сыра, сметаны, крем-фреша, кумыса, сквашенной пахты и ацидофильного молока.

Предпочтительно, молочный продукт, ферментированный с помощью молочнокислых бактерий, выбран из группы, состоящей из йогурта и сыра. В конкретном воплощении молочный продукт, ферментированный с помощью молочнокислых бактерий, представляет собой йогурт. В конкретном воплощении молочный продукт, ферментированный с помощью молочнокислых бактерий, представляет собой сыр.

ПРИМЕРЫ

Если не указано иное, молоко, используемое в приведенных ниже примерах, представляло собой так называемое В-молоко (9,5% восстановленное обезжиренное молоко, термически обработанном в течение 30 минут при 99°C). В-молоко представляет собой коровье молоко.

ПРИМЕР 1: Сравнительные эксперименты - двухстадийный способ из предшествующего уровня техники по сравнению с одностадийным способом ферментации по изобретению - В. pumilus и S. thermophilus

Как обсуждалось выше, в предшествующем уровне техники, например в CN 103300147 A, описан способ получения ферментированного молока путем использования двухстадийного способа. На первой стадии молоко ферментируют с помощью Bacillus subtilis (48 часов в CN 103300147 А) и на второй стадии к ранее полученному с помощью Bacillus ферментированному молоку добавляют молочнокислые бактерии и выполняют ферментацию молочнокислыми бактериями (то есть понижают рН - подкисление).

Как обсуждается в данном рабочем примере 1 - авторы настоящего изобретения сравнили двухстадийный способ из предшествующего уровня техники с одностадийным одновременным способом по изобретению.

Bacillus pumilus сами по себе:

Bacillus pumilus СНСС5042 и СНСС16735 инокулировали из замороженных ампул в бульон BHI объемом 3x5 мл каждый и инкубировали при 37°C и 150 об/мин в течение ночи (ON).

4×200 мл В-молока переносили в 4 сосуда для встряхивания, и штаммы В. pumilus 5042 и 16735 инокулировали по 1% (из ночной культуры в среду с сердечно-мозговым экстрактом (BHI)) в 2 бутыли каждый. Их инкубировали при 37°C и 150 об/мин в течение 24 часов.

5042 и 16735 также инокулировали из замороженных ампул в 5 мл бульона BHI и инкубировали таким же образом.

24-часовые сосуды с 16735 пожелтели. В обоих сосудах (то есть и для 5042, и для 16735) происходило некоторое пенообразование.

Эксперимент по подкислению с В. pumilus и S. thermophilus:

24-часовые культуры В. pumilus переносили из сосудов для встряхивания в стерильные 200 мл сосуды.

Ночные культуры В. pumilus в BHI центрифугировали и осадки ресуспендировали в 5 мл В-молока каждый.

S. thermophiles (ST) СНСС4895 и СНСС4460 инокулировали в М17 + 2% лактозы и инкубировали при 37°C в течение ночи.

11 мл ночных ST культур центрифугируют и ресуспендируют в каждые 11 мл В-молока.

1. 1% инокуляция в В-молоке культуры 5042 после 24 часов в сосуде для встряхивания

2. 24-часовая культура 5042 из сосудов для встряхивания + 1% 4895

3. 24-часовая культура 5042 из сосудов для встряхивания + 1% 4460

4. 1% инокуляция в В-молоке 24-часовой культуры 16735 в сосуде для встряхивания

5. 24-часовая культура 16735 из сосудов для встряхивания + 1% 4895

6. 24-часовая культура 16735 из сосудов для встряхивания + 1% 4460

7. 1%4895

8. 1% 4895 + 1% 5042 (в течение ночи в BHI)

9. 1% 4895 + 1% 16735 (в течение ночи в BHI)

10. 1%4460

11.1% 4460 + 1% 5042 (в течение ночи в BHI)

12. 1% 4460 + 1% 16735 (в течение ночи в BHI)

13. В-молоко

Подкисление при 37°C на водяной бане. рН измеряли при помощи компьютерного записывающего устройства в течение ночи.

Результаты эксперимента по подкислению с В. pumilus и S. thermophiles (ST):

Культуры с предварительно инкубированным штаммом Bacillus pumilus СНСС5042 разделились на две фазы (см. Фиг. 1 - верхнее изображение, которое относится к эксперименту 2 (см. выше)).

Культура с предварительно инкубированным штаммом Bacillus pumilus СНСС16735 все еще была желтой (см. Фиг. 1 - нижнее изображение, которое относится к эксперименту 5 (см. выше)).

Разделение фаз и развитие окрашивания приводит к значительным проблемам при применении концепции с предварительной инкубацией Bacillus.

Как можно видеть на Фиг. 2 данного описания изобретения:

Сосуды с предварительно инкубированными штаммами Bacillus pumilus имели более высокое значение рН.

Не происходило никакого улучшения подкисляющей активности по сравнению только со штаммами ST. Конечный рН был также значительно выше, чем только для штаммов ST.

Как обсуждалось выше:

Эксперимент номер 7 представляет собой только штамм ST 4895 (то есть контроль);

Эксперимент номер 8 представляет собой штамм ST 4895 + Bacillus 1% 5042

Эксперимент номер 9 представляет собой штамм ST 4895 + Bacillus 1% 16735

Эти эксперименты 8 и 9 выполняли в соответствии с одностадийным способом совместного культивирования и ферментации по изобретению и результаты заключались в том, что молочнокислое брожение значительно быстрее достигало желательного пониженного уровня рН, например значения рН=5 и рН=4,5 были достигнуты значительно быстрее.

Аналогичные положительные результаты получали для штамма ST 4460 (сравните #11 и #12 с контролем #10).

Ферментация только с помощью клеток Bacillus существенно не снижала рН (см. #1 и #4).

Анализ роста В. pumilus во время ферментации:

Культивирование культуры 8 и 9 на BHI:

Здесь было проанализировано, обусловлен ли эффект Bacillus pumilus совместно с ST ростом Bacillus в молоке или чем-нибудь еще. Культуру 8 и 9, следовательно, сеяли на чашки после инокулирования, перед инкубацией на агаре BHI в разведениях от 10^-1 до 10^-4 и сеяли снова через сутки, чтобы увидеть росли ли они.

Штамм ST 4895 наносили штрихами на агар BHI в то же самое время, чтобы увидеть, может ли он расти на чашке для посева. Чашки аэробно инкубировали при 37°.

После ферментации культуру 8 и 9 разбавляли в 10 раз и снова сеяли на агар BHI в разведении 10^-3-10^-6. Чашки инкубировали аэробно при 37° в течение ночи.

Результат посева СНСС4895 на BHI: штамм не растет на чашке. Результат культивирования 8 и 9 на агаре BHI:

СНСС4895 не учитывали, так как он очень слабо растет на чашке.

Большая часть клеток Bacillus, по-видимому, была ликвидирована при подкислении с помощью ST - возможно из-за низкого рН.

Таким образом, не происходило значительного роста штаммов Bacillus pumilus. Фактически, они по существу погибали во время процесса ферментации (вероятно, из-за снижения рН).

Это можно рассматривать как преимущество, так как в этом случае отсутствует или присутствует очень мало клеток Bacillus в конечном молочном продукте, ферментированном молочнокислыми бактериями.

Заключения:

Результат этого Примера 1 продемонстрировал, что двухстадийный способ из предшествующего уровня техники не работает должным образом для Bacillus pumilus.

В результате предварительной инкубации и ферментации с Bacillus pumilus в течение 24 часов (то есть первая стадия двухстадийного способа из предшествующего уровня техники) с последующей ферментацией с помощью S. thermophilus (то есть втора стадией способа из предшествующего уровня техники) получают ферментированное молоко, разделенное на две фазы (см. Фиг. 1 - верхнее изображение) с нежелательным желтым цветом (см. Фиг 1 - нижнее изображение).

Такое разделение фаз и развитие окрашивания будут приводить к значительным проблемам при применении концепции с предварительной инкубацией Bacillus (то есть двухстадийного способа из предшествующего уровня техники).

Как можно видеть на Фиг. 2 здесь и в отношении двухстадийного способа из предшествующего уровня техники:

Сосуды с предварительно инкубированными штаммами Bacillus pumilus имели более высокое значение рН.

Не было никакого улучшения подкисляющей активности по сравнению с одними штаммами ST.

Конечное значение рН было также значительно выше чем для одних ST.

В отличие от этого - одностадийный способ (то есть только одна стадия ферментации и с Bacillus pumilus и с S. thermophilus) по настоящему изобретению работал очень хорошо.

Как видно из Фиг. 2 здесь, при использовании одностадийного способа по настоящему изобретению один положительный результат заключался в том, что молочнокислая ферментация значительно быстрее достигала желательного пониженного уровня рН.

Кроме того, ферментированное молоко (стадия (а) способа по первому аспекту) достигало желательного значения рН значительно быстрее, чем в случае сравнительного способа, выполняемого в идентичных условиях, за исключением того, что в сравнительном способе не проводили инокуляцию молока бактериями Bacillus (стадия (а) способа по первому аспекту данного изобретения).

На Фиг. 2 это можно увидеть путем, например, сравнения подкисления только штаммом ST 4460, которое является значительно менее быстрым/скорым, чем одностадийный одновременный профиль подкисления для ST 4460 + Bacillus 5042 и ST 4460 + Bacillus 16735. Аналогичные положительные результаты были получены для штамма ST 4895, когда желательный пониженные уровни рН были достигнуты значительно быстрее при одновременной одностадийной ферментации вместе с Bacillus.

Кроме того, результат данного Примера 1 показал, что не было значительного роста штаммов Bacillus pumilus при одновременной ферментации со штаммами ST. Фактически клетки Bacillus по существу погибали во время процесса ферментации (возможно из-за снижения рН). Это можно рассматривать как преимущество, так как в этом случае отсутствовали или присутствовало очень мало клеток Bacillus в конечном молочном продукте, ферментированном молочнокислыми бактериями.

ПРИМЕР 2: Сравнительные эксперименты - двухстадийный способ из предшествующего уровня техники - В. subtilis и S. thermophilus

Этот пример можно рассматривать как аналогичный Примеру 1 выше - в этом примере аналогичный эксперимент проводили со штаммами Bacillus subtilis СНСС15877 и СНСС16871 (в Примере 1 использовали Bacillus pumilus).

Штаммы Bacillus subtilis СНСС 15877 и СНСС 16871 наносили штрихами на агар BHI из замороженных ампул и инкубировали аэробно при 37°C в течение ночи.

Отдельную колонию из СНСС15877 и СНСС16871 инокулировали в 6 мл бульона BHI и инкубировали при 37°C, при 150 об/мин.

4×200 мл В-молока переносили в 4 сосуда для встряхивания и штаммы В. subtilis 15877sc и 16687sc инокулировали по 1% (из ночной культуры в BHI) в 2 сосуда каждый. Их инкубировали при 37°C и 150 об/мин в течение 24 часов.

Штаммы S. thermophilus СНСС4895 и СНСС4460 инокулировали в М17 + 2% лактозы и инкубировали при 37°C в течение ночи.

Эксперимент по подкислению:

24-часовые культуры В. subtilis переносили из сосудов для встряхивания в стерильные 200 мл сосуды. Эти штаммы также сделали молоко желтым (то есть как в Примере 1 для Bacillus pumilus).

7 мл ночных St культур центрифугировали и ресуспендировали в 7 мл В-молока каждый.

1. 1% инокуляция в В-молоко культуры 15877 после 24 часов в сосуде для встряхивания

2. 24-часовая культура 15877 из сосуда для встряхивания + 1% 4895

3. 24-часовая культура 15877 из сосуда для встряхивания + 1% 4460

4. 1% инокуляция в В-молоко культуры 16687 после 24 часов в сосуде для встряхивания

5. 24-часовая культура 16687 из сосуда для встряхивания + 1% 4895

6. 24-часовая культура 16687 из сосуда для встряхивания + 1% 4460

7. 1% 4895

8. 1% 4460

9. В-молоко Результаты:

Все четыре предварительно инкубированные сосуды с Bacillus subtilis выглядели как сосуд 5 из предыдущего эксперимента в Примере 1 (разжиженная и желтая культура).

Сосуды с предварительно инкубированными штаммами Bacillus subtilis имели более высокий рН.

Не было никакого улучшения подкисляющей активности по сравнению с одними штаммами ST. Конечное значение рН также было намного выше, чем для одних штаммов St.

Выводы:

Результат этого Примера 2 показал по существу то же самое для Bacillus subtilis, что и для Bacillus pumilus в Примере 1, поскольку для Bacillus subtilis двухстадийный способ из предшествующего уровня техники также не работает должным образом.

ПРИМЕР 3: Стимуляция роста S. thermophilus посредством совместной ферментации со штаммами Bacillus subtilis и В. pumilus - одностадийный способ ферментации по изобретению

Стимуляция роста S. thermophilus СНСС4895 путем добавления штаммов Bacillus subtilis

Следующие штаммы Bacillus subtilus инокулировали в бульон MRS и инкубировали при 37°C в течение ночи: СНСС3810 СНСС15877 СНСС16282 СНСС19200

Ночные культуры центрифугировали и каждый осадок ресуспендировали в 1 об. В-молока (9,5% обезжиренного молока, прокипяченного в течение 30 мин при 99°C).

S. thermophilus СНСС4895 предварительно выращивали в М17 с 2% лактозой при 37°C, центрифугировали и ресуспендировали в 1 об. В-молока.

Для эксперимента по подкислению каждый из ресуспендированных штаммов инокулировали по 1% в 200 мл В-молока. За подкислением следили при 37°C на водяной бане путем измерения рН с помощью компьютерного записывающего устройства в течение ночи.

1. 1% СНСС4895

2. 1% СНСС4895 + 1% СНСС15877

3. 1% СНСС4895 + 1% СНСС16282

4. 1% СНСС4895 + 1% СНСС 19200

5. 1% СНСС4895 + 1% СНСС3810

6. 1% СНСС 15877

7. 1% СНСС 16282

8. 1% СНСС 19200

9. 1% СНСС3810

10. В-молоко Результаты:

Штаммы В. subtilis СНСС3810, СНСС15877, СНСС16282 и СНСС19200 были способны усиливать подкисляющую активность ST СНСС4895.

Стимуляция роста S. thermophilus CHCC489S путем добавления штаммов Bacillus pumilus и Bacillus subtilis

Следующие штаммы Bacillus pumilus и В. subtilis инокулировали в бульон BHI и инкубировали во встряхивателе-инкубаторе при 150 об/мин в течение ночи при 37°C.

Штаммы первоначально инокулировали в MRS без перемешивания, как предыдущие штаммы, но они демонстрировали лишь слабый рост.

В. pumilus СНСС5042

В. pumilus СНСС15512

В. pumilus СНСС15544

В. pumilus СНСС16735

В. pumilus СНСС16873

В. pumilus СНСС17513

В. subtilis CHCC16871

СНСС4895 инокулировали в М17 + 2% лактозы и инкубировали при 37°C в течение ночи.

Ночные культуры центрифугировали и осадки ресуспендировали в 1 об. В-молока.

Для эксперимента по подкислению ресуспендированные штаммы инокулировали по 1% каждый в 200 мл В-молока. За подкислением следили при 37°C на водяной бане путем измерения рН с помощью компьютерного записывающего устройства в течение ночи.

1. 1% СНСС4895

2. 1% СНСС4895 + 1% СНСС5042 (pumilus)

3. 1% СНСС4895 + 1% СНСС15512 (pumilus)

4. 1% СНСС4895 + 1% СНСС15544 (pumilus)

5. 1% СНСС4895 + 1% СНСС16735 (pumilus)

6. 1% CHCC4895 + 1% CHCC16871 (subtilis)

7. 1% CHCC4895 + 1% CHCC17513 (pumilus)

8. 1% СНСС4895 + 1% СНСС16873 (pumilus)

9. 1% CHCC5042

10. 1% CHCC15512 11.1% СНСС 15544

12. 1% СНСС 16735

13. 1% СНСС16871

14. 1% СНСС17513

15. 1% СНСС 16873

16. В-молоко

Результаты:

Результаты показаны на Фиг. 3 данного описания изобретения.

Все штаммы Bacillus были способны значительно усиливать подкисляющую активность СНСС4895. Значение рН 5,0 было достигнуто на два часа раньше, чем при инкубации только с СНСС4895. В то же время они вообще не подкисляли молоко, что означает, что снижение рН при совместной ферментации происходит не из-за производства кислоты бактериями В. subtilis, а скорее из-за стимуляции роста.

Стимуляция роста пяти штаммов S. thermophilus путем добавления штаммов Bacillus pumilus и В. subtilis

В этом эксперименте подкисляющую активность пяти дополнительных штаммов S. thermophilus тестировали в присутствии двух штаммов В. subtilis и двух штаммов В. pumilus. Пять штаммов S. thermophilus характеризуются разными подкисляющими активностями в молоке.

Штаммы S. thermophilus:

СНСС3175

СНСС4460

СНСС5389

СНСС6592

СНСС9204

Штаммы Bacillus sp.:

СНСС15877 (subtilis)

СНСС16871 (subtilis)

CHCC5042 (pumilus)

СНСС16735 (pumilus)

Штаммы Bacillus sp.инкубировали в течение ночи в бульоне BHI при 37°C с перемешиванием при 150 об/мин.

Штаммы S. thermophilus инкубировали в течение ночи в М17 + 2% лактозы при 37°C.

Ночные культуры центрифугировали и осадки ресуспендировали в 1 об. В-молока.

Для эксперимента по подкислению ресуспендированные штаммы инокулировали по 1% каждого в 200 мл В-молока. За подкислением следили при 37°C на водяной бане путем измерения рН с помощью компьютерного записывающего устройства в течение ночи.

Результаты;

Результаты показали, что все четыре штамма Bacillus были способны значительно усиливать подкисляющую активность пяти штаммов S. thermophilus СНСС3175, СНСС4460, СНСС5389, СНСС6592 и СНСС9204.

Выводы:

Результат этого примера 3 показал, что добавление штаммов Bacillus subtilis и В. pumilus может стимулировать подкисление разных штаммов S. thermophilus.

Все протестированные штаммы S. thermophilus показали эффект при совместном ферментации с отдельными различными штаммами Bacillus subtilis и В. pumilus.

ПРИМЕР 4: Стимуляция роста Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus путем совместной ферментации со штаммами В. pumilus - одностадийный способ ферментации по изобретению

Стимуляция роста пяти штаммов Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus путем добавления штаммов Bacillus pumilus

Инокуляция В. pumilus 5042sc и 16735sc (изоляты одиночных колоний ночной культуры, см. выше) в 3×5 мл бульона BHI. Инкубирование при 150 об/мин, 37°C.

Инокуляция Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus CHCC3984 в 9 мл MRS.

Ночные культуры Bacillus pumilus объединяли, 12 мл центрифугировали и каждый осадок ресуспендировали в 12 мл В-молока.

Штаммы Lactobacillus bulgaricus центрифугировали и ресуспендировали в 9 мл В-молока.

Эксперимент по подкислению:

1% инокуляция в 200 мл В-молока. Подкисление при 37°C на водяной бане. рН измеряли с помощью компьютерного записывающего устройства в течение ночи.

1. 3984

2.3984 + 5042

3. 3984 + 16735

4. В-молоко Результаты:

Оба тестируемых штамма Bacillus pumilus оказывали значительный эффект стимулирования роста Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus CHCC3984. Когда клетки Bacillus культивировали совместно со штаммом Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, значение pH=5 было достигнуто значительно быстрее, чем в контрольном эксперименте (то есть только с СНСС3984).

ПРИМЕР 5: Стимуляция роста Lactococcus lactis посредством совместной ферментации со штаммами В. pumilus - одностадийный способ ферментации по изобретению

Стимуляция роста пяти штаммов Lactococcus lactis путем добавления штаммов Bacillus pumilus и В. subtilis

Инокуляция В. pumilus 5042 и 16735 (из замороженных ампул) в 3×5 мл бульона BHI. Инкубирование при 150 об/мин, 37°C.

Инокуляция штаммов Lactococcus lactis СНСС2281, СНСС4427, СНСС9867, СНСС3949 и СНСС3950 в М17. 1% глюкозы добавляли к 3949 и 3950, которые являются лактоза-отрицательными. Инкубирование при 30°C в течение ночи.

Ночные культуры В. pumilus объединяли, 11 мл центрифугировали и каждый осадок ресуспендировали в 11 мл В-молока.

Штаммы Lactococcus lactis центрифугировали и ресуспендировали в 1 об. В-молока.

Эксперимент по подкислению:

1% инокуляция в 200 мл В-молока. Подкисление при 30°C на водяной бане. рН измеряли с помощью компьютерного записывающего устройства в течение ночи.

1. 2281

2. 2281 + 5042

3. 2281 + 16735

4. 4427

5. 4427 + 5042

6. 4427 + 16735

7. 9867

8. 9867 + 5042

9. 9867 + 16735

10. 3949 + 1% глюкоза

11. 3949 + 5042 + 1% глюкоза

12. 3949 + 16735 + 1% глюкоза

13. 3950 + 1% глюкоза

14. 3950 + 5042 + 1% глюкоза

15. 3950 + 16735 + 1% глюкоза

16. В-молоко

Результаты:

Результаты показали, что штаммы Lactococcus lactis подкисляют немного быстрее при выращивании вместе со штаммами Bacillus pumilus. Однако это воздействие не является таким значительным, как наблюдалось для некоторых штаммов S. thermophilus (см. Примеры выше).

Одной из причин выбора Lactococcus lactis СНСС3949 и СНСС3950 в этом эксперименте была теория, согласно которой протеолитическая система штаммов В. pumilus отвечает за эффект стимуляции роста. СНСС3949 и СНСС3950, которые являются протеиназа-негативными, теоретически должны получить больше преимуществ по сравнению с другими тестируемыми штаммами Lactococcus lactis (то есть СНСС2281, СНСС4427, СНСС9867) от совместного культивирования с В. pumilus.

Однако в данном эксперименте рост СНСС3949 и СНСС3950 не был значительно усиленным по сравнению с другими испытанными штаммами Lactococcus lactis.

ПРИМЕР 6: Скрининг подходящих штаммов Bacillus - одностадийный способ ферментации по изобретению

В данном примере проводили скрининг клеток Bacillus, которые обеспечивают улучшение подкисляющей активности по сравнению с использованием одних штаммов LAB.

Скрининг в 96-луночных планшетах с 1 мл молока

Для скрининга был выбран штамм S. thermophilus (ST) СНСС 12339 (штамм, продуцирующий экзополисахарид (EPS)).

Скрининг выполняли в 96-луночных планшетах с 1 мл молока и тестировали 156 разных штаммов Bacillus, выбранных из следующих видов Bacillus: Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus aryabhattai, Bacillus atrophaeus, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus flexus, Bacillus fusiformis, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus methylotrophicus, Bacillus mojavensis, Bacillus pumilus, Bacillus safensis, Bacillus siamensis, Bacillus simplex, Bacillus subtilis, Bacillus tequilensis и Bacillus vallismortis.

Определяли время подкисления и текстуру. Текстуру определяли, используя TADM технологию. В целом, результаты показали, что большинство клеток Bacillus работает - то есть они обеспечивают улучшение подкисляющей активности (скорость) и текстуры по сравнению с использованием только штаммов LAB. В частности, 135 протестированных штаммов Bacillus обеспечивали более высокую скорость подкисления по сравнению только со штаммом ST, и 60 протестированных штаммов имели улучшенную текстуру по сравнению только со штаммом ST. Подкисление посредством самого ST было медленным, вплоть до 14 часов или более для рН 6-4,5. Добавление Bacillus значительно сократило время подкисления до всего лишь 2-4 часов для самых быстрых штаммов.

Результаты из 200 мл сосудов

Проверенных кандидатов (из скрининга 96-луночных планшетов) тестировали в 200 мл сосудах с молоком. Определяли время подкисления и текстуру. Отбирали образцы для определения потребления сахара, продуцирования малых кислот и летучих веществ. 200 мл сосуды хранили в течение 4 недель в холодильнике; и снова анализировали синерезис, запах и летучие вещества. Также наблюдали за ростом Bacillus в молоке.

Измерения сдвигового напряжения показали, что штамм Lb СНСС12945 имел на вплоть до 73% лучшую текстуру, когда в молоко был добавлен штамм Bacillus СНСС15176, по сравнению с одним штаммом Lb. Штамм Bacillus, выделенный из соевого продукта натто, обеспечивал на 40% лучшую текстуру в комбинации со штаммом Lb по сравнению с одним штаммом Lb. Однако у трех штаммов ST текстура была не намного лучше при добавлении Bacillus по сравнению только со штаммами ST в молоке. Две разные заквасочные культуры - СН-1 и заквасочная культура Sweety - продемонстрировали улучшенную на 23%текстуру при добавлении Bacillus в молоко.

Время подкисления молока со штаммами LAB и Bacillus было более коротким, чем только со штаммами LAB. В масштабе 1 мл уменьшение времени подкисления от рН 6 до рН 4,5 составляло вплоть до 6 часов для лучших комбинаций (Lb СНСС12945 с Bacillus). Но также у быстроподкисляющего штамма ST СНСС15915 наблюдалось уменьшение времени подкисления от 4,35 до 3 часов с Bacillus. В 200 мл сосудах уменьшение времени подкисления составляло 4 часа для лучших комбинаций (Lb СНСС12945 и Bacillus СНСС18102, выделенных из натто).

Исследовали рост Bacillus в молоке. Штаммы Bacillus, протестированные в этом документе, не растут в молоке, с добавлением или без добавления LAB. Для роста Bacillus требуется кислород. Стандартной процедурой подкисления является инокуляция бактерий в 200 мл молока в 200 мл сосуде. Затем сосуд стоит неподвижно на водяной бане или в инкубатор без перемешивания. Наблюдалась тенденция к более быстрому сокращению количества вегетативных клеток Bacillus в присутствии штамма LAB. Большая часть клеток штамма Bacillus в молоке продуцировала споры, но спорообразование также ингибировалось присутствием LAB.

Bacillus активно поддерживали подкисление и рост как Lb СНСС 12945, так и ST СНСС12561 по сравнению только с штаммами LAB. Конечное значение КОЕ/мл для LAB было вплоть до двух раз выше по сравнению только со штаммами LAB в молоке.

Для отдельных штаммов LAB результаты были следующими:

Lb; СНСС12945.

Подкисление происходило намного быстрее, когда некоторые из Bacillus были добавлены к Lb-ферментациям. Время от рН 6 до рН 4,5 было уменьшено с 8 часов для одного Lb до немного более чем 2 часов для самых быстрых комбинаций.

ST2; СНСС12561 (медленный)

Подкисление; подкисление было улучшено с 6 часов для самого ST2, до 4 часов для лучших комбинаций Bacillus и ST2.

ST3; СНСС15915 (быстрый)

Подкисление посредством этого ST3 соответствует правильным и плавным кривым подкисления. Некоторые из комбинаций с Bacillus, по-видимому, ускоряют подкисление от рН 6 до рН 4,5 по сравнению с одним ST3.

Чтобы оценить влияние добавления Bacillus к штаммам LAB в молоке, образцы анализировали на сахара, летучие вещества и малые кислоты. Никаких серьезных различий не наблюдалось при добавлении и без добавления Bacillus.

Для оценки хранения сосуды с ферментированным молоком хранили в течение 4 недель в холодильнике и в образцах определяли летучие вещества. Ферментированное молоко хорошо пахло, и профиль летучих веществ был почти таким же, что и после 1 суток хранения. В кратком изложении, во время хранения ферментированное молоко с Bacillus не изменялось отлично от ферментированного молока с добавлением только LAB.

Выводы:

Результат, полученный в этом примере, продемонстрировал, что во время хранения ферментированное молоко с Bacillus не изменялось отлично от ферментированного молока с добавлением только LAB.

Соответственно, одностадийный способ ферментации по настоящему изобретению обеспечивает коммерчески соответствующий ферментированный молочный продукт высокого качества, как обсуждалось выше, а двухстадийный способ из предшествующего уровня техники не работает должным образом.

Для всех протестированных штаммов LAB (один Lactobacillus (Lb) и три разных штамма S. thermophilus (ST)) - были найдены должным образом работающие кандидаты из по меньшей мере следующих разных видов Bacillus: В. subtilis, В. licheniformis, В. pumilus, В. amylioliquefaciens, В. megaterium и других.

ПРИМЕР 7: Стимуляция роста S. thermophilus СНСС4460 разными концентрациями Bacillus pumilus СНСС16735 - одностадийный способ ферментации по изобретению

S. thermophilus СНСС4460 инокулировали в 15 мл М17 + 2% лактозы и инкубировали при 37°C в течение ночи (ON).

Bacillus pumilus СНСС5042 инокулировали в бульон BHI и инкубировали в течение ночи при 37°C, 200 об/мин.

Для эксперимента по подкислению 15 мл ночной культуры СНСС4460 центрифугировали и осадок ресуспендировали в 15 мл В-молока.

6 мл ночной культуры СНСС 16735 центрифугировали и осадок ресуспендировали в 6 мл В-молока.

СНСС4460 инокулировали отдельно (1%) в В-молоке и совместно культивировали с разными концентрациями СНСС 16735 в соответствии со следующей схемой.

1% инокуляция СНСС16735 приводит к концентрации примерно 6×10⁶ КОЕ/мл в начале ферментации молока.

1. 1%СНСС4460

2. 1% СНСС4460 + 1% СНСС16735

3. 1% СНСС4460 + 0,1% СНСС16735

4. 1% СНСС4460 + 0,01% СНСС16735

5. 1% СНСС4460 + 0,001% СНСС16735

6. 1% СНСС4460 + 0,0001% СНСС16735

7. В-молоко - контроль

За подкислением следили при 37°C на водяной бане путем измерения рН с помощью компьютерного записывающего устройства в течение ночи.

Результаты:

Результаты показаны на Фиг. 4 данного описания изобретения.

Добавление Bacillus subtilis СНСС16735, соответствующее проценту инокуляции 1% и 0,1%, приводило к увеличению подкисляющей активности СНСС4460. Более низкие проценты инокуляции СНСС16735 не приводили к стимуляции роста СНСС4460. Выводы:

Результат, полученный в этом примере, показал, что инокуляция молока примерно 6×10⁵ КОЕ/мл бактерий Bacillus на стадии (а) способа по первому аспекту, как описано здесь, работает приемлемо.

Результат был лучше при примерно 6×10⁶ КОЕ/мл бактерий Bacillus.

Исходя из этих результатов, представляется, что описанный способ по первому аспекту не будет работать на коммерчески приемлемом уровне при использовании менее чем примерно 10⁴ КОЕ/мл бактерий Bacillus на стадии (а) способа по первому аспекту, как описано здесь.

Фактически, по-видимому, было бы очень предпочтительно использовать по меньшей мере 10⁵ КОЕ/мл бактерий Bacillus на стадии (а) способа по первому аспекту.

ПРИМЕР 8: Предварительное совместное культивирование ST и Bacillus

В данном эксперименте были использованы те же штаммы Bacillus pumilus СНСС5042, СНСС16735 и S. thermophilus СНСС4460, как в Примере 1 выше.

Как обсуждалось в Примере 1 - в данном примере ночные (ON) культуры в BHI центрифугировали и каждый осадок ресуспендировали в молоке.

Как обсуждается ниже - в данном примере штамм S. thermophilus предварительно инкубировали со штаммами В. pumilus и ночные культуры после этого использовали на второй стадии для инокуляции молока. Ночные культуры использовали как таковые (то есть без центрифугирования). Было получено улучшенное, более быстрое снижение рН..

S. thermophilus СНСС4460 инокулировали в 15 мл М17+2% лактоза и инкубировали при 37°C в течение ночи.

Bacillus pumilus СНСС5042 и СНСС16735 инокулировали в бульон BHI и инкубировали в течение ночи при 37°C, 200 об/мин.

Из ночных культур осуществляли 0,5% инокуляцию СНСС4460 вместе с 0,5% инокуляцией СНСС5042, соответственно СНСС16735, в М17+2% лактозы.

Инкубацию совместных культур осуществляли при 37°C в течение ночи без перемешивания.

СНСС4460 снова инокулировали из замороженного запаса в 15 мл М17+2% лактозы и инкубировали в течение ночи при 37°C, и СНСС5042 и СНСС16735 снова инокулировали из замороженного запаса в 10 мл BHI и инкубировали при 37°C, 200 об/мин в течение ночи.

Эксперимент по подкислению:

15 мл СНСС4460 ON культуры центрифугировали и осадок ресуспендировали в 15 мл В-молока.

6 мл СНСС5042 и 6 мл СНСС16735 ON культур центрифугировали и каждый осадок ресуспендировали в 6 мл В-молока.

Две совместные культуры не центрифугировали. Их инокулировали непосредственно по 1% в 200 мл В-молока из предварительно инкубированных сокультур.

В качестве контроля СНСС4460 также непосредственно инокулировали по 1% в 200 мл В-молока из ночной культуры.

1. 1% СНСС4460 из ночной культуры

2. 1% СНСС4460/СНСС5042 из предварительно инкубированной сокультуры

3. 1% СНСС4460/СНСС16735 из предварительно инкубированной сокультуры

4. 1% СНСС4460, центрифугировали и ресуспендировали

5. 1% СНСС4460 + 1% СНСС5042, оба центрифугировали и ресуспендировали

6. 1% СНСС4460 + 1% СНСС 16735, оба центрифугировали и ресуспендировали

7. В-молоко - контроль

Результаты:

Результаты показаны на Фиг. 5 данного описания изобретения.

Предварительное инкубирование СНСС4460 с СНСС5042/СНСС16735 приводит к улучшенной подкисляющей активности по сравнению с инокулированием только СНСС4460 из ночной культуры.

Когда предварительно инкубированные сокультуры центрифугировали и ресуспендировали в В-молоке и из них инокулировали 1% в В-молоко, подкисляющая активность также увеличивалась по сравнению со штаммом СНСС4460, центрифугированным и ресуспендированном в молоке в качестве одноштаммовой культуры.

В предварительно инкубированной культуре СНСС4460 + СНСС16735 после ночного роста измеряли титр, который составлял 9×10⁴ клеток Bacillus. После инокуляции этой предварительной культуры и инкубирования в молоке в течение ночи (вторые сутки ферментации) измеряли титр, который составлял 1×10³ клеток Bacillus.

Выводы:

Результат, полученный в этом примере, дополнительно продемонстрировал описанный здесь положительный эффект совместного культивирования клеток Bacillus и LAB. Сильное увеличение подкисляющей активности наблюдается, когда клетки Bacillus предварительно инкубируют с S. thermophilus до того, как культуру использовали для инокуляции молока, независимо от того, используют эту сокультуру непосредственно для инокуляции или эту сокультуру центрифугируют и затем ресуспендируют в молоке перед инокуляцией (что исключает вынос ростовой среды в первые сутки).

ПРИМЕР 9: Совместная ферментация S. thermophilus с разными штаммами Bacillus - одностадийный способ ферментации по изобретению

Текстурный синергизм

Два штамма Bacillus из японского продукта Натто были выделены и депонированы, как СНСС18102 и СНСС18103. На чашках СНСС18102 был более вязким, чем СНСС18103, что указывало на продуцирование γ-PGA (поли-гамма-глутамат), полимера глутамата. Идея заключалась в том, что штаммы Bacillus могут вносить вклад в текстуру в молоке. Два штамма Bacillus инокулировали в молоко вместе со штаммом ST (СНСС 16404, медленно подкисляющий и продуцирующий глюкозу). Оба штамма инокулировали по 1% из промытых ночных культур. После подкисления в течение 24 часов в 1 мл В-молока определяли текстуру с помощью метода TADM на роботе Hamilton. Результаты ясно показали, что текстура отличалась, когда два штамма Bacillus были добавлены к ST в молоке, что показало явное увеличение текстуры при совместном подкислении молока этими двумя штаммами Bacillus.

В экспериментах по росту в минимальной среде СНСС18102 и СНСС18103 не росли на лактозе или глюкозе. Когда эти два штамма были добавлены в молоко вместе со Sweety ST, эти два штамма Bacillus не использовали выделенную глюкозу. Данные анализа (малые кислоты, летучие вещества, сахара) показали, что штаммы Bacillus не вносят существенного вклада в общий химический состав и метаболиты, продуцируемые в ферментированном молоке, поскольку штаммы Bacillus не показывают роста. СНСС18102 вносит больший вклад в текстуру, чем СНСС18103. Остается еще вопрос, каким образом штаммы Bacillus вносят вклад в текстуру ферментированного молока.

Авторы предполагают, что улучшенная текстура может быть обусловлена способностью Bacillus продуцировать γ-PGA, биопленку или усилением подкисления и роста ST.

Синергизм подкисления в молоке

Подкисление молока представляет собой важный фактор, поскольку более быстрое подкисление может сэкономить время производителя ферментированных молочных продуктов и/или появляется возможность продавать меньше бактерий с такой же активностью. Добавление разных штаммов Bacillus (OD 0,02) в молоко вместе с 0,024% заквасочной культуры (содержащей СНСС16404, ST-16731, ST-15757 и LBAbu16159) продемонстрировало благоприятные эффекты в отношении подкисления для 4 штаммов. Подкисление начиналось в холоде, что объясняет длительное время подкисления.

Важной временной точкой является "время до рН 4,55". Два штамма Bacillus, СНСС18102 и СНСС18103, оба достигают рН 4,55 быстрее, чем одна заквасочная культура. Самая быстрая культура с СНСС18102 достигала рН 4,55 на 45 минут раньше чистой заквасочной культуры. Культуры с СНСС18103 и СНСС15146 достигали рН 4,55 на 25 минут раньше чистой заквасочной культуры. Культура с СНСС15396 достигала рН 4,55 на 15 минут раньше чистой заквасочной культуры. Показано, что разные штаммы Bacillus могут быть полезными для заквасочной культуры в отношении подкисления.

В другом эксперименте штамм Bacillus, В. pumilus А650-3, выделенный из сырого молока, был способен стимулировать подкисляющую активность разных штаммов ST. Штаммы ST и штамм В. pumilis инокулировали 1% из ночной культуры.

Витамин К

Известно, что Bacillus subtilis "натто" продуцирует витамин K, особенно в ферментированном японском соевом продукте Натто. В этом эксперименте авторы изобретения добавляли два штамма Bacillus, выделенных из натто, вместе со штаммом ST (СНСС16404, тот же, что и в эксперименте по текстуре) или без него, в 200 мл молока на 24 часа при 37°C. Результаты показали, что оба штамма Bacillus могут продуцировать витамин K независимо от штамма ST. Уровень составлял 6-7 мкг/100 мл ферментированного молока для СНСС18102 и ~9 мкг/100 мл ферментированного молока для СНСС18103, см. Таблицу 2. Штаммы Bacillus продуцировали, главным образом, МK-4 и МK-7, а также небольшое количество K1 (MK-4, MK-7 и K1 являются разными типами витамина K). Штамм ST не вносит вклад в уровень витамина K.

Выводы:

Совместная инокуляция двух Натто-штаммов Bacillus с S. thermophilus (ST) имела несколько интересных результатов:

- Продуцирование витамина K в количестве 6-9 мкг/100 мл

ферментированного молока

- Улучшение характеристик текстуры в ферментированном молоке (значения TADM - 5500 Па против - 12000 Па)

- Увеличение скорости подкисления на 45 мин (время до рН 4,55)

Было показано, что штамм В. pumilus значительно стимулирует рост ST СНСС4895, тогда как один штамм В. pumilus не оказывает подкисляющего действия в молоке.

Ссылки

1. US 2009/0011081 A1.

2. US 5077063.

3. CN 103300147 A.

4. ROSSLAND, Е., LANGSRUD, Т. and SORHAUG, Т., 2005. Influence of controlled lactic fermentation on growth and sporulation of Bacillus cereus in milk. International journal of food microbiology, 103 (1), pp. 69-77.

5. The European Union (EU) European Food Safety Authority (EFSA) Panel on Biological Hazards (BIOHAZ) Scientific Opinion on the maintenance of the list of QPS biological agents intentionally added to food and feed (2013 update). The citation reference is "EFSA Journal 2013; 11(11):3449 [108 pp.]. doi:10.2903/j.efsa.2013.3449" и на дату подачи данной заявки он может быть загружен по следующей ссылке: http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/3449.pdf

1. Способ получения молочного продукта, ферментированного с помощью молочнокислых бактерий, включающий следующую стадию:

(а) ферментацию молока млекопитающего в течение 3-48 часов с помощью 10⁴-10¹² КОЕ/мл инокулированных молочнокислых бактерий (LAB) и 10⁴-10¹² КОЕ/мл инокулированных бактерий Bacillus в подходящих условиях при температуре от 22°С до 45°С до тех пор, пока ферментированное молоко не достигнет желательного значения рН от 3,5 до 5,5, и где начало ферментации молока посредством бактерий Bacillus происходит одновременно с началом LAB-ферментации молока; и

где инокулированные бактерии Bacillus на стадии (а) представляют собой по меньшей мере одну Bacillus, выбранную из группы, состоящей из: Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus aryabhattai, Bacillus atrophaeus, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus flexus, Bacillus fusiformis, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus methylotrophicus, Bacillus mojavensis, Bacillus pumilus, Bacillus safensis, Bacillus siamensis, Bacillus sonorensis, Bacillus simplex, Bacillus subtilis, Bacillus tequilensis и Bacillus vallismortis.

2. Способ по п. 1, где ферментированное молоко на стадии (а) достигает рН=4,5 быстрее, чем в сравнительном способе, выполненном в идентичных условиях, как в п. 1, за исключением того, что в сравнительном способе не производится никакой инокуляции молока бактериями Bacillus на стадии (а).

3. Способ по любому из пп. 1-2, где инокулированные бактерии Bacillus на стадии (а) п. 1 представляют по меньшей мере одну бактерию Bacillus, выбранную из группы, состоящей из Bacillus pumilus и Bacillus subtilis.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где инокулированные молочнокислые бактерии на стадии (а) п. 1 представляют собой по меньшей мере одну молочнокислую бактерию, выбранную из группы, состоящей из: Lactococcus spp., Streptococcus spp. и Lactobacillus spp.

5. Способ по п. 4, где инокулированные молочнокислые бактерии на стадии (а) представляют собой S. thermophilus.

6. Способ по п. 5, где инокулированные бактерии Bacillus на стадии (а) п. 1 представляют собой по меньшей мере одну бактерию Bacillus, выбранную из группы, состоящей из Bacillus pumilus и Bacillus subtilis.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где на стадии (а) используют от 10⁶ до 10¹⁰ КОЕ/мл инокулированных молочнокислых бактерий (LAB) и где на стадии (а) используют от 10⁵ до 10⁹ КОЕ/мл инокулированных бактерий Bacillus.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где подходящие условия на стадии (а) п. 1 включают температуру от 36°С до 38°С и

и где желательное значение рН на стадии (а) составляет от 4,4 до 4,6.

9. Способ по любому из пп. 1-8, где ферментированное молоко на стадии (а) п. 1 достигает рН=4,5 на один час быстрее, чем в сравнительном способе, выполненном в идентичных условиях, как в п. 1, за исключением того, что в сравнительном способе не производят инокуляцию молока бактериями Bacillus на стадии (а).

10. Способ по любому из пп. 1-9, где молоко на стадии (а) п. 1 представляет собой коровье молоко.

11. Способ по любому из пп. 1-10, где полученный с помощью молочнокислых бактерий молочный продукт по п. 1 представляет собой по меньшей мере один ферментированный молочный продукт, выбранный из группы, состоящей из: кефира, йогурта, сыра, сметаны, крема-фреша, кумыса, сквашенной пахты и ацидофильного молока.

12. Композиция для получения молочного продукта, ферментированного молочнокислыми бактериями, способом по п. 1, содержащая заквасочную культуру, содержащую по меньшей мере одну молочнокислую бактерию и по меньшей мере одну бактерию Bacillus, выбранную из группы, состоящей из: Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus aryabhattai, Bacillus atrophaeus, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus flexus, Bacillus fusiformis, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus methylotrophicus, Bacillus mojavensis, Bacillus pumilus, Bacillus safensis, Bacillus siamensis, Bacillus simplex, Bacillus sonorensis, Bacillus subtilis, Bacillus tequilensis и Bacillus vallismortis.

13. Применение бактерии Bacillus для получения молочного продукта, ферментированного молочнокислыми бактериями, включающее ферментацию молока млекопитающего в течение 3-48 часов с помощью 10⁴-10¹² КОЕ/мл инокулированных молочнокислых бактерий (LAB) и от 10⁴-10¹² КОЕ/мл инокулированных бактерий Bacillus в подходящих условиях при температуре от 22°С до 45°С до тех пор, пока ферментированное молоко не достигнет желательного значения рН от 3,5 до 5,5, и где начало ферментации молока посредством бактерий Bacillus происходит одновременно с началом LAB-ферментации молока; и

где бактерии Bacillus представляют собой по меньшей мере одну бактерию Bacillus, выбранную из группы, состоящей из: Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus aryabhattai, Bacillus atrophaeus, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus flexus, Bacillus fusiformis, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus methylotrophicus, Bacillus mojavensis, Bacillus pumilus, Bacillus safensis, Bacillus siamensis, Bacillus simplex, Bacillus sonorensis, Bacillus subtilis, Bacillus tequilensis и Bacillus vallismortis.