Способы очистки антител

Изобретение относится к способу очистки рекомбинантного полипептида от белков клетки-хозяина (HCP), способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель, (b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим по меньшей мере 75 мМ каприлата и больше чем 0,5 M аргинина; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя. Способ демонстрирует увеличение удаления HCP. 5 н. и 15 з.п. ф-лы, 13 ил., 9 табл., 8 пр.

 

Область изобретения, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области очистки белков с использованием суперантигена, такого как белок A, белок G или белок L, иммобилизованного на твердом носителе. В частности, изобретение относится к компонентам буфера для промывки и способам использования буферов для промывки для удаления примеси клетками-хозяевами в ходе стадий промывки, минимизируя потерю желаемого белкового продукта.

Предпосылки изобретения

Примеси белков клеток-хозяев (HCP), по классификации FDA относимые к примесям, «связанным с процессом», необходимо удалять до достаточно низких уровней в процессе выделения и очистки биофармацевтического продукта. Достаточная очистка от HCP, в частности, может быть затруднительной для некоторых продуктов на основе моноклональных антител (mAb) в ходе типичного процесса выделения и очистки. В большинстве случаев, при выделении и очистке mAb используют «платформенный» подход; типичная платформа для выделения и очистки mAb состоит из захвата при аффинной хроматографии на основе белка A, после чего следует от одной до трех неаффинных стадий дополнительной очистки. Стадия аффинного захвата на белке A представляет собой основной компонент платформы и обеспечивает основную очистку от HCP. Последующие стадии очистки, как правило, представляют собой ионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия или многомодальную хроматографию.

Для многих продуктов mAb концентрация HCP в достаточной степени снижена после первой хроматографической стадии дополнительной очистки. Однако существует много mAb, для которых проводят вторую хроматографическую стадию дополнительной очистки, в частности, для удаления дополнительных HCP; для этого могут потребоваться значительные усилия в хоте процесса и это приведет к повышению сложности процесса. В предыдущих исследованиях идентифицирована субпопуляция примесей HCP, которые осуществляют взаимного притяжение с молекулой продукта mAb (Levy et al., (2014) Biotechnol. Bioeng. 111(5):904-912; Aboulaich et al., (2014) Biotechnol. Prog. 30(5):1114-1124). Большинство HCP, которые не поддаются очистки на стадии с белком A, обусловлено связью с продуктом, а не элюированием или адсорбцией на лиганде белка A или основной матрице. Популяция трудно удаляемых HCP относительно мала по сравнению с разнообразной популяцией HCP, присутствующих в клеточной культуре, и сходна для различных продуктов mAb.

Несмотря на то, что популяция трудноудаляемых примесей HCP главным образом идентична для всех продуктов на основе mAb, изменение степени взаимодействий HCP-mAb может значительно влиять на общую очистку от HCP на стадии с белком A; совсем небольшие изменения в аминокислотной последовательности продуктов на основе mAb могут влиять на взаимодействия HCP-mAb на стадиях с белком A и на стадии дополнительной очистки. На популяцию HCP, загружаемых на колонку с белком A, которая оказывает очевидное влияние на возможность ассоциации HCP-mAb, может влиять возраст клетки, способ и условия сбора, и небольшие различия наблюдали у различных линий клеток-хозяев. Кроме ассоциации с продуктом, для большинства полимерных смол с белком A имеет место низкий уровень примесей HCP, которые связываются с основной матрицей и элюируют совместно с продуктом. Полимеры со пористым стеклом c контролируемым размером пор имеют значительно более высокие уровни HCP, связанных с основной матрицей.

Одну конкретную добавку для промывки, каприлат натрия, ранее идентифицировали в качестве одной из наиболее эффективных для нарушения ассоциации HCP-mAb и дающей низкую концентрацию HCP в элюате белка A. Каприлат натрия (также известный как октаноат натрия) представляет собой насыщенную жирную кислоту из 8 атомов углерода, которая оказалась нетоксичной у мышей при критической мицеллярной концентрации приблизительно 360 мМ. В предыдущих исследованиях использовали 50 мМ каприлата натрия (Aboulaich et al., (2014) Biotechnol. Prog. 30(5):1114-1124), 40 мМ каприлата натрия при различных NaCl и pH (Chollangi et al., (2015) Biotechnol. Bioeng. 112(11):2292-2304) и вплоть до 80 мМ каприлата натрия (Herzer et al., (2015) Biotechnol. Bioeng. 112(7):1417-1428), для усовершенствования очистки от HCP, и 50 мМ каприлата натрия при высоком pH с NaCl как для общей очистки от HCP, так и для удаления протеолитических примесей HCP (Bee et al., (2015) Biotechnol. Prog. 31(5):1360-1369). Ранее поданы предварительные патентные заявки на промывку с помощью белка A, содержащие вплоть до 100 мМ каприлата натрия (WO2014/141150; WO2014/186350). Дополнительно каприловую кислоту использовали для осаждения белковых примесей клетки-хозяина в нехроматографических процессах до и после стадии захвата на белке A (Brodsky et al., (2012) Biotechnol. Bioeng. 109(10): 2589-2598; Zheng et al., (2015) Biotechnol. Prog. 31(6):1515-1525; Herzer et al., (2015) Biotechnol. Bioeng. 112(7):1417-1428).

В настоящей области существует необходимость получения усовершенствованных способов очистки белков, в частности, антител, от белков клетки-хозяина.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу очистки рекомбинантного полипептида от белков клетки-хозяина (HCP), включающему: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель, (b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим больше чем приблизительно 50 мМ каприлата и больше чем приблизительно 0,5 M аргинина; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя.

В другом варианте осуществления каприлат представляет собой каприлат натрия. В еще одном другом варианте осуществления буфер для промывки содержит от приблизительно 75 мМ до приблизительно 300 мМ каприлата.

В другом аспекте изобретения, буфер для промывки содержит от приблизительно 0,75 M до приблизительно 1,5 M аргинина.

В другом аспекте изобретения, буфер для промывки дополнительно содержит от приблизительно 0,5 M до приблизительно 1 M лизина.

В одном из вариантов осуществления изобретения элюируемый рекомбинантный полипептид содержит меньше чем приблизительно 2% фрагментированного рекомбинантного полипептида.

В одном из аспектов изобретения, HCP происходит из клетки млекопитающего, например, HCP представляет собой фосфолипаза-B-подобный 2 белок и/или катепсин L. В еще одном аспекте изобретения, очистку рекомбинантного полипептида от катепсина L измеряют по сниженной активности катепсина L в элюате со стадии (c).

В одном из вариантов осуществления pH буфера для промывки находится между pH 7 и pH 9; или pH 7,5 и pH 8,5.

В другом варианте осуществления изобретения, рекомбинантный полипептид представляет собой моноклональное антитело (mAb), например, такое как IgG1 или IgG4.

В еще одном другом варианте осуществления, буфер для промывки не содержит хлорид натрия.

В одном из аспектов изобретения, суперантиген выбран из группы, состоящей из белка A, белка G и белка L.

В другом аспекте изобретения, после стадии (c) количество HCP составляет меньше чем приблизительно 200 нг HCP/мг продукта.

Настоящее изобретение относится к способe очистки рекомбинантного полипептида от белков клетки-хозяина (HCP), способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель; (b1) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим больше чем приблизительно 50 мМ каприлата; (b2) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим больше чем приблизительно 0,5 M аргинина; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя.

Настоящее изобретение также относится к способу очистки рекомбинантного полипептида от белков клетки-хозяина (HCP), способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель; (b1) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим больше чем приблизительно 0,5 M аргинина; (b2) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим больше чем приблизительно 50 мМ каприлата; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу очистки рекомбинантного полипептида от фосфолипаза-B-подобного 2 белка, способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель, (b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим приблизительно 100 мМ каприлата и приблизительно 1,1 M аргинина; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя.

В еще одном другом варианте осуществления, изобретение относится к способу очистки рекомбинантного полипептида от катепсина L, способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель, (b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим приблизительно 150 мМ каприлата и приблизительно 1,1 M аргинина; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя.

В одном из аспектов, изобретение относится к способу очистки рекомбинантного полипептида от белков клетки-хозяина (HCP), способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель; (b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим каприлат в концентрации больше чем приблизительно 250 мМ; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя.

В другом аспекте изобретение относится к способу очистки рекомбинантного полипептида от белков клетки-хозяина (HCP), способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель, (b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим от приблизительно 150 мМ до приблизительно 850 мМ каприлата; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу очистки рекомбинантного полипептида от белков клетки-хозяина (HCP), способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель, (b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим от приблизительно 100 мМ до приблизительно 850 мМ каприлата и от приблизительно 0,25 M до приблизительно 1,5 M аргинина; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя.

Краткое описание фигур

Фиг. 1: процент выхода (треугольники, ▲) и концентрация HCP (квадраты, ■) в элюате белка A с использованием mAb1 в качестве модели при различных концентрациях каприлата натрия при промывании.

Фиг. 2: процент загруженного mAb1 в элюированной, десорбированной и промытой фракциях для 5 концентраций каприлата натрия в буфере для промывки.

Фиг. 3: изотерма Ленгмюра подходит для адсорбции mAb1 на смоле MabSelect SuRe в растворах с различными концентрациями каприлата натрия.

Фиг. 4: концентрация HCP в элюате белка A для 5 mAb с использованием буферов для промывки с 100 мМ и 250 мМ каприлата натрия.

Фиг. 5: концентрация HCP в элюате белка A для mAb2 с использованием буферов для промывки, содержащих различные концентрации каприлата натрия и аргинина при различных pH. Примечание: все буферы для промывки содержат 300 мМ ацетата натрия.

Фиг. 6: концентрация HCP в элюате белка A для двух различных подаваемых потоков mAb1 с использованием буферов для промывки, содержащих различные концентрации каприлата натрия и аргинина при различных pH. Примечание: все буферы для промывки содержат 300 мМ ацетата натрия.

Фиг. 7: концентрация PLBL2 в элюате белка A для подаваемых потоков mAb5 с использованием буферов для промывки, содержащих различные концентрации каприлата натрия и аргинина при различных pH.

Фиг. 8: концентрация HCP в элюате белка A для подаваемых потоков mAb5 с использованием буферов для промывки, содержащих различные концентрации каприлата натрия и аргинина при различных pH.

Фиг. 9: выход стадии с белком A для подаваемых потоков mAb5 с использованием буферов для промывки, содержащих различные концентрации каприлата натрия и аргинина при различных pH.

Фиг. 10: активности катепсина L в элюатах mAb3 с белка A для промывки, содержащего каприлат натрия и аргинин или лизин.

Фиг. 11: процент фрагментации антитела для промежуточных продуктов процесса с моноклональным антителом.

Фиг. 12: концентрация HCP с использованием буферов для промывки только с каприлатом в сравнении с каприлатом+аргинин.

Фиг. 13: процент фрагментации антитела для нефасованного лекарственного вещества моноклонального антитела, хранимого при 25°C в течение вплоть до 10 суток.

Подробное описание

Следует понимать, что изобретение не ограничено конкретными способами, реактивами, соединениями, композициями или биологическими системами, которые конечно могут изменяться. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем описании, служит лишь цели описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена в качестве ограничения. Как используют в этом описании и приложенной формуле изобретения, формы единственного числа включают формы множественного числа, пока контекст явно не диктует иное. Таким образом, например, упоминание о «полипептиде» включает комбинацию двух или больше полипептидов и тому подобное.

Термин «содержит» охватывает «включает» или «состоит», например, композиция, «содержащая» X, может состоять исключительно из X или может содержать что-то дополнительное, например X+Y. Термин «состоит по существу из» ограничивает объем признака конкретно указанными материалами или стадиями и тем, что не влияет существенно на основную характеристику(и) заявленного признака. Термин «состоит из» исключает присутствие любого дополнительного компонента(ов).

«Приблизительно», как используют в настоящем описании, когда относится к поддающемуся измерению значению, такому как количество, длительность времени и тому подобное, обозначает, что охвачены варианты±20% или±10%, в том числе±5%,±1% и±0,1% от точно определенного значения, поскольку такие варианты подходят для того, чтобы осуществлять описанные способы.

Если не определено иного, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, в каком их обычно понимает специалист в области, к которой относится изобретение. Несмотря на то, что любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем описании, можно использовать при практической реализации для тестирования настоящего изобретения, предпочтительные материалы и способы описаны в настоящем описании. В описании и формуле изобретения используют следующую терминологию.

«Полипептид,» «пептид» и «белок» используют взаимозаменяемо в настоящем описании чтобы отослать к полимеру аминокислотных остатков. Полипептид может быть природного происхождения (из ткани), рекомбинантной или естественной экспрессии из препаратов прокариотических или эукариотических клеток или получен химически через способы синтеза. Термины применимы к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой искусственный химический миметик соответствующей встречаемой в природе аминокислоты, а также ко встречаемым в природе аминокислотным полимерам и не встречаемым в природе аминокислотным полимерам. Аминокислотные миметики относится к химическим соединениям, которые имеют структуру, которая отличается от общей химической структуры аминокислоты, но которые функционируют сходно со встречаемой в природе аминокислотой. Не природные остатки хорошо описаны в научной и патентной литературе; некоторые образцовые не природные композиции, которые можно использовать в качестве миметиков природных аминокислотных остатков, и руководства изложены далее. Миметики ароматических аминокислот можно создавать посредством замены с помощью, например, D- или L-нафилаланина; D- или L-фенилглицина; D- или L-2 тиенеилаланина; D- или L-1, -2,3- или 4-пиренилаланина; D- или L-3 тиенеилаланина; D- или L-(2-пиридинил)-аланина; D- или L-(3-пиридинил)-аланина; D- или L-(2-пиразинил)-аланина; D- или L-(4-изопропил)-фенилглицина: D-(трифторметил)-фенилглицина; D-(трифторметил)-фенилаланина: D-п-фтор-фенилаланина; D- или L-п-бифенилфенилаланина; K- или L-п-метокси-бифенилфенилаланина: D- или L-2-индол(алкил)аланины; и D- или L-алкилаланины, где алкил может представлять собой замещенный или незамещенный метил, этил, пропил, гексил, бутил, пентил, изопропил, изобутил, втор-изотил, изопентил или не кислые аминокислоты. Ароматические кольца не природной аминокислоты включают, например, ароматические кольца тиазолила, тиофенила, пиразолила, бензимидазолила, нафтила, фуранила, пирролила и пиридила.

«Пептид», как используют в настоящем описании, включает пептиды, которые представляют собой консервативные варианты тех пептидов, которые конкретно проиллюстрированы в настоящем описании. «Консервативный вариант», как используют в настоящем описании, обозначает замену аминокислотного остатка на другой, биологически схожий остаток. Примеры консервативных вариантов включают, но не ограничиваясь этим, замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин, аланин, цистеин, глицин, фенилаланин, пролин, триптофан, тирозин, норлейцин или метионин, на другой или замену одного полярного остатка на другой, такую как замена аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту или глутамина на аспарагин и тому подобное. Нейтральные гидрофильные аминокислоты, которые можно заменят друг на другу, включают аспарагин, глутамин, серин и треонин.

«Консервативный вариант» также включает использование замещенной аминокислоты вместо незамещенной исходной аминокислоты при условии, что антитела, индуцированные замещенным полипептидом, также обладают иммунологической реактивностью с незамещенным полипептидом. Такие консервативные замены входят в определение классов белков, описанных в настоящем описании.

«Катионный», как используют в настоящем описании, относится к любому пептиду, который обладает суммарным положительным зарядом при pH 7,4. Биологическую активность пептидов можно определять стандартными способами, известными специалистам в данной области и описанными в настоящем описании.

«Рекомбинантный», когда используют в отношении белка, указывает на то, что белок модифицирован посредством введения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или изменения нативной нуклеиновой кислоты или белка.

Как используют в настоящем описании, «терапевтический белок» относится к любому белку и/или полипептиду, который можно вводить млекопитающему для того, чтобы вызывать биологический или медицинский ответ в ткани, системе, у животного или человека, к которому стремится, например, исследователь или клиницист. Терапевтический белок может вызывать больше чем один биологический или медицинский ответ. Кроме того, термин «терапевтически эффективное количество» обозначает любое количество, которое, по сравнению с соответствующим субъектом, который не получал такое количество, ведет к, но не ограничиваясь этим, излечению, предотвращению или улучшению заболевания, нарушения или побочного эффекта или снижению скорости развития заболевания или нарушения. Объем термина также включает количества, эффективные для усиления нормальной физиологической функции, а также количества, эффективные для того, чтобы вызывать у пациента физиологическую функцию, которая усиливает терапевтический эффект второго фармацевтического средства или способствует ему.

Все «аминокислотные» остатки, идентифицированные в настоящем описании, имеют природную L-конфигурацию. Согласно стандартной полипептидной номенклатуре, сокращения для аминокислотных остатков приведены в следующей таблице.

Таблица 1: аминокислотные сокращения.

1 буква	3 буквы	Аминокислота
Y	Tyr	L-тирозин
G	Gly	L-глицин
F	Phe	L-фенилаланин
M	Met	L-метионин
A	Ala	L-аланин
S	Ser	L-серин
I	Ile	L-изолейцин
L	Leu	лейцин
T	Thr	L-треонин
V	Val	L-валин
P	Pro	L-пролин
K	Lys	L-лизин
H	His	L-гистидин
Q	Gln	L-глутамин
E	Glu	L-глутаминовая кислота
W	Trp	L-триптофан
R	Arg	L-аргинин
D	Asp	L-аспарагиновая кислота
N	Asn	L-аспарагин
C	Cys	L-цистеин

Следует отметить, что все последовательности аминокислотных остатков представлены в настоящем описании с помощью формул, в которых ориентация слева направо соответствует стандартному направлению от аминоконца к карбоксиконцу.

Способы очистки

В одном из аспектов настоящее изобретение направлено на способ очистки рекомбинантного полипептида от белков клетки-хозяина (HCP), способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель; (b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим каприлат и аргинин; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя.

В одном из аспектов настоящее изобретение направлено на способ очистки рекомбинантного полипептида от белков клетки-хозяина (HCP), способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель; (b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим больше чем приблизительно 50 мМ каприлата и больше чем приблизительно 0,5 M аргинина; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя.

В одном из аспектов настоящее изобретение направлено на способ очистки рекомбинантного полипептида от белков клетки-хозяина (HCP), способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель; (b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим каприлат в концентрации больше чем 250 мМ; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя.

В одном из аспектов настоящее изобретение направлено на способ очистки рекомбинантного полипептида от белков клетки-хозяина (HCP), способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель, (b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим от приблизительно 150 мМ до приблизительно 850 мМ каприлата; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя.

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на способ очистки рекомбинантного полипептида от белков клетки-хозяина (HCP), способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель; (b1) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя первым буфером для промывки, содержащим каприлат; (b2) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя вторым буфером для промывки, содержащим аргинин; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя.

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на способ очистки рекомбинантного полипептида от белков клетки-хозяина (HCP), способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель; (b1) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя первым буфером для промывки, содержащим аргинин; (b2) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя вторым буфером для промывки, содержащим каприлат; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя.

После нанесения (или загрузки) раствора на суперантигенный хроматографический твердый носитель на стадии (a), рекомбинантный полипептид будет адсорбирован на суперантигене, иммобилизованном на твердом носителе. Затем примеси HCP можно удалять за счет приведения иммобилизованного суперантигена, содержащего адсорбированный рекомбинантный полипептид, в контакт с буфером для промывки, как раскрыто в настоящем описании.

«Суперантиген» относится к стандартным лигандам, которые взаимодействуют с членами суперсемейства иммуноглобулинов в месте, которое отличается от целевых сайтов связывания лигандов этих белков. Стафилококковые энтеротоксины представляют собой примеры суперантигенов, которые взаимодействуют с T-клеточными рецепторами. Суперантигены, которые связывают антитела, включают, но не ограничиваясь этим, белок G, который связывает константную область IgG (Bjorck and Kronvall (1984) J. Immunol., 133:969); белок A, который связывает константную область IgG и домены VH (Forsgren and Sjoquist, (1966) J. Immunol., 97:822); и белок L, который связывает домены VL (Bjorck, (1988) J. Immunol., 140:1194). Следовательно, в одном из вариантов осуществления суперантиген выбран из группы, состоящей из белка A, белка G и белка L.

Когда используют в настоящем описании, термин «белок A» охватывает белок A, извлеченный из его нативного источника (например, клеточной стенки Staphylococcus aureus), белок A, полученный синтетически (например, посредством синтеза пептидов или посредством рекомбинантных способов), и их варианты, которые сохраняют способность связывать белки, которые имеют область C_H2/C_H3. Белок A можно приобретать коммерчески, например, в Repligen или Pharmacia.

Как используют в настоящем описании, «аффинная хроматография» представляет собой хроматографический способ, в котором используют специфические обратимые взаимодействия между биологическими молекулами вместо общих свойств биологической молекулы, таких как изоэлектрическая точка, гидрофобность или размер, чтобы осуществлять хроматографическое разделение. «Аффинная хроматография на белке A» или «хроматография на белке А» относится к специфическому аффинному хроматографическому способу, в котором используют аффинность связывающих IgG доменов белка A к Fc части молекулы иммуноглобулина. Эта Fc часть содержит константные домены иммуноглобулинов CH2 и CH3 человека или животного, или домены иммуноглобулинов, по существу схожие с ними. На практике, хроматография на белке А включает использование белка A, иммобилизованного на твердом носителе. См. Gagnon, Protein A Affinity Chromatography, Purification Tools for Monoclonal Antibodies, стр.155-198, Validated Biosystems, (1996). Белок G и белок L также можно использовать для аффинной хроматографии. Твердый носитель представляет собой неводную матрицу, к которой прилипает белок A (например, колонка, смола, матрица, гранула, гель и тому подобное). Такие носители включают агарозу, сефарозу, стекло, диоксид кремния, полистирол, коллодиевый древесный уголь, песок, полиметакрилат, сшитый поли(стирол-дивинилбензол) и агарозу с декстрановым поверхностным разбавителем и любой другой подходящий материал. Такие материалы хорошо известны в данной области. Любой подходящий способ можно использовать для прикрепления суперантигена к твердому носителю. Способы прикрепления белков к подходящим твердым носителям хорошо известны в данной области. См., например Ostrove, в Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, (1990) 182: 357-371. Такие твердые носители, с иммобилизованным белком A или белком L и без него, легко доступны во многих коммерческих источниках, таких как Vector Laboratory (Burlingame, Calif.), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Calif.), BioRad (Hercules, Calif.), Amersham Biosciences (part of GE Healthcare, Uppsala, Sweden) и Millipore (Billerica, Mass.).

Способ, описанный в настоящем описании, может включать одну или несколько дополнительных стадий очистки, такие как одна или несколько дополнительных стадий хроматографии. В одном из вариантов осуществления одну или несколько дополнительных стадий хроматографии выбран из группы, состоящей из: анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии и хроматографии в смешанном режиме, в частности, анионообменной хроматографии.

В одном из вариантов осуществления способ дополнительно включает фильтрование элюата, получаемого с помощью стадии (c) способов, описанных в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления способ дополнительно включает следующие стадии после стадии (c): (d) титрования раствора, содержащего извлеченный белок, до приблизительно pH 3,5 с использованием 30 мМ уксусной кислоты, 100 мМ HCl; (e) предоставление раствору со стадии (d) возможности оставаться приблизительно при pH 3,5 в течение от приблизительно 30 до приблизительно 60 минут; и (f) корректировки pH раствора со стадии (e) до приблизительно pH 7,5 с использованием 1 M Tris. В одном из вариантов осуществления способ дополнительно включает фильтрование раствора, получаемого с помощью стадии (f).

В одном из вариантов осуществления количество рекомбинантного белка, наносимого на колонку на стадии (a) (т. е. коэффициент загрузки) составляет 35 мг/мл или меньше, например, 30 мг/мл или меньше, 20 мг/мл или меньше, 15 мг/мл или меньше или 10 мг/мл или меньше. Понятно, что «коэффициент загрузки» относится к миллиграммам (мг) белка (например, моноклонального антитела) на миллилитр (мл) смолы.

Буферы для промывки

«Буфер» представляет собой буферный раствор, который противостоит изменениям pH с помощью действия его сопряженных кислотно-основных компонентов. «Уравновешивающий буфер» относится к раствору, используемому для того, чтобы получать твердую фазу для хроматографии. «Загрузочный буфер» относится к раствору, используемому для того, чтобы загружать смесь белка и примесей на твердую фазу (т. е. хроматографическую матрицу). Уравновешивающий и загрузочный буферы могут представлять собой одно и то же. «Буфер для промывки» относится к раствору, используемому для того, чтобы удалять остающиеся примеси из твердой фазы после завершения загрузки. «Элюирующий буфер» используют для того, чтобы удалять целевой белок из хроматографической матрицы.

«Соль» представляет собой соединение, образуемое посредством взаимодействия кислоты и основания.

В одном из аспектов изобретения буфер для промывки содержит алифатический карбоксилат. Алифатический карбоксилат может иметь неразветвленную или разветвленную цепь. В определенных вариантах осуществления алифатический карбоксилат представляет собой алифатическую карбоновую кислоту или ее соль, или источником алифатического карбоксилата является алифатическая карбоновая кислота или ее соль. В определенных вариантах осуществления алифатический карбоксилат имеет неразветвленную цепь и выбран из группы, состоящей из метановой (муравьиной) кислоты, этановой (уксусной) кислоты, пропановой (пропионовой) кислоты, бутановой (масляной) кислоты, пентановой (валериановой) кислоты, гексановой (капроновой) кислоты, гептановой (энантовой) кислоты, октановой (каприловой) кислоты, нонановой (пеларгоновой) кислоты, декановой (каприновой) кислоты, ундекановой (ундециловой) кислоты, додекановой (лауриновой) кислоты, тридекановой (тридециловой) кислоты, тетрадекановой (миристиновой) кислоты, пентадекановой кислоты, гексадекановой (пальмитиновой) кислоты, гептадекановой (маргариновой) кислоты, октадекановой (стеариновой) кислоты и эйкозановой (арахидоновой) кислоты или любых их солей. Соответственно, алифатический карбоксилат может содержать углеродный остов из 1-20 углеродов в длину. В одном из вариантов осуществления алифатический карбоксилат содержит остов из 6-12 углеродов. В одном из вариантов осуществления алифатический карбоксилат выбран из группы, состоящей из капроата, гептаноата, каприлата, деканоата и додеканоата. В дополнительном варианте осуществления алифатический карбоксилат представляет собой каприлат.

В одном из вариантов осуществления источник алифатического карбоксилата выбран из группы, состоящей из алифатической карбоновой кислоты, соли натрия и алифатической карбоновой кислоты, соли калия и алифатической карбоновой кислоты и соли аммония и алифатической карбоновой кислоты. В одном из вариантов осуществления источник алифатического карбоксилата представляет собой соль натрия и алифатической карбоновой кислоты. В дополнительном варианте осуществления буфер для промывки содержит каприлат натрия, деканоат натрия или додеканоат натрия, в частности, каприлат натрия.

В одном из вариантов осуществления буфер для промывки содержит больше чем приблизительно 50 мМ каприлата. В одном из вариантов осуществления буфер для промывки содержит больше чем приблизительно 200 мМ каприлата. В одном из вариантов осуществления буфер для промывки содержит больше чем приблизительно 250 мМ каприлата. В дополнительном варианте осуществления буфер для промывки содержит по меньшей мере приблизительно 50 мМ каприлата, например, по меньшей мере приблизительно 75 мМ, приблизительно 100 мМ, приблизительно 150 мМ, приблизительно 200 мМ, приблизительно 250 мМ или приблизительно 300 мМ каприлата. В одном из вариантов осуществления буфер для промывки содержит меньше чем приблизительно 850 мМ каприлата, например, меньше чем приблизительно 800 мМ, приблизительно 750 мМ, приблизительно 700 мМ, приблизительно 650 мМ, приблизительно 600 мМ, приблизительно 550 мМ, приблизительно 500 мМ, приблизительно 450 мМ, приблизительно 400 мМ, приблизительно 350 мМ, приблизительно 300 мМ каприлата. В другом варианте осуществления, буфер для промывки содержит приблизительно 100 мМ, приблизительно 125 мМ, приблизительно 150 мМ, приблизительно 175 мМ, приблизительно 200 мМ или приблизительно 250 мМ каприлата.

В одном из вариантов осуществления буфер для промывки содержит больше чем приблизительно 50 мМ каприлата натрия. В одном из вариантов осуществления буфер для промывки содержит больше чем приблизительно 200 мМ каприлата натрия. В одном из вариантов осуществления буфер для промывки содержит больше чем приблизительно 250 мМ каприлата натрия. В дополнительном варианте осуществления буфер для промывки содержит по меньшей мере приблизительно 50 мМ каприлата натрия, например, по меньшей мере приблизительно 75 мМ, приблизительно 100 мМ, приблизительно 150 мМ, приблизительно 200 мМ, приблизительно 250 мМ или приблизительно 300 мМ каприлата натрия. В одном из вариантов осуществления буфер для промывки содержит меньше чем приблизительно 850 мМ каприлата натрия, например, меньше чем приблизительно 800 мМ, приблизительно 750 мМ, приблизительно 700 мМ, приблизительно 650 мМ, приблизительно 600 мМ, приблизительно 550 мМ, приблизительно 500 мМ, приблизительно 450 мМ, приблизительно 400 мМ, приблизительно 350 мМ, приблизительно 300 мМ каприлата натрия. В другом варианте осуществления буфер для промывки содержит приблизительно 100 мМ, приблизительно 125 мМ, приблизительно 150 мМ, приблизительно 175 мМ, приблизительно 200 мМ, или приблизительно 250 мМ каприлата натрия.

В одном из вариантов осуществления буфер для промывки содержит от приблизительно 50 мМ до приблизительно 750 мМ каприлата; от приблизительно 50 мМ до приблизительно 500 мМ каприлата; от приблизительно 75 мМ до приблизительно 400 мМ каприлата; от приблизительно 75 мМ до приблизительно 350 мМ каприлата; от приблизительно 75 мМ до приблизительно 300 мМ каприлата; от приблизительно 75 мМ до приблизительно 200 мМ каприлата; от больше чем приблизительно 250 мМ до приблизительно 750 мМ каприлата; от больше чем приблизительно 250 мМ до приблизительно 500 мМ каприлата; от больше чем приблизительно 250 мМ до приблизительно 400 мМ каприлата; от больше чем приблизительно 250 мМ до приблизительно 350 мМ каприлата; или от больше чем приблизительно 250 мМ до приблизительно 300 мМ каприлата.

В одном из вариантов осуществления буфер для промывки содержит от приблизительно 50 мМ до приблизительно 750 мМ каприлата натрия; от приблизительно 50 мМ до приблизительно 500 мМ каприлата натрия; от приблизительно 75 мМ до приблизительно 400 мМ каприлата натрия; от приблизительно 75 мМ до приблизительно 350 мМ каприлата натрия; от приблизительно 75 мМ до приблизительно 300 мМ каприлата натрия; от приблизительно 75 мМ до приблизительно 200 мМ каприлата натрия; от больше чем приблизительно 250 мМ до приблизительно 750 мМ каприлата натрия; от больше чем приблизительно 250 мМ до приблизительно 500 мМ каприлата натрия; от больше чем приблизительно 250 мМ до приблизительно 400 мМ каприлата натрия; от больше чем приблизительно 250 мМ до приблизительно 350 мМ каприлата натрия; или от больше чем приблизительно 250 мМ до приблизительно 300 мМ каприлата натрия.

В одном из вариантов осуществления буфер для промывки содержит органическую кислоту, соль щелочного металла или аммония из основания, сопряженного с органической кислотой, и органическое основание. В одном из вариантов осуществления буфер для промывки получают без добавления NaCl.

В одном из вариантов осуществления основание, сопряженное с органической кислотой, представляет собой соль натрия, калия или аммония из основания, сопряженного с органической кислотой. В одном из вариантов осуществления органическая кислота представляет собой уксусную кислоту и основание, сопряженное с уксусной кислотой, представляет собой соль натрия (т. е. ацетат натрия).

В одном из вариантов осуществления буфер для промывки дополнительно содержит от приблизительно 1 мМ до приблизительно 500 мМ уксусной кислоты. В одном из вариантов осуществления буфер для промывки содержит приблизительно 45 мМ уксусной кислоты. В одном из вариантов осуществления буфер для промывки дополнительно содержит от приблизительно 1 мМ до приблизительно 500 мМ основания Tris. В одном из вариантов осуществления буфер для промывки содержит приблизительно 55 мМ основания Tris. В одном из вариантов осуществления буфер для промывки дополнительно содержит от приблизительно 1 мМ до приблизительно 500 мМ ацетата натрия. В одном из вариантов осуществления буфер для промывки содержит приблизительно 300 мМ ацетата натрия.

В одном из вариантов осуществления pH буфера для промывки составляет между приблизительно pH 7 и приблизительно pH 9; например от приблизительно pH 7,5 до приблизительно pH 8,5.

В одном из вариантов осуществления буфер для промывки содержит от приблизительно 0,25 M до приблизительно 1,5 M аргинина. В дополнительном варианте осуществления буфер для промывки содержит от приблизительно 0,25 M до приблизительно 2 M аргинина. В дополнительном варианте осуществления буфер для промывки содержит от приблизительно 0,5 M до приблизительно 2 M аргинина. В еще одном другом варианте осуществления, буфер для промывки содержит от приблизительно 0,75 M до приблизительно 1,5 M аргинина. В дополнительном варианте осуществления буфер для промывки содержит приблизительно 1 M, приблизительно 1,1 M, приблизительно 1,2 M, приблизительно 1,3 M, приблизительно 1,4 M, приблизительно 1,5 M, приблизительно 1,6 M, приблизительно 1,7 M, приблизительно 1,8 M, приблизительно 1,9 M или приблизительно 2 M аргинина. В одном из вариантов осуществления буфер для промывки содержит от приблизительно 0,5 M до приблизительно 2 M аргинина, в частности от приблизительно 0,75 M до приблизительно 2 M аргинина. В дополнительном варианте осуществления буфер для промывки содержит больше чем приблизительно 1 M аргинина.

Понятно, что упоминания об «аргинине» относятся не только к природным аминокислотам, но также охватывают производные аргинина или их соли, такие как аргинин HCl, ацетиларгинин, агматин, аргиновая кислота, N-α-бутироил-L-аргинин или N-α-пивалоиларгинин.

Альтернативно, аргинин можно включать в начальный буфер для промывки (т. е. использовать одновременно). Следовательно, в одном из аспектов изобретение относится к способу очистки рекомбинантного полипептида от белков клетки-хозяина (HCP), способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель, (b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим от приблизительно 100 мМ до приблизительно 850 мМ каприлата и от приблизительно 0,25 M до приблизительно 1,5 M аргинина; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя. Как показано в примерах, описанных в настоящем описании, промывания суперантигенной хроматографии, содержащие комбинацию каприлата и аргинина, имели неожиданный синергический эффект усовершенствованной очистки от белков клетки-хозяина, в частности для удаления PLBL2 и катепсина L, которые представляют собой два белка клетки-хозяина, которые особенно трудно удалить.

В одном из вариантов осуществления буфер для промывки содержит от приблизительно 100 мМ до приблизительно 750 мМ каприлата; от приблизительно 100 мМ до приблизительно 500 мМ каприлата; от приблизительно 100 мМ до приблизительно 400 мМ каприлата; от приблизительно 100 мМ до приблизительно 350 мМ каприлата; или от приблизительно 100 мМ до приблизительно 300 мМ каприлата; и/или от приблизительно 0,25 M до приблизительно 2 M аргинина, от приблизительно 0,5 M до приблизительно 1,5 M аргинина; или от приблизительно 0,5 M до приблизительно 1 M аргинина.

В одном из вариантов осуществления буфер для промывки содержит от приблизительно 100 мМ до приблизительно 750 мМ каприлата натрия; от приблизительно 100 мМ до приблизительно 500 мМ каприлата натрия; от приблизительно 100 мМ до приблизительно 400 мМ каприлата натрия; от приблизительно 100 мМ до приблизительно 350 мМ каприлата натрия; или от приблизительно 100 мМ до приблизительно 300 мМ каприлата натрия; и/или от приблизительно 0,25 M до приблизительно 2 M аргинина; от приблизительно 0,5 M до приблизительно 1,5 M аргинина; или от приблизительно 0,5 M до приблизительно 1 M аргинина.

В одном из вариантов осуществления буфер для промывки содержит от приблизительно 0,5 M до приблизительно 2 M аргинина и от приблизительно 50 мМ до приблизительно 750 мМ каприлата натрия; от приблизительно 0,5 M до приблизительно 1,5 M аргинина и от приблизительно 50 мМ до приблизительно 500 мМ каприлата натрия; или от приблизительно 0,5 M до приблизительно 1,5 M аргинина и от приблизительно 50 мМ до приблизительно 250 мМ каприлата натрия.

В одном из вариантов осуществления буфер для промывки дополнительно содержит от приблизительно 0,5 M до приблизительно 1 M лизина, например, приблизительно 0,75 M лизина. В этом варианте осуществления лизин включают в начальный буфер для промывки (т. е. используют одновременно). В альтернативном варианте осуществления лизин включают в отдельный буфер для промывки (т. е. используют последовательно). Как показано в примерах, предоставленных в настоящем описании, добавление лизина успешно снижает объем элюирования.

Рекомбинантные полипептиды

В одном из вариантов осуществления полипептид представляет собой связывающий антиген полипептид. В одном из вариантов осуществления связывающий антиген полипептид выбран из группы, состоящей из антитела, фрагмента антитела, отдельного вариабельного домена иммуноглобулина (dAb), mAbdAb, Fab, F(ab')₂, Fv, Fv с дисульфидной связью, scFv, полиспецифическое антитело в закрытой конформации, scFv с дисульфидной связью, диатело или растворимый рецептор. В дополнительном варианте осуществления связывающий антиген белок представляет собой антитело, например, моноклональное антитело (mAb). Термины рекомбинантный полипептид, молекула продукта и mAb используют в настоящем описании взаимозаменяемо. Антитело может представлять собой, например, химерное, гуманизированное или доменное антитело.

Термины Fv, Fc, Fd, Fab или F(ab)₂ используют в их стандартных значениях (см., например, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).

«Химерное антитело» относится к тому типу сконструированных антител, которые содержат встречаемую в природе вариабельную область (легкой цепи и тяжелых цепей), происходящую из донорного антитела, в ассоциации с константными областями легкой и тяжелой цепей, происходящими из акцепторного антитела.

«Гуманизированное антитело» относится к тому типу сконструированных антител, у которых CDR происходят из не относящегося к человеку донорного иммуноглобулина, остальные части молекулы, происходящие из иммуноглобулина, происходят из одного (или больше) иммуноглобулина(ов) человека. Кроме того, каркасные несущие остатки можно изменять для сохранения аффинности связывания (см., например, Queen et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10032, Hodgson et al., (1991) Bio/Technology, 9:421). Подходящее акцепторное антитело человека может представлять собой то, которое выбран из стандартной базы данных, например, базы данных KABAT.RTM., базы данных Los Alamos и базы данных Swiss Prot, по гомологии с нуклеотидной и аминокислотной последовательностями донорного антитела. Антитело человека, отличающееся гомологией с каркасными областями донорного антитела (на аминокислотной основе), может подходить для того, чтобы предоставлять константную область тяжелой цепи и/или вариабельную каркасную область тяжелой цепи для вставки донорных CDR. Подходящее акцепторное антитело, способное жертвовать константными или вариабельными каркасными областями легкой цепи, можно выбирать схожим образом. Следует отметить, что тяжелые и легкие цепи акцепторного антитела не обязательно должны происходить из того же акцепторного антитела. В известном уровне техники описано несколько путей получения таких гуманизированных антител, например, см. EP-A-0239400 и EP-A-054951.

Термин «донорное антитело» относится к антителу (моноклональному и/или рекомбинантному), которое передает аминокислотные последовательности своих вариабельных областей, CDR или других функциональных фрагментов или их аналогов первому иммуноглобулиновому партнеру с тем, чтобы предоставлять область, кодирующую измененный иммуноглобулин, и результирующее экспрессированное измененное антитело с антигенной специфичностью и нейтрализующей активность, характерной для донорного антитела. Термин «акцепторное антитело» относится к антителу (моноклональному и/или рекомбинантному), гетерологичному относительно донорного антитела, которое жертвует всеми (или любой частью, но в некоторых вариантах осуществления всеми) аминокислотными последовательностями, кодирующими его каркасные области тяжелой и/или легкой цепей и/или константные области его тяжелой и/или легкой цепей, первому иммуноглобулиновому партнеру. В определенных вариантах осуществления антитело человека представляет собой акцепторное антитело.

«CDR» определяют как аминокислотные последовательности определяющих комплементарность областей антитела, которые представляют собой гипервариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина. См., например, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4-е изд., U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). В вариабельной части иммуноглобулина имеют место три CDR (или области CDR) тяжелой цепи и три CDR (или области CDR) легкой цепи. Таким образом, «CDR», как используют в настоящем описании, относится ко всем трем CDR тяжелой цепи или ко всем трем CDR легкой цепи (или ко всем CDR как тяжелой, так и легкой цепей, если уместно). Структура и укладка белка антитела могут обозначать, что другие остатки считают частью антигенсвязывающей области, и специалист сочтет их таковыми (например, см. Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883).

Как используют в настоящем описании термин «домен» относится к структуре уложенного белка, который имеет третичную структуру, независимую от остального белка. В целом, домены отвечают за отдельные функциональные свойства белков, и во многих случаях их можно добавлять, удалять или переносить на другие белки без утраты функции остальной части белка и/или домена. «Отдельный вариабельный домен антитела» представляет собой уложенный полипептидный домен, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антитела. Следовательно, он включает полные вариабельные домены антитела и модифицированные вариабельные домены, например, в которых одна или несколько петель заменены на последовательности, которые не характерны для вариабельных доменов антитела, или вариабельные домены антитела, которые усечены или содержат N- или C-концевые удлинения, а также уложенные фрагменты вариабельных доменов, которые сохраняют по меньшей мере активность и специфичность связывания полноразмерного домена.

Фраза «отдельный вариабельный домен иммуноглобулина» относится к вариабельному домену антитела (V_H, V_HH, V_L), который специфически связывает антиген или эпитоп независимо от другой V области или домена. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина может быть представлен в определенном формате (например, гомо- или гетеромультимер) с другими отличающимися вариабельными областями или вариабельными доменами, где другие области или домены не требуются для связывания антигена отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина (т. е. когда отдельный вариабельный домен иммуноглобулина связывает антиген независимо от дополнительных вариабельных доменов). «Доменное антитело» или «dAb» является таким же, как «отдельный вариабельный домен иммуноглобулина», который способен связываться с антигеном, как термин используют в настоящем описании. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина может представлять собой вариабельный домен антитела человека, но также включает отдельные вариабельные домены антитела от других биологических видов, таких как VHH dAb грызунов (например, как раскрыто в WO 00/29004), акул-нянек и верблюдовых (нанотела). VHH верблюдовых представляют собой полипептиды отдельных вариабельных доменов иммуноглобулинов, которые происходят от биологических видов, включающих верблюда, ламу, альпаку, дромедара и гуанако, которые продуцируют антитела из тяжелых цепей, которые в природе не содержат легкие цепи. Такие домены VHH можно гуманизировать в соответствии со стандартными приемами, доступными в данной области, и такие домены все еще считают «доменными антителами» в соответствии с изобретением. Как используют в настоящем описании «VH включает домены VHH верблюдовых. NARV представляет собой отдельный вариабельный домен иммуноглобулина другого типа, который идентифицировали у хрящевых рыб, включая акулу-няньку. Эти домены также известны как вариабельная область нового антигенного рецептора (обычно сокращают до V(NAR) или NARV). Более подробно см. Mol. Immunol. (2006) 44, 656-665 и US2005/0043519.

Термины «mAbdAb» и dAbmAb» используют в настоящем описании для обозначения антигенсвязывающих белков, содержащих моноклональное антитело и по меньшей мере одно однодоменное антитело. Два термина можно использовать взаимозаменяемо, и предусмотрено, что они имеют одно и то же значение, как используют в настоящем описании.

Часто очистка рекомбинантных полипептидов от белков клетки-хозяина ведет к фрагментации рекомбинантного полипептида. Заявители обнаруживали, что при использовании способов очистки, описанных в настоящем описании, количество фрагментации рекомбинантного полипептида значительно снижено. В одном из вариантов осуществления элюируемый рекомбинантный полипептид содержит меньше чем приблизительно 10%, приблизительно 9%, приблизительно 8%, приблизительно 7%, приблизительно 6%, приблизительно 5%, приблизительно 4%, приблизительно 3%, приблизительно 2% или приблизительно 1% фрагментированного рекомбинантного полипептида. В другом варианте осуществления рекомбинантный полипептид представляет собой антитело, и элюируемое антитело содержит меньше чем приблизительно 10%, приблизительно 9%, приблизительно 8%, приблизительно 7%, приблизительно 6%, приблизительно 5%, приблизительно 4%, приблизительно 3%, приблизительно 2% или приблизительно 1% фрагментированного антитела.

Белки клетки-хозяина

«Примесь» относится к любой чужеродной или нежелательной молекуле, которая присутствует в загружаемом образце перед суперантигенной хроматографией или после суперантигенной хроматографии в элюате. Могут иметь место «примеси из процесса». Они представляют собой примеси, которые присутствуют в качестве результата процесса, в котором получают белок, представляющий интерес. Например, они включают белки клетки-хозяина (HCP), РНК и ДНК. «HCP» относится к белкам, не относящимся к белку, представляющему интерес, которые продуцирует клетка-хозяин в ходе клеточной культуры или ферментации, включая внутриклеточные и/или секретируемые белки. Примером белка клетки-хозяина являет протеаза, которая может вызывать повреждение белка, представляющего интерес, если все еще присутствует в ходе и после очистки. Например, если протеаза остается в образце, содержащем белок, представляющий интерес, она может создавать вещества или примеси, связанные с продуктом, которые исходно не присутствовали. Присутствие протеазы может вызывать разрушение, например, фрагментацию, белка, представляющего интерес, с течением времени в ходе процесса очистки и/или в конечном составе.

В одном из вариантов осуществления белки клетки-хозяина продуцируются/происходят из клетки млекопитающего или бактериальной клетки. В дополнительном варианте осуществления клетку млекопитающего выбран из клетки человека или грызуна (такого как хомяк или мышь). В еще одном дополнительном варианте осуществления клетка человека представляет собой клетку HEK, клетка хомяка представляет собой клетку CHO или клетка мыши представляет собой клетку NS0.

В определенных вариантах осуществления клетку-хозяина выбран из группы, состоящей из выбранных из группы, состоящей из клеток CHO, клеток NS0, клеток Sp2/0, клеток COS, клеток K562, клеток BHK, клеток PER.C6 и клеток HEK (т. е., белки клетки-хозяина происходят из этих клеток-хозяев). Альтернативно, клетка-хозяин может представлять собой бактериальную клетку, выбранную из группы, состоящей из E. coli (например, W3110, BL21), B. subtilis и/или других подходящих бактерий; эукариотические клетки, такие как клетки грибов или дрожжей (например, Pichia pastoris, Aspergillus sp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa).

«Раствор» может представлять собой клеточную культуральную среду, например, сырьевой поток клеточной культуры. Сырьевой поток можно фильтровать. Раствор может представлять собой осветленный необработанный бульон (CUB) (или осветленный ферментативный бульон/супернатант). CUB также известен как клеточный культуральный супернатант, в котором любые клетки и/или клеточный дебрис удаляют посредством осветления. Раствор может представлять собой лизированный препарат клеток, экспрессирующих белок (например, раствор представляет собой лизат).

Примеси из процесса также включают компоненты, используемые для выращивания клеток или обеспечения экспрессии белка, представляющего интерес, например, растворители (например, метанол, используемый для культивирования клеток дрожжей), антибиотики, метотрексат (MTX), компоненты среды, флоккулянты и тому подобное. Также включены молекулы, которые являются частью суперантигенной твердой фазы, которые вымываются в образец в течение предшествующих стадий, например, белок A, белок G или белок L.

Примеси также включают «связанные с продуктом варианты», которые включают белки, которые сохраняют свою активность, но отличаются по своей структуре, и белки, которые утратили свою активность по причине их отличия в структуре. Эти связанные с продуктом варианты включают, например, высокомолекулярные частицы (HMW), низкомолекулярные частицы (LMW), агрегированные белки, предшественники, разрушенные белки, белки с нарушенной укладкой, белки с недостаточными дисульфидными связями, фрагменты и дезамидированные частицы.

Присутствие любой одной из этих примесей в элюате можно измерять для того, чтобы устанавливать, была ли стадия промывания успешной. Например, авторы изобретения показали снижение уровня HCP, выраженного в нг HCP на мг продукта (см. примеры). Альтернативно, обнаруживаемые HCP можно выражать в «частях на миллион» или «ч./млн», что является эквивалентом для нг/мг, или «ч./млрд» («частях на миллиард»), что является эквивалентом для пг/мг.

В одном из вариантов осуществления, после стадии (c), количество HCP составляет меньше чем приблизительно 200 нг HCP/мг продукта (т. е. нг/мг); меньше чем приблизительно 150 нг/мг; меньше чем приблизительно 100 нг/мг; меньше чем приблизительно 50 нг/мг; или меньше чем приблизительно 20 нг/мг.

Снижение также можно показывать по сравнению с контрольной стадией промывания без алифатического карбоксилата и/или по сравнению с раствором (например, осветленным необработанным бульоном) перед очисткой.

В одном из вариантов осуществления, после стадии (c), коэффициент относительного снижения HCP, по сравнению с ранее опубликованным промывку с 100 мМ каприлата (например, см. WO2014/141150), составляет от приблизительно 2 раз до приблизительно 50 раз. Следовательно, в одном из вариантов осуществления, после стадии (c), коэффициент относительного снижения HCP по сравнению с буфером для промывки, состоящим по существу из 100 мМ каприлата, составляет от приблизительно 2 раз до приблизительно 50 раз. В дополнительном варианте осуществления коэффициент относительного снижения составляет по меньшей мере приблизительно 2 раза, 5 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 25 раз, 30 раз, 35 раз, 40 раз, 45 раз или 50 раз. Во избежание сомнений, упоминание о «буфере для промывки, состоящем по существу из 100 мМ каприлата» не исключает присутствия дополнительных компонентов, которые не оказывают существенного влияния на основные характеристики промывания с 100 мМ каприлата, например, буферные соли и/или ацетат натрия.

В одном из вариантов осуществления извлечение белка, представляющего интерес, из элюата составляет 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, 50% или меньше, в том числе любое дискретное значение в диапазоне от 100% до 50% или любой поддиапазон, определяемый с помощью любой пары дискретных значений в этом диапазоне, после стадии промывания по изобретению. В одном из вариантов осуществления извлечение белка, представляющего интерес, из элюата составляет больше чем 70%, например, больше чем 75%, 80%, 85%, 90% 95% или 99%. Процент (%) извлечения в элюате вычисляют посредством определения количества белка, представляющего интерес, в элюате, в качестве процентной доли количества белка, представляющего интерес, нанесенного на колонку, в соответствии со следующей формулой:

Процентная доля извлечения=количество продукта в элюате/количество продукта, нанесенного на колонку × 100

Количество примесей (т. е. белков клетки-хозяина), присутствующих в элюате, можно определять с помощью ELISA, OCTET или других способов, чтобы определять уровень одной или нескольких примесей, описанных выше. В примерах, описанных в настоящем описании, способ ELISA используют для того, чтобы определять уровень HCP в образце.

В одном из вариантов осуществления белок клетки-хозяина выбран из PLBL2 (фосфолипаза-B-подобный 2 белок) и/или катепсина L.

В одном из вариантов осуществления белок клетки-хозяина представляет собой PLBL2. Следовательно, в одном из аспектов изобретения, предусмотрен способ очистки рекомбинантного полипептида от фосфолипаза-B-подобного 2 белка (PLBL2), способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и PLBL2, на суперантигенный хроматографический твердый носитель, (b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим от приблизительно 150 мМ до приблизительно 850 мМ каприлата; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя.

В другом аспекте изобретения, предусмотрен способ очистки рекомбинантного полипептида от фосфолипаза-B-подобного 2 белка (PLBL2), способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и PLBL2, на суперантигенный хроматографический твердый носитель, (b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим от приблизительно 55 мМ до приблизительно 850 мМ каприлата и от приблизительно 0,25 M до приблизительно 1,5 M аргинина; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя.

В другом аспекте изобретения, предусмотрен способ очистки рекомбинантного полипептида от фосфолипаза-B-подобного 2 белка (PLBL2), способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и PLBL2, на суперантигенный хроматографический твердый носитель, (b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим приблизительно 100 мМ каприлата и приблизительно 1,1 M аргинина; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя.

Обнаружено, что PLBL2 представляет собой примесь HCP, которую трудно удалять в течение последующей обработки антител, в частности, mAb5 (см. примеры), из-за кажущегося связывания с молекулой продукта. Следовательно, в одном из вариантов осуществления рекомбинантный полипептид представляет собой антитело, такое как антитело IgG, в частности, антитело IgG4. Количество PLBL2 можно измерять с использованием известных в данной области способов, например, посредством ELISA, например, PLBL2-специфического ELISA, описанного в примерах или раскрытого в WO2015/038884.

Протеаза катепсин L образуется в ходе культуры клеток CHO, и потенциально она может разрушать антитела, такие как молекула продукта mAb3 (см. примеры). Следовательно, в одном из вариантов осуществления рекомбинантный полипептид представляет собой антитело, такое как антитело IgG, в частности, антитело IgG1.

В одном из вариантов осуществления белок клетки-хозяина представляет собой катепсин L. В этом варианте осуществления очистку рекомбинантного полипептида от катепсина L можно измерять по сниженной активности катепсина L (например, с использованием PromoKine PK-CA577-K142) в элюате со стадии (c).

В одном из аспектов изобретения, предусмотрен способ очистки рекомбинантного полипептида от катепсина L, способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и катепсин L, на суперантигенный хроматографический твердый носитель, (b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим от приблизительно 150 мМ до приблизительно 850 мМ каприлата; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя.

В другом аспекте изобретения, предусмотрен способ очистки рекомбинантного полипептида от катепсина L, способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и катепсин L, на суперантигенный хроматографический твердый носитель, (b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим от приблизительно 55 мМ до приблизительно 850 мМ каприлата и от приблизительно 0,25 M до приблизительно 1,5 M аргинина; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя.

В другом аспекте изобретения, предусмотрен способ очистки рекомбинантного полипептида от катепсина L, способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и катепсин L, на суперантигенный хроматографический твердый носитель, (b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим приблизительно 150 мМ каприлата и приблизительно 1,1 M аргинина; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя.

В одном из аспектов изобретения, предусмотрен очищенный рекомбинантный полипептид, получаемый любым одним из способов очистки, которые определены в настоящем описании.

Изобретение далее описано со ссылкой на следующие неограничивающие примеры.

Разрушение полисорбатов

Полисорбаты, такие как полисорбат 20 и полисорбат 80, представляют собой неионные поверхностно-активные средства, широко используемые для того, чтобы стабилизировать белковые фармацевтические средства в продукте конечного состава. Остаточные ферменты в фармацевтическом препарате могут разрушать полисорбаты, что может влиять на итоговый срок хранения продукта. Не ограничиваясь теорией, способы, описанные в настоящем описании, уменьшают количество разрушенного полисорбата посредством снижения количества остаточных белков клетки-хозяина в конечном продукте. В одном из вариантов осуществления количество разрушенного полисорбата составляет меньше чем приблизительно 50%, приблизительно 40%, приблизительно 30%, приблизительно 20%, приблизительно 10%, приблизительно 5%, приблизительно 4%, приблизительно 3%, приблизительно 2% или приблизительно 1%.

ПРИМЕР 1: Скрининг и оптимизация pH и концентрация каприлата натрия при промывании белка A

Введение

В работе, описанной в настоящем описании, промывку белка A оптимизировали для того, чтобы достигать достаточного удаления HCP с использованием процесса с двумя колонками (белок A, после чего следует анионный обмен) для всех продуктов mAb. Существующие платформенные процессы часто требуют второй стадии дополнительной очистки для достижения необходимого уровня HCP. Устранение стадии хроматографии упрощает процесс, делает возможным более быструю разработку процесса и может уменьшать риски применимости установки. Стратегия оптимизации промывания состояла в усовершенствовании очистки от HCP посредством нарушения взаимодействий HCP-mAb. Осуществляли скрининг различных добавок для промывки и pH при промывании и затем оптимизировали общее удаление HCP во всем процессе с белком A.

Материалы и способы

Н-октаноат натрия, ледяную уксусную кислоту, ацетат натрия, гидроксид натрия, бензиловый спирт и основание Trizma приобретали в Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO). Растворы получали с использованием воды, которую дополнительно очищали с использованием системы Millipore Milli-Q®. Любую корректировку pH выполняли с использованием 3 M основания Tris или 3 M уксусной кислоты.

Культура клеток яичника китайского хомяка (CHO) для получения mAb

Осветленный нефильтрованный бульон (CUB) содержал один из нескольких GSK продуктов mAb, таких как mAb1 (IgG1, pI=8,7, MW=149 кДа), mAb2 (IgG1, pI=8,3, MW=149 кДа), mAb3 (IgG1, pI=7,9, MW=149 кДа), mAb4 (IgG1, pI=8,6, MW=148 кДа) или mAb5 (IgG4, pI=7,1, MW=145 кДа). Схожие способы использовали для продуцирования и сбора всех mAb, используемых в этом исследовании. Например, mAb1 получали посредством засевания 2 л реакторов mAb1-экспрессирующими клетками DG44 при количестве жизнеспособных клеток 1,23-1,24 MM/мл и жизнеспособности ~93,8%. Затем культуру поддерживали при ~34°C, pH ~6,9 и 6 г/л глюкозы в течение 16 суток. Скорость перемешивания поддерживали на ~300 об./мин. После культивирования, неосветленное культуральное текучее вещество, содержащее клетки и mAb, центрифугировали партиями на 10000 g в течение 20 минут. Затем осуществляли вакуумное фильтрование культурального текучего вещества через 0,45 мкМ и 0,2 мкМ SFCA фильтр из Nalgene.

Очистка на белке A

Смолу с белком A MabSelect SuRe^TM (MSS) из GE Healthcare набивали в колонку диаметром 0,5 см до конечной высоты слоя 25 см. Смолу набивали потоком, после гравитационной усадки, в 0,4 M NaCl при линейной скорости потока 475 см/ч в течение 2 часов с использованием ÄKTA Avant 25. Качество набивки оценивали с использованием инъекции 100 мкл 2M NaCl для того, чтобы подтверждать, что асимметрия составляла 1,0±0,2 и по меньшей мере 1000 тарелок на метр. Во всех экспериментах с белком A использовали коэффициент загрузки 35 мг mAb/мл смолы и все скорости потоков в процессе эквивалентны линейной скорости 300 см/ч. Способ хроматографии на белке А и буферы описаны в таблице 2.

Таблица 2: условия работы для хроматографии на белке А (WO2014/141150).

Стадия хроматографии:	Композиция:	Объем:
1. Уравновешивание	55 мМ основания Tris, 45 мМ уксусной кислоты, pH 7,5	3 CV
2. Загрузка образца	Осветленный необработанный большим объемом (CUB), коэффициент загрузки=35 мг/мл
3. Каприлат-содержащее промывку:	55 мМ основания Tris, 45 мМ уксусной кислоты, указанная концентрация каприлата натрия, указанный pH	Различ.
4. Уравновешивание	55 мМ основания Tris, 45 мМ уксусной кислоты, pH 7,5	3 CV
5. Элюирование	1,8 мМ ацетата натрия, 28,2 мМ уксусной кислоты, pH 3,6	3 CV
6. Десорбция	300 мМ уксусной кислоты, pH 2,6	3 CV
7. Нейтрализация	55 мМ основания Tris, 45 мМ уксусной кислоты, pH 7,5	1 CV
8. Очистка	0,1 M гидроксида натрия	3 CV
9. Хранение	33 мМ уксусной кислоты, 167 мМ ацетата натрия, 2% бензиловый спирт (об./об.) pH 5,5	3 CV

Оптимизация промывка

Предыдущие исследования показали, что многие трудно удаляемые примеси HCP непосредственно связаны с mAb (Levy et al., (2014) Biotechnol. Bioeng. 111(5):904-912; Aboulaich et al., (2014) Biotechnol. Prog. 30(5):1114-1124); условия в растворе, которые нарушают взаимодействия HCP-mAb, вероятно, обеспечивают усовершенствованную очистку от HCP в ходе стадии промывания белка A, и с этой целью в этой работе осуществляли скрининг и оптимизацию различных растворов для промывки. В частности, растворы для промывки, содержащие различные концентрации каприлата натрия при различных pH, использовали после загрузки образца для устранения HCP с mAb, адсорбированных на белке A, перед элюированием. Для того чтобы оценивать и количественно определять эффективность удаления HCP при каждом промывании, разрабатывали собственный HCP ELISA, как описано далее в разделе о способах ELISA. Ранее обнаруживали, что каприлат натрия обеспечивает надежную очистку от HCP, когда используют при промывании белка A. Однако предыдущие исследования ограничены концентрациями каприлата натрия ниже 100 мМ и pH 7,5; за начальным обзорным исследованием следовало исследование по сферическому центральному композиционному плану для определения характеристик поведения промывания белка A каприлатом натрия в диапазонах концентраций и pH. Эти эксперименты приведены далее в таблицах 3 и 4. Статистическое моделирование выполняли в соответствии с разделом о способах статистического анализа.

Анализ

Выход белка A

Выход белка A определяли посредством измерения концентрации mAb в элюате с использованием Nanodrop 2000c (Thermo Scientific). Три показания Nanodrop для каждого образца элюата усредняли для того, чтобы определять концентрацию белка; общее содержание mAb в элюате белка A вычисляли посредством умножения концентрации mAb на объем элюата (определяли по хроматограмме). Концентрацию mAb в загружаемом веществе определяли с использованием колонки POROS® A 20 мкМ на HPLC Agilent серии 1100. Исходные данные для каждого образца CUB на аналитическом белке A сравнивали со стандартом с известной концентрацией для каждого конкретного mAb, чтобы вычислять титр. Общий загружаемый объем умножали на измеряемый титр для того, чтобы вычислять общую массу загруженного mAb, и вычисляли выход посредством деления общего mAb в элюате на общее mAb в загружаемом веществе.

Измерение концентрации белков клетки-хозяина (HCP): HCP ELISA

Анализ белков клетки-хозяина с использованием HCP ELISA разрабатывали самостоятельно для того, чтобы количественно определять общее количество иммуногенных HCP в образцах продукта, происходящего из CHO (Mihara et al., (2015) J. Pharm. Sci. 104: 3991-3996). Этот HCP ELISA разрабатывали с использованием специальных поликлональных антител козы против HCP CHO и самостоятельно полученного эталонного стандарта HCP для использования с несколькими продуктами среди продуктов, происходящих из CHO.

Статистический анализ

Для того чтобы анализировать эффективность промывания в единицах очистки от HCP и выхода, осуществляли обзорный эксперимент и исследование по центральному композиционному плану. Оба коэффициента масштабировали до единичной шкалы -1, 1 и основную линейную модель аппроксимировали к данным. Отдельную модель аппроксимировали к каждому ответу. Когда выбирали конечную модель, оценивали модельные допущения на оставшемся и осуществляли трансформацию в зависимости от ситуации. Все параметры модели оценивали при уровне значимости 5% и осуществляли обратное исключение, начиная с полной модели, в том числе все члены квадратичных коэффициентов.

Измерение равновесной изотермы MabSelect SuRe

Для смолы MabSelect SuRe^TM проводили замену буфера в DI воде для того, чтобы создавать ~50% взвесь. Взвесь добавляли в ResiQuot, сушили с использованием домашней вакуумной линии и пробки из смолы 20,8 мкл распределяли в планшет с 96 глубокими лунками. В отдельном 96-луночном планшете создавали белковые растворы между 0 и 10 мг/мл с 100, 250 и 500 мМ каприлата натрия. Концентрацию белка измеряли для каждого раствора, после чего следовало добавление 1 мл в каждую пробку из смолы. Смесь смолы и белка уравновешивали в течение ночи с перемешиванием. Смолу удаляли посредством фильтрования непосредственно в UV 96-луночный планшет и измеряли конечную концентрацию. Концентрацию адсорбированного белка, q, вычисляли с использованием следующего уравнения:

q = (V_{жидкость} (C₀-C_f))/V_смола.

Результаты и обсуждение

Результаты, представленные в этом разделе, показывают, что при высокой концентрации каприлата натрия (>100 мМ) происходит удаление значительно большего количества белка клетки-хозяина (HCP) в ходе хроматографии на белке А, чем в ранее опубликованных буферах для промывки белка A на основе каприлата натрия. Это демонстрировали с использованием нескольких mAb с относительно высокими уровнями HCP в качестве модели, и подтверждали путем постановки статистического эксперимента; CUB (загружаемый белок A) для тестированных mAb имел концентрации HCP между 10⁶ и 10⁷ нг/мг.

Основная цель этой работы состояла в том, чтобы оценивать влияние концентрации каприлата натрия и pH в буфере для промывки на очистку от HCP на стадии хроматографии на белке А. Главные задачи были двоякими. Первая состояла в понимании влияния на HCP в полном рабочем диапазоне концентраций каприлата натрия и pH. Обзорную схему использовали для исследования всего диапазона обоих параметров (таблица 3); максимальная концентрация каприлата натрия составляла 1 M, а диапазон pH составлял 7-9. Вторая задача состояла в том, чтобы оптимизировать концентрацию каприлата натрия и pH для очистки от HCP, при этом сохраняя приемлемый выход на стадии. Сферический центральный композиционный план (CCD, таблица 4) использовали для этой оптимизации. В обзорном и CCD исследованиях использовали mAb1 в качестве модельного mAb. Находки из этих начальных исследований тестировали на дополнительных mAb. Результаты обзорного и CCD исследования представлены далее.

Таблица 3: схема обзорного исследования для исследования концентраций каприлата натрия вплоть до 1 M и pH от 7,0 до 9,0 при промывании белка A.

Номер промывания	Концентрация каприлата натрия (мМ)	pH
1	0	7,0
2	250	7,5
3	500	8,0
4	750	8,5
5	1000	9,0

Таблица 4: сферический центральный композиционный экспериментальный план для того, чтобы оптимизировать концентрацию каприлата натрия и pH при промывании белка A.

Номер промывания	Концентрация каприлата натрия (мМ)	pH
1	150	8,0
2	250	7,0
3	250	8,5
4	500	8,7
5	500	8,0
6	500	7,3
7	750	8,5
8	750	7,5
9	850	8,0

Результаты, полученные в CCD исследовании, представлены в таблице 5. В целом, pH буфера для промывки белка A имел минимальное влияние на очистку от HCP. Промывания, содержащие 500 мМ или 750 мМ каприлата натрия, имели почти идентичные уровни HCP во всем тестируемом диапазоне pH. Статистический анализ осуществляли, как описано в разделе о способах. В кратком изложении, отдельные модели аппроксимировали к каждому ответу (выход и HCP), и параметры модели оценивали при значимости 5% с использованием критерия Фишера. Критерий Фишера подтверждал, что pH при промывании не оказывает статистически значимого эффекта на концентрацию HCP. Схожий анализ также подтверждал, что pH не является значимым фактором для процента выхода.

Таблица 5: результаты центрального композиционного плана для концентрации каприлата натрия и pH в растворах для промывки белка A (тестировали с mAb1).

Концентрация каприлата натрия (мМ)	pH	HCP (нг/мг)	% выхода
150	8,0	205,8	98,7
250	7,5	69,9	87,5
250	8,5	31,4	94,3
500	7,3	17,1	77,4
500	8,0	18,2	75,7
500	8,7	19,0	76,0
750	7,5	17,2	73,7
750	8,5	13,6	74,1
850	8,0	15,5	70,1

Статистический анализ результатов CCD подтверждал, что концентрация каприлата натрия представляет собой значимый фактор - как с линейными, так и с квадратичными членами - как для очистки от HCP, так и для процента выхода. Концентрацию HCP (нг/мг) снижали на два порядка величины, когда концентрацию каприлата натрия увеличивали от 0 до 1 M (фиг. 1 - процент выхода (треугольники, ▲) и концентрация HCP (квадраты, ■)). Однако, когда концентрация каприлата натрия возрастает больше 250 мМ, выход падает с вышеуказанных 90% до 70% (фиг. 1). Это большое снижение выхода стадии при каприлате натрия выше 250 мМ может быть обусловлено формированием каприлатных мицелл. Экспериментально устанавливали, что критическая мицеллярная концентрация каприлата (CMC) в буфере для промывки белка A составляет 340 мМ. Когда концентрация каприлата натрия возрастала с 250 мМ до 500 мМ, имело место 15% снижение выхода и только 2,8% снижение HCP. Это может указывать на то, что свободная форма каприлата натрия представляет собой активную форму для удаления HCP, тогда как любая концентрация выше CMC показывает снижающийся эффект, поскольку каприлатные мицеллы вызывают снижение выхода.

ПРИМЕР 2: Исследование снижения выхода и потенциальные стратегии минимизации

Снижение процента выхода выше CMC подсказывает, что каприлатные мицеллы - вместо свободной формы каприлата - могут снижать выход на стадии с белком A. Для того чтобы определять природу снижения выхода, измеряли концентрацию mAb в элюированной, десорбированной и промытой фракциях для процессов с белком A с использованием различных промываний с каприлатом натрия (фиг. 2). Этот результат демонстрирует, что снижение выхода при высокой концентрации каприлата натрия обусловлено десорбцией в ходе стадии промывания.

Для того чтобы дополнительно охарактеризовать снижение выхода в ходе промывания с высоким каприлатом натрия, измеряли равновесные изотермы связывания для того, чтобы определять снижение емкости mAb при высоких концентрациях каприлата натрия (фиг. 3). Ранее опубликованное промывку с каприлатом - содержащее 100 мМ каприлата натрия - имело максимальную связывающую способность 57 г/л, при аппроксимации с изотермой Ленгмюра. Изотерма адсорбции схожа при 250 мМ каприлата натрия, но при 500 мМ каприлата натрия изотерма Ленгмюра имела неудовлетворительное соответствие. Этот результат подтверждает, что промывания с высокой концентрацией каприлата натрия снижают связывающую способность смолы с белком A и вызывают снижение выхода.

После определения источника снижения выхода, исследовали способы уменьшения снижения выхода. Две стратегии, которые были исследованы, представляли собой сниженный объем промывания и сниженный коэффициент загрузки. Промывку с 250 мМ каприлата натрия тестировали при 4, 6 и 8 CV. Уменьшение длительности промывания от 8 до 4 CV обеспечивало только 2% увеличение выхода (таблица 6) и увеличение концентрации HCP только от 31,0 до 35,8 нг/мг. Это показывало, что промывания с высоким каприлатом натрия позволяют достигать приемлемых уровней HCP при меньших объемах, чем тестировали в ходе начальных обзорных и CCD исследований, и также демонстрировало, что меньшие объемы промывания не компенсируют сниженную связывающую способность при высоких концентрациях каприлата натрия.

Таблица 6: концентрация HCP и выход стадии с белком A для различных объемов промывания с 250 мМ каприлата натрия при использовании mAb1 в качестве модели.

Объем промывания (CV)	HCP (нг/мг)	% выхода
4	35,8	89,7
6	33,0	89,6
8	31,0	87,7

Сниженный коэффициент загрузки в ходе захвата белка A также изучали в качестве минимизации снижения выхода в ходе промываний с высокой концентрацией каприлат натрия (таблица 7). Когда коэффициент загрузки снижали с 30 мг/мл до 10 мг/мл, выход возрастал на 4,7% и 7,7% для промываний с 250 мМ и 500 мМ каприлата натрия, соответственно. Коэффициент загрузки оказывал минимальное влияние на концентрацию HCP в элюате белка A.

Таблица 7: концентрация HCP и выход стадии с белком A для различных коэффициентов загрузки белка A с использованием промываний с 250 мМ и 500 мМ каприлата натрия, используя mAb1 в качестве модели.

Концентрация каприлата натрия (мМ)	Коэффициент загрузки (г/л)	HCP (нг/мг)	% выхода
250	10	42,3	95
250	15	38,1	92,8
250	20	46,3	92,3
250	25	41,9	91,8
250	30	40,2	90,2
500	10	24,5	88,5
500	15	23,4	86,9
500	20	20,2	85,5
500	25	18,6	84,8
500	30	16,9	80,8

ПРИМЕР 3: эффективность усовершенствованного промывания с использованием дополнительных mAb

Предшествующие исследования оптимизации промывания белка A выполняли с использованием только mAb1 в качестве модельного продукта. В CCD исследовании подтверждали, что pH не являлся значимым фактором для удаления HCP. Статистический анализ и последующие исследования выхода показывали, что концентрация каприлата натрия оптимальна вплоть до 400 мМ. Для того чтобы подтверждать усовершенствованное удаление HCP при промывании с 250 мМ каприлата натрия относительно ранее разработанного промывания с 100 мМ каприлата натрия, в этом разделе исследовали дополнительные mAb. Концентрацию HCP в элюате белка A для 5 mAb сравнивали для промываний, содержащих 100 или 250 мМ каприлата натрия (фиг. 4). Источником одного mAb (mAb3) служили два отдельных вышележащих процесса: процесс с высокой плотностью клеток с более высокими уровнями HCP и стандартный процесс, который сравним с другими исследованными молекулами.

За исключением mAb2, все тестируемые здесь mAb имели меньше чем 100 нг/мг в элюате белка A при использовании промывания с 250 мМ каприлата натрия. В большинстве случаев концентрацию HCP усовершенствовали приблизительно на порядок величины просто путем увеличения концентрации каприлата натрия при промывании. Дополнительно, эти mAb имели приемлемые выход стадии и качество продукта с повышенной концентрацией каприлата натрия.

ПРИМЕР 4: добавление аргинина в промывку белка A на основе каприлата натрия

Аминокислота аргинин имеет сильно отличающиеся физические и химические свойства по сравнению с жирной кислотой каприлатом натрия. Предложена гипотеза о том, что структурные различия между этими двумя добавками могут вести к ортогональным механизмам удаления HCP, т. е. смеси аргинина и каприлата могут вызывать более хорошее удаление HCP, чем промывку с использованием только одного компонента. Следующие исследования выполняли для того, чтобы оценивать и общее удаление HCP и удельное удаление HCP для смесей каприлата/аргинина.

Общая очистка от HCP с использованием буфера для промывки белка A с каприлатом/аргинином

Буферы для промывки белка A, содержащие комбинации каприлата натрия и аргинина, тестировали с mAb1 и mAb2. Результаты для mAb2 представлены на фиг. 5. Буферы для промывки белка A, содержащие только 100 мМ каприлата натрия или 750 мМ аргинина, приводили к концентрациям HCP между 700 и 1300 нг/мг. Увеличение концентрации каприлата натрия до 250 мМ приводило к существенному усовершенствованию очистки от HCP - в соответствии результатами для «высокого каприлата натрия», рассмотренным в настоящем описании ранее. Промывку с использованием 250 мМ каприлата натрия при pH 8,5 вело к 273 нг/мг HCP в элюате белка A. Добавление аргинина в промывку белка A на основе каприлата дополнительно усовершенствовало удаление HCP: 250 мМ каприлата натрия с 750 мМ аргинина при pH 7,5 или 8,5 вело к концентрациям HCP 209 и 144 нг/мг, соответственно.

Схожее исследование каприлата/аргинина выполняли с mAb1. Источником mAb1 служили два отдельных вышележащих процесса: «стандартный» порционный биореактор с подпиткой и процесс с высокой плотностью клеток. Процесс с высокой плотностью клеток вел к более высоким титрам продукта и концентрации HCP. Это включали в это исследование в качестве «худшего случая» сырьевого материала. Результаты представлены на фиг. 6.

В целом, результаты для mAb1 схожи с находками для mAb2, представленными на фиг. 5. Как для стандартного подаваемого потока mAb1, так и для материала высокой плотности, усовершенствовали очистку от HCP посредством увеличения каприлата натрия от 100 до 250 мМ. Дополнительно, 500 мМ аргинина обеспечивало более хорошую очистку от HCP, чем любое промывку с использованием только каприлата натрия. Однако промывку с использованием и каприлата натрия и аргинина, или в виде смеси или посредством применения последовательных промываний, демонстрировало усовершенствованную очистку от HCP относительного любого компонента в отдельности. Наивысшей эффективностью обладало промывку с использованием 250 мМ каприлата натрия и 750 мМ аргинина при pH 8,5. Эта комбинация высокого каприлата натрия и аргинина давала элюаты белка A с 113 и 67 нг/мг для mAb1 высокой плотности и стандартного mAb1, соответственно.

ПРИМЕР 5: промывку белка A с использованием каприлата/аргинина для того, чтобы удалять PLBL2

PLBL2 представляет собой конкретную примесь HCP, которую трудно удалять в течение последующей обработки mAb5, IgG4, из-за кажущегося связывания с молекулой продукта. Ранее обнаружено, что эта конкретная примесь HCP связывается с продуктами IgG4 в ходе последующей обработки. PLBL2 также вызывает «нелинейность разведения» в ходе анализа HCP ELISA. Промывания белка A с использованием высоких концентраций каприлата натрия и/или аргинина тестировали на удаление PLBL2 в ходе стадии с белком A для mAb5.

Промывания тестировали с использованием концентраций каприлата натрия вплоть до 750 мМ, pH от 7,5 и 8,5 и концентрации аргинина вплоть до 1 M. Для каждого испытания промывания белка A общая концентрация PLBL2 (фиг. 7, измеряли с использованием PLBL2-специфического ELISA) приведена наряду с общим HCP (фиг. 8) и выходом стадии (фиг. 9).

Концентрация PLBL2 варьировала от почти 1 до 600 нг/мг для различных тестовых промываний. Промывания без использования аргинина и с использованием меньше чем 100 мМ каприлата натрия работали хуже всего и давали элюат белка A с PLBL2 приблизительно 600 нг/мг. Увеличение концентрации каприлата натрия до 250 мМ снижало PLBL2 до ~100 нг/мг; концентрации каприлата натрия больше чем 250 мМ продолжали снижать PLBL2 до ~50 нг/мг, но также вели к снижению выхода. Общий HCP также в целом снижался при увеличении каприлата натрия.

Промывания белка A с использованием аргинина были наиболее успешными в отношении очистки от PLBL2, и они также демонстрировали хорошее удаление общего HCP. 1000 мМ аргинина без каприлата натрия приводил к ~10 нг/мг PLBL2 и 62 нг/мг HCP. Высокая концентрация аргинина не вызывает значимое снижение выхода.

Комбинация каприлата натрия и аргинина являлась наиболее эффективным промывкум для mAb5. В частности, 250 мМ каприлата натрия с 1 M аргинина при pH 7,5 или 8,5 приводили к 2-3 нг/мг PLBL2 и ~20-30 нг/мг HCP, при этом сохраняя выход стадии ~90%. Промывания с использованием 1 M аргинина и 100 мМ каприлата натрия также были успешными, но вели к слегка более высоким концентрациям PLBL2 и HCP.

ПРИМЕР 6: промывку с использованием каприлата/аргинина для снижения активности катепсина L

Промывания белка A с использованием каприлата натрия и аргинина тестировали с mAb3 на способность к очистке от катепсина L. Протеаза катепсин L образуется в ходе клеточной культуры CHO и она потенциально может разрушать молекулу продукта mAb3. Показано, что не происходит удаления катепсина L из mAb3 в ходе процесса с белком A. Тестировали промывания с использованием 100 мМ каприлата натрия, 250 мМ каприлата натрия, 100 мМ каприлата натрия с 1000 мМ аргинина и 100 мМ каприлата натрия с 750 мМ лизина.

Промывания с использованием 250 мМ каприлата натрия для этого конкретного продукта вели к неожиданному поведению при элюировании из белка A: элюирование при низком pH, обычно завершающееся за ~2 объема колонки, длилось более 10 объемов колонки. Дополнительно, mAb3 элюат белка A имел очень высокую агрегацию (измеряли посредством SEC), когда тестировали промывку с использованием 250 мМ каприлата натрия. Это поведение не наблюдали для любых других продуктов, которые тестировали при промывании с использованием высокого каприлата натрия.

Промывания белка A с использованием аргинина или лизина не имели протяженного поведения элюирования, которое наблюдали при использовании только 250 мМ каприлата натрия. Активности катепсина L, измеряемые в элюатах белка A, для трех различных промываний (100 мМ каприлата («платформенный msss элюат»); 250 мМ каприлата, 1 M аргинина («msss элюат с каприлатом/аргинином»); 250 мМ каприлата, 750 мМ лизина («msss элюат с каприлатом/лизином»)) приведены на фиг. 10; объемы элюирования белка A перечислены в таблице 8. Измеряемая активность значительно снижалась при промывании с использованием 100 мМ каприлата натрия, 1000 мМ аргинина, и последующее исследование стабильности показывало, что фрагментация снижалась для материала, полученного с использованием этого промывания, по сравнению с промывкум с использованием 100 мМ каприлата натрия. Добавление 750 мМ лизина вместо аргинина успешно снижало большой объем элюирования, но не значительно снижало активность катепсина L. Комбинация каприлата натрия и 1000 мМ аргинина обеспечивает усовершенствованный катепсин L и общую очистку от HCP, при этом сохраняя атрибуты обоснованного объема элюирования и приемлемого качества продукта.

Таблица 8: объем элюата белка A для mAb3 при использовании различных растворов для промывки.

Промывку	Объем элюирования (CV)
100 мМ каприлата натрия	1,73
250 мМ каприлата натрия	9,89
250 мМ каприлата натрия, десорбция, используемая для элюирования	5,41
250 мМ каприлата натрия, 90 мМ аргинина	3,95
250 мМ каприлата натрия, затем 90 мМ аргинина	9,75
250 мМ каприлата натрия, 750 мМ лизина	1,95
250 мМ каприлата натрия, 1 M аргинина	1,59
100 мМ каприлата натрия, 1 M аргинина	1,49

Пример 7: Промывку белка A с использованием каприлата/аргинин для удаления HCP

Промывания белка A с использованием каприлата натрия и аргинина тестировали с mAb3 на способность к очистке от HCP. Концентрации буфера для промывки и получаемые концентрации HCP приведены далее в таблице 9. Промывку с использованием аргинина/каприлата сравнивали с промываниями для mAb3 с использованием только каприлата.

Промывку с использованием 150 мМ каприлата обеспечивает значительно более высокую очистку от HCP, чем промывку с использованием 100 мМ каприлата. Комбинация 1,1 M аргинина и 150 мМ каприлата дополнительно усовершенствует очистку от HCP в значительное число раз. Усовершенствованная очистка от HCP в ходе стадии с белком A позволяла убрать конечную хроматографическую стадию дополнительной очистки, которая необходима в процессе с использованием только каприлата.

Таблица 9

Каприлат (мМ)	Аргинин (M)	HCP (нг/мг)
150	1,1	97,3
150	0	556,0
100	0	907,0

Пример 8: снижение фрагментации mAb3

Очистку mAb3 на белке A промываниями с использованием каприлата натрия и аргинина тестировали на фрагментацию антитела в ходе очистки. Получали данные (фиг. 11-13), охватывающие 3 партии буфера для промывки, содержащего 100 мМ каприлата, и 2 партии буфера для промывки, содержащего 150 M каприлата+1,1 M аргинина.

На фиг. 11 представлен процент фрагментации антитела (измеряли с использованием SEC HPLC) на всем протяжении всего последующего процесса. На фиг. 12 представлена концентрация HCP в ходе процесса. Партии с каприлатом/аргинином не имеют значимого формирования фрагментации антитела в ходе процесса, тогда как партии с только каприлатом имеют значимое образование фрагментации антитела после третьей стадии дополнительной очистки (не нужна при промывании с использованием каприлата/аргинина).

Кроме того, сравнивали стабильность нефасованного лекарственного вещества, полученного с помощью обоих процессов (только каприлат и каприлат+аргинин). Нефасованное лекарственное вещество из процесса с каприлатом и аргинином не образует фрагментацию антитела в пределах 10 суток при 25 градусах по Цельсию; нефасованное лекарственное вещество из процесса с только каприлатом образует значимую фрагментацию антитела в течение 10 суток при 25 градусах по Цельсию (фиг. 13).

Комбинация каприлата и аргинин в буфере для промывки значительно снижает образование фрагментации антитела на всем протяжении последующего процесса из-за усовершенствованной очистки от катепсина L.

Заключение

Очистку от HCP на стадии с белком A оптимизировали посредством модификации буфера для промывки, чтобы минимизировать взаимодействия HCP-mAb. Начальные скрининговые исследования показывали, что pH буфера для промывки белка A, варьировавший от 7 до 9, не оказывает значительного влияния на очистку от HCP или выход стадии. Концентрация каприлата натрия оказывает сильный эффект как на выход стадии, так и на удаление HCP. При очень высоких концентрациях каприлата натрия (выше CMC) очистка от HCP оптимальна, но выход стадии очень низок. В этом исследовании обнаруживали, что использование промывания белка A с использованием 250 мМ каприлата натрия дает большое усовершенствование в очистке от HCP по сравнению с ранее использованными промываниями с использованием 100 мМ каприлата натрия, при этом сохраняя приемлемый выход стадии. В этом исследовании также обнаруживали, что промывания белка A с использованием комбинации 250 мМ каприлата натрия и 500-1000 мМ аргинина обеспечивают более высокую очистку от HCP по сравнению с промываниями с использованием только каприлата натрия. Обнаружено, что промывания белка A с использованием каприлата натрия и аргинина успешно удаляют катепсин L и PLBL2, две особенно сложные примеси HCP, из mAb3 и mAb5, соответственно.

Понятно, что варианты осуществления, описанные в настоящем описании, можно применять ко всем аспектам изобретения. Кроме того, все публикации, включая в качестве неограничивающих примеров патенты и патентные заявки, цитированные в этом описании, включены в настоящее описание посредством ссылки, как если бы они были изложены полностью.

1. Способ очистки рекомбинантного полипептида от белков клетки-хозяина (HCP), где способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель, (b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим по меньшей мере 75 мМ каприлата и больше чем 0,5 M аргинина; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя, где суперантиген выбран из группы, состоящей из белка А, белка G и белка L.

2. Способ по п.1, где каприлат представляет собой каприлат натрия.

3. Способ по любому из пп.1 или 2, где буфер для промывки содержит по меньшей мере 100 мМ каприлата натрия.

4. Способ по п.1, где буфер для промывки содержит от 75 мМ до 300 мМ каприлата.

5. Способ по любому из пп.1-4, где буфер для промывки содержит от 0,75 M до 1,5 M аргинина.

6. Способ по любому из пп.1-5, где буфер для промывки дополнительно содержит от 0,5 M до 1 M лизина.

7. Способ по любому из пп.1-6, где элюируемый рекомбинантный полипептид содержит меньше чем 2% фрагментированного рекомбинантного полипептида.

8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где HCP происходит из клетки млекопитающего.

9. Способ по любому из предыдущих пунктов, где HCP представляет собой фосфолипаза-B-подобный 2 белок.

10. Способ по любому из пп.1-8, где HCP представляет собой катепсин L.

11. Способ по п.10, где очистку рекомбинантного полипептида от катепсина L измеряют по сниженной активности катепсина L в элюате со стадии (c).

12. Способ по любому из предыдущих пунктов, где pH буфера для промывки составляет между pH 7-9; или pH 7,5-8,5.

13. Способ по любому из предыдущих пунктов, где рекомбинантный полипептид представляет собой моноклональное антитело (mAb).

14. Способ по п.13, где mAb представляет собой IgG1 или IgG4.

15. Способ по любому из предшествующих пунктов, где буфер для промывки не содержит хлорид натрия.

16. Способ по любому из предшествующих пунктов, где после стадии (c) количество HCP составляет меньше чем 200 нг HCP/мг продукта.

17. Способ очистки рекомбинантного полипептида от белков клетки-хозяина (HCP), где способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель; (b1) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим по меньшей мерее 75 мМ каприлата; (b2) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим больше чем 0,5 M аргинина; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя, где суперантиген выбран из группы, состоящей из белка А, белка G и белка L.

18. Способ очистки рекомбинантного полипептида от белков клетки-хозяина (HCP), где способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель; (b1) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим больше чем 0,5 M аргинина; (b2) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим по меньшей мерее 75 мМ каприлата; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя, где суперантиген выбран из группы, состоящей из белка А, белка G и белка L.

19. Способ очистки рекомбинантного полипептида от фосфолипаза-B-подобного 2 белка, где способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель, (b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим 100 мМ каприлата и 1,1 M аргинина; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя, где суперантиген выбран из группы, состоящей из белка А, белка G и белка L.

20. Способ очистки рекомбинантного полипептида от катепсина L, где способ включает: (a) нанесение раствора, содержащего рекомбинантный полипептид и HCP, на суперантигенный хроматографический твердый носитель,

(b) промывку суперантигенного хроматографического твердого носителя буфером для промывки, содержащим 150 мМ каприлата и 1,1 M аргинина; и (c) элюирование рекомбинантного полипептида из суперантигенного хроматографического твердого носителя, где суперантиген выбран из группы, состоящей из белка А, белка G и белка L.