Способ лечения рассеянного склероза

Группа изобретений относится к медицине и касается способа улучшения функциональной способности у пациента, имеющего рассеянный склероз, включающего введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где пациент имеет улучшение функциональной способности после введения и где улучшение функциональной способности сохраняется в течение по меньшей мере 12 недель; где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Группа изобретений также касается способа снижения среднегодовой частоты рецидивов у пациента-человека, имеющего рассеянный склероз; набора для лечения рассеянного склероза у пациента в соответствии с указанным способом. Группа изобретений обеспечивает улучшение функциональной способности у пациента, имеющего рассеянный склероз. 16 н. и 42 з.п. ф-лы, 34 ил., 14 табл., 2 пр.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0001] Настоящее изобретение относится к способам лечения рассеянного склероза (MS) у пациента и к изделию с инструкциями по такому применению.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0002] Рассеянный склероз (MS) представляет собой воспалительное и демиелинизирующее дегенеративное заболевание центральной нервной системы (ЦНС) человека. Он является распространенным по всему миру заболеванием, которым страдает приблизительно 300000 человека в США; он представляет собой заболевание молодых взрослых людей, причем у 70%-80% начало происходит в возрасте между 20 и 40 годами (Anderson et al. Ann Neurology 31(3):333-6 (1992); Noonan et al. Neurology 58:136-8 (2002)). MS представляет собой гетерогенное нарушение, исходя из клинического течения, оценки посредством магнитно-резонансной томографии (MRI) и анализа патологий биоптата и секционного материала (Lucchinetti et al. Ann Neurol 47:707-17 (2000)). Заболевание проявляется большим количеством возможных комбинаций нарушений, включая синдромы спинного мозга, ствола головного мозга, черепных нервов, мозжечка, полушарий головного мозга и когнитивные синдромы. Прогрессирующая нетрудоспособность является судьбой большинства пациентов с MS, особенно в перспективе 25 лет. Половине пациентов MS требуется трость для ходьбы в пределах 15 лет от возникновения заболевания. MS является основной причиной неврологической нетрудоспособности у молодых взрослых людей и людей среднего возраста и до последнего десятилетия не имел известных способов лечения, оказывающих благотворное воздействие. MS трудно диагностировать вследствие неспецифических клинических данных, что привело к развитию высокоструктурированных диагностических критериев, которые включают несколько технологических достижений, состоящих из MRI-сканирования, исследований вызванных потенциалов и исследований цереброспинальной жидкости (CSF). Все диагностические критерии основываются на общих принципах рассеянных бляшек в центральном белом веществе, появляющихся в различные моменты времени и необъяснимые другими этиологическими факторами, такими как инфекция, сосудистое нарушение или аутоиммунное нарушение (McDonald et al. Ann Neurol 50:121-7 (2001)). MS имеет четыре формы заболевания: рецидивирующе-ремиттирующий MS (RRMS; 80%-85% случаев при возникновении), первично-прогрессирующий MS (PPMS; 10%-15% при возникновении), прогрессирующе-рецидивирующий MS (PRMS; 5% при возникновении); и вторично-прогрессирующий MS (SPMS) (Kremenchutzky et al. Brain 122 (Pt 10):1941-50 (1999); Confavreux et al. N Engl J Med 343(20):1430-8 (2000)). Согласно оценке, у 50% пациентов с RRMS развивается SPMS в течение 10 лет и вплоть до у 90% пациентов с RRMS в конечном итоге развивается SPMS (Weinshenker et al. Brain 112(Pt 1):133-46 (1989)).

[0003] В США несколько модифицирующих заболевание лекарственных средств, принадлежащих пяти классам, одобрены для лечения RRMS, в то время как для PPMS отсутствуют одобренные лекарственные средства. Способы лечения RRMS включает следующие: класс интерферонов, IFN-бета-1a (REBIF^®, Extavia, AVONEX^® и PLEGRIDY™) и IFN-бета-1b (BETASERON^®); глатирамера ацетат (COPAXONE^®), полипептид; натализумаб (TYSABRI^®), алемтузумаб (LEMTRADA^®, оба являются моноклональными антителами); диметилфумарат (TECFIDERA^®) и финголимод (GILENYA^®), оба из которых являются низкомолекулярными средствами и митоксантрон (NOVANTRON^®), цитотоксическое средство; терифлуномид (AUBAGIO^®). Другие лекарственные средства с целью модификации заболевания используют с различной степенью успеха, включая метотрексат, циклофосфамид, азатиоприн и внутривенный (в/в) иммуноглобулин. Современные способы терапии лишены достаточной эффективности для устранения раннего заболевания или не используются при раннем MS вследствие ассоциированных с ними побочных эффектов (Hartung et al. (2011) Expert Rev Neurother. 11, 351-62; Freedman et al., Mult. Scler. Relat. Disord. 3(2):147-55, 2014). Таким образом, остается потребность в высокоэффективных способах терапии с приемлемым профилем польза-риск, которые могут быть проведены рано в ходе заболевания для снижения долговременных последствий нарастания нетрудоспособности и повышения качества жизни пациентов.

[0004] Все приведенные в настоящем описании ссылки включены в качестве ссылок в полном объеме.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] В рамках изобретения предусматриваются способы лечения рассеянного склероза у пациента-человека, включающие введение эффективного количества антитела против CD20. Можно вводить любое из антител против CD20, описанных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

[0006] В одном аспекте в рамках настоящего изобретения предусматривается способ улучшения функциональной способности у пациента, имеющего рассеянный склероз, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где пациент имеет улучшение функциональной способности после лечения; где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления пациент после лечения имеет подтвержденное снижение нетрудоспособности в течение 12 недель. В некоторых вариантах осуществления пациент после лечения имеет подтвержденное снижение нетрудоспособности в течение 24 недель. В некоторых вариантах осуществления улучшение функциональной способности у пациента сохраняется в течение по меньшей мере 12 недель. В некоторых вариантах осуществления улучшение функциональной способности у пациента сохраняется в течение по меньшей мере 24 недель. В некоторых вариантах осуществления улучшение функциональной способности измеряют с помощью испытания ходьбы на 25 футов на время (T-25FW) или показателя EDSS.

[0007] В некоторых вариантах осуществления пациент имеет окрашивающиеся гадолинием T1-бляшки на исходном уровне. В некоторых вариантах осуществления пациент не имеет окрашивающихся гадолинием T1-бляшек на исходном уровне.

[0008] В другом аспекте в рамках настоящего изобретения предусматривается способ подавления прогрессирования нетрудоспособности у пациента-человека, имеющего рассеянный склероз, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где введение приводит к снижению подтвержденных случаев прогрессирования нетрудоспособности, и где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления введение приводит к снижению подтвержденного 12-неделеьного прогрессирования нетрудоспособности. В некоторых вариантах осуществления введение приводит к снижению подтвержденного 24-недельного прогрессирования нетрудоспособности. В некоторых вариантах осуществления подтвержденное прогрессирование нетрудоспособности определяют с помощью показателя расширенной шкалы оценки состояния инвалидности (EDSS).

[0009] В некоторых вариантах осуществления пациент имеет окрашиваемые гадолинием T1-бляшки на исходном уровне. В некоторых вариантах осуществления пациент не имеет окрашивающихся гадолинием T1-бляшек на исходном уровне.

[0010] В другом аспекте в рамках настоящего изобретения предусматривается способ замедления возникновения подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности или снижения риска подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности у пациента-человека, имеющего рассеянный склероз, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления введение приводит к замедлению возникновения или снижению риска подтвержденного 12-недельного прогрессирования нетрудоспособности. В некоторых вариантах осуществления введение приводит к замедлению возникновения или снижению риска подтвержденного 24-недельного прогрессирования нетрудоспособности.

[0011] В некоторых вариантах осуществления пациент имеет окрашивающиеся гадолинием T1-бляшки на исходном уровне. В некоторых вариантах осуществления пациент не имеет окрашивающихся гадолинием T1-бляшек на исходном уровне.

[0012] В рамках настоящего изобретения предусматривается способ уменьшения объема T2-бляшек у пациента-человека, имеющего рассеянный склероз, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В определенных вариантах осуществления пациент имеет окрашивающиеся гадолинием T1-бляшки на исходном уровне. В определенных вариантах осуществления пациент не имеет окрашивающихся гадолинием T1-бляшек на исходном уровне.

[0013] В другом аспекте в рамках настоящего изобретения предусматривается способ замедления или предупреждения снижения объема головного мозга у пациента, имеющего рассеянный склероз, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где уменьшение объема головного мозга замедляется или предотвращается у пациента; и где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления предупреждается дальнейшее уменьшение объема головного мозга у пациента, который имеет уменьшение объема головного мозга.

[0014] Также в рамках настоящего изобретения предусматривается способ уменьшения атрофии головного мозга у пациента-человека, имеющего рассеянный склероз, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где атрофия головного замедляется или предупреждается, где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В определенных вариантах осуществления предупреждается дальнейшая атрофия головного мозга у пациента, который имеет атрофию головного мозга.

[0015] В рамках настоящего изобретения предусматривается способ лечения пациента-человека с рассеянным склерозом, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где лечение приводит к отсутствию признаков активности заболевания (NEDA) в течение по меньшей мере 12 недель, где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В определенных вариантах осуществления лечение приводит к отсутствию признаков активности заболевания (NEDA) в течение по меньшей мере 24 недель.

[0016] Также в рамках настоящего изобретения предусматривается способ лечения пациента-человека с рассеянным склерозом, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где лечение приводит к достижению пациентом свободного от бляшек статуса после лечения в течение 96 недель, где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В определенных вариантах осуществления лечение приводит к достижению пациенту свободного от бляшек статуса после 48 недель лечения. В определенных вариантах осуществления лечение приводит к достижению пациентом свободного от бляшек статуса после 24 недель лечения. В определенных вариантах осуществления лечение приводит к тому, что пациент является свободным от окрашивающихся гадолинием бляшек. В определенных вариантах осуществления лечение приводит к тому, что пациент является свободным от бляшек T2.

[0017] В рамках настоящего изобретения предусматривается способ лечения пациента-человека с рецидивирующей формой рассеянного склероза, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где лечение приводит к одному или нескольким из:

a) пациент является свободным от рецидива через 96 недель;

b) пациент не имеет подтвержденных явлений прогрессирования нетрудоспособности через 96 недель;

c) пациент не имеет усиливаемых гадолинием T1-бляшек через 96 недель;

d) пациент не имеет новых и/или увеличивающихся T2-бляшек через 96 недель;

где антитело против CD20 содержит: 1) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и 2) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

[0018] В другом аспекте в рамках настоящего изобретения предусматривается способ лечения пациента-человека с высокоактивным рассеянным склерозом, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления пациент с высокоактивным рассеянным склерозом имеет недостаточный ответ на другой способ терапии рассеянного склероза. В некоторых вариантах осуществления пациента с высокоактивным рассеянным склерозом ранее не лечили другим способом терапии рассеянного склероза. В некоторых вариантах осуществления другой способ терапии рассеянного склероза представляет собой терапию интерфероном или глатирамера ацетатом. В некоторых вариантах осуществления введение антитела против CD20 является эффективными в отношении одного или нескольких из следующих: (1) уменьшение количества бляшек в головном мозге пациента; (2) уменьшение среднегодовой частоты рецидивов; (3) уменьшение прогрессирования нетрудоспособности; и (4) повышение функциональной способности. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает проведение MRI-сканирования и определение того, имеет ли пациент высокоактивный рассеянный склероз, перед введением антитела против CD20 пациенту.

[0019] В другом аспекте в рамках настоящего изобретения предусматривается способ лечения пациента-человека с рассеянным склерозом ранней стадии, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает диагностику пациента, имеющего рассеянный склероз ранней стадии, перед введением пациенту антитела против CD20. В некоторых вариантах осуществления у пациента диагностировано наличие рассеянного склероза, но ему не проводили лечение в течение по меньшей мере двух лет перед введением антитела против CD20.

[0020] В другом аспекте в рамках настоящего изобретения предусматривается способ лечения пациента-человека с рассеянным склерозом, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где лечение приводит к отсутствиям признаков активности заболевания (NEDA) у пациента, и где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В определенных вариантах осуществления NEDA определяют как: отсутствие определяемых протоколом рецидивов, отсутствие явлений CDP, отсутствие новых или увеличивающихся T2-бляшек и отсутствие усиливаемых Gd T1-бляшек.

[0021] В определенных вариантах осуществления лечение или введение антитела против CD20 пациенту с рецидивирующей формой рассеянного склероза приводит к одному или нескольким из следующих:

a) приблизительно 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% или 50% снижение среднегодовой частоты рецидивов (например, в течение периода, составляющего по меньшей мере приблизительно 1 год, 1,5 года или два года), по сравнению с пациентом(ами), которому проводят лечение интерфероном бета-1a (таким как REBIF^®), включая любой диапазон между этими величинами;

b) приблизительно любое из 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% или 50% снижения риска подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 12 недель по сравнению с пациентом(ами), которому проводят лечение интерфероном бета-1a (таким как REBIF^®), включая любой диапазон между этими величинами;

c) приблизительно любое из 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% или 50% снижения риска подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 24 недель по сравнению с пациентом(ами), которому проводят лечение интерфероном бета-1a (таким как REBIF^®), включая любой диапазон между этими величинами;

d) приблизительно любое из 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% уменьшения общего количества гадолиний⁺ T1-бляшек по сравнению с пациентом(ами), которыми проводят лечение интерфероном бета-1a (such as REBIF^®), включая любой диапазон между этими величинами;

e) приблизительно любое из 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% уменьшения среднего количества гадолиний⁺ T1-бляшек через 24 недели, 48 недель и/или 96 недель по сравнению с пациентом(ами), которому проводят лечение интерфероном бета-1a (таким как REBIF^®), включая любой диапазон между этими величинами;

f) приблизительно любое из 70%, 71%, 72% 73% 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% или 85% уменьшения количества новых и/или увеличивающихся гиперинтенсивных T2-бляшек по сравнению с пациентом(ами), которому проводят лечение интерфероном бета-1a (таким как REBIF^®), включая любой диапазон между этими величинами;

g) приблизительно любое из 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% уменьшения среднего количества новых и/или увеличивающихся гиперинтенсивных T2-бляшек через 24 недели, 48 недель и/или 96 недель по сравнению с пациентом(ами), котором проводят лечение интерфероном бета-1a (таким как REBIF^®), включая любой диапазон между этими величинами;

h) приблизительно любое из 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5%, или 20% снижения скорости уменьшения объема всего головного мозга по сравнению с пациентом(ами), которому не проводят лечение, включая любой диапазон между этими величинами;

i) приблизительно любое из 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%. 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64% или 65% снижения подтвержденного уменьшения нетрудоспособности, сохраняющегося в течение по меньшей мере 12 недель, по сравнению с пациентом(ами), которому проводят лечение интерфероном бета-1a (таким как REBIF^®), включая любой диапазон между этими величинами;

j) приблизительно любое из 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74% или 75% уменьшения количества новых гипоинтенсивных T1-бляшек по сравнению с пациентом(ами), которому проводят лечение интерфероном бета-1a (таким как REBIF^®), включая любой диапазон между этими величинами; и

k) приблизительно любое из 55%, 56%, 57%. 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%,70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% или 85% увеличения вероятности достижения NEDA (без признаков активности заболевания),

где NEDA определяют как отсутствие определяемых протоколом рецидивов, отсутствие событий CDP, отсутствие новых или увеличивающихся T2-бляшек и отсутствие усиливаемых Gd T1-бляшек по сравнению с пациентом(ами), которому проводят лечение интерфероном бета-1a (таким как REBIF^®), включая любой диапазон между этими величинами.

[0022] В определенных вариантах осуществления лечение дополнительно или альтернативно может приводить приблизительно к 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% или 25% снижению атрофии головного мозга по сравнению с пациентом(ами), которому проводят лечение интерфероном бета-1a (таким как REBIF^®), включая любой диапазон между этими величинами.

[0023] В определенных вариантах осуществления лечение или введение антитела против CD20 пациенту с первичным прогрессирующим рассеянным склерозом приводит к одному или нескольким из следующих:

a) приблизительно любое из 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29% или 30% снижения риска подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 12 недель по сравнению с пациентом(ами), которому не проводят лечение, включая любой диапазон между этими величинами;

b) приблизительно любое из 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29% или 30% снижения риска подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 24 недель по сравнению с пациентом(ами), которому не проводят лечение, включая любой диапазон между этими величинами;

c) приблизительно любое из 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34% или 35% снижения скорости прогрессирования ухудшения времени ходьбы при измерении с использованием ходьбы на 25 футов на время, по сравнению с пациентом(ами), которым не проводят лечения, включая любой диапазон между этими величинами;

d) приблизительно любое из 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% или 15% снижения объема T2-бляшек по сравнению с пациентом(ами), которому не проводят лечения, включая любой диапазон между этими величинами;

e) приблизительно любое из 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,4%, 3,5%, 4%, 4,5% или 5% снижения объема гиперинтенсивных T2-бляшек от исходного уровня приблизительно на 20 неделе, 24 неделе, 28 неделе, 32 неделе, 36 неделе, 40 неделе, 44 неделе, 48 неделе, 52 неделе, 56 неделе, 60 неделе, 64 неделе, 68 неделе, 72 неделе, 76 неделе, 80 неделе, 84 неделе, 88 неделе, 92 неделе, 96 неделе, 100 неделе, 104 неделе, 108 неделе, 112 неделе, 116 неделе и 120 неделе; и

f) приблизительно любое из 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5% или 20% снижения скорости уменьшения объема всего головного мозга по сравнению с пациентом(ами), которому не проводят лечение, включая любой диапазон между этими величинами.

[0024] В определенных вариантах осуществления любого из способов пациент сохраняет способность к индукции гуморального ответа на антиген в ходе лечения. В определенных вариантах осуществления антиген представляет собой антиген свинки, антиген краснухи, антиген ветрянки, антиген S. pneumonia, антиген столбнячного токсоида, пневмококковый антиген и антиген вируса гриппа.

[0025] В некоторых вариантах осуществления способов, описанных выше и в настоящем описании, при первоначальном воздействии или последующих воздействиях вводят второе лекарственное средство, где антитело против CD20 представляет собой первое лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления второе лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из интерферона, глатирамера ацетата, цитотоксического средства, химиотерапевтического средства, митоксантрона, метотрексата, циклофосфамида, хлорамбуцила, азатиоприна, гамма-глобулина, кампата, антитела против CD4, кладрибина, кортикостероида, микофенолата мофетила (MMF), циклоспорина, снижающего уровень холестерина лекарственного средства класса статинов, эстрадиола, тестостерона, гормон-заместительного лекарственного средства, ингибитора TNF, модифицирующего заболевание противоревматического лекарственного средства (DMARD), нестероидного противовоспалительного средства (NSAID), левотироксина, циклоспорина A, аналога соматостатина, антагониста цитокина или рецептора цитокина, антиметаболита, иммунодепрессивного средства, антагониста интегринов или антитела против них, антитела против LFA-l, эфализумаба, антитела против альфа-4-интегрина, натализумаба и другого антитела против маркера поверхности B-клеток.

[0026] В некоторых вариантах осуществления способов, описанных выше и в настоящем описании, рассеянный склероз представляет собой рецидивирущую форму рассеянного склероза. В некоторых вариантах осуществления рецидивирующая форма рассеянного склероза представляет собой рецидивирующе-ремиттирующий рассеянный склероз (RRMS). В некоторых вариантах осуществления рецидивирующая форма рассеянного склероза представляет собой вторично-прогрессирующий рассеянный склероз с сопутствующими рецидивами (rSPMS). В некоторых вариантах осуществления рассеянный склероз представляет собой прогрессирующий рассеянный склероз. В некоторых вариантах осуществления рассеянный склероз представляет собой первично-прогрессирующий рассеянный склероз (PPMS).

[0027] В некоторых вариантах осуществления способов, описанных выше и в настоящем описании, антитело против CD20 вводят пациенту для обеспечения первоначального воздействия антитела против CD20 с последующим одним или несколькими воздействиями антитела против CD20, где каждое воздействие представляет собой приблизительно 600 мг антитела и каждое воздействие предоставляют пациенту в качестве одной или двух доз антитела против CD20, и где интервал между воздействиями составляет приблизительно 24 недели или приблизительно 6 месяцев. В некоторых вариантах осуществления первоначальное воздействие включает первую дозу и вторую дозу антитела против CD20, где каждая доза представляет собой приблизительно 300 мг, и интервал между первой дозой и второй дозой составляет приблизительно 14 суток. В некоторых вариантах осуществления дополнительное воздействие включает однократную дозу приблизительно 600 мг. В некоторых вариантах осуществления первоначальное воздействие и одно или несколько дополнительных воздействию включают первую дозу и вторую дозу антитела против CD20, где каждая доза составляет приблизительно 300 мг, и интервал между первой дозой и второй дозой составляет приблизительно 14 суток.

[0028] В некоторых вариантах осуществления способов, описанных выше и в настоящем описании, антитело против CD20 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления антитело против CD20 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, или SEQ ID NO: 26, или SEQ ID NO: 15, или SEQ ID NO: 27, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления антитело против CD20 представляет собой окрелизумаб. В некоторых вариантах осуществления антитело против CD20 представляет собой фармацевтически приемлемую композицию. В некоторых вариантах осуществления антитело против CD20 находится в составе, содержащем 30 мг/мл антитела, 20 мМ ацетат натрия, 106 мМ трегалозу, 0,02% полисорбат 20, pH 5,3. В некоторых вариантах осуществления антитело в составе хранят при приблизительно 2-8°C в количестве 300 мг/флакон. В некоторых вариантах осуществления антитело разбавляют в солевом растворе (0,9% хлорид натрия) в мешке для в/в введения в целях введения путем инфузии. В некоторых вариантах осуществления антитело против CD20 представляет собой его антигенсвязывающий фрагмент.

[0029] В некоторых вариантах осуществления способов, описанных выше и в настоящем описании, антитело против CD20 вводят внутривенно. В некоторых вариантах осуществления антитело против CD20 вводят внутривенно при каждом воздействии антитела. В некоторых вариантах осуществления способов, описанных в настоящем описании выше, антитело вводят подкожно. В некоторых вариантах осуществления антитело против CD20 вводят подкожно при каждом воздействии антитела.

[0030] В некоторых вариантах осуществления в рамках настоящего изобретения предусматривается композиция, содержащая антитело против CD20, которая содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, для применения для лечения рассеянного склероза у пациента согласно любому из способов, описанных выше.

[0031] В некоторых вариантах осуществления в рамках настоящего изобретения предусматривается антитело против CD20, которое содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, для применения для изготовления лекарственного средства для лечения рассеянного склероза у пациента согласно любому из способов, описанных выше.

[0032] В определенных вариантах осуществления любого из способов, описанных выше и/или в настоящем описании, снижение, или уменьшение, или улучшение после введения антитела против CD20 можно сравнивать с исходным уровнем, с уровнем у пациента(ов) без лечения и/или с уровнем у пациента(ов), например, таким как средний, усредненный или срединный уровень в группе пациентов, которым проводят отличающееся лечение (такое как интерферон бета-1a или REBIF^®).

[0033] В другом аспекте в рамках настоящего изобретения предусматривается изделие, содержащее: (a) контейнер, содержащий антитело против CD20 (например, окрелизумаб); и (b) вкладыш в упаковку с инструкциями по лечению рассеянного склероза у пациента согласно любому из способов, описанных выше и в настоящем описании.

[0034] Следует понимать, что одно, некоторое или все из свойств различных вариантов осуществления, описанных в настоящем описании, можно комбинировать с получением других вариантов осуществления настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0035] На фиг.1A представлено выравнивание последовательностей, сравнивающее аминокислотные последовательности вариабельного домена легкой цепи (V_L) каждого из 2H7 мыши (SEQ ID NO: 1), гуманизированного варианта 2H7.v16 (SEQ ID NO: 2) и легкой цепи каппа человека подгруппы I (SEQ ID NO: 3). CDR V_L 2H7 и hu2H7.v16 являются следующими: CDR1 (SEQ ID NO: 4), CDR2 (SEQ ID NO: 5) и CDR3 (SEQ ID NO: 6).

[0036] На фиг.1B представлено выравнивание последовательностей, сравнивающее аминокислотные последовательности вариабельного домена тяжелой цепи (V_H) каждого из 2H7 мыши (SEQ ID NO: 7), гуманизированного варианта 2H7.v16 (SEQ ID NO: 8) и консенсусной последовательности тяжелой цепи подгруппы III человека (SEQ ID NO: 9). CDR V_H 2H7 и hu2H7.v16 являются следующими: CDR1 (SEQ ID NO: 10), CDR2 (SEQ ID NO: 11) и CDR3 (SEQ ID NO: 12).

[0037] На фиг.1A и фиг.1B CDR1, CDR2 и CDR3 в каждой цепи заключены в скобки, и они фланкируются каркасными областями FR1-FR4, как указано. 2H7 относится к антителу 2H7 мыши. Звездочками между двумя рядов последовательностей указано положение, которое различается между двумя последовательностями. Нумерация остатков осуществлена согласно Kabat et al. Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), причем инсерции показаны как a, b, c, d и e.

[0038] На фиг.2 представлена аминокислотная последовательность зрелой легкой цепи 2H7.v16 (SEQ ID NO: 13).

[0039] На фиг.3 представлена аминокислотная последовательность зрелой тяжелой цепи 2H7.v16 (SEQ ID NO: 14).

[0040] На фиг.4 представлена аминокислотная последовательность зрелой тяжелой цепи 2H7.v31 (SEQ ID NO: 15). L-цепь 2H7.v31 является такой же, как и у 2H7.v16.

[0041] На фиг.5 представлено выравнивание зрелых легких цепей 2H7.v16 и 2H7.v511 (SEQ ID NO. 13 и 16, соответственно) с нумерацией остатков вариабельных доменов согласно Kabat и нумерацией остатков константного домена согласно Eu.

[0042] На фиг.6 представлено выравнивание зрелых тяжелых цепей 2H7.v16 и 2H7.v511 (SEQ ID NO. 14 и 17, соответственно) с нумерацией остатков вариабельных доменов согласно Kabat и нумерацией остатков константных доменов согласно Eu.

[0043] На фиг.7 представлен обзор схемы испытания для двух идентичных испытаний фазы III (т.е. испытание I и испытание II) для окрелизумаба по сравнению с интерфероном бета-1a (REBIF^®) у пациентов с рецидивирующим рассеянным склерозом.

[0044] На фиг.8 представлен иерархический план статистического анализа для испытания I и испытания II.

[0045] На фиг.9 представлено распределение пациентов в испытании I и испытании II.

[0046] На фиг.10A представлена среднегодовая частота рецидивов (ARR) через 96 недель у пациентов, которых лечили окрелизумабом, по сравнению с пациентами, которых лечили интерфероном бета-1a, в испытании I.

[0047] На фиг.10B представлена среднегодовая частота рецидивов (ARR) через 96 недель для пациентов, которых лечили окрелизумабом, по сравнению с пациентами, которых лечили интерфероном бета-1a в испытании II.

[0048] На фиг.11 представлено время до возникновения подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности (CDP) в течение по меньшей мере 12 недель на протяжении периода 96 недель у пациентов, которых лечили окрелизумабом, по сравнению с пациентами, которых лечили интерфероном бета-1a (объединенные данные испытания I и испытания II).

[0049] На фиг.12A представлено время до возникновения подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 12 недель на протяжении периода 96 недель у пациентов, которых лечили окрелизумабом, по сравнению с пациентами, которых лечили интерфероном бета-1a, в испытании I.

[0050] На фиг.12B представлено время до возникновения подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 12 недель на протяжении периода 96 недель у пациентов, которых лечили окрелизумабом, по сравнению с пациентами, которых лечили интерфероном бета-1a, в испытании II.

[0051] На фиг.13 представлено время до возникновения подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 24 недель на протяжении периода 96 недель у пациентов, которых лечили окрелизумабом, по сравнению с пациентами, которых лечили интерфероном бета-1a (объединенные данные испытания I и испытания II).

[0052] На фиг.14A представлено время до возникновения подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 24 недель на протяжении периода 96 недель у пациентов, которых лечили окрелизумабом, по сравнению с пациентами, которых лечили интерфероном бета-1a, в испытании I.

[0053] На фиг.14B представлено время до возникновения подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 24 недель на протяжении периода 96 недель у пациентов, которых лечили окрелизумабом, по сравнению с пациентами, которых лечили интерфероном бета-1a, в испытании II.

[0054] На фиг.15 представлена доля пациентов (с исходным показателем EDSS 2,0 или менее) с подтвержденным снижением нетрудоспособности (т.е. CDI) в течение по меньшей мере 12 недель у пациентов, которым вводили окрелизумаб, по сравнению с пациентами, которым вводили интерферон бета-1a (объединенные данные испытания I и испытания II).

[0055] На фиг.16A представлена доля пациентов (с исходным показателем EDSS 2,0 или менее) с подтвержденным снижением нетрудоспособности (т.е. CDI) в течение по меньшей мере 12 недель у пациентов, которым вводили окрелизумаб, по сравнению с пациентами, которым вводили интерферон бета-1a, в испытании I.

[0056] На фиг.16B представлена доля пациентов (с исходным показателем EDSS 2,0 или менее) с подтвержденным снижением нетрудоспособности (т.е. CDI) в течение по меньшей мере 12 недель у пациентов, которым вводили окрелизумаб, по сравнению с пациентами, которым вводили интерферон бета-1a, в испытании II.

[0057] На фиг.16C представлено изменение комплексной функциональной оценки при рассеянном склерозе от исходного уровня до 96 недели у пациентов, которым вводят окрелизумаб, по сравнению с пациентами, которым вводят интерферон бета-1a, в испытании I.

[0058] На фиг.16D представлено изменение комплексной функциональной оценки при рассеянном склерозе от исходного уровня до 96 недели у пациентов, которым вводят окрелизумаб, по сравнению с пациентами, которым вводят интерферон бета-1a, в испытании II.

[0059] На фиг.17A представлено общее число усиливаемых гадолинием T1-бляшек, обнаруженных на 24 неделе, 48 неделе и неделе 96 у пациентов, которым вводили окрелизумаб, по сравнению с пациентами, которым вводили интерферон бета-1a, в испытании I.

[0060] На фиг.17B представлено общее число усиливаемых гадолинием T1-бляшек, обнаруженных на 24 неделе, 48 неделе и неделе 96 у пациентов, которым вводили окрелизумаб, по сравнению с пациентами, которым вводили интерферон бета-1a, в испытании II.

[0061] На фиг.18A представлено среднее общее количество усиливаемых гадолинием T1-бляшек у пациентов, которым вводили окрелизумаб, на 24 неделе, 48 неделе и на 96 неделе, по сравнению с пациентами, которым вводили IFNβ-1a, в испытании I.

[0062] На фиг.18B представлено среднее общее количество усиливаемых гадолинием T1-бляшек у пациентов, которым вводили окрелизумаб, на 24 неделе, 48 неделе и на 96 неделе, по сравнению с пациентами, которым вводили IFNβ-1a, в испытании II.

[0063] На фиг.19A представлено общее количество новых и/или увеличивающихся гиперинтенсивных T2-бляшек, обнаруженных на 24 неделе, 48 неделе и 96 неделе у пациентов, которым вводили окрелизумаб, по сравнению с пациентами, которым вводили интерферон бета-1a, в испытании I и испытании II.

[0064] На фиг.19B представлено общее количество новых и/или увеличивающихся гиперинтенсивных T2-бляшек, обнаруженных на 24 неделе, 48 неделе и 96 неделе у пациентов, которым вводили окрелизумаб, по сравнению с пациентами, которым вводили интерферон бета-1a, в испытании II.

[0065] На фиг.19С представлено среднее количество новых и/или увеличивающихся гиперинтенсивных T2-бляшек, обнаруженных на 24 неделе, 48 неделе и 96 неделе у пациентов, которым вводили окрелизумаб, по сравнению с пациентами, которым вводили интерферон бета-1a, в испытании I.

[0066] На фиг.19D представлено среднее количество новых и/или увеличивающихся гиперинтенсивных T2-бляшек, обнаруженных на 24 неделе, 48 неделе и 96 неделе у пациентов, которым вводили окрелизумаб, по сравнению с пациентами, которым вводили интерферон бета-1a, в испытании II.

[0067] На фиг.20A представлена скорость уменьшения объема головного мозга с 24 недели по 96 неделю у пациентов, которым вводили окрелизумаб, по сравнению с пациентами, которым вводили интерферон бета-1a, в испытании I.

[0068] На фиг.20B представлена скорость уменьшения объема головного мозга с 24 недели по 96 неделю у пациентов, которым вводили окрелизумаб, по сравнению с пациентами, которым вводили интерферон бета-1a, в испытании II.

[0069] На фиг.21A представлена скорость уменьшения объема головного мозга от исходного уровня до 96 недели у пациентов, которым вводили окрелизумаб, по сравнению с пациентами, которым вводили интерферон бета-1a, в испытании I.

[0070] На фиг.21B представлена скорость уменьшения объема головного мозга от исходного уровня до 96 недели у пациентов, которым вводили окрелизумаб, по сравнению с пациентами, которым вводили интерферон бета-1a, в испытании II.

[0071] На фиг.22A представлено общее количество новых гипоинтенсисвных T1-бляшек на MRI-изображение через 24 недели, 48 недель и 96 недель у пациентов, которым вводили окрелизумаб, по сравнению с пациентами, которым вводили интерферон бета-1a, в испытании I.

[0072] На фиг.22B представлено общее количество новых гипоинтенсисвных T1-бляшек на MRI-изображение через 24 недели, 48 недель и 96 недель у пациентов, которым вводили окрелизумаб, по сравнению с пациентами, которым вводили интерферон бета-1a, в испытании II.

[0073] На фиг.23A представлены обусловленные инфузией реакции у пациентов, которым вводили IFNβ-1a, в испытании I и испытании II (объединенные).

[0074] На фиг.23B представлены обусловленные инфузией реакции у пациентов, которым вводили окрелизумаб, в испытании I и испытании II (объединенные).

[0075] На фиг.24 представлена схема испытания для испытания фазы III для окрелизумаба у пациентов с первично-прогрессирующим рассеянным склерозом (PPMS).

[0076] На фиг.25 представлена статистическая иерархия испытания фазы III для окрелизумаба у пациентов с PPMS.

[0077] На фиг.26 представлено распределение пациентов на дату клинического прекращения испытания при PPMS фазы III.

[0078] На фиг.27 представлено время до возникновения подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 12 недель у пациентов, которым вводили окрелизумаб, по сравнению с пациентами, которым вводили плацебо, для испытания при PPMS фазы III.

[0079] На фиг.28 представлено время до возникновения подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 24 недель у пациентов, которых лечили окрелизумабом, по сравнению с пациентами, которым вводили плацебо, для испытания при PPMS фазы III.

[0080] На фиг.29 представлена скорость снижения скорости ходьбы при измерении в испытании ходьбы на 25 футов на время у пациентов, которым вводили 600 мг окрелизумаба, по сравнению с пациентами, которым вводили плацебо, от исходного уровня до недели 120 для испытания при PPMS фазы III.

[0081] На фиг.30 представлен уровень снижения скорости ходьбы на 120 неделе относительно исходного уровня у пациентов, которым вводили 600 мг окрелизумаба, по сравнению с пациентами, которым вводили плацебо, для испытания при PPMS фазы III.

[0082] На фиг.31 представлено процентное изменение объема всего головного мозга с 24 недели по 96 неделю у пациентов, которым вводили 600 мг окрелизумаба, по сравнению с пациентами, которым вводили плацебо, для испытания при PPMS фазы III.

[0083] На фиг.32 представлено изменение объема T2-бляшек у пациентов, которым вводили 600 мг окрелизумаба, по сравнению с пациентами, которым вводили плацебо, для испытания при PPMS фазы III.

[0084] На фиг.33 представлены обусловленные инфузией реакции (IRR) у пациентов, которым вводили 600 мг окрелизумаба, по сравнению с пациентами, которым вводили плацебо, по воздействию и тяжести до даты клинического прекращения в испытании при PPMS фазы III.

[0085] На фиг.34A представлена доля пациентов без признаков активности заболевания (NEDA), которым вводили IFNβ-1a, по сравнению с долей пациентов с NEDA, которым вводили окрелизумаб, в испытании I.

[0086] На фиг.34B представлена доля пациентов без признаков активности заболевания (NEDA), которым вводили IFNβ-1a, по сравнению с долей пациентов с NEDA, которым вводили окрелизумаб, в испытании II.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Определения

[0087] "B-клетка" представляет собой лимфоцит, который созревает в костном мозге, и включает наивную B-клетку, B-клетку памяти или эффекторную B-клетку (плазмациты). B-клетка в рамках настоящего изобретения может представлять собой нормальную или незлокачественную B-клетку.

[0088] "маркер B-клеточной поверхности" или "антиген B-клеточной поверхности" в рамках настоящего изобретения представляет собой антиген, экспрессируемый на поверхности B-клетки, на который может быть нацелено антитело, которое связывается с ней. Иллюстративные маркеры B-клеточной поверхности включают маркеры поверхности лейкоцитов CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 и CD86 (для описания см. The Leukocyte Antigen Facts Book, 2^nd Edition. 1997, ed. Barclay et al. Academic Press, Harcourt Brace & Co., New York). Другие маркеры B-клеточной поверхности включают RP105, FcRH2, B-cell CR2, CCR6, P2X5, HLA-DOB, CXCR5, FCER2, BR3, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRH1, IRTA2, ATWD578, FcRH3, IRTA1, FcRH6, BCMA и 239287. В рамках настоящего изобретения представляющий особый интерес маркер B-клеточной поверхности предпочтительно экспрессируется на B-клетках по сравнению с другими B-клеточными тканями млекопитающего, и он может экспрессироваться как на B-клетках-предшественниках, так и на зрелых B-клетках. Предпочтительным маркером B-клеточной поверхности в рамках настоящего изобретения является CD20.

[0089] Антиген "CD20" или "CD20" представляет собой негликозилированный фосфопротеин размером приблизительно 35 кДа, встречающийся на поверхности более чем 90% B-клеток периферической крови или лимфоидных органов. CD20 присутствует как на нормальных B-клетках, так и на злокачественных B-клетках, но он не экспрессируется на стволовых клетках. Другие названия для CD20 в литературе включают "ограниченный B-лимфацитами антиген" и "Bp35". Антиген CD20 описан, например, в Clark et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:1766 (1985).

[0090] "Антитело-антагонист" в рамках настоящего изобретения представляет собой антитело, которое при связывании с маркером B-клеточной поверхности на B-клетках разрушает или истощает B-клетки у млекопитающего и/или препятствует одной или нескольким функциям B-клеток, например, путем снижения или предупреждения гуморального ответа, индуцируемого B-клеткой. Антитело антагонист предпочтительно способно истощать B-клетки (т.е. снижать уровни циркулирующих B-клеток) у млекопитающего, которого лечили ими. Такого истощения можно достигать посредством различных механизмов, таких как антителозависимая клеточно-опосредуемая цитотоксичность (ADCC) и/или комплементзависимая цитотоксичность (CDC), ингибирование пролиферации B-клеток и/или индукция гибели B-клеток (например, посредством апоптоза).

[0091] "Антителозависимая клеточно-опосредуемая цитотоксичность" или "ADCC" относится опосредуемой клетками реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fc-рецепторы (FcR) (например, натуральные киллерные (NK) клетки, нейтрофилы и макрофаги) распознают связанное антитело на клетке-мишени, а затем осуществляют лизис клетки-мишени. Основные клетки для опосредования ADCC - NK-клетки - экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на кроветворных клетках обобщенно представлена в таблице 3, на стр. 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Для оценки активности ADCC представляющей интерес молекулы можно проводить анализ ADCC in vitro, такой как анализ, описанный в патенте США № 5500362 или 5821337. Пригодные эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и натуральные киллерные (NK) клетки. Альтернативно или дополнительно, активность ADCC представляющей интерес молекулы можно оценивать in vivo, например, в модели на животных, такой как модель, описанная в Clynes et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998).

[0092] "Эффекторные клетки человека" представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcR и выполняют эффекторные функции. В некоторых вариантах осуществления клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и осуществляют эффекторную функцию ADCC. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), натуральные киллерные (NK) клетки, моноциты, цитотоксические T-клетки и нейтрофилы; причем предпочтительными являются PBMC и NK-клетки.

[0093] Термины "Fc-рецептор" или "FcR" используют для описания рецептора, который связывается с Fc-областью антитела. В некоторых вариантах осуществления FcR представляет собой FcR человека с нативной последовательностью. Более того, предпочтительный FcR представляет собой FcR, который связывает IgG-антитело (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, в том числе аллельные варианты и альтернативно-сплайсированные формы этих рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA ("активирующий рецептор") и FcγRIIB ("ингибирующий рецептор"), которые обладают сходными аминокислотными последовательностями, отличающимися, главным образом, своими цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcγRIIA в своем цитоплазматическом домене содержит иммунорецепторный тирозин-связывающий активирующий мотив (ITAM). Ингибирующий рецептор FcγRIIB в своем цитоплазматическом домене содержит иммунорецепторный тирозин-связывающий ингибирующий мотив (ITIM), (см. Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcR рассмотрены в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). К термину "FcR" в настоящем описании относятся другие FcR, том числе FcR, которые будут выявлены в будущем. Также термин включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG плоду (Guyer et al, J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al, J. Immunol. 24:249 (1994)).

[0094] "Комплементзависимая цитотоксичность" или "CDC" относится к способности молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Каскад активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, полипептид (например, антитело)) в комплексе с распознаваемым ей антигеном. Для оценки активации комплемента можно проводить анализ CDC, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

[0095] "Ингибирующие рост" антитела представляют собой антитела, которые предупреждают или снижают пролиферацию клетки, экспрессирующей антиген, с которым связывается антитело. Например, антитело может предупреждать или снижать пролиферацию B-клеток in vitro и/или in vivo.

[0096] Антитела, которые "индуцируют апоптоз", представляют собой антитела, которые индуцируют запрограммированную гибель клеток, например B-клеток при определении стандартными анализами апоптоза, такими как связывание аннексина V, фрагментация ДНК, сжатие клеток, расширение эндоплазматической сети, фрагментацию клеток и/или образование мембранных везикул (называемых апоптотическими тельцами).

[0097] Термин "антитело" в рамках настоящего изобретения используют в наиболее широком значении и, в частности, он охватывает моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), образовавшиеся из по меньшей мере двух интактных антител, и фрагменты антител при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность.

[0098] "Фрагменты антител" содержат часть интактного антитела, предпочтительно содержащую ее антигенсвязывающую область. Примеры фрагментов антител включают Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv-фрагменты; диантитела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител и полиспецифические антитела, образованные фрагментами антител.

[0099] Для целей настоящего описания "интактное антитело" представляет собой антитело, содержащее вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, а также Fc-область.

[0100] "Нативные антитела" обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины массой приблизительно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, между тем как количество дисульфидных связей варьируется среди тяжелых цепей различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет межцепочечные дисульфидные мостики с равными интервалами. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (V_H), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (V_L) и константный домен на другом ее конце; константный домен легкой цепи расположен параллельно первому константному домену тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи расположен параллельно вариабельному домену тяжелой цепи. Полагают, что конкретные аминокислотные остатки образуют поверхность контакта между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи.

[0101] Термин "вариабельный" относится к тому факту, что последовательности определенных сегментов вариабельных доменов значительно отличаются среди антител и используются в связывании и специфичности каждого конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако вариабельность не является равномерной на протяжении участка вариабельных доменов антител. Она концентрируется в трех сегментах, называемых гипервариабельными областями, в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высококонсервативные участки вариабельных доменов называют каркасными областями (FR). Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, главным образом, приминающих конфигурацию β-слоев, соединенных тремя гипервариабельными участками, которые формируют петли, объединяющие структуру β-слоев, и, в некоторых случаях, формирующие ее часть. Гипервариабельные области в каждой цепи расположены вместе в непосредственной близости от FR и, совместно с гипервариабельными областями другой цепи, участвуют в формировании антигенсвязывающего центра антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константные домены не вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но они проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC).

[0102] Расщепление антител папаином обеспечивает два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых "Fab"-фрагментами, каждый из которых имеет один антигенсвязывающий участок, и остаточный "Fc"-фрагмент, название которого отражает его способность к быстрой кристаллизации. Обработка пепсином обеспечивает фрагмент F(ab')₂, который обладает двумя антигенсвязывающими участками и все еще способен связывать антиген.

[0103] "Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий участок. Эта область состоит из димера, состоящего из одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, связанных прочной нековалентной связью. Именно в этой конфигурации три гипервариабельных области каждого вариабельного домена взаимодействуют, определяя антигенсвязывающий участок на поверхности димера V_H-V_L. В совокупности, шесть гипервариабельных областей сообщают антигенсвязывающую способность антителу. Однако, даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три гипервариабельных области, специфичных к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с меньшей аффинностью, чем у целого связывающего участка.

[0104] Fab-фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на C-конце домена C_H1 тяжелой цепи, включая один или несколько остатков цистеина из шарнирной области антитела. Fab'-SH в настоящем описании представляет собой обозначение для Fab', в котором остаток(ки) цистеина константных доменов обладает свободной тиольной группой. F(ab')₂-фрагменты антитела исходно были получены в качестве пар Fab'-фрагментов, которые обладают остатками цистеина шарнирной области между ними. Также известны другие способы химического связывания фрагментов антител.

[0105] "Легкие цепи" антител (иммуноглобулинов) из любого вида позвоночных могут быть отнесены к одному из двух различных типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), исходя из аминокислотных последовательностей их константных доменов.

[0106] В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей, антитела можно отнести к различным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть далее подразделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам антител, обозначают как α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Субъединичные структуры и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

[0107] "Одноцепочечные Fv" или фрагменты антител "scFv" содержат V_H- и V_L-домены антитела, где эти домены присутствуют в виде единой полипептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между V_H- и V_L-доменами, который обеспечивают возможность формирования структуры scFv, требуемой для связывания антигена. Для обзора scFv, см. Pliickthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

[0108] Термин "диантитела" относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими участками, которые содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в одной и той же полипептидной цепи (V_H-V_L). Посредством использования линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить образование пары двумя доменами на одной цепи, домены вынуждают образовывать пары с комплементарными доменами другой цепи и формировать два антигенсвязывающих участка. Диантитела более подробно описаны, например, в EP 404,097; WO 93/11161; и Hollinger et ah, Proc. Natl. Acad. Set USA, 90:6444-6448 (1993).

[0109] Термин "моноклональное антитело", как используют в рамках изобретения, относится к антителу, полученному из совокупности по существу однородных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие совокупность, являются идентичными и/или связывают один и тот же эпитоп, за исключением возможных вариантов, которые могут появляться в процессе получения моноклонального антитела, которые присутствуют в основном в небольших количествах. В противоположность препаратам поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате моноклонального антитела направлено против одной детерминанты на антигене. В дополнение к их специфичности, препараты моноклонального антитела являются преимущественными в том, что они, как правило, не содержат примесей других иммуноглобулинов. Определение "моноклональный" указывает на тот признак антитела, что его получают из по существу гомогенной совокупности антител, и не подразумевает того, что антитело должно быть получено каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, предназначенные для применения в соответствии с настоящим изобретением, можно получать множеством способов, включая, например, способ гибридом, впервые описанный Kohler et al., Nature 256:495 (1975), или их можно получать способами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). "Моноклональные антитела" также могут быть выделены из библиотек фаговых антител с использованием способов, описанных, например, в Clackson et al, Nature 352:624-628 (1991) и Marks et al, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991).

[0110] Моноклональные антитела в рамках настоящего изобретения в особенности включают "химерные" антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как оставшаяся часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют требуемую биологическую активность (патент США № 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 81:6851-6855 (1984)). Представляющие интерес химерные антитела в рамках настоящего изобретения включают "приматизированные" антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена не являющегося человеком примата (например, старосветской мартышки, такой как бабуин, макак-резус или яванский макак) и последовательности константного домена человека (патент США № 5693780).

[0111] "Гуманизированные" формы не являющихся человеческими антител (например, мыши) представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, не являющегося человеческим. В основном, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента заменены остатками из гипервариабельной области видов, не являющихся человеком (донорное антитело), таких как мышь, крыса, кролик или не являющиеся человеком приматы, которые обладают требуемой специфичностью, аффинностью и емкостью. В некоторых случаях, остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками, не являющиеся человеческими. Более того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые отсутствуют в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации проводят для дополнительного улучшения характеристик антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит по существу все по меньшей мере из одного, и, как правило, двух, вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют гипервариабельным петлям иммуноглобулина, не являющегося человеческим, и все или по существу все FR-области представляют собой FR-области из последовательности иммуноглобулина человека, за исключением замены(замен) в FR, как указано выше. Также гуманизированное антитело необязательно содержит по меньшей мере участок константной области иммуноглобулина, как правило, константного домена иммуноглобулина человека. Для более подробной информации см. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

[0112] Термин "гипервариабельная область", как используют в настоящем описании, относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Гипервариабельная область может содержать аминокислотные остатки из "определяющей комплементарность области" или "CDR" (например приблизительно в области остатков 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в V_L, и приблизительно в области 31-35B (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в V_H (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или остатки из "гипервариабельной петли" (например остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи, и 26-32 (H1), 52A-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). "Каркасные" или "FR" остатки представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельной области, как определено в настоящем описании.

[0113] "Простое антитело" представляет собой антитело (как определено в настоящем описании), которое не конъюгировано с гетерологичной молекулой, такой как цитотоксическая часть или радиоактивная метка.

[0114] Исключительно для целей настоящего описания и если нет иных указаний, "гуманизированное 2H7" относится к гуманизированному антителу, которое связывает CD20 человека, или к его антигенсвязывающему фрагменту, где антитело является эффективным для истощения B-клеток приматов in vivo, причем антитело содержит в его вариабельной области H-цепи (V_H) по меньшей мере последовательность CDR H3 SEQ ID NO: 12 (фиг.1B) из антитела против CD20 человека и по существу консенсусные остатки каркасной области (FR) человека из тяжелой цепи подгруппы III (V_HIII) человека. В некоторых вариантах осуществления антитело дополнительно содержит последовательность CDR H1 H-цепи SEQ ID NO: 10 и последовательность CDR H2 SEQ ID NO: 11, и, в некоторых вариантах осуществления дополнительно содержит последовательность CDR L1 L-цепи SEQ ID NO: 4, последовательность CDR L2 SEQ ID NO: 5, последовательность CDR L3 SEQ ID NO: 6 и по существу консенсусные остатки каркасной области (FR) человека из легкой цепи каппа подгруппы I (V_κI) человека, где область V_H может быть связана с константной областью цепи IgG человека, где эта область может представлять собой, например, IgG1 или IgG3. В некоторых вариантах осуществления такое антитело содержит последовательность V_H SEQ ID NO: 8 (v16, как показано на фиг.1B), необязательно также содержащую последовательность V_L SEQ ID NO: 2 (v16, как показано на фиг.1A), которые могут иметь аминокислотные замены D56A и N100A в H-цепи и S92A в L-цепи (v96). В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой интактное антитело, содержащее аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепей SEQ ID NO: 13 и 14, соответственно, как показано на фиг.2 и 3. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой 2H7.v31, содержащее аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепей SEQ ID NO: 13 и 15, соответственно, как показано на фиг.2 и 4. Антитело в рамках настоящего изобретения, кроме того, может содержать по меньшей мере одну аминокислотную замену в Fc-области, которая повышает активность ADCC и/или CDC, как например, антитело, в котором аминокислотные замены представляют собой S298A/E333A/K334A, и в некоторых вариантах осуществления 2H7.v31, имеющее аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 15 (как показано на фиг.4). Любое из этих антител, кроме того, может содержать по меньшей мере одну аминокислотную замену в Fc-области, которая снижает активность CDC, например, содержит по меньшей мере одну замену K322A. См. патент США № 6528624B1 (Idusogie et al.).

[0115] Термин "окрелизумаб" (регистрационный номер CAS № 637334-45-3) в рамках настоящего изобретения относится к полученному способами генной инженерии гуманизированному моноклональному антителу, направленному против антигена CD20, и содержащему (a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и (b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, включая его фрагменты, которые сохраняют способность связывать CD20. Окрелизумаб доступен от Genentech.

[0116] "Выделенное" антитело представляет собой антитело, которое идентифицировано и отделено и/или извлечено из компонента его природного окружения. Загрязняющие компоненты природной среды, представляют собой материалы, которые препятствуют диагностическим или терапевтическим применениям антитела и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В некоторых вариантах осуществления антитело очищают (1) до более чем 95% по массе антитела, как определяют способом Лоури, и в некоторых вариантах осуществления до более чем 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности при SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием кумасси синего или, предпочтительно, окрашивания серебром. Выделенное антитело включает антитело в рекомбинантных клетках in situ, поскольку в этом случае отсутствует по меньшей мере один компонент условий природного окружения антитела. Однако, как правило, выделенное антитело получают посредством по меньшей мере одной стадии очистки.

[0117] "Индивидуум" или "пациент" в рамках настоящего изобретения представляет собой индивидуума или пациента, являющегося человеком. Как правило, индивидуум или пациент является подходящим для лечения рассеянного склероза. Для целей настоящего описания такой подходящий индивидуум или пациент представляет собой индивидуума или пациента, которые испытывают, испытывали или вероятно испытают один или несколько признаков, симптомов или других признаков рассеянного склероза; у которых диагностирован рассеянный склероз, например, вновь диагностирован (в случае "впервые выявленного" MS), ранее диагностирован с новым рецидивом или обострением, ранее диагностирован и находится в состоянии ремиссии и т.д.; и/или имеется риск развития рассеянного склероза. Индивидуум, страдающий риском наличия рассеянного склероза, может быть необязательно идентифицирован как индивидуум, который был подвергнут скринингу в отношении повышенных уровней положительных по CD20 B-клеток в сыворотке, цереброспинальной жидкости (CSF) и/или бляшке(ах) MS, и/или подвергнут скринингу с использованием анализа для обнаружения аутоантител, оцениваемых качественно и предпочтительно количественно. Иллюстративные такие аутоантитела, ассоциированные с рассеянным склерозом, включают антитела против основного белка миелина (MBP), антитела против олигодендроцитарного гликопротеина миелина (MOG), антитела против ганглиозида и/или антитела против нейрофиламентов. Такие аутоантитела могут быть обнаружены в сыворотке индивидуума, цереброспинальной жидкости (CSF) и/или бляшке MS. Под "повышенным" уровнем(ями) аутоантител или B-клеток в рамках настоящего изобретения подразумевают уровень(и) таких аутоантител или B-клеток, которые значительно превышают уровень(и) у индивидуума без MS.

[0118] Как используют в рамках изобретения, "лечение" или "проведение лечения" представляет собой подход для получения благоприятных или желательных результатов, включая клинические результаты. Для целей настоящего изобретения благоприятные или желательные клинические результаты включают, но не ограничиваются ими, один или несколько из следующих: снижение одного или нескольких симптомов заболевания, уменьшение степени заболевания, стабилизацию заболевания (например, предупреждение или замедление ухудшения заболевания), отсрочивание или замедление прогрессирования заболевания, смягчение болезненного состояния, снижение дозы одного или нескольких других лекарственных средств, требуемых для лечения заболевания и/или повышение качества жизни.

[0119] Как используют в рамках изобретения, "отсрочивание" или "замедление" прогрессирования рассеянного склероза означает отсрочивание, задерживание, замедление, затормаживание, стабилизацию и/или отдаление развития заболевания. Это отсрочивание может иметь различную продолжительность, в зависимости от анамнеза заболевания и/или индивидуума, подвергаемого лечению.

[0120] Как используют в рамках изобретения "в момент начала лечения" относится к периоду времени при или перед первым воздействием лекарственного средства против рассеянного склероза, такого как антитело против CD20. В некоторых вариантах осуществления "в момент начала лечения" представляет собой любое из одного года, девяти месяцев, шести месяцев, трех месяцев, двух месяцев или одного месяцев перед введением средства против рассеянного склероза, такого как антитело против CD20. В некоторых вариантах осуществления "в момент начала лечения" означает от непосредственно перед до момента, совпадающего с первым воздействием лекарственного средства против рассеянного склероза, такого как антитело против CD20.

[0121] Как используют в рамках изобретения, "на основе" включает (1) оценку, определение или измерение характеристик пациента, как описано в настоящем описании (и предпочтительно выбор пациента, пригодного для проведения лечения); и (2) проведение лечения(й), как описано в настоящем описании.

[0122] "Симптом" MS представляет собой любое патологическое явление или отклонение от нормы в отношении структуры, функции или ощущений, испытываемое индивидуумом и указывающее на MS.

[0123] "Рассеянный склероз" относится к хроническому и часто инвалидизирующему заболеванию центральной нервной системы, характеризующемуся прогрессирующим разрушением миелина. Существует четыре международно признанных формы MS, а именно, первично-прогрессирующий рассеянный склероз (PPMS), рецидивирующе-ремиттирующий рассеянный склероз (RRMS), вторично-прогрессирующий рассеянный склероз (SPMS) и прогрессирующе-рецидивирующий рассеянный склероз (PRMS).

[0124] "Прогрессирующий рассеянный склероз", как используют в рамках изобретения, относится к первично-прогрессирующему рассеянному склерозу (PPMS), вторично-прогрессирующему рассеянному склерозу (SPMS) и прогрессирующе-рецидивирующему рассеянному склерозу (PRMS). В некоторых вариантах осуществления прогрессирующий рассеянный склероз характеризуется документально подтвержденной необратимой утратой неврологической функции, сохраняющейся в течение ≥ 6 месяцев, которая не может быть отнесена к клиническому рецидиву.

[0125] "Первично-прогрессирующий рассеянный склероз" или "PPMS" характеризуется постепенным прогрессированием заболевания от его возникновения с редкими сопутствующими рецидивами и ремиссиями. Могут существовать периоды стабилизации активности заболевания и могут существовать хорошие и плохие дни или недели. PPMS отличается от RRMS и SPMS тем, что возникновение, как правило, происходит в возрасте поздних тридцатых или ранних сороковых лет, мужчины имеют такую же вероятность его развития, что и женщины, и первоначальная активность заболевания часто располагается в спинном мозге, но не в головном мозге. Активность заболевания PPMS также можно наблюдать (или обнаруживать) в головном мозге. PPMS представляет собой подтип MS, который с наименьшей вероятностью демонстрирует воспалительные (усиливаемые гадолинием) бляшки при сканировании MRI. Первично-прогрессирующей формой заболевания страдает от 10 до 15% всех людей с рассеянным склерозом. PPMS может быть определен согласно критериям et al. Ann Neurol 69:292-392 (2010). Индивидуум с PPMS, подвергаемый лечению в рамках изобретения, обычно представляет собой индивидуума с вероятным или окончательным диагнозом PPMS.

[0126] "Рецидивирующе-ремиттирующий рассеянный склероз" или "RRMS" характеризуется рецидивами (также известными как обострения), в ходе которых могут появляться новые симптомы и старые могут вновь появляться или ухудшаться. После рецидивов следуют периоды ремиссии, в ходе которых индивидуум полностью или частично восстанавливается от нарушений, приобретенных во время рецидива. Рецидивы могут длиться в течение суток, недель или месяцев, и восстановление может быть медленным или постепенным или практически мгновенным. У большинства людей с MS сначала диагностируют RRMS. Это происходит, как правило, в возрасте двадцатых или тридцатых лет, хотя известны значительно более ранние или более поздние диагнозы. Этот подтип MS присутствует у женщин в два раза чаще, чем у мужчин. Во время рецидивов миелин, защитная изолирующая оболочка вокруг нервных волокон (нейронов) в областях белого вещества центральной нервной системы (ЦНС), может повреждаться при воспалительном ответе собственной иммунной системой организма. Это вызывает широкое множество неврологических симптомов, которые могут значительно варьироваться в зависимости от того, какие области ЦНС повреждены. Непосредственно после рецидива воспалительный ответ угасает и конкретный тип глиальных клеток в ЦНС (называемых олигодендроцитами) способствует ремиелинизации - процессу, посредством которого миелиновая оболочка вокруг аксона может быть восстановлена. Именно ремиелинизация может быть ответственна за ремиссию. Приблизительно 50% пациентов с RRMS становятся пациентами с SPMS в течение 10 лет от возникновения заболевания. После 30 лет эта цифра достигает 90%. В любой момент времени люди с рецидивирующе-ремиттирующей формой заболевания составляют приблизительно 55% от всех людей с MS.

[0127] "Вторично-прогрессирующий рассеянный склероз" или "SPMS" характеризуется устойчивым прогрессированием клинического неврологического повреждения с сопутствующими рецидивами или без них и с небольшими ремиссиями и стабилизацией. Люди, у которых развился SPMS, ранее имели период RRMS, который может длиться от двух до сорока лет или более. Любые сопутствующие рецидивы и ремиссии имеют тенденцию к утиханию с течением времени. С начала вторично-прогрессирующей фазы заболевания нетрудоспособность начинает развиваться значительно быстрее, чем при RRMS, хотя прогрессирование может все еще быть достаточно медленным у некоторых индивидуумов. Через 10 лет у 50% людей с RRMS развивается SPMS. К моменту от 25 до 30 лет эта цифра достигает 90%. SPMS имеет тенденцию к тому, чтобы быть ассоциированным с более низкими уровнями образования воспалительных бляшек, чем при RRMS, однако общая тяжесть заболевания продолжает увеличиваться. В любой момент времени люди с SPMS составляют приблизительно 30% от всех людей с рассеянным склерозом.

[0128] "Прогрессирующе-рецидивирующий рассеянный склероз", обозначаемый "PRMS", характеризуется устойчивым прогрессированием клинического неврологического повреждения с сопутствующими рецидивами и ремиссиями. Непосредственно после рецидива происходит значительное выздоровление, однако между рецидивами происходит постепенное ухудшение симптомов. PRMS страдает приблизительно 5% всех людей с рассеянным склерозом. Некоторые неврологи полагают, что PRMS является вариантом PPMS. Выражение "эффективное количество" относится к количеству антитела (или другого лекарственного средства), которое является эффективным для смягчения или лечения рассеянного склероза. Такое эффективное количество, как правило, приводит к улучшению признаков, симптомов или других показателей MS, таких как уменьшение частоты рецидивов, предупреждение инвалидизации, снижение количества и/или объема бляшек головного мозга при MRI, улучшение показателя ходьбы на 25 футов на время, замедление или отсрочивание прогрессирования заболевания, такое как увеличение времени до прогрессирования заболевания (например, с использованием расширенной шкалы оценки состояния инвалидности EDSS) и т.д.

[0129] "Воздействие антитела" относится к контакту с антителом или воздействие антитела, описанного в настоящем описании, в одной или нескольких дозах, вводимых в течение периода времени приблизительно 1-20 суток. Дозы могут быть введены в одно время или с фиксированными или нерегулярными временными интервалами в течение этого периода воздействия. Первоначальное и последующие (например, второе или третье) воздействия антител разделены по времени друг от друга, как подробно описано в настоящем описании.

[0130] Как используют в рамках изобретения, "интервал" между воздействиями антитела относится к периоду времени между более ранним воздействием антитела и более поздним воздействием антитела. Воздействие антитела по настоящему изобретению может включать одну или две дозы. В случаях, когда воздействие антитела включает одну дозу, интервал между двумя воздействиями антител относится к количеству времени, прошедшему между дозой одного воздействия антитела (например, 1 сутки) и дозой следующего воздействия антитела. Если одного воздействие антитела включает две дозы, и следующее воздействие антитела включает одну дозу, интервал между двумя воздействиями антитела относится к количеству времени, прошедшему между первой из двух доз первого воздействия антитела (например, сутки 1) и дозой следующего воздействия антитела. В случаях, когда каждое из двух воздействий антител содержит две дозы, интервал между воздействиями антител относится к количеству времени, прошедшему между первой из двух доз первого воздействия антитела (например, сутки 1) и первой дозой из двух доз второго воздействия антитела. Например, если способ по настоящему изобретению включает первое воздействие антитела с двумя дозами и второе воздействие антитела с двумя дозами и второе воздействие антитела не осуществляют, пока не пройдет приблизительно 24 недели или 6 месяцев после первого воздействия антитела, тогда интервал между первой дозой первого воздействия антитела и первой дозой второго воздействия антитела составляет приблизительно 24 недель или 6 месяцев.

[0131] Термин "иммунодепрессивное средство", как используют в рамках изобретения для вспомогательной терапии, относится к веществам, которые действуют, подавляя или маскируя иммунную систему млекопитающего, подвергаемого лечению в рамках настоящего изобретения. Он может включать вещества, которые подавляют продукцию цитокинов, снижают или подавляют экспрессию собственных антигенов, или маскируют антигены MHC. Примеры таких средств включают 2-амино-6-арил-5-замещенные пиримидины (см. патент США № 4665077); нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID); ганцикловир, такролимус, глюкокортикоиды, такие как кортизол или альдостерон, противовоспалительные средства, такие как ингибитор циклооксигеназы, ингибитор 5-липоксигеназы, или антагонист рецептора лейкотриена; антагонисты пуринов, такие как азатиоприн или микофенолата мофетил (MMF); алкилирующие средства, такие как циклофосфамид; бромкриптин; даназол; дапзон; глутаральдегид (который маскирует антигены MHC, как описано в патенте США № 4120649); антиидиотипические антитела для антигенов MHC и фрагментов MHC; циклоспорин A; стероиды, такие как кортикостероиды или глюкокортикостероиды или аналоги глюкокортикоидов, например, преднизон, метилпреднизолон и дексаметазон; ингибиторы дигидрофолатредуктазы, такие как метотрексат (пероральный или подкожный); гидроксихлороквин; сульфасалазин; лефлуномид; антагонисты цитокинов или рецепторов цитокинов, включая антитела против интерферона-альфа, -бета или -гамма, антитела против фактора некроза опухоли-альфа (инфликсимаб или адалимумаб), иммуноадгезин против TNF-альфа (этанерцепт), антитела против фактора некроза опухоли-бета, антитела против интерлейкина-2 и антитела против рецептора IL-2; антитела против LFA-1, включая антитела против CD11a и против CD18; антитела против L3T4; гетерологичный антилимфоцитарный глобулин; общие антитела против T-клеток, предпочтительно антитела против CD3 или против CD4/CD4a; растворимый пептид, содержащий связывающий домен LFA-3 (WO 90/08187, опубликованная 7/26/90); стрептокиназу; TGF-бета; стрептодорназу; РНК или ДНК из хозяина; FK506; RS-61443; дезоксиспергуалин; рапамицин; рецептор T-клеток (Cohen et al., патент США № 5114721); фрагменты T-клеточного рецептора (Offner et al., Science, 251: 430-432 (1991); WO 90/11294; Janeway, Nature, 341: 482 (1989); и WO 91/01133); и антитела против T-клеточного рецептора (EP 340109), такие как T10B9.

[0132] Термин "цитотоксическое средство", как используют в настоящем описании, относится к веществу, которое ингибирует функционирование клеток, или препятствует ему, и/или вызывает разрушение клеток. Подразумевают, что термин включает радиоактивные изотопы (например, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические средства и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины из бактерий, грибов, растений или животных, или их фрагменты.

[0133] "Химиотерапевтическое средство" представляет собой химическое соединение, пригодное для лечения злокачественной опухоли. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид CYTOXAN^®; алкилсульфонаты, такие как бисульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогинины (особенно буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая его синтетические аналоги на основе адозелезина, карзелезина и бизелезина); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги, KW-2189 и CB1-TM1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлолрнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднемустин, трофосфамид, иприт урацила; нитрозомочевинаы, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимустин; антибиотики, такие как эндииновые антибиотики (например, калихеамицин, особенно калихеамицин гамма1I и калихеамицин омега1I (см., например, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин A; бифосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также хромофор на основе неокарциностатина и сходные хромопротеиновые хромофоры на основе эндииновых антибиотиков), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, cактиномицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, декторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин ADRIAMYCIN^® (включая морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марселломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пуринов, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидинов, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадренальные средства, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; средства для восполнения фолиевой кислоты, такие как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамид гликозид; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демекольцин; диазиквон; эльфорнитин; эллиптиний ацетат; эпотилон; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK^® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно токсин T-2, верракурин A, роридин A и ангвидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-C"); циклофосфамид; тиотепу; таксоиды, например, TAXOL^® паклитаксел (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), свободный от кремофора модифицированный альбумином состав наночастиц паклитаксела ABRAXANE^TM (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) и доксетаксел TAXOTERE^® (Rhône- Poulenc Rorer, Antony, Франция); хлоранбуцил; гемцитабин GEMZAR^®; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; NAVELBINE^® винорелбин; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселоду; ибандронат; CPT-11; ингибитор топоизомераз RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из описанных выше.

[0134] Также в это определение входят антигормональные средства, которые действуют, регулируя или ингибируя действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены и селективные модуляторы рецепторов эстрогенов (SERM), включая, например, тамоксифен (включая тамоксифен NOLVADEX^®), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торемифен FARESTON; ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, которая регулирует продукцию эстрогена в надпочечниках, например, такие как 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, магестрола ацетат MEGASE^®, экземестан AROMASIN^®, форместан, фадрозол, ворозол RIVISOR^®, лектрозол FEMARA^®, и анастрозол ARIMIDEX^®; и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, леупролид и гозерелин; а также троксацитабин (нуклеозидный аналог цитозина 1,3-диоксолан); антисмысловые олигонуклеотиды, в частности, олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессию генов в каскадах передачи сигнала, вовлеченных в аберрантную пролиферацию клеток, например, такие как PKC-альфа, Ralf и H-Ras; вакцины, такие как вакцины для генной терапии, например, вакцина ALLOVECTIN^®, вакцина LEUVECTIN^® и вакцина VAXID^®; PROLEUKIN^® rIL-2; ингибитор топоизомеразы 1 LURTOTECAN^®; ABARELIX^® rmRH; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеуказанных.

[0135] Термин "цитокин" является общим термином для белков, высвобождаемых одной популяцией клеток, которые воздействуют на другую клетку в качестве межклеточных медиаторов. Примерами таких цитокинов являются лимфокины, монокины, интерлейкины (IL), такие как IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; фактор некроза опухоли, такой как TNF-α или TNF-β; и другие полипептидные факторы, включая LIF и kit-лиганд (KL). Как используют в рамках изобретения, термин "цитокин" включает белки из природных источников или из рекомбинантных клеточных культур и биологически активные эквиваленты цитокинов с нативной последовательностью, включая полученные синтетическими способами низкомолекулярные соединения и их фармацевтически приемлемые производные и соли.

[0136] Термин "гормон" относится к полипептидным гормонам, которые, как правило, секретируется железистыми органами с протоками. К гормонам относятся, например, гормон роста, такой как гормон роста человека, N-метионильный гормон роста человека и бычий гормон роста; паратиреоидный гормон; тироксин; инсулин; проинсулин; релаксин; эстрадиол; гормон-замещающая терапия; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан или тестолактон; прорелаксин; гликопротеиновые гормоны, такие как фолликуло-стимулирующий гормон (FSH), тиреостимулирующий гормон (TSH) и лютеинизирующий гормон (LH); пролактин, плацентарный лактоген, гонадотропин-ассоциированный пептид мыши, гонадотропин-рилизинг фактор; ингибин; активин; мюллерово ингибирующее вещество и тромбопоэтин. Как используют в рамках настоящего изобретения, термин "гормон" включает белки из природных источников или из рекомбинантной клеточной культуры и биологически активные эквиваленты гормона с нативной последовательностью, включая синтетически продуцируемые низкомолекулярные соединения и их фармацевтически приемлемые производные и соли.

[0137] Термин "фактор роста" относится к белкам, которые обеспечивают рост и включают, например, печеночный фактор роста; фибробластный фактор роста; сосудисто-эндотелиальный фактор роста; факторы роста нервов, такие как NGF-β; тромбоцитарный фактор роста; трансформирующие факторы роста (TGF), такие как TGF-α и TGF-β; инсулиноподобный фактор роста-I и -II; эритропоэтин (EPO); остеоиндуктивные факторы; интерфероны, такие как интерферон-α, -β и -γ; и колониестимулирующие факторы (CSF), такие как макрофагальный CSF (M-CSF); гранулоцитарно-макрофагальный CSF (GM-CSF) и гранулоцитарный CSF (G-CSF). Как используют в рамках настоящего изобретения, термин "фактор роста" включает белки из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток и биологически активные эквиваленты фактора роста с нативной последовательностью, включая синтетически продуцируемые низкомолекулярные соединения и их фармацевтически приемлемые производные и соли.

[0138] Термин "интегрин" относится к рецепторному белку, который позволяет клеткам как связываться с внеклеточным матриксом, так и отвечать на него, и который вовлечен в различные клеточные функции, такие как заживление ран, дифференцировка клеток, хоминг опухолевых клеток и апоптоз. Они являются частью крупного семейства рецепторов клеточной адгезии, которые вовлечены во взаимодействия клетка-внеклеточный матрикс и клетка-клетка. Функциональные интегрины состоят из двух трансмембранных гликопротеиновых субъединиц, называемых альфа и бета, которые являются связанными нековалентно. Альфа-субъединицы обладают гомологией между собой, также как и бета-субъединицы. Рецепторы всегда содержат одну альфа-цепь и одну бета-цепь. Примеры включают альфа-6-бета-1, альфа-3-бета-1, альфа-7-бета1, LFA-1 и т.д. Как используют в рамках изобретения, термин "интегрин" включает белки из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток и биологически активные эквиваленты интегрина с нативной последовательностью, включая синтетически продуцируемые низкомолекулярные соединения и их фармацевтически приемлемые производные и соли.

[0139] Примеры "антагонистов интегринов или антител против интегринов" в рамках настоящего изобретения включают антитело против LFA-1; антитело против альфа-4 интегрина, такое как натализумаб (TYSABRI^®), доступное от Biogen Idec/Elan Pharmaceuticals, Inc.; диазациклические производные фенилаланина (WO 2003/89410); производные фенилаланина (WO 2003/70709, WO 2002/28830, WO 2002/16329 и WO 2003/53926); производные фенилпропионовой кислоты (WO 2003/10135); производные энамина (WO 2001/79173); производные пропионовой кислоты (WO 2000/37444); производные алкановой кислоты (WO 2000/32575); замещенные фенильные производные (патенты США № 6677339 и 6348463); производные ароматических аминов (патент США № 6369229) и полипептид дизинтегринового домена ADAM (US2002/0042368), антитела к интегрину альфа-v-бета-3 (EP 633945); аза-связанные бициклические производные аминокислот (WO 2002/02556) и т.д.

[0140] Для целей настоящего описания, "фактор некроза опухоли альфа (TNF-альфа)" относится к молекуле TNF-альфа человека, содержащей аминокислотную последовательность, как описано в Pennica et al., Nature, 312:721 (1984) или Aggarwal et al., JBC, 260:2345 (1985).

[0141] "Ингибитор TNF-альфа" в рамках настоящего изобретения представляет собой средство, которое ингибирует в некоторой степени биологическую функцию TNF-альфа, как правило, посредством связывания TNF-альфа и нейтрализации его активности. Примерами ингибиторов TNF, конкретно предусматриваемых в рамках настоящего изобретения, являются этанерцепт (ENBREL^®), инфликсимаб (REMICADE^®) и адалимумаб (HUMIRA™).

[0142] Примеры "модифицирующих заболевание противоревматических лекарственных средств" или "DMARD" включают гидроксихлороквин, сульфасалазин, метотрексат, лефлуномид, этанерцепт, инфликсимаб (плюс пероральный и подкожный метотрексат), азатиоприн, D-пеницилламин, золото (пероральное), золото (внутримышечное), миноциклин, циклоспорин, иммуносорбцию со стафилококковым белком A, включая его соли и производные и т.д.

[0143] Примерами "нестероидных противовоспалительных лекарственных средств" или "NSAID" являются ацетилсалициловая кислота, ибупрофен, напроксен, индометацин, сулиндак, толметин, включая их соли и производные и т.д.

[0144] "Кортикостероид" относится к любому из нескольких синтетических или встречающихся в природе веществ с общей химической структурой стероидов, которые имитируют или усиливают эффекты встречающихся в природе кортикостероидов. Примеры синтетических кортикостероидов включают преднизон, преднизолон (включая метилпреднизолон), дексаметазон, глюкокортикоид и бетаметазон.

[0145] "Вкладыш в упаковку" относится к инструкциям, обычно включаемым в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, противопоказаниях, других терапевтических продуктах, подлежащих комбинированию с упакованным продуктом, и/или предупреждения, касающиеся применения таких терапевтических продуктов и т.д.

[0146] "Ярлык" используют в рамках настоящего изобретения для обозначения информации, обычно включаемой в коммерческие упаковки фармацевтических составов, включая контейнеры, такие как флаконы, и вкладыши в упаковку, а также другие типы упаковок.

[0147] Указание на "приблизительно" величину или параметр в рамках настоящего изобретения включает (и описывает) варьирование, относящееся к самой этой величине или параметру. Например, описание, указывающее на "приблизительно X" включает описание "X".

[0148] Как используют в рамках изобретения и в прилагаемой формуле изобретения, форма единственного числа включает множественное число объекта отсылки, если контекст явно не указывает на иное. Понятно, что аспекты и варианты изобретения, описанные в настоящем описании, включают "состоящий" и/или "по существу состоящий" из аспектов и вариантов.

[0149] Следует понимать, что одно, некоторые или все свойства различных вариантов осуществления, описанных в настоящем описании, можно комбинировать для получения вариантов осуществления настоящего изобретения. Эти и другие аспекты изобретения станут очевидными специалисту в данной области.

[0150] Все ссылки, цитированные в настоящем описании, включая патентные заявки и публикации, включены в качестве ссылок в полном объеме.

II. Способы лечения

[0151] В определенных вариантах осуществления предусматривается способ обеспечения улучшения функциональной способности у пациента, имеющего рассеянный склероз, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где пациент имеет улучшение функциональной способности после лечения; где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

[0152] В определенных вариантах осуществления пациент после лечения имеет подтвержденное снижение нетрудоспособности по меньшей мере приблизительно в течение 12 недель. В определенных вариантах осуществления пациент после лечения имеет подтвержденное снижение нетрудоспособности в течение по меньшей мере 24 недель. В определенных вариантах осуществления подтвержденное снижение нетрудоспособности определяют с помощью показателя расширенной шкалы оценки состояния инвалидности (EDSS). В определенных вариантах осуществления показатель EDSS пациента снижается по меньшей мере приблизительно на 0,1, приблизительно на 0,2, приблизительно на 0,3, приблизительно на 0,4, приблизительно на 0,5, приблизительно на 0,6, приблизительно на 0,7, приблизительно на 0,8, приблизительно на 0,9, приблизительно на 1,0 или более чем на приблизительно 1,0 балл (как например, приблизительно на 1,1, приблизительно на 1,2, приблизительно на 1,3, приблизительно на 1,4 или приблизительно на 1,5 балла).

[0153] В определенных вариантах осуществления улучшение функциональной способности сохраняется в течение по меньшей мере приблизительно 1 недели, по меньшей мере приблизительно 2 недель, по меньшей мере приблизительно 3 недель, по меньшей мере приблизительно 4 недель, по меньшей мере приблизительно 5 недель, по меньшей мере приблизительно 6 недель, по меньшей мере приблизительно 7 недель, по меньшей мере приблизительно 8 недель, по меньшей мере приблизительно 9 недель, по меньшей мере приблизительно 10 недель, по меньшей мере приблизительно 11 недель, по меньшей мере приблизительно12 недель, по меньшей мере приблизительно 13 недель, по меньшей мере приблизительно 14 недель, по меньшей мере приблизительно 15 недель, по меньшей мере приблизительно 16 недель, по меньшей мере приблизительно 17 недель, по меньшей мере приблизительно 18 недель, по меньшей мере приблизительно 19 недель, по меньшей мере приблизительно 20 недель, по меньшей мере приблизительно 21 недели, по меньшей мере приблизительно 22 недель, по меньшей мере приблизительно 23 недель, включая любой диапазон между этими величинами. В определенных вариантах осуществления улучшение функциональной способности сохраняется в течение по меньшей мере приблизительно 24 недель, по меньшей мере приблизительно 25 недель, по меньшей мере приблизительно 26 недель, по меньшей мере приблизительно 27 недель, по меньшей мере приблизительно 28 недель, по меньшей мере приблизительно 29 недель, по меньшей мере приблизительно 30 недель, по меньшей мере приблизительно 35 недель, по меньшей мере приблизительно 40 недель, по меньшей мере приблизительно 45 недель, по меньшей мере приблизительно 50 недель, по меньшей мере приблизительно 55 недель, по меньшей мере приблизительно 60 недель, по меньшей мере приблизительно 65 недель, по меньшей мере приблизительно 70 недель, по меньшей мере приблизительно 75 недель или более чем приблизительно 75 недель, включая любой диапазон между этими величинами.

[0154] В определенных вариантах осуществления повышение функциональной способности измеряют с помощью испытании ходьбы на 25 футов на время (T25-FW). В определенных вариантах осуществления время ходьбы на 25 футов после начала лечения уменьшается приблизительно на 5 секунд, приблизительно на 10 секунд, приблизительно на 30 секунд, приблизительно на 60 секунд, приблизительно на 90 секунд, приблизительно на 2 минуты, приблизительно на 2,5 минуты, приблизительно на 3 минуты, приблизительно на 3,5 минуты, приблизительно на 4 минуты, приблизительно на 4,5 минуты, приблизительно на 5 минут, приблизительно на 5,5 минуты, приблизительно на 6 минут, приблизительно на 6,5 минуты, приблизительно на 7 минут, приблизительно на 7,5 минуты, приблизительно на 8 минут, приблизительно на 8,5 минуты, приблизительно на 9 минут, приблизительно на 9,5 минуты или приблизительно на 10 минут относительно времени ходьбы на 25 футов непосредственно перед началом лечения.

[0155] В определенных вариантах осуществления повышение функциональной активности демонстрируется отсутствием признаков активности заболевания (NEDA). В определенных вариантах осуществления NEDA демонстрируется отсутствием новых или увеличивающихся T2-бляшек или усиливаемых гадолинием T1-бляшек при магнитно-резонансной томографии. В определенных вариантах осуществления NEDA демонстрируется отсутствием рецидива. В определенных вариантах осуществления NEDA демонстрируется отсутствием прогрессирования. В определенных вариантах осуществления NEDA демонстрируется отсутствием ухудшения EDSS. В определенных вариантах осуществления NEDA определяется как: отсутствие определяемых протоколом рецидивов, отсутствие событий CDP, отсутствие новых или увеличивающихся T2-бляшек и отсутствие усиливаемых гадолинием T1-бляшек. В определенных вариантах осуществления NEDA сохраняется в течение по меньшей мере приблизительно 1 недели, по меньшей мере приблизительно 2 недель, по меньшей мере приблизительно 3 недель, по меньшей мере приблизительно 4 недель, по меньшей мере приблизительно 5 недель, по меньшей мере приблизительно 6 недель, по меньшей мере приблизительно 7 недель, по меньшей мере приблизительно 8 недель, по меньшей мере приблизительно 9 недель, по меньшей мере приблизительно 10 недель, по меньшей мере приблизительно 11 недель, по меньшей мере приблизительно12 недель, по меньшей мере приблизительно 13 недель, по меньшей мере приблизительно 14 недель, по меньшей мере приблизительно 15 недель, по меньшей мере приблизительно 16 недель, по меньшей мере приблизительно 17 недель, по меньшей мере приблизительно 18 недель, по меньшей мере приблизительно 19 недель, по меньшей мере приблизительно 20 недель, по меньшей мере приблизительно 21 недели, по меньшей мере приблизительно 22 недель, по меньшей мере приблизительно 23 недель, включая любой диапазон между этими величинами. В определенных вариантах осуществления повышение функциональной способности сохраняется в течение по меньшей мере приблизительно 24 недель, по меньшей мере приблизительно 25 недель, по меньшей мере приблизительно 26 недель, по меньшей мере приблизительно 27 недель, по меньшей мере приблизительно 28 недель, по меньшей мере приблизительно 29 недель, по меньшей мере приблизительно 30 недель, по меньшей мере приблизительно 35 недель, по меньшей мере приблизительно 40 недель, по меньшей мере приблизительно 45 недель, по меньшей мере приблизительно 50 недель, по меньшей мере приблизительно 55 недель, по меньшей мере приблизительно 60 недель, по меньшей мере приблизительно 65 недель, по меньшей мере приблизительно 70 недель, по меньшей мере приблизительно 75 недель или более чем приблизительно 75 недель, включая любой диапазон между этими величинами.

[0156] В определенных вариантах осуществления пациент имеет окрашивающиеся гадолинием T1-бляшки на исходном уровне (т.е. до начала лечения). В определенных вариантах осуществления пациент не имеет окрашивающихся гадолинием T1-бляшек на исходном уровне (т.е. до начала лечения).

[0157] В определенных вариантах осуществления в рамках настоящего изобретения предусматривается способ подавления прогрессирования нетрудоспособности у пациента-человека, имеющего рассеянный склероз, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где введение приводит к снижению подтвержденных случаев прогрессирования нетрудоспособности, и где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В определенных вариантах осуществления введение приводит к снижению 12-недельного подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности. В определенных вариантах осуществления введение приводит к снижению 24-недельного подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности.

[0158] В определенных вариантах осуществления пациент имеет окрашивающиеся гадолинием T1-бляшки на исходном уровне (т.е. до начала лечения). В определенных вариантах осуществления пациент не имеет окрашивающихся гадолинием T1-бляшек на исходном уровне (т.е. до начала лечения).

[0159] В определенных вариантах осуществления в рамках настоящего изобретения предусматривается способ замедления возникновения подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности у пациента-человека, имеющего рассеянный склероз, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

[0160] В определенных вариантах осуществления подтвержденное прогрессирование нетрудоспособности определяют с помощью показателя расширенной шкалы оценки состояния инвалидности (EDSS). В определенных вариантах осуществления показатель EDSS пациента возрастает по меньшей мере приблизительно на 1,0 балл относительно исходного показателя EDSS, составляющего приблизительно 5,5 или менее. В определенных вариантах осуществления показатель EDSS пациента возрастает приблизительно на 0,5 балла относительно исходного показателя EDSS, превышающего 5,5. В определенных вариантах осуществления увеличение EDSS подтверждается по меньшей мере через 12 недель после первоначального неврологического ухудшения.

[0161] В определенных вариантах осуществления пациент имеет окрашивающиеся гадолинием T1-бляшки на исходном уровне (т.е. до начала лечения). В определенных вариантах осуществления пациент не имеет окрашивающихся гадолинием T1-бляшек на исходном уровне (т.е. до начала лечения).

[0162] В определенных вариантах осуществления в рамках настоящего изобретения предусматривается способ уменьшения объема T2-бляшек у пациента-человека, имеющего рассеянный склероз, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В определенных вариантах осуществления пациент имеет окрашивающиеся гадолинием T1-бляшки на исходном уровне. В определенных вариантах осуществления пациент не имеет окрашивающихся гадолинием T1-бляшек на исходном уровне.

[0163] В определенных вариантах осуществления предусматривается способ замедления или предупреждения уменьшения объема головного мозга у пациента, имеющего рассеянный склероз, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где уменьшение объема головного мозга замедляется или предупреждается у пациента; и где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В определенных вариантах осуществления уменьшение объема головного мозга замедляется. В определенных вариантах осуществления уменьшение объема головного мозга предупреждается у пациента, который не имел уменьшения объема головного мозга. В определенных вариантах осуществления предупреждается дальнейшее уменьшение объема головного мозга у пациента, который имеет уменьшение объема головного мозга.

[0164] В определенных вариантах осуществления предусматривается способ замедления или предупреждения атрофии головного мозга у пациента, имеющего рассеянный склероз, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где у пациента замедляется или предупреждается атрофия головного мозга; и где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В определенных вариантах осуществления атрофия головного мозга замедляется. В определенных вариантах осуществления атрофия головного мозга предупреждается у пациента, который не имел атрофии головного мозга. В определенных вариантах осуществления предупреждается дальнейшая атрофия головного мозга у пациента, который имеет атрофию головного мозга.

[0165] В определенных вариантах осуществления предусматривается способ лечения пациента-человека с рассеянным склерозом, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где лечение приводит к отсутствию признаков активности заболевания (NEDA) в течение по меньшей мере 12 недель, где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В определенных вариантах осуществления лечение приводит к отсутствию признаков активности заболевания (NEDA) в течение по меньшей мере 24 недель.

[0166] Предусматривается способ лечения пациента-человека с рассеянным склерозом, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где лечение приводит к достижению пациентом свободного от бляшек статуса после 96 недель лечения, где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В определенных вариантах осуществления лечение приводит к достижению пациентом свободного от бляшек статуса после 48 недель лечения. В определенных вариантах осуществления лечение приводит к достижению свободного от бляшек статуса после 24 недель лечения. В определенных вариантах осуществления лечение приводит к тому, что пациент является свободным от окрашивающихся гадолинием бляшек. В определенных вариантах осуществления лечение приводит к тому, что пациент является свободным от T2-бляшек.

[0167] В определенных вариантах осуществления предусматривается способ лечения пациента-человека с рецидивирующей формой рассеянного склероза, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где лечение приводит к одному или нескольким из следующих: a) пациент является свободным от рецидивов через 96 недель; b) пациент не имеет подтвержденных событий прогрессирования нетрудоспособности через 96 недель; c) пациент не имеет усиливаемых гадолинием T1-бляшек через 96 недель; d) пациент не имеет новых и/или увеличивающихся T2-бляшек через 96 недель; где антитело против CD20 содержит: 1) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и 2) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

[0168] В определенных вариантах осуществления пациента ранее не лечили другой терапией рассеянного склероза (т.е. "наивный пациент"). В определенных вариантах осуществления наивный пациент переносит по меньшей мере 2 рецидива за 2 года перед началом лечения. В определенных вариантах осуществления наивный пациент переносит по меньшей мере 1 рецидив за последний год перед началом лечения.

[0169] В определенных вариантах осуществления пациент имеет недостаточный ответ на другую терапию рассеянного склероза. В определенных вариантах осуществления пациента, который имеет недостаточный ответ, ранее лечили интерфероном бета-1a или глатирамера ацетатом в течение по меньшей мере 1 года. В определенных вариантах осуществления пациент, который имеет недостаточный ответ, переносит по меньшей мере один рецидив или имеет по меньшей мере 1 исходную усиливаемую гадолинием бляшку в то время, как его лечат другой терапией рассеянного склероза.

[0170] В определенных вариантах осуществления предусматривается способ лечения пациента-человека с высокоактивным рассеянным склерозом, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

[0171] В определенных вариантах осуществления пациента с высокоактивным рассеянным склерозом ранее не лечили другой терапией рассеянного склероза (т.е. "наивный пациент"). В определенных вариантах осуществления наивные пациенты с высокоактивным рассеянным склерозом переносят по меньшей мере 2 рецидива за последний год перед рандомизацией, и имеют либо (a) по меньшей мере 1 исходную усиливаемую гадолинием бляшку, либо (b) увеличение количества T2-бляшек при первоначальном посещении (изменение категории от 0-5 до 6-9 бляшек или от 6-9 бляшек до > 9 бляшек), по сравнению с предшествующим MRI.

[0172] В определенных вариантах осуществления пациент с высокоактивным рассеянным склерозом имеет недостаточный ответ на другую терапию рассеянного склероза. В определенных вариантах осуществления пациента с высокоактивным рассеянным склерозом, который имеет недостаточный ответ, ранее лечили интерфероном бета-1a или глатирамера ацетатом в течение по меньшей мере 1 года. В определенных вариантах осуществления пациент с высокоактивным рассеянным склерозом, который имеет недостаточный ответ, перенес по меньшей мере один рецидив и либо (a) имел по меньшей мере девять T2-бляшек или (b) имел по меньшей мере одну усиливаемую гадолинием бляшку на исходном уровне в то время, как его лечили другой терапией рассеянного склероза.

[0173] В определенных вариантах осуществления введение антитела против CD20 пациенту с высокоактивным рассеянным склерозом является эффективным для одного или нескольких из следующих: (1) уменьшение количества бляшек в головном мозге пациента; (2) снижение среднегодовой частоты рецидивов; (3) снижение прогрессирования нетрудоспособности; и (4) улучшение функциональной способности. В определенных вариантах осуществления способ лечения пациента с высокоактивным рассеянным склерозом дополнительно включает проведение MRI-сканирования и определение того, имеет ли пациент высокоактивный рассеянный склероз, до введения пациенту антитела против CD20.

[0174] В определенных вариантах осуществления предусматривается способ лечения пациента-человека с ранней стадией рассеянного склероза, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает диагностику пациента, имеющего раннюю стадию рассеянного склероза, до введения пациенту антитела против CD20.

[0175] В определенных вариантах осуществления предусматривается способ лечения пациента-человека с рассеянным склерозом, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где лечение приводит к отсутствию признаков активности заболевания активность у пациента, и где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

[0176] В определенных вариантах осуществления пациент имеет рецидивирующую форму рассеянного склероза. В некоторых вариантах осуществления рецидивирующая форма MS (RMS) относится к выборке пациентов, обычно состоящей как из пациентов с RRMS, так и из пациентов с SPMS с сопутствующими рецидивами (также обычно называемого "рецидивирующим SPMS"). В определенных вариантах осуществления рецидивирующая форма рассеянного склероза представляет собой рецидивирующе-ремиттирующий рассеянный склероз (RRMS). В определенных вариантах осуществления рецидивирующая форма рассеянного склероза представляет собой вторично-прогрессирующий рассеянный склероз с сопутствующими рецидивами (rSPMS). В определенных вариантах осуществления пациент имеет прогрессирующий рассеянный склероз. В определенных вариантах осуществления прогрессирующий рассеянный склероз представляет собой первично-прогрессирующий рассеянный склероз. В определенных вариантах осуществления пациент имеет возраст менее 18 лет. В определенных вариантах осуществления пациент имеет возраст от 18 до 55 лет. В определенных вариантах осуществления пациент имеет возраст более 55 лет.

[0177] В некоторых вариантах осуществления "подтвержденное прогрессирование нетрудоспособности" или "CDP" относится к увеличению по меньшей мере на 1,0 балл от исходного показателя EDSS у пациентов с исходным показателем 5,5 или менее, или увеличению на 0,5 балла у пациентов с исходным показателем более 5,5 в течение 96 недель, где увеличение EDSS подтверждается при регулярном запланированном посещении по меньшей мере через 12 недель после первоначального неврологического ухудшения.

[0178] В некоторых вариантах осуществления "подтвержденное снижение нетрудоспособности" или "CDI" относится к уменьшению показателя EDSS по меньшей мере на 1,0 балл по сравнению с исходным уровнем у пациентов с исходным показателем EDSS 5,5 или менее, или снижение на 0,5 балла у пациентов с исходным показателем EDSS выше 5,5.

[0179] В некоторых вариантах осуществления атрофия головного мозга относится к одному или нескольким из следующих: потеря аксонов в головном мозге, потеря ткани в бляшках серого вещества или бляшках белого вещества, уоллеровское перерождение путей, связанное с бляшками, или нагрузка бляшками. В определенных вариантах осуществления атрофия головного мозга относится к уменьшению объема всего головного мозга. В определенных вариантах осуществления атрофия головного мозга относится к уменьшению объема одной или нескольких структур головного мозга (включая, но не ограничиваясь ими, полушария головного мозга, мозжечок, таламус, лобно-височный неокортекс, ствол головного мозга, гиппокамп, теменную долю и/или гипоталамус). В определенных вариантах осуществления атрофия головного мозга относится к истончению коры в прецентральной извилине, верхней лобной извилине, таламусе и/или скорлупе. В определенных вариантах осуществления атрофия головного мозга относится к потере по меньшей мере приблизительно 0,4%, по меньшей мере приблизительно 0,5%, по меньшей мере приблизительно 0,6%, или по меньшей мере 0,7% объема головного мозга в год. Следующие детали, касающиеся атрофии головного мозга, подробно описаны, например, в Riley et al. (2012) Expert Rev Neurother 12(3), 323-333.

[0180] В некоторых вариантах осуществления пациент или индивидуум имеют высокоактивный рассеянный склероз. В некоторых вариантах осуществления "высокоактивный рассеянный склероз" при лечении наивных пациентов относится к пациентам, которых ранее не лечили другим способом терапии рассеянного склероза и которые перенесли по меньшей мере 2 рецидива за последний год перед рандомизацией, и либо (a) имеют по меньшей мере 1 исходную усиливаемую гадолинием бляшку, либо (b) имеют увеличение количества T2-бляшек при исходном посещении (изменение категории от 0-5 до 6-9 бляшек или от 6-9 бляшек до >9 бляшек) по сравнению с предшествующим исследованием MRI. В некоторых вариантах осуществления "высокоактивный рассеянный склероз" относится к пациентам, которых ранее лечили другой терапией рассеянного склероза и которые имели по меньшей мере один рецидив за последний год и либо (a) имеют по меньшей мере девять T2-бляшек, либо (b) имеют по меньшей мере одну усиливаемую гадолинием бляшку на исходном уровне.

[0181] В определенных вариантах осуществления исходный уровень у пациента относится к уровню до введения или лечения антителом против CD20 пациенту, например, приблизительно за 2 месяца, приблизительно за 1,5 месяца, приблизительно за 1 месяц, приблизительно за 30 суток, приблизительно за 25 суток, приблизительно за 21 сутки, приблизительно за 14 суток, приблизительно за 7 суток, приблизительно за 6 суток, приблизительно за 5 суток, приблизительно за 4 суток, приблизительно за 3 суток, приблизительно за 2 суток, приблизительно за 1 сутки перед введением или лечением пациента антителом против CD20.

[0182] В определенных вариантах осуществления пациент сохраняет способность индуцировать гуморальный иммунный ответ на антиген в ходе лечения. В определенных вариантах осуществления антиген представляет собой антиген свинки, антиген краснухи, антиген ветрянки, антиген S. pneumonia, антиген столбнячного токсоида, пневмококковый антиген или антиген вируса гриппа.

[0183] Способы, описанные в настоящем описании, могут охватывать любую комбинацию вариантов осуществления, описанных в настоящем описании.

III. Дозировки

[0184] Согласно некоторым вариантам осуществления любого из способов и изделий, описанных в настоящем описании, способ или инструкции включают введение эффективного количества антитела против CD20 пациенту с рассеянным склерозом для обеспечения первоначального воздействия антитела от приблизительно 0,3 до приблизительно 4 грамм (предпочтительно от приблизительно 0,3 до приблизительно 1,5 грамма, как например, приблизительно 0,6 грамм или приблизительно 1,0 грамм), за которым следует второе воздействие антитела от приблизительно 0,3 до приблизительно 4 грамм (предпочтительно от приблизительно 0,3 до приблизительно 1,5 грамма, как например, приблизительно 0,6 грамм или приблизительно 1,0 грамм), причем воздействие второго антитела не осуществляют до от приблизительно 16 до приблизительно 60 недель после первоначального воздействия антитела. Для целей настоящего изобретения второе воздействие антитела представляет собой следующий раз, когда пациента лечат антителом против CD20, после первоначального воздействия антитела с отсутствием промежуточного лечения или воздействия антитела против CD20 между первоначальным и вторым воздействиями. В некоторых вариантах осуществления первоначальное воздействие антитела и/или второе воздействие антитела представляет собой любое из 0,3 грамма, 0,4 грамма, 0,5 грамма, 0,6 грамма, 0,7 грамма, 0,8 грамма, 0,9 грамма или 1,0 грамм.

[0185] Интервал между первоначальным и вторым или последующими воздействиями антитела можно измерять от первой дозы первоначального воздействия антитела.

[0186] В некоторых вариантах осуществления воздействия антител осуществляют с интервалами приблизительно 24 недели или 6 месяцев; или приблизительно 48 недель или 12 месяцев.

[0187] В одном варианте осуществления второе воздействие антитела не осуществляют до момента от приблизительно 20 до приблизительно 30 недель после первоначального воздействия, необязательно с последующим третьим воздействием антитела в количестве от приблизительно 0,3 до приблизительно 4 грамм (предпочтительно от приблизительно 0,3 до приблизительно 1,5 грамма), причем третье воздействие не проводят до приблизительно от 46 до 60 недель (предпочтительно приблизительно от 46 до 54 недель) после первоначального воздействия, а затем в некоторых вариантах осуществления не проводят следующего воздействия антитела до по меньшей мере приблизительно 70-75 недель после первоначального воздействия. В некоторых вариантах осуществления третье воздействие антитела осуществляют в любом количестве из приблизительно 0,3 грамма, 0,4 грамма, 0,5 грамма, 0,6 грамма, 0,7 грамма, 0,8 грамма, 0,9 грамма или 1,0 грамма.

[0188] В альтернативном варианте осуществления второе воздействие антитела не осуществляют до приблизительно от 46 до 60 недель после первоначального воздействия и последующие воздействия антитела не осуществляют до приблизительно от 46 до 60 недель после первоначального воздействия антитела.

[0189] Любое одно или несколько из воздействий антител в рамках настоящего изобретения может быть предоставлено пациенту в качестве однократной дозы антитела или в качестве двух отдельных доз антитела (т.е. состоящих из первой и второй дозы). Конкретное количество доз (одна или две), используемых для каждого воздействия антитела может зависеть, например, от типа подвергаемого лечению MS, типа используемого антитела, использования и типа используемого второго лекарственного средства, и способа и частоты введения. Когда вводят две отдельных дозы, вторую дозу предпочтительно вводят в течение приблизительно от 3 до 17 суток, более предпочтительно приблизительно от 6 до 16 суток, и наиболее предпочтительно приблизительно от 13 до 16 суток после введения первой дозы. В некоторых вариантах осуществления, когда вводят две отдельных дозы, вторую дозу вводят приблизительно через 14 суток. Когда вводят две отдельных дозы, первая и вторая дозы антитела предпочтительно составляют приблизительно от 0,3 до 1,5 грамма, более предпочтительно от приблизительно 0,3 до приблизительно 1,0 грамма. В некоторых вариантах осуществления, где вводят две отдельных дозы, первая и вторая дозы антитела представляют собой любую из 0,3 грамма, 0,4 грамма, 0,5 грамма или 0,6 грамма. В некоторых вариантах осуществления первоначальное воздействие окрелизумаба включает первую дозу и вторую дозу окрелизумаба, где первая доза и вторая доза окрелизумаба составляют приблизительно 0,3 грамма. В некоторых вариантах осуществления второе воздействие окрелизумаба включает однократную дозу окрелизумаба, где однократная доза окрелизумаба составляет 0,6 грамма.

В одном варианте осуществления предусматривается по меньшей мере приблизительно три, по меньшей мере приблизительно четыре или по меньшей мере приблизительно пять воздействий антитела у пациента, например, приблизительно от 3 до 60 воздействий, и, более конкретно, приблизительно от 3 до 40 воздействий, наиболее часто приблизительно от 3 до 20 воздействий. В некоторых вариантах осуществления любого из способов способы дополнительно включают предоставление от приблизительно одного до приблизительно трех последующих воздействий окрелизумаба. В некоторых вариантах осуществления такое воздействие осуществляют с интервалами приблизительно 24 недель или 6 месяцев, или 48 недель или 12 месяцев. В определенных вариантах осуществления интервал укорочен приблизительно на 4 недели, приблизительно на 3,5 недели, приблизительно на 3 недели, приблизительно 2,5 недели, приблизительно на 2 недели, приблизительно на 1,5 недели, приблизительно на 1 неделю, приблизительно на 6 суток, приблизительно на 5 суток, приблизительно на 4 суток, приблизительно на 3 суток, приблизительно на 2 суток или приблизительно на 1 сутки. В определенных вариантах осуществления более одного 1 интервала укорочено приблизительно на 4 недели, приблизительно на 3,5 недели, приблизительно на 3 недели, приблизительно на 2,5 недели, приблизительно на 2 недели, приблизительно на 1,5 недели, приблизительно на 1 неделю, приблизительно на 6 суток, приблизительно на 5 суток, приблизительно на 4 суток, приблизительно на 3 суток, приблизительно на 2 суток или приблизительно на 1 сутки. В определенных вариантах осуществления интервал удлинен приблизительно на 4 недели, приблизительно на 3,5 недели, приблизительно на 3 недели, приблизительно на 2,5 недели, приблизительно на 2 недели, приблизительно на 1,5 недели, приблизительно на 1 неделю, приблизительно на 6 суток, приблизительно на 5 суток, приблизительно на 4 суток, приблизительно на 3 суток, приблизительно на 2 суток или приблизительно на 1 сутки. В определенных вариантах осуществления более одного интервала удлинено приблизительно на 4 недели, приблизительно на 3,5 недели, приблизительно на 3 недели, приблизительно на 2,5 недели, приблизительно на 2 недели, приблизительно на 1,5 недели, приблизительно на 1 неделю, приблизительно на 6 суток, приблизительно на 5 суток, приблизительно на 4 суток, приблизительно на 3 суток, приблизительно на 2 суток или приблизительно на 1 сутки. В определенных вариантах осуществления более 1 интервала укорочено приблизительно на 4 недели, приблизительно на 3,5 недели, приблизительно на 3 недели, приблизительно на 2,5 недели, приблизительно на 2 недели, приблизительно на 1,5 недели, приблизительно на 1 неделю, приблизительно на 6 суток, приблизительно на 5 суток, приблизительно на 4 суток, приблизительно на 3 суток, приблизительно на 2 суток или приблизительно на 1 сутки или удлинено приблизительно на 4 недели, приблизительно на 3,5 недели, приблизительно на 3 недели, приблизительно на 2,5 недели, приблизительно на 2 недели, приблизительно на 1,5 недели, приблизительно на 1 неделю, приблизительно на 6 суток, приблизительно на 5 суток, приблизительно на 4 суток, приблизительно на 3 суток, приблизительно на 2 суток или приблизительно на 1 сутки.

[0190] В одном варианте осуществления каждое воздействие антитела осуществляют в качестве однократной дозы антитела. В альтернативном варианте осуществления каждое воздействие антитело осуществляют в качестве двух отдельных доз антитела. В некоторых вариантах осуществления некоторое воздействие осуществляют в качестве однократной дозы или в качестве двух отдельных доз.

[0191] Антитело может представлять собой простое антитело или может быть конъюгировано с другой молекулой, такой как цитотоксическое средство, такое как радиоактивное соединение. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой ритуксимаб, гуманизированное 2H7 (например, содержащее последовательности вариабельного домена SEQ ID NO. 2 и 8) или гуманизированное 2H7, содержащее последовательности вариабельного домена SEQ ID NO. 23 и 24, или huMax-CD20 (Genmab). В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой окрелизумаб (например, содержащий (a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и (b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14).

[0192] В одном варианте осуществления пациента ранее никогда не лечили лекарственным средством(ами), таким как иммунодепрессивное средство(а), для лечения рассеянного склероза и/или никогда ранее не лечили антителом к маркеру B-клеточной поверхности (например никогда ранее не лечили антителом против CD20).

[0193] Антитело вводят любыми подходящими способами, включая перентарельное, местное, подкожное, внутрибрюшинное, внутрилегочное, интраназальное и/или осуществляемое в очаг повреждения введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Также предусматривается интратекальное введение (см., например, патентную заявку США № 2002/0009444, Grillo-Lopez, A concerning intrathecal delivery of a CD20 antibody). Кроме того, антитело можно вводить импульсной инфузией, например, со снижающимися дозами антитела. В некоторых вариантах осуществления дозирование проводят внутривенно, подкожно или интратекально. В некоторых вариантах осуществления дозирование проводят посредством внутривенной инфузии(ий).

[0194] Хотя антитело против CD20 может быть единственным лекарственным средством, вводимым пациенту для лечения рассеянного склероза, необязательно можно вводить второе лекарственное средство, такое как цитотоксическое средство, химиотерапевтическое средство, иммунодепрессивное средство, цитокин, антагонист цитокина или антитело к нему, фактор роста, гормон, интегрин, антагонист интегрина или антитело к нему (например, антитело против LFA-1 или антитело против альфа 4 интегрина, такое как натализумаб (TYSABRI^®), доступный от Biogen Idec/Elan Pharmaceuticals, Inc) и т.д., вместе с антителом, которое связывает маркер B-клеточной поверхности (например, с антителом против CD20).

[0195] В некоторых вариантах осуществления комбинированной терапии, антитело комбинируют с лекарственным средством класса интерферонов, таким как IFN-бета-1a (REBIF^® и AVONEX^®) или IFN-бета-1b (BETASERON^®); олигопептидом, таким как глатирамера ацетат (COPAXONE^®); цитотоксическим средством, таким как митоксантрон (NOVANTRONE^®), метотрексат, циклофосфамид, хлорамбуцил, азатиоприн; внутривенным иммуноглобулином (гамма-глобулин); истощающей лимфоциты терапией (например, митоксантрон, циклофосфамид, алемтузумаб (Campath^®, LEMTRADA^TM), антитело против CD4, кладрибин, тотальное облучение всего организма, трансплантация костного мозга); кортикостероидом (например, метилпреднизолон, преднизон, дексаметазон или глюкокортикоид), включая системную терапию кортикостероидами; не истощающей лимфоциты иммунодепрессивной терапией (например, микофенолат мофетил (MMF) или циклоспорин); снижающими уровень холестерина лекарственными средствами класса "статинов", которые включают церивастатин (BAYCOL^®), флувастатин (LESCOL^®), аторвастатин (LIPITOR^®), ловастатин (MEVACOR^®), правастатин (PRAVACHOL^®), симвастатин (ZOCOR^®); эстрадиол; тестостерон (необязательно при повышенных дозах; Stuve et al. Neurology 8:290-301 (2002)); гормон-заместительной терапией; лечением симптомов, вторичных для MS или связанных с MS (например, спастичность, недержание, боль, усталость); ингибитором TNF; модифицирующим заболеванием противоревматическим средством (DMARD); нестероидным противовоспалительным средством (NSAID); плазмаферезом; левотироксином; циклоспорином A; аналогом соматостатина; антагонистом цитокина или рецептора цитокина; антиметаболитом; иммунодепрессивным средством; реабилитирующей хирургической операцией; радиоактивным йодом; тиреоидэктомией; другим антагонистом B-клеточной поверхности/антителом к ней; и т.д.

[0196] Второе лекарственное средство вводят при первоначальном воздействии и/или последующих воздействиях антитела против CD20, такое комбинированное введение включает совместное введение с использованием отдельных составов или одного фармацевтического состава и последовательное введение в любом порядке, где предпочтительно существует период времени, когда оба (или все) активных вещества одновременно проявляют их виды биологической активности.

[0197] Помимо введения антител пациенту, настоящее изобретение предусматривает введение посредством генной терапии. Такое введение нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, охватывается выражением введение "эффективного количества" антитела. См., например, WO96/07321, опубликованную 14 марта 1996 года, касающуюся применения генной терапии для получения внутриклеточных антител.

[0198] Существует два основных подхода введения нуклеиновой кислоты (необязательно содержащейся в векторе) в клетки пациента: in vivo и ex vivo. Для доставки in vivo нуклеиновую кислоту инжектируют прямо пациенту, обычно в области, где требуется антитело. Для лечения ex vivo клетки пациента извлекают, нуклеиновую кислоту вводят в эти выделенные клетки и модифицированные клетки вводят пациенту либо прямо, либо, например, инкапсулированными в пористые мембраны, которые имплантируют пациенту (см., например, патенты США № 4892538 и 5283187). Существует множество способов, доступных для введения нуклеиновых кислот в живые клетки. Способы варьируются в зависимости от того, переносится ли нуклеиновая кислота в культивируемые клетки in vitro или в клетки предполагаемого хозяина in vivo. Способы, пригодные для переноса нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих in vitro, включают применение липосом, электропорацию, микроинъекцию, слияние клеток, использование DEAE-декстрана, способ преципитации с фосфатом кальция и т.д. Обычно используемым вектором для доставки гена ex vivo является ретровирус.

[0199] В некоторых вариантах осуществления способы переноса нуклеиновой кислоты in vivo включают трансфекцию вирусными векторами (такими как аденовирус, вирус простого герпеса I или аденоассоциированный вирус) и системы на основе липидов (пригодными липидами для опосредуемого липидами переноса генов являются, например, DOTMA, DOPE и DC-Chol). В некоторых ситуациях, является желательным предоставление источника нуклеиновой кислоты со средством, которое нацелено на клетки-мишени, такое как антитело, специфичное к мембранному белку клеточной поверхности или клетке-мишени, лиганд для рецептора на клетке-мишени и т.д. Когда используют липосомы, для нацеливания и/или облегчения захвата можно использовать белки, которые связываются с мембраной клеточной поверхности, ассоциированные с эндоцитозом, например, капсидные белки или их фрагменты, тропные к конкретному типу клеток, антитела для белков, которые претерпевают интернализацию при циклировании, и белки, которые нацелены на внутриклеточную локализацию и повышают внутриклеточное время полужизни. Способ рецептор-опосредуемого эндоцитоза описан, например, Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987); и Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990). Для обзора известных в настоящее время протоколов маркирования генов и генной терапии см. Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). Также см. WO 93/25673 и ссылки, цитированные в ней.

IV. Антитела и их получение

[0200] В способах и изделиях по настоящему изобретению используются или они включают антитело, которое связывается с маркером B-клеточной поверхности, в частности, антитело, которое связывается с CD20. Таким образом, способы получения таких антител описаны в настоящем описании.

[0201] В некоторых вариантах осуществления антитело против CD20, используемое в способах, описанных в настоящем описании, получают способом, включающим экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей гуманизированное антитело, содержащее аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей SEQ ID NO: 14 или 13, соответственно, в клетке-хозяине и выделение гуманизированного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, экспрессируемых в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего (например, клетку CHO), клетку насекомого или клетку растения. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку. Способы получения антител против CD20 дополнительно описаны, например, в патенте США № 7799900.

[0202] Маркер B-клеточной поверхности для применения для получения или скрининга антитела может представлять собой, например, растворимую форму маркера или его части, содержащую желаемый эпитоп. Альтернативно или дополнительно, клетки, экспрессирующие маркер на их клеточной поверхности, можно использовать для получения или скрининга антител. Другие формы маркера B-клеточной поверхности, пригодные для получения антител, будут очевидны специалистам в данной области.

[0203] В описании представлены иллюстративные способы получения антител, используемых в соответствии с настоящим изобретением.

(i) Поликлональные антитела

[0204] Поликлональные антитела предпочтительно индуцируют у животных многократными подкожными (п/к) или внутрибрюшинными (в/б) инъекциями соответствующего антигена и адъюванта. Может быть пригодной конъюгация соответствующего антигена с белком, который является иммуногенным у вида, подлежащего иммунизации, например гемоцианиномом лимфы улитки (KLH), сывороточным альбумином, бычьим тиреоглобулином, или ингибитором трипсина сои, с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, например, сложного эфира малеимидобензоилсульфосукцинимида (конъюгация через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимида (через остатки лизина), глутаральдегида, янтарного ангидрида, SOCl₂, или R¹N=C=NR, где R и R¹ являются отличающимися алкильными группами.

[0205] Животных иммунизируют антигеном, иммуногенными конъюгатами или производными путем комбинирования, например, 100 мкг или 5 мкг белка или конъюгата (для кроликов или мышей, соответственно) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда и инжектирования раствор внутрикожно в множество областей. Через один месяц животным проводят вспомогательную инъекцию от 1/5 до 1/10 исходного количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда посредством подкожной инъекции в множество областей. Через от семи до 14 суток у животных проводят взятие крови и сыворотку анализируют в отношении титра антител. Вспомогательные инъекции у животных проводят до тех пор, пока титр не достигнет плато. В некоторых вариантах осуществления у животного проводят вспомогательную иммунизацию конъюгатом того же антигена, но с другим белком и/или через другой линкерный реагент. Конъюгаты также можно получать в рекомбинантной культуре клеток в качестве слитых белков. Также можно использовать средства, вызывающие агрегацию, такие как квасцы, для усиления иммунного ответа.

(ii) Моноклональные антитела

Моноклональные антитела получают из совокупности по существу однородных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие совокупность, являются идентичными и/или связывают один и тот же эпитоп за исключением возможных вариантов, которые появляются в ходе продукции моноклонального антитела, причем такие варианты обычно присутствуют в небольших количествах. Таким образом, определение "моноклональный" указывает на тот признак антитела, что оно не является смесью различных или поликлональных антител.

[0206] Например, моноклональные антитела можно получать с использованием способа гибридом, впервые описанного Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или их можно получать способами рекомбинантных ДНК (патент США № 4816567).

[0207] В способе гибридом мышь или другое пригодное животное-хозяин, такой как хомячок, иммунизируют, как описано выше, для индукции лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые специфично связываются с белком, используемым для иммунизации. Альтернативно лимфоциты можно иммунизировать in vitro. Затем лимфоциты подвергают слиянию с клетками миеломы с использованием пригодного средства, вызывающего слияние клеток, такого как полиэтиленгликоль, с получением гибридомных клеток (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

[0208] Полученные таким образом гибридомные клетки высевают и выращивают в пригодной культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание неслитых родительских клеток миеломы. Например, если родительские клетки миеломы лишены фермента гипоксантин-гуанин-фосфорибозил-трансферазы (HGPRT или HPRT), селективная культуральная среда для гибридом, как правило, включает вещества гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), которые препятствуют росту клеток с дефицитом HGPRT.

[0209] В некоторых вариантах осуществления клетки миеломы представляют собой клетки, которые эффективно подвергаются слиянию, поддерживают стабильную продукцию антитела на высоком уровне выбранными антителопродуцирующими клетками, и являются чувствительными к среде, такой как HAT. Среди них, в некоторых вариантах осуществления миеломные клеточные линии представляют собой линии миеломы мышей, такие как линии, происходящие из опухолей мышей MOPC-21 и MPC-11, доступные в Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, США, и клетки SP-2 или X63-Ag8-653, доступные в American Type Culture Collection, Rockville, Mariland, США. Также для продукции моноклональных антител человека описаны миеломные клеточные линии и линии гетеромиеломы мыши-человека (Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984); и Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

[0210] Культуральную среду, в которой выращивают гибридомные клетки, анализируют в отношении продукции моноклональных антител, направленных против антигена. В некоторых вариантах осуществления специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых гибридомными клетками, определяют посредством иммунопреципитации или анализа связывания in vitro, такого как радиоиммунный анализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

[0211] Аффинность связывания моноклонального антитела можно определять, например, посредством анализа Скэтчарда, описанного в Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

[0212] После идентификации гибридомных клеток, которые продуцируют антитела с требуемой специфичностью, аффинностью и/или активностью, клоны можно субклонировать способами лимитирующих разведений и выращивать стандартными способами (Goding, Monoclonal antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Пригодные для этой цели культуральные среды включают, например, среду D-MEM или RPMI-1640. Кроме того, гибридомные клетки можно выращивать in vivo у животных в качестве асцитных опухолей.

[0213] Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, пригодным способом выделяют из культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки общепринятыми способами очистки антител, например, такими как хроматография с белком A-Sepharose, хроматография с гидроксилапатитом, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.

[0214] ДНК, кодирующую моноклональные антитела, без труда выделяют и секвенируют с использованием общепринятых способов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфично связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антител мыши). В некоторых вариантах осуществления в качестве источника такой ДНК служат гибридомные клетки. Для обеспечения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах, после выделения ДНК можно встраивать в экспрессирующие векторы, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки миеломы, которые в ином случае не продуцируют белок иммуноглобулина. Обзорные статьи о рекомбинантной экспрессии в бактериях ДНК, кодирующей антитело, включают Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol, 5:256-262 (1993) и Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

[0215] В следующем варианте осуществления моноклональные антитела или фрагменты антител можно выделять из фаговых библиотек антител, созданных с использованием способов, описанных в McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). В Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol Biol, 222:581-597 (1991) описано выделение антител мыши и человека, соответственно, с использованием фаговых библиотек. В более поздних публикациях описана продукция высокоаффинных (нМ-порядок) антител человека посредством шаффлинга цепей (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), а также комбинаторной инфекции и рекомбинации in vivo в качестве стратегии для конструирования очень крупных фаговых библиотек (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Таким образом, эти способы представляют собой приемлемые альтернативы традиционным способам гибридомных моноклональных антител для выделения моноклональных антител.

[0216] Также ДНК можно модифицировать, например, посредством замены кодирующими последовательностями константного домена тяжелой и легкой цепи человека гомологичных последовательностей мыши (патент США № 4816567; и Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci USA, 81:6851 (1984)), или ковалентного связывания с кодирующей иммуноглобулин последовательностью всей или части кодирующей последовательности для не являющегося иммуноглобулином полипептида.

[0217] Как правило, такими последовательностями полипептидов, не являющихся иммуноглобулинами, заменяют константные домены антитела, или ими заменяют вариабельные домены одного антигенсвязывающего участка антитела с получением химерного двухвалентного антитела, содержащего один антигенсвязывающий центр со специфичностью к одному антигену и другой антигенсвязывающий центр со специфичностью к другому антигену.

(iii) Гуманизированные антитела

[0218] Способы гуманизации антител, не являющихся человеческими, описаны в данной области. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело обладает одним или несколькими встроенными в него аминокислотными остатками из источника, который не является человеческим. Эти не являющиеся человеческими аминокислотные остатки часто называют "импортными" остатками, которые, как правило, взяты из "импортного" вариабельного домена. Гуманизацию, главным образом, можно проводить в соответствии со способом Winter и коллег (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), посредством замены последовательностями гипервариабельных областей соответствующих последовательностей антитела человека. Таким образом, такие "гуманизированные" антитела представляют собой химерные антитела (патент США № 4816567), где по существу менее целого вариабельного домена человека заменено соответствующей последовательностью не являющегося человеком вида. На практике, гуманизированные антитела, как правило, представляют собой антитела человека, в которых некоторые остатки гипервариабельной области и возможно некоторые остатки FR заменены остатками из аналогичных участков антител грызунов.

[0219] Выбор вариабельных доменов человека, как легких, так и тяжелых цепей, для использования при получении гуманизированных антител является очень важным для снижения антигенности. Согласно так называемому способу "наилучшего соответствия", последовательность вариабельного домена антитела грызуна подвергают скринингу относительно целой библиотеки известных последовательностей вариабельных доменов человека. Последовательность человека, которая является наиболее сходной с последовательностью грызуна, затем принимают в качестве каркасной области (FR) человека для гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol, 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol, 196:901 (1987)). В другом способе используют конкретную каркасную область, полученную из консенсусной последовательности всех антител человека из конкретной подгруппы вариабельных областей легких или тяжелых цепей. Одну и ту же каркасную область можно использовать для нескольких различных гуманизированных антител (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol, 151:2623 (1993)).

[0220] Кроме того, важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой аффинности к антигену и других положительных биологических свойств. Для достижения этой цели в некоторых вариантах осуществления гуманизированные антитела получают с помощью процесса анализа исходных последовательностей и различных предполагаемых гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов являются широкодоступными и известны специалистам в данной области. Доступными являются компьютерные программы, которые иллюстрируют и выводят на экран возможные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей иммуноглобулинов-кандидатов. Исследование этих выведенных на экран данных позволяет проводить анализ возможной роли остатков в функционировании предполагаемых последовательностей иммуноглобулинов, т.е. анализ остатков, которые влияют на способность иммуноглобулина-кандидата связывать свой антиген. Таким образом, можно отбирать остатки FR и комбинировать их из реципиентной и импортной последовательностей таким образом, чтобы были достигнуты требуемые свойства антител, такие как повышенная аффинность к антигену(ам)-мишени. Как правило, остатки гипервариабельной области оказывают непосредственное и наиболее значительное влияние на связывание антигена.

[0221] В некоторых вариантах осуществления антитело против CD20 представляет собой гуманизированное антитело против 2H7. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело против 2H7 предпочтительно содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей CDR, как показано на фиг.1A и 1B. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело 2H7 предпочтительно содержит одну, две, три, четыре, пять или шесть из следующих последовательностей CDR:

последовательность CDR L1 RASSSVSYXH, где X представляет собой M или L (SEQ ID NO: 18), например, RASSSVSYMH (SEQ ID NO: 4) (фиг. 1A),

последовательность CDR L2 APSNLAS (SEQ ID NO: 5) (фиг.1A),

последовательность CDR L3 QQWXFNPPT, где X представляет собой S или A (SEQ ID NO: 19), например, QQWSFNPPT (SEQ ID NO: 6) (фиг.1A),

последовательность CDR H1 GYTFTSYNMH (SEQ ID NO: 10) (фиг.1B),

последовательность CDR H2 AIYPGNGXTSYNQKFKG, где X представляет собой D или A (SEQ ID NO: 20), например AIYPGNGDTSYNQKFKG (SEQ ID NO: 11) (фиг.1B), и

последовательность CDR H3 VVYYSXXYWYFDV, где X в положении 6 представляет собой N, A, Y, W или D, и X в положении 7 представляет собой S или R (SEQ ID NO: 21), например VVYYSNSYWYFDV (SEQ ID NO: 12) (фиг.1B).

[0222] Последовательности CDR, описанные выше, как правило, присутствуют в каркасных последовательностях вариабельной области легой цепи и вариабельной области тяжелой цепи, таких как по существу человеческие консенсусные остатки FR легкой цепи каппа подгруппы I (V_L6I) человека, и по существу человеческие консенсусные остатки FR тяжелой цепи подгруппы III (V_HIII) человека. Также см. WO 2004/056312 (Lowman et al.).

[0223] В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи может быть связана с константной областью IgG-человека, где область может представлять собой, например, область IgG1 или IgG3, включая нативную последовательность и варианты константных областей.

[0224] В некоторых вариантах осуществления такое антитело содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 8 (v16, как показано на фиг.1B), и необязательно также содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 2 (v16, как показано на фиг.1A), которая необязательно содержит одну или несколько аминокислотную замену(замен) в положениях 56, 100 и/или 100a, например, D56A, N100A или N100Y, и/или S100aR в вариабельном домене тяжелой цепи и одну или несколько аминокислотную замену(замен) в положениях 32 и/или 92, например M32L и/или S92A, вариабельного домена легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой интактное антитело, содержащее аминокислотные последовательности легкой цепи SEQ ID NO: 13 или 16, и аминокислотные последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 14, 15, 17, 22 или 25. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело 2H7 представляет собой окрелизумаб (Genentech).

[0225] В вариантах осуществления гуманизированное 2H7 представляет собой интактное антитело или фрагмент антитела, содержащие последовательность вариабельной области легкой цепи:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 2);

и последовательность вариабельной области тяжелой цепи:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 8).

[0226] В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело 2H7 представляет собой интактное антитело, в некоторых вариантах осуществления оно содержит аминокислотную последовательность легкой цепи:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVДНКLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 13);

и аминокислотную последовательность тяжелой цепи:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 14)

или аминокислотную последовательность тяжелой цепи:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 26)

или аминокислотную последовательность тяжелой цепи:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 15)

или аминокислотную последовательность тяжелой цепи:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 27).

[0227] В некоторых вариантах осуществления аминокислота K на C-конце тяжелой цепи удалена.

[0228] В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело 2H7 содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи 2H7.v511:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 23)

и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 2H7.v511:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 24).

[0229] В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело 2H7.v511 представляет собой интактное антитело, оно может содержать аминокислотную последовательность легкой цепи:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVДНКLQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 16)

и аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 17 или:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 25).

[0230] В некоторых вариантах осуществления антитело в рамках настоящего изобретения дополнительно содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в Fc-области, которая повышает активность ADCC, такую как аминокислотные замены в положениях 298, 333 и 334, предпочтительно S298A, E333A и K334A, с использованием нумерации Eu для остатков тяжелой цепи. Также см. патент США № 6737056B1, Presta. Любое из этих антител может содержать по меньшей мере одну замену в Fc-области, которая повышает связывание FcRn или время полужизни в сыворотке, например замену в положении 434 тяжелой цепи, такую как N434W. Также см. патент США № 6737056B1, Presta. Любое из этих антител, кроме того, может содержать по меньшей мере одну аминокислотную замену в Fc-области, которая увеличивает активность CDC, например, может содержать по меньшей мере замену в положении 326, предпочтительно K326A или K326W. Также см. патент США № 6528624B1 (Idusogie et al.).

[0231] некоторых вариантах осуществления гуманизированные варианты 2H7 представляют собой варианты, содержащие вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO: 2 и вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO: 8, включая варианты с заменами в Fc-области (если присутствуют) или без них, и варианты, содержащие вариабельный домен тяжелой цепи с изменением N100A; или D56A и N100A; или D56A, N100Y, и S100aR; в SEQ ID NO: 8 и вариабельный домен легкой цепи с изменением M32L; или S92A; или M32L и S92A; в SEQ ID NO: 2. M34 в вариабельном домене тяжелой цепи 2H7.v16 был идентифицирован в качестве потенциального источника стабильности антитела и является другим потенциальным кандидатом для замены.

[0232] В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельная область вариантов на основе 2H7.v16 содержит аминокислотные последовательности v16 за исключением положений аминокислотных замен, которые указаны в таблице 1 ниже. Если нет иных указаний, варианты 2H7 имеют ту же легкую цепь, что и v16.

Таблица 1 Иллюстративные варианты гуманизированного антитела 2H7
Версия 2H7	Изменения тяжелой цепи	Изменения легкой цепи	Изменения Fc
	(VH)	(VL)
16 в качестве эталона			-
31	-	-	S298A, E333A, K334A
73	N100A	M32L
75	N100A	M32L	S298A, E333A, K334A
96	D56A, N100A	S92A
114	D56A, N100A	M32L, S92A	S298A, E333A, K334A
115	D56A, N100A	M32L, S92A	S298A, E333A, K334A, E356D, M358L
116	D56A, N100A	M32L, S92A	S298A, K334A, K322A
138	D56A, N100A	M32L, S92A	S298A, E333A, K334A, K326A
477	D56A, N100A	M32L, S92A	S298A, E333A, K334A, K326A, N434W
375	-	-	K334L
588	-	-	S298A, E333A, K334A, K326A
511	D56A, N100Y, S100aR	M32L, S92A	S298A, E333A, K334A, K326A

(iv) Антитела человека

[0233] В качестве альтернативы гуманизации можно получать антитела человека. Например, в настоящее время возможным является получение трансгенных животных (например, мышей), которые способны, при иммунизации, продуцировать полный набор антител человека в отсутствии продукции эндогенных иммуноглобулинов. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена участка соединения тяжелых цепей антител (J_H) у химерных мышей и мутантных мышей зародышевой линии приводит к полному ингибированию продукции эндогенных антител. Перенос системы генов иммуноглобулинов зародышевой линии человека в таких мутантных мышей зародышевой линии приводит к продукции антител человека при антигенной стимуляции. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in ImmuNo., 7:33 (1993); и патенты США № 5591669; 5589369 и 5545807.

[0234] Альтернативно для получения антител человека и фрагментов антител in vitro можно использовать технологию фагового дисплея (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)), из наборов генов вариабельных (V) доменов иммуноглобулинов неиммунизированных доноров. В соответствии с этим способом, гены V домена антител клонируют в рамке считывания либо главного, либо минорного гена белка оболочки нитевидного бактериофага, такого как M13 или fd, и они экспонируются в качестве функциональных фрагментов антител на поверхности частицы фага. Вследствие того, что нитевидная частица содержит одноцепочечную копию ДНК генома фага, селекция на основе функциональных свойств антитела также приведет к селекции гена, кодирующего антитело, проявляющее такие свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые из свойств B-клетки. Фаговый дисплей можно проводить в различных формах; для их обзора см, например, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Для фагового дисплея можно использовать несколько источников сегментов V-генов. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991), выделили набор разнообразных антител против оксазолона из небольшой случайной комбинаторной библиотеки V-генов, полученной из селезенок иммунизированных мышей. Можно сконструировать набор V-генов из неиммунизированных доноров-людей и можно выделять антитела против широкого набора антигенов (в том числе против собственных антигенов), главным образом, в соответствии со способами, описанными Marks et al., J. Mol Biol. 222:581-597 (1991), или Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). См., также, патенты США № 5565332 и 5573905.

[0235] Антитела человека также можно получать посредством активированных B-клеток in vitro (см. патенты США 5567610 и 5229275).

(v) Фрагменты антител

[0236] Для получения фрагментов антител были разработаны различные способы. Традиционно, эти фрагменты получали посредством протеолитического расщепления полноразмерных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однако эти фрагменты в настоящее время можно получать непосредственно с помощью рекомбинантных клеток-хозяев. Например, фрагменты антител можно выделять из фаговых библиотек антител, описанных выше. Альтернативно фрагменты Fab'-SH можно выделять непосредственно из E. coli и химически связывать с получением фрагментов F(ab')₂ (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). В соответствии с другим подходом фрагменты F(ab')₂ можно выделять непосредственно из рекомбинантной культуры клеток-хозяев. Другие способы получения фрагментов антител будут очевидны квалифицированному специалисту. В других вариантах осуществления предпочтительное для выбора антитело представляет собой одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv). См. WO 93/16185; патент США № 5571894; и патент США № 5587458. Фрагмент антитела также может представлять собой "линейное антитело", например, как описано в патенте США 5641870. Такие линейные фрагменты антител могут быть моноспецифическими или биспецифическими.

(vi) Биспецифические антитела

[0237] Биспецифические антитела представляют собой антитела, которые обладают специфичность связывания в отношении по меньшей мере двух различных эпитопов. Иллюстративные биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами маркера B-клеточной поверхности. Другие такие антитела могут связывать маркер B-клеточной поверхности и, кроме того, связывать второй отличающийся маркер B-клеточной поверхности. Альтернативно плечо, связывающееся с маркером B клеточной поверхности, можно комбинировать с плечом, которое связывается с триггерной молекулой на лейкоците, такой как молекула T-клеточного рецептора (например, CD2 или CD3), или Fc-рецепторами для IgG (FcγR), такими как FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16), чтобы механизмы клеточной защиты были сфокусированы на B-клетку. Биспецифические антитела также можно использовать для локализации цитотоксических средств у B-клетки. Эти антитела обладают плечом, связывающим маркер B-клеточной поверхности, и плечом, которое связывает цитотоксическое средство (например, сапорин, антитело против интерферона-α, алкалоид барвинка, A-цепь рицина, метотрексат или гаптен с радиоактивным изотопом). Биспецифические антитела можно получать в качестве полноразмерных антител или фрагментов антител (например, биспецифические антитела F(ab')₂).

[0238] Способы получения биспецифических антител известны в данной области. Общепринятый способ получения полноразмерных биспецифических антител основан на совместной экспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулинов, где две цепи обладают различной специфичностью (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Вследствие случайной сборки тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, такие гибридомы (квадромы) потенциально продуцируют смесь из 10 различных молекул антител, из которых только одна обладает правильной биспецифичной структурой. Очистка правильных молекул, которую обычно проводят посредством стадий аффинной хроматографии, является довольно трудоемкой и выход продукта является низким. Аналогичные способы описаны в WO 93/08829, и в Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

[0239] В соответствии с другим подходом проводят слияние вариабельных доменов антитела с требуемой специфичностью связывания (участками связывания антитело-антиген) с последовательностями константных доменов иммуноглобулинов. В некоторых вариантах осуществления проводят слияние с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим по меньшей мере часть шарнирной области, CH2 и CH3. В некоторых вариантах осуществления меньшей мере один из компонентов, предназначенных для слияния, обладает первым константным доменом тяжелой цепи (CH1), содержащим участок, необходимый для связывания легкой цепи. ДНК, кодирующую предназначенные для слияния компоненты тяжелых цепей иммуноглобулинов и, если желательно, легкой цепи иммуноглобулина, встраивают в отдельные экспрессирующие векторы, и котрансфицируют в пригодный организм-хозяин. Это обеспечивает значительную гибкость при регулировании соотношений трех полипептидных фрагментов друг с другом в вариантах осуществления, где неравные соотношения трех полипептидных цепей в конструкции обеспечивает оптимальный выход. Однако возможным является встраивание двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессирующий вектор, если экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит к высокому выходу продукта или если соотношения не имеют особого значения.

[0240] В некоторых вариантах осуществления этого подхода, биспецифические антитела состоят из тяжелой цепи гибридного иммуноглобулина с одной специфичностью связывания на одном плече, и пары тяжелая цепь-легкая цепь гибридного иммуноглобулина (обладающей другой специфичностью связывания) на другом плече. Было обнаружено, что такая асимметричная структура облегчает разделение требуемого биспецифического соединения и нежелательных сочетаний цепей иммуноглобулинов, поскольку наличие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифичной молекулы обеспечивает легкий способ разделения. Этот подход описан в WO 94/04690. Для более подробного описания получения биспецифических антител см., например, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

[0241] В соответствии с другим подходом, описанным в патенте США № 5731168, для максимального увеличения процентного количества гетеродимеров, которые выделяют из рекомбинантных клеточных культур можно сконструировать область контакта между парой молекул антител. В некоторых вариантах осуществления область контакта содержит по меньшей мере часть C_H3-домена константного домена антитела. В этом способе одну или несколько небольших боковых цепей аминокислот из области контакта первой молекулы антитела заменяют на более крупные боковые цепи (например, тирозин или триптофан). В области контакта второй молекулы антитела создают компенсирующие "полости" идентичного или сходного с крупной боковой цепью(ями) размера посредством замены крупных боковых цепей аминокислот на цепи меньших размеров (например, аланин или треонин). Это обеспечивает механизм для повышения выхода гетеродимера по сравнению с другими нежелательными конечными продуктами, такими как гомодимеры.

[0242] Биспецифические антитела включают поперечно-сшитые антитела или "гетероконъюгаты" антител. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть связано с авидином, а другое с биотином. Такие антитела, например, были предложены для нацеливания клеток иммунной системы против нежелательных клеток (патент США № 4676980), и для лечения ВИЧ-инфекции (WO 91/00360, WO 92/200373 и EP 03089). Гетероконъюгаты антител можно получать с использованием любого пригодного способа сшивания. Пригодные сшивающие средства хорошо известны в данной области, и описаны в патенте США № 4676980, совместно с рядом способов сшивания.

[0243] Способы получения биспецифических антител из фрагментов антител также описаны в литературе. Например, биспецифические антитела можно получать с использованием образования химических связей. В Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) описан способ, где полноразмерные антитела протеолитически расщепляют с получением F(ab')₂-фрагментов. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии вещества арсенита натрия, образующего комплексы с дитиолами, для стабилизации соседних дитиолов и предотвращения образования межмолекулярного дисульфида. Затем полученные Fab'-фрагменты конвертируют в производные с тионитробензоатом (TNB). Одно из производных Fab'-TNB затем повторно конвертируют в Fab'-тиол восстановлением меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством другого производного Fab'-TNB с получением биспецифического антитела. Полученные биспецифические антитела можно использовать в качестве средств для селективной иммобилизации ферментов.

[0244] Также были описаны различные способы получения и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из рекомбинантной клеточной культуры. Например, были получены биспецифические антитела с использованием лейциновых молний. Kositelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Пептиды лейциновой молнии белков Fos и Jun связывали с Fab'-участками двух различных антител посредством слияния генов. Гомодимеры антител восстанавливали в шарнирной области с получением мономеров, а затем повторно окисляли с получением гетеродимеров антител. Этот способ также можно использовать для получения гомодимеров антител. Способ "диантител", описанный Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:6444-6448 (1993) обеспечивает альтернативный механизм получения биспецифических фрагментов антител. Фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) посредством линкера, который является слишком коротким для возможности образования пары между двумя доменами на одной и той же цепи. Таким образом, домены V_H и V_L одного фрагмента вынуждены образовывать пару с комплементарными доменами V_L и V_H другого фрагмента, таким образом, формируя два антигенсвязывающих центра. Также описана другая стратегия для получения фрагментов биспецифических антител с использованием димеров одноцепочечных Fv (sFv). См. Gruber et al., J. Immunol, 152: 5368 (1994).

[0245] Также предусмотрены антитела более чем c двумя валентностями. Например, можно получать триспецифические антитела. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

V. Конъюгаты и другие модификации антитела

[0246] Антитело, используемое в способах и включенное в изделия, описанные в настоящем описании, необязательно конъюгировано с цитотоксическим средством. Например, антитело может быть конъюгировано с лекарственным средством, как описано в WO2004/032828.

[0247] Химиотерапевтические средства, пригодные для получения таких конъюгатов антитело-цитотоксическое средство, описаны выше.

[0248] Также в рамках настоящего изобретения предусматриваются конъюгаты антитела и одного или нескольких низкомолекулярных токсинов, таких как калихеамицин, майтанзин (патент США № 5208020), трихотен и CC1065. В одном варианте осуществления изобретения антитело конъюгировано с одной или несколькими молекулами майтанзина (например, от приблизительно 1 до приблизительно 10 молекул майтанзина на молекулу антитела). Майтанзин, например, может конвертироваться в May-SS-Me, который может восстанавливаться до May-SH3 и реагировать с модифицированным антителом (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)) с образованием конъюгата майтанзиноид-антитело.

[0249] Альтернативно антитело конъюгировано с одной или несколькими молекулами калихеамицина. Антибиотики семейства калихеамицинов способны образовывать двухцепочечные разрывы ДНК в субпикомолярных концентрациях. Структурные аналоги калихеамицина, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются ими, γ₁^I, α₂^I, α₃^I, N-ацетил-γ₁^I, PSAG и θ^I₁ (Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993) и Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)).

[0250] Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать, включают A-цепь дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, A-цепь экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), A-цепь рицина, A-цепь абрина, A-цепь модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки-диантаны, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены. См., например, WO 93/21232, опубликованную 28 октября 1993 года.

[0251] Кроме того, настоящее изобретение предусматривает антитело, конъюгированное с соединением с нуклеолитической активностью (например, рибонуклеаза или ДНК-эндонуклеаза, такая как дезоксирибонуклеаза; ДНК-аза).

[0252] Для получения радиоконъюгированных антител доступно множество радиоактивных изотопов. Примеры включают At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² и радиоактивные изотопы Lu.

[0253] Конъюгаты антитела и цитотоксического средства можно получать с использованием различных бифункциональных агентов для связывания белков, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCL), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как 2,6-диизоцианат толуола), и вторичные активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин на основе рицина можно получать, как описано в Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987). Меченая углеродом-14 1-изотиоцианатбензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) представляет собой иллюстративный хелатирующий агент для конъюгации радионуклеотида с антителом. См. WO94/11026. Линкер может представлять собой "расщепляющийся линкер", способствующий высвобождению цитотоксического лекарственного средства в клетку. Например, можно использовать неустойчивый к действию кислот линкер, чувствительный к пептидазам линкер, диметиловый линкер или дисульфидсодержащий линкер (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)).

[0254] Альтернативно слитый белок, содержащий антитело и цитотоксическое средство, можно получать, например, рекомбинантными способами или пептидным синтезом.

[0255] В другом варианте осуществления антитело можно конъюгировать с "рецептором" (таким как стрептавидин) для применения в предварительном нацеливании на опухоль, где конъюгат антитело-рецептор вводят пациенту, а затем проводят удаление не связавшегося конъюгата из кровотока с использованием агента для выведения, а затем вводят "лиганд" (например, авидин), который конъюгирован с цитотоксическим средством (например, радионуклид).

[0256] Антитела по настоящему изобретению также можно конъюгировать с активирующим пролекарство ферментом, который конвертирует пролекарство (например, пептидильное химиотерапевтическое средство, см. WO81/01145) в активное лекарственное средство против злокачественной опухоли. См., например, WO 88/07378 и патент США № 4975278.

[0257] Ферментный компонент таких конъюгатов включает любой фермент, способный действовать на пролекарство так, чтобы оно конвертировалось в его более активную цитотоксическую форму.

[0258] Ферменты, которые являются пригодными в способе по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются ими, щелочную фосфатазу, пригодную для конвертирования фосфатсодержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; арилсульфатазу, которая пригодна для конвертирования сульфатсодержащих пролекарств в свободные лекарственные средства; цитозиндезаминазу, которая пригодна для конвертирования нетоксичного 5-фторцитозина в лекарственное средство против злокачественной опухоли, 5-фторурацил; протеазы, такие как протеаза serratia, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (такие как катепсины B и L), которые пригодны для конвертирования содержащих пептид пролекарств в свободные лекарственные средства; D-аланилкарбоксипептидазы, которые пригодны для конвертирования пролекарств, которые содержат заместители в виде D-аминокислот; расщепляющие углеводы ферменты, такие как β-галактозидаза и нейраминидаза, которые пригодны для конвертирования гликозилированных пролекарств в свободные лекарственные средства; β-лактамаза, которая пригодна для конвертирования лекарственных средств, дериватизированных β-лактамами, в свободные лекарственные средства; и пенициллинамидазы, такие как амидаза пенициллина V и амидаза пенициллина G, которые пригодны для конвертирования лекарственных средств, дериватизированных по их атомам азота аминогрупп с помощью феноксиацетильной или фенилацетильной групп, соответственно, в свободные лекарственные средства. Альтернативно антитела с ферментативной активностью, также известные в данной области как "абзимы", можно использовать для преобразования пролекарств в свободные активные лекарственные средства (см., например, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Конъюгаты антитело-абзим можно получать, как описано в настоящем описании, для доставки абзима в популяцию опухолевых клеток.

[0259] Ферменты по настоящему изобретению можно ковалентно связывать с антителом способами, хорошо известными в данной области, такими как применение гетеробифункциональных сшивающих реагентов, рассмотренных выше. Альтернативно слитые белки, содержащие по меньшей мере антигенсвязывающую область антитела по изобретению, связанную по меньшей мере с функционально активной частью фермента по изобретению, можно конструировать с использованием способов рекомбинантных ДНК, хорошо известных в данной области (см., например, Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)).

[0260] В рамках настоящего изобретения предусматриваются другие модификации антитела. Например, антитело может быть связано с одним из множества небелковых полимеров, например, полиэтиленгликолем (PEG), полипропиленгликолем, полиоксиалкиленами или сополимерами полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля. В некоторых вариантах осуществления фрагменты антител, такие как Fab’, связаны с одной или несколькими молекулами PEG.

[0261] Антитела, описанные в настоящем описании, также можно составлять в качестве липосом. Липосомы, содержащие антитело, получают способами, известными в данной области, такими как описаны в Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); патентах США № 4485045 и 4544545; и WO97/38731, опубликованной 23 октября 1997 года. Липосомы с увеличенным временем циркуляции описаны в патенте США № 5013556.

[0262] Особенно пригодные липосомы можно получать способом обращено-фазового выпаривания с липидной композицией, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и PEG-дериватизированный фосфатидилэтаноламин (PEG-PE). Липосомы экструдируют через фильтры с определенным размером пор с получением липосом желаемого диаметра. Fab'-фрагменты антитела по настоящему изобретению можно конъюгировать с липосомами, как описано в Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) посредством реакции дисульфидного обмена. Химиотерапевтическое средство необязательно содержится в липосоме. См. Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19)1484 (1989).

[0263] Предусматривается модификация(и) аминокислотной последовательности антитела. Например, может быть желательным повышение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела получают путем внесения соответствующих нуклеотидных замен в нуклеиновую кислоту антитела или пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции, и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Любую комбинацию делеции, инсерции и замены осуществляют для получения конечной конструкции при условии, что конечная конструкция обладает желаемыми характеристиками. Аминокислотные замены также могут изменять посттрансляционные процессы антител, такие как изменение номера или положения участков гликозилирования.

[0264] Пригодный способ для идентификации определенных остатков или областей антитела, которые являются предпочтительными областями для мутагенеза, называют "аланин-сканирующим мутагенезом", как описано Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989). В этом способе выявляют остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys, и glu) и заменяют на нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту (наиболее предпочтительно аланин или полиаланин) для нарушения взаимодействия аминокислот с антигеном. Те положения аминокислот, которые демонстрируют функциональную чувствительность к замещению, затем подтверждают посредством внесения дополнительных или других вариантов в участки замещения, или вместо них. Таким образом, поскольку участок для внесения изменения в аминокислотную последовательность является предопределенным, нет необходимости в непосредственной предопределенности характера мутации. Например, для анализа действия мутации в данной области, в кодоне-мишени или участке-мишени проводят ala-сканирующий или случайный мутагенез и экспрессированные варианты антитела подвергают скринингу в отношении наличия требуемой активности.

[0265] Вставки в аминокислотную последовательность включают N- и/или C-концевые конструкции для слияния, длина которых находится в диапазоне от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, вставки внутрь последовательности одного или нескольких аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым метионильным остатком или антитело, слитое с цитотоксическим полипептидом. Другие варианты молекулы антитела со вставками включают слитые конструкции N- или C-конца антитела с ферментом или полипептидом, который увеличивает время полужизни антитела.

[0266] Другим типом варианта является вариант с заменой аминокислоты. Эти варианты имеют по меньшей мере один аминокислотный остаток в молекуле антитела, замененный другим остатком. Представляющие наибольший интерес участки для мутагенеза с заменами включают гипервариабельные области, однако также предусмотрены изменения FR. Консервативные замены представлены в таблице 2 под заголовком "Предпочтительные замены". Если такие замены приводят к изменению биологической активности, тогда можно вносить более существенные изменения, обозначенные как "иллюстративные замены" в таблице 2, и продукты подвергать скринингу.

Таблица 2
Исходный остаток	Иллюстративные замены	Предпочтительные замены
Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Asp, Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu; Asn	Glu
Cys (C)	Ser; Ala	Ser
Gln (Q)	Asn; Glu	Asn
Glu (E)	Asp; Gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; Норлейцин	Leu
Leu (L)	Норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Val; Ser	Ser
Trp (W)	Tyr; Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Норлейцин	Leu

[0267] Существенные модификации биологических свойств антитела проводят, выбирая замены, которые значительно отличаются по их эффекту на поддержание (a) структуры полипептидного остова в области замены, например, такой как конформация в виде слоя или спирали, (b) заряда или гидрофобности молекулы в участке-мишени, или (c) объема боковой цепи. Аминокислоты можно подразделить на группы на основе сходства свойств их боковых цепей: (A. L. Lehninger, Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):

(1) неполярные: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

(2) незаряженные полярные: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3) кислотные: Asp (D), Glu (E)

(4) основные: Lys (K), Arg (R), His(H)

[0268] Альтернативно встречающиеся в природе остатки можно подразделить на группы, исходя из общих свойств боковых цепей:

(1) гидрофобные: Норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) кислотные: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.

[0269] Неконсервативные замены вовлекают замену члена одного из этих классов членом из другого класса.

[0270] Любой остаток цистеина, не вовлеченный в поддержание надлежащей конформации антитела, также можно заменять, главным образом, серином, для повышения окислительной стабильности молекулы и для предотвращения аберрантного сшивания. Напротив, цистеиновую связь(и) можно добавлять к полипептиду для повышения его стабильности (в частности, где антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как Fv-фрагмент).

[0271] Особенно предпочтительный тип варианта с заменами включает замену одного или нескольких остатков гипервариабельной области исходного антитела. Как правило, полученный вариант(ы), выбранный для дальнейшей разработки, будет обладать улучшенными биологическими свойствами относительно исходного антитела, из которого он получен. Удобный путь получения таких вариантов с заменами вовлекает созревание аффинности с использованием фагового дисплея. В кратком изложении несколько участков гипервариабельной области (например, 6-7 участков) подвергают мутации с получением всех возможных аминокислотных замен в каждом участке. Полученные таким образом варианты антитела экспонируются моновалентным образом на частицах нитевидных фагов в качестве молекул, слитых с продуктом гена III фага M13, упакованных в каждую частицу. Затем экспонированные на фаге варианты подвергают скринингу в отношении их биологической активности (например, аффинности связывания), как описано в настоящем описании. В целях идентификации участков гипервариабельной области-кандидатов для модификации можно проводить аланин-сканирующий мутагенез, идентифицируя остатки гипервариабельной области, вносящих значительный вклад в связывание антигена. Альтернативно или дополнительно, может быть целесообразным анализ кристаллической структуры комплекса антиген-антитело в целях идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки являются кандидатами для замены в соответствии со способами, известными в данной области, включая способы, приведенные в настоящем описании. После получения таких вариантов панель вариантов подвергают скринингу, как описано в настоящем описании и антитела с наилучшими свойствами в одном или нескольких соответствующих анализах можно отбирать для дальнейшей разработки.

[0272] Другой тип аминокислотного варианта полипептида изменяет исходный характер гликозилирования антитела. Такое изменение включает делецию одной или нескольких углеводных частей, находящихся на антителе, и/или добавление одного или нескольких участков гликозилирование, которые не присутствуют на антителе.

[0273] Гликозилирование полипептидов, как правило, является либо N-связанным, либо O-связанным. N-связанное гликозилирование относится к присоединению углеводной части к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-X-серин и аспарагин-X-треонин, где X представляет собой любую аминокислоту, за исключением пролина, представляют собой последовательности, распознаваемые для ферментативного присоединения углеводной группы к боковой цепи аспарагина. Таким образом, наличие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный участок гликозилирования. O-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров, представляющих собой N-ацетилгалактозамин, галактозу или ксилозу, к гидроксиаминокислоте, обычно, к серину или треонину, хотя также можно использовать 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.

[0274] Добавление участков гликозилирования к полипептиду удобно проводить, изменяя аминокислотную последовательность, чтобы она содержала одну или несколько из описанных выше трипептидных последовательностей (для участков N-связанного гликозилирования). Также изменение можно проводить посредством добавления или замены одного или нескольких остатков серина или треонина в последовательности исходного антитела (для участков О-связанного гликозилирования).

[0275] Когда антитело содержит Fc-область, можно изменять углевод, связанный с ней. Например, антитела со зрелой углеводной структурой, которая лишена фукозы, связанной с Fc-областью антитела, описаны в патентной заявке США № US 2003/0157108 A1 (Presta, L.); также см. US 2004/0093621 A1 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd), касающейся композиции антитела CD20. Антитела с биссекторным N-ацетилглюкозамином (GlcNAc) в углеводе, связанным с Fc-областью антитела, описаны в WO03/011878, Jean-Mairet et al. и в патенте США № 6602684, Umana et al. Антитела по меньшей мере с одним остатком галактозы в олигосахариде, связанным с Fc-областью антитела, описаны в WO97/30087 (Patel et al.); также см. WO98/58964 (Raju, S.) и WO99/22764 (Raju, S.), касающиеся антител с измененным углеводом, связанным с Fc-областью.

[0276] В некоторых вариантах осуществления вариант гликозилирования, описанный в настоящем описании, содержит Fc-область, где углеводная структура, связанная с Fc-областью, лишена фукозы. Такие варианты имеют улучшенную функцию ADCC. Необязательно, Fc-область дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен, которые далее усиливают ADCC, например, замены в положениях 298, 333 и/или 334 Fc-области (нумерация остатков согласно Eu). Примеры публикаций, относящихся к "дефукозилированным" или "дефицитным по фукозе" вариантам антител, включают: патентную заявку США № US 2003/0157108 A1, Presta, L; WO 00/61739A1; WO 01/29246A1; US 2003/0115614A1; US 2002/0164328A1; US 2004/0093621A1; US 2004/0132140A1; US 2004/0110704A1; US 2004/0110282A1; US 2004/0109865A1; WO 03/085119A1; WO 03/084570A1; WO 2005/035778; WO 2005/035586 (описывающую РНК-ингибирование (РНК-i) фукозилирования); Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Примеры клеточных линий, способных продуцировать дефукозилированные антитела, включают клетки Lec13 CHO с дефицитом фукозилирования белков (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); патентная заявка США № US 2003/0157108 A1, Presta, L; и WO 2004/056312 A1, Adams et al., особенно в примере 11), и клеточные линии с нокаутом, такие как клетки CHO с нокаутом гена альфа-1,6-фукозилтрансферазы FUT8 (Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)).

[0277] Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие варианты аминокислотной последовательности антитела, получают различными способами, известными в данной области. Эти способы включают, но не ограничиваются ими, выделение из природного источника (в случае встречающихся в природе вариантов аминокислотной последовательности) или получение с помощью олигонуклеотид-опосредуемого (или сайт-направленного) мутагенеза, ПЦР-мутагенеза и кассетного мутагенеза ранее полученного варианта или не являющейся вариантом версии антитела.

[0278] Может быть желательной модификация антитела по изобретению в отношении эффекторной функции, например, чтобы усилить антигензависимую клеточно-опосредуемую цитотоксичность (ADCC) и/или комплементзависимую цитотоксичность (CDC) антитела. Этого можно достигать путем внесения одной или нескольких аминокислотных замен в Fc-область антитела. Альтернативно или дополнительно, в Fc-область можно вносить остаток(и) цистеина, тем самым, позволяя образование межцепочечных дисульфидных связей в этой области. Гомодимерное антитело, полученное таким образом, может иметь увеличенную способность к интернализации и/или увеличенное опосредуемое комплементом уничтожение клеток и антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). См. Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) и Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Гомодимерные антитела с усиленной противоопухолевой активностью также можно получать с использованием гетеробифункциональных сшивающих агентов, как описано в Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Альтернативно можно конструировать антитело, которое обладает двумя Fc-областями и, тем самым, может иметь усиленную способность к опосредуемому комплементом лизису и ADCC. См. Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

[0279] В WO 00/42072 (Presta, L.) описаны антитела с усиленной функцией ADCC в присутствии эффекторных клеток человека, где антитела содержат аминокислотные замены в их Fc-области. В некоторых вариантах осуществления антитело с усиленной ADCC содержит замены в положениях 298, 333 и/или 334 Fc-области. В некоторых вариантах осуществления измененная Fc-область представляет собой Fc-область IgG1 человека, содержащую или состоящую из замен в одном, двух или трех из этих положений.

[0280] Антитела с измененным связыванием C1q и/или комплементзависимой цитотоксичностью (CDC) описаны в WO99/51642, патенте США № 6194551B1, патенте США № 6242195B1, патенте США № 6528624B1 и патенте США № 6538124 (Idusogie et al.). Антитела содержат аминокислотную замену в одном или нескольких из положений аминокислот 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 и/или 334 их Fc-области.

[0281] Для повышения времени полужизни антитела в сыворотке, в антитело (особенно фрагмент антитела) можно включать эпитоп, связывающий рецептор спасения, как описано, например, в патенте США 5739277. Как используют в рамках изобретения, термин "эпитоп, связывающий рецептор спасения" относится к эпитопу Fc-области молекулы IgG (например, IgG₁, IgG₂, IgG₃ или IgG₄), который ответственен за повышение времени полужизни молекулы IgG в сыворотке in vivo. Антитела с заменами в Fc-области и увеличенным временем полужизни также описаны в WO 0/42072 (Presta, L.).

[0282] Также предусматриваются сконструированные антитела с тремя или более (предпочтительно четырьмя) функциональными антигенсвязывающими центрами (заявка США № US2002/0004587 A1, Miller et al.).

VI. Фармацевтические составы

[0283] Терапевтические составы антител, используемых в соответствии с настоящим изобретением, получают для хранения путем смешения антитела, имеющего требуемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях, и включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметэтония; хлорид бензалкония, хлорид бензэтония; фенол, бутил или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (менее 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG).

[0284] Иллюстративные составы антитела против CD20 описаны в WO 98/56418. В данной публикации описан жидкий многодозовый состав, содержащий 40 мг/мл ритуксимаба, 25 мМ ацетат, 150 мМ трегалозу, 0,9% бензиловый спирт, 0,02% полисорбат 20 при pH 5,0, который имеет минимальный срок хранения два года при 2-8°C. Другой представляющий интерес состав антитела против CD20 содержит 10 мг/мл ритуксимаба в 9,0 мг/мл хлорида натрия, 7,35 мг/мл цитрата натрия дигидрата, 0,7 мг/мл полисорбата 80 и стерильной воде для инъекций, pH 6,5.

[0285] Лиофилизированные составы, адаптированные для подкожного введения, описаны в патенте США № 6267958 (Andya et al.). Такие лиофилизированные составы можно разбавлять подходящим разбавителем до высокой концентрации белка и разбавленный состав можно вводить подкожно млекопитающему, подлежащему лечению в рамках настоящего изобретения.

[0286] Также предусматриваются кристаллизованные формы антитела. См., например, US 2002/0136719 A1 (Shenoy et al.).

[0287] Состав в рамках настоящего изобретения также может содержать более одного активного соединения, если необходимо для конкретного подвергаемого лечению показания, в некоторых вариантах осуществления соединения с дополняющей активностью, которые не оказывают неблагоприятного влияния друг на друга. Например, может быть желательным дополнительное предоставление цитотоксического средства; химиотерапевтического средства; иммунодепрессивного средства; цитокина; антагониста цитокина или антитела к нему; фактора роста; гормона; интегрина; антагониста интегрина или антитела к нему (например, антитело против LFA-1 или антитело против альфа-4 интегрина (такое как натализумаб/TYSABRI^®), доступное от Biogen Idec/Elan Pharmaceuticals, Inc.); лекарственного средства класса интерферонов, такого как IFN-бета-1a (REBIF^® и AVONEX^®) или IFN-бета-1b (BETASERON^®); олигопептида, такого как глатирамера ацетат (COPAXONE^®); цитотоксического средства, такого как (NOVANTRONE^®), метотрексат, циклофосфамид, хлорамбуцил или азатиоприн; внутривенного иммуноглобулина (гамма-глобулин); истощающего лимфоциты лекарственного средства (например, митоксантрон, циклофосфамид, кампат, антитело против CD4 или кладрибин); не истощающего лимфоциты иммунодепрессивного лекарственного средства (например, микофенолат мофетил (MMF) или циклоспорин); снижающего уровень холестерина лекарственного средства класса "статинов"; эстрадиола; тестостерона; гормон-заместительной терапии; лекарственного средства, которое лечит симптомы, являющиеся вторичными для MS или связанными с MS (например, спастичность, недержание, боль, усталость); ингибитора TNF; модифицирующего заболевание противоревматического лекарственного средства (DMARD); нестероидного противовоспалительного средства (NSAID); кортикостероида (например, метилпреднизолон, преднизон, дексаметазон или глюкокортикоид); левотироксина; циклоспорина A; аналога соматостатина; антагониста цитокина; антиметаболита; иммунодепрессивного средства; антагониста интегрина или антитела к нему (например, антитело против LFA-1, такое как эфализумаб или антитело против альфа-4 интегрина, такое как натализумаб); или другого антагониста B-клеточной поверхности/антитела к нему; и т.д. в составе. Тип и эффективные количества таких других средств зависят, например, от количества антитела, присутствующего в составе, типа рассеянного склероза, подвергаемого лечению, и клинических параметров пациентов. Их обычно используют в одних и тех же дозировках и с теми же путями введения, как использовали ранее или приблизительно от 1 до 99% ранее дозировок используемых.

[0288] Активные ингредиенты также могут быть заключены в микрокапсулы, полученные, например, способами коацервации или межповерхностной полимеризации, как например, микрокапсулы на основе гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсулы на основе полиметилметакрилата, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомы, микросферы альбумина, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсиях. Такие способы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

[0289] Можно получать препараты с замедленным высвобождением. Пригодные примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, которые имеют форму формованных изделий, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают простые полиэфиры, гидрогели (например, поли-(2-гидроксиэтилметакрилат) или поливиниловый спирт, полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, недеградирующий этиленвинилацетат, деградирующие сополимеры молочная кислота-гликолевая кислота, такие как LUPRON DEPOT™ (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочная кислота-гликолевая кислота и леупролида ацетата), и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.

[0290] Составы для применения для введения in vivo должны быть стерильными. Этого без труда достигают фильтрацией через стерильные фильтрационные мембраны.

[0291] В некоторых вариантах осуществления состав содержит один или несколько из группы, состоящей из гистидинового буфера, трегалозы, сахарозы и полисорбата 20. В некоторых вариантах осуществления гистидиновый буфер представляет собой гистидин-ацетатный буфер, pH 6,0. Примеры составов, пригодных для введения антитела против CD20, представлены в Andya et al., US 2006/0088523, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме в отношении составов.

[0292] Иллюстративные составы антитела против CD20 описаны в Andya et al., US 2006/0088523 и WO 98/56418, которые включены в качестве ссылок в полном объеме. В некоторых вариантах осуществления состав представляет собой жидкий многодозовый состав, содержащий антитело против CD20 в дозе 40 мг/мл, 25 мМ ацетат, 150 мМ трегалозу, 0,9% бензиловый спирт, 0,02% полисорбат 20 при pH 5,0, который имеет минимальный срок хранения два года при 2-8°C. В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес состав антитела против CD20 содержит 10 мг/мл антитела в 9,0 мг/мл хлорида натрия, 7,35 мг/мл цитрата натрия дигидрата, 0,7 мг/мл полисорбата 80 и стерильной воде для инъекций, pH 6,5. В некоторых вариантах осуществления антитело против CD20 представляет собой водный фармацевтический состав, содержащий 10-30 мМ ацетат натрия при от приблизительно pH 4,8 до приблизительно pH 5,5, предпочтительно при pH5,5, полисорбат в качестве поверхностно-активного вещества в количестве приблизительно 0,01-0,1% об./об., трегалозу в количестве приблизительно 2-10% масс./об. и бензиловый спирт в качестве консерванта (U.S. 6171586, который включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). Лиофилизированные составы, адаптированные для подкожного введения, описаны в WO 97/04801, которая включена в качестве ссылки в полном объеме. Такие лиофилизированные составы можно разбавлять подходящим разбавителем до высокой концентрации белка и разбавленный состав можно вводить подкожно млекопитающему, подлежащему лечению в рамках настоящего изобретения.

[0293] В некоторых вариантах осуществления состав гуманизированных вариантов 2H7 представляет собой антитела в дозе 12-14 мг/мл в 10 мМ гистидине, 6% сахарозе, 0,02% полисорбате 20, pH 5,8. В конкретном варианте осуществления варианты 2H7 и, в частности, 2H7.v16 составляют в дозе 20 мг/мл антитела в 10 мМ сульфате гистидина, 60 мг/мл сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 20 и стерильной воде для инъекций при pH 5,8. В конкретном варианте осуществления один в/в состав гуманизированного 2H7.v16 представляет собой: 30 мг/мл антитела в 20 мМ ацетате натрия, 4% трегалозе дигидрате, 0,02% полисорбате 20 (Tween 20™), pH 5,3. В некоторых вариантах осуществления состав гуманизированного варианта 2H7.v511 представляет собой 15-30 мг/мл антитела, предпочтительно 20 мг/мл антитела, в 10 мМ сульфате гистидина, 60 мг/мл сахарозе (6%), 0,2 мг/мл полисорбате 20 (0,02%) и стерильной воде для инъекций при pH5,8. В другом варианте осуществления состав для вариантов 2H7 и, в частности, 2H7.v511 представляет собой 20 мг/мл 2H7, 20 мМ ацетат натрия, 4% трегалозы дигидрат, 0,02% полисорбат 20, pH 5,5, для внутривенного введения. В некоторых вариантах осуществления состав 2H7.v114 представляет собой антитело в концентрации 15-25 мг/мл, предпочтительно 20 мг/мл, в 20 мМ ацетате натрия, 240 мМ (8%) трегалозы дигидрате, 0,02% полисорбате 20, pH 5,3. В некоторых вариантах осуществления антитело против CD20 (например, 2H7.v16) находится в составе, содержащем 30 мг/мл антитела, 20 мМ ацетат натрия, 106 мМ трегалозу, 0,02% полисорбат 20, и pH 5,3. Жидкий состав, содержащий антитело, может находиться в количестве 300 мг/флакон, и его можно хранить при 2-8°C в защищенном от света месте. В некоторых вариантах осуществления перед введением состав антитела разбавляют нормальным солевым раствором (0,9% хлорид натрия) в мешке для в/в введения посредством инфузии.

VII. Изделия и способы изготовления

[0294] Кроме того, изобретение относится к изделиям, содержащим материалы, пригодные для лечения прогрессирующего рассеянного склероза, описанные в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления изделие содержит, упакованные вместе, фармацевтическую композицию, содержащую антитело против CD20 и фармацевтически приемлемый носитель и ярлык, на котором указано, что антитело против CD20 или фармацевтическая композиция показаны для лечения пациентов с рассеянным склерозом и обеспечивают улучшение функциональной способности у пациентов, имеющих рассеянный склероз.

[0295] В некоторых вариантах осуществления изделие содержит, упакованные вместе, фармацевтическую композицию, содержащую антитело против CD20 и фармацевтически приемлемый носитель и ярлык, на котором указано, что антитело против CD20 или фармацевтическая композиция показаны для лечения пациентов с рассеянным склерозом и подавляют прогрессирование нетрудоспособности у пациентов, имеющих рассеянный склероз.

[0296] В некоторых вариантах осуществления изделие содержит, упакованные вместе, фармацевтическую композицию, содержащую антитело против CD20 и фармацевтически приемлемый носитель и ярлык, на котором указано, что антитело против CD20 или фармацевтическая композиция показаны для лечения пациентов с рассеянным склерозом и замедляет возникновение подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности у пациентов, имеющих рассеянный склероз. В некоторых вариантах осуществления подтвержденное прогрессирование заболевания представляет собой увеличение EDSS, которое сохраняется в течение двенадцати недель. В некоторых вариантах осуществления подтвержденное прогрессирование заболевания представляет собой увеличение EDSS, которое сохраняется в течение двадцати четырех недель.

[0297] В некоторых вариантах осуществления изделие содержит, упакованные вместе, фармацевтическую композицию, содержащую антитело против CD20 и фармацевтически приемлемый носитель и ярлык, на котором указано, что антитело против CD20 или фармацевтическая композиция показаны для лечения пациентов с рассеянным склерозом и замедляют или предупреждают уменьшение объема головного мозга у пациентов, имеющих рассеянный склероз.

[0298] В некоторых вариантах осуществления изделие содержит, упакованные вместе, фармацевтическую композицию, содержащую антитело против CD20 и фармацевтически приемлемый носитель, и ярлык, на котором указано, что антитело против CD20 или фармацевтическая композиция показаны для лечения пациентов с высокоактивным рассеянным склерозом. В некоторых вариантах осуществления на ярлыке далее указано, что антитело против CD20 или фармацевтическая композиция показаны для лечения пациентов с высокоактивным рассеянным склерозом, которых ранее не лечили другой терапией рассеянного склероза. В некоторых вариантах осуществления на ярлыке далее указано, что антитело против CD20 или фармацевтическая композиция показаны для лечения пациентов с высокоактивным рассеянным склерозом, которых ранее лечили другой терапией рассеянного склероза. В некоторых вариантах осуществления на ярлыке дополнительно указано, что антитело против CD20 или фармацевтическая композиция показаны для лечения пациентов с высокоактивным рассеянным склерозом, которые имеют недостаточный ответ на другую терапию рассеянного склероза.

[0299] В некоторых вариантах осуществления изделие содержит, упакованные вместе, фармацевтическую композицию, содержащую антитело против CD20 и фармацевтически приемлемый носитель и ярлык, на котором указано, что антитело против CD20 или фармацевтическая композиция показаны для лечения пациентов с рассеянным склерозом и что антитело против CD20 или фармацевтическая композиция являются эффективными для одного или нескольких из следующих: (1) уменьшение количества бляшек в головном мозге пациента; (2) уменьшение среднегодовой частоты рецидивов; (3) уменьшение прогрессирования нетрудоспособности; и (4) повышение функциональной способности.

[0300] В некоторых вариантах осуществления любого из изделий рассеянный склероз представляет собой прогрессирующий рассеянный склероз. В определенных вариантах осуществления прогрессирующий рассеянный склероз представляет собой первично-прогрессирующий рассеянный склероз. В некоторых вариантах осуществления рассеянный склероз представляет собой рецидивирующую форму рассеянного склероза. В определенных вариантах осуществления рецидивирующая форма рассеянного склероза представляет собой рецидивирующе-ремиттирующий рассеянный склероз. В определенных вариантах осуществления рецидивирующая форма рассеянного склероза представляет собой вторично-прогрессирующий рассеянный склероз с сопутствующими рецидивами (rSPMS).

[0301] В некоторых вариантах осуществления любого из изделий антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления антитело против CD20 представляет собой окрелизумаб.

[0302] В определенных вариантах осуществления вкладыш в упаковку имеет инструкции, на которых обозначено (т.е. указано), что пациенту вводят количество окрелизумаба, которое является эффективным для обеспечения первоначального воздействия окрелизумаба от приблизительно 0,3 до приблизительно 0,6 грамма с последующим вторым воздействием окрелизумаба от приблизительно 0,3 до приблизительно 0,6 грамма, причем второе воздействие не проводят до приблизительно от 16 до 60 недель после первоначального воздействия, и каждое воздействие окрелизумаба предоставляют пациенту в качестве одной или двух доз окрелизумаба. В некоторых вариантах осуществления первоначальное воздействие окрелизумаба составляет приблизительно 0,6 грамма. В некоторых вариантах осуществления второе воздействие окрелизумаба составляет приблизительно 0,6 грамма. В некоторых вариантах осуществления второе воздействие проводят через приблизительно 24 недель после первоначального воздействия. В некоторых вариантах осуществления одно или несколько воздействий окрелизумаба предоставляют пациенту в качестве одной дозы окрелизумаба. В некоторых вариантах осуществления одно или несколько воздействий окрелизумаба предоставляют пациенту в качестве двух доз окрелизумаба. В некоторых вариантах осуществления две дозы окрелизумаба содержат приблизительно 0,3 грамма окрелизумаба.

[0303] Изделие содержит контейнер и ярлык на контейнере или вкладыш в упаковку, прилагаемый к контейнеру. Пригодные контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластмасса. В контейнере находится или содержится композиция, которая является эффективной для лечения рассеянного склероза, и он может иметь отверстие для стерильного доступа (например, контейнер может представлять собой мешок для внутривенного раствора или флакон, содержащий пробку, проницаемую для иглы для подкожных инъекций). По меньшей мере одно активное вещество в композиции представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления контейнер содержит от приблизительно 0,3 до приблизительно 4,0 грамм антитела против CD20. В некоторых вариантах осуществления контейнер содержит от приблизительно 0,3 до приблизительно 1,5 грамма антитела против CD20.

[0304] На ярлыке или вкладыше в упаковку указано, что композицию используют для лечения рассеянного склероза у пациента, страдающего им, с конкретным руководством, касающимся дозируемых количеств и интервалов между дозированиями антитела и любого другого предоставляемого лекарственного средства. Кроме того изделие может содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый разбавитель или буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, изделие может включать другие материалы, желаемые с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

[0305] Необязательно, изделие в рамках настоящего изобретения дополнительно содержит контейнер, содержащий средство, отличное от антитела для лечения и, кроме того, содержит инструкции по лечению пациента таким средством, причем такое средство предпочтительно представляет собой химиотерапевтическое средство или иммунодепрессивное средство, лекарственное средство класса интерферонов, такое как IFN-бета-1a (REBIF^® и AVONEX^®) или IFN-бета-1b (BETASERON^®); олигопептид, такой как глатирамера ацетат (COPAXONE^®); цитотоксическое средство, такое как митоксантрон (NOVANTRONE^®), метотрексат, циклофосфамид, хлорамбуцил или азатиоприн; внутривенный иммуноглобулин (гамма-глобулин); истощающее лимфоциты лекарственное средство (например, митоксантрон, циклофосфамид, кампат, антитело против CD4 или кладрибин); не истощающее лимфоциты иммунодепрессивное лекарственное средство (например, микофенолат мофетил (MMF) или циклоспорин); снижающее уровень холестерина лекарственное средство класса "статинов"; эстрадиол; гормон-заместительную терапию; лекарственное средство, которое лечит симптомы, вторичные для MS или связанные с MS (например, спастичность, недержание, боль, усталость); ингибитор TNF; модифицирующее заболевание противоревматическое лекарственное средство (DMARD); нестероидное противовоспалительное средство (NSAID); кортикостероид (например, метилпреднизолон, преднизон, дексаметазон или глюкокортикоид); левотироксин; циклоспорин A; аналог сомастатина; антагонист цитокина или рецептора цитокина; антиметаболит; иммунодепрессивное средство; антагонист интегрина или антитело к нему (например, антитело против LFA-1, такое как эфализумаб или антитело против альфа-4 интегрина, такое как натализумаб); и другое антитело против маркера B-клеточной поверхности; и т.д.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Испытания фазы III для окрелизумаба по сравнению с интерфероном бета-1a (Rebif) у пациентов с рецидивирующим рассеянным склерозом

[0306] Рассеянный склероз представляет собой гетерогенное заболевание с непредсказуемым течением и отсутствием способа излечения (Scalfari et al. (2013) JAMA Neurol.70, 214-22; Tremlett et al. (2006) Neurology. 66, 172-7; Markowitz (2010) Am J Manag Care. 16, S211-8; Hauser et al. (2013) Ann Neurol. 74, 317-27). Несмотря на различные способы лечения рецидивирующих форм рассеянного склероза, ставшие доступными за последние годы, у многих пациентов продолжается нарастание неврологической нетрудоспособности, таким образом, остается существенная неудовлетворенная потребность в более эффективных и хорошо переносимых способах лечения (Markowitz (2010) Am J Manag Care. 16, S211-8; Rotstein et al. (2015) JAMA Neurol. 72, 152-8; Sorensen (2007) J Neurol Sci. 259,128-32). Кроме того, профиль риска более эффективных способов лечения до настоящего времени препятствовал их применению на ранних этапах заболевания (Markowitz (2010) Am J Manag Care. 16, S211-8; Hartung et al. (2011) Expert Rev Neurother. 11, 351-62; Hauser SL. (2015) Mult Scler. 21, 8-21).

[0307] B-клетки являются ключевым фактором, вносящим вклад в патогенез рассеянного склероза (Monson (2005) J Neuroimmunol. 158, 170-81; Hauser SL. (2015) Mult Scler. 21, 8-21). B-клетки редко наблюдают в цереброспинальной жидкости здоровых контролей, но они часто встречаются в низких процентных количествах в цереброспинальной жидкости пациентов с рассеянным склерозом (Cepok (2005) Brain. 128, 1667-76; Cross et al. (2011) Biochim Biophys Acta. 1812, 231-8), их повышенные уровни в цереброспинальной жидкости коррелируют с более быстрым прогрессированием заболевания при рецидивирующе-ремиттирующем рассеянном склерозе и вторично-прогрессирующем рассеянном склерозе (Cepok (2005) Brain. 128, 1667-76). B-клетки влияют на основной патогенез рассеянного склероза посредством ряда функций: презентация антигена (Constant (1999) J Immunol. 162, 5695-703; Crawford et al. (2006) J Immunol. 176, 3498-506), продукция аутоантител (Bar-OR A (2010) Ann Neurol. 67, 452-61; Duddy (2007) J Immunol. 178, 6092-9), регуляция цитокинов (Genain et al. (1999) Nat Med. 5, 170-5; Storch et al. (1998) Ann Neurol. 43, 465-71) и образование эктопических подобных лимофидным фолликулам агрегатов (Magliozzi et al. (2010) Ann Neurol. 68, 477-93; Serafini et al. (2004) Brain Pathol. 14:164-74). Интерес к B-клеткам возрос после исследований для подтверждения концепции и экспериментальных исследований, и интерес к их применимости при рассеянном склерозе увеличился с течением времени (Hauser et al. (2008) N Engl J Med. 358, 676-88; Kappos et al. (2011) Lancet. 378, 1779-87; Lehmann-Horn et al. (2013) Ther Adv Neurol Disord. 6, 161-73).

[0308] CD20 представляет собой антиген клеточной поверхности, находящийся на пре-B-клетках, зрелых B-клетках и B-клетках памяти, однако он не экспрессируется на лимфоидных стволовых клетках и плазмацитах (Stashenko et al. (1980) J Immunol. 125, 1678-85; Loken et al. (1987) Blood. 70, 1316-24; Tedder et al. (1994) Immunol Today. 15, 450-4). В исследовании HERMES ритуксимаб, химерное моноклональное антитело против CD20, значительно уменьшал воспалительные бляшки в головном мозге и клинические рецидивы по сравнению с плацебо у пациентов с рецидивирующе-ремиттирующим рассеянным склерозом; таким образом, обеспечивая доказательства, что селективное истощение CD20⁺ B-клеток является потенциально эффективным подходом для лечения при рассеянном склерозе (Kappos et al. (2011) Lancet. 378, 1779-87).

[0309] Окрелизумаб представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело, которое селективно истощает экспрессирующие CD20 B-клетки (Klein et al. (2013) MAbs. 5, 337-8; Genovese et al. (2008) Arthritis Rheum. 58, 2652-61), одновременно сохраняя способность к восстановлению B-клеток и изначально существующему гуморальному иммунитету (Martin et al. (2006) Annu Rev Immunol. 24, 467-96; DiLillo et al. (2008) J Immunol. 180, 361-71). Окрелизумаб связывается с большой внеклеточной петлей CD20 с высокой аффинностью, селективно истощая B-клетки посредством нескольких механизмов, включая антителозависимый клеточно-опосредуемый фагоцитоз, антителозависимую клеточно-опосредуемую цитотоксичность, комплементзависимую цитотоксичность и индукцию апоптоза (Klein et al. (2013) MAbs. 5, 22-33).

[0310] Проводили два идентичных многоцентровых рандомизированных двойных слепых контолируемых двумя плацебо испытаний фазы 3 с параллельными группами (испытание I и испытание II) для исследования эффективности и безопасности окрелизумаба по сравнению с интерфероном (IFN) β-1a у пациентов с рецидивирующими формами рассеянного склероза. Результаты этих двух исследований описаны ниже.

Способы

Критерии пригодности и исключения

[0311] Ключевые критерии пригодности включали: возраст от 18 до 55 лет; диагноз рассеянного склероза в соответствии с пересмотренными в 2010 году критериями Макдональда (Polman et al. (2011) "Diagnostic criteria for multiple sclerosis: 2010 revisions to the McDonald criteria". Ann Neurol 69, 292-302); показатель расширенной шкалы оценки состояния инвалидности (EDSS, см. world-wide-web.neurostatus.org) от 0 до 5,5 при скрининге; по меньшей мере две задокументированных клинических атаки в течение предшествующих 2 лет или одна клиническая атака в течение года перед скринингом (но не в течение 30 суток перед скринингом); задокументированное MRI-исследование головного мозга с аномалиями, соответствующими рассеянному склерозу; неврологическая стабильность в течение по меньшей мере 30 суток перед как скринингом, так и посещением исходного уровня.

[0312] Ключевые критерии исключения включали: диагноз первичного прогрессирующего рассеянного склероза; пациентов с длительностью заболевания более 10 лет в комбинации с показателем EDSS, меньшим или равным 2,0 при скрининге; известное присутствие других неврологических нарушений, которые могут имитировать рассеянный склероз; беременность или лактацию; предшествующее лечение любыми направленными на B-клетки способами терапии или другими противопоказанными лекарственными средствами (т.е. потребность в длительном лечении системными кортикостероидами или иммунодепрессантами в ходе исследования, первичный или вторичный иммунодефицит в анамнезе или активный на текущий момент, активная инфекция или рецидивирующая или хроническая инфекция в анамнезе или известное ее присутствие (например, гепатит B или C, ВИЧ, сифилис, туберкулез), прогрессирующая многоочаговая лейкоэнцефалопатия в анамнезе, противопоказания или непереносимость пероральных или внутривенных кортикостероидов, или противопоказания к Rebif или несовместимость с применением Rebif).

Схема исследования

[0313] Пациентов случайным образом распределяли (1:1) для введения либо окрелизумаба, 600 мг, путем внутривенной инфузии каждые 24 недели (проводимые в качестве двух инфузий по 300 мг на 1 и 15 сутки для первой дозы, и в качестве однократной инфузии 600 мг на 1 сутки для каждого 24-недельного курса лечения после этого), либо подкожного IFNβ-1a три раза в неделю в дозе 44 мкг на протяжении 96-недельного периода лечения. См.фиг.7. Пациентам в группе окрелизумаба и в группе IFNβ-1a также вводили подкожно и внутривенно плацебо, соответственно. Рандомизация проводилась центрально независимым организатором. Пациентов стратифицировали по региону (США/остальные страны) и исходному показателю EDSS (менее 4/больше или равно 4).

[0314] Для поддержания сокрытия распределения по группам исследования, каждый центр исследования имел отдельных лечащих исследователей (неврологи, имеющие опыт в лечении рассеянного склероза) и оценивающих исследователей (неврологи или другие практикующие специалисты по уходу за здоровьем), для всех из которых весь ход испытания был слепым. Лечащие исследователи имели доступ к данным безопасности и сокрытым данным эффективности и принимали решения о лечении, исходя из данных клинического ответа и лабораторных данных пациента. Оценивающие исследователи проводили неврологическую оценку, включая показатели EDSS (Kurtze (1983) "Rating neurologic impairment in multiple sclerosis: an Expanded Disability Status Scale (EDSS)." Neurology. 33, 1444-52), функциональные системные показатели (Kurtze (1983) "Rating neurologic impairment in multiple sclerosis: an Expanded Disability Status Scale (EDSS)." Neurology. 33, 1444-52; Haber and LaRocca, eds. Minimal Record of Disability for multiple sclerosis. New York: National Multiple Sclerosis Society; 1985), комплексную функциональную шкалу рассеянного склероза (MSFC) (Rudick et al. (2002) "The multiple sclerosis functional composite: a new clinical outcome measure for multiple sclerosis trials." Multiple Sclerosis (Houndmills, Basingstoke, England) 8, 359-65), исследование низкоконтрастной остроты зрения (LCVA) (Wieder et al. (2013) "Low contrast visual acuity testing is associated with cognitive performance in multiple sclerosis: a pilot study". BMC Neurology. 13, 167), тест на сопоставление символов и цифр (SDMT) (Smith A. (1982). Symbol digit modalities test: Manual. Los Angeles: Western Psychological Services), и шкалу общего состояния по Карнофски (Mor et al. "The Karnofsky Performance Status Scale. An examination of its reliability и validity in a research setting". Cancer. 53. 2002-2007). Оценка MRI проводилась независимо центральным исследователем MRI, слепым в отношении распределения по лечению.

[0315] Пациенты, которые завершили 96-недельный период лечения, были пригодным для включения в открытую продленную фазу испытания. Пациентов, которые прекратили участие преждевременно или которые не хотели участвовать в открытом продлении, включали в 48-недельную фазу наблюдения для оценки безопасности, которая включала мониторинг B-клеток.

Методики испытания

[0316] Показатели EDSS определяли при скрининге, на исходном уровне и каждые 12 недель; показатели MSFC, LCVA и SDMT определяли на исходном уровне и каждые 12 недель; и оценку по шкале общего состояния по Карнофски проводили на исходном уровне и каждые 24 недели. MRI проводили на исходном уровне и на 24, 48 и 96 неделях. Мониторинг неблагоприятных явлений проводили на протяжении исследования.

[0317] Первичным результатом была среднегодовая частота определяемых протоколом рецидивов через 96 недель, где рецидивы определяли как новые или ухудшающиеся неврологические симптомы, сохраняющиеся в течение более чем 24 часов, которые объяснимы только рассеянным склерозом. Новые или ухудшающиеся неврологические симптомы должны сопровождаться объективным неврологическим ухудшением, согласующимся с увеличением EDSS по меньшей мере на половину ступени, увеличением на 2 балла функционального системного показателя EDSS или на 1 балл по двух или более функциональных системных показателей EDSS. Рецидивы классифицировали как определяемые протоколом рецидивы с помощью автоматизированного алгоритма, следуя правилам, описанным выше. Алгоритм был составлен до закрытия базы данных и раскрытия данных.

[0318] Ключевые вторичные результаты включали: время возникновения подтвержденного 12-недельного прогрессирования нетрудоспособности (т.е. CDP), определяемое в испытании как увеличение по меньшей мере на 1,0 бал от исходного показателя EDSS у пациентов с исходным показателем 5,5 или менее, или увеличение на 0,5 балла у пациентов с исходным показателем выше 5,5, в течение 96 недель, где увеличение EDSS подтверждалось при регулярном запланированном посещении по меньшей мере через 12 недель после первоначального неврологического ухудшения; общее количество усиливаемых гадолинием T1-бляшек на 24, 48 и 96 неделях; общее количество новых и/или увеличивающихся гиперинтенсивных T2-бляшек на 24, 48 и 96 неделях; долю пациентов, которые имели подтвержденное 12-недельное снижение нетрудоспособности (т.е. CDI) на протяжении 96 недель (анализированное только для подгруппы пациентов с исходным показателем EDSS по меньшей мере 2,0); время до появления 24-недельного CDP, подтвержденного через 24 недели после первоначального неврологического ухудшения, на протяжении 96 недель; фармакокинетику, иммуногенность и фармакодинамику окрелизумаба; и безопасность и переносимость окрелизумаба. CDI в испытании определяют как снижение показателя EDSS по меньшей мере на 1,0 балл по сравнению с исходным уровнем у пациентов с исходным показателем EDSS 5,5 или менее, или снижение на 0,5 балла у пациентов с исходным показателем EDSS выше 5,5.

Статистический анализ

[0319] Статистическая иерархия представлена на фиг.8. Для достижения достаточной статистической мощности для исследования эффектов окрелизумаба в отношении CDP и CDI, было заранее запланировано, что эти результаты будут объединены для обоих испытаний фазы III. Все другие результаты анализировали отдельно для каждого испытания. Первичный и вторичный анализ эффективности проводили на выборке всех пациентов с намерением лечиться.

[0320] Все анализы эффективности проводили на выборке из всех пациентов с намерением лечиться. Среднегодовую частоту рецидивов (ARR), являющуюся первичным результатом эффективности, анализировали с использованием отрицательной биномиальной модели, которая для каждого пациента включала возникновение между датой рандомизации и датой раннего прекращения лечения/ 96 неделей в статистическом анализе, учитывая продолжительность воздействия, группу лечения, регион (США/остальные страны) и исходный показатель EDSS (менее 4,0/больше или равно 4,0) в качестве ковариат. Значимый результат при двухстороннем значении альфа 0,05 демонстрирует лучший эффект окрелизумаба в отношении снижения ARR.

[0321] Размер выборки для каждого испытания был основан на оцененной среднегодовой частоте рецидивов 0,165 для группы окрелизумаба и 0,33 для группы IFNβ-1a. С использованием двухстороннего t-критерия было сделано заключение, что выборка из 400 пациентов на группу обеспечит 84% статистическую мощность для поддержания частоты ошибок типа I 0,05 и обнаружения относительного снижения 50% для окрелизумаба по сравнению с IFNβ-1a (предполагая процент отсева 20%). Анализ чувствительности в соответствии с протоколом оценивал эффект значительных нарушений протокола на первичный результат.

[0322] Исследовали десять вторичных результатов эффективности в иерархическом порядке снижения клинической важности двухстороннего альфа 0,05 (см. фиг.8; ARR=среднегодовая частота рецидивов; CDI=подтвержденное снижение нетрудоспособности; CDP=подтвержденное прогрессирование нетрудоспособности; Gd=гадолиний; MSFC=комплексная функциональная шкала рассеянного склероза; NEDA=отсутствие признаков активности заболевания; SF-36 PCS=краткая форма 36, показатель физического здоровья). NEDA определяют как: отсутствие определяемых протоколом рецидивов, отсутствие событий CDP, отсутствие новых или увеличивающихся T2-бляшек и отсутствие усиливаемых Gd T1-бляшек. Анализ вторичных результатов эффективности на индивидуальном уровне исследования является следующим:

[0323] - Для первого вторичного результата эффективности (время до возникновения подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 12 недель), значение p на уровне испытания интерпретируется как неподтверждающее вследствие недостаточной статистической мощности на уровне испытания для обнаружения соответствующих различий способов лечения.

[0324] - Второй вторичный результат эффективности (общее количество усиливаемых Gd T1-бляшек на 24, 48 и 96 неделях) исследуют в качестве подтверждения, если и только если в анализе обоих испытаний вместе первый вторичный результат эффективности достигает уровня значимости 0,05 (т.е. p объединенного анализа ≤ 0,05). Если в анализе объединенных испытаний значение p объединенного анализа первого вторичного результата эффективности p>0,05, тогда значения p второго и последующих вторичных результатов эффективности в иерархии интерпретируют как неподтверждающие.

[0325] - Третий вторичный результат эффективности (общее количество новых и/или увеличивающихся гиперинтенсивных T2-бляшек на 24, 48 и 96 неделях) исследуют в качестве подтверждения, если и только если второй вторичный результат эффективности (общее количество усиливаемых Gd T1-бляшек на 24, 48 и 96 неделях) достигает уровня значимости 0,05 (т.е. p≤0,05). Если значение p второго вторичного результата эффективности p>0,05, тогда значения p третьего и последующих вторичных результатов эффективности в иерархии интерпретируют как неподтверждающие.

[0326] - Для четвертого (доля пациентов, которые имеют подтвержденное снижение нетрудоспособности в течение по меньшей мере 12 недель) и пятого (время до возникновения подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 24 недель) вторичных результатов эффективности, значение p на уровне испытания интерпретируют как неподтверждающее, вследствие недостаточной статистической мощности на уровне испытания для обнаружения соответствующих различий в лечении.

[0327] - Шестой вторичный результат эффективности (общее число новых гипоинтенсивных T1-бляшек (хронические "черные дыры") на 24, 48 и 96 неделях) исследуют в качестве подтверждения, если и только если в анализе объединенных испытаний пятый вторичный результат эффективности (время до возникновения подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 12 недель) достигает уровня значимости 0,05 (т.е. значение p объединенного анализа p≤0,05). Если в анализе обоих испытаний вместе значение p объединенного анализа пятого вторичного результата эффективности p>0,05, тогда значения p шестого и последующих результатов эффективности в иерархии интерпретируют как неподтверждающие.

[0328] - Седьмой (и последующие) вторичный результат эффективности исследуют подтверждающим образом, если и только если шестой (или непосредственно предшествующий) вторичный результат эффективности достигает уровня значимости 0,05 (т.е. p≤0,05). Если значение p шестого (или непосредственно предшествующего) вторичного результата эффективности p>0,05, тогда значения p седьмого (или текущего) и всех последующих вторичных результатов эффективности в иерархии интерпретируют как неподтверждающие.

[0329] Более того, для анализов вторичных результатов эффективности, где данные обоих испытаний объединены (так что существует достаточная статистическая мощность для сравнения всех первичных и вторичных результатов эффективности):

[0330] - Первый вторичный результат эффективности (время до возникновения подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 12 недель) исследуют в качестве подтверждения, если и только если первичный результат эффективности (среднегодовая частота определяемых протоколом рецидивов в течение 2 лет) достигает уровня значимости 0,05 (т.е. значение p в объединенном анализе p≤0,05). Если значение p объединенного анализа первичного результата эффективности p>0,05, тогда все значения p объединенного анализа вторичных результатов эффективности интерпретируют как неподтверждающие.

[0331] - Второй (и последующие) вторичный результат эффективности исследуют в качестве подтверждения, если и только если первый (или непосредственно предшествующий) вторичный результат эффективности достигает уровня значимости 0,05 (т.е. значение p объединенного анализа p≤0,05). Если значение p объединенного анализа первого (или непосредственно предшествующего) вторичного результата эффективности p>0,05, тогда значения p объединенного анализа второго (или текущего) и всех последующих вторичных результатов эффективности в иерархии интерпретируют как неподтверждающие.

[0332] Выборку безопасности использовали для всех анализов данных безопасности, и она включала всех пациентов, которым проводили какое-либо исследуемое лечение.

Результаты

Пациенты

[0333] В целом 1656 пациентов было включено в первое (N=821) и второе (N=835) испытания фазы III (выборка всех пациентов с намерением лечиться). Исходные демографические данные и характеристики заболевания были сходными среди популяций в каждом испытании и между двумя испытаниями (см. таблицу 3).

Таблица 3. Исходные демографические данные и характеристики заболевания
ХАРАКТЕРИСТИКА	ИСПЫТАНИЕ I	ИСПЫТАНИЕ II
	IFNβ-1a, 44 мкг (n=411)	Окрелизумаб, 600 мг (n=410)	IFNβ-1a, 44 мкг (n=418)	Окрелизумаб, 600 мг (n=417)
Возраст, лет, среднее значение (SD)	36,9 (9,3)	37,1 (9,3)	37,4 (9,0)	37,2 (9,1)
Женский пол, n (%)	272 (66,2)	270 (65,9)	280 (67,0)	271 (65,0)
Время с момента возникновения, лет, среднее значение (SD)	6,3 (6,0)	6,7 (6,4)	6,7 (6,1)	6,7 (6,1)
Время с момента постановки диагноза, лет, среднее значение (SD)	3,7 (3,6)	3,8 (4,8)	4,1 (5,1)	4,2 (5,0)
Рецидивы за последние 12 месяцев, среднее значение (SD)	1,3 (0,6)	1,3 (0,7)	1,3 (0,7)	1,3 (0,7)
Ранее не подвергавшиеся лечению, no. (%)†	292 (71,4)	301 (73,8)	314 (75,3)	304 (72,9)
Средний показатель EDSS	2,8 (1,3)	2,9 (1,2)	2,8 (1,4)	2,8 (1,3)
Усиливаемые гадолинием T1-бляшки, количество (%)
0	252 (61,9)	233 (57,5)	243 (58,6)	252 (61,0)
1	52 (12,8)	64 (15,8)	62 (14,9)	58 (14,0)
2	30 (7,4)	30 (7,4)	38 (9,2)	33 (8,0)
3	16 (3,9)	16 (3,9)	14 (3,4)	15 (3,6)
>4	57 (14,0)	57 (14,0)	58 (14,0)	55 (13,3)
T2-бляшки - количество	51,06±39,91	51,04±39,00	51,01±35,69	49,26±38,59
Объем T2-бляшек - см3	9,74±11,28	10,84±13,90	10,61±12,30	10,73±14,28
Нормализованный объем головного мозга - см3	1499,18±87,68	1500,93±84,10	1501±90,98	1503±92,63
Пациенты без Gd+-бляшек, n (%)	252 (61,9)	233 (57,5)	243 (58,6)	252 (61,0)
Количество Gd+ T1-бляшек, среднее значение (SD)	1,9 (5,2)	1,7 (4,2)	2,0 (4,9)	1,8 (5,0)
Количество T2-бляшек, среднее значение (SD)	51,1 (39,9)	51,0 (39,0)	51,0 (35,7)	49,3 (38,6)
†Пациенты, которых не лечили модифицирующей заболевание терапией в течение 2 перед включением в испытание

[0334] Всего 366 (89%) и 340 (83%) пациентов в группах окрелизумаба и IFNβ-1a, соответственно, завершили первое испытание (см. фиг.9), и 360 (86%) и 320 (77%) в группах окрелизумаба и IFNβ-1a завершили второе испытание (см. фиг.9). Более 85% пациентов в группах окрелизумаба завершили испытание I и испытание II. Все рандомизированные пациенты были включены в выборку ITT. Пациенты, которые были преждевременно исключены из испытания и пациенты, для которых оценку не проводили по любой причине, тем не менее, были включены в анализ ITT (намерение лечиться).

Эффективность

[0335] Клинические исходы и исходы по MRI для первого и второго испытаний обобщенно представлены в таблице 4. Частота рецидивов рассеянного склероза снижалась в случае окрелизумаба в обоих испытаниях со среднегодовой частотой рецидивов (ARR) после внесения поправки через 96 недель (первичный результат) 0,156 для окрелизумаба (против 0,292 для IFNβ-1a) в испытании I и 0,155 для окрелизумаба (против 0,290 для IFNβ-1a) в испытании II (см. таблицу 4 и фиг.10A и 10B). Среднегодовая частота рецидивов (на основе определяемых протоколом рецидивов) у пациентов, которых лечили окрелизумабом, была снижена на 46% и 47% против IFNβ-1 в испытании I и испытании II, соответственно (p<0,0001 для обоих сравнений). ARR с внесенной поправкой вычисляли посредством биномиальной регрессии и в нее вносили поправку на исходный показатель EDSS (<4,0 против ≥4,0) и географическое положение (США против остальных стран). Среднегодовая частота рецидивов (на основе всех клинических рецидивов) у пациентов, которых лечили окрелизумабом, была снижена на 42% (p=0,001) и 47% (p<0,0001) против IFNβ-1 в испытании I и испытании II, соответственно.

Таблица 4. Клинические результаты и результаты MRI в ходе испытания в течение 96-недель (выборка ITT)*
Результат	Объединенные испытания I и II	Испытание I	Испытание II
IFNβ-1a, 44 мкг (n=829)	Окрелизумаб, 600 мг (n=827)	IFNβ-1a, 44 мкг (n=411)	Окрелизумаб, 600 мг (n=410)	IFNβ-1a, 44 мкг (n=418)	Окрелизумаб, 600 мг (n=417)
Клинические результаты
Среднегодовая частота рецидивов через 96-недель
Частота (95% CI)			0,292 (0,235-0,361)	0,156 (0,122-0,200)	0,290 (0,234-0,361)	0,155 (0,121-0,198)
Снижение риска против IFNβ-1a - % (95% CI; значение p)				46 p<0,0001)		47; p<0,0001)
Подтвержденное прогрессирование нетрудоспособности в течение по меньшей мере 12 недель†
Пациенты с событием - %	13,6	9,1
Отношение рисков против IFNβ-1a (95% CI)		0,60 (0,45-0,81)		0,57 (0,37-0,90)		0,63 (0,42-0,92)
Снижение риска против IFNβ-1a - % (значение p)		0 (p=0,0006)		43 (p=0,0139)		37 (p<0,0169)
Подтвержденное прогрессирование нетрудоспособности в течение по меньшей мере 24 недель†
Пациенты с событием - %	10,5	6,9
Отношение шансов против IFNβ-1a (95% CI)		0,60 (0,43-0,84)		0,57 (0,34-0,95)		0,63 (0,40-0,98)
Снижение риска против IFNβ-1a - % (значение p)		40 (p=0,0025)		43 (p=0,0278)		37 (p=0,0370)
Подтвержденное снижение нетрудоспособности в течение по меньшей мере 12 недель †,‡
Количество оцениваемых пациентов	614	628
Пациенты с улучшением, сохранившимся в течение 12 недель - %	15,6	20,7
Относительное улучшение против IFNβ-1a - % (значение p)		33 (p=0,0194)		61 (p=0,0106)		14 (p=0,4019)
Комплексная функциональная шкала рассеянного склероза
Среднее изменение MSFC от исходного уровня до 96 недели			0,174±0,031	0,213±0,031)	0,169±0,029	0,276±0,028
Отличие в среднем значении с внесенной поправкой (95% CI; значение p)				0,039±0,039 (-0,039-0,166; p=0,3261)		0,107±0,037 (0,034-0,180; p=0040)
NEDA на 96 неделе‡,§
Количество оцениваемых пациентов			291	289	270	289
Пациенты с NEDA - %			27,1	47,4	24,1	43,9
Относительное улучшение против IFNβ-1a - % (значение p)				74 (p<0,0001)		81 (p<0,0001)
Компоненты NEDA на 96‡,§ неделе - %
Свободные от рецидива пациенты			66,7	80,4	64,3	78,9
Пациенты, свободные от подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности			87,8	92,4	84,9	89,4
Пациенты, свободные от усиливаемых гадолинием T1-бляшек			69,8	91,7	63,9	90,2
Пациенты, свободные от новых и/или увеличивающихся T2-бляшек			38,7	61,7	38,0	60,9
Результаты MRI
Усиливаемые гадолинием T1-бляшки на 24, 48 и 96 неделях
Пациенты с какими-либо усиливаемыми гадолинием T1-бляшками			30,2	8,3	36,1	9,8
Среднее количество бляшек (95% CI)			0,286 (0,200-0,409)	0,016 (0,0009-0,030)	0,416 (0,309-0,561)	0,021 (0,012-0,036)
Снижение риска против. IFNβ-1a - % (значение p)				94 (p<0,0001)		95 (p<0,0001)
Новые и/или увеличивающиеся гиперинтенсивные T2-бляшки на 24, 48 и 96 неделях¶
Пациенты с новыми и/или увеличивающимися гиперинтенсивными T2-бляшками - %			61,3	38,3	62,0	39,1
Среднее количество бляшек (95% CI)			1,413 (1,123-1,777)	0,323 (0,256-0,407)	1,904 (1,536-2,359)	0,325 (0,259-0,409)
Соотношение частот (95% CI)				0,229 (0,174-0,300)		0,171 (0,130-0,225)
Снижение риска против IFNβ-1a - % (значение p)				77 (P<0,0001)		83 (P<0,0001)
Гипоинтенсивные T1-бляшки на 24, 48 и 96 неделях¶
Среднее количество бляшек (95% CI)			0,982 (0,780-1,237)	0,420 (0,337-0,524)	1,255 (1,003-1,571)	0,449 (0,357-0,560)
Соотношение частот (95% CI)				0,428 (0,328-0,557)		0,357 (0,272-0,470)
Снижение риска против IFNβ-1a - % (значение p)				57 (P<0,0001)		64 (P<0,0001)
Объем головного мозга на 24-96 неделях
Среднее изменение			-0,741±0,046	-0,572±0,044	-0,750±0,051	0,638±0,049
значение p				P=0,0042		P=0,0900
Среднее отличие средних значений с внесенной поправкой (95% CI)				0,168 (0,053-0,283)		0,112 (-0,018-0,241)
Объем головного мозга от исходного уровня до 96 надели**
Среднее процентное изменение			-1,233±0,055	-0,943±0,054	-1,354±0,064	-1,032±0,062
значение p				p<0,0001		p<0,0001
Среднее отличие средних значений с внесенной поправкой (95% CI)				0,290 (0,148-0,432)		0,322 (0,156-0,488)
Сообщенные пациентами исходы
Краткая форма 36 компонента физического здоровья от исходного уровня до 96 недели
Среднее значение			45,399±0,529	45,065±0,507	44,552±0,544	44,307±0,541
значение p				P=0,2193		P=0,0404
Отличие средних значений с внесенной поправкой				0,693 (-0,414-1,800)		1,159 (0,051-2,269)
*Величины плюс-минус представляют собой средние значения ± стандартное отклонение †Полужирным шрифтом указаны запланированные объединенные результаты ‡У пациентов с исходным показателем EDSS по меньшей мере 2,0 §NEDA определяют как: отсутствие определяемых протоколом рецидивов, отсутствие событий CDP, отсутствие новых или увеличивающихся T2-бляшек и отсутствие усиливаемых гадолинием бляшек ¶После внесения поправки на исходное число бляшек, EDSS (<4,0/≥4,0) и географический регион (США/ROW)

Нетрудоспособность

[0336] По сравнению с IFNβ-1a, окрелизумаб снижал риск подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности (т.е. CDP), которое сохранялось в течение 12 недель, на 40% в течение 96-недельного периода испытания (испытание I и испытание II, объединенные данные; p=0,0006; фиг.11, CI=доверительный интервал; HR=отношение рисков). Необъединенные данные для испытания I и испытания II, демонстрирующие, что окрелизумаб снижал риск подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности (т.е. CDP), которое сохранялось в течение 12 недель, по сравнению с IFNβ-1a, представлены на фиг.12A (испытание I) и фиг.12B (испытание II). Окрелизумаб также снижал риск CDP, которое сохранялось в течение 24 недель, на 40% против IFNβ-1a в течение 96-недельного периода испытания (испытание I и испытание II, объединенные данные; p=0,0025; фиг.13). Необъединенные данные для испытания I и испытания II, демонстрирующие, что окрелизумаб снижал риск подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности (т.е. CDP), которое сохранялось в течение 24 недель, по сравнению с IFNβ-1a, представлены на фиг. 14A и фиг.14B. Доля пациентов (с исходным показателем EDSS 2,0 или менее) с подтвержденным снижением нетрудоспособности (т.е. CDI) в течение по меньшей мере 12 недель составляла 20,7% у пациентов, которым вводили окрелизумаб (n=628), против 15,6% у пациентов, которым вводили IFNβ-1a (n=614), что соответствует снижению риска 33% для окрелизумаба (испытание I и испытание II, объединенные данные; p=0,0194). См. фиг.15. Необъединенные данные для доли пациентов (с исходным показателем EDSS 2,0 или менее) с подтвержденным снижением нетрудоспособности в течение по меньшей мере 12 недель в испытании I и испытании II представлены на фиг.16A и фиг.16B. Необъединенные данные для результатов комплексной функциональной шкалы рассеянного склероза представлены на фиг.16C и 16D. Фиг.16C и 16D включают пациентов с оценкой на исходном уровне и по меньшей мере одной величиной после исходного уровня. Оценки получены в анализе на основе модели со смешанным эффектами для повторяющихся измерений (MMRM) с использованием неструктурированной ковариационной матрицы: изменение=исходный показатель MSFCS+географический регион (США против остальных стран)+исходный показатель EDSS (<4,0 против >=4,0)+неделя+лечение+лечение*неделя (повторяющиеся величины на протяжении недели)+исходный показатель MSFCS*неделя. 15,6% пациентов, которых лечили окрелизумабом, достигли CDI на 24 неделе (против 11,6% для пациентов, которых лечили IFNβ-1a), что соответствует относительному улучшению 36% (относительный риск 1,36 [p=0,0343]).

[0337] По сравнению с IFNβ-1a, более высокие доли пациентов, которых лечили окрелизумабом, имели улучшенные показатели EDSS (20,2% [n=146] против 15,0% [n=98]; отношение шансов с поправкой [aOR] 1,288; p=0,0866]). Значительно меньшее количество пациентов в группе окрелизумаба имели ухудшение показателей EDSS по сравнению с IFNβ-1a (10,1% [n=73] против 16,6% [n=109]; aOR 0,575, p=0,0009).

Связанные с MRI результаты

[0338] По сравнению с IFNβ-1a, окрелизумаб снижал общее количество усиливаемых гадолинием T1-бляшек на 24, 48 и 96 неделях на 94% в испытании I и 95% в испытании II (p<0,0001 для обоих испытаний; см. таблицу 4 и фиг.17A и 17B). Окрелизумаб снижал среднее общее количество усиливаемых гадолинием T1-бляшек на 91% на 24 неделе, на 98% на 48 неделе, и на 95% на 96 неделе по сравнению с IFNβ-1a с испытании I (p<0,0001 для всех моментов времени, см. фиг.18A). Окрелизумаб снижал среднее общее количество усиливаемых гадолинием T1-бляшек на 92% на 24 неделе, на 96% на 48 неделе и на 97% на 96 неделе по сравнению с IFNβ-1a в испытании II (p<0,0001 для всех моментов времени, см. фиг.18B). В результаты на фиг.17A-B и 18A-B вносили поправку на средние значения, вычисленные посредством отрицательной биномиальной регрессии, и вносили поправку ни исходный уровень усиливаемых Gd T1-бляшек (присутствующих или нет), исходный показатель EDSS (<4,0 против ≥4,0) и географическое положение (США против остальных стран).

[0339] Окрелизумаб также снижал общее количество новых/увеличивающихся гиперинтенсивных T2-бляшек на 24, 48 и 96 неделях на 77% по сравнению с IFNβ-1a в испытании I и на 83% по сравнению с IFNβ-1a в испытании II (p<0,0001 для обоих сравнений; см. таблицу 5 и фиг.19A и 19B). Как показано на фиг.19С, окрелизумаб снижал среднее количество новых/увеличивающихся гиперинтенсивных T2-бляшек на 24 неделе на 41%; на 48 неделе на 94% и на 96 неделе на 98% по сравнению с IFNβ-1a в испытании I. Как показано на фиг.19D, окрелизумаб снижал среднее количество новых/увеличивающихся гиперинтенсивных T2-бляшек на 24 неделе на 61%; на 48 неделе на 96%; и на 97 неделе на 97% по сравнению с IFNβ-1a в испытании II. (После внесения поправки на средние значения, вычисленные посредством отрицательной биномиальной регрессии, и после внесения поправки на исходное количество T2-бляшек, исходный EDSS (<4,0 против ≥4,0) и географическую область (США против ROW).) EDSS, расширенная шкала оценки состояния инвалидности; IFN, интерферон; MRI, магнитно-резонансная томография; ROW, остальные страны. Окрелизумаб снижал появление более хронических и растущих областей связанного с MS повреждения головного мозга (гиперинтенсивные T2-бляшки) на 24, 48 и 96 неделях приблизительно на 80% по сравнению с IFNβ-1a (объединенные испытание I и испытание II). В результаты на фиг.19A-D вносили поправку на средние значения, вычисленные посредством отрицательной биномиальной регрессии, и вносили поправку на исходное количество T2-бляшек, исходный показатель EDSS (<4,0 против ≥4,0) и географическое положение (US против остальных стран).

[0340] Окрелизумаб замедлял уменьшение объема головного мозга с 24 недели по 96 недели по сравнению с IFNβ-1a (испытание I, p=0,0042; испытание II, p=0,0900; фиг.20A и 20B). Окрелизумаб также замедлял снижение объема головного мозга от исходного уровня до 96 недели по сравнению с IFNβ-1a (испытание I, p=<0,0001; испытание II, p=0,0001; фиг.21A и 21B). Результаты, представленные на фиг.20A-B и 21A-B, сравнивали с использованием критерия Кохрана-Мантеля-Гензеля, стратифицированного по географической области (США против остальных стран) и исходному показателю EDSS (<4,0 против ≥4,0). Результаты на фиг.20A-B и 21A-B сравнивали с использованием критерия Кохрана-Мантеля-Гензеля, стратифицированного по географической области (США против остальных стран) и исходному показателю EDSS (<4,0 против >4,0). Окрелизумаб снижал скорость уменьшения объема головного мозга от 24 недели до 96 недели на 22,7% в испытании I (p=0,0042) и на 14,9% в испытании II (p=0,0900) по сравнению с IFNβ-1a. См. фиг.20. В испытании I уменьшение объема головного мозга (от исходного уровня до 96 недели) у пациентов, которых лечили окрелизумабом, было снижено на 23,5% относительно пациентов, которых лечили IFNβ-1a (P<0,0001). В испытании II уменьшение объема головного мозга (от исходного уровня до 96 недели) у пациентов, которых лечили окрелизумабом, было снижено на 23,8% относительно пациентов, которых лечили IFNβ-1a (P=0,0001). См. фиг.21.

[0341] Пациенты, которых лечили окрелизумабом, продемонстрировали снижение на 18,8% атрофии головного мозга по сравнению с пациентами, которых лечили IFNβ-1a.

[0342] Окрелизумаб снижал общее число новых гипоинтенсивных T1-бляшек на 57% по сравнению с IFNβ-1a в испытании I и на 64% по сравнению с IFNβ-1a в испытании II. См. фиг.22A и 22B.

[0343] Результаты эффективности для испытания I и испытания II обобщенно представлены в таблице 5.

Таблица 5. Обобщение эффективности для испытания I и испытания II
	ИСПЫТАНИЕ I	ИСПЫТАНИЕ II	Объединенные испытания
Результат	Снижение риска, значение p	Снижение риска, значение p	Снижение риска, значение p
ARR	46%, <0,0001	47%, <0,0001
Время до CDP 12 недель	43%, 0,0139	37%, 0,0169	40%, 0,0006
Общее количество усиливаемых Gd T1-бляшек (24, 48, 96 недели)	94%, <0,0001	95%, <0,0001
Всего новых/увеличивающихся T2-бляшек (24, 48, 96 недели)	77%, <0,0001	83%,<0,0001
CDI, 12 недель	улучшение 61%, 0,0106	улучшение 14%, 0,4019	улучшение 33%, 0,0194
Время до CDP 24 недели	43%, 0,0278	37%, 0,0370	40%,0,0025
Общее количество гипоинтенсивных T1-бляшек (24, 48, 96 недель)	57%, <0,0001	64%, <0,0001
Отличие средних значений MSFC (от исходного уровня до 96 недели)	p=0,3261	p=0,0040
Отличие средних объемов головного мозга (от 24 недели до 96 недели)	p=0,0042	p=0,090
Изменение SF-36 PCS (от исходного уровня до 96 недели)	p=0,2193	p=0,0404
NEDA на 96 неделе	улучшение 74%, <0,0001	улучшение 81%, <0,0001

[0344] В испытании I 80,4% пациентов, которых лечили окрелизумабом, не имели рецидивов в течение 96 недель против 66,7% пациентов, которых лечили IFNβ-1a. В испытании II 78,9% пациентов, которых лечили окрелизумабом, не имели рецидивов в течение 96 недель против 64,5% пациентов, которых лечили IFNβ-1a.

[0345] В испытании I, 92,4% пациентов, которых лечили окрелизумабом, не имели CDP в течение 96 недель против 87,8% пациентов, которых лечили IFNβ. В испытании II 89,4% пациентов, которых лечили окрелизумабом, не имели CDP в течение 96 недель против 84,9% пациентов, которых лечили IFNβ.

[0346] В испытании I, 92,3% пациентов, которых лечили окрелизумабом, имели снижение/стабилизацию нетрудоспособности против 86,1% пациентов, которых лечили IFNβ-1a. В испытании II 87,5% пациентов, которых лечили окрелизумабом, имели снижение/стабилизацию нетрудоспособности против 80,4% пациентов, которых лечили IFNβ-1a.

[0347] В испытании I 7,7% пациентов, которых лечили OCR, имели увеличение нетрудоспособности против 13,9% пациентов, которых лечили IFNβ-1a (отношение шансов с внесением поправки 0,559; p=0,0242). В испытании II 12,5% пациентов, которых лечили OCR, имели увеличение нетрудоспособности против 19,6% пациентов, которых лечили IFNβ-1a (отношение шансов с внесением поправки 0,577; p=0,0121).

[0348] В испытании I 91,7% пациентов, которых лечили окрелизумабом, не имели усиливаемых гадолинием T1-бляшек через 96 недель против 69,8% пациентов, которых лечили IFNβ. В испытании II, 90,2% пациентов, которых лечили окрелизумабом, не имели усиливаемых гадолинием T1-бляшек через 96 недель против 63,9% пациентов, которых лечили IFNβ.

[0349] В испытании I 61,7% пациентов, которых лечили окрелизумабом, не имели новых/увеличивающихся T2-бляшек через 96 недель против 38,7% пациентов, которых лечили IFNβ. В испытании II 60,9% пациентов, которых лечили окрелизумабом, не имели новых/увеличивающихся T2-бляшек через 96 недель против 38,0% пациентов, которых лечили IFNβ.

[0350] На 24 неделе ≥96,0% всех пациентов, которых лечили OCR, не имели новых/увеличивающихся T2-бляшек по сравнению с 60,8-70,9% пациентов, которых лечили IFNβ1-a.

Безопасность

Неблагоприятные явления

[0351] Общая встречаемость неблагоприятных явлений составляла 83,3% и 83,3% для пациентов, которых лечили IFNβ-1a и окрелизумабом, соответственно, в испытании I и испытании II (объединенные). (См. таблицу 6A).

Таблица 6A. Неблагоприятные явления (выборка безопасности).
n (%)	ОБЪЕДИНЕННЫЕ ИСПЫТАНИЕ I И ИСПЫТАНИЕ II
IFNβ-1a, 44 мкг (n=826)	Окрелизумаб, 600 мг (n=825)
Общее количество пациентов с ≥ 1 неблагоприятным явлением (AE)	688 (83,3)	687 (83,3)
Общее количество пациентов с ≥ 1 AE, встречающимся с относительной частотой ≥ 5%	539 (65,3)	544 (65,9)
Повреждение, отравление и осложнения, вызванные процедурами	155 (18,8)	333 (40,4)
Обусловленная инфузией реакция	80(9,7)	283 (34,3)
Общие нарушения и состояния области введения	396 (47,9)	173 (21,0)
Гриппоподобные расстройства	177 (21,4)	38 (4,6)
Эритема области инъекции	127 (15,4)	1 (0,1)
Усталость	64 (7,7)	64 (7,8)
Реакция области инъекции	45 (5,4)	2 (0,2)
Инфекции и инфестации	433 (52,4)	482 (58,4)
Инфекция верхних дыхательных путей	87 (10,5)	125 (15,2)
Назофарингит	84 (10,2)	122 (14,8)
Инфекция мочевыводящих путей	100 (12,1)	96 (11,6)
Синусит	45 (5,4)	46 (5,6)
Бронхит	29 (3,5)	42 (5,1)
Нарушения нервной системы	252 (30,5)	224 (27,2)
Головная боль	124 (15,0)	93 (11,3)
Психиатрические нарушения	144 (17,4)	149 (18,1)
Депрессия	54 (6,5)	64 (7,8)
Бессонница	38 (4,6)	46 (5,6)
Нарушение скелетно-мышечных и соединительной тканей	207 (25,1)	204 (24,7)
Боль в спине	37 (4,5)	53 (6,4)
Артралгия	51 (6,2)	46 (5,6)

Таблица 6A включает только объединенные AE, возникшие у ≥5% пациентов по меньшей мере в одной группе лечения и в соответствующем классе систем органов.

Таблица 6B. Все тяжелые неблагоприятные явления
n (%)	IFNβ-1a, 44 мкг (n=826)	Окрелизумаб, 600 мг (n=825)
Общее количество пациентов с ≥ SAE	72 (8,7)	57 (6,9)
Инфекции и инфестации	24 (2,9)	11 (1,3)
Нарушения нервной системы	11 (1,3)	8 (1,0)
Повреждение, отравление и осложнения, вызванные процедурами	10 (1,2)	6 (0,7)

[0352] Серьезные неблагоприятные явления сообщались для 8,7% пациентов, которых лечили IFNβ-1a, и 6,9% пациентов, которых лечили окрелизумабом, в испытании I и испытании II (объединенные). (См. таблицу 6B).

Инфекции

[0353] Встречаемость инфекций составляла 52,8% для IFNβ-1a и 56,6% для окрелизумаба в испытании I и 52,0% для IFNβ-1a и 60,2% для окрелизумаба в испытании II. Наиболее частыми инфекциями (сообщенными по меньшей мере у 10% пациентов по меньшей мере в одной группе лечения) были инфекции мочевыводящих путей, инфекции верхних дыхательных путей и назофарингит. Встречаемость серьезных инфекций в обоих испытаниях была низкой (от 1,2 до 2,9% для всех групп лечения в обоих испытаниях). Не сообщалось о серьезных оппортунистических инфекциях в какой-либо группе в ходе испытания в течение 96 недель. В целом, инфекции вирусом герпеса были сообщены для 28 пациентов, которых лечили и IFNβ-1a, и 50 пациентов, которых лечили окрелизумабом. Все случаи были мягкими или умеренными, за исключением одного случая простого герпеса у пациента, которого лечили окрелизумабом в испытании I, который был классифицирован как тяжелый.

Обусловленные инфузией реакции

[0354] Число пациентов по меньшей мере с одной обусловленной инфузией реакцией (IRR) было более высоким у пациентов, которых лечили окрелизумабом, против IFNβ-1a (30,9% для окрелизумаба против 7,3% для IFNβ-1a в испытании I; 37,6% для окрелизумаба против 12,0% для IFNβ-1a в испытании II; 34,3% для окрелизумаба против 9,7% для IFNβ-1 как в испытании I, так и в испытании II (объединенные)). Один пациент, которого лечили OCR, имел тяжелый IRR при первой инфузии с угрожающим жизни брохоспазмом; несмотря на разрешение этого случая, последующее лечение было отменено согласно протоколу. Отмена лечения вследствие IRR при первой инфузии произошла у 11 пациентов (1,3%) только в группе окрелизумаба. Встречаемость IRR у пациентов, которых лечили окрелизумабом, была наивысшей при первой инфузии (27,5%) и значительно снижалась при последующем дозировании (13,7% при 2 дозе). Большинство обусловленных инфузией реакций представляли собой реакции 1 или 2 степени и сообщались для первой инфузии первой дозы (см. фиг.23A и 23B, объединенные данные для испытания I и испытания II). Числа в столбцах соответствуют доле пациентов, испытывающих какую-либо степень IRR. Классификации согласно общим терминологическим критериям (CTCAE): степень 1, мягкая: бессимптомная или мягкие симптомы; степень 2, умеренная: показано минимальное, местное или неинвазивное вмешательство; степень 3, тяжелая или клинически значимая, но не угрожающая прямо жизни; степень 4, угрожающие жизни последствия, показано срочное вмешательство; степень 5, смерть, обусловленная AE. Примечание: всем вводили 100 мг метилпреднизолона в/в. В течение 96 недель 9,7% пациентов, которых лечили IFNβ-1a, (n=80/826) и 34,3% пациентов, которых лечили окрелизумабом, (n=283/825) имели по меньшей мере 1 IRR; большинство из них имели тяжесть от мягкой до умеренной (99% [n=79] и 93% [n=262], соответственно). Большинство симптомов IRR у пациентов, которых лечили окрелизумабом, включали зуд, сыпь, раздражение в горле и гиперемию. IRR наиболее часто возникали в процессе инфузии (IFNβ-1a, 46,3%; окрелизумаб, 80,6%) и их контролировали коррекцией инфузии и симптоматическим лечением (42,5% пациентам, которые имели IRR, в группе IFNβ-1a и 65,4% в группе окрелизумаба проводили лечение).

Злокачественные опухоли

[0355] Всего было сообщено о двух злокачественных опухолях в случае IFNβ-1a (одна карцинома мантийных клеток и одна плоскоклеточная карцинома) и было сообщено о четырех злокачественных опухолях у пациентов, которых лечили окрелизумабом (два случая инвазивной карциномы протоков молочных желез, один почечноклеточный рак и одна злокачественная меланома).

Лабораторная оценка

[0356] При лабораторной оценке на 2 неделе средние уровни CD19 снижались до ничтожно малых у пациентов, которых лечили окрелизумабом. Отсутствовало влияние на CD3-, CD4, CD8-, CD16- и CD56-положительные клетки, что подтверждает, что окрелизумаб не влияет на врожденный иммунитет и общее количество T-клеток. Отсутствовало влияние окрелизумаба на титры существующих антител против свинки, краснухи, ветрянки и пневмококка.

[0357] Хотя только прямое сравнение окрелизумаба с IFNβ-1a проводили в испытании I и испытании II, эти результаты эффективности и безопасности указывают на то, что профиль польза/риск окрелизумаба в течение 2-летнего периода является лучшим относительно всех модифицирующих заболевание способов терапии (DMT), доступных для лечения пациентов с RMS.

Эффекты окрелизумаба на гуморальный иммунитет

[0358] Перед включением в испытание врачам советовали изучить статус иммунизации пациента и следовать местным рекомендациям по вакцинации; иммунизации должны были быть завершены за ≥6 недель до лечения. Измерения титров антител (Ab) против свинки, краснухи, ветрянки и Streptococcus pneumoniae проводили на исходном уровне и на 12, 24, 48, 72 и 96 неделях. Доля пациентов с уровнями Ab, которые можно было считать защитными, оценивали для каждой группы лечения с течением времени.

[0359] Свинка: 94,1% пациентов, которых лечили IFNβ и 93,6% пациентов, которых лечили окрелизумабом, имели положительные уровни Ab против свинки на исходном уровне. (Эта доля варьировалась (минимум-максимум) 92,7-94,8% (IFNβ-1a) и 91,8-93,5% (окрелизумаб) на протяжении шести измерений, проведенных в ходе 96-недельного периода лечения в испытании.)

[0360] Краснуха: 87,9% пациентов, которых лечили IFNβ-1a, и 89,0% пациентов, которых лечили окрелизумабом, имели положительные уровни Ab против краснухи, и они находились в диапазоне (минимум-максимум) 89,8-90,8% (IFNβ-1a) и 88,7-89,4% (окрелизумаб) на протяжении шести измерений, проведенных в ходе периода лечения.

[0361] Ветрянка: 95,5% обеих групп лечения имели положительные уровни Ab против ветрянки на исходном уровне, и они находились в диапазоне (минимум-максимум) 96,2-97,5% (IFNβ-1a) и 94,8-95,6% (окрелизумаб) на протяжении шести измерений, проведенных в ходе периода лечения.

[0362] S. pneumonia: Среди оцениваемых пациентов среднее значение (стандартное отклонение) уровня Ab против S. pneumonia на исходном уровне составляло 53,67 (54,13) мг/мл для пациентов, которых лечили IFNβ-1a, и 55,35 (67,00) мг/мл для пациентов, которых лечили окрелизумабом. Через 96 недель среднее изменение от исходного уровня составляло -1,13 (40,25) мг/мл для пациентов, которых лечили IFNβ-1a, и -1,99 (59,60) мг/мл для пациентов, которых лечили окрелизумабом.

[0363] В открытом испытании фазы III для оценки эффекта окрелизумаба на иммунные ответы у пациентов с рецидивирующим рассеянным склерозом приблизительно 100 пациентов будут случайным образом распределять (2:1) для введения окрелизумаба 600 мг в качестве двух внутривенных инфузий по 300 мг на 1 сутки и 15 сутки. В группе A будут вводить окрелизумаб перед иммунизацией. Группу B будут оставлять наивными в отношении лечения/будут продолжать лечение интерфероном в процессе иммунизации.

[0364] Пациентов группы A будут иммунизировать содержащей столбнячный токсоид (TT) адсорбированной вакциной, 23-валентной вакциной на основе пневмококкового полисахарида (23-PPV), и KLH на 85 сутки/12 неделе (12 недель после лечения окрелизумабом). Пациентов группы A далее будут подразделять на получение любого из:

- усиливающая 13-валентная конъюгатная вакцина на основе пневмококка (13-PCV; группа A1); или

- вакцина против вируса гриппа (группа A2).

[0365] Пациентов группы B будут иммунизировать TT, 23-PPV, вакциной против гриппа и повторным введением гемоцианина лимфы улитки (KLH) на 1 сутки/1 неделе.

[0366] Все группы будут подвергать оценке после иммунизации до конца периода испытания (группа A: 169 сутки/24 неделя; группа B: 84 сутки/12 неделя). Ключевые критерии пригодности включают по меньшей мере 1 предшествующую иммунизацию против TT, столбняка или дифтерии; или против столбняка, дифтерии и бесклеточной вакциной против коклюша. Первичный показатель результата будет сравнивать долю пациентов в группах A1 и A2 с положительным ответом на TT (IgG) через 8 недель после иммунизации с пациентами в группе B.

[0367] Ключевые вторичные результаты включают: доли пациентов в группах A1 и A2 против группы B с положительным ответом индивидуального серотипа антител против пневмококка через 4 недели после 23-PPV; средние уровни антител против KLH (IgG) в группе A против группы B через 4 недели после последнего введения KLH; доля пациентов в группе A1 против группы B с положительными ответами индивидуального серотипа антител против пневмококка через 4 недели после усиливающего введения 13-PCV; доля пациентов в группе A2 против группы B, которые достигли серопротенции через 4 недели после введения вакцины против гриппа; показатели подгрупп B- и T-клеток и натуральных киллеров; и общую безопасность.

Обобщение

[0368] Испытание I и испытание II показали, что у пациентов с рецидивирующими формами MS, окрелизумаб значительно снижал среднегодовую частоту рецидивов и риск подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение 12 и 24 недель по сравнению с IFNβ-1a. Окрелизумаб представляет собой первое средство для лечения рассеянного склероза, которое значительно снижает подтвержденное прогрессирование нетрудоспособности как в течение 12, так и в течение 24 недель, в двух отдельных испытаниях фазы III и против активного средства сравнения, что демонстрирует стабильность эффекта. Доля пациентов, которые достигли снижения нетрудоспособности в течение по меньшей мере 12 недель, также была значительно увеличена среди пациентов, которым вводили окрелизумаб, по сравнению с IFNβ-1a. Эти клинические данные подтверждаются результатами MRI, по которым окрелизумаб значительно снижал количество усиливаемых гадолинием T1-бляшек и новых/увеличивающихся T2-бляшек в головном мозге по сравнению с IFNβ-1a. Эффект на усиливаемые гадолинием T1-бляшки и новые/увеличивающиеся T2-бляшки имеет такую величину, которая указывает на то, что фокальное воспаление и активность заболевания являются по большей части прекращены/приостановлены.

[0369] В исследовательских анализах окрелизумаб снижал уменьшение объема головного мозга (см. фиг.21A-D) и увеличивал долю пациентов без признаков активности заболевания (NEDA) в выборке ITT с улучшением EDSS ≥ 2,0 (см. таблицы 4 и 5 и фиг.34) по сравнению с IFNβ-1a. (На фиг.34, доля пациентов с NEDA сравнена с использованием критерия β2 Кохрана-Мантеля-Гензеля, стратифицированного по географическому региону (США против остальных стран) и исходному показателю EDSS (<4,0 против ≥4,0)).

[0370] Эти результаты эффективности, которые демонстрируют снижение ухудшения нетрудоспособности и у некоторых пациентов улучшение функционирования, подтверждают гипотезу о том, что окрелизумаб обладает эффектами на маркеры воспаления и нейрональное повреждение. Эффективность, демонстрируемая окрелизумабом, в отношении как воспалительных, так и дегенеративных исходов, указывает на то, что лечение окрелизумабом обладает мощными противовоспалительными эффектами и также может обладать нейропротективными эффектами.

[0371] Пользу окрелизумаба в испытании I и испытании II наблюдали рано, и она сохранялась в течение 96-недельного периода лечения; исходя из более раннего опыта, после прекращения лечения симптомов риск возобновления не ожидается (Kappos et al. (2012) "Long-термин safety and efficacy of ocrelizumab in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis: Week 144 results of a phase II, randomized, multicentre trial." 28th Congress of the European Committee for Treatment and Research in Multiple Sclerosis).

[0372] Неблагоприятные явления, наблюдаемые у пациентов, которым вводили окрелизумаб, согласовывались с неблагоприятными явлениями, сообщенными для испытания окрелизумаба фазы II (Kappos et al. (2011) Lancet. 378, 1779-87). Отсутствовали случаи тяжелых оппортунистических инфекций, сообщенных в ходе испытаний в течение 96 недель. Результаты на настоящий момент указывают на то, что окрелизумаб не оказывает существенного влияния на иммунный надзор. В целом, окрелизумаб имел сходный профиль безопасности с IFNβ-1a в течение 96 недель как в испытании I, так и в испытании II.

[0373] В качестве класса лекарственных средств, нацеленные на CD20⁺ лекарственные средства имеют низкий риск прогрессирующей многоочаговой лейкоэнцефалопатии (<1 на 25000) (Clifford et al. (2011) Arch Neurol. 68, 1156-64). В испытаниях на настоящий момент не было сообщений о случаях прогрессирующей многочаговой лейкоэнцефалопатии.

[0374] Как и ожидалось, обусловленные инфузией реакции более часто наблюдали в случае окрелизумаба. В соответствии с испытанием фазы II с дозой окрелизумаба 600 мг, эти реакции по большей части наблюдались для первой дозы и снижались при последующих дозах (Hauser et al. (2008) N Engl J Med. 358, 676-88). Это подтверждает основание для разделения первой дозы 600 мг на две отдельных инфузии по 300 мг с интервалом приблизительно две недели. Обусловленные инфузией реакции контролировались премедикацией, коррекцией инфузии и симптоматическим лечением.

[0375] Клинически данные и данные MRI в совокупности указывают на то, что окрелизумаб является по меньшей мере настолько же эффективным, как любое другое протестированное средство для лечения рассеянного склероза, включая средства, которые считаются высокоэффективными способами терапии. Хотя в испытании I и испытании II проводили только прямое сравнение с IFNβ-1a, эти результаты эффективности и безопасности указывают на то, что профиль польза/риск окрелизумаб в течение 2-летнего периода является лучшим относительно всех модифицирующих заболевание способов терапии, доступных для лечения пациентов с RMS. Высокая эффективность не ассоциирована с увеличением риска безопасности по сравнению с IFNβ-1a. Другие преимущества включают раннее появление пользы лечения и отсутствие возобновления симптомов после прекращения лечения окрелизумабом.

[0376] Данные, полученные для испытания I и испытания II, демонстрируют, что нацеливание на CD20⁺ B-клетки может быть эффективным для лечения рецидивирующего MS.

Анализ подгрупп

[0377] Для оценки относительной пользы/риска с различными степенями активности заболевания и предшествующим ответом на лечение до включения в испытание было идентифицировано четыре дополнительных подгруппы:

[0378] Активные наивные в отношении лечения; определяемые как не имеющие предшествующего лечения, перенесшие по меньшей мере 2 рецидива за последние 2 года, и по меньшей мере 1 рецидив за последний год перед рандомизацией.

[0379] Активные недостаточно отвечающие; определяются как пациенты, которых ранее лечили IFNβ-1a или глатирамера ацетатом в течение по меньшей мере 1 года, и либо (a) перенесли по меньшей мере один рецидив за последний год или (b) имели по меньшей мере 1 усиливаемую гадолинием бляшку на исходном уровне.

[0380] Высокоактивные наивные в отношении лечения пациенты; определяются как пациенты, наивные в отношении лечения, которые перенесли по меньшей мере 2 рецидива за последний год перед рандомизацией, и либо (a) имеют по меньшей мере 1 исходную усиливаемую гадолинием бляшку, либо (b) имеют увеличение количества T2-бляшек при посещении исходного уровня (изменение категории от 0-5 до 6-9 бляшек или от 6-9 бляшек до > 9 бляшек), по сравнению с предшествующим исследованием MRI.

[0381] Высокоактивные недостаточно отвечающие; определяются как пациенты, которых ранее лечили интерфероном или глатирамера ацетатом в течение по меньшей мере 1 года, которые имели по меньшей мере один рецидив за последний год, и либо (a) имеют по меньшей мере девять T2-бляшек, либо b) имеют по меньшей мере одну усиливаемую Gd бляшку при первоначальном посещении.

[0382] Испытание I и испытание II объединяли для повышения мощности для обнаружения различий среди 4 подгрупп. В каждой подгруппе было по меньшей мере 100 пациентов для обеспечения достаточного выявления различий между способами лечения.

[0383] Проводили исследование среднегодовой частоты рецидивов на звено/группу для определения того, определялись ли тенденции к недостаточному ответу абсолютными исходами для окрелизумаба и IFNβ-1a. В целом, окрелизумаб продемонстрировал значительный эффект снижения среднегодовой частоты рецидивов во всех подгруппах по сравнению с IFNβ-1a (см. таблицу 7). Недостаточно отвечающие пациенты в группе интерферона имели более высокое значение ARR, чем в группе ITT, в то время как пациенты, которым вводили окрелизумаб, из той же подгруппы имели более низкое значение ARR, чем в группе ITT. Группа активных наивных в отношении лечения пациентов имела более высокое значение ARR как в группе интерферона, так и в группе окрелизумаба.

[0384] Для всех 4 подгрупп окрелизумаб имел более высокий эффект лечения по сравнению с IFNβ-1a в отношении ARR, CDP в течение по меньшей мере 12 недель, CDP в течение по меньшей мере 24 недель, CDI и MRI (см. таблицы 7-11 выше). Для ARR и MRI отличие было статистически значимым среди всех 4 подгрупп. Для CDP в течение по меньшей мере 12 недель, существовали статистически значимые эффекты как для активных, так и для высокоактивных недостаточно отвечающих пациентов, демонстрируя, что окрелизумаб имеет стабильные эффекты лечения по сравнению с IFNβ-1a. Для CDP в течение по меньшей мере 24 недель, эти группы продемонстрировали тенденцию к значимости (p=0,075 и p=0,082, соответственно). По сравнению с объективными показателями, такими как усиливаемые Gd T1-бляшки (указывающие на острые воспалительные эффекты, согласующиеся с механизмом действия для OCR), устойчивые и стабильные эффекты окрелизумаба по сравнению с IFNβ-1a являются очевидными для всех подгрупп.

[0385] Аналогично, проводили анализ исходов безопасности для 4 подгрупп и сравнивали с общей выборкой безопасности. Вследствие сравнительно малого размера групп сравнение между группами было ограничено, чтобы не делать неприемлемых выводов на основе малого количеств событий. Результаты безопасности в 4 группах согласовывались друг с другом и были сходными с общей выборкой ("выборка безопасности", определяемая как любой пациент с любым воздействием OCR) с в основном низкой долей пациентов, которые перенесли какие-либо AE, SAE и AE, приведшие к исключению. В соответствии с наблюдениями в выборке безопасности, в группе окрелизумаба было больше инфекций по сравнению с группой интерферона, в то время как доля пациентов, перенесших серьезные инфекции, в группе окрелизумаба была сходной или более низкой, чем в случае интерферона, во всех подгруппах.

[0386] Общие исходы эффективности и безопасности для окрелизумаба были сравнимыми с ITT/выборкой безопасности в каждой подгруппе. Таким образом, окрелизумаб продемонстрировал благоприятный профиль польза/риск во всех подгруппах. Согласованность данных среди подгрупп далее подтверждает наблюдаемые эффекты в общей выборке.

Пример 2: Испытание фазы III для окрелизумаба у пациентов с первично-прогрессирующим рассеянным склерозом

[0387] Проводили рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое испытание с параллельными группами для оценки эффективности и безопасности окрелизумаба по сравнению с плацебо у пациентов с первично-прогрессирующим рассеянным склерозом.

[0388] Клинические испытания прогрессирующих форм MS, как правило, имеют длительность > 2 лет вследствие гетерогенности скоростей прогрессирования заболевания, которые иногда исторически являются более низкими, чем ожидается, что приводит к неспособности продемонстрировать эффект лечения. Это испытание имело управляемую событиями модель, что означает, что, если запланированное количество подтвержденных событий прогрессирования нетрудоспособности не достигалось к 120 неделе вследствие медленного прогрессирования заболевания, период лечения продлевали до тех пор, пока не произойдет достаточное количество событий прогрессирования для поддержания статистической мощности для обнаружения различий способов лечений. В результате слепой период лечения составлял минимум 120 недель с момента последнего включенного пациента; средний период лечения составил 3,5 года. Большинство пациентов продолжат наблюдаться в течение периода 3-4 лет в слепой фазе лечения.

Способы

Критерии пригодности и исключения

[0389] Ключевые критерии пригодности включали: возраст от 18 до 55 лет; диагноз первично-прогрессирующего рассеянного склероза в соответствии с пересмотренными в 2005 году критериями Макдональда (Polman et al. (2011) "Diagnostic criteria for multiple sclerosis: 2005 revisions to the McDonald criteria." Ann Neurol 58, 840-846); показатель расширенной шкалы оценки состояния инвалидности (EDSS) от 3 до 6,5 баллов при скрининге; документированный анамнез или присутствие при скрининге повышенного индекса IgG в образце цереброспинальной жидкости (CSF) и/или одной или нескольких полос олигоклональных IgG, обнаруженных посредством изоэлектрического фокусирования, в образце цереброспинальной жидкости (CSF); отсутствие рецидивирующе-ремиттирущего рассеянного склероза (RRMS), вторично-прогрессирующего рассеянного склероза (SPMS) или прогрессирующе-рецидивирующего рассеянного склероза (PRMS) в анамнезе; длительность заболевания от появления симптомов MS (a) менее 15 лет у пациентов с EDSS при скрининге > 5,0 или (b) менее 10 лет у пациентов с EDSS при скрининге ≤ 5,0; и отсутствие лечения другими модифицирующими заболевание средствами от рассеянного склероза при скрининге.

[0390] Ключевые критерии исключения включали: рецидивирующе-ремиттирущий рассеянный склероз, вторично-прогрессирующий или прогрессирующе-рецидивирующий рассеянный склероз в анамнезе при скрининге; противопоказания к магнитно-резонансной томографии (MRI); известное присутствие других неврологических нарушений; известную активную инфекцию или наличие в анамнезе или присутствие текущей рецидивирующей или хронической инфекции; злокачественную опухоль в анамнезе, включая солидные опухоли и гематологические злокачественные опухоли (за исключением базально-клеточного in situ плоскоклеточного рака кожи и карциномы in situ шейки матки, которые были вырезаны и устранены); предшествующее лечение направленными на B-клетки способами терапии (например, ритуксимаб, окрелизумаб, атацицепт, белимумаб или офатумумаб); любое предшествующее лечение блокаторами транспорта лимфоцитов (например, натализумаб, FTY720), любое предшествующее лечение алемтузумабом (CAMPATH^®, LEMTRADA™), антителом против CD4, кладрибином, циклофосфамидом, митоксантроном, азатиоприном, микофенолата мофетилом, циклоспорином, метотрексатом, общим облучением организма или трансплантацией костного мозга; лечение интерферонами β, глатирамера ацетатом, в/в иммуноглобулином, плазмаферезом или другими иммуномодулирующими способами терапии в пределах 12 недель до рандомизации; системную терапию кортикостероидами в пределах 4 недель перед скринингом; и любое сопутствующее заболевание, которое может потребовать длительного лечения системными кортикостероидами или иммунодепрессантами в ходе испытания. Период скрининга мог быть удлинен (но не может превышать 8 недель) для пациентов, которые использовали системные кортикостероиды против MS перед скринингом. Для включения пациентов системные кортикостероиды не должны вводиться между скринингом и первоначальным посещением.

Схема испытания

[0391] Пациентов случайным образом распределяли 2:1 для лечения либо окрелизумабом (300 мг внутривенно, 2 инфузии с интервалом 14 суток в каждом курсе лечения (т.е. воздействии)), либо плацебо. Пациентов стратифицировали по возрасту (≤45 против >45) и региону (США против остальных стран).

[0392] Испытание состояло из следующих периодов (обобщенно представленных на фиг.24):

Скрининг вплоть до 4 недель.

Период слепого лечения: всех пациентов подвергали исследуемому лечению в течение по меньшей мере 120 недель, соответствующему пяти курсам лечения, каждый курс имел длительность 24 недели. Поскольку пациентов набирали в течение периода 12-18 месяцев, этот период слепого лечения продлился вплоть до 3,5-4 лет для первой группы пациентов, включенных в испытание. Как показано на фиг.24, дозы окрелизумаба вводили в качестве двойных внутривенных инфузий 300 мг × 2 с интервалом 14 суток. За тридцать минут до начала каждой инфузии окрелизумаба или плацебо пациентам вводили 100 мг метилпреднизолона внутривенно. Также было рекомендовано лечение до инфузии пероральным обезболивающим/жаропонижающим средством (например, ацетаминофен) и пероральным антигистамином (например, дифенгидрамин).

Открытый период лечения: После первичного демаскирования, пациентов, которым лечение принесло пользу, открыто лечили окрелизумабом. Пациентов, рандомизированных в группу окрелизумаба, продолжали открыто лечить двойной инфузией окрелизумаба (в/в инфузии 300 мг, проводимые с интервалом 14 суток) каждые 24 недели. Пациентам, рандомизированным в группу плацебо, проводили двойную инфузию окрелизумаба при первом открытом курсе лечения, т.е. две в/в инфузии, проводимые с интервалом 14 суток, начиная со следующего регулярного запланированного посещения после промежуточной блокировки базы данных и первичного анализа.

Методики испытания

[0393] Первичным результатом эффективности было время до возникновения подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в ходе периода лечения, определяемое как увеличение EDSS, которое сохранялось в течение по меньшей мере 12 недель, исходя из регулярно запланированных посещений.

[0394] Вторичные результаты включали: время до возникновения подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в ходе периода лечения, определяемого как увеличение EDSS, которое сохранялось в течение по меньшей мере 24 недель, исходя из регулярных запланированных посещений; изменение результатов испытания ходьбы на 25 футов на время (T25-FW) от исходного уровня до 120 недели; процентное изменение общего объема T2-бляшек при MRI от исходного уровня до 120 недели; процентное изменение общего объема головного мозга при MRI с 24 недели по 120 неделю; и изменение краткой формы 36 (SF-36) показателя физического компонента от исходного уровня до 120 недели.

Статистический анализ

[0395] Статистическая иерархия представлена на фиг.25.

Результаты

Пациенты

[0396] Как показано в таблице 12, анамнез заболевания пациентов с рассеянным склерозом и характеристики заболевания были хорошо сбалансированными.

Таблица 12. Демографические данные пациентов и исходные характеристики заболевания
	Плацебо, n=244	Окрелизумаб, 600 мг, N=488
Возраст, лет, среднее значение (SD)	44,4 (8,3)	44,7 (7,9)
Женщины, n (%)	124 (50,8)	237 (48,6)
Время с появления симптомов, лет, среднее значение (SD)	6,1 (3,6)	6,7 (4,0)
Время с момента постановки диагноза, лет, среднее значение (SD)	2,8 (3,3)	2,9 (3,2)
Наивные в отношении лечения модифицирующим заболевание средством против MS, n (%)	214 (87,7)	433 (88,7)
EDSS, среднее значение (SD)	4,7 (1,2)	4,7 (1,2)
Данные MRI
Пациенты Gd+ бляшками, n (%)	60 (24,7%)	133 (27,5)
Число Gd+ T1-бляшек, среднее значение (SD)	0,6 (1,6)	1,2 (5,1)
Объем T2-бляшек, см3, среднее значение(SD)	10,9 (13,0)	12,7 (15,1)
Нормализованный объем головного мозга, см3, среднее значение (SD)	1469,9 (88,7)	1462,9 (83,9)

[0397] Как показано на фиг.26, характеристики выборки всех пациентов с намерением лечиться были хорошо сбалансированными.

Нетрудоспособность

[0398] Время до подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности, которое сохранялось в течение по меньшей мере 12 недель, у пациентов, которым вводили 600 мг окрелизумаба, по сравнению с пациентами, которым вводили плацебо, представлено на фиг.27 (отношение шансов HR). Время до подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности, которое сохранялось в течение по меньшей мере 24 недель, у пациентов, которым вводили 600 мг окрелизумаба, по сравнению с пациентами, которым вводили плацебо, представлено на фиг.28. Пациентов ITT с изначальным прогрессированим нетрудоспособности, которые рано прекратили лечение без подтверждающей оценки EDSS, считали имеющими подтвержденное прогрессирование нетрудоспособности, значение p было основано на логарифмическом ранговом критерии, стратифицированном по географическому региону и возрасту. Окрелизумаб снижал риск CDP, сохраняющегося в течение ≥ 12 недель, на 24% относительно плацебо и снижал риск CDP, сохраняющегося в течение ≥ 24 недель, на 25% против плацебо. Анализы на фиг.27 и 28 были основаны на выборке ITT; значение p было основано на логарифмическом ранговом критерии, стратифицированном по географическому региону и возрасту. Пациентов с изначальным прогрессированием нетрудоспособности, которые рано прекратили лечение, у которых отсутствовала подтверждающая оценка EDSS, считали имеющими подтвержденное прогрессирование нетрудоспособности.

[0399] Риск CDP в течение 12 недель снижался на 35% у пациентов, которым вводили окрелизумаб с исходными Gd⁺ T1-бляшками (отношение шансов 0,65; 95% CI, 0,40-1,06; p=0,0826) против 16% у пациентов, которым вводили окрелизумаб, без исходных Gd⁺ T1-бляшек (отношение шансов 0,84; 95% CI, 0,62-1,13; p=0,2441).

[0400] Риск CDP в течение 24 недель снижался на 33% у пациентов, которым вводили окрелизумаб, с исходными Gd⁺ T1-бляшками (отношение шансов 0,67; 95% CI, 0,40-1,14; p=0,1417) против 19% у пациентов, которым вводили окрелизумаб, без исходных Gd⁺ T1-бляшек (отношение шансов 0,81; 95% CI, 0,59-1,10; p=0,1783).

[0401] На фиг.29 представлен показатель снижения скорости ходьбы (т.е. снижения показателя прогрессирования времени ходьбы) при измерении с помощью испытания ходьбы на 25 футов на время у пациентов, которым вводили 600 мг окрелизумаба, по сравнению с пациентами, которым вводили плацебо, от исходного уровня до 120 недели. Окрелизумаб снижал показатель снижения скорости ходьбы на 29% против плацебо. Анализ бы основан на выборке ITT; значение p было основано на ранговом ANCOVA при посещении на 120 неделе с внесенной поправкой на исходный результат испытания ходьбы на 25 футов на время, географический регион и возраст, причем отсутствующие данные вводились посредством переноса данных последнего наблюдения (т.е. LOCF). Точечная оценка и 95% CI были основаны на логарифмически преобразованных данных. Анализ на фиг.19 основан на ITT (выборка всех пациентов с намерением лечиться); значение p было основано на ранговом ANCOVA при посещении на 120 неделе с внесенной поправкой на исходный результат испытания ходьбы на 25 футов на время, географический регион и возраст, причем отсутствующие данные вводились посредством LOCF (перенос данных последнего наблюдения). Точечная оценка и 95% CI (доверительный интервал) были основаны на анализе MMRM и логарифмически преобразованных данных, в которые была внесена поправка на исходный результат испытания ходьбы на 25 футов, географический регион и возраст. На фиг.30 представлен показатель снижения скорости ходьбы на 120 неделе относительно исходного уровня у пациентов, которым вводили 600 мг окрелизумаба, по сравнению с пациентами, которым вводили плацебо. Окрелизумаб снижал показатель снижения скорости ходьбы на 10% против плацебо (p=0,404).

Результаты, касающиеся MRI

[0402] На фиг.31 представлено процентное изменение объема всего головного мозга с 24 недели по 96 неделю у пациентов, которым вводили 600 мг окрелизумаба, по сравнению с пациентами, которым вводили плацебо. Окрелизумаб снижал скорость уменьшения всего объема головного мозга с 24 недели по 96 неделю на 17,5% по сравнению с плацебо (p=0,0206). Анализ был основан на выборке ITT с оценкой на 24 неделе и по меньшей мере одной оценкой после 24 недели; значение p было основано на MMRM при посещении на 120 неделе с внесенной поправкой на объем головного мозга на 24 неделе, географический регион и возраст.

[0403] Пациенты, которым вводили 600 мг окрелизумаба, продемонстрировали существенное снижение объема T2-бляшек от исходного уровня до 120 недели по сравнению с пациентами, которым вводили плацебо. Как показано на фиг.32, объем T2-бляшек возрастал на 7,4% у пациентов в группе плацебо, в то время как объем T2-бляшек у пациентов, которым вводили окрелизумаб, снижался на 3,4% (p<0,001). Анализ был основан на выборке ITT; значение p было основано на ранжированном ANCOVA при посещении на 120 неделе с внесенной поправкой на исходный объем T2-бляшек, географический регион и возраст, причем отсутствующие данные вводили посредством LOCF (перенос данных последнего наблюдения). Точечная оценка и 95% CI (доверительные интервалы) были основаны на анализе MMRM и на логарифмически преобразованных данных с внесенной поправкой на исходный объем T2-блялек, географический регион и возраст.

[0404] У пациентов, имеющих Gd⁺ T1-бляшки на исходном уровне, общий объем T2-бляшек снижался на 3,8% в группе пациентов, которых лечили окрелизумабом (95% CI, от -7,0 до -0,5). Напротив, общий объем T2-бляшки увеличивался на 12,0% у пациентов, которым вводили плацебо (95% CI, 7,2-17,1; p<0,001). У пациентов без Gd⁺ T1-бляшек на исходном уровне общий объем T2-бляшек снижался на 3,1% у пациентов, которым вводили окрелизумаб (95% CI, от -5,0 до -1,1). Напротив, общий объем T2-бляшек увеличивался на 6,1% у пациентов, которым вводили плацебо (95% CI, 3,3-9,0; p<0,001).

Эффективность

[0405] Результаты эффективности для этого испытания обобщенно представлены в таблице 13.

Таблица 13 Обобщение эффективности
Результат	Снижение риска	Значение p
Время до CDP в течение 12 недель	24%	0,321
Время до CDP в течение 24 недель	25%	0,0365
Изменение результатов испытания ходьбы на 25 футов на время (от исходного уровня до 120 недели)	29%	0,0404
Процентное изменение общего объема T2-бляшек при MRI (от исходного уровня до 120 недели)	плацебо: увеличение на 7,4%, окрелизумаб: снижение на 3,4%	<0,0001
Процентное изменение общего объема головного мозга при MRI (с 24 недели по 120 неделю)	17,5%	0,0206
Изменение SF-36 PCS (от исходного уровня до 120 недели)

Безопасность

Обусловленные инфузией реакции

[0406] В анализ безопасности было включено 725 пациентов (т.е. 239 в группе плацебо и 486 в группе окрелизумаба). На протяжении средней продолжительности лечения, составляющей приблизительно 3 года, доля пациентов по меньшей мере с одной обусловленной инфузией реакцией (IRR) составила 25,5% (n=61) для пациентов, которым вводили плацебо, и 39,9% (n=194) для пациентов, которых лечили окрелизумабом; большинство из них имело тяжесть от мягкой до умеренной (93,4% [n=57] и 96,9% [n=188], соответственно). Наиболее распространенные симптомы IRR включали нарушения кожи и подкожной ткани (45,9% [n=89] для пациентов, которых лечили окрелизумабом, и 13,1% [n=8] для пациентов, которым вводили плацебо). Отсутствовали угрожающие жизни или фатальные IRR. Встречаемость IRR у пациентов, которых лечили окрелизумабом, была наивысшей при первой инфузии (27,4%) и значительно снижалась при последующем дозировании (11,6% при первой инфузии дозы 2). В целом, IRR по большей части возникали в ходе инфузии у пациентов, которых лечили окрелизумабом (61,3% по сравнению с 37,7% у пациентов, которым вводили плацебо). Один пациент (0,2%) отказался от лечения окрелизумабом вследствие IRR при первой инфузии.

Неблагоприятные явления

[0407] Неблагоприятные явления, сообщенные для ≥10% пациентов в каждой группе лечения до последней клинической даты представлены в таблице 14A.

Таблица 14A.
n (%)	Плацебо (n=239)	Окрелизумаб 600 мг (n=486)
Все пациенты с ≥1 AE	215 (90,0)	462 (95,1)
Инфекции и инфестации*	162 (67,8)	339 (69,8)
Назофарингит	65 (27,2)	110 (22,6)
Инфекции мочевыводящих путей	54 (22,6)	96 (19,8)
Грипп	21 (8,8)	56 (11,5)
Инфекция верхних дыхательных путей	14 (5,9)	53 (10,9)
Бронхит	12 (5,0)	30 (6,2)
Гастроэнтерит	12 (5,0)	20 (4,1)
Повреждение, отравление и осложнения, вызванные процедурами	104 (43,5)	263 (54,1)
Нарушения скелетно-мышечных и соединительной тканей	98 (41,0)	181 (37,2)
Нарушения нервной системы	79 (33,1)	174 (35,8)
Общие нарушения и нарушения области введения	60 (25,1)	130 (26,7)
Желудочно-кишечные нарушения	60 (25,1)	126 (25,9)
Психиатрические расстройства	59 (24,7)	89 (18,3)
Нарушения кожи и подкожной ткани	44 (18,4)	99 (20,4)
Дыхательные, торакальные и медиастинальные нарушения	35 (14,6)	87(17,9)
Нарушения метаболизма и питания	28 (11,7)	56 (11,5)
Нарушения почек и мочевыводящих путей	30 (12,6)	51 (10,5)
Нарушения сосудов	26 (10,9)	54 (11,1)
Изучение	20 (8,4)	58 (11,9)
*Только для инфекций и инфестаций SOC: представлены события, сообщенные по меньшей мере для 5% пациентов в одной группе лечения.

[0408] Процент всех пациентов, перенесших более 1 тяжелого неблагоприятного явления, составил 22,2% в группе плацебо по сравнению с 20,4% в группе введения. См. таблицу 14B. В целом, количество тяжелых неблагоприятных явлений было низким, и они были сходными в обеих группах.

[0409] Наиболее распространенное неблагоприятное явление, ассоциированное с окрелизумабом, представляло собой обусловленные инфузией реакции (39,9% против 25,5% для плацебо). Один пациент (0,2%) отказался от лечения окрелизумабом вследствие IRR при первой инфузии. Как показано на фиг.33, тяжесть обусловленных инфузией реакций (IRR) снижалась при каждом последующем курсе и при каждой дозе в одном и том же курсе. Окрелизумаб имеет сходный с плацебо профиль безопасности.

Таблица 14B. Общие тяжелые неблагоприятные события
n (%)	Плацебо, n=239	Окрелизумаб, n=486
Все пациенты с ≥1 SAE	53 (22,2)	99 (20,4)
Инфекции и инфестации	14 (5,9)	30 (6,2)
Повреждение, отравление и осложнения, вызванные процедурами	11 (4,6)	19 (3,9)
Нарушения нервной системы	9 (3,8)	18 (3,7)
Новообразования: доброкачественные, злокачественные и неуточненные (включая кисты и полипы)	7 (2,9)	8 (1,6)
Желудочно-кишечные нарушения	3 (1,3)	10 (2,1)
Нарушения скелетно-мышечных и соединительной тканей	6 (2,5)	6 (1,2)
Нарушения скелетно-мышечных и соединительной тканей	3 (1,3)	6 (1,2)
Нарушения почек и мочевыводящих путей	3 (1,3)	5 (1,0)

[0410] Данные, полученные в этом испытании, демонстрируют, что B-клетки могут играть роль в патофизиологии PPMS. Окрелизумаб является первым исследуемым лекарственным средством, продемонстрировавшим стабильный статистически значимый клинический эффект при PPMS в крупном испытании фазы III по сравнению с плацебо. Окрелизумаб вызывал значительно снижал клиническое прогрессирование нетрудоспособности, сохраняющееся в течение 12 недель (первичный результат), снижал клиническое прогрессирование нетрудоспособности, сохраняющееся в течение 24 недель, изменял результат испытания ходьбы на 25 футов на время, изменял объем T2-бляшек и снижал уменьшение объема головного мозга. Пациенты, которым вводили окрелизумаб, стабильно удовлетворяли ключевым вторичным результатам. На протяжении средней продолжительности лечения, составившей приблизительно 3 года, окрелизумаб продемонстрировал благоприятный профиль безопасности. В целом, встречаемость неблагоприятных явлений, ассоциированных с окрелизумабом, была сходной с плацебо. Наиболее распространенные неблагоприятные явления представляли собой обусловленные инфузией реакции от мягких до умеренных. Встречаемость тяжелых неблагоприятных явлений, ассоциированных с окрелизумаболм, включая тяжелые инфекции, была сходной с плацебо.

[0411] Примеры, которые предназначены только для иллюстрации изобретения, и, таким образом, не должны быть истолкованы как ограничивающие изобретение каким-либо образом, также описывают и детализируют аспекты и варианты осуществления изобретения, рассмотренные выше. Указанные выше примеры и подробное описание представлены в качестве иллюстрации и не для ограничения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Hideki GARREN

Jean-Paul PFEFEN

Anne-Marie LI-KWAI-CHEUNG

Michele LIBONATI

<120> СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА

<130> 146392035240

<150> US 62/238,103

<151> 2015-10-06

<160> 27

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 1

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 2

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 3

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 4

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 4

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 5

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 6

Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 7

Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Thr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 10

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His

1 5 10

<210> 11

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 11

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 12

Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 13

<211> 213

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 14

<211> 452

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 15

<211> 452

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 16

<211> 213

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Phe Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 17

<211> 452

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Ala Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 18

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 9

<223> Xaa = Met или Leu

<400> 18

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Xaa His

1 5 10

<210> 19

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 4

<223> Xaa = Ser или Ala

<400> 19

Gln Gln Trp Xaa Phe Asn Pro Pro Thr

1 5

<210> 20

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 8

<223> Xaa = Asp или Ala

<400> 20

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Xaa Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 21

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 6

<223> Xaa = Asn, Ala, Tyr, Trp, или Asp

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 7

<223> Xaa = Ser или Arg

<400> 21

Val Val Tyr Tyr Ser Xaa Xaa Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 22

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 22

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Trp Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Trp Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 23

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 23

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr

35 40 45

Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ala Phe Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 24

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 24

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 25

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Tyr Arg Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Ala Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly

450

<210> 26

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly

450

<210> 27

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly

450

<---

1. Способ улучшения функциональной способности у пациента, имеющего рассеянный склероз, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где пациент имеет улучшение функциональной способности после введения и где улучшение функциональной способности сохраняется в течение по меньшей мере 12 недель; где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

2. Способ по п.1, где пациент после лечения имеет подтвержденное 12-недельное снижение нетрудоспособности.

3. Способ по п.1, где пациент после лечения имеет подтвержденное 24-недельное снижение нетрудоспособности.

4. Способ по п.1, где улучшение функциональной способности у пациента сохраняется в течение по меньшей мере 24 недель.

5. Способ по любому из пп.1-4, где улучшение функциональной способности измеряют с помощью испытания ходьбы на 25 футов на время (T-25FW) или показателя EDSS.

6. Способ снижения среднегодовой частоты рецидивов у пациента-человека, имеющего рассеянный склероз, по меньшей мере на 30%, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где введение приводит к снижению среднегодовой частоты рецидивов по меньшей мере на 30%, где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

7. Способ снижения риска подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности у пациента-человека, имеющего рассеянный склероз, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где риск подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 12 недель снижается: (i) по меньшей мере на 30% у пациента с рецидивирующей формой рассеянного склероза по сравнению с пациентом с рецидивирующей формой, которому проводят лечение интерфероном бета-1a, или (ii) по меньшей мере на 15% у пациента с первичным прогрессирующим рассеянным склерозом по сравнению с пациентом с первичным прогрессирующим рассеянным склерозом, которому не проводят лечение; и где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

8. Способ по п.7, где риск подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 24 недель снижается: (i) по меньшей мере на 30% у пациента с рецидивирующей формой рассеянного склероза по сравнению с пациентом с рецидивирующей формой рассеянного склероза, которому проводят лечение интерфероном бета-1a, или (ii) по меньшей мере на 15% у пациента с первичным прогрессирующим рассеянным склерозом по сравнению с пациентом с первичным прогрессирующим рассеянным склерозом, которому не проводят лечение.

9. Способ по любому из пп.7, 8, где пациент имеет окрашивающиеся гадолинием T1-бляшки на исходном уровне.

10. Способ по любому из пп.7, 8, где пациент не имеет окрашивающихся гадолинием T1-бляшек на исходном уровне.

11. Способ уменьшения объема T2-бляшек у пациента-человека, имеющего рассеянный склероз, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где объем T2-бляшек у пациента после введения уменьшается по меньшей мере на 1%, и где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

12. Способ по п.11, где пациент имеет окрашивающиеся гадолинием T1-бляшки на исходном уровне.

13. Способ по п.11, где пациент не имеет окрашивающихся гадолинием T1-бляшек на исходном уровне.

14. Способ снижения скорости потери объема головного мозга у пациента, имеющего рассеянный склероз, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где скорость потери объема головного мозга у пациента снижается по меньшей мере на 10%; и где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

15. Способ по п.14, где предупреждается дальнейшее снижение объема головного мозга у пациента, который имеет снижение объема головного мозга.

16. Способ снижения атрофии головного мозга у пациента-человека, имеющего рассеянный склероз, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где атрофия головного мозга снижается после введения по меньшей мере на 10%, где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

17. Способ по п.16, где предупреждается дальнейшая атрофия головного мозга у пациента, который имеет атрофию головного мозга.

18. Способ лечения пациента-человека с рассеянным склерозом, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где лечение приводит к отсутствию признаков активности заболевания (NEDA) в течение по меньшей мере 12 недель, где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

19. Способ по п.18, где лечение приводит к отсутствию признаков активности заболевания (NEDA) в течение по меньшей мере 24 недель.

20. Способ лечения пациента-человека с рассеянным склерозом, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где лечение приводит к достижению пациентом свободного от бляшек статуса после лечения в течение 96 недель, где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

21. Способ по п.20, где лечение приводит к достижению пациентом свободного от бляшек статуса после лечения в течение 48 недель.

22. Способ по п.20, где лечение приводит к достижению пациентом свободного от бляшек статуса после лечения в течение 24 недель.

23. Способ по любому из пп.20-22, где лечение приводит к тому, что пациент является свободным от окрашиваемых гадолинием бляшек.

24. Способ по любому из пп.20-22, где лечение приводит к тому, что пациент является свободным от T2-бляшек.

25. Способ лечения пациента-человека с рецидивирующей формой рассеянного склероза, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где лечение приводит к одному или нескольким из:

a) пациент является свободным от рецидивов через 96 недель;

b) пациент не имеет подтвержденных событий прогрессирования нетрудоспособности через 96 недель;

c) пациент не имеет усиливаемых гадолинием T1-бляшек через 96 недель;

d) пациент не имеет новых и/или увеличивающихся T2-бляшек через 96 недель;

где антитело против CD20 содержит: 1) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и 2) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

26. Способ лечения пациента-человека с высокоактивным рассеянным склерозом, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

27. Способ по п.26, где пациент с высокоактивным рассеянным склерозом является недостаточно отвечающим на другую терапию рассеянного склероза.

28. Способ по п.26, где пациента с высокоактивным рассеянным склерозом ранее не лечили другой терапией рассеянного склероза.

29. Способ по п.27, где другая терапия рассеянного склероза представляет собой интерферон или глатирамера ацетат.

30. Способ по любому из пп.26-29, где введение антитела против CD20 является эффективным для одного или нескольких из следующих: (1) снижение количества бляшек в головном мозге пациента; (2) снижение среднегодовой частоты рецидива; (3) снижение прогрессирования нетрудоспособности и (4) улучшение функциональной способности.

31. Способ по любому из пп.26-30, дополнительно включающий проведение сканирования MRI и определение того, имеет ли пациент высокоактивный рассеянный склероз, до введения антитела против CD20 пациенту.

32. Способ лечения пациента-человека с рассеянным склерозом ранней стадии, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

33. Способ по п.32, дополнительно включающий диагностику пациента, имеющего рассеянный склероз ранней стадии, до введения антитела против CD20 пациенту.

34. Способ лечения пациента-человека с рассеянным склерозом, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где лечение приводит к отсутствию признаков активности заболевания (NEDA) у пациента и где антитело против CD20 содержит: a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

35. Способ лечения пациента-человека с рецидивирующей формой рассеянного склероза, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где лечение приводит к одному или нескольким из:

a) по меньшей мере 30% снижение среднегодовой частоты рецидивов;

b) по меньшей мере 30% снижение риска подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 12 недель;

c) по меньшей мере 30% снижение риска подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 24 недель;

d) по меньшей мере 90% уменьшение количества гадолиний⁺ T1-бляшек;

e) по меньшей мере 90% снижение среднего количества гадолиний⁺ T1-бляшек на 24 неделе, 48 неделе и/или 96 неделе;

f) по меньшей мере 70% уменьшение количества новых и/или увеличивающихся гиперинтенсивных T2-бляшек;

g) по меньшей мере 40% уменьшение среднего количества новых и/или увеличивающихся T2-бляшек на 24 неделе, 48 неделе и/или 96 неделе;

h) по меньшей мере 10% снижение скорости уменьшения объема всего головного мозга;

i) по меньшей мере 10% снижение подтвержденной нетрудоспособности, сохраняющееся в течение по меньшей мере 12 недель;

j) по меньшей мере 50% уменьшение количества новых гипоинтенсивных T1-бляшек; и

k) по меньшей мере 55% улучшение NEDA (отсутствие признаков активности заболевания);

где снижение или улучшение в одном или более из a)-k) сравнивают с пациентом(ами) с рецидивирующей формой рассеянного склероза, которому проводят лечение интерфероном бета-1a, и где антитело против CD20 содержит: 1) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и 2) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

36. Способ лечения пациента-человека с рецидивирующей формой рассеянного склероза, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где лечение приводит по меньшей мере к 15% снижению атрофии головного мозга, где снижение сравнивают с пациентом(ами) с рецидивирующей формой рассеянного склероза, которому проводят лечение интерфероном бета-1a, и где антитело против CD20 содержит: 1) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и 2) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

37. Способ лечения пациента-человека с первично-прогрессирующим рассеянным склерозом, включающий введение пациенту эффективного количества антитела против CD20, где лечение приводит к одному или нескольким из:

a) по меньшей мере 15% снижения риска подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 12 недель по сравнению с пациентом(ами), которому не проводят лечение;

b) по меньшей мере 15% снижения риска подтвержденного прогрессирования нетрудоспособности в течение по меньшей мере 24 недель по сравнению с пациентом(ами), которому не проводят лечение;

c) по меньшей мере 15% снижения прогрессирования показателя времени хождения, измеряемого в испытании ходьбы на 25 футов на время, по сравнению с пациентом(ами), которому не проводят лечение;

d) по меньшей мере 10% снижения объема T2-бляшек по сравнению с пациентом(ами), которому не проводят лечение;

e) по меньшей мере 3% снижения объема T2-бляшеек от исходного уровня до 24 недели; и

f) по меньшей мере 12% снижения скорости уменьшения объема всего головного мозга;

где снижение в одном или более из a)-f) сравнивают с пациентом(ами) с рецидивирующей формой рассеянного склероза, которому не проводят лечение;

где антитело против CD20 содержит: 1) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и 2) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

38. Способ по любому из пп.1, 6, 7, 11, 14, 16, 18, 20, 25, 26, 32 и 34-37, где пациент сохраняет способность к индукции гуморального иммунного ответа на антиген в ходе лечения.

39. Способ по п.38, где антиген представляет собой антиген свинки, антиген краснухи, антиген ветрянки, антиген S. pneumonia, антиген столбнячного токсоида, пневмококковый антиген или антиген вируса гриппа.

40. Способ по любому из пп.1, 6, 7, 11, 14, 16, 18, 20, 25, 26, 32 и 34-37, где при первоначальном воздействии или последующих воздействиях вводят второе лекарственное средство, где антитело против CD20 представляет собой первое лекарственное средство.

41. Способ по любому из пп.1, 6, 11, 14, 16, 18, 20, 26, 32 и 34, где рассеянный склероз представляет собой рецидивирующую форму рассеянного склероза.

42. Способ по п.41, где рецидивирующая форма рассеянного склероза представляет собой рецидивирующе-ремиттирующий рассеянный склероз (RRMS).

43. Способ по п.42, где рецидивирующая форма рассеянного склероза представляет собой вторично-прогрессирующий рассеянный склероз с сопутствующими рецидивами (rSPMS).

44. Способ по любому из пп.1, 6, 11, 14, 16, 18, 20, 26, 32 и 34, где рассеянный склероз представляет собой прогрессирующий рассеянный склероз.

45. Способ по п.44, где рассеянный склероз представляет собой первично-прогрессирующий рассеянный склероз (PPMS).

46. Способ по любому из пп.1, 6, 7, 11, 14, 16, 18, 20, 25, 26, 32 и 34-37, где антитело против CD20 вводят пациенту для обеспечения первоначального воздействия антитела против CD20, за которыми следуют одно или несколько дополнительных воздействий антитела против CD20, где каждое воздействие представляет собой 600 мг антитела, и каждое воздействие осуществляют у пациента в качестве одной или двух доз антитела против CD20, и где интервал между воздействиями составляет 24 недели или 6 месяцев.

47. Способ по п.46, где первоначальное воздействие включает первую дозу и вторую дозу антитела против CD20, где каждая доза составляет 300 мг и первая доза и вторая доза разделены на 14 суток.

48. Способ по п.47, где дополнительные воздействия включают однократную дозу 600 мг.

49. Способ по п.48, где первоначальное воздействие и одно или несколько дополнительных воздействий включают первую дозу и вторую дозу антитела против CD20, где каждая доза составляет 300 мг и первая доза и вторая доза разделены на 14 суток.

50. Способ по любому из пп.1, 6, 7, 11, 14, 16, 18, 20, 25, 26, 32 и 34-37, где антитело против CD20 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

51. Способ по любому из пп.1, 6, 7, 11, 14, 16, 18, 20, 25, 26, 32 и 34-37, где антитело против CD20 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, или SEQ ID NO: 15, или SEQ ID NO: 26, или SEQ ID NO: 27, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.

52. Способ по любому из пп.1, 6, 7, 11, 14, 16, 18, 20, 25, 26, 32 и 34-37, где антитело против CD20 представляет собой окрелизумаб.

53. Способ по любому из пп.1, 6, 7, 11, 14, 16, 18, 20, 25, 26, 32 и 34-37, где антитело против CD20 представляет собой фармацевтически приемлемую композицию.

54. Способ по любому из пп.1, 6, 7, 11, 14, 16, 18, 20, 25, 26, 32 и 34-37, где антитело против CD20 вводят внутривенно.

55. Способ по п.54, где антитело против CD20 вводят внутривенно при каждом воздействии антитела.

56. Способ по любому из пп.1, 6, 7, 11, 14, 16, 18, 20, 25, 26, 32 и 34-37, где антитело вводят подкожно.

57. Способ по п.56, где антитело против CD20 вводят подкожно при каждом воздействии антитела.

58. Набор для лечения рассеянного склероза у пациента в соответствии со способом по любому из пп.1, 6, 7, 11, 14, 16, 18, 20, 25, 26, 32 и 34-37, содержащий: (a) контейнер, содержащий окрелизумаб; и (b) вкладыш в упаковку с инструкциями по лечению у пациента рассеянного склероза.