Антитело против il-4r и его применение
Владельцы патента RU 2758091:
БЕЙЦЗИН УИЗДОМАБ БАЙОТЕКНОЛОДЖИ КО., ЛТД (CN)
ДЖЕНРИКС (ШАНХАЙ) БАЙОФАРМАСЬЮТИКАЛ КО.ЛТД. (CN)
ЧУНЦИН ДЖЕНРИКС БАЙОФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД. (CN)
Группа изобретений относится к биотехнологии. Раскрыты антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающиеся с человеческим IL-4R, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения заболевания, опосредованного IL-4R, содержащая эффективное количество указанного антитела и фармацевтически приемлемый носитель, и способ предупреждения или лечения заболевания, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела. Изобретения позволяют получить новые антитела против человеческого IL-4R, используемые в лечении заболеваний, опосредованных IL-4R. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 11 ил., 12 табл., 4 пр.
ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
Настоящая заявка заявляет приоритет заявки на патент Китая №201810360234.5, поданной 20 апреля 2018 г. с названием изобретения «Антитело против IL-4R и его применение», все содержание которой включено сюда посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В целом, настоящая заявка относится к области генной инженерии и лекарственных средств на основе антител. В частности, настоящая заявка относится к антителам против человеческого рецептора интерлейкина-4 (IL-4R) и их применению. Согласно настоящей заявке разработаны новые антитела против человеческого IL-4R и предложено применение этих антител в лечении заболеваний, опосредованных IL-4R.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Интерлейкин-4 (IL-4) состоит из 153 аминокислот и имеет молекулярную массу приблизительно 17 кДа. Изначально IL-4 был обнаружен благодаря его способности стимулировать пролиферацию В-клеток и был назван фактором-1, стимулирующим В-клетки (BSF-1)[1]. IL-4, как и IL-13, принадлежит к семейству цитокинов 1 типа и имеет четвертичную структуру с гидрофобным кластерным ядром из 4 α-спиралей[2]. IL-4 секретируется Тп2-клетками, участвует в Тh2-опосредованных иммунных ответах и имеет широкий спектр биологической активности, включая стимуляцию пролиферации Т-клеток, тучных клеток, гранулоцитов, мегакариоцитов и эритроцитов[3]. Кроме того, IL-4 может стимулировать экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости II класса В-клетками. IL-13 имеет аминокислотную последовательность, приблизительно на 30% гомологичную IL-4, и многие его функции сходны с функциями IL-4. Как IL-4, так и IL-13 стимулируют пролиферацию В-клеток и, в сочетании с CD40/CD40L в качестве костимулирующих молекул, индуцируют превращение IgM-типов в IgE[5]. IL-4 стимулирует агрегацию тучных клеток, повышает экспрессию высокоаффинного рецептора IgE на тучных клетках и низкоаффинного рецептора IgE CD23 (FcεRII) на В-клетках, повышает экспрессию молекулы адгезии эндотелия сосудов (VCAM-1) и стимулирует миграцию эозинофилов, Т-лимфоцитов, моноцитов и базофилов. В отличие от IL-13, IL-4 может стимулировать дифференцировку Th2-клеток из наивных Т-клеток[6].
Для биологической функции IL-4 необходимо его связывание с мембранными рецепторами. Человеческий рецептор интерлейкина (IL-4R) представляет собой гетеродимер, образованный двумя полипептидными цепями, одна из которых, α-цепь, обладает высокой аффинностью в отношении IL-4. Поскольку α-цепь IL-4R играет ведущую роль в связывании IL-4 с комплексом IL-4R, во многих научных исследованиях и сообщениях обозначение IL-4Rα часто используют вместо IL-4R. IL-4R экспрессирован на множестве клеток, таких как человеческие В-клетки, тучные клетки, эозинофилы, базофилы, макрофаги/моноциты, дендритные клетки, фиброциты, эпителий дыхательных путей и гладкомышечные клетки. IL-4Rα может образовывать два типа рецепторных комплексов с другими субъединицами. Рецепторы 1 типа, состоящие из IL-4Rα и γс, экспрессированы главным образом на гемопоэтических стволовых клетках[3]. В негемопоэтических стволовых клетках IL-4 выполняет свои функции главным образом через рецепторы II типа, состоящие из IL-4Rα и IL-13Rα1[8,9]. Рецепторы II типа являются корецепторами IL-4 и IL-13. Для выполнения своих функций IL-13 связывается с IL-13Ral. Как рецепторы I типа, так и рецепторы II типа передают сигналы через путь Jak/STAT. IL-4Rα, γс и IL-13Rα1 связываются с Jak1, Jak3 и Tyk2, соответственно, активируя последующие пути. IL-4 и IL-13 могут также передавать сигналы через семейство субстратов инсулиновых рецепторов (IRS), в конечном счете активируя PI3-K и NF-κВ в ядре[10]. Блокада IL-4R может ингибировать биологические функции как IL-4, так и IL-13.
В нескольких исследованиях было показано, что IL-4 и IL-13 связаны с заболеваниями, включающими Th2-иммунный ответ. Атопический дерматит (АД), также известный как наследственный аллергический дерматит, представляет собой частое дерматологическое заболевание, распространенное у детей и подростков. АД часто сопровождается определенными наследственными аллергическими заболеваниями, такими как аллергический ринит и астма[11]. Было обнаружено, что у пациентов с АД повышены уровни Th2-факторов, например IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13[12], и уровень IgE[13]. Также было обнаружено, что Тп2-факторы ассоциированы с прогрессированием АД. Мыши со сверхэкспрессией Тп2-факторов, таких как IL-4 и IL-13, продемонстрировали недостаточность защитных свойств кожи и расстройства, подобные АД[14,15]. Повышенные уровни IL-4 и IL-13 у пациентов с АД препятствуют дифференцировке эпидермиса и выработке противомикробных пептидов. У мышей с дефицитом IL-4 аллергическое воспаление кожи развивается реже. Согласно этим исследованиям, блокада IL-4R может быть эффективна в лечении АД. Моноклональные антитела против IL-4R имеются в продаже за рубежом и продемонстрировали хороший терапевтический эффект при АД[11].
Кроме того, IL-13 и IL-4 играют важные роли при астме. Астма представляет собой распространенное воспалительное заболевание легких, характеризующееся гиперреактивностью дыхательных путей (ГРДП), гиперсекрецией слизи, фиброзом и повышением уровней IgE. Неспецифические стимулы, такие как холодный воздух, часто приводят к усилению гиперреактивности дыхательных путей. ГРДП и избыточная секреция слизи приводят к обструкции дыхательных путей, что является основной причиной летальных исходов при астме. Тп2-факторы играют важные роли в прогрессировании астмы[18]. В бронхах и жидкости альвеолярного лаважа пациентов с астмой наблюдается сверхэкспрессия IL-4 и IL-13[19]. Несмотря на некоторое функциональное сходство IL-13 и IL-4, некоторые исследования указывают на то, что IL-13 играет более важную роль в прогрессировании астмы, чем другие Тп2-цитокины[20]. IL-13 может стимулировать дифференцировку и фиброз бокаловидных клеток. Введение рекомбинантного IL-13 в дыхательные пути мышей без аллергенной стимуляции приводит к воспалению дыхательных путей, гиперсекреции слизи и гиперреактивности дыхательных путей[21,22]. Введение растворимого IL-13Rα2 может предотвращать возникновение ГРДП, гиперсекреции слизи и воспаления в легких у мышей. Введение антитела против IL-4Rα в модели астмы снижает ГРДП и уменьшает количество эозинофилов в жидкости альвеолярного лаважа. Исследования показали, что блокада IL-4Rα может быть эффективна в лечении астмы.
В данной области желательны разработка и применение новых антител против IL-4R.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В первом аспекте в настоящей заявке предложено антитело, связывающееся с человеческим IL-4R, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где:
HCDR1 имеет последовательность GFTFSSYAMS, HCDR2 имеет последовательность SITGGGGGIYYADSVKG, HCDR3 имеет последовательность DRISITIRPRYFGLDF, LCDR1 имеет последовательность RSSQSLLYSIGYNYLD, LCDR2 имеет последовательность LGSNRAS и LCDR3 имеет последовательность MQSFKAPYT; или
HCDR1 имеет последовательность GFTFSSYAMS, HCDR2 имеет последовательность SITGGGGGIYYADSVKG, HCDR3 имеет последовательность DRISITIRPRYFGLDF, LCDR1 имеет последовательность RSSRNVIYGNGYNYLD, LCDR2 имеет последовательность LGNNVAA и LCDR3 имеет последовательность MQSLQAPYT; или
HCDR1 имеет последовательность GFTFSSYAMS, HCDR2 имеет последовательность SITGGGGGIYYADSVKG, HCDR3 имеет последовательность DRISITIRPRYFGLDF, LCDR1 имеет последовательность RSSQNVYGNGYNYLD, LCDR2 имеет последовательность LGTNVAA и LCDR3 имеет последовательность MQSLQAPYT; или
HCDR1 имеет последовательность GFTFSSYAMS, HCDR2 имеет последовательность SITGGGGGIYYADSVKG, HCDR3 имеет последовательность DRISITIRPRYFGLDF, LCDR1 имеет последовательность RSSQNVYGNGYNYLD, LCDR2 имеет последовательность LGNNVAA и LCDR3 имеет последовательность MQSLKAPYT; или
HCDR1 имеет последовательность GFTFSSYAMS, HCDR2 имеет последовательность SITGGGGGIYYADSVKG, HCDR3 имеет последовательность DRISITIRPRYFGLDF, LCDR1 имеет последовательность RSSHNLLYSNGYNYLD, LCDR2 имеет последовательность LGSNRAY и LCDR3 имеет последовательность MQALQSPYT;
HCDR1 имеет последовательность GFTFSSYAMS, HCDR2 имеет последовательность SITGGGGGIYYADSVKG, HCDR3 имеет последовательность DRISITIRPRYFGLDF, LCDR1 имеет последовательность RSSQSLLYSNGYNYLD, LCDR2 имеет последовательность LGSNRAS и LCDR3 имеет последовательность MQALETPYA;
где HCDR и LCDR определены согласно Kabat.
В некоторых воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
В некоторых воплощениях вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30 или 31.
В некоторых воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
В некоторых воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
В некоторых воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
В некоторых воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29.
В некоторых воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.
В некоторых воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.
Во втором аспекте в настоящей заявке предложено антитело, связывающееся с человеческим IL-4R, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 18, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела по меньшей мере на 90% идентична любой из SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30 или 31.
В некоторых воплощениях первого аспекта и второго аспекта антитело направлено против IL-4Rα.
В некоторых воплощениях первого аспекта и второго аспекта антитело способно связываться с рекомбинантным человеческим IL-4R (SEQ ID NO: 1) и рекомбинантным IL-4R обезьяны (SEQ ID NO: 3) и имеет KD менее 1 нМ при связывании с рекомбинантным человеческим IL-4R.
В некоторых воплощениях первого аспекта и второго аспекта антитело способно ингибировать активацию клеток HEK-Blue IL-4/IL-13 рекомбинантным IL-4 (SEQ ID NO: 4) со значением IC50 ниже 100 пМ.
В некоторых воплощениях первого аспекта и второго аспекта антитело способно ингибировать активацию клеток HEK-Blue IL-4/IL-13 рекомбинантным IL-13 (SEQ ID NO: 32) со значением IC50 ниже 50 пМ.
В некоторых воплощениях первого аспекта и второго аспекта антитело способно ингибировать пролиферацию клеток TF-1, индуцированную рекомбинантным IL-4 (SEQ ID NO: 4), со значением IC50 ниже 200 пМ.
В некоторых воплощениях первого аспекта и второго аспекта антитело представляет собой интактное антитело, Fab-фрагмент, F(ab')2-фрагмент или одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv).
В некоторых воплощениях первого аспекта и второго аспекта антитело представляет собой полностью человеческое антитело.
В некоторых воплощениях первого аспекта и второго аспекта антитело дополнительно содержит константную область тяжелой цепи подтипа IgG1, подтипа IgG2 или подтипа IgG4 и/или константную область легкой цепи подтипа κ или подтипа λ.
В некоторых воплощениях первого аспекта и второго аспекта антитело представляет собой моноклональное антитело.
В некоторых воплощениях первого аспекта и второго аспекта антитело представляет собой нейтрализующее антитело.
В некоторых воплощениях первого и второго аспектов антитело способно связывать и нейтрализовать человеческий IL-4R, блокируя посредством этого сигнальные пути IL-4 - IL-4R и IL-13 - IL-4R.
В третьем аспекте в настоящей заявке предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по первому аспекту и второму аспекту или его антигенсвязывающий фрагмент.
В четвертом аспекте в настоящей заявке предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело по первому аспекту и второму аспекту и фармацевтически приемлемый эксципиент, разбавитель или носитель.
В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция предназначена для применения в лечении заболевания, опосредованного IL-4R.
В пятом аспекте в настоящей заявке предложено применение антитела по первому и второму аспектам в изготовлении лекарственного средства для предупреждения или лечения заболевания, опосредованного IL-4R.
В шестом аспекте в настоящей заявке предложен способ предупреждения или лечения заболевания, опосредованного IL-4R, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела по первому аспекту и второму аспекту или фармацевтической композиции по четвертому аспекту.
В некоторых воплощениях четвертого аспекта, пятого аспекта и шестого аспекта заболевание, опосредованное IL-4R, представляет собой аутоиммунное заболевание. В некоторых воплощениях аутоиммунное заболевание представляет собой астму или аллергический дерматит.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1 показан эпитопный анализ связывания IL-4R с типичными антителами против IL-4R, фаг-scFv, по настоящей заявке.
На Фиг. 2 показан график ингибирования экспрессии SEAP, индуцированной IL-4, в клетках HEK-Blue IL-4/IL-13 типичными моноклональными антителами против IL-4R по настоящей заявке.
На Фиг. 3 показан график ингибирования экспрессии SEAP, индуцированной IL-13, в клетках HEK-Blue IL-4/IL-13 типичными моноклональными антителами против IL-4R по настоящей заявке.
На Фиг. 4 показано, что типичный мутант легкой цепи S1E6 по настоящей заявке ингибирует связывание IL-4 с IL-4R.
На Фиг. 5 показано, что типичный мутант легкой цепи S1E6 по настоящей заявке ингибирует связывание IL-4 с IL-4R.
На Фиг. 6 показан график ингибирования экспрессии SEAP, индуцированной IL-4, в клетках HEK-Blue IL-4/IL-13 типичным мутантом легкой цепи S1E6 по настоящей заявке.
На Фиг. 7 показан график ингибирования экспрессии SEAP, индуцированной IL-13, в клетках HEK-Blue IL-4/IL-13 типичным мутантом легкой цепи S1E6 по настоящей заявке.
На Фиг. 8 показан график ингибирования экспрессии SEAP, индуцированной IL-4, в клетках HEK-Blue IL-4/IL-13 типичным мутантом легкой цепи S1E6 по настоящей заявке.
На Фиг. 9 показан график ингибирования экспрессии SEAP, индуцированной IL-13, в клетках HEK-Blue IL-4/IL-13 типичным мутантом легкой цепи S1E6 по настоящей заявке.
На Фиг. 10 показано, что типичный мутант легкой цепи S1E6 по настоящей заявке ингибирует пролиферацию клеток TF-1, индуцированную IL-4.
На Фиг. 11 показано, что типичный мутант легкой цепи S1E6 по настоящей заявке ингибирует экспрессию CD23 в человеческих МКПК, индуцированную IL-4.
ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
В SEQ ID NO: 1 показана аминокислотная последовательность внеклеточного домена человеческого (Homo sapiens) IL-4R (hIL-4R).
В SEQ ID NO: 2 показана аминокислотная последовательность внеклеточного домена мышиного (Mus musculus) IL-4R (mIL-4R).
В SEQ ID NO: 3 показана аминокислотная последовательность внеклеточного домена IL-4R Масаса mulatto (mmIL-4R).
В SEQ ID NO: 4 показана аминокислотная последовательность внеклеточного домена человеческого IL-4 (hIL-4).
В SEQ ID NO: 5 показана аминокислотная последовательность His-метки (His).
В SEQ ID NO: 6 показана аминокислотная последовательность Fc-области (Fc) человеческого антитела IgG1.
В SEQ ID NO: 7 показана аминокислотная последовательность Fc-области (mFc) мышиного антитела IgG2a.
В SEQ ID NO: 8 показана аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи человеческого подтипа IgG1.
В SEQ ID NO: 9 показана аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи человеческого подтипа IgG2.
В SEQ ID NO: 10 показана аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи человеческого подтипа IgG4.
В SEQ ID NO: 11 показана аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи мышиного подтипа IgG1.
В SEQ ID NO: 12 показана аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи мышиного подтипа IgG2a.
В SEQ ID NO: 13 показана аминокислотная последовательность константной области легкой цепи человеческого подтипа каппа (κ).
В SEQ ID NO: 14 показана аминокислотная последовательность константной области легкой цепи человеческого подтипа лямбда (λ).
В SEQ ID NO: 15 показана аминокислотная последовательность константной области легкой цепи мышиного подтипа каппа (κ).
В SEQ ID NO: 16 показана аминокислотная последовательность константной области легкой цепи мышиного подтипа лямбда (λ).
В SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19 показаны полноразмерная аминокислотная последовательность, аминокислотная последовательность VH и аминокислотная последовательность VL клона S1E6, соответственно.
В SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 показаны полноразмерная аминокислотная последовательность, аминокислотная последовательность VH и аминокислотная последовательность VL клона S1H9, соответственно.
В SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 показаны полноразмерная аминокислотная последовательность, аминокислотная последовательность VH и аминокислотная последовательность VL клона S2C2, соответственно.
В SEQ ID NO: 26 показана аминокислотная последовательность мутанта легкой цепи L18D7.
В SEQ ID NO: 27 показана аминокислотная последовательность мутанта легкой цепи L28G5.
В SEQ ID NO: 28 показана аминокислотная последовательность мутанта легкой цепи L28F8.
В SEQ ID NO: 29 показана аминокислотная последовательность мутанта легкой цепи L28C9.
В SEQ ID NO: 30 показана аминокислотная последовательность мутанта легкой цепи L10B2.
В SEQ ID NO: 31 показана аминокислотная последовательность мутанта легкой цепи L10C2.
В SEQ ID NO: 32 показана аминокислотная последовательность человеческого рекомбинантного IL-13.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящей заявки разработали новые антитела против человеческого IL-4R, применяя методики конструирования антител. В различных аспектах настоящей заявки предложены новые антитела против человеческого IL-4R или их антигенсвязывающие фрагменты, полинуклеотиды, кодирующие указанные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, векторы, содержащие указанные полинуклеотиды, клетки-хозяева, содержащие указанные полинуклеотиды или векторы, способы получения и очистки указанных антител и медицинское и биологическое применение указанных антител или их антигенсвязывающих фрагментов. На основе последовательностей вариабельных областей антител, предложенных здесь, можно конструировать молекулы полноразмерных антител и применять их в качестве лекарственных средств для лечения клинических заболеваний, опосредованных IL-4R.
Если не указано иное, изобретение можно применять на практике с использованием методик, традиционных для области молекулярной биологии, микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии.
Если не указано иное, термины, использованные в настоящей заявке, имеют значение, в котором их обычно понимают специалисты в данной области.
Определения
При использовании здесь, термин «антитело» относится к молекуле иммуноглобулина, способной специфично связываться с мишенью через по меньшей мере один сайт распознавания антигена, расположенный в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Мишени включают, без ограничения, углеводы, полинуклеотиды, липиды и полипептиды. При использовании здесь «антитело» включает не только интактное (то есть полноразмерное) антитело, но и его антигеневязывающий фрагмент (например Fab, Fab', F(ab')2, Fv), его вариант, слитый белок, содержащий фрагменты антитела, гуманизированное антитело, химерное антитело, диатело, линейное антитело, одноцепочечное антитело, мультиспецифичное антитело (например, биспецифичное антитело) и любые другие модифицированные форматы молекулы иммуноглобулина, содержащие желаемый сайт специфичного распознавания антигена, включая гликозилированный вариант антитела, вариант аминокислотной последовательности антитела и ковалентно модифицированное антитело.
Обычно интактное или полноразмерное антитело содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и первую, вторую и третью константные области (CH1, СН2 и СН3). Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (VL) и константную область (CL). Полноразмерное антитело может представлять собой антитело любого типа, такое как антитело IgD, IgE, IgG, IgA или IgM (или их подтипы), но не обязательно принадлежит к какому-либо определенному типу. Иммуноглобулины могут быть отнесены к различным типам в зависимости от аминокислотных последовательностей константных доменов их тяжелых цепей. Обычно выделяют пять основных типов иммуноглобулинов, то есть IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из этих типов могут быть разделены далее на подтипы (изотипы), такие как IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие отдельным типам иммуноглобулинов, называют α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные структуры различных типов иммуноглобулинов хорошо известны.
При использовании здесь термин «антигенсвязывающий фрагмент» относится к части или области интактной молекулы антитела, обеспечивающей связывание с антигеном. Антигенсвязывающий домен может содержать вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или вариабельную область легкой цепи (VL). Каждый VH и VL обычно содержит три гипервариабельных участка, то есть CDR1, CDR2 и CDR3.
Специалистам в данной области хорошо известно, что гипервариабельные участки (CDR, обычно включающие CDR1, CDR2 и CDR3) являются участками вариабельной области, оказывающими наибольшее влияние на аффинность и специфичность антитела. Есть два распространенных определения последовательностей CDR VH или VL, то есть определение Kabat и определение Chothia (см., например, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et at, J. Mol. Biol. 273: 927-948 (1997); и Martin et at, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9268-9272 (1989)). Для последовательностей вариабельных областей заданного антитела последовательности CDR-участков VH и VL могут быть определены согласно определению Kabat или согласно определению Chothia. В некоторых воплощениях настоящей заявки последовательности CDR определены согласно Kabat.
Для последовательностей вариабельных областей данного антитела последовательности CDR-участков в последовательностях вариабельных областей могут быть проанализированы множеством способов, например, с применением программного обеспечения Abysis, доступного в режиме онлайн (http://www.abysis.org/).
Примеры антигенсвязывающего фрагмента включают, без ограничения: (1) Fab-фрагмент, который может представлять собой моновалентный фрагмент, имеющий цепь VL-CL и цепь VH-CH1; (2) F(ab')2-фрагмент, который может представлять собой бивалентный фрагмент, имеющий два Fab'-фрагмента, связанные дисульфидной связью в шарнирной области (то есть димер Fab'); (3) Fv-фрагмент, имеющий домены VL и VH одной ветви антитела; (4) одноцепочечный Fv (scFv), который может представлять собой одну полипептидную цепь, состоящую из домена VH и домена VL, соединенных полипептидным линкером; и (5) (scFv)2, который может содержать два домена VH, соединенные пептидным линкером, и два домена VL, связанные с двумя доменами VH дисульфидной связью.
При использовании здесь термин «специфичное связывание» относится к неслучайному взаимодействию со связыванием двух молекул, например, к связыванию антитела с эпитопом антигена.
При использовании здесь термин «моноклональное антитело» относится к антителу из практически однородной популяции антител, то есть, антитела, составляющие популяцию, одинаковы, за исключением происходящих естественным образом мутаций, которые могут присутствовать у небольшого числа отдельных антител. В частности, моноклональные антитела, описанные здесь, включают «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующей последовательности антитела, имеющего происхождение от определенного вида или принадлежащего к определенному типу или подтипу антител, в то время как остальная часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующей последовательности антитела, имеющего происхождение от другого вида или принадлежащего к другому типу или подтипу антител, а также включают фрагменты таких антител при условии, что они демонстрируют желаемую биологическую активность (патент США №4,816,567; и Morrison et at, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)).
В последовательностях нуклеиновых кислот, описанных здесь, использованы вырожденные основания (помимо традиционных оснований А, Т, С и G), и они имеют то же значение, в котором их обычно понимают специалисты в данной области. Например, R обозначает А или G, Y обозначает С или Т, М обозначает А или С, К обозначает G или Т, S обозначает С или G, W обозначает А или Т, Н обозначает А, или С, или Т, В обозначает С, или G, или Т, V обозначает А, или С, или G, D обозначает А, или G, или Т, N обозначает А, или С, или G, или Т.
В первом аспекте в настоящей заявке предложено антитело, связывающееся с человеческим IL-4R, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где:
HCDR1 имеет последовательность GFTFSSYAMS, HCDR2 имеет последовательность SITGGGGGIYYADSVKG, HCDR3 имеет последовательность DRISITIRPRYFGLDF, LCDR1 имеет последовательность RSSQSLLYSIGYNYLD, LCDR2 имеет последовательность LGSNRAS, и LCDR3 имеет последовательность MQSFKAPYT; или
HCDR1 имеет последовательность GFTFSSYAMS, HCDR2 имеет последовательность SITGGGGGIYYADSVKG, HCDR3 имеет последовательность DRISITIRPRYFGLDF, LCDR1 имеет последовательность RSSRNVIYGNGYNYLD, LCDR2 имеет последовательность LGNNVAA, и LCDR3 имеет последовательность MQSLQAPYT; или
HCDR1 имеет последовательность GFTFSSYAMS, HCDR2 имеет последовательность SITGGGGGIYYADSVKG, HCDR3 имеет последовательность DRISITIRPRYFGLDF, LCDR1 имеет последовательность RSSQNVYGNGYNYLD, LCDR2 имеет последовательность LGTNVAA, и LCDR3 имеет последовательность MQSLQAPYT; или
HCDR1 имеет последовательность GFTFSSYAMS, HCDR2 имеет последовательность SITGGGGGIYYADSVKG, HCDR3 имеет последовательность DRISITIRPRYFGLDF, LCDR1 имеет последовательность RSSQNVYGNGYNYLD, LCDR2 имеет последовательность LGNNVAA и LCDR3 имеет последовательность MQSLKAPYT; или
HCDR1 имеет последовательность GFTFSSYAMS, HCDR2 имеет последовательность SITGGGGGIYYADSVKG, HCDR3 имеет последовательность DRISITIRPRYFGLDF, LCDR1 имеет последовательность RSSHNLLYSNGYNYLD, LCDR2 имеет последовательность LGSNRAY, и LCDR3 имеет последовательность MQALQSPYT;
HCDR1 имеет последовательность GFTFSSYAMS, HCDR2 имеет последовательность SITGGGGGIYYADSVKG, HCDR3 имеет последовательность DRISITIRPRYFGLDF, LCDR1 имеет последовательность RSSQSLLYSNGYNYLD, LCDR2 имеет последовательность LGSNRAS, и LCDR3 имеет последовательность MQALETPYA;
где HCDR и LCDR определены согласно Kabat.
В некоторых воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
В некоторых воплощениях вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30 или 31.
В некоторых воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
В некоторых воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
В некоторых воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
В некоторых воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29.
В некоторых воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.
В некоторых воплощениях вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.
Во втором аспекте в настоящей заявке предложено антитело, связывающееся с человеческим IL-4R, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 18, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела по меньшей мере на 90% идентична любой из SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30 или 31.
В некоторых воплощениях первого аспекта и второго аспекта антитело направлено против IL-4Rα.
В некоторых воплощениях первого аспекта и второго аспекта антитело способно связываться с рекомбинантным человеческим IL-4R (SEQ ID NO: 1) и рекомбинантным IL-4R обезьяны (SEQ ID NO: 3) и имеет KD менее 1 нМ при связывании с рекомбинантным человеческим IL-4R.
В некоторых воплощениях первого аспекта и второго аспекта антитело способно ингибировать активацию клеток HEK-Blue IL-4/IL-13 рекомбинантным IL-4 (SEQ ID NO: 4) со значением IC50 ниже 100 пМ.
В некоторых воплощениях первого аспекта и второго аспекта антитело способно ингибировать активацию клеток HEK-Blue IL-4/IL-13 рекомбинантным IL-13 (SEQ ID NO: 32) со значением IC50 ниже 50 пМ.
В некоторых воплощениях первого аспекта и второго аспекта антитело способно ингибировать пролиферацию клеток TF-1, индуцированную рекомбинантным IL-4 (SEQ ID NO: 4), со значением IC50 ниже 200 пМ.
В некоторых воплощениях первого аспекта и второго аспекта антитело представляет собой интактное антитело, Fab-фрагмент, F(ab')2-фрагмент или одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv).
В некоторых воплощениях первого аспекта и второго аспекта антитело представляет собой полностью человеческое антитело.
В некоторых воплощениях первого аспекта и второго аспекта антитело дополнительно содержит константную область тяжелой цепи подтипа IgG1, подтипа IgG2 или подтипа IgG4 и/или константную область легкой цепи подтипа к или подтипа X.
В некоторых воплощениях первого аспекта и второго аспекта антитело представляет собой моноклональное антитело.
В некоторых воплощениях первого аспекта и второго аспекта антитело представляет собой нейтрализующее антитело.
В некоторых воплощениях первого и второго аспектов антитело способно связывать и нейтрализовать человеческий IL-4R, блокируя посредством этого сигнальные пути IL-4 - IL-4RhIL-13 IL-4R.
В третьем аспекте в настоящей заявке предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по первому аспекту и второму аспекту или его антигенсвязывающий фрагмент.
В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с регуляторной последовательностью, которая может быть распознана клеткой-хозяином, трансформированной вектором.
В четвертом аспекте в настоящей заявке предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело по первому аспекту и второму аспекту и фармацевтически приемлемый эксципиент, разбавитель или носитель.
В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция может дополнительно содержать один или более чем один смазывающий агент, такой как тальк, стеарат магния и минеральное масло, смачивающий агент, эмульгатор, суспендирующий агент, консервант, такой как бензойная кислота, сорбиновая кислота и пропионат кальция, подсластитель и/или корригент.
В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция, предложенная здесь, может быть изготовлена в форме таблетки, пилюли, порошка, пастилки, эликсира, суспензии, эмульсии, раствора, сиропа, суппозитория или капсулы.
В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция по настоящей заявке может быть доставлена с применением любого физиологически приемлемого пути введения, включая, без ограничения, пероральное введение, парентеральное введение, интраназальное введение, ректальное введение, внутрибрюшинное введение, интраваскулярную инъекцию, подкожное введение, трансдермальное введение или ингаляционное введение.
В некоторых воплощениях, там, где это уместно, фармацевтическая композиция для терапевтического применения может быть изготовлена для хранения в лиофилизированной форме или в форме водного раствора смешиванием агента, имеющего желаемую степень чистоты, с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом.
В некоторых воплощениях фармацевтическую композицию применяют для лечения заболевания, опосредованного IL-4R.
В пятом аспекте в настоящей заявке предложено применение антитела по первому и второму аспектам в изготовлении лекарственного средства для предупреждения или лечения заболевания, опосредованного IL-4R.
В шестом аспекте в настоящей заявке предложен способ предупреждения или лечения заболевания, опосредованного IL-4R, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела по первому аспекту и второму аспекту или фармацевтической композиции по четвертому аспекту.
В некоторых воплощениях четвертого аспекта, пятого аспекта и шестого аспекта заболевание, опосредованное IL-4R, представляет собой аутоиммунное заболевание. В некоторых воплощениях аутоиммунное заболевание представляет собой астму или аллергический дерматит.
В других аспектах в настоящей заявке предложены вектор, содержащий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящей заявке, и клетка-хозяин, содержащая указанные молекулу нуклеиновой кислоты или вектор.
В других аспектах в настоящей заявке предложен способ получения антитела по настоящей заявке. В некоторых воплощениях способ получения антитела включает культивирование клетки-хозяина для обеспечения возможности экспрессии нуклеиновой кислоты. В некоторых воплощениях способ получения антитела дополнительно включает выделение антитела из культуральной среды клетки-хозяина.
Следует понимать, что предшествующее подробное описание предназначено только для обеспечения лучшего понимания настоящей заявки специалистами в данной области и никоим образом не ограничивает ее. Возможны различные модификации и изменения описанных воплощений специалистами в данной области.
Последующие Примеры приведены исключительно в целях наглядности и не ограничивают объем настоящей заявки.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Конструирование фаговой дисплейной библиотеки антител
Эти примеры проводили согласно заявкам на патенты Китая 201610609651.Х (название изобретения: «Антитело против человеческого PDL1 и его применение») и 201510097117.0 (название изобретения: «Моноклональное антитело против человеческого IL-17»), поданным авторами изобретения ранее. Содержание двух заявок на патенты, указанных выше, включено сюда посредством ссылки.
Пример 2: Получение рекомбинантных белков
При получении и изучении моноклональных антител против IL-4R были использованы несколько рекомбинантных белков, включая внеклеточный домен человеческого IL-4R (hIL-4R, SEQ ID NO: 1), внеклеточный домен мышиного IL-4R (mIL-4R, SEQ ID NO: 2), внеклеточный домен IL-4R Macaca mulatto (mmIL-4R, SEQ ID NO: 3), внеклеточный домен человеческого IL-4 (hIL-4, SEQ ID NO: 4) и человеческий рекомбинантный IL-13 (SEQ ID NO: 32). Все эти белки имеют посттрансляционные модификации (например, гликозилирование или дисульфидные связи), и поэтому, для сохранения структуры и функции рекомбинантных белков, предпочтительно использовать системы экспрессии на основе клеток млекопитающих. Кроме того, к С-концам этих рекомбинантных белков присоединяли His-метку (His, SEQ ID NO: 5), Fc-область человеческого антитела IgG1 (Fc, SEQ ID NO: 6) или Fc-область мышиного антитела IgG2a (mFc, SEQ ID NO: 7), что облегчало очистку рекомбинантных белков и функциональную идентификацию моноклональных антител. Константная область тяжелой цепи антитела может представлять собой константную область тяжелой цепи антитела человеческого подтипа IgG1 (SEQ ID NO: 8), человеческого подтипа IgG2 (SEQ ID NO: 9), человеческого подтипа IgG4 (SEQ ID NO: 10), мышиного подтипа IgG1 (SEQ ID NO: 11) или мышиного подтипа IgG2a (SEQ ID NO: 12), и константная область легкой цепи может представлять собой константную область легкой цепи человеческого подтипа к (SEQ ID NO: 13), человеческого подтипа λ (SEQ ID NO: 14), мышиного подтипа к (SEQ ID NO: 15) или мышиного подтипа λ (SEQ ID NO: 16).
В соответствии с аминокислотными последовательностями отдельных интересующих рекомбинантных белков в базе данных Uniprot разрабатывали и синтезировали гены этих рекомбинантных белков (включая гены, кодирующие His-метку, Fc или mFc). Синтезированные гены отдельных рекомбинантных белков клонировали в подходящие эукариотические векторы экспрессии (такие как pcDNA3.1, Invitrogen, Inc.) с применением обычных молекулярно-биологических методик. Затем полученными плазмидами экспрессии рекомбинантных белков трансфицировали клетки НЕК293 (такие как HEK293F, Invitrogen, Inc.) с использованием липосом (таких как 293 fectin, Invitrogen, Inc.) или других катионных трансфекционных реагентов (таких как PEI). Клетки культивировали в суспензии в бессывороточных средах на протяжении 3-4 суток. Затем проводили центрифугирование, получая культуральные супернатанты.
Экспрессированные рекомбинантные белки, слитые с His-метками, наносили на колонку для металлохелатной аффинной хроматографии (например, HisTrap FF, GE, Inc.) для одностадийной очистки рекомбинантных белков, присутствовавших в культуральном супернатанте. Одностадийную очистку экспрессированных рекомбинантных белков, слитых с Fc и mFc, проводили с использованием колонок для аффинной хроматографии с белком A/G (например, MabSelect SuRe, GE, Inc.). Затем консервационные буферы рекомбинантных белков заменяли на PBS (рН 7,0) или другие подходящие буферы с использованием обессоливающей колонки (такой как HiTrap Desaulting, GE, Inc.). По необходимости, образцы антител можно стерилизовать фильтрацией и затем хранить в аликвотах при -20°С.
Пример 3: Скрининг моноклональных антител против человеческого IL-4R с применением технологии фаговой дисплейной библиотеки антител
3.1 Скрининг моноклональных антител против человеческого IL-4R
В качестве антигена использовали рекомбинантный hIL-4R-His, полученный в Примере 2. С применением методики твердофазного скрининга (экспериментальный протокол, описанный в Phage Display: General Experimental Guidelines / (US) Clackson, Т., (US) Lowman, H. B. Editing; Ma Lan et al. Chemical Industry Press, 2005) для скрининга фаговой дисплейной библиотеки человеческих одноцепочечных антител, полученной в Примере 1, были получены три человеческих антитела, имеющие разные последовательности, но способные специфично связываться с человеческим IL-4R, включая клон S1E6 (аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 17, последовательность VH показана в SEQ ID NO: 18, и последовательность VL показана в SEQ ID NO: 19), S1H9 (аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 20, последовательность VH показана в SEQ ID NO: 21, последовательность VL показана в SEQ ID NO: 22), S2C2 (аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 23, последовательность VH показана в SEQ ID NO: 24, и последовательность VL показана в SEQ ID NO: 25).
3.2 Первичный функциональный анализ моноклональных антител против человеческого IL-4R (белковый уровень)
Три моноклональных антитела, S1E6, S1H9 и S2C2, получали в форме очищенных фагов (фаг-scFv) и приводили в контакт с сорбированным рекомбинантным антигеном IL-4R. Различные моноклональные антитела фаг-scFv в фиксированном титре подвергали воздействию рекомбинантного IL-4 при нескольких градиентах концентрации, соответственно. Для определения способности рекомбинантного IL-4 блокировать связывание трех моноклональных антител фаг-scFv с IL-4R использовали вторичное антитело против М13, конъюгированное с HRP. Полученные результаты (ФИГ. 1) показывают, что рекомбинантный IL-4 конкурирует с S1E6, фаг-scFv, за связывание с IL-4R, указывая на то, что одноцепочечное антитело S1E6 и IL-4 имеют сходные сайты связывания IL-4R.
3.3 Первичный функциональный анализ рекомбинантных моноклональных антител против человеческого IL-4R (клеточный уровень)
Клетки HEK-Blue™ IL-4/IL-13 (InvivoGen, hkb-il413) представляют собой репортерную клеточную линию, разработанную компанией InvivoGen на основе клеток НЕК293. Данная клеточная линия стабильно трансдуцирована человеческим геном STAT6 и репортером SEAP (основная фосфатаза). При стимуляции клеток интерлейкином-4 (IL-4) или интерлейкином-13 (IL-13) в клетках происходят активация сигнального пути STAT6, индукция экспрессии репортера SEAP и синтез и секреция SEAP в клеточный супернатант. Концентрацию SEAP можно проанализировать количественно с использованием устройства для прочтения микропланшетов при 630 нм.
В данном Примере была проведена оценка способности различных рекомбинантных моноклональных антител против IL-4R (константная область тяжелой цепи человеческого подтипа IgG4) ингибировать IL-4 и IL-13 с использованием клеток HEK-Blue™ IL-4/IL-13. В каждую лунку 96-луночного планшета высевали 5×104 клеток HEK-Blue™ IL-4/IL-13 и клетки стимулировали IL-4 (40 пМ) или IL-13 (80 пМ). Для блокировки IL-4 или IL-13 вносили моноклональные антитела против IL-4R при нескольких градиентах концентрации. Результаты, представленные на ФИГ. 2 и ФИГ. 3, показывают, что антитело S1E6 обладает наибольшей способностью к блокировке IL-4 и IL-13, S2C2 слабее, чем S1E6, a S1H9 неспособно блокировать стимуляцию клеток HEK-Blue™ IL-4/IL-13, обусловленную IL-4 и IL-13.
Пример 4: Созревание аффинности моноклональных антител против человеческого IL-4R
4.1 Созревание аффинности антитела S1E6 in vitro на основе методик мутации CDR легкой цепи и замены легкой цепи
Проводили созревание аффинности моноклонального антитела S1E6 in vitro с использованием двухвекторной системы фагового дисплея на основе методики мутации CDR легкой цепи (LCDR) (подробное описание приведено в Примере 5 заявки на патент Китая №201510097117.0, поданной заявителем ранее). Библиотеку мутантов S1E6VK-CDR123 объемом более 1,4×108 конструировали классической ПЦР с перекрывающимися праймерами. Праймеры для введения мутаций в три CDR легкой цепи S1E6 (S1E6VK) показаны в Таблице 5. Затем проводили три раунда скрининга библиотеки мутаций легкой цепи с использованием рекомбинантного hIL-4R-His в качестве антигена. В итоге, были идентифицированы четыре высокоаффинных мутанта легкой цепи L18D7 (аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 26), L28G5 (аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 27), L28F8 (аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 28) и L28C9 (аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 29).
В то же время, проводили исследования созревания аффинности тяжелой цепи антитела S1E6 in vitro с использованием двухвекторной системы фагового дисплея на основе методики замены легкой цепи (подробности приведены в Примере 4.3 заявки на патент Китая №201510097117.0, поданной заявителем ранее). Были получены два высокоаффинных мутанта легкой цепи L10B2 (аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 30) и L10C2 (аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 31).
4.2 Функциональный анализ рекомбинантных белков моноклональных антител против IL-4R
Рекомбинантные целые человеческие антитела в форме человеческих IgG4-каппа получали обычными молекулярно-биологическими методами из мутантов легкой цепи, связывавшихся с IL-4R с высокой аффинностью, полученных в 4.1.
На 96-луночные планшеты сорбировали антиген IL-4R-mFc (3 мкг/мл, 100 мкл на лунку) в течение ночи при 4°С. Проводили градиентное разведение каждого рекомбинантного антитела против IL-4R с IL-4-His в фиксированной концентрации, вносили его в 96-луночный планшет по 100 мкл на лунку и инкубировали при 37°С на протяжении 1 ч. Для выявления связывания IL-4-His с IL-4R-mFc использовали мышиный IgG против His-метки, конъюгированный с HRP (Kangweishiji, CW0285M). Результаты ELISA-анализа (ФИГ. 4 и ФИГ. 5) показывают, что шесть мутантов легкой цепи S1E6 были способны эффективно блокировать связывание IL-4R с IL-4 и превосходили S1E6. IC50 показана в Таблице 6 и Таблице 7.
Аффинность каждого химерного антитела IgG4 против IL-4R определяли с использованием Biacore Х100. Наборы для аминного сочетания, наборы для захвата человеческих антител, чипы СМ5, 10х HBS-EP (рН 7,4) и все реагенты, использованные в этом анализе, были приобретены у GE Healthcare. В соответствии с инструкциями к наборам, антитело против человеческой Fc-области сочетали с поверхностью чипа СМ5, примененяя метод аминного сочетания, и белки антител разводили до подходящих концентраций для захвата приблизительно 100 RU антител антителом против человеческой Fc. Получали серию градиентов концентрации IL-4R-His (100 нМ, 33,3 нМ, 11,1 нМ, 3,7 нМ, 1,23 нМ) и пропускали их над поверхностью стационарной фазы. Поверхность чипа восстанавливали с использованием 3 М MgCl2, и аффинность каждого моноклонального антитела измеряли при 25°С. Данные Biacore анализировали с использованием программного обеспечения Biacore X100 Evaluation Software (версия 2.0.1), и результаты анализа показаны в Таблице 8 и Таблице 9.
Сходным образом, проводили захват моноклональных антител против IL-4R и получали серию градиентов концентрации mmIL-4R-mFc (50 нм, 16,7 нм, 5,56 нм, 31,85 нм, 0,62 нм). Данные по аффинности связывания каждого моноклонального антитела против IL-4R с mmIL-4R показаны в Таблице 10.
4.4.1 Анализ биологической активности моноклональных антител против IL-4R на основе клеток HEK-Blue IL-4/IL-13 Экспериментальные протоколы подробно описаны в Примере 3.3. Полученные результаты (Фиг. 6 и Фиг. 7) показывают, что четыре мутанта легкой цепи S1E6 имеют существенно более высокую биологическую активность, чем S1E6, и что значения IC50 четырех мутантов легкой цепи S1E6 при ингибировании IL-4 или IL-13 являются сходными (Таблица 11 и Таблица 12). Результаты, представленные на Фиг. 8 и 9, показывают, что активность в отношении IL-4 и IL-13 усилена и у двух других мутантов легкой цепи SLE6, у L10B2 в большей степени, чем у L10C2; значения IC50, приведенные в Таблице 13, показывают, что L10C2 ингибирует IL-4 в концентрации, в 1,6 раза превосходящей соответствующую концентрацию L10B2, а значения IC50, приведенные в Таблице 14, показывают, что L10C2 ингибирует IL-13 в концентрации, в 2,4 раза превосходящей соответствующую концентрацию L10B2.
Клеточная линия эритролейкоза человека (TF-1) была разработана Kitamura и соавт. в 1989 г. Клетки TF-1, использованные в данном эксперименте, были взяты из банка клеток АТСС (CRL-2003). Рост клеток TF-1 полностью зависит от GM-CSF или IL-3. Эритропоэтин (ЕРО) также может поддерживать кратковременный рост клеток TF-1, но не индуцирует дифференцировку клеток TF-1. Кроме того, на клетки TF-1 влияют многие цитокины, и такие цитокины, как IL-4 и IL-13, могут стимулировать пролиферацию клеток TF-1. В каждую лунку 96-луночного планшета высевали 2×104 клеток. Клетки TF-1 стимулировали с использованием IL-4 (80 пМ) и добавляли серию градиентов моноклональных антител против IL-4R (диапазон концентраций от 65,536 нМ до 0,25 пМ, четырехкратное разведение). Число жизнеспособных клеток определяли с использованием набора для анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® (Promega, G7571). Результаты, представленные на Фиг. 10, показывают, что графики ингибирования пролиферации TF-1 четырьмя мутантами легкой цепи S1E6 почти идентичны без существенных различий по значениям IC50, как показано в Таблице 15.
CD23 (FcsRII) представляет собой клеточный поверхностный рецептор с низкой аффинностью в отношении IgE и экспрессируется на поверхности многих воспалительных клеток. Повышение экспрессии CD23 усиливает захват и представление антигенов в слизистой оболочке бронхов, приводя к аллергическим реакциям. IL-4 может стимулировать повышение экспрессии CD23 на поверхности моноцитов, макрофагов и В-лимфоцитов.
МКПК выделяли из образцов цельной крови здоровых людей центрифугированием в градиенте плотности фиколла. МКПК стимулировали с использованием IL-4 (100 пМ). Добавляли серию градиентов моноклональных антител против IL-4R (максимальная концентрация 16384 пМ с четырехкратным разведением до 0,25 пМ). Клетки инкубировали на протяжении 48 ч при 37°С в среде с 5% СО2, затем собирали и окрашивали антителом против CD23, конъюгированным с РЕ (BD Pharmingen, 555711). Экспрессию CD23 на МКПК определяли проточной цитометрией (BD Accuri™ С6). Результаты, представленные на ФИГ. 11, показывают, что L18D7 ингибирует экспрессию CD23 на МКПК сильнее, чем L28C9, который ингибирует IL-4 со значением IC50, превышающим IC50 L18D7 в 2,3 раза.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Howard, М., et al., Identification of а Т cell-derived b cell growth factor distinct from interleukin 2.J Exp Med, 1982. 155 (3): P. 914-23.
2. LaPorte, S.L., et al., Molecular and structural basis of cytokine receptor pleiotropy in the interleukin-4/13 system. Cell, 2008. 132 (2): P. 259-72.
3. Nelms, K., et al., The IL-4 receptor: Signaling mechanisms and biologic functions. Annu Rev Immunol, 1999. 17: P. 701-38.4. Wynn, T.A., IL-13 effector functions. Annu Rev Immunol, 2003. 21: P. 425-56.
5. Punnonen, J., et al., Interleukin 13 induces interleukin 4 - independent IgG4 and IgE synthesis and CD23 expression by human В cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90 (8): P. 3730-4.
6. Zurawski, G. and J.E. de Vries, Interleukin 13, an interleukin 4-like cytokine that acts on monocytes and В cells, but not on T cells. Immunol Today, 1994. 15 (1): P. 19-26.
7. Corren, J., Role of interleukin-13 in asthma. Curr Allergy Asthma Rep, 2013. 13 (5): P. 415-20.
8. Obiri, N.I., et al., Receptor for interleukin 13.Interaction with interleukin 4 by a mechanism that does not involve the common gamma chain shared by receptors for interleukins 2, 4, 7, 9, and 15. J Biol Chem, 1995. 270 (15): P. 8797-804.
9. Hilton, D.J., et al., Cloning and characterization of a binding subunit of the interleukin 13 receptor that is also a component of the interleukin 4 receptor. Proc Natl Acad Sci USA, 1996. 93 (1): P. 497-501.
10. Kraich, M., et al., A modular interface of IL-4 allows for scalable affinity without affecting specificity for the IL-4 receptor. BMC Biol, 2006. 4: P. 13.
11. Blakely, К., M. Gooderham, and K. Papp, Dupilumab, A Monoclonal Antibody for Atopic Dermatitis: A Review of Current Literature. Skin Therapy Lett, 2016. 21 (2): P. 1-5.
12. Esnault, S., et al., Differential spontaneous expression of mRNA for IL-4, IL-10, IL-13, IL-2 and interferon-gamma (IFN-gamma) in peripheral blood mononuclear cell (PBMC) from atopic patients. Clin Exp Immunol, 1996. 103 (1): P. 111-8.
13. Jujo, K., et al., Decreased interferon gamma and increased interleukin-4 production in atopic dermatitis promotes IgE synthesis. J Allergy Clin Immunol, 1992. 90 (3 Pt 1): P. 323-31.
14. Chan, L.S., N. Robinson, and L. Xu, Expression of interleukin-4 in the epidermis of transgenic mice results in a pruritic inflammatory skin disease: An experimental animal model to study atopic dermatitis. J Invest Dermatol, 2001. 117 (4): P. 977-83.
15. Zheng, Т., et al., Transgenic expression of interleukin-13 in the skin induces a pruritic dermatitis and skin remodeling.J Invest Dermatol, 2009. 129 (3): P. 742-51.
16. Howell, M. D., et al., Cytokine modulation of atopic dermatitis filaggrin skin expression.J Allergy Clin Immunol, 2007. 120 (1): P. 150-5.
17. Sehra, S., et al., IL-4 regulates skin homeostasis and the predisposition toward allergic skin inflammation. J Immunol, 2010. 184 (6): P. 3186-90.
18. Larche, M., D.S. Robinson, and A.B. Kay, The role of T lymphocytes in the pathogenesis of asthma. J Allergy Clin Immunol, 2003. 111 (3): P. 450-63; quiz 464.
19. Kotsimbos, T.C., P. Ernst, and Q.A. Hamid, Interleukin-13 and interleukin-4 are coexpressed in atopic asthma. Proc Assoc Am Physicians, 1996. 108 (5): P. 368-73.
20. Wills-Karp, M., Interleukin-13 in asthma pathogenesis. Curr Allergy Asthma Rep, 2004. 4(2): P. 123 -31.
21. Grunig, G., et al., Requirement for IL-13 independently of IL-4 in experimental asthma.Science, 1998. 282 (5397): P. 2261-3.
22. Wills-Karp, M., et al., Interleukin - 13: Central mediator of allergic asthma. Science, 1998. 282 (5397): P. 2258-61.
1. Антитело, специфично связывающееся с человеческим IL-4R, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где: указанный HCDR1 имеет последовательность GFTFSSYAMS (SEQ ID NO:33), указанный HCDR2 имеет последовательность SITGGGGGIYYADSVKG (SEQ ID NO:34), указанный HCDR3 имеет последовательность DRISITIRPRYFGLDF (SEQ ID NO:35), указанный LCDR1 имеет последовательность RSSQSLLYSIGYNYLD (SEQ ID NO:36), указанный LCDR2 имеет последовательность LGSNRAS (SEQ ID NO:37) и указанный LCDR3 имеет последовательность MQSFKAPYT (SEQ ID NO:38); или указанный HCDR1 имеет последовательность GFTFSSYAMS (SEQ ID NO:33), указанный HCDR2 имеет последовательность SITGGGGGIYYADSVKG (SEQ ID NO:34), указанный HCDR3 имеет последовательность DRISITIRPRYFGLDF (SEQ ID NO:35), указанный LCDR1 имеет последовательность RSSRNVIYGNGYNYLD (SEQ ID NO:39), указанный LCDR2 имеет последовательность LGNNVAA (SEQ ID NO:40) и указанный LCDR3 имеет последовательность MQSLQAPYT (SEQ ID NO:41); или указанный HCDR1 имеет последовательность GFTFSSYAMS (SEQ ID NO:33), указанный HCDR2 имеет последовательность SITGGGGGIYYADSVKG (SEQ ID NO:34), указанный HCDR3 имеет последовательность DRISITIRPRYFGLDF (SEQ ID NO:35), указанный LCDR1 имеет последовательность RSSQNVYGNGYNYLD (SEQ ID NO:42), указанный LCDR2 имеет последовательность LGTNVAA (SEQ ID NO:43) и указанный LCDR3 имеет последовательность MQSLQAPYT (SEQ ID NO:41); или указанный HCDR1 имеет последовательность GFTFSSYAMS (SEQ ID NO:33), указанный HCDR2 имеет последовательность SITGGGGGIYYADSVKG (SEQ ID NO:34), указанный HCDR3 имеет последовательность DRISITIRPRYFGLDF (SEQ ID NO:35), указанный LCDR1 имеет последовательность RSSQNVYGNGYNYLD (SEQ ID NO:42), указанный LCDR2 имеет последовательность LGNNVAA (SEQ ID NO:40) и указанный LCDR3 имеет последовательность MQSLKAPYT (SEQ ID NO:44); или указанный HCDR1 имеет последовательность GFTFSSYAMS (SEQ ID NO:33), указанный HCDR2 имеет последовательность SITGGGGGIYYADSVKG (SEQ ID NO:34), указанный HCDR3 имеет последовательность DRISITIRPRYFGLDF (SEQ ID NO:35), указанный LCDR1 имеет последовательность RSSHNLLYSNGYNYLD (SEQ ID NO:45), указанный LCDR2 имеет последовательность LGSNRAY (SEQ ID NO:46) и указанный LCDR3 имеет последовательность MQALQSPYT (SEQ ID NO:47); указанный HCDR1 имеет последовательность GFTFSSYAMS (SEQ ID NO:33), указанный HCDR2 имеет последовательность SITGGGGGIYYADSVKG (SEQ ID NO:34), указанный HCDR3 имеет последовательность DRISITIRPRYFGLDF (SEQ ID NO:35), указанный LCDR1 имеет последовательность RSSQSLLYSNGYNYLD (SEQ ID NO:48), указанный LCDR2 имеет последовательность LGSNRAS (SEQ ID NO:37) и указанный LCDR3 имеет последовательность MQALETPYA (SEQ ID NO:49); где HCDR и LCDR определены согласно Kabat.
2. Антитело по п. 1, где вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18.
3. Антитело по п. 1, где вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26, 27, 28, 29, 30 или 31.
4. Антитело по п. 1, где: вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18 и вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26; или вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18 и вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:27; или вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18 и вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28; или вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18 и вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29; или вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18 и вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:30; или вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:18 и вариабельная область легкой цепи антитела имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:31.
5. Антитело по п. 1, где: антитело способно связываться с рекомбинантным человеческим IL-4R (SEQ ID NO:1) и рекомбинантным IL-4R обезьяны (SEQ ID NO:3) и имеет KD менее 1 нМ при связывании с рекомбинантным человеческим IL-4R; и/или антитело способно ингибировать активацию клеток HEK-Blue IL-4/IL-13 рекомбинантным IL-4 (SEQ ID NO:4) со значением IC50 ниже 100 пМ; и/или антитело способно ингибировать активацию клеток HEK-Blue IL-4/IL-13 рекомбинантным IL-13 (SEQ ID NO:32) со значением IC50 ниже 50 пМ; и/или антитело способно ингибировать пролиферацию клеток TF-1, индуцированную рекомбинантным IL-4 (SEQ ID NO:4), со значением IC50 ниже 200 пМ; и/или антитело представляет собой интактное антитело, Fab-фрагмент, F(ab')2-фрагмент или одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv), предпочтительно полностью человеческое антитело; и/или антитело дополнительно содержит константную область тяжелой цепи подтипа IgG1, подтипа IgG2 или подтипа IgG4 и/или константную область легкой цепи подтипа κ или подтипа λ; и/или антитело представляет собой моноклональное антитело; и/или антитело связывает и нейтрализует человеческий IL-4R, тем самым блокируя сигнальные пути IL-4 – IL-4R и IL-13 – IL-4R.
6. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по п. 1 или его антигенсвязывающий фрагмент.
7. Фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения заболевания, опосредованного IL-4R, содержащая эффективное количество антитела по п. 1 и фармацевтически приемлемый эксципиент, разбавитель или носитель.
8. Способ предупреждения или лечения заболевания, опосредованного IL-4R, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела по п. 1.
9. Способ по п. 8, где заболевание, опосредованное IL-4R, представляет собой аутоиммунное заболевание.
10. Способ по п. 8, где заболевание, опосредованное IL-4R, представляет собой астму или аллергический дерматит.
