Способ штрихкодирования ампликонов при подготовке таргетных библиотек днк к массовому параллельному секвенированию

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетической инженерии. Предложен способ присоединения олигонуклеотидных штрихкодов к продуктам таргетной амплификации ДНК посредством формирования «липких» концов ампликонов с помощью Pfu ДНК-полимеразы. На первом этапе проводят дизайн праймеров для таргетной амплификации таким образом, чтобы 5'-конец каждого праймера содержал заданную последовательность из пяти нуклеотидов: 5'-TTCAG, далее, после проведения таргетной амплификации, полученные ампликоны обрабатывают Pfu ДНК-полимеразой в присутствии соответствующих дезоксирибонуклеозид-трифосфатов (дНТФ), затем по сформированным «липким» концам ампликона проводят лигирование штрихкода и одного из адаптеров, при этом лигирование второго адаптера к штрихкоду происходит в той же реакционной смеси с использованием выступающего конца, имеющего иную нуклеотидную последовательность, с помощью праймеров, комплементарных адаптерам, далее в ходе ПЦР проводят обогащение реакционной смеси целевыми последовательностями. Технический результат: расширение функциональных возможностей способа, повышение эффективности введения штрихкодов и снижение вероятности формирования побочных продуктов при подготовке таргетных ДНК-библиотек к массовому параллельному секвенированию. 2 ил., 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетической инженерии и может быть использовано для присоединения олигонуклеотидных штрихкодов к продуктам таргетной амплификации с целью их последующей идентификации в процессе исследования методами массового параллельного секвенирования.

Таргетное секвенирование является одним из наиболее востребованных приложений массового параллельного секвенирования. Оно позволяет проводить одновременный анализ целевых (таргетных) участков большого количества образцов ДНК. Для идентификации образцов ДНК в ходе анализа требуется введение специальных олигонуклеотидов – штрихкодов. Штрихкоды присоединяют к продуктам амплификации целевых участков ДНК – ампликонам – в процессе подготовки таргетной библиотеки.

Известен способ присоединения штрихкодов к продуктам таргетной амплификации ДНК путём проведения реакции лигирования по «тупым» концам. Способ имеет крайне низкую специфичность, в результате чего нарабатывается широкий спектр разнообразных побочных продуктов.

Известен способ кодирования продуктов ПЦР в реальном времени с помощью комбинаций замещающих зондов разного цвета для одной целевой последовательности, комплементарных одной общей последовательности с тушителем. При обнаружении в реакционной смеси детектируемой последовательности регистрируется комбинация цветового сигнала, по которой и определяется результат реакции [1] Однако недостатками этого способа являются невысокая мультиплексируемость (до 15 вариантов, по мнению авторов) и необходимость синтеза нескольких меченых олигонуклеотидов для одной детектируемой последовательности.

Известен способ штрихкодирования ампликонов путем осуществления дополнительных циклов полимеразной цепной реакции (ПЦР) [2]. Штрихкодирование данным способом требует применения длинных олигонуклеотидов с последовательностями, частично гомологичными каждому ампликону. Использование длинных олигонуклеотидов создаёт риск побочных реакций, а проведение дополнительных циклов ПЦР повышает вероятность возникновения и/или накопления ошибок.

Таким образом, разработка новых способов раздельного определения множества нуклеотидных последовательностей в одном образце является актуальной для молекулярной биологии. Особенно важно это для генотипирования, когда требуется в одном образце выявить наличие множества мутаций в виде однонуклеотидных замен, делеций, инсерций и т.д.

Известен способ одновременной детекции множества последовательностей нуклеотидов при проведении одной полимеразной цепной реакции, заключающийся в том, что готовят реакционную смесь, добавляют в нее специфичные для каждой детектируемой последовательности прямые праймеры нескольких видов с разными метками, кодирующие соотношением их количества вид детектируемой последовательности, и один вид обратного праймера для каждой детектируемой последовательности, проводят амплификацию, гибридизацию полученных ампликонов с закрепленными на разных участках поверхности олигонуклеотидами, где каждый отдельный участок поверхности содержит олигонуклеотиды, комплементарные только ампликонам с одной детектируемой последовательности, считывание сигнала с меток на ампликонах, расположенных на одном участке поверхности, и идентификацию разных детектируемых последовательностей нуклеотидов по соотношению сигналов различных меток, которое повторяет соотношение количеств меченных разными метками прямых праймеров в исходной реакционной смеси [3]

Недостатками известного способа являются трудоемкость и недостаточная эффективность.

Наиболее близким к заявленному способу – прототипом, является способ штрихкодирования ампликонов, который заключается в амплификации целевых участков ДНК, создании выступающих («липких») T-A-концов и дальнейшем лигировании олигонуклеотидных штрихкодов по выступающим T-A-концам [4].

Недостатком прототипа является зависимость процесса аденилирования (формирования A-конца) от структуры праймеров, используемых для таргетной амплификации, что может привести к существенному снижению выхода продукта лигирования [5]. Кроме того, данный способ не позволяет одновременно со штрихкодами ввести необходимые для последующего секвенирования адаптеры, что требует проведения дополнительной операции.

Задачей настоящего изобретения является создание нового способа штрихкодирования ампликонов при подготовке таргетных библиотек ДНК к массовому параллельному секвенированию.

Техническим результатом настоящего изобретения является расширение функциональных возможностей способа, повышение эффективности введения штрихкодов и снижение вероятности формирования побочных продуктов при подготовке таргетных ДНК-библиотек к массовому параллельному секвенированию.

Поставленная задача достигается способом, который заключается в следующем.

На первом этапе проводят дизайн праймеров для таргетной амплификации таким образом, чтобы 5'-конец каждого праймера содержал заданную последовательность из пяти нуклеотидов: 5'-TTCAG. Эта последовательность необходима для формирования «липких» концов и последующего лигирования штрихкодов и адаптеров.

Далее, после проведения таргетной амплификации, полученные ампликоны обрабатывают Pfu ДНК-полимеразой в присутствии соответствующих дезоксирибонуклеозид-трифосфатов (дНТФ). Pfu-полимераза обладает 3'-экзонуклеазной активностью, с помощью которой она отщепляет несколько 3'-концевых нуклеотидов у каждого ампликона. Если в реакционной смеси присутствуют соответствующие дНТФ, то фермент за счёт своей полимеразной активности начинает снова включать нуклеотиды в цепь взамен отщеплённых, так, что в системе устанавливается равновесие между процессами отщепления и обратного включения нуклеотидов в цепь (при условии избытка соответствующих дНТФ в реакционной смеси).

В данном случае реакционная смесь содержит dTTP и dCTP. Как только происходит отщепление dC (или dT) в ходе последовательного 3'-экзонуклеазного расщепления цепи, полимераза немедленно включает dC (или dT) обратно в исходное положение. Таким образом, 3'-экзонуклеазное расщепление прекращается в заданном положении, что приводит к формированию «липкого» конца, имеющего структуру 5'-TTC. Подобный подход был описан ранее для лигазно-независимого клонирования [4].

Затем по сформированным «липким» концам ампликона проводят лигирование штрихкода и одного из адаптеров. Лигирование второго адаптера к штрихкоду происходит в той же реакционной смеси с использованием выступающего конца, имеющего иную нуклеотидную последовательность.

На заключительном этапе с помощью праймеров, комплементарных адаптерам, в ходе ПЦР проводят обогащение реакционной смеси целевыми последовательностями.

На фиг. 1 представлена схема штрихкодирования ампликонов при подготовке таргетных библиотек ДНК к массовому параллельному секвенированию.

Предлагаемый способ штрихкодирования имеет ряд преимуществ. Во-первых, связывание штрихкода с ампликоном с использованием «липких» концов является весьма эффективным. Во-вторых, представленный способ требует минимального молярного избытка штрихкодов и адаптеров в реакционной смеси, что снижает вероятность протекания побочных реакций. В-третьих, универсальный набор коротких штрихкодирующих нуклеотидных последовательностей может быть создан один раз и использован для штрихкодирования большого количества таргетных библиотек, что существенно снижает стоимость процедуры подготовки библиотек. Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Выполняли дизайн праймеров для таргетной амплификации участков генов человека BRCA1 (5'-TTCAGCAATTCCTTGTCACTCAGACCAACT-3' и 5'-TTCAGAAATGTTCTGCTAGCTTGTTTTCTTCAC-3'),

BRCA2 (5'-TTCAGCCCTATTGCATATTTCTTCATGTGACCA-3' и 5'-TTCAGCTTTACTGCAAGAATGCAGTCTGTA-3') и CFTR (5'-TTCAGACATGCAACTTATTGGTCCCACT-3' и 5'-TTCAGTGTTTGGAGTTGGATTCATCCT-3').

Осуществляли ПЦР с использованием указанных праймеров в термоциклере БИС-Н, модель М111-02 (Россия) при следующих условиях: начальная денатурация – 3 мин. при 95°C, далее 30 циклов: денатурация – 10 с при 95°C, гибридизация праймеров – 20 с при 60°C, элонгация цепей – 40 с при 72°C. Реакционная смесь объёмом 25 мкл содержала 10 нг геномной ДНК человека; 400 нМ каждого праймера; 320 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата; 3 мМ MgCl₂; 16 мМ (NH₄)₂SO₄; 67 мМ Tris-HCl (pH = 8,8); 1 единицу активности Taq ДНК-полимеразы.

Реакционную смесь после проведения ПЦР очищали с помощью магнитных частиц Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, США) согласно рекомендациям производителя. Очищенные продукты таргетной амплификации растворяли в воде объёмом 22,5 мкл.

Полученные ампликоны обрабатывали Pfu-полимеразой. К 22,5 мкл смеси ампликонов добавляли 0,5 мкл Pfu-полимеразы, содержащей 2 единицы активности в 1 мкл, 6 мкл 5х буфера для Pfu-полимеразы, и 1 мкл смеси dTTP и dCTP (25 мМ каждого). Полученную смесь объёмом 30 мкл инкубировали при 70°C в течение 10 мин.

Структуры использованных адаптеров и штрихкода приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Адаптер A	5’- CCATCTCATCCCTGCGTGTCT -3’ 3’-TTGGTAGAGTAGGGACGCACAGAGGC-5’
Штрихкод	5’-CCGACTCAGAAGAGGATTC -3’ 3’- TGAGTCTTCTCCTAAGAAG-5’
Адаптер P1	5’-GAAATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT-3’ 3’- TAGTCCGTGACGGGTATCTCTCCTTTCGCCTCCGCATCACC -5’

Реакционную смесь очищали с помощью магнитных частиц Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, США) согласно рекомендациям производителя. Очищенные продукты растворяли в 15 мкл воды.

Лигирование штрихкода и адаптеров к полученным ампликонам с «липкими» концами осуществляли следующим образом. К 15 мкл раствора ампликонов добавляли 2 мкл ДНК-лигазы T4 (250 единиц активности в мкл), 1 мкл полинуклеотидкиназы T4 (2 единицы активности в мкл), 3 мкл 10х буфера для ДНК-лигазы, 3 мкл 0,2 мкМ раствора штрихкода, 3 мкл 0,2 мкМ раствора адаптера A и 3 мкл 0,2 мкМ раствора адаптера P1. Полученную смесь объёмом 30 мкл инкубировали при 37°C в течение 20 мин.

Реакционную смесь очищали с помощью магнитных частиц Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, США) согласно рекомендациям производителя. Очищенные продукты растворяли в 50 мкл воды.

Для повышения концентрации целевых последовательностей проводили обогащение с использованием праймеров A (5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3') и P1 (5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG-3') в термоциклере БИС-Н, модель М111-02 (Россия) при следующих условиях: начальная денатурация – 3 мин. при 95°C, далее 15 циклов: денатурация – 10 с при 95°C, гибридизация праймеров – 20 с при 58°C, элонгация цепей – 40 с при 72°C. Реакционная смесь объёмом 25 мкл содержала 2 мкл очищенного продукта лигирования; 400 нМ каждого праймера; 320 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата; 3 мМ MgCl₂; 16 мМ (NH₄)₂SO₄; 67 мМ Tris-HCl (pH = 8,8); 1 единицу активности Taq ДНК-полимеразы.

В завершение полученную ДНК-библиотеку очищали с помощью магнитных частиц Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, США) согласно рекомендациям производителя. Очищенные продукты растворяли в 25 мкл воды.

Результаты электрофоретического разделения продуктов таргетной амплификации в 2%-ном агарозном геле до и после штрихкодирования показаны на фиг. 2. Номером 1 обозначены продукты таргетной амплификации до штрихкодирования, номером 2 – после введения штрихкода. Длина продуктов в результате штрихкодирования изменилась на величину, соответствующую суммарной длине штрихкода и адаптеров.

Пример 2.

Процесс штрихкодирования, описанный в примере 1, повторяли с ампликоном, полученным в результате таргетной амплификации участка гена CFTR человека с помощью праймеров 5'-TTCAGCCTTTTGTAGGAAGTCACCAAAGCA-3' и 5'-TTCAGTACCAGCTCACTACCTAATTTATGACATT-3'.

Результаты электрофоретического разделения продуктов таргетной амплификации в 2%-ном агарозном геле до и после штрихкодирования представлены на фиг. 2, где под номерами 3 (до штрихкодирования) и 4 (после штрихкодирования).

Пример 3.

Процесс штрихкодирования, описанный в примере 1, повторяли с ампликонами, полученными в результате таргетной амплификации двух участков гена BRCA2 человека. Для амплификации использовали пары праймеров:

5'-TTCAGTGTCCCAGTTGGTACTGGAAATC-3' и 5'-TTCAGCTGGTGATTTCACTAGTACCTTGCTC-3'; 5'-TTCAGACGCTGATGAATGTGAAAAATCTAAAAACC-3' и 5'-TTCAGTTCTCTGTGTCTAATAGGTCTTTTTCTGA-3'.

Результат представлен на фиг. 2 под номерами 5 (до штрихкодирования) и 6 (после штрихкодирования).

Таким образом, заявляемый способ является универсальным и может быть использован для подготовки таргетных библиотек для любой платформы для проведения массового параллельного секвенирования (IonTorrent, Illumina и др.), а также может быть легко модифицирован для использования в роботизированных системах. Использование данного способа позволит существенно снизить вероятность формирования побочных продуктов в ходе штрихкодирования и повысить эффективность процесса.

Источники информации

1. Huang Q, Zheng L, Zhu Y, Zhang J, Wen H, et al. (2011) Multicolor Combinatorial Probe Coding for Real-Time PCR. PLoS ONE 6(1): e16033. doi:10.1371/journal.pone.0016033.

2. Parameswaran P, Jalili R, Tao L, Shokralla S, Gharizadeh B, Ronaghi M, Fire AZ. A pyrosequencing-tailored nucleotide barcode design unveils opportunities for large-scale sample multiplexing. Nucleic Acids Res. 2007;35:e130.

3. Патент RU 2644262C1, опубл. 08.02.2018.

4. Vigneault F, Sismour AM, Church GM. Efficient microRNA capture and bar-coding via enzymatic oligonucleotide adenylation. Nat Methods 2008;5:777–779.

5. Brownstein MJ, Carpten JD, Smith JR. Modulation of Non-Templated Nucleotide Addition by Taq DNA Polymerase: Primer Modifications that Facilitate Genotyping. Biotechnique 1995;20:1004–1010.

6. Aslanidis C, De Jong PJ. Ligation independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 1990;18: 6069–6074.

Способ штрихкодирования ампликонов при подготовке таргетных библиотек ДНК к массовому параллельному секвенированию, включающий подготовку реакционной смеси и проведение таргетной амплификации, отличающийся тем, что на первом этапе проводят дизайн праймеров для таргетной амплификации таким образом, чтобы 5'-конец каждого праймера содержал заданную последовательность из пяти нуклеотидов: 5'-TTCAG, далее, после проведения таргетной амплификации, полученные ампликоны обрабатывают Pfu ДНК-полимеразой в присутствии соответствующих дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дНТФ), затем по сформированным «липким» концам ампликона проводят лигирование штрихкода и одного из адаптеров, лигирование второго адаптера к штрихкоду проводят в той же реакционной смеси с использованием выступающего конца, имеющего иную нуклеотидную последовательность, с помощью праймеров, комплементарных адаптерам, далее в ходе ПЦР проводят обогащение реакционной смеси целевыми последовательностями.