Генетическая кассета, содержащая кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности генов trail, pten и ifnβ-1, и фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний

Изобретения относятся к области биотехнологии, конкретно к генотерапевтическим лекарственным препаратам на основе белков с противоопухолевым и иммуномодулирующим эффектами, и могут быть использованы для лечения онкологических заболеваний человека. Предложена генетическая кассета, содержащая кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1, представленные SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 соответственно, разделенные нуклеотидной последовательностью из ряда P2А, или E2А, или F2А, или T2А пептида, для экспрессии генов, кодирующих белки TRAIL, PTEN и IFNβ-1, с возможностью использования в лентивирусном эукариотическом экспрессионном векторе. Также предложена фармацевтическая композиция для лечения онкологического заболевания человека, содержащая мезенхимные стволовые клетки, полученные от пациентов с онкологическим заболеванием, экспрессирующие генетическую кассету TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1, TRAIL-E2A-PTEN-E2A-IFNβ-1, TRAIL-F2A-PTEN-F2A-IFNβ-1 или TRAIL-T2A-PTEN-T2A-IFNβ-1 в эффективном количестве. 2 н.п. ф-лы, 4 ил.

 

Генетическая кассета, содержащая кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1, и фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а конкретно к генотерапевтическим лекарственным препаратам, более точно к кодон-оптимизированным нуклеотидным последовательностям генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1, разделенные последовательностью 2А пептидов, генетическим кассетам, содержащим кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1, и фармацевтической композиции для лечения онкологических заболеваний человека.

Далее в целях исключения неоднозначного понимания текста заявителем приведены использованные в заявочном материале термины и их расшифровка:

Иммуномодулирующая активность — способность какого-либо вещества, в частности белка, регулировать работу иммунной системы человека;

кДНК — комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота;

МКПК — мононуклеарные клетки периферической крови человека;

мРНК — матричная рибонуклеиновая кислота;

МСК — мезенхимные стволовые клетки;

Противоопухолевая активность — способность какого-либо вещества, в частности белка, вызывать гибель опухолевых клеток;

Секретировать — способность клеток организма выводить какие-либо вещества, в частности белки, за пределы клетки.

Саморасщепляющиеся 2А пептиды — класс пептидов длиной 18–22 аминокислот, которые располагаются между двумя целевыми пептидами и обеспечивают их расщепление друг от друга во время синтеза белка путем рибосомного скиппинга.

E2A — саморасщепляющийся 2А пептид из equine rhinitis virus, применяющийся для соединения двух генов в одну генетическую кассету.

F2A — саморасщепляющийся 2А пептид из foot-and-mouth disease virus, применяющийся для соединения двух генов в одну генетическую кассету.

IFNβ-1 — ген, кодирующий интреферон бета 1.

P2A — саморасщепляющийся 2А пептид из porcine teschovirus-1, применяющийся для соединения двух генов в одну генетическую кассету.

PTEN — ген, кодирующий фосфатазу с двойной субстратной специфичностью.

T2A — саморасщепляющийся 2А пептид из thosea asigna virus, применяющийся для соединения двух генов в одну генетическую кассету.

TRAIL — ген, кодирующий апоптоз-индуцирующий лиганд семейства факторов некроза опухоли.

Заявленное техническое решение основывается на идее того, что использование генетической кассеты на основе кодон-оптимизированных нуклеотидных последовательностей генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1 может послужить для модификации мезенхимных стволовых клеток человека, способных избирательно мигрировать в места опухолей. После чего модифицированные мезенхимные стволовые клетки человека обретают способность секретировать и доставлять белки с ранее показанной противоопухолевый или иммуномодулирующей активностью, таким образом оказывая комбинированный терапевтический эффект за счет индукции (запуска процесса) гибели опухолевых клеток пациента, а также стимуляции клеток иммунной системы пациента на борьбу с опухолью.

Указанный технический результат становится возможным вследствие использования комбинации терапевтических белков TRAIL, PTEN и IFNβ-1, обладающих противоопухолевой и иммуномодулирующей активностью, и использования мезенхимных стволовых клеток (далее - МСК) в качестве средства доставки, при этом следует обратить внимание на то, что МСК обладают природной способностью мигрировать в место локализации опухоли в ответ на выделенные опухолью в межклеточное пространство белки, такие как например интерлейкин-6 или фактор роста фибробластов и т.д.

Указанный подход основан на идее того, что мезенхимные стволовые клетки способны после введения в организм пациента мигрировать в место расположения опухоли и секретировать там терапевтические белки способные угнетать опухолевые клетки.

При этом следует обратить внимание на то, что описанный выше эффект может быть использован за счет комбинации различных белков с прямым и опосредованным (иммуномодуляция) противоопухолевыми эффектами, для лечения широкого спектра злокачественных новообразований.

Заявленное техническое решение предоставляет возможность решить проблему сложности подбора препаратов для лечения пациентов от различных видов злокачественных опухолей, за счет возможности в целом целенаправленного комбинирования различных терапевтических агентов, для направленного лечения широкого спектра онкозаболеваний а также позволит повысить терапевтический эффект за счет целевой доставки терапевтических белков в места локализации опухолей, что позволяет сделать логически обоснованный вывод о соответствии заявленного технического решения не только критерию мировая новизна, но и критерию изобретательский уровень, вследствие того, что, в соответствии с заявленным техническим решением мезенхимные стволовые клетки, будучи трансдуцированными генетическим вектором, содержащим генетическую кассету с кодон-оптимизированными нуклеотидными последовательностями генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1, обеспечивают возможность эффективной целевой доставки комбинации различных терапевтических агентов в место расположения опухолей.

Таким образом, краткая сущность заявленного технического решения заключается в разработке кодон-оптимизированных нуклеотидных последовательностей, кодирующих гены TRAIL, PTEN и IFNβ-1, а также мультицистронных кассет TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1, TRAIL-E2A-PTEN-E2A-IFNβ-1, TRAIL-F2A-PTEN-F2A-IFNβ-1, TRAIL-T2A-PTEN-T2A-IFNβ-1, созданных на основе генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1, для терапии онкологических заболеваний человека различной этиологии.

Входящие в состав описанных выше генетических кассет гены кодируют следующие белки:

- ген TRAIL кодирует белок апоптоз-индуцирующий лиганд семейства факторов некроза опухоли,

- ген PTEN кодирует белок фосфатазу с двойной субстратной специфичностью,

- ген IFNβ-1 кодирует цитокин интерферон бета 1.

При этом следует обратить особое внимание на то, что гены, входящие в состав мультицистронных кассет TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1, TRAIL-E2A-PTEN-E2A-IFNβ-1, TRAIL-F2A-PTEN-F2A-IFNβ-1, TRAIL-T2A-PTEN-T2A-IFNβ-1, разделяются последовательностями, кодирующими саморасщепляющиеся белки P2A, E2A, F2A или T2A, которые и позволяют собственно достичь синтеза трех отдельных белков с одной кассеты с тремя генами за счет своей способности к саморасщеплению.

На дату подачи заявленного технического решения в России и мире существует проблема существенного роста новых случаев выявления у человека злокачественных образований.

Онкологические заболевания занимают второе место среди причин смертности и инвалидизации населения во всем мире после сердечно-сосудистых заболеваний. По данным официальной статистики онкологические заболевания являются одними из самых распространенных причин заболеваемости и смертности в мире, и в скором времени могут даже обогнать сердечно-сосудистые заболевания. Число новых случаев злокачественных новообразований продолжает расти с каждым годом. В 2018 году в Российской Федерации было выявлено более 600 тыс. случаев злокачественных новообразований, что на 1,2% выше по сравнению с показателями 2017 года [Каприн, А.Д., с соавт., Состояние онкологической помощи населению России в 2018 году. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2019. – илл. – 236 с. ISBN 978-5-85502-250-6].

При этом основными методами терапии онкологических заболеваний остаются химиотерапевтические препараты, недостатком которых является низкая специфичность действия, а также высокая системная токсичность, что обусловливает тяжелые побочные эффекты в виде повреждения здоровых клеток и тканей организма, что может привести к летальным последствиям.

На основании вышеизложенного можно сделать вывод, что существует проблема разработки новых более безопасных и эффективных метод терапии онкологических заболеваний с использованием клеток и белков человека. Однако большинство генно-инженерных подходов не показывают ожидаемой эффективности в клинических испытаниях на человеке и лишь несколько генно-клеточных препаратов на дату представления заявочных материалов официально разрешены для лечения пациентов с онкологическими заболеваниями (некоторые из одобренных препаратов описаны заявителем далее в исследовании уровня техники).

В существующих на сегодняшний день препаратах или аналогах для достижения терапевтического эффекта обычно используется один белок с противоопухолевым или иммуномодулирующим эффектом, и вследствие этого, по мнению заявителя, такие противоопухолевые препараты не показывают ожидаемой эффективности, либо оказываются эффективны только для лечения ограниченного числа опухолей. Поэтому заявителем было принято решение совместить сразу три белка с противоопухолевой и иммуномодулирующей активностью, чтобы увеличить терапевтическую эффективность и расширить спектр онкологических заболеваний, для которых может быть использован препарат, повысив тем самым эффективность применения по назначению заявленной фармацевтической композиции для лечения онкологических заболеваний человека. В заявленном техническом решении для достижения заявленной терапевтической цели обеспечивается совместная доставка трех белков с противоопухолевым и иммуномодулирующим терапевтическим эффектом, объединенных в генетическую кассету за счет использования в заявленном техническом решении общеизвестного как такового способа (метода), такого как разделение последовательностей 2А пептидами, описанного в источнике [Li et al., Effects of different 2A peptides on transgene expression mediated by tricistronic vectors in transfected CHO cells, 2020, 47 (1): p.469-475].

Для этого заявителем предложено использование мультицистронных генетических кассет, где три гена TRAIL, PTEN и IFNβ-1 объединяются через последовательности P2A, E2A, F2A или T2A, что в итоге объединения обеспечивается возможность получения заявленных мультицистронных кассет TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1, TRAIL-E2A-PTEN-E2A-IFNβ-1, TRAIL-F2A-PTEN-F2A-IFNβ-1, TRAIL-T2A-PTEN-T2A-IFNβ-1.

Такая генетическая кассета обеспечивает совместную доставку и совместный синтез трех различных терапевтических белков, которые в результате совместного синергетического воздействия обеспечивают не известный ранее эффект, а именно возможность совместной доставки белков в место локализации опухоли. После доставки этих белков (TRAIL, PTEN и IFNβ-1) в место локализации опухоли, возникает терапевтический эффект, а именно наблюдается одновременно:

- прямая индукция гибели опухолевых клеток,

- стимуляция клеток иммунной системы пациента на борьбу с опухолью, т.е. в заявленном техническом решении явно наблюдается создание сверхсуммарного технического эффекта, что по мнению заявителя является неочевидным для специалиста и дополнительно доказывает соответствие заявленного технического решения критерию изобретательский уровень.

Выбор генов для включения в генетическую кассету обоснован их известными в целом терапевтическими эффектами. В одних из ранних исследований МСК со сверхэкспрессией интерферона бета (IFN-beta) вводили мышам с ксенотрансплантантами меланомы человека, что привело к снижению роста опухоли и увеличению продолжительности жизни мышей в 2 раза по сравнению с контрольной группой [Studeny, M., et al., Bone marrow-derived mesenchymal stem cells as vehicles for interferon-beta delivery into tumors. Cancer Res, 2002. 62 (13): p. 3603-8].

Одним из наиболее перспективных терапевтических проапототических цитокинов является TNF-связанный апоптоз-индуцирующий лиганд TRAIL (англ. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand), который избирательно вызывает апоптоз опухолевых клеток.

Противоопухолевый эффект TRAIL-модифицированных МСК описан для разных типов опухолей.

TRAIL не цитотоксичен для нормальных клеток и тканей млекопитающих (Szegezdi, E., et al., Stem cells are resistant to TRAIL receptor-mediated apoptosis. J Cell Mol Med, 2009. 13(11-12): p. 4409-14. doi:10.1111/j.1582-4934.2008.00522.x; Yuan, Z., et al., Mesenchymal stromal cell delivery of full-length tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand is superior to soluble type for cancer therapy. Cytotherapy, 2015. 17: p. 885–896. doi: 10.1016/j.jcyt.2015.03.603).

Фосфотаза PTEN (англ. Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10) является одним из основных супрессоров опухолей в организме человека. Yang с соавторами показали, что МСК, экспрессирующие PTEN, способны к целевой миграции к опухолевым клеткам глиобластомы DBTRG в ко- культуре in vitro (Yang et al., 2014).

Также описана противоопухолевая активность PTEN-модифицированных МСК в ко- культуре с клетками глиомы U251 in vitro (Guo, X.R., et al., PTEN-mRNA engineered mesenchymal stem cell-mediated cytotoxic effects on U251 glioma cells. Oncol. Lett, 2016. 11: p. 2733–40. doi: 10.3892/ol.2016. 4297).

Заявленное техническое решение при более детальном рассмотрении заключается в разработке кодон-оптимизированных нуклеотидных последовательностей, кодирующих генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1 и их сочетаний в виде генетической кассеты, для получения заявленной фармацевтической композиции.

Использование генетической кассеты, кодирующей кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1, позволяет обеспечить комбинированный противоопухолевый и иммуномодулирующий эффект в месте расположения опухоли. Указанное доказано заявителем в эксперименте, результаты которого приведены на Фиг.3 и Фиг.4, соответственно. На Фиг.3 показана противоопухолевая активность заявленной фармацевтической композиции относительно клеток нейробластомы (подавление деления на 30%) и аденокарциномы легкого (подавление деления на 15%). На Фиг.4 показана иммуномодулирующая активность заявленной фармацевтической композиции - после добавления заявленной фармацевтической композицией в клетки здорового человека число иммунных клеток, обладающих противоопухолевой активностью, увеличилось на 50%. Указанное является доказательством достижения поставленных целей в заявленном техническом решении.

Заявителем проведен анализ существующего уровня техники по научной и патентной информации в области генно-клеточной терапии онкологических заболеваний и выявлен ряд аналогов, которые используются в настоящее время для лечения различных онкологических заболеваний человека.

Из исследованного уровня техники выявлен ряд функциональных аналогов (по назначению), применяющихся для лечения на дату представления заявленных материалов известных в мире онкологических заболеваний человека.

Из исследованного уровня техники выявлен способ лечения онкологических заболеваний по патенту РФ № 2390558 «Мигрирующие в опухоль клетки, сконструированные с помощью опосредованного аденовирусом переноса гена, для получения лиганда (TRAIL), индуцирующего апоптоз с участием фактора некроза опухоли». Сущностью известного технического решения является способ лечения онкологических заболеваний человека, основывающийся на внутривенном введении гемопоэтических клеток CD34+, трансдуцированных лигандом, индуцирующим апоптоз с участием фактора некроза опухоли. Способ по п. 1 представляет собой мигрирующие в опухоль клетки, трансдуцированные лигандом, индуцирующим апоптоз с участием фактора некроза опухоли, при условии, что указанные мигрирующие в опухоль клетки не являются дендритными клетками. Способ, где клетки по п. 1, выбранные из гемопоэтических клеток CD34⁺ из периферической крови раковых пациентов, леченных фактором роста; NK-клеток из периферической крови; цитокин-индуцированных клеток-киллеров (CIK), полученных путем культивирования ex vivo мононуклеарных клеток периферической крови; эндотелиальных клеток и эндотелиальных клеток-предшественников; инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL); лимфокин-активированных клеток-киллеров (LAK); макрофагов; мезенхимных стволовых клеток (MSC). Способ, где клетки по п. 2, можно получить путем трансдукции NK-клеток или клеток CD34+ аденовирусными векторами, кодирующими лиганд, индуцирующий апоптоз с участием фактора некроза опухоли. Способ, где клеточные препараты, содержат клетки по пп.1-3 в смеси с физиологически приемлемыми носителями. Способ, где клетки по пп.1-3 применяются для приготовления лекарственного средства для лечения опухолей. Способ, где клетки по п. 5 применяются для лечения лимфомы или рака молочной железы. Способ, где лекарственное средство для применения по пп.5, 6 или 7 вводят внутривенно.

Таким образом, в изобретении в целом описывается метод лечения онкологических заболеваний человека с использованием мигрирующих в опухоль клеток, в частности, CD34⁺ клеток, трансдуцированных аденовирусом, экспрессирующим лиганд (TRAIL), индуцирующий апоптоз с участием фактора некроза опухолей, и их использование в противоопухолевой терапии. Предполагается, что введение таких клеток позволит избирательно индуцировать гибель опухолевых клеток, в частности, клеток лимфомы и рака молочной железы.

Существенным недостатком данного метода является то, что авторы заявляют клетки CD34+, как способные мигрировать в опухоль, однако описанные клетки представляют собой смесь различных клеток иммунной системы, не все из которых способны обладают способностью к направленной миграции, особенно в места опухоли. Кроме того, авторы используют клетки, модифицированные аденовирусом, кодирующим один белок TRAIL. Однако известно, что не все клетки чувствительны к индукции апоптоза с помощью TRAIL, поэтому использование известного технического решения ограничено для опухолей, чувствительных к TRAIL, и не может рассматриваться как универсальный подход для терапии онкологических заболеваний в целом.

Предотвратить описанные выше недостатки позволит заявленная группа изобретений, а именно - использование генетической кассеты, которая состоит из кодон-оптимизированных генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1 в соответствии с 1 пунктом формулы изобретения, совместно с фармацевтической композицией по 2 пункту формулы заявленного изобретения, что позволяет модифицировать мезенхимные стволовые клетки преимущественно самих пациентов с онкологическими заболеваниями, после чего, полученные клетки будут избирательно мигрировать в места опухолей и выделять три белка с различными противоопухолевыми и иммуномодулирующими свойствами, которые кодируют гены, входящие в состав генетической кассеты по 1 пункту формулы заявленного технического решения.

Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту РФ № 2718542 «Лечение злокачественной опухоли с использованием химерного рецептора антигена против CD19». Сущностью известного технического решения является способ лечения онкологических заболеваний иммунной системы человека, основывающийся на внутривенном введении клеток, которая экспрессирует молекулу CAR, которая связывает CD19, в комбинации с ингибитором киназ. Композиция по п. 1, содержащая клетку (например, популяцию клеток), которая экспрессирует молекулу CAR , которая связывает CD19 ("CAR19-экспрессирующая клетка"), для применения в комбинации с одним или несколькими ингибиторами киназ для лечения млекопитающего, имеющего заболевание, ассоциированное с экспрессией CD19, где ингибитор киназы выбран из ингибитора тирозинкиназы Брутона (BTK), ингибитора циклин-зависимой киназы 4 (CDK4), ингибитора mTOR или ингибитора киназы, взаимодействующей с митоген-активируемой протеинкиназой (MNK). Способ лечения млекопитающего по п. 2, имеющего заболевание, ассоциированное с экспрессией CD19, включающий введение млекопитающему эффективного количества клеток (например, популяции клеток), которые экспрессируют молекулу CAR, которая связывает CD19 (CAR19-экспрессирующие клетки), в комбинации с одним или несколькими ингибиторами киназ для лечения млекопитающего, имеющего заболевание, ассоциированное с экспрессией CD19, где ингибитор киназы выбран из ингибитора тирозинкиназы Брутона (BTK), ингибитора циклин-зависимой киназы 4 (CDK4), ингибитора mTOR или ингибитора киназы, взаимодействующей с митоген-активируемой протеинкиназой (MNK). Применение или способ по п.1 или 2, где ингибитор киназы и CAR19-экспрессирующую клетку вводят млекопитающему в качестве терапии первой линии. Применение или способ по п.1 или 2, где CAR19-экспрессирующую клетку вводят млекопитающему после введения ингибитора киназы. Применение или способ по п.4, где: (i) CAR19-экспрессирующую клетку вводят после прекращения введения ингибитора киназы; или (ii) введение ингибитора киназы начинают до введения CAR19-экспрессирущей клетки, и CAR19-экспрессирующую клетку вводят в комбинации с продолжающимся введением ингибитора киназы. Применение или способ по любому из пп.1-4, где млекопитающее является или идентифицировано как являющееся полностью или частично отвечающим на ингибитор BTK (например, ибрутиниб), или полностью или частично отвечающим на CAR19-экспрессирующую клетку. Применение или способ по любому из пп.1-6, где ингибитор BTK выбран из ибрутиниба, GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774 или LFM-A13. Применение или способ по любому из пп.1-6, где ингибитор CDK4 выбран из: палбоциклиба, алоизина A, флавопиридола, 2-(2-хлорфенил)-5,7-дигидрокси-8-[(3S,4R)-3-гидрокси-1-метил-4-пиперидинил]-4-хроменона; кризотиниба (PF-02341066, P276-00, RAF265, индисулама, росковитина, динациклиба, BMS 387032, MLN8054, AG-024322, AT7519, AZD5438, BMS908662 или рибоциклиба. Применение или способ по любому из пп.1-6, где ингибитор mTOR выбран из: рапамицина, аналога рапамицина, такого как эверолимус, темсиролимус, ридафоролимус, семапимод, AZD8055, PF04691502, SF1126, XL765 или OSI-027. Применение или способ по любому из пп.1-6, где ингибитор MNK выбран из: CGP052088, CGP57380, церкоспорамида, ETC-1780445-2 или 4-амино-5-(4-фторанилино)пиразолo[3,4-d]пиримидина. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, где ингибитор киназы представляет собой ибрутиниб, и доза ибрутиниба составляет приблизительно 250 мг, 300 мг, 350 мг, 400 мг, 420 мг, 440 мг, 460 мг, 480 мг, 500 мг, 520 мг, 540 мг, 560 мг, 580 мг или 600 мг каждые сутки. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, где клетка экспрессирует молекулу CAR, содержащую связывающий CD19 домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен. Применение или способ по п.12, где внутриклеточный сигнальный домен содержит костимулирующий домен и первичный сигнальный домен. Применение или способ по п.12 или 13, где молекула CAR содержит связывающий CD19 домен, содержащий определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (CDR1 LC), определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (CDR2 LC), определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (CDR3 LC), определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (CDR1 HC), определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (CDR2 HC) и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (CDR3 HC) связывающего CD19 домена. Применение или способ по любому из пп.12-14, где связывающий CD19 домен содержит вариабельную область легкой цепи мыши, приведенную в таблице 7, вариабельную область тяжелой цепи мыши, приведенную в таблице 7, или обе из них. Применение или способ по любому из пп.12-15, где связывающий CD19 домен содержит CDR1 LC SEQ ID NO: 5, CDR2 LC SEQ ID NO: 26 и CDR3 LC SEQ ID NO: 27. Применение или способ по любому из пп.12-16, где связывающий CD19 домен содержит CDR1 HC SEQ ID NO: 19, CDR2 LC любой из SEQ ID NO: 20-23 и CDR3 HC SEQ ID NO: 24. Применение или способ по любому из пп.12-17, где связывающий CD19 домен содержит последовательность SEQ ID NO: 59 или последовательность, обладающую 95-99% идентичностью с ней. Применение или способ по любому из пп.12-14, 16 или 17, где связывающий CD19 домен представляет собой гуманизированный связывающий CD19 домен. Применение или способ по п.19, где гуманизированный связывающий CD19 домен содержит последовательность, выбранную из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, или последовательность, обладающую 95-99% идентичностью с ними. Применение или способ по п.19 или 20, где гуманизированный связывающий CD19 домен представляет собой scFv, который содержит вариабельную область легкой цепи, связанную с вариабельной областью тяжелой цепи через линкер, например, где линкер содержит последовательность SEQ ID NO: 53. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, где молекула CAR содержит трансмембранный домен белка, выбранного из: альфа-, бета- или зета-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154. Применение или способ по п.22, где трансмембранный домен содержит последовательность SEQ ID NO: 15. Применение или способ по п.12, где связывающий CD19 домен связан с трансмембранным доменом шарнирной областью, например, где шарнирная область содержит последовательность SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 45. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, где молекула CAR содержит костимулирующий домен, например, где костимулирующий домен содержит функциональный сигнальный домен белка, выбранного из: OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) или 4-1BB (CD137), например, где костимулирующий домен содержит последовательность SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 51. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, где молекула CAR содержит внутриклеточный сигнальный домен, например, где внутриклеточный сигнальный домен содержит функциональный сигнальный домен 4-1BB, функциональный сигнальный домен CD3-зета, или оба из них, или где внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность CD27, функциональный сигнальный домен CD3-зета или оба из них. Применение или способ по п.26, где внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность SEQ ID NO: 16, последовательность SEQ ID NO: 17, или обе из них; где внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность SEQ ID NO: 16, последовательность SEQ ID NO: 43, или обе из них; где внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность SEQ ID NO: 51, последовательность SEQ ID NO: 17, или обе из них; или где внутриклеточный сигнальный домен содержит последовательность SEQ ID NO: 51, последовательность SEQ ID NO: 43, или обе из них. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, где молекула CAR дополнительно содержит лидерную последовательность, например, где лидерная последовательность содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, где молекула CAR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 42. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов для применения в комбинации со средством, которое ингибирует иммунную ингибиторную молекулу, выбранную из: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (например, CEACAM-1, CEACAM-3 и/или CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 или TGFR-бета. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, где композиция содержит 1-5×108 CAR -экспрессирующих клеток. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, где заболевание, ассоциированное с экспрессией CD19, представляет собой злокачественную опухоль. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, где заболевание, ассоциированное с экспрессией CD19, представляет собой гематологическую злокачественную опухоль, например, гематологическую злокачественную опухоль, выбранную из лейкоза или лимфомы. Применение или способ по п.32, где злокачественная опухоль выбрана из: хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), лимфомы из клеток мантийной зоны (MCL), множественной миеломы, острого лимфоидного лейкоза (ALL), лимфомы Ходжкина, B-клеточного острого лимфоидного лейкоза (BALL), T-клеточного острого лимфоидного лейкоза (TALL), мелкоклеточного лимфоцитарного лейкоза (SLL), B-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, новообразования из бластных плазмацитоидных дендритных клеток, лимфомы Беркитта, диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы (DLBCL), DLBCL, ассоциированной с хроническим воспалением, фолликулярной лимфомы, педиатрической фолликулярной лимфомы, волосатоклеточного лейкоза, мелкоклеточной или крупноклеточной фолликулярной лимфомы, злокачественных лимфопролиферативных состояний, MALT-лимфомы (внеузловая лимфома маргинальной зоны ассоциированной со слизистыми оболочками лимфоидной ткани), лимфомы маргинальной зоны, миелодисплазии и миелодиспластического синдрома, неходжкинской лимфомы, плазмабластной лимфомы, новообразования из плазмацитоидных дендритных клеток, макроглобулинемии Вальденстрема, лимфомы маргинальной зоны селезенки, лимфомы/лейкоза селезенки, диффузной мелкоклеточной B-клеточной лимфомы красной пульпы селезенки, волосатоклеточного лейкоза-варианта, лимфоплазматической лимфомы, болезни тяжелых цепей, плазмацитарной миеломы, одиночной плазмацитомы кости, внекостной плазмацитомы, лимфомы маргинальной зоны лимфатических узлов, педиатрической лимфомы маргинальной зоны лимфатических узлов, первичной кожной лимфомы фолликулярного центра, лимфоматоидного гранулематоза, первичной средостенной (тимической) крупноклеточной B-клеточной лимфомы, внурисосудистой крупноклеточной B-клеточной лимфомы, ALK+ крупноклеточной B-клеточной лимфомы, крупноклеточной B-клеточной лимфомы, возникающей на фоне ассоциированного с HHV8 мультицентрового заболевания Кастлемана, первичной выпотной лимфомы, B-клеточной лимфомы или неклассифицируемой лимфомы. Применение или способ по п.32, где злокачественная опухоль выбрана из MCL, CLL, ALL, лимфомы Ходжкина или множественной миеломы. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов для применения в комбинации с цитокином. Применение или способ по п.36, где цитокин представляет собой IL-7, IL-15 или IL-21. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, где CAR представляет собой регулируемый CAR (RCAR). Применение или способ по п.38, где RCAR содержит: внутриклеточный сигнальный член, содержащий внутриклеточный сигнальный домен и первый домен переключения, антигенсвязывающий член, содержащий антигенсвязывающий домен, который связывает CD19 и второй домен переключения; и трансмембранный домен. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, где млекопитающее имеет или идентифицировано как имеющее мутацию BTK. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, где заболевание, ассоциированное с экспрессией CD19, представляет собой гематологическую злокачественную опухоль, и где резистентность к ингибитору киназы, клетке, которая экспрессирует молекулу CAR, у млекопитающего, или обоим из них, задерживается или снижается. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, где заболевание, ассоциированное с экспрессией CD19, представляет собой гематологическую злокачественную опухоль, и где ремиссия гематологической злокачественной опухоли продлевается или рецидив гематологической злокачественной опухоли отсрочивается. Применение или способ по п.1 или 2, где CAR19-экспрессирующую клетку вводят в комбинации со вторым ингибитором киназы, где второй ингибитор киназы отличается от ибрутиниба, когда млекопитающее является или идентифицировано как являющееся не отвечающим или имеющим рецидив в ответ на ибрутиниб. Применение или способ по п.43, где второй ингибитор киназы выбран из одного или нескольких из GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774 или LFM-A13, или их комбинации. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, где млекопитающее является (или идентифицировано как являющееся) частично отвечающим на ингибитор киназы, и млекопитающему вводят CAR19-экспрессирующую клетку, отдельно или в комбинации с ингибитром BTK, в период частичного ответа. Применение или способ по п.1 или 2, где млекопитающее является (или идентифицировано как являющееся) не отвечающим, имеющим прогрессирующее или стабильное заболевание после лечения ибрутинибом, и млекопитающему вводят CAR19-экспрессирующую клетку, отдельно или в комбинации со вторым ингибитором BTK, в период прогрессирующего или стабильного заболевания, где второй ингибитор киназы отличается от ибрутиниба. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, где ингибитор киназы представляет собой ибрутиниб и ибрутиниб составлен для введения на протяжении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более курсов, например, где длина курса составляет 21 или 28 суток. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, которые включают проведение инфузии лимфоцитов по меньшей мере с одной клеткой, экспрессирующей CAR против CD19. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, где клетка и ингибитор киназы составлены для одновременного введения. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, где клетка или ингибитор киназы составлены для последовательной доставки. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, где млекопитающее подвергалось истощению лимфоцитов. Применение или способ по п.51, где истощение лимфоцитов включает введение одного или нескольких из мелфалана, цитоксана, циклофосфамида и флударабина. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающие введение млекопитающему низкой усиливающей иммунитет дозы ингибитора mTOR. Применение или способ по п.53, где ингибитор mTOR представляет собой эверолимус или рапамицин. Способ получения CAR -экспрессирующей клетки (например, CAR -экспрессирующей иммунной эффекторной клетки) или популяции клеток, включающий: приведение клетки или популяции клеток в контакт с ингибитором BTK; и введение (например, трансдукцию) нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу CAR , в клетку или популяцию клеток в таких условиях, чтобы происходила экспрессия молекулы CAR. Способ по п.55, где молекула CAR представляет собой молекулу CAR, которая связывает CD19. Способ по п.55 или 56, где клетка представляет собой T - клетку или NK-клетку, или где популяция клеток включает T - клетки , NK-клетки, или и те, и другие. Способ по любому из пп.55-57, который включает приведение клетки или популяции клеток в контакт с ингибитором BTK в течение 10-20, 20-30, 30-40, 40-60 или 60-120 минут, а затем удаление большей части или всего ингибитора BTK из клетки или популяции клеток. Способ по любому из пп.55-58, где ингибитор BTK добавляют после сбора клетки или популяции клеток, или до стимуляции клетки или популяции клеток. Способ по любому из пп.55-59, где ингибитор BTK выбран из: ибрутиниба, GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774 или LFM-A13. Способ по любому из пп.55-60, где популяция клеток также включает злокачественные клетки. Способ по п.61, где ингибитор BTK ингибирует BTK в злокачественных клетках. Способ по любому из пп.55-62, дополнительно включающий истощение T-регуляторных клеток (например, CD25+ клеток) в популяции клеток. Реакционная смесь, содержащая популяцию иммунных эффекторных клеток, ингибитор BTK и молекулу CAR или нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу CAR. Реакционная смесь по п.64, где одна или несколько из иммунных эффекторных клеток экспрессируют молекулу CAR или содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу CAR. Реакционная смесь по п.64, где ингибитор BTK выбран из ибрутиниба, GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774 или LFM-A13. Реакционная смесь по п.64, которая дополнительно содержит злокачественные клетки. Реакционная смесь, содержащая популяцию иммунных эффекторных клеток и молекулу CAR или нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу CAR, где иммунные эффекторные клетки содержат ковалентно инактивированную ITK. Реакционная смесь по п.68, которая дополнительно содержит злокачественные клетки. Реакционная смесь по п.68, где злокачественные клетки содержат ковалентно инактивированную BTK. Композиция, содержащая клетку, которая экспрессирует молекулу CAR, которая связывает CD19 ("CAR19-экспрессирующую клетку"), и один или несколько ингибиторов киназ, где ингибитор киназы выбран из ингибитора тирозинкиназы Брутона (BTK), ингибитора циклин-зависимой киназы 4 (CDK4), ингибитора mTOR или ингибитора киназы, взаимодействующей с митоген-активируемой протеинкиназой (MNK). Композиция по п.71, где экспрессирующая CAR19 клетка и один или несколько ингибиторов киназ присутствуют в одной дозированной форме или в качестве двух или более дозированных форм. Композиция по п.71 или 72 для применения в качестве лекарственного средства. Композиция по п.71 или 72 для применения для лечения заболевания, ассоциированного с экспрессией CD19. Применение, способ или композиция по любому из предшествующих пунктов, где CAR19-экспрессирующая клетка представляет собой иммунную эффекторную клетку человека (например, T - клетку человека или NK-клетку человека) или популяцию клеток.

Таким образом, в известном изобретении в целом описывается способ лечения онкологических заболеваний, связанных с экспрессией CD19, путем введения эффективного количества иммунных эффекторных клеток, экспрессирующих молекулу CAR, которая связывается с CD19, в комбинации с ингибитором тирозинкиназы Брутона (BTK).

Недостатками известного технического решения являются:

- узкий спектр применения для лечения опухолей гематологической системы, поскольку молекула CD19 экспрессируется только на поверхности иммунных клеток человека;

- высокая системная токсичность, поскольку CAR Т-клетки связываются и ингибирует работу не только опухолевых, но и нормальных иммунных клеток пациента;

- отсутствие целевой доставки лекарства непосредственно к опухолевым клеткам вследствие того, что опухолевые иммунные клетки циркулируют в кровотоке, в то время как заявленная фармацевтическая композиция позволяет обеспечить целевую доставку в места опухолей, вследствие чего эффективность заявленного технического решения на гораздо более широкий спектр онкологических заболеваний, в том числе нейробластома или аденокарцинома легкого (см Фиг. 3). На Фиг.3 показана противоопухолевая активность заявленной фармацевтической композиции относительно клеток нейробластомы (подавление деления на 30%) и аденокарциномы легкого (подавление деления на 15%).

Исключить описанные выше недостатков позволит использование генетической кассеты по 1 пункту формулы заявленного технического решения, которая состоит из кодон-оптимизированных генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1, разделенных последовательностью 2А пептидов, поскольку она кодирует сразу три гена с терапевтической активность и может быть использована для лечения широкого спектра опухолей, при этом, использование фармацевтической композицией по пункту 2 формулы заявленного технического решения позволяет использовать мезенхимные стволовые клетки для таргетной доставки в места опухолей и избежать появления системных побочных эффект, таких как цитокиновый шторм (потенциально летальная воспалительная реакция иммунной системы), нейтропения (снижение числа нейтрофилов в крови, что приводит к повышенному риску возникновения инфекций), которые, в целом, в заявленном техническом решении не предполагается, однако в случае их по каким либо иным основаниям данные негативные (побочные) эффекты нивелируются за счет обеспечения целевой доставки лекарственных средств представленного в заявленном техническом решении.

Из исследованного уровня выявлено изобретение по заявке КНР CN105440120A «Recombinant tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand protein and application thereof», сущностью которого является рекомбинантный белок TRAIL, который имеет N-концевую гистидиновую метку и рекомбинантный ген молнии изолейцина, и его применения для терапии онкологических заболеваний и ревматоидного артрита. Апоптоз-индуцирующий лиганд семейства факторов некроза опухоли (TRAIL), отличающийся тем, что TRAIL клонирован из аминокислотной последовательности TRAIL 114-281 и вектора PET для получения рекомбинантного белка N - TRAIL с концевой гистидиновой меткой и рекомбинантным геном мотива изолейциновой молнии PET23dw-His-ILZ-hTRAIL 114-281, называемый HZ-TRAIL. Рекомбинантный TRAIL, по п. 1, где аминокислотная последовательность TRAIL показана в SEQ ID NO: 1. Рекомбинантный TRAIL по п. 1, в котором указанный TRAIL пригоден для экспрессии в клетках Escherichia coli, дрожжей и млекопитающих. Применение рекомбинантного TRAIL из пп. 1-3, в котором рекомбинантный TRAIL индуцирует апоптоз опухолевых клеток или воспалительных лимфоцитов. Применение рекомбинантного TRAIL по п. 4, в котором указанный рекомбинантный TRAIL применяется в качестве противоопухолевого лекарственного средств. Применение рекомбинантного TRAIL по п. 4, в котором указанный рекомбинантный TRAIL применяется в качестве лекарственного средства от ревматоидного артрита.

Таким образом, в изобретении в целом описывается способ применения рекомбинантного апоптоз-индуцирующего лиганда семейства факторов некроза опухоли (TRAIL) с концевой гистидиновой меткой и рекомбинантным геном мотива изолейциновой молнии для лечения онкологических заболеваний и ревматоидного артрита. Присутствие в конструкции гистидиновой метки и изолейциновой молнии позволяет увеличить стабильность и период полувыведения TRAIL из организма.

Однако основным недостатком по-прежнему остается короткий период полувыведения рекомбинантного белка TRAIL, который составляет 30-60 минут, что существенно снижает его терапевтический эффект. Также, TRAIL может быть использован для терапии ограниченного числа опухолей, чувствительных к TRAIL-индуцированному апоптозу. Известное техническое решение также не предусматривает целевой доставки терапевтического агента к месту расположения опухоли.

Решением описанной выше проблемы может быть использование фармацевтической композиции по п. 2 формулы заявленного технического решения, состоящей из мезенхимных стволовых клеток, которые будут доставлять и экспрессировать белки TRAIL, PTEN и IFNβ-1 в месте опухоли продолжительное время, что позволит обеспечить продолжительный терапевтический эффект.

Таким образом, из исследованного уровня техники заявителем выявлены аналоги только по назначению. Аналогов заявленных мультицистронных кассет TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1, TRAIL-E2A-PTEN-E2A-IFNβ-1, TRAIL-F2A-PTEN-F2A-IFNβ-1, и TRAIL-T2A-PTEN-T2A-IFNβ-1, созданных на основе кодон-оптимизированных нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих TRAIL, PTEN и IFNβ-1 по заявленной генетической последовательности заявителем из исследованного уровня техники не выявлено, в связи с чем формула изобретения составлена без ограничительной части.

Целью и техническим результатом заявленного технического решения является разработка кодон-оптимизированных нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих белки TRAIL, PTEN и IFNβ-1, и разработка мультицистронных кассет TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1, TRAIL-E2A-PTEN-E2A-IFNβ-1, TRAIL-F2A-PTEN-F2A-IFNβ-1 и TRAIL-T2A-PTEN-T2A-IFNβ-1, созданных на основе описанных выше генов, разработка фармацевтической композиции для терапии широкого спектра онкологических заболеваний человека, в том числе тяжело поддающихся лечению, таких как опухоли нервной системы, например, нейробластома, опухолей легких, таких как аденокарцинома легкого.

Сущностью является генетическая кассета, содержащая кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1, представленные SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 соответственно, разделенные нуклеотидной последовательностью из ряда P2А, или E2А, или F2А, или T2А пептида, для экспрессии генов, кодирующих белки TRAIL, PTEN и IFNβ-1, с возможностью использования в любом лентивирусном эукариотическом экспрессионном векторе. Фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний человека, содержащая мезенхимные стволовые клетки, полученны от пациентов с онкологическим заболеванием, экспрессирующие генетическую кассету TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1, TRAIL-E2A-PTEN-E2A-IFNβ-1, TRAIL-F2A-PTEN-F2A-IFNβ-1, или TRAIL-T2A-PTEN-T2A-IFNβ-1 по п. 1, содержащую кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1, представленные SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 соответственно, разделенные нуклеотидной последовательностью из ряда P2А, или E2А, или F2А, или T2А пептида, в эффективном количестве и фармацевтически допустимые вспомогательные вещества.

Заявленное техническое решение поясняется графическими материалами, представленными на Фиг.1 – Фиг.4.

На Фиг. 1 показана относительная экспрессия мРНК генов TRAIL, PTEN, и IFN-1β в нативных МСК и МСК, генетически модифицированных лентивирусом, кодирующим генетическую кассету TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1, содержащую гены TRAIL (SEQ ID NO: 1), PTEN (SEQ ID NO: 2) и IFNβ-1 (SEQ ID NO: 3), разделенные нуклеотидной последовательность гена белка P2A. A – относительная экспрессия мРНК гена TRAIL; Б – относительная экспрессия мРНК гена PTEN; В – относительная экспрессия мРНК гена IFN-1β.

На Фиг. 2 показан вестерн блот анализ секреции белков TRAIL (А), PTEN (Б), и IFN-1β (В) в нативных МСК и МСК, генетически модифицированных лентивирусом, кодирующим генетическую кассету TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1, содержащую гены TRAIL (SEQ ID NO: 1), PTEN (SEQ ID NO: 2) и IFNβ-1 (SEQ ID NO: 3), разделенные нуклеотидной последовательность гена белка P2A. Нативные МСК – не модифицированные мезенхимные стволовые клетки; МСК-TRAIL-PTEN-IFNβ-1 – МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1.

На Фиг. 3 показаны результаты анализа числа здоровых клеток SH-SY5Y (А) и A549 (Б) после совместного культивирования с нативными и генетически модифицированными МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1, где нативные SH-SY5Y – клетки нейробластомы, культивировавшиеся без МСК; A549 – клетки аденокарциномы легкого, культивировавшиеся без МСК; нативые МСК – образец опухолевых клеток SH-SY5Y или A549, культивировавшийся с нативными МСК; МСК-TRAIL-PTEN-IFNβ-1 – образец опухолевых клеток SH-SY5Y или A549, культивировавшийся с МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1.

На Фиг. 4 показаны результаты анализа числа активированных иммунных клеток здорового человека, в частности CD3⁺CD4^-CD8⁺ T-киллеров (А) и T хэлперов второго типа (Th2) (Б) после культивирования с МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1. Нативные МКПК – образец мононуклеарных клеток из периферической крови человека, культивировавшихся без МСК, нативые МСК – образец МКПК, культивировавшийся с нативными МСК, МСК-TRAIL-PTEN- IFNβ-1 – образец МКПК, культивировавшийся с МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1.

Таким образом, графические материалы, иллюстрирующие примеры конкретного выполнения заявленного технического решения, доказывают возможность достижения заявленных технических результатов, а именно:

- уровень экспрессии мРНК генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1 в генетически модифицированных МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 увеличивается в 4 тыс. раз по сравнению с нативными МСК;

- экспрессия белков TRAIL, PTEN и IFN-1β в МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 подтверждается вестерн блот анализом с использованием специфичных антител;

- число здоровых клеток SH-SY5Y после культивирования с МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 снижается на 30% по сравнению с клетками SH-SY5Y, культивировавшимися без МСК и клетками SH-SY5Y, культивировавшимися с нативными МСК. Число здоровых клеток A549

после культивирования с МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 снижается на 15% по сравнению с клетками A549, культивировавшимися без МСК и клетками A549, культивировавшимися с нативными МСК;

- число CD3⁺CD4^-CD8⁺ T-киллеров увеличивается на 10% и числа T хэлперов второго типа (Th2) увеличивается на 52% в образце МКПК после культивирования с МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 по сравнению с образцами нативных МСК и МКПК, культивировавшихся отдельно.

Поставленная цель и заявленный технический результат достигается путем синтеза генетической мультицистронной кассеты, содержащей оптимизированные по кодонному составу нуклеотидные последовательности генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1, разделенные нуклеотидной последовательностью саморасщепляющегося 2А пептида, например, P2A, E2A, F2A или T2A.

При этом следует отметить, что способ получения генетической кассеты не является предметом предполагаемого изобретения, т.к. реализуется посредством применения известных технологий.

Под саморасщепляющимися 2А пептидами понимается класс пептидов длиной 18–22 аминокислот, которые располагаются между двумя целевыми пептидами и обеспечивают их расщепление друг от друга во время синтеза белка путем рибосомного скиппинга. Названия 2А пептидов исходят от наименований вирусов, в которых они были обнаружены. Например, F2A получен из вируса ящура, E2A – вирус лошадиного ринита, P2A – свиной тешовирус-1, T2A – вирус Thosea asigna.

В биологических исследованиях 2А пептиды используются для создания мультицистронных векторов с целью ко-экспресии (совместной экспрессии) нескольких генов.

Далее заявителем приведено описание конкретного выполнения (осуществления) заявленного технического решения.

Заявленное техническое решение, осуществляется в 7 этапов, причем 1 этап - создание генетической кассеты, содержащей кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1, 2-4 этапы - получение фармацевтической композиции, 5-7 этапы - проверка противоопухолевой и иммуномодулирующей активности полученной фармацевтической композиции. Далее заявителем приведены этапы реализации заявленного технического решения, и их детальные описания:

1 этап: оптимизация кодонного состава нуклеотидных последовательностей генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1.

2 этап: создание донорной плазмиды.

3 этап: клонирование заявленной последовательности TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 из донорной плазмиды в экспрессионную векторную плазмиду.

4 этап: создание лантивирусных частиц, кодирующих заявленную последовательность TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 и генетическая модификация мезенхимных стволовых клеток (МСК) лентивирусами, кодирующими последовательность TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1

5 этап: анализ экспрессии функционально активных белков TRAIL, PTEN и IFNβ-1 в генетически модифицированных МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1.

6 этап: анализ противоопухолевой активности генетически модифицированных МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1.

7 этап: анализ иммуномодулирующей активности генетически модифицированных МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1.

Далее заявителем приведено подробное описание каждого из вышеописанных этапов осуществления заявленного технического решения.

1 этап. Оптимизация кодонного состава нуклеотидных последовательностей генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1.

Производят кодонную оптимизацию нуклеотидных последовательностей генов. Для оптимизации кодонного состава генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1 используют известные алгоритмы, например, OptimumGene (GeneScript, США), который учитывает различные факторы, влияющие на уровни экспрессии генов, такие, как смещение кодонов, GC-состав, содержание CpG-динуклеотидов, вторичную структуру мРНК, тандемные повторы, сайты рестрикции, которые могут помешать клонированию, преждевременные сайты полиаденилирования, дополнительные минорные сайты связывания с рибосомой.

В качестве матрицы для кодонной оптимизации используют нуклеотидные последовательности мРНК генов TRAIL (Gene ID: 8743), PTEN (Gene ID: 5728) и IFNβ-1 (Gene ID: 3456). Дикий тип нуклеотидных последовательностей кодирующей части генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1 содержит тандем редких кодонов, которые могут остановить трансляцию или снизить ее эффективность. При оптимизации кодонного состава дикого типа гена TRAIL улучшается индекс адаптации кодонов CAI (англ. Codon Adaptation Index) с 0,74 до 0,95. При оптимизации кодонного состава дикого типа гена PTEN улучшается индекс адаптации кодонов CAI с 0,72 до 0,95. При оптимизации кодонного состава дикого типа гена IFNβ-1 улучшается индекс адаптации кодонов CAI с 0,78 до 0,97.

Для увеличения стабильности мРНК оптимизируют GC-состав путем удаления протяженных участков с высоким содержанием GC-пар. Кроме того, в процессе оптимизации удаляют потенциальные цис-действующие сайты.

Заявителем установлено, что в результате кодонной оптимизации длины аминокислотных последовательностей генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1 не изменяются и составляют 843, 1209 и 561 аминокислотных остатков, соответственно.

Далее проводят синтез de novo нуклеотидных последовательностей кДНК генов TRAIL (SEQ ID NO: 1), PTEN (SEQ ID NO: 2) и IFNβ-1 (SEQ ID NO: 3), разделенных общеизвестными нуклеотидными последовательностями саморасщепляющегося пептида, из ряда 2А, P2A, E2A, F2A, T2A или нуклеотидной последовательностью IRES.

2 этап. Создание донорной плазмиды.

Создают донорную плазмиду, например pUC57-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1, содержащую нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, разделенные нуклеотидной последовательностью Р2А пептида, путем субклонирования оптимизированных по кодонному составу нуклеотидных последовательностей генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1, разделенных нуклеотидной последовательностью P2A пептида, в плазмидный вектор pUC57 (Addgene, США) по сайтам рестрикции HindIII и BamHI. Правильность сборки генетической конструкции pUC57-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 подтверждается рестрикционным анализом и секвенированием нуклеотидных последовательностей генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1.

3 этап. Клонирование заявленной последовательности TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 из донорной плазмиды в экспрессионную векторную плазмиду.

Проводят субклонирование генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3), разделенных последовательностью P2A пептида, из плазмиды pUC57-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 в экспрессионный плазмидный вектор, например, лентивирусный плазмидный вектор pLX303 (AddGene, США). Клонирование генов из донорной плазмиды pUC57-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 в экспрессионный вектор pLX303 проводят путем LR-рекомбинации (по технологии Gateway, Invitrogen, США).

Реакцию LR-рекомбинации проводят при комнатной температуре. В 1,5 мл пробирке смешивают 150 нг вектора-донора pUC57-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1, 150 нг вектора-реципиента pLX303, 1,5 мкл буфера ТЕ pH 8,0, 1 мкл смеси ферментов LR Clonase (Invitrogen, США), перемешивают пипетированием. Смесь инкубируют в течение, например, 16 часов при комнатной температуре, например, 25°С. После инкубации к смеси добавляют 1 мкл фермента протеиназы-K (Invitrogen, США) и перемешивают пипетированием. Смесь инкубируют в течение, например, 10 минут при 37°С в термостате. Для бактериальной трансформации используют 1,5–2 мкл рекомбинационной смеси. В предварительно охлажденную 1,5 мл пробирку добавляют 50 мкл раствора компетентных клеток из 50 мл пробирки и 2 мкл рекомбинационной смеси. Раствор компетентных клеток с рекомбинационной смесью держат на льду в течение, например, 30 минут, после чего клетки подвергаются тепловому шоку на водяной бане при 42°С в течение, например, 30 секунд, по прошествии которых пробирки с трансформированными клетками незамедлительно переносятся обратно на лед. Затем к клеткам добавляют 250 мкл среды LS-LB и инкубируют в шейкере в течение, например, 1 часа при 37°С. После инкубации бактерии высевают на селективную среду, содержащую ампициллин в концентрации 100 мг/мл.

Выросшие колонии проверяют на наличие плазмидного вектора pLX303-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 со вставкой целевых генов с помощью ПЦР-скринига по стандартной методике с использованием геноспецифичных праймеров. Результаты выделения плазмидной ДНК анализируют методом электрофореза в 1 % агарозном геле.

Дальнейшая работа проводится с колониями, выросшими на селективной среде с ампициллином. Отдельную бактериальную колонию иннокулируют в 15 мл пробирку, содержащую 5 мл среды с ампициллином (в концентрации 100 мг/мл) и инкубируют в термостате в течение, например, 14–16 часов при 37°С с интенсивным перемешиванием, после чего биомассу используют для выделения плазмидной ДНК по стандартным общеизвестным протоколам.

4 этап. Создание лентивирусных частиц, кодирующих заявленную последовательность TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 и генетическая модификация мезенхимных стволовых клеток (МСК) полученными лентивирусами, кодирующими последовательность TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1.

Репликативно дефектные лентивирусы получают путем трансфекции клеток HEK293T кальций фосфатым методом тремя кодирующими плазмидами: генетической конструкцией pLX303-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1; упаковочной плазмидой (pCMV-dR8.2 dvpr, Addgene # 8455, США); оболочечной плазмидой (pCMV-VSV-G, Addgene # 8454, США). Полученные LV-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 концентрируют ультрацентрифугированием в течение 2 часа при 26 000 об/мин.

Полученный LV-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 используют для генетической модификации мезенхимных стволовых клеток, выделенных из жировой ткани человека. МСК высевают на 6-луночный планшет в количестве 5000 клеток на лунку. На следующий день добавляют LV-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 с множественностью инфекции (MOI) 10 и культивируют в бессывороточной среде DMEM/F12 в течение 6 часов. В конце инкубации клетки отмывают от вируса и добавляют свежую полную среду DMEM/F12. Чтобы отобрать генетически модифицированнные клетки, МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 культивируют в присутствии селективного антибиотика бластицидин S (5 мкг/мл, Invitrogen, США) в течение 10 дней. Полученные клетки МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 используют для дальнейшей работы.

5 этап. Анализ экспрессии функционально активных белков TRAIL, PTEN и IFNβ-1 в генетически модифицированных МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1.

Для оценки экспрессии генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1 в генетически модифицированных МСК проводят полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и вестерн блот анализ.

Общую РНК из образцов нативных и генетически модифицированных МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 выделяют с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, США) по методике, рекомендуемой производителем. Синтез кДНК проводят с использованием набора GoScript Reverse Transcription System (Promega, США) согласно инструкции фирмы производителя. Последовательности праймеров и проб для генов 18S рибосомной РНК (18S rRNA), TRAIL, PTEN и IFN-1β подбирают с помощью онлайн программы GenScript Online Real-time PCR (TaqMan) Primer Design Tool (GenScript, США).

Полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени (ПЦР-РВ) проводят по технологии TaqMan с использованием MicroAmp 96-луночных планшетов (BioRad, США). Для реакции амплификации используют 1 мкл кДНК, 0,3 мкл смеси праймеров и пробы (в финальной концентрации 300 нM), 4,7 мкл of MilliQ H₂O и 4 мкл 10х буфера TaqMan (Евроген, Россия). Конечный объем реакции составляет 10 мкл.

Амплификацию проводят на приборе CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США) с использованием следующего температурного режима: денатурация при 95°C в течение 1 минуты; 44 цикла, включающих денатурацию при 95°C в течение 30 секунд, отжиг праймеров при 55°C в течение 30 секунд и элонгацию при 72°C в течение 1 минуты. Нормализацию уровня экспрессии целевых генов проводят по уровню экспрессии 18S рРНК. Определение относительного уровня экспрессии исследуемых генов осуществляют с применением delta/deltaCT-метода.

Анализ экспрессии белков TRAIL, PTEN и IFN-1β в генетически модифицированных МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 проводят с помощью вестерн блот анализа. Для выделения общего белка образцы нативных и генетически модифицированных МСК (1×10⁶ клеток) лизируют в RIPA буфере, содержащем ингибитор протеаз, затем центрифугируют при 12 000 об/мин в течение 30 мин. Равные объемы лизатов разделяют в 4–12% градиентных гелях и переносят на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0.2 мкм (#162-0112, BioRad, США) с использованием транс-блот-системы для полусухого электрофоретического переноса (BioRad, США). Мембраны с белками инкубируют в течение ночи с первичными антителами. Используемые в работе первичные антитела: anti-PTEN [Y184] (ab32199, Abcam, разведение 1:100), anti-TRAIL (ab9959, Abcam, разведение 1:100), anti-IFN-beta (ab85803, Abcam, разведение 1:100). Затем мембраны инкубируют со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (#8a0467j, American Qualex Antibodies, США) в разведении 1:2000 в течение 2 часов. Белки визуализируют с использованием субстрата Clarity™ Western ECL (#1705061, BioRad, США) в системе ChemiDoc XRS+ (BioRad, США).

По результатам анализов заявителем была подтверждена экспрессия мРНК и белков TRAIL, PTEN и IFN-1β в МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFN-1β (Фиг. 1 и 2).

6 этап. Анализ противоопухолевой активности генетически модифицированных МСК.

Противоопухолевая активность МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 оценивается путем совместного культивирования 5 × 10⁴ МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 и 5 × 10⁴ опухолевых клеток нейробластомы SH-SY5Y или клеток аденокарциномы легкого A549 в 6 луночном планшете в течение 72 часов. Затем клетки окрашиваются антителами для оценки жизнеспособности с использованием набора APC Annexin V Apoptosis Detection Kit with PI (#3804660, Sony Biotechnology, США) в соответствии с протоколом производителя. Окрашенные клетки анализируются с помощью проточной цитофлуориметрии на проточном цитометре FACS AriaIII.

По результатам анализов заявителем была показана противоопухолевая активность МСК-TRAIL-PTEN-IFN-1β в отношении клеток нейробластомы человека SH-SY5Y и клеток аденокарциномы легкого человека A549 in vitro (Фиг. 3).

7 этап. Анализ иммуномодулирующей активности генетически модифицированных МСК.

Иммуномодулирующая активность МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 оценивается путем совместного культивирования МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 и мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови человека (МКПК). 2 млн МКПК совместно культивируются с 100 000 МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 в течение 72 часов. Активация популяций МКПК оценивается с помощью проточной цитофлуориметрии путем окрашивания антителами, специфичными к поверхностным маркерам, характерным для различных популяций иммунных клеток человека, а именно: PE anti-human HLA-DR Antibody (#307605, Biolegend), APC anti-human CD25 Antibody (#302610, BioLegend), FITC anti-human CD8a Antibody (#300906, BioLegend), PE anti-human CD3 Antibody ( #300308, BioLegend), Pacific Blue anti-human CD4 Antibody (#317429, BioLegend), PerCP/Cy5.5 anti-human CD38 Antibody (#356614, BioLegend), PE anti-human CD127 (IL-7Rα) Antibody (#351304, BioLegend), APC anti-human CD183 (CXCR3) Antibody (#353708, BioLegend), PE anti-human CD196 (CCR6) Antibody (#353410, BioLegend), APC anti-human CD4 Antibody (#300514, BioLegend), Brilliant Violet 421 anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody (# 328626, BioLegend), FITC anti-human CD3 Antibody (# 317306, BioLegend), PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD56 (NCAM) Antibody (# 362506, BioLegend). Анализ результатов проводят на приборе FACS Aria III (BD Biosciences, США).

В результате анализа заявителем было показано увеличение числа CD3⁺CD4^-CD8⁺ T-киллеров и T хэлперов второго типа (Th2) после культивирования с МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 (Фиг. 4).

Результаты, описанные на Этапах 1-7, приведены на Фиг. 1-4 соответственно.

Из данных, приведенных на Фиг. 1, видно, что мезенхимные стволовые клетки, генетически модифицированные лентивирусом, кодирующим генетическую кассету TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1, содержащую нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, разделенные нуклеоидной последовательностью Р2А пептида, экспрессируют в 4 тыс. раз больше кДНК генов TRAIL (SEQ ID NO: 1), PTEN (SEQ ID NO: 2) и IFNβ-1 (SEQ ID NO: 3). Такие данные показывают, что кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности TRAIL (SEQ ID NO: 1), PTEN (SEQ ID NO: 2) и IFNβ-1 (SEQ ID NO: 3) и созданная на их основе кассета TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 могут быть использованы для создания лентивирусного вектора и могут эффективно экспрессироваться в генетически модифицированных этим вектором клетках.

Из данных, приведенных на Фиг. 2 видно, что в МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 экспрессируются белки TRAIL, PTEN и IFN-1β. Такие данные показывают, что с генетической кассеты TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1, содержащей нуклеотидные последовательности генов TRAIL (SEQ ID NO: 1), PTEN (SEQ ID NO: 2) и IFNβ-1 (SEQ ID NO: 3), могут синтезироваться соответствующие белки, что подтверждает функциональную активность кодон-оптимизированных последовательностей и генетической кассеты TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1.

Из данных, приведенных на Фиг. 3 видно что совместное культивирование клеток нейробластомы человека SH-SY5Y с генетически модифицированными МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1, экспрессирующими генетическую кассету TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1, содержащую нуклеотидные последовательности TRAIL (SEQ ID NO: 1), PTEN (SEQ ID NO: 2) и IFNβ-1 (SEQ ID NO: 3), приводит к индукции апоптоза и значительному снижению числа здоровых клеток SH-SY5Y (54,50 ± 1,83%) по сравнению с клетками SH-SY5Y, культивировавшимися без МСК (87,52 ± 0,53%) или клетками SH-SY5Y, культивировавшимися c нативными МСК (83,6 ± 0,46%). Совместное культивирование клеток аденокарциномы легкого A549 с модифицированными МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 приводит к снижению числа здоровых клеток (71,7 ± 0,84%) по сравнению с клетками A549, культивировавшимися без МСК (85,35 ± 1,6%) и нативными МСК (84,2 ± 1,4%). Такие данные показывают, что белки, экспрессирующиеся с генетической кассеты TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1, обладают противоопухолевой активностью.

Из данных, приведенных на Фиг. 4, видно, что обнаружено увеличение числа CD3⁺CD4^-CD8⁺ T-киллеров после культивирования с МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 (110,3±4,17%) по сравнению с МКПК, культивировавшихся c нативных МСК (98,5±4,17%), и МКПК, культивировавшихся отдельно (100,0±0,18%). Так же было обнаружено увеличение числа T хэлперов второго типа (Th2), которые также играют важную роль в противоопухолевом иммунном ответе, в образце МКПК после культивирования с МСК-TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1 (152,9±0,94%) по сравнению с образцами МКПК, культивировавшихся c нативными МСК (116,5±2,36%), и МКПК, культивировавшихся отдельно (100,0±1,18%). Также следует отметить, что не было отмечено статистически значимого увеличения числа регуляторных Т-клеток, которые ассоциируются с подавлением противоопухолевого иммунного ответа. Такие данные показывают, что белки, экспрессирующиеся с генетической кассеты TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1, обладают иммуномодулирующей активностью.

Таким образом, из вышеизложенного можно сделать общий вывод, что заявителем достигнуты поставленные цели и заявленный технический результат, а именно:

- получена генетическая кассета, содержащая кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1, представленные SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 соответственно, разделенные нуклеотидной последовательностью из ряда IRES, или P2А, или E2А, или F2А, или T2А пептида, с возможностью использования в любом эукариотическом экспрессионном векторе,

- получена фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний, содержащая мезенхимные стволовые клетки, эксперессирующие гены TRAIL, PTEN и IFNβ-1, содержащиеся в заявленной генетической кассете, в эффективном количестве и фармацевтически допустимые вспомогательные вещества.

При этом в примерах конкретного выполнения экспериментально доказано, что использование заявленного технического решения на основе кодон оптимизированных последовательностей генов TRAIL (SEQ ID NO: 1), PTEN (SEQ ID NO: 2) и IFNβ-1 (SEQ ID NO: 3) позволяет вызывать гибель опухолевых клеток, а также стимулировать активность иммунных клеток.

Основываясь на приведенных экспериментальных данных, приведенных на Фиг.1-Фиг.4 соответственно, представляется возможным сделать логический вывод о том, что рекомбинантные плазмидные конструкции, созданные на основе кодон-оптимизированных последовательностей генов TRAIL (SEQ ID NO: 1), PTEN (SEQ ID NO: 2) и IFNβ-1 (SEQ ID NO: 3), а также с использованием нуклеотидных последовательностей, 2A, P2A, E2A, F2A или T2A пептидов могут быть использованы в составе фармацевтической композиции для получения готовой лекарственной формы генного препарата.

Фармацевтическая композиция дополнительно может содержать вещества, повышающие эффективность генетической модификации мезенхимных стволовых клеток (например, протамина сульфат) в случае реализации генно-клеточного метода лечения.

Способ использования фармацевтической композиции заключается во введении человеку таким способом и в таком количестве, которые обеспечат лечебный эффект в зависимости от нозологической формы заболевания и медицинских показаний.

Фармацевтическая композиция может вводиться местно - внутримышечно, системно - внутривенно, внутриартериально, аэрозольно, в виде генно-клеточной трансплантации или трансфузии после in vitro обработки различных аутологичных клеток, например, гемопоэтических и их более дифференцированных производных, мезенхимных, сосудисто-стромальной фракции и др. Хотя указанные способы введения широко известны из уровня техники, для специалиста в данной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного уровня техники не выявлены источники, в которых описаны признаки, совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков, перечисленные в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, поскольку из исследованного уровня техники заявителем не выявлены технические решения, характеризующиеся использованием генетической конструкции, содержащей кодон-оптимизированные кДНК генов TRAIL (SEQ ID NO: 1), PTEN (SEQ ID NO: 2) и IFNβ-1 (SEQ ID NO: 3) для терапии онкологических заболеваний человека. Кроме того, заявленное техническое решение, по мнению заявителя, не является очевидным для специалиста, т.к. обеспечивает реализацию задачи по лечению широкого спектра онкологических заболеваний человека, за счет достижения сверхсуммарного эффекта, а именно - наблюдается одновременно как прямая индукция гибели опухолевых клеток, так и стимуляция клеток иммунной системы пациента на борьбу с опухолью, что является дополнительным фактором неочевидности соответствия заявленного технического решения указанному критерию.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, так как оно может быть использовано в промышленных масштабах для создания препаратов, предназначенных для лечения широкого спектра онкологических заболеваний человека.

--->

Перечень последовательностей

SEQ ID NO: 1

<110> Казанский (Приволжский) федеральный университет

<120> Генетическая кассета, содержащая кодон-оптимизированные

нуклеотидные последовательности генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1, и

фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний

<160> 3

<210> 1

<211> 843

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atggcaatga tggaggtgca gggaggaccc agcctgggac agacctgcgt gctgatcgtg 60

atcttcacag tgctgctgca gagcctgtgc gtggccgtga cctacgtgta cttcaccaac 120

gagctgaagc agatgcagga caagtactcc aagtctggca tcgcctgctt cctgaaggag 180

gacgattcct attgggaccc taacgatgag gagagcatga attccccatg ttggcaggtg 240

aagtggcagc tgcggcagct ggtgagaaag atgatcctga ggacctccga ggagaccatc 300

tctacagtgc aggagaagca gcagaatatc agcccactgg tgcgggagag aggaccacag 360

agggtggcag cacacatcac cggaacaagg ggccgcagca acacactgag ctcccctaac 420

tccaagaatg agaaggccct gggcaggaag atcaattctt gggagtctag ccgctctggc 480

cacagcttcc tgtccaacct gcacctgcgg aatggcgagc tggtcatcca cgagaagggc 540

ttttactata tctacagcca gacctatttc agatttcagg aggagatcaa ggagaacaca 600

aagaatgaca agcagatggt gcagtacatc tataagtaca cctcttaccc cgatcctatc 660

ctgctgatga agagcgcccg gaactcttgc tggagcaagg acgccgagta tggcctgtac 720

tccatctatc agggcggcat cttcgagctg aaggagaacg atagaatctt cgtgagcgtg 780

acaaatgagc acctgatcga catggatcac gaggcctctt tctttggcgc ctttctggtg 840

ggc

SEQ ID NO: 2

<110> Казанский (Приволжский) федеральный университет

<120> Генетическая кассета, содержащая кодон-оптимизированные

нуклеотидные последовательности генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1, и

фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний

<160> 3

<210> 2

<211> 1209

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgaccgcca tcatcaagga gatcgtgtcc cggaataagc ggagatatca ggaggatggc 60

ttcgacctgg atctgacata tatctaccct aacatcatcg ccatgggatt tccagcagag 120

cggctggagg gcgtgtacag aaacaatatc gacgatgtgg tgagattcct ggactctaag 180

cacaagaacc actataagat ctacaatctg tgcgccgaga ggcactatga caccgccaag 240

ttcaactgtc gcgtggccca gtacccattt gaggatcaca atccccctca gctggagctg 300

atcaagccct tttgcgagga cctggatcag tggctgtccg aggacgataa tcacgtggca 360

gcaatccact gcaaggcagg caagggaagg acaggcgtga tgatctgtgc ctatctgctg 420

cacaggggca agttcctgaa ggcccaggag gccctggact tttacggcga ggtgaggacc 480

cgcgataaga agggcgtgac aatcccttcc cagcggcggt acgtgtacta ttactcttac 540

ctgctgaaga accacctgga ttacaggcca gtggccctgc tgttccacaa gatgatgttt 600

gagaccatcc ccatgttctc tggcggcaca tgcaaccctc agtttgtggt gtgccagctg 660

aaggtgaaga tctatagctc caatagcggc cccacccgga gagaggacaa gttcatgtac 720

ttcgagtttc cacagcccct gcccgtgtgc ggcgatatca aggtggagtt ctttcacaag 780

cagaacaaga tgctgaagaa ggacaagatg ttccactttt gggtgaatac cttctttatc 840

ccaggccccg aggagacatc tgagaaggtg gagaatggca gcctgtgcga ccaggagatc 900

gattctatct gtagcatcga gagggccgac aacgataagg agtacctggt gctgaccctg 960

acaaagaatg acctggataa ggccaacaag gacaaggcca atcgctattt cagccctaac 1020

tttaaggtga agctgtactt caccaagaca gtggaggagc cttccaatcc agaggcctct 1080

agctccacca gcgtgacacc agacgtgtcc gataacgagc ccgaccacta tagatactcc 1140

gataccacag actctgatcc cgagaacgag ccttttgacg aggatcagca cacccagatc 1200

acaaaggtg

SEQ ID NO: 3

<110> Казанский (Приволжский) федеральный университет

<120> Генетическая кассета, содержащая кодон-оптимизированные

нуклеотидные последовательности генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1, и

фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний

<160> 3

<210> 3

<211> 561

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Atgaccaaca agtgcctgct gcagatcgcc ctgctgctgt gcttcagcac cacagccctg 60

tccatgtctt acaacctgct gggcttcctg cagagaagct ccaattttca gtgccagaag 120

ctgctgtggc agctgaacgg caggctggag tattgtctga aggaccgcat gaatttcgat 180

atccccgagg agatcaagca gctgcagcag tttcagaagg aggacgccgc cctgacaatc 240

tacgagatgc tgcagaacat cttcgccatc tttcggcagg attctagctc caccggctgg 300

aatgagacaa tcgtggagaa cctgctggcc aacgtgtacc accagatcaa ccacctgaag 360

accgtgctgg aggagaagct ggagaaggag gactttacac ggggcaagct gatgtctagc 420

ctgcacctga agcggtacta tggcagaatc ctgcactacc tgaaggccaa ggagtattcc 480

cactgcgcct ggaccatcgt gagggtggag atcctgcgca acttctactt tatcaatcgg 540

ctgacaggct atctgagaaa t

<---

1. Генетическая кассета, содержащая кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1, представленные SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 соответственно, разделенные нуклеотидной последовательностью из ряда P2А, или E2А, или F2А, или T2А пептида, для экспрессии генов, кодирующих белки TRAIL, PTEN и IFNβ-1, с возможностью использования в любом лентивирусном эукариотическом экспрессионном векторе.

2. Фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний человека, содержащая мезенхимные стволовые клетки, полученные от пациентов с онкологическим заболеванием, экспрессирующие генетическую кассету TRAIL-P2A-PTEN-P2A-IFNβ-1, TRAIL-E2A-PTEN-E2A-IFNβ-1, TRAIL-F2A-PTEN-F2A-IFNβ-1, или TRAIL-T2A-PTEN-T2A-IFNβ-1 по п. 1, содержащую кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1, представленные SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 соответственно, разделенные нуклеотидной последовательностью из ряда P2А, или E2А, или F2А, или T2А пептида, в эффективном количестве и фармацевтически допустимые вспомогательные вещества.