Антитела, специфичные к гиперфосфорилированному тау-белку, и способы их применения

Авторы патента:

ПЕДЕРСЕН, Ян, Торлейф (DK)

ПЕДЕРСЕН, Ларс, Остергаард (DK)

ДЖУХЛ, Карстен (DK)

МАРИГО, Мауро (DK)

КЬЯЕРГААРД, Кристиан (DK)

АСУНИ, Абдур-Рашид (DK)

РОЗЕНКВИСТ, Нина, Хелен (DK)

ДЭЧСЕЛ, Юстус, Клаус, Альфред (DK)

ТАГМОСЕ, Лена (DK)

ЙЕНСЕН, Томас (DK)

КРИСТЕНСЕН, Сорен (DK)

ДАВИД, Лаурент (DK)

ФОЛЬБРАХТ, Кристиан (DK)

ХЕЛЬБО, Лоун (DK)

C07K16/18 - против материала из животных или человека

A61P25/28 - для лечения нейродегенеративных заболеваний центральной нервной системы, например ноотропные агенты, агенты для усиления умственных способностей, для лечения болезни Альцгеймера или других форм слабоумия

A61P25/16 - для лечения болезни Паркинсона

Владельцы патента RU 2760875:

Х. ЛУНДБЕКК А/С (DK)

Изобретение относится к области биохимии, в частности к моноклональному антителу, которое специфически связывается с патогенным гиперфосфорилированным тау-белком. Также раскрыто применение указанного антитела для лечения таупатии и для лечения болезни Альцгеймера. Изобретение обладает способностью эффективно лечить заболевания, ассоциированные с тау-белком. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 11 пр., 6 табл., 26 ил.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0001] Настоящее изобретение относится к новому классу моноклональных антител, которые специфически связываются с фосфорилированным сериновым остатком 396 в патологическом гиперфосфорилированном (PHF) тау-белке (pS396), а также к способам применения этих молекул и их фрагментов, связывающих тау-белок, в лечении болезни Альцгеймера и таупатий.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Настоящая заявка содержит один или несколько перечней последовательностей в соответствии с 37 C.F.R 1.821 и далее, которые раскрыты на машиночитаемых носителях (название файла: 1049-WO-PCT_FINAL_ST25_1.txt, создан 13 июня 2017 года и имеет размер 65 кБ), при этом данный файл включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Возрастные нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера (AD) и деменция, в настоящее время являются одной из крупнейших общественных проблем. По оценкам Всемирной организации здравоохранения стоимость лечения лиц старшего возраста будет продолжать повышаться, и количество диагностированных случаев деменции утроится к 2050 году (World Health Organization and Alzheimer's Disease International - Status Report (2012) DEMENTIA: A public health priority, WHO). Первыми средствами лечения AD были модуляторы высвобождения нейромедиаторов, такие как ингибиторы ацетилхолинэстеразы, и модуляторы NMDA-рецепторов. Эти терапевтические средства стали доступными на рубеже тысячелетий и по-прежнему образуют краеугольный камень облегчения симптомов дефицитов памяти, связанных с деменцией и AD. Тем не менее, эти лекарственные средства не воздействуют целенаправленно на первопричины AD: накопление агрегатов β-амилоидного (Аβ) пептида и тау-белка и ассоциированную с ним утрату нейронных синапсов и в конечном счете нейронов.

[0004] Долгосрочные исследования в широком общественном масштабе с участием лиц старшего возраста (Weiner, M.W. et al. (2014) ADNI online: http://www.adni-info.org/; Breteler, M.M. et al. (1992) Neuroepidemiology 11 Suppl 1, 23-28; Launer, L.J. (1992) Neuroepidemiology 11 Suppl 1, 2-13) наряду с масштабными полногеномными исследованиями ассоциаций (Lambert, J.С.et al. (2013) Nat. Genet. 45, 1452-1458) показали, что AD представляет собой неоднородную комбинацию форм деменции, где до 10 процентов пациентов с запущенной формой AD не имеют патологии амилоидного пептида (Crary, J.F. et al. (2014) Acta Neuropathol. 128, 755-766). Дополнительно, фундаментальные патологоанатомические исследования, проведенные Braak и Braak (Braak, Н. and Braak, Е. (1996) Acta Neurol. Scand. Suppl 165, 3-12), продемонстрировали четкую корреляцию между степенью патологии нейрофибриллярных клубков и когнитивным статусом перед вскрытием. Эти наблюдения подкреплялись несколькими исследователями (Nelson, Р.Т. et al. (2012) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 71, 362-381) и в недавних долгосрочных исследованиях биомаркеров, которые указывают на то, что уровни тау-белка и гиперфосфорилированного тау-белка в спинномозговой жидкости (CSF) повышаются на протяжении ранних и поздних стадий заболевания (Jack, C.R., Jr. et al. (2013) Lancet Neurol. 12, 207-216).

[0005] Как указано выше, тау-белок, ассоциированный с микротрубочками, и его гиперфосфорилированный вариант образуют основную составляющую внутриклеточных нейрофибриллярных клубков, которые являются одним из главных характерных признаков AD. Дополнительно, определенные варианты гена тау-белка ассоциированы с семейными формами лобно-височной деменции (FTD). Появление патологии тау-белка при AD происходит в соответствии с четко выраженным пространственным паттерном, начиная с энторинальной коры с последующим переходом в гиппокампальные и корковые зоны (Braak, Н. and Braak, Е. (1996) Acta Neurol. Scand. Suppl 165, 3-12). Конкретная стадия патологии тау-белка также хорошо коррелирует с когнитивными способностями (Nelson, Р.Т. et al. (2012) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 71, 362-381; Braak, E. et al. (1999) Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. 249 Suppl 3, 14-22). Взятые вместе эти данные составляют основу гипотезы, опирающейся на то, что тау-белок играет определенную роль в AD. Она подразумевает, что внутриклеточное накопление тау-белка приводит к разрушению микротрубочек и коллапсу дендритных шипиков. В результате этого нарушается коммуникация между нейронами и наступает гибель клеток. Недавно также было показано, что тау-белок сам по себе может образовывать эндопатогенные молекулы, которые могут способствовать распространению нейродегенерации от одной клетки к следующей (Clavaguera, F. et al. (2009) Nat. Cell Biol. 11, 909-913).

I. Тау-белок в качестве эндопатогена

[0006] Clavaguera и соавторы продемонстрировали, что тау-белок сам по себе может действовать в качестве эндопатогена (Clavaguera, F. et al. (2009) Nat. Cell Biol. 11, 909-913). Экстракты головного мозга, получаемые при низкой скорости центрифугирования, выделяли из трансгенных по тау-белку мышей P301S (Allen, В. et al. (2002) J. Neurosci. 22, 9340-9351), разбавляли и инъецировали в гиппокамп и корковые зоны молодых мышей ALZ17. Мыши ALZ17 представляют собой трансгенную по тау-белку линию мышей, у которых развивается только поздняя форма патологии (Probst, A. et al. (2000) Acta Neuropathol. 99, 469-481). У подвергнутых инъекции мышей ALZ17 быстро развивалась патология плотных филаментов, и введение иммуноистощенных по тау-белку экстрактов головного мозга от мышей P301S или экстрактов от мышей дикого типа не индуцировало патологию тау-белка. Фракционирование экстрактов головного мозга на растворимый (S1) и нерастворимый в саркозиле (Р3) тау-белок (Sahara, N. et al. (2013) J. Alzheimer's. Dis. 33, 249-263) и их инъекция мышам ALZ17 продемонстрировали, что фракция Р3 в наибольшей степени способна индуцировать патологию. Она содержит большую часть внутриклеточного гиперфосфорилированного филаментозного тау-белка. Патологию в большинстве случаев также можно было индуцировать при инъекции экстрактов от P301S в головной мозг мышей дикого типа, но NFT не образовывались. В последующих исследованиях Clavaguera и соавт.показали, что человеческий тау-белок, экстрагированный посмертно из ткани головного мозга с другими таупатиями (болезнью аргирофильных зерен (AGD), прогрессирующим надъядерным параличом (PSP) и кортикобазальной дегенерацией (CBD)), также может индуцировать патологию тау-белка в модели ALZ17 (Clavaguera, F. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 9535-9540). С момента представления этих данных сообщалось о некоторых других моделях затравочного действия и разнесения тау-белка (Ahmed, Z. et al. (2014) Acta Neuropathol. 127, 667-683; Walker, L.C. et al. (2013) JAMA Neurol. 70, 304-310). Основной вывод этих исследований указывает на механизм, посредством которого патогенный тау-белок во внутриклеточных включениях секретируется из клетки в периплазматическое пространство. Патологический материал тау-белка затем транспортируется по оболочке синаптических пузырьков как в антероградном, так и в ретроградном направлении и впоследствии поглощается соседними клетками путем объемного эндоцитоза. Этот механизм объясняет, почему разнесение патологии, наблюдаемое при заболевании у человека, следует четко выраженному анатомическому паттерну. Весьма любопытно, что периферическое введение патологического тау-белка может ускорять формирование патологии тау-белка у мышей ALZ17 (Clavaguera, F. et al. (2014) Acta Neuropathol. 127, 299-301). Этот механизм разнесения может объяснять распространение заболевания при других протеинопатиях (Goedert, М. era/. (2010) Trends Neurosci. 33, 317-325; Sigurdsson, E.M. et al. (2002) Trends Mol. Med. 8, 411-413).

II. Молекулы тау-белка

[0007] Обнаружение того, что тау-белок может действовать в качестве эндопатогена, побудило к поиску "патогенных молекул", на которые можно нацеливаться в рамках потенциальных методов интервенционной терапии.

[0008] Ген тау-белка, ассоциированного с микротрубочками (МАРТ), расположен на хромосоме 17 в человеческом геноме и экспрессирует шесть изоформ тау-белка в головном мозге взрослого человека. Эти изоформы образуются в результате альтернативного сплайсинга экзонов 2, 3 и 10 из 16 экзонов в гене МАРТ. Экзоны 2 и 3 экспрессируют повтор из 29 аминокислот, а экзон 10 экспрессирует дополнительный домен, связывающийся с микротрубочками. В результате этого изоформы тау-белка будут содержать 0, 1 или 2 N-концевых повтора и 3 или 4 С-концевых домена, связывающихся с микротрубочками (тау-белок 3R или 4R). Обычно экспрессируются шесть изоформ тау-белка. Наиболее длинная (2N4R) и наиболее короткая (0N3R) изоформы состоят из 441 и 352 аминокислот соответственно (Kolarova, М. et al. (2012) Int. J. Alzheimers. Dis. 2012, 731526). N-концевой выступающий домен тау-белка (2N4R) состоит из "хвоста" с высоким содержанием глицина из 44 аминокислот и остатков 45-102, охватывающих две высококислые области (N1, N2-домены). В остатках 151-243 обнаружены две области, богатые пролином (Р1, Р2-домены). Остальную часть белка составляют четыре домена, связывающихся с микротрубочками (R1-R4), за которыми расположена короткая С-концевая область.

[0009] Тау-белок является растворимым и высоколабильным в отношении фосфорилирования белком. Примерно 20 процентов или 85 аминокислотных остатков в наиболее длинной изоформе тау-белка являются потенциальными (Ser, Thr или Tyr) сайтами фосфорилирования. Экспериментально наблюдалось, что примерно половина из них фосфорилируется (Hanger, D.P. et al. (2009) Trends Mol. Med. 15, 112-119; Hasegawa, M. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 17047-17054), и что сайты фосфорилирования группируются вокруг концевых остатков доменов, связывающихся с микротрубочками. Тау-белок подвергается динамичному фосфорилированию и дефосфорилированию в ходе клеточного цикла. Он должен диссоциировать из микротрубочек, чтобы обеспечить прохождение митоза. Его основной ролью в постмитотических клетках (дифференцированных нейронах) является действие в качестве стабилизатора микротрубочек, что обеспечивает оптимальный аксональный транспорт. Он может ассоциировать с микротрубочками только в своей главным образом дефосфорилированной форме, поэтому фосфорилирование выступает в качестве непосредственного переключателя ассоциации с микротрубочками/диссоциации из микротрубочек в нейроне. В нормальных условиях цитозольный тау-белок в среднем содержит два фосфорилированных сайта. В материале парных спиральных филаментов по меньшей мере 7-8 сайтов являются фосфорилированными (Hanger, DP. et al. (2009) Trends Mol. Med. 15, 112-119; Hasegawa, M. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 17047-17054). Парные спиральные филаменты гиперфосфорилированного тау-белка являются ключевой характерной особенностью болезни Альцгеймера (Kosik et. al. (1986) PNAS, 86, 4044-4048), в иммуноцитохимическом анализе материала головного мозга человека с AD наблюдается четко выраженный сдвиг подвижности гиперфосфорилированного тау-белка.

[0010] Исследование тау-белка с помощью традиционных структурных методик, таких как рентгеновская кристаллография или спектроскопия ЯМР, было затруднительным, что отражает его метастабильную природу. Такие исследования проводились главным образом в отношении фрагментов доменов нефосфорилированного тау-белка. Единственное до настоящего времени структурное исследование полноразмерного тау-белка (2N4R) с помощью спектроскопии ЯМР выявило, что белок содержит только редкие фрагменты стабильной вторичной структуры (Mukrasch, M.D. et al. (2009) PLoS. Biol. 7, e34). Этот анализ указывает на то, что вторичная структура пептидного остова обладает высокой склонностью принимать структуру β-листа. Первые 200 остатков остова являются значительно более упорядоченными, чем С-конец, охватывающий домены, связывающиеся с микротрубочками. Наличие большого количества специфических взаимодействий дальнего порядка в белке в растворе указывает на то, что он существует в сильно разупорядоченном состоянии расплавленной глобулы (Ohgushi, М. and Wada, А. (1983) FEBS Lett. 164, 21-24).

[0011] В материале клубков были идентифицированы продукты расщепления тау-белка протеазами, образующиеся, в частности, под действием каспазы и кальпаина (Asp13, Glu391 и Asp421) (Gamblin, Т.С. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10032-10037). В частности, усечение no Asp421 подробно изучалось с применением антитела С3 к тау-белку, которое связывается со свободным концом Asp421. Было предположено, что это усечение является ранним событием в патогенезе AD, ассоциированным с индукцией апоптоза (deCalignon A. et al. (2010) Nature 464, 1201-1204). N-концевое расщепление по Asp13 и С-концевое расщепление по Glu391 считаются поздними событиями в патогенезе (deCalignon A. et al. (2010) Nature 464, 1201-1204; Delobel, P. et al. (2008) Am. J. Pathol. 172, 123-131). Недавно в CSF от пациентов с AD и PSP был идентифицирован дополнительный N-концевой фрагмент (остатки 1-224), и была выдвинута гипотеза, что он является ранним маркером заболевания и особенно патогенным (US 14/092539; Bright, J. et al. (2014) Neurobiol. Ageing, 1-17). Об аналогичном фрагменте, образующемся в результате расщепления кальпаином, сообщали другие группы (Ferreira, A. and Bigio, Е.Н. (2011) Mol. Med. 17, 676-685; Reinecke, J.В. et al. (2011) PLoS. One. 6, e23865).

[0012] Было выдвинуто предположение, что, помимо гиперфосфорилирования и фрагментации тау-белка, посттрансляционное ацетилирование (Cohen, T.J. et al. (2011) Nat. Commun. 2, 252; Min, S.W. et al. (2010) Neuron 67, 953-966) и O-GlcNAc-илирование (Zhu, Y. et al. (2014) J. Biol. Chem.) являются процессами, определяющими патологию, при формировании патологии клубков, ассоциированной с AD.

III. Виды иммунотерапии с применением тау-белка

[0013] Виды иммунотерапии традиционно разделяются на пассивные и активные подходы к вакцинации. При активном подходе к вакцинации патогенное средство или его инактивированную патогенную форму вводят пациенту путем инъекции, и иммунная система вызывает иммунный ответ. Это запускает созревание В-клеток, вырабатывающих высокоаффинные антитела к введенному антигену или клеточный ответ к таковому. При пассивном подходе к вакцинации запуска иммунной системы избегают путем инфузии антитела, специфичного к антигену. Собственная система очищения организма затем удаляет связанный с антителом лиганд.

[0014] AC Immune предоставляет моноклональное мышиное антитело к фосфосерину-409 тау-белка. Определяли профиль антител к антигенам ткани головного мозга человека с AD и контрольной ткани головного мозга, и их отбирали на основании их способности к распознаванию патологии клубков. Оба гуманизированных варианта двух антител hACI-36-2B6-Ab1 и hACI-36-3A8-Ab1 связываются с эпитопом тау-белка в пределах аминокислот 401-418 (WO 2013/151762).

[0015] Группа Roger Nitsch выделила аутоантитела к тау-белку от пожилых здоровых индивидуумов без признаков дегенеративной таупатии. Был выделен ряд антител с применением полноразмерного рекомбинантного человеческого тау-белка (2N4R) для обнаружения антител, специфичных к тау-белку. Их потом подвергали скринингу в отношении их способности к проведению различий между изолятами тау-белка от больных и здоровых индивидуумов. Три лидерных антитела 4Е4, 4А3 и 24 В2 были описаны в патентной литературе (WO 2012049570; US 2012087861). Картирование их эпитопов указывает на то, что все они распознают аминокислоты в пределах области связывания с микротрубочками и в С-концевом направлении от него в положениях от V339 до K369. Эти антитела не проявляют какую-либо фосфоспецифичность.

[0016] C2N Diagnostics фокусируется главным образом на разработке средств диагностики для раннего выявления нейродегенеративного заболевания. Получали антитела к полноразмерному человеческому и мышиному тау-белку. Идентифицировали восемь и пять антител, соответственно распознающих человеческий и мышиный тау-белок (Yanamandra, K. et al. (2013) Neuron 80, 402-414). Три антитела с разными показателями кинетики связывания отбирали для оценивания in vivo. А именно это были HJ9.3, HJ9.4 и HJ8.5, распознающие соответственно остатки 306-320, 7-13 и 25-30 тау-белка, при этом последнее (HJ8.5) является специфичным к человеческому тау-белку. Антитела также отбирали на основании их способности к предупреждению переноса патологии в оригинальном механизированном репортерном анализе трансцеллюлярного распространения патологии тау-белка (Sanders, D.W. et al. (2014) Neuron 82, 1271-1288; Kfoury, N. et al. (2012) J. Biol. Chem. 287, 19440-19451). Их оценивание в исследованиях с длительной i.c.v. инъекцией у трансгенных по P301S мышей продемонстрировало их способность к уменьшению уровней гиперфосфорилированного тау-белка, определенную в иммуногистохимическом анализе обработанных мышей.

[0017] Антитела Peter Davies изначально разрабатывали как средства диагностики, которые могут обеспечивать установление различий между патологическим и нормальным тау-белком в материале головного мозга от субъектов с AD и контрольном материале головного мозга (Greenberg, S.G. and Davies, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 5827-5831). Оценивание терапевтической полезности антител PHF1 и МС1 было продемонстрировано у мышей P301S и JPNL3 (P301L) (Boutajangout, A. et al. (2011) J. Neurochem. 118, 658-667; Chai, X. et al. (2011) J. Biol. Chem. 286, 34457-34467; D'Abramo, C. et al. (2013) PLoS. One. 8, e62402). PHF1 распознает линейный эпитоп фосфорилированного тау-белка (pS396, pS404), тогда как МС1 представляет собой конформационно-зависимое антитело, которое распознает структурный эпитоп тау-белка, для которого требуются две отдельные части линейной последовательности, эпитоп в пределах остатков 46-202 и С-концевой эпитоп пределах остатков 312-342 возраста 3 недель, а мышей P301L обрабатывали в течение 7 месяцев посредством еженедельных инъекций, начиная с возраста 4 месяцев. У мышей K3, обработанных антителом IgG2a/k к pS404, наблюдали уменьшение количества положительных по тау-белку нейрофибриллярных включений. Оба pS404-специфичные антитела были способны уменьшать уровень pS422-положительного тау-белка, тогда как у мышей, обработанных панспецифическим антителом к тау-белку, уменьшение не наблюдалось. Эти исследования позволяют предположить, что: 1) очищение от тау-белка может зависеть от изотипа антитела, и 2) может быть важным целенаправленное воздействие на молекулы тау-белка, имеющие отношение к заболеванию, поскольку общее антитело к тау-белку было не способно уменьшать уровни гиперфосфорилированного тау-белка (PCT/US2014/025044).

[0021] Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что антитела, специфичные к фосфорилированному сериновому остатку 396 тау-белка (pS396), являются эффективными в моделях заболеваний; в этом состоит отличие от антител из предшествующего уровня техники, которые распознают главным образом тау-белки, фосфорилированные как по остатку 396, так и по остатку 404, фосфорилированные только по остатку 404 или по другим остаткам тау-белка.

[0022] Авторы настоящего изобретения разработали антитела, которые дополнительно характеризуются значительной специфичностью и селективностью в отношении патологического человеческого тау-белка. Антитела по настоящему изобретению демонстрируют намного более высокую степень специфичности и селективности в отношении патологического человеческого тау-белка по сравнению с непатологическим тау-белком, чем антитела из WO 2013/050567 (см. фигуру 1 из WO 2013/050567). Образование антител из WO 2012/045882, которые, как сообщалось, характеризуются специфичным связыванием, вызывалось в ответ на аминокислотные последовательности с 6-9 остатками из аминокислот 393-401, 396-401, 394-400 и 393-400 тау-белка. Это входит в противопоставление с антителами по настоящему изобретению, образование которых происходит в ответ на патогенный гиперфосфорилированный тау-белок, содержащий более длинную аминокислотную последовательность, описанную в данном документе.

[0023] Дополнительно, антитела и их эпитопсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению демонстрируют множество преимущественных признаков, таких как способность к проведению различий между патологическим и непатологическим человеческим тау-белком и, в частности, к связыванию с тау-белком, ассоциированным с альцгеймеровской (AD) патологией. В электрофизиологических исследованиях антитела и их эпитопсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению были дополнительно способны устранять уменьшенные парное облегчение и самопроизвольный миниатюрный возбуждающий синаптический ток (mEPSC).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0024] Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам и их эпитопсвязывающим фрагментам, способным специфически связываться с фосфорилированным сериновым остатком 396 человеческого тау-белка (изоформы 2N4R) (SEQ ID NO: 1). Антитела дополнительно характеризуются своей способностью различать фосфорилированные остатки 396 и 404, так что они практически не связываются с фосфорилированным остатком 404.

[0025] Антитела по настоящему изобретению являются селективными в отношении патологического тау-белка в присутствии непатологического, но при этом фосфорилированного, тау-белка. Антитела по настоящему изобретению способны вызывать селективное истощение клубков тау-белка из патологического тау-белка в присутствии нормального тау-белка. Без ограничения какой-либо конкретной теорией полагают, что истощение клубков тау-белка, содержащих тау-белок, который был фосфорилирован в положении 396 тау-белка, предупреждает затравочное действие патологического тау-белка с образованием клубков тау-белка. Соответственно, один аспект настоящего изобретения относится к антителу, способному селективно связываться с фосфорилированным в положении 396 тау-белком даже в тех случаях, когда такие молекулы находятся в присутствии тау-белка, который был фосфорилирован в положении 404 тау-белка. Связанный аспект настоящего изобретения относится к антителу, способному селективно связываться с фосфорилированным в положении 396 тау-белком даже в тех случаях, когда такие молекулы находятся в присутствии непатогенного тау-белка. Как определено дополнительно, настоящее изобретение относится к антителу, селективному в отношении патологического тау-белка, при этом указанный патологический тау-белок является гиперфосфорилированным тау-белком, появляющимся в виде полосы, соответствующей 64 кДа (в вестерн-блот-анализе), у трансгенных мышей, сверхэкспрессирующих изоформу 2N4R человеческого тау-белка.

[0026] Один аспект настоящего изобретения направлен на антитело к тау-белку, которое при применении с иммуноистощенными экстрактами от трансгенных мышей rTg4510 специфично уменьшает полосы гиперфосфорилированного тау-белка размером 64 кДа и 70 кДа на по меньшей мере 90%, уменьшая при этом полосу тау-белка размером 55 кДа не более чем на 10%. Дополнительный аспект настоящего изобретения направлен на антитело к тау-белку, которое специфично уменьшает полосы гиперфосфорилированного тау-белка размером 64 и 70 кДа по меньшей мере на 90%, уменьшая при этом полосу тау-белка размером 55 кДа не более чем на 10%; или которое при применении согласно описанному в данном документе с посмертными экстрактами головного мозга от людей с AD обладает способностью к специфичному уменьшению полос гиперфосфорилированного в pS396 тау-белка по меньшей мере на 90% без уменьшения при этом полос негиперфосфорилированного тау-белка более чем на 10%.

[0027] Другой аспект настоящего изобретения направлен на способ лечения пациента с таупатией, такой как болезнь Альцгеймера, включающий истощение клубков или ослабление прогрессирования образования указанных клубков, при этом указанные клубки содержат гиперфосфорилированный тау-белок, при этом указанный способ включает приведение гиперфосфорилированного тау-белка в контакт с антителом по настоящему изобретению таким образом, что клубки истощаются, содержание в них гиперфосфорилированного тау-белка уменьшается или прогрессирование образования клубков ослабляется.

[0028] Как определено в качестве альтернативы, настоящее изобретение относится к способу лечения пациента с таупатией, такой как болезнь Альцгеймера, при этом указанный способ включает приведение клубков в контакт с антителом, селективным в отношении тау-белка, имеющего фосфорилированный остаток 396, таким образом, что в клубках происходит истощение по гиперфосфорилированному тау-белку.

[0029] Один аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело к гиперфосфорилированному человеческому тау-белку или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(b) CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 47;

(d) CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 55;

(e) CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 56; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 54 и SEQ ID NO: 57.

[0030] Один аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело к гиперфосфорилированному человеческому тау-белку или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) легкую цепь, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23; и

(b) тяжелую цепь, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27.

[0031] Дополнительный аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело к гиперфосфорилированному человеческому тау-белку или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

[0032] Представляющий интерес аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело к гиперфосфорилированному человеческому тау-белку или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 31;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

и дополнительно содержащие по меньшей мере одно из

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

[0033] Представляющий интерес аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело к гиперфосфорилированному человеческому тау-белку или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 31; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39;

и дополнительно содержащие по меньшей мере одно из

(b) CDR2 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

и дополнительно содержащие по меньшей мере одно из

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6; и

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7.

[0034] Антитела и их эпитопсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению можно применять в лечении таупатий, таких как болезнь Альцгеймера (AD), болезнь аргирофильных зерен (AGD), прогрессирующий надъядерный паралич (PSP), кортикобазальная дегенерация (CBD), TBI (травматическое повреждение головного мозга легкой, острой или хронической форм) и хроническая травматическая энцефалопатия (СТЕ).

[0035] Антитела и их эпитопсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению дополнительно предназначены для применения в лечении психоза, в частности, психоза, обусловленного AD, или психоза у пациентов с AD, и апатии, обусловленной AD, или апатии у пациентов с AD.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[0036] Фигура 1. Жидкофазный анализ ингибирования захвата антигенов Р3 из материала от субъектов с AD с применением гуманизированного С10-2 и вариантов (C10-2_N32S и C10-2_N32S_A101T). Как описано в примере 3А, исследовали зависимое от концентрации ингибирование захвата антигенов Р3 из материала от субъектов с AD Р396-специфичными антителами hC10-2 (квадратики), hC10-2_N32S (черные кружки) и hC10-2_N332_A101T (белые кружки). Фракцию Р3 из материала от субъектов с AD инкубировали 60 минут при комнатной температуре (к.т.) с возрастающими концентрациями антител (0-1000 нМ) перед инкубацией с 200 нг/мл мышиного антитела С10-2, иммобилизированного на 96-луночных планшетах. Захваченные антигены Р3 из материала от субъектов с AD выявляли с помощью меченого SULFO-TAG антитела к общему тау-белку (MSD).

[0037] Рассчитанные значения IC50 антител hC10-2_N32S (черные кружки) и hC10-2_N332_A101T (белые кружки) составляли 44 нМ и 14 нМ соответственно. Это является заметным улучшением по сравнению с hC10-2, как можно увидеть при сравнении кривых на фигуре 1. Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения антитела ингибируют Р3 из материала от субъектов с AD в жидкофазном анализе ингибирования, описанном в данном документе, таким образом, что сигнал уменьшается на 50% при концентрации антитела, составляющей 100 нМ или меньше, исходя из жидкофазного анализа ингибирования захвата антигенов Р3 из материала от субъектов с AD.

[0038] Фигура 2. Анализ ингибирования пептида, иллюстрирующий кажущуюся аффинность hC10-2 и родственных вариантов. Как описано в примере 3В, зависимое от концентрации ингибирование связывания антитела в растворе жидкой фазы с пептидом Ptau 386-408 (pS396) исследовали с антителами hC10-2 (квадратики), hC10-2_N32S (черные кружки) и hC10-2_N32_A101T (белые кружки). Антитела предварительно инкубировали при 1 нг/мл в течение 60 мин при к.т. с возрастающими концентрациями (0-10000 нМ) Ptau 386-408 (pS396) перед инкубированием в лунках, покрытых 100 нг/мл Ptau 386-408 (pS396/pS404). Связанное с лунками антитело выявляли с помощью меченого SULFO-TAG антитела к IgG человека (MSD).

[0039] Как можно увидеть из фигуры 2, антитело hC-10.2 (IC50=24 нМ), антитело hC10.2_N32S (IC50=50 нМ) и антитело hC10.2_N32S, А101Т (IC50=34 нМ) характеризуются значениями IC50, составляющими менее 100 нМ и даже менее 60 нМ, исходя из исследований кажущейся аффинности с применением раствора жидкой фазы с Ptau (Р396) 386-408.

[0040] Фигура 3 (панели A-Z и AA-AG). Иммуногистохимическое выявление патологического тау-белка в образцах головного мозга, полученных посмертно от доноров с AD, и в головном мозге от мышей rTg4510. Как описано в примере 4, в префронтальной коре от 3 различных доноров с AD hC10-2, hC10-2_N32S и hC10-2_N32S_A101T метили нейрофибриллярные клубки, нити нейропиля и дистрофические нейриты. Наиболее высокие интенсивности окрашивания выявляли при наиболее высоких концентрациях антитела. В контрольных срезах головного мозга не наблюдалась иммунореактивность. Все 3 антитела метили фосфорилированный тау-белок в головном мозге от rTg4510 с запущенной формой патологии.

[0041] Окрашивание усиливалось в направлении от hC10-2 к hC10-2_N32S и к hC10-2_N32S_A101T. Наиболее высокие интенсивности окрашивания выявляли в случае hC10-2_N32S_A101T, затем hC10-2_N32S и затем hC10-2. Иммуногистохимическое выявление патологического тау-белка в образцах головного мозга от субъектов с болезнью Альцгеймера наблюдали при концентрациях не более 100 нг/мл hC10-2_N32S_A101T и hC10-2_N32S.

[0042] Фигура 4 (панели A-F). Окрашивание структур тау-белка у мышей rTg4510, обработанных hC10-2. hC10.2 вводили i.v. (На панелях А, С, Е и F представлены rTg4510; на панелях В и D представлены tTA). Мыши получали однократную инъекцию антител hC10-2 при концентрации 80 мг/кг в объеме 150 мкл. Срезы головного мозга получали через 3 дня согласно способу, описанному в примере 5. hC10-2 специфично метило целевые структуры in vivo в гиппокампе и коре головного мозга из образцов головного мозга rTg4510, но не из контрольных образцов головного мозга tTA. Изображения с наложением сигналов AlexaFluor488 и Hoechst показаны на срезах гиппокампа.

[0043] Фигура 5 (панели A-F). Окрашивание структур тау-белка у мышей rTg4510, обработанных hC10-2_N32S. (На панелях А, С и Е представлены rTg4510; на панелях В, D и F представлены tTA). Мыши получали однократную инъекцию антител hC10-2_N32S при концентрации 80 мг/кг в объеме 150 мкл. Срезы головного мозга получали через 3 дня согласно способу, описанному в примере 5. hC10-2_N32S специфично метило целевые структуры in vivo в гиппокампе и коре головного мозга из образцов головного мозга rTg4510, но не из контрольных образцов головного мозга tTA. Изображения с наложением сигналов AlexaFluor488 и Hoechst показаны на срезах гиппокампа.

[0044] Фигура 6 (панели A-F). Окрашивание структур тау-белка у мышей rTg4510 после i.v. инъекции hC10-2_N32S_A101T. (На панелях А, С и Е представлены rTg4510; на панелях В, D и F представлены tTA). Мыши получали однократную инъекцию антител hC10-2_N32S_A101T при концентрации 80 мг/кг в объеме 150 мкл. Срезы головного мозга получали через 3 дня согласно способу, описанному в примере 5. hC10-2_N32S_A101T специфично метило целевые структуры in vivo в гиппокампе и коре головного мозга из образцов головного мозга rTg4510, но не из контрольных образцов головного мозга tTA. Изображения с наложением сигналов AlexaFluor488 и Hoechst показаны на срезах гиппокампа.

[0045] Сравнение фигур 4-6 указывает на то, что hC10.2, hC10-2_N32S и hC10-2_N32S_A101T проникают через гематоэнцефалический барьер при внутривенной инъекции. Фигуры дополнительно указывают, что hC10-2_N32S и hC10-2_N32S_A101T метили структуры тау-белка (иммунореактивные в отношении клубков тау-белка) в гиппокампе и коре головного мозга с улучшенными результатами по сравнению с hC10-2.

[0046] Фигура 7 (панели A-D). Молекулы тау-белка, распознаваемые pS396-специфичными антителами в головном мозге от субъектов с болезнью Альцгеймера (AD). Как описано в примере 6, в срезах головного мозга от субъектов с AD клубки тау-белка были либо совместно мечеными антителами к Е1 и р396, либо положительными только для антител к pS396 (стрелки). Срезы анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Ряд клубков тау-белка метили только антитела hC10-2 либо антитела hC10-2_N32S_A101T (стрелки). Учитывая, что не поддающиеся выявлению клубки не окрашиваются антителами к N-концевому фрагменту тау-белка, молекулы тау-белка, меченые антителами hC10-2 или hC10-2_N32S_A101T в отдельности, вероятно, представляют внеклеточные не поддающиеся выявлению клубки.

[0047] Фигуры 8А-8С. Выявление патологического тау-белка с помощью вестерн-блоттинга. Как описано в примере 6, разделе "Выявление патологического тау-белка с помощью вестерн-блоттинга", патологический тау-белок выявляли с помощью вестерн-блоттинга с использованием hC10.2, hC10-2_N32S, hC10-2_N32S_A101T. Объединенные образцы переднего мозга от трех мышей rTg4510 и таковые от нетрансгенных (отличных от Tg) контрольных однопометных животных, умерщвленных в возрасте 32 недель, и объединенные образцы коры головного мозга от четырех доноров с AD и таковые от четырех здоровых контрольных (НС) доноров соответственно фракционировали на растворимые (S1) фракции, фракции растворимого в TBS осадка (S1p) и нерастворимые в саркозиле (Р3) фракции и анализировали с помощью вестерн-блоттинга в отношении фосфорилированного эпитопа pS396 тау-белка с использованием 1 мкг/мл hC10.2 (A), hC10-2_N32S (В), hC10-2_N32S_A101T (С). В случае rTg4510 нормальный человеческий тау-белок 4R0N отображался при 55 кДа, тогда как гиперфосфорилированные молекулы тау-белка отображались при 64 кДа и 70 кДа. В случае AD гиперфосфорилированные молекулы тау-белка отображались в виде четырех полос, соответствующих 54, 64, 69 и 74 кДа, при различном количестве типичного для AD пятна.

[0048] Каждое из hC10-2, hC10-2_N32S и hC10-2_N32S_A101T было селективным в отношении тау-белков мышей rTg4510 по сравнению с нетрансгенными мышами и в отношении тау-белков доноров с AD по сравнению со здоровыми контрольными донорами. Кроме того, в растворимых (S1) фракциях, фракциях растворимого в TBS осадка (S1p) и нерастворимых в саркозиле (Р3) фракциях каждое из hC10-2, hC10-2_N32S и hC10-2_N32S_A101T было селективным в отношении патогенного тау-белка размером 64 кДа от мышей rTg4510 по сравнению с нормальным тау-белком размером 55 кДа от мышей rTg4510.

[0049] Фигура 9. Иммунопреципитация тау-белка из образцов головного мозга от субъектов с AD. Как описано в примере 6, разделе "Иммунопреципитация патологического тау-белка", иммунопреципитацию тау-белка с использованием 10 мкг hC10.2, hC10-2_N32S, hC10-2_N32S_A101T, с использованием контрольного IgG1 человека (hIgG1) из 500 мкг предварительно очищенных лизатов гомогенатов коры головного мозга, объединенных от четырех доноров с AD и здоровых контрольных (НС) доноров, анализировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием поликлонального кроличьего антитела к тау-белку pS396 (тау-белок pS396). В случае AD гиперфосфорилированные молекулы тау-белка отображались в виде четырех полос, соответствующих 54, 64, 69 и 74 кДа, при различном количестве типичного для AD пятна.

Фигура 10 А-С. Количественная оценка агрегации тау-белка с помощью анализа Cisbio. Затравочный материал дикого типа (Wt) (WW) не продемонстрировал затравочного действия, и фоновый сигнал вычитали из всех затравочных образцов. Гомогенаты от Tg4510 характеризовались эффективным затравочным действием, и на затравочный эффект не влияла обработка с помощью В12, однако на него в различной степени влияла обработка в исследованиях затравочного действия, проводимых с использованием антител к тау-белку по настоящему изобретению (hC10-2_N32S_A101T>hC10-2_N32S>hC10-2) при концентрации 20 мкг/мл. На графических изображениях представлены результаты четырех независимых групп экспериментов, и они выполнены в виде диаграммы относительной агрегации тау-белка (кратности сигнала относительно фонового уровня, нормализованной к общему белку), и относительное содержание нерастворимого тау-белка р396 количественно оценивали с помощью денситометрии вестерн-блотов нерастворимой в Triton-X фракции (нормализованная кратность сигнала по отношению к фоновому уровню). Все образцы нормализовали по отношению к антителу изотипического контроля В12. На фигуре 10 В-С представлена количественная оценка агрегации тау-белка с помощью анализа Cisbio. Клетки HEK293, трансфицированные pcDNA для введения затравки, не продемонстрировали сигнал, что подтверждало отсутствие выявления входящего затравочного материала. Затравочный материал Wt (дикого типа) (WW) не продемонстрировал затравочного действия, однако, в отличие от этого, гомогенаты от rTg4510 (СС) характеризовались эффективным затравочным действием по сравнению с лишенными затравки. На этот затравочный эффект не влияла обработка с помощью HEL, но он частично устранялся путем обработки антителами к тау-белку (С10-2>D1.2>hACI36-2B6-Ab1). На графических изображениях представлены три независимых набора образцов, и они выполнены в виде диаграммы относительной агрегации тау-белка (кратности сигнала относительно фонового уровня, нормализованной по отношению к общему белку). В примере 6, разделе "Клеточный анализ и анализ агрегации", описан следующий протокол.

[0050] Фигура 11. Количественная оценка сигнала Tau5 в вестерн-блоттинге после иммуноистощения экстрактов головного мозга от субъектов с AD с применением различных количеств антител hC10-2 и 2.10.3. Как описано в примере 7, оба антитела удаляли небольшую долю общего тау-белка из экстрактов головного мозга от субъектов с болезнью Альцгеймера.

[0051] Фигура 12. Количественная оценка сигнала тау-белка P-S422 в вестерн-блоттинге после иммуноистощения экстрактов головного мозга от субъектов с AD с применением различных количеств антител hC10-2 (ромбы) и 2.10.3 (треугольники). На фигуре показаны результаты из примера 7. Тау-белок, фосфорилированный по серину-422, может эффективно удаляться из экстрактов головного мозга от субъектов с AD в результате иммуноистощения с применением hC10-2 либо 2.10.3. Оба антитела приводили к удалению более 90% тау-белка P-S422, хотя для достижения такого же эффекта требовалось большее количество антитела 2.10.3.

[0052] Фигура 13. Количественная оценка сигнала тау-белка pS396 в вестерн-блоттинге после иммуноистощения экстрактов головного мозга от субъектов с AD с применением различных количеств антител hC10-2 и 2.10.3. На фигуре показаны результаты из примера 7. Иммуноистощение с помощью hC10-2 приводило к удалению 88% тау-белка, фосфорилированного по серину-396, тогда как 2.10.3 приводило к удалению лишь 55% тау-белка pS396 из экстрактов головного мозга от субъектов с AD.

[0053] Фигура 14. Количественная оценка сигнала тау-белка P-S199/202 в вестерн-блоттинге после иммуноистощения экстрактов головного мозга от субъектов с AD с применением различных количеств антител hC10-2 и 2.10.3. На фигуре показаны результаты из примера 7. Иммуноистощение с помощью hC10-2 приводило к очищению 69% тау-белка, фосфорилированного по серину-199/202. Антитело 2.10.3 не приводило к такому же дозозависимому уменьшению.

[0054] Фигура 15. Картины вестерн-блоттинга экстрактов головного мозга от субъектов с болезнью Альцгеймера до и после иммуноистощения. На фигуре показаны результаты из примера 7. Присутствует фрагмент тау-белка, фосфорилированного по серину-396, размером 25 кДа. Иммуноистощение с помощью hC10-2 приводило к уменьшению полосы тау-белка размером 25 кДа. 2 других фосфо-специфичных антитела 2.10.3 и АТ8 не приводили к удалению этой молекулы размером 25 кДа.

[0055] Фигура 16. Количественная оценка сигнала тау-белка pS396 в вестерн-блоттинге после иммуноистощения экстрактов головного мозга от субъектов с AD с применением различных количеств вариантов hC10-2 N32S, N32Q, N32S_A101T, N32Q_A101T, N32Q_D55E и N32S_D55E. Как можно сделать вывод из примера 8, способность антител по настоящему изобретению к удалению тау-белка, фосфорилированного по серину-396, из гомогенатов головного мозга от субъектов с AD, была существенной. При содержании менее 0,1 мкг антитела (точка замера при 75 нг) варианты приводили к уменьшению сигнала pS396 по меньшей мере на 28% (за исключением N32Q, D55E, который характеризовался 16%), тогда как С10.2 приводило к уменьшению сигнала pS396 на менее чем 6%.

[0056] Фигура 17 (панели A-D). Затравка клубков тау-белка в гиппокампе, вызванная инъекцией экстрактов головного мозга от субъектов с AD. Как изложено в примере 8а, при дозе 15 мг/кг обработка с помощью hC10-2 значимо уменьшала патологию клубков в подвергнутом затравочному действию гиппокампе на 57% (Р<0,05). Наблюдалась отчетливая тенденция, указывающая на то, что hC10-2 также уменьшало патологию. Для сравнения 2.10.3 не характеризовалось эффектом при той же дозе.

[0057] Фигура 18. Остатки P-Ser396 и Tyr394 находятся в центре антигенсвязывающего участка

Показана структура Ile(392)-Val(393)-Tyr(394)-Lys(395)-pSer(396)-Pro(397)-Val(398). В основном взаимодействии с антителом по настоящему изобретению участвует гидрофобный карман, pSer396 и Y394 тау-белка. Существуют разветвленная сеть водородных связей, образующаяся между боковой цепью с Y(394) и остовом из фосфоната с pSer396, и взаимодействия зарядов/полярные взаимодействия между ними. CDR1 НС антител по настоящему изобретению содержит палиндромный мотив из 8 остатков ПОЛЯРНАЯ АМИНОКИСЛОТА - ГИДРОФОБНАЯ АМИНОКИСЛОТА -ПОЛЯРНАЯ АМИНОКИСЛОТА - ЗАРЯЖЕННАЯ АМИНОКИСЛОТА - ЗАРЯЖЕННАЯ АМИНОКИСЛОТА - ПОЛЯРНАЯ АМИНОКИСЛОТА - ГИДРОФОБНАЯ АМИНОКИСЛОТА - ПОЛЯРНАЯ АМИНОКИСЛОТА (Thr-Phe-Thr-Asp-Arg-Thr-Ile-His). Заряженные остатки взаимодействуют посредством разветвленной сети связей, образованной водородными связями, взаимодействий зарядов, и взаимодействий зарядов/полярных взаимодействий между антителом и тау-белком.

[0058] Фигура 19. Эффективность антител в парадигме лечения

Как изложено в примере 8b, клетки HEK293, экспрессирующие hTau-P301L, подвергали затравочному действию гомогенатов от Tg4510, предварительно инкубированных с указанными антителами, трипсинизировали и подвергали повторному затравочному

действию через 24 часа (антитела повторно добавляли) и собирали через 48 ч. после подвергания затравочному действию. Общие клеточные гомогенаты исследовали в отношении агрегированного тау-белка с помощью анализа агрегации тау-белков от Cisbio. Данные представляют собой объединенные данные от 4 независимых биологических повторов +/- S.E.M., нормализованные по отношению к СС+В12 (tg4510).

[0059] Клетки, экспрессирующие P301L-htau, подвергали затравочному действию 40 мкг гомогената головного мозга от Тд4510 (общий белок), предварительно инкубированного в течение ночи при 4°С с антителами (20 мкг/мл = 133 нМ) в 6-луночных планшетах. Затравка с помощью СС+В12 приводила к значительному затравочному ответу. hC10.2 оказывало примерно 40% влияние на агрегацию. Все другие антитела демонстрировали по меньшей мере сопоставимый с hC10.2 эффект. В частности, варианты hC10.2 N32S и N32S_A101T демонстрировали более выраженные эффекты в виде уменьшенной агрегации тау-белка на 45% и 62%. Вариант N32S_A101T демонстрировал значимо более выраженный эффект в отношении агрегации по сравнению с hC10.2. На фигуре показано, что гуманизированное С10.2 является эффективным при вовлечении индуцированного тау-белком затравочного действия, однако добавление N32S и, в частности, двойной мутации N32S и А101Т повышает нейтрализующую активность mAb.

[0060] Фигура 20. Исследования по дезамидированию вариантов в стрессовых условиях

Как изложено в примере 8 с, дезамидирование остатков Asn в положении 32 или 34 VL-цепи контролировали путем анализа триптического пептида LC:T2 [VTMTCQASQDTSIXLNWFQQKPGK; SEQ ID NO: 58] с помощью LC-MS. X представляет собой Asn, Gin либо Ser в соответствующих вариантах, указанных на фигуре 20. MS анализ позволяет выполнить расчет относительного содержания дезамидированных пептидов по отношению к недезамидированным. В случае WT, вариантов А101Т и D55E наблюдается существенное дезамидирование в пептиде LC:T2. Также очевидно, что изменение Asn32 либо на Gin, либо на Ser полностью предотвращает дезамидирование пептида по другим остаткам Asn34. Также не выявляли никакого дезамидирования вариантов Gln32. Аналогичные результаты наблюдали в случае вариантов Asn34.

[0061] Фигура 21. Уменьшение затравочного действия и агрегации тау-белка в кортикальных нейронах с помощью антител к тау-белку

Затравочное действие и агрегацию тау-белка в культурах кортикальных нейронов из эмбрионов мышей rTg4510 индуцировали с помощью 0,2 нг патологического тау-белка из фракций Р3 ил и S1 р от 40-недельных мышей rTg4510 и измеряли с помощью анализа агрегации тау-белка Cisbio. На 7-й день культивирования (DIV) нейроны обрабатывали смесью Р3 или S1p и 10 мкг антитела или фосфатно-солевого буферного раствора (PBS). Полное изменение среды осуществляли на DIV11 с удалением остаточных затравок Р3 и S1p и антител. Затравку тау-белка обеспечивали в течение дополнительных 4 дней, и нейроны подвергали лизису на DIV15 с измерением затравочного действия и агрегации тау-белка. PBS и контрольное антитело IgG человека (контр, ab IgG) не влияли на затравочное действие и агрегацию тау-белка. Затравочное действие и агрегация тау-белка частично обращались путем обработки антителами к тау-белку (hC10.2_A101T_N32S > hC10.2_N32S > hC10.2). Измеряли следующее уменьшение затравочного действия и агрегации тау-белка: 23% - в случае hC10.2, 41-53% - в случае hC10.2_N32S и 48-60% - в случае hC10.2_A101T_N32S. На столбиковых диаграммах представлены данные из двух независимых экспериментов по агрегации тау-белка, нормализованные по отношению к нейрональному белку, в виде средних значений±SD. Использовали однофакторный ANOVA и критерий Ньюмена-Кейлса для множественных сравнений (PBS/контр, ab IgG в сравнении с hC10.2, hC10.2_N32S, hC10.2_A101T_N32S, ***р<0,001; hC10.2 и hC10.2_N32S, hC10.2_A101T_N32S, ###p<0,001).

[0062] Фигура 22. Дозозависимое окрашивание структур тау-белка у мышей rTg4510 после i.v. инъекции hC10-2_N32S.

hC10-2_N32S специфично метило целевые структуры in vivo в гиппокампе и коре головного мозга из образцов головного мозга rTg4510. Показаны изображения передней поясной коры головного мозга. Наиболее сильные сигналы наблюдали при дозе 20 и 80 мг/кг, слабые сигналы - при дозе 8 мг/кг, отсутствие видимого сигнала - при дозе 0,8 мг/кг.

[0063] Фигура 23. Вызванная затравочным действием патология тау-белка в гиппокампе

Число клеток, характеризующихся окрашиванием клубков по Gallyas, в подвергнутом затравочному действию гиппокампе, уменьшалось посредством обработки с помощью hC10-2 (50%), hC10-2_N32S (48%) и hC10-2_N32S_A101T (47%). Количественную оценку выполняли в каждых 6-х срезах, охватывающих дорсальный гиппокамп, всего использовали 8 срезов на животное. Число клеток отражает сумму положительных клеток во всех подобластях гиппокампа, идентифицированных в 8 срезах. Для анализа данных использовали однофакторный anova и критерий Данетта для множественных сравнений.

[0064] ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, ВКЛЮЧЕННЫЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

SEQ ID NO: 1 человеческий тау-белок (2N4R)

SEQ ID NO: 2 остатки 386-408 тау-белка (pS396, pS404)

SEQ ID N0:3 CDR1 легкой цепи C10-2

SEQ ID NO: 4 CDR2 легкой цепи С10-2

SEQ ID NO: 5 CDR3 легкой цепи C10-2

SEQ ID NO: 6 CDR1 тяжелой цепи C10-2

SEQ ID NO: 7 CDR2 тяжелой цепи C10-2

SEQ ID NO: 8 CDR3 тяжелой цепи C10-2

SEQ ID NO: 9 легкая цепь мышиного C10-2

SEQ ID NO: 10 тяжелая цепь мышиного C10-2

SEQ ID NO: 11 тяжелая цепь гуманизированного C10-2

SEQ ID NO: 12 легкая цепь гуманизированного C10-2

SEQ ID NO: 13 вариант D55E тяжелой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 14 вариант D55Q тяжелой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 15 вариант D55S тяжелой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 16 вариант N32S легкой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 17 вариант N32Q легкой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 18 вариант N34S легкой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 19 вариант N34Q легкой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 20 вариант N32S, N34S легкой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 21 вариант N32Q, N34S легкой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 22 вариант N32Q, N34Q легкой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 23 вариант N32S, N34Q легкой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 24 вариант А101Т тяжелой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 25 вариант D55E, А101Т тяжелой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 26 вариант D55Q, А101Т тяжелой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 27 вариант D55S, А101Т тяжелой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 28 вариант D55E CDR2 тяжелой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 29 вариант D55Q CDR2 тяжелой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 30 вариант D55S CDR2 тяжелой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 31 вариант N32S CDR1 легкой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 32 вариант N32Q CDR1 легкой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 33 вариант N34S CDR1 легкой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 34 вариант N34Q CDR1 легкой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 35 вариант N32S, N34S CDR1 легкой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 36 вариант N32Q, N34S CDR1 легкой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 37 вариант N32Q, N34Q CDR1 легкой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 38 вариант N32S, N34Q CDR1 легкой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 39 вариант А101Т CDR3 тяжелой цепи гуманизированного С10-2

SEQ ID NO: 40 CDR1 легкой цепи гуманизированного С10-2 согласно нумерации IMGT

SEQ ID NO: 41 CDR2 легкой цепи гуманизированного С10-2 согласно нумерации IMGT

SEQ ID NO: 42 CDR3 легкой цепи гуманизированного С10-2 согласно нумерации IMGT

SEQ ID NO: 43 CDR1 тяжелой цепи гуманизированного С10-2 согласно нумерации IMGT

SEQ ID NO: 44 CDR2 тяжелой цепи гуманизированного С10-2 согласно нумерации IMGT

SEQ ID NO: 45 CDR3 тяжелой цепи гуманизированного С10-2 согласно нумерации IMGT

SEQ ID NO: 46 вариант N32S CDR1 легкой цепи гуманизированного С10-2 согласно нумерации IMGT

SEQ ID NO: 47 вариант N32S CDR2 легкой цепи гуманизированного С10-2 согласно нумерации IMGT

SEQ ID NO: 48 вариант N32S CDR3 легкой цепи гуманизированного С10-2 согласно нумерации IMGT

SEQ ID NO: 49 вариант A101T CDR1 тяжелой цепи гуманизированного С10-2 согласно нумерации IMGT

SEQ ID NO: 50 вариант A101T CDR2 тяжелой цепи гуманизированного С10-2 согласно нумерации IMGT

SEQ ID NO: 51 вариант A101T CDR3 тяжелой цепи гуманизированного С10-2 согласно нумерации IMGT

SEQ ID NO: 52 CDR1 тяжелой цепи гуманизированного С10-2 согласно нумерации Chotia

SEQ ID NO: 53 CDR2 тяжелой цепи гуманизированного С10-2 согласно нумерации Chotia

SEQ ID NO: 54 CDR3 тяжелой цепи гуманизированного C10-2 согласно нумерации Chotia

SEQ ID NO: 55 вариант A101T CDR1 тяжелой цепи гуманизированного С10-2 согласно нумерации Chotia

SEQ ID NO: 56 вариант A101T CDR2 тяжелой цепи гуманизированного С10-2 согласно нумерации Chotia

SEQ ID NO: 57 вариант A101T CDR3 тяжелой цепи гуманизированного С10-2 согласно нумерации Chotia

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0065] Используемый в данном документе термин "тау" является синонимом "тау-белка" и относится к любой из изоформ тау-белка (идентифицированных, например, в UniProt как Р10636, 1-9). Нумерация аминокислот тау-белка, используемая в данном документе, приведена применительно к изоформе 2 (SEQ ID NO: 1), показанной ниже, при этом метионин (М) является аминокислотным остатком 1. SEQ ID NO: 1:

[0066] Настоящее изобретение относится к антителам и их эпитопсвязывающим фрагментам, которые способны специфически связываться стау-белком, и в частности, с человеческим тау-белком, и в одном варианте осуществления проявляют способность к специфичному связыванию с фосфорилированным остатком S396 (pS396) человеческого тау-белка. Антитела и их эпитопсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению дополнительно характеризуются тем, что они не способны или практически не способны специфически связываться с фосфорилированным сериновым остатком 404 (pS404) в человеческом тау-белке, например, в условиях ограниченного количества антител или ненасыщающих условиях. Дополнительно, фосфорилирование в pS404 не препятствует специфичному связыванию с pS396-содержащими эпитопами. Используемые в данном документе обозначения "pS" и "^(P)S" означают фосфосериновый аминокислотный остаток и последующие номера определяют положение остатка по отношению к последовательности под SEQ ID NO: 1. Как используется в данном документе, антитело "практически" не способно связываться с эпитопом, если относительно другого эпитопа такое связывание составляет менее 20%, менее 10%, менее 5%, менее 2% и более предпочтительно менее 1% от связывания, наблюдаемого для такого другого эпитопа.

[0067] Термин "антитело" (АЬ) в контексте настоящего изобретения относится к молекуле иммуноглобулина или, согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, фрагменту молекулы иммуноглобулина, которые обладают способностью к специфичному связыванию с эпитопом молекулы ("антигена"). Встречающиеся в природе антитела обычно предусматривают тетрамер, который обычно состоит по меньшей мере из двух тяжелых цепей (НС) и по меньшей мере двух легких цепей (LC). Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного домена тяжелой цепи (сокращенно называемого в данном документе VH) и константного домена тяжелой цепи, обычно состоящего из трех доменов (СН1, СН2 и СН3). Человеческие тяжелые цепи могут относиться к любому изотипу, включая IgG (подтипы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4). Каждая легкая цепь состоит из вариабельного домена легкой цепи (сокращенно называемого в данном документе VL) и константного домена легкой цепи (CL). Человеческие легкие цепи включают каппа-цепи и лямбда-цепи. Вариабельный домен тяжелой и легкой цепей обычно отвечает за распознавание антигена, тогда как константный домен тяжелой и легкой цепей может опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, в том числе с различными клетками иммунной системы (например, эффекторными клетками) и первым компонентом (C1q) классического пути активации системы комплемента. VH- и VL-домены могут дополнительно подразделяться на гипервариабельные домены, называемые "областями, определяющими комплементарность", которые чередуются с доменами с более консервативной последовательностью, называемыми "каркасными областями" (FR). Каждый VH и VL состоит из трех CDR-доменов и четырех FR-доменов, расположенных от аминоконца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Вариабельные домены тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Особенно значимыми являются антитела и их эпитопсвязывающие фрагменты, которые были "выделены" таким образом, чтобы они существовали в физической среде, отличающейся от той, в которой они могут встречаться в природе, или которые были модифицированы таким образом, чтобы они отличались по аминокислотной последовательности от встречающегося в природе антитела или его эпитосвязывающих фрагментов.

[0068] Термин "эпитоп" означает антигенную детерминанту, способную специфически связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят из поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи Сахаров, и обычно имеют специфические характеристики трехмерной структуры, а также специфические характеристики заряда. Конформационные и линейные эпитопы отличаются тем, что связывание с первыми, но не с последними, всегда утрачивается в присутствии денатурирующих растворителей. Эпитоп может содержать аминокислотные остатки, непосредственно участвующие в связывании, и другие аминокислотные остатки, которые непосредственно не участвуют в связывании, такие как аминокислотные остатки, эффективно блокируемые пептидом, специфично связывающимся с эпитопом (другими словами, аминокислотный остаток находится в пределах области узнавания для пептида, специфично связывающегося с эпитопом).

[0069] Используемый в данном документе термин "эпитопсвязывающий фрагмент антитела" означает фрагмент, часть, область или домен антитела (независимо от того, как они получены (например, путем расщепления, рекомбинантным путем, синтетическим путем и т.п.)), которые способны специфично связываться с эпитопом. Эпитопсвязывающий фрагмент может содержать любой из 1, 2, 3, 4, 5 или все 6 CDR-доменов такого антитела и, несмотря на то, что способен специфично связываться с таким эпитопом, может проявлять специфичность, аффинность или селективность в отношении того эпитопа, который отличается от эпитопа для такого антитела. Однако предпочтительно, чтобы эпитопсвязывающий фрагмент содержал все 6 CDR-доменов такого антитела. Эпитопсвязывающий фрагмент антитела может представлять собой или содержать часть одной полипептидной цепи (например, в scFv) или может представлять собой или содержать часть двух или более полипептидных цепей, каждая из которых имеет аминоконец и карбоксильный конец (например, в диателе, Fab-фрагменте, Fab₂-фрагменте и т.п.). Фрагменты антител, которые проявляют способность к связыванию с эпитопом, можно получить, например, путем расщепления интактных антител протеазами. Более предпочтительно, чтобы, несмотря на то, что два домена Fv-фрагмента, VL и VH, в естественных условиях кодируются отдельными генами или полинуклеотидами, которые кодируют такие последовательности генов (например, их кодирующей кДНК), можно было с помощью рекомбинантных способов соединить гибким линкером, который обеспечивает возможность их получения в виде одной белковой цепи, в которой VL- и VH-области ассоциируют друг с другом с образованием одновалентных эпитопсвязывающих молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv), см., например, Bird et al., (1988) Science 242: 423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 5879-5883). В качестве альтернативы, путем использования гибкого линкера, который является слишком коротким (например, имеет длину менее чем приблизительно 9 остатков) для того, чтобы обеспечить возможность ассоциации VL- и VH-доменов одной полипептидной цепи друг с другом, можно образовать биспецифическое антитело, диатело или аналогичную молекулу (в которой две такие полипептидные цепи ассоциируют друг с другом с образованием двухвалентной эпитопсвязывающей молекулы) (см., например, PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993) в отношении описания диател). Примеры эпитопсвязывающих фрагментов, охватываемых настоящим изобретением, включают (i) Fab'- или Fab-фрагмент - одновалентный фрагмент, состоящий из VL-, VH-, CL- и СН1-доменов, или одновалентное антитело, описанное в WO 2007059782; (ii) F(ab')2-фрагменты - двухвалентные фрагменты, содержащие два Fab-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирном домене; (iii) Fd-фрагмент, по сути состоящий из VH- и СН1-доменов; (iv) Fv-фрагмент, по сути состоящий из VL- и VH-доменов, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), который по сути состоит из VH-домена и также называется доменным антителом (Holt et al.; Trends Biotechnol. 2003 Nov; 2i(II): 484-90); (vi) антитела верблюдовых или нанотела (Revets et al.; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan; 5_(I): I II-24) и (vii) выделенную область, определяющую комплементарность (CDR). Дополнительно, несмотря на то, что два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, их с помощью рекомбинантных способов можно соединить синтетическим линкером, который обеспечивает возможность их получения в виде одной белковой цепи, в которой VL- и VH-домены находятся в паре, с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечные антитела или одноцепочечные Fv (scFv), см., например, Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), и Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Эти и другие фрагменты антител, применимые в контексте настоящего изобретения, дополнительно обсуждаются в данном документе. Также следует понимать, что термин "антитело", если не указано иное, также включает антителоподобные полипептиды, такие как химерные антитела и гуманизированные антитела, и фрагменты антител, сохраняющие способность к специфичному связыванию с антигеном (эпитопсвязывающие фрагменты), получаемые с помощью любой известной методики, такой как ферментативное расщепление, синтез пептидов и рекомбинантные методики. Полученное антитело может иметь любой изотип. Как используется в данном документе, "изотип" относится к классу иммуноглобулина (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), кодируемому генами константных доменов тяжелых цепей. Такие фрагменты антител получают с помощью традиционных методик, известных специалистам в данной области техники; при этом подходящие фрагменты, способные связываться с желаемым эпитопом, можно без труда подвергнуть скринингу в отношении полезности таким же образом, как и интактное антитело. В одном варианте осуществления Fc-область антител по настоящему изобретению содержит мутацию, которая модулирует эффекторные функции.

[0070] Термин "биспецифическое антитело" относится к антителу, содержащему два независимых эпитопсвязывающих фрагмента, каждый из которых нацеливается на независимые мишени. Эти мишени могут представлять собой эпитопы, присутствующие в различных белках, или различные эпитопы, присутствующие в одной и той же мишени. Молекулы биспецифических антител можно получить с помощью компенсаторных аминокислотных изменений в константных доменах НС исходных молекул моноспецифических двухвалентных антител. Полученное в результате гетеродимерное антитело содержит один Fab, вклад в образование которого вносят два разных исходных моноспецифических антитела. Аминокислотные изменения в Fc-домене приводят к повышенной стабильности гетерод и мерного антитела с биспецифичностью, которая стабильна с течением времени. (Ridgway et al., Protein Engineering 9, 617-621 (1996), Gunasekaran et al., JBC 285, 19637-1(2010), Moore et al., MAbs 3:6 546-557 (2011), Strop et al., JMB 420, 204-219 (2012), Metz et al., Protein Engineering 25:10 571-580 (2012), Labrijn et al., PNAS 110:113, 5145-5150 (2013), Spreter Von Kreudenstein et al., MAbs 5:5 646-654 (2013)). Биспецифические антитела также могут включать молекулы, получаемые с помощью слияний ScFv. Затем два моноспецифических scfv независимо соединяют с Fc-доменами, которые могут образовывать стабильные гетеродимеры, с получением одной биспецифической молекулы (Mabry et al., PEDS 23:3 115-127 (2010). Биспецифические молекулы обладают способностями к двойному связыванию.

[0071] Термины "С10-2", "человеческое С10-2", "hC10-2", "НС10-2", "hC10.2", "Гуманизированное С10-2" и "гуманизированное С10-2", как используется в данном документе и на фигурах, подразумеваются как синонимы и определяются как антитело С10-2. Данный термин подразумевается как означающий антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельный домен легкой цепи антитела, имеющий:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

и вариабельный домен тяжелой цепи антитела, имеющий:

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, или состоящие из них.

[0072] Антитело С10-2 представляет собой гуманизированное антитело, которое может быть определено как содержащее тяжелую цепь под SEQ ID NO: 11, легкую цепь под SEQ ID NO: 12 или обе. Один вариант осуществления настоящего изобретения направлен на антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь под SEQ ID NO: 11 и легкую цепь под SEQ ID NO: 12.

[0073] Термин "mC10-2", используемый в данном документе и на фигурах, подразумевается как означающий мышиное антитело С10-2 и определяется под SEQ ID NO: 9 и 10. Мышиное антитело С10.2 используется в качестве контрольного антитела и не является частью настоящего изобретения.

[0074] Термины "hC10-2_N32S" и "C10-2_N32S", используемые в данном документе и на фигурах, подразумеваются как синонимы и являются вариантами антитела С10-2, где легкая цепь была подвергнута мутации таким образом, чтобы по меньшей мере содержать мутацию аминокислотного остатка 32 по типу замены N на S, и определяются как антитело N32S. Термины "hC10-2_N32Q" и "C10-2_N32Q", используемые в данном документе и на фигурах, подразумеваются как синонимы и являются вариантами антитела С10-2, где легкая цепь была подвергнута мутации таким образом, чтобы по меньшей мере содержать мутацию аминокислотного остатка 32 по типу замены N на Q, и определяются как антитело N32Q.

[0075] Термины "hC10-2_N34S" и "C10-2_N34S", используемые в данном документе и на фигурах, подразумеваются как синонимы и являются вариантами антитела С10-2, где легкая цепь была подвергнута мутации таким образом, чтобы по меньшей мере содержать мутацию аминокислотного остатка 34 по типу замены N на S, и определяются как антитело N34S. Термины "hC10-2_N34Q" и "C10-2_N34Q", используемые в данном документе и на фигурах, подразумеваются как синонимы и являются вариантами антитела С10-2, где легкая цепь была подвергнута мутации таким образом, чтобы по меньшей мере содержать мутацию аминокислотного остатка 34 по типу замены N на Q, и определяются как антитело N34Q.

[0076] Термины "hC10-2_N32S_N34S" и "C10-2_N32S_N34S", используемые в данном документе и на фигурах, подразумеваются как синонимы и являются вариантами антитела С10-2, где легкая цепь была подвергнута мутации таким образом, чтобы по меньшей мере содержать мутации аминокислотных остатков 32 и 34 по типу замены N на S, и определяются как антитело N32S, N34S. Термины "пСЮ-2_N32Q_N34S" и "C10-2_N32Q_N34S", используемые в данном документе и на фигурах, подразумеваются как синонимы и являются вариантами антитела С10-2, где легкая цепь была подвергнута мутации таким образом, чтобы по меньшей мере содержать мутации аминокислотных остатков 32 и 34 по типу замены N на Q и по типу замены N на S соответственно, и определяются как антитело N32Q, N34S. Термины "hC10-2_N32Q_N34Q" и "C10-2_N32Q_N34Q", используемые в данном документе и на фигурах, подразумеваются как синонимы и являются вариантами антитела С10-2, где легкая цепь была подвергнута мутации таким образом, чтобы по меньшей мере содержать мутации аминокислотных остатков 32 и 34 по типу замены N на Q, и определяются как антитело N32Q, N34Q. Термины "hC10-2_N32S_N34Q" и "С10-2_N32S_N34Q", используемые в данном документе и на фигурах, подразумеваются как синонимы и являются вариантами антитела С10-2, где легкая цепь была подвергнута мутации таким образом, чтобы по меньшей мере содержать мутации аминокислотных остатков 32 и 34 по типу замены N на S и по типу замены N на Q соответственно, и определяются как антитело N32S, N34Q.

[0077] Термины "hC10-2_D55E" и "С10-2_D55E", используемые в данном документе и на фигурах, подразумеваются как синонимы и являются вариантами антитела С10-2, где тяжелая цепь была подвергнута мутации таким образом, чтобы по меньшей мере содержать мутацию аминокислотного остатка 55 по типу замены D на Е, и определяются как антитело D55E. Термины "hC10-2_D55Q", "C10-2_D55Q", используемые в данном документе и на фигурах, подразумеваются как синонимы и являются вариантами антитела С10-2, где тяжелая цепь была подвергнута мутации таким образом, чтобы по меньшей мере содержать мутацию аминокислотного остатка 55 по типу замены D на Q, и определяются как антитело D55Q. Термины "hC10-2_D55S", "C10-2_D55S", используемые в данном документе и на фигурах, подразумеваются как синонимы и являются вариантами антитела С10-2, где тяжелая цепь была подвергнута мутации таким образом, чтобы по меньшей мере содержать мутацию аминокислотного остатка 55 по типу замены D на S, и определяются как антитело D55S.

[0078] Термины "hC10-2_А101Т" и "С10-2_А101Т", используемые в данном документе и на фигурах, подразумеваются как синонимы и являются вариантами антитела С10-2, где тяжелая цепь была подвергнута мутации таким образом, чтобы по меньшей мере содержать мутацию аминокислотного остатка 101 по типу замены А на Т, и определяются как антитело А101Т.

[0079] Термины "hC10-2_N32S_A101T", "C10-2_N32S_A101T", "hC10-2_A101T_N32S" и "C10-2_A101T_N32S", используемые в данном документе и на фигурах, подразумеваются как синонимы и являются вариантами антитела С10-2, где тяжелая цепь была подвергнута мутации таким образом, чтобы по меньшей мере содержать мутацию аминокислотного остатка 101 по типу замены А на Т, и где легкая цепь была подвергнута мутации таким образом, чтобы по меньшей мере содержать мутацию аминокислотного остатка 32 по типу замены N на S, и определяются как антитело N32S, А101Т.

[0080] Термины "hC10-2_N32Q_A101T", "C10-2_N32Q_A101T", hC10-2_A101T_N32Q" и "C10-2_A101T_N32Q, используемые в данном документе и на фигурах, подразумеваются как синонимы и являются вариантами антитела С10-2, где тяжелая цепь была подвергнута мутации таким образом, чтобы по меньшей мере содержать мутацию аминокислотного остатка 101 по типу замены А на Т, и где легкая цепь была подвергнута мутации таким образом, чтобы по меньшей мере содержать мутацию аминокислотного остатка 32 по типу замены N на Q, и определяются как антитело N32Q, А101Т.

[0081] Термины "моноклональное антитело" или "композиция на основе моноклональных антител", используемые в данном документе, относятся к препарату из молекул антител единого молекулярного состава. Традиционная композиция на основе моноклональных антител характеризуется единой специфичностью связывания и аффинностью к конкретному эпитопу. В определенных вариантах осуществления моноклональное антитело может состоять из более чем одного Fab-домена, за счет чего повышается специфичность более чем к одной мишени. Термины "моноклональное антитело" или "композиция на основе моноклональных антител" не подразумеваются как ограниченные каким-либо конкретным способом получения (например, рекомбинантным, трансгенным, гибридомным и т.п.).

[0082] Антитела по настоящему изобретению и их эпитопсвязывающие фрагменты предпочтительно являются "гуманизированными", в частности, если они используются для терапевтических целей. Термин "гуманизированный" относится к молекуле, обычно получаемой с помощью рекомбинантных методик, которая имеет эпитопсвязывающий участок, полученный из иммуноглобулина от вида, отличного от человека, и остальную часть структуры иммуноглобулина, в основе которой лежит структура и/или последовательность человеческого иммуноглобулина. Эпитопсвязывающий участок может содержать либо полные вариабельные домены антитела, отличного от человеческого, слитые с человеческими константными доменами, либо только области, определяющие комплементарность (CDR), или их части, таких вариабельных доменов, привитые на соответствующие человеческие каркасные области человеческих вариабельных доменов. Остатки каркасных областей таких гуманизированных молекул могут быть дикого типа (например, полностью человеческими), или они могут быть модифицированы так, чтобы содержать одну или несколько аминокислотных замен, которые не встречаются в антителе человека, последовательность которого послужила основой для гуманизации. Гуманизация уменьшает или устраняет вероятность того, что константный домен молекулы будет действовать в качестве иммуногена у людей, однако возможность выработки иммунного ответа на чужеродный вариабельный домен сохраняется (LoBuglio, A.F. et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 4220-4224). Другой подход фокусируется не только на получении константных доменов человеческого происхождения, но также и на модификации вариабельных доменов таким образом, чтобы реконструировать их как можно более близко к человеческой форме. Известно, что вариабельные домены как тяжелой, так и легкой цепей содержат три определяющие комплементарность области (CDR), которые различаются по ответу на рассматриваемые антигены и определяют способность связывания, фланкированные четырьмя каркасными областями (FR), которые являются относительно консервативными у данного вида и которые предположительно обеспечивают остов для CDR. В тех случаях, когда антитела, отличные от человеческих, получают в отношении конкретного антигена, вариабельные домены можно "реконструировать" или "гуманизировать" путем прививания CDR, полученных из антитела, отличного от человеческого, на FR, присутствующие в человеческом антителе, подлежащем модификации. О применение такого подхода к различным антителам сообщалось в Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53: 851-856. Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy", Nature 332: 323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity", Science 239: 1534-1536; Kettleborough, C.A. et al. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation", Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) "Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity", Human Antibodies Hybridoma 2: 124-134; Gorman, S.D. et al. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) "Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo", Bio/Technology 9: 266-271; Co, M.S. et al. (1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88: 2869-2873; Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89: 4285-4289 и Co, M.S. et al. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen", J. Immunol. 148: 1149-1154. В некоторых вариантах осуществления в гуманизированных антителах сохраняются все последовательности CDR (например, в гуманизированном антителе мыши, которое содержит все шесть CDR из антител мыши). В других вариантах осуществления гуманизированные антитела имеют одну или несколько CDR (одну, две, три, четыре, пять, шесть), измененных по сравнению с исходным антителом, которые также называют одной или несколькими CDR, "полученными из" одной или нескольких CDR исходного антитела. Возможность гуманизации антитела хорошо известна (см., например, патенты США №№5225539, 5530101, 5585089, 5859205, 6407213, 6881557).

[0083] Термин "антитело "XX" подразумевается как означающий антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент (например, антитело "С10-2"), содержащие: (а) легкую цепь и тяжелую цепь, вариабельный домен тяжелой цепи либо CDR1-3 вариабельного домена тяжелой цепи, определенные по их соответствующему SEQ ID NO, или (b) вариабельный домен легкой цепи и тяжелую цепь, вариабельный домен тяжелой цепи либо CDR1-3 вариабельного домена тяжелой цепи, определенные по их соответствующему SEQ ID NO, или (с) CDR1-3 вариабельного домена легкой цепи, определенные по их соответствующему SEQ ID NO, и тяжелую цепь, вариабельный домен тяжелой цепи либо CDR1-3 вариабельного домена тяжелой цепи, определенные по их соответствующему SEQ ID NO, или состоящие из них. В определенных вариантах осуществления антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент определены содержащимися в них полным вариабельным доменом тяжелой цепи, определенным по его SEQ ID NO, и вариабельным доменом легкой цепи, определенным по его SEQ ID NO.

[0084] Если в данном документе не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константном домене антитела соответствует системе нумерации EU, также называемой EU-индексом, которая описана в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

[0085] В некоторых антителах для сохранения связывания в гуманизированном антителе необходима лишь часть CDR, а именно подмножество остатков CDR, необходимых для связывания, называемых SDR. Остатки CDR, не контактирующие с соответствующим эпитопом и не содержащиеся в SDR, можно идентифицировать на основании предыдущих исследований. Например, остатки Tyr, Ser, Gin, Lys, Phe, Gin, соответствующие остаткам 60-65 НС под SEQ ID NO: 11, часто не являются необходимыми для выделения из областей CDR по Kabat (они также встречаются в CDR2 НС (SEQ ID NO: 7), лежащих за пределами гипервариабельных петель по Chothia (см. Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, публикация №91-3242; Chothia, C. et al. (1987) "Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins", J. Mol. Biol. 196: 901-917), с помощью молекулярного моделирования и/или эмпирическим путем или согласно описанному в Gonzales, N.R. et al. (2004) "SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity", Mol. Immunol. 41: 863-872. В таких гуманизированных антителах в положениях, в которых отсутствуют один или несколько остатков донорного CDR или в которых весь донорный CDR пропущен, аминокислота, занимающая положение, может представлять собой аминокислоту, занимающую соответствующее положение (согласно нумерации по Kabat) в акцепторной последовательности антитела. Количество таких замен акцепторных аминокислот на донорные в CDR, которые нужно включить, отражает баланс альтернативных мнений. Такие замены являются потенциально преимущественными для снижения количества мышиных аминокислот в гуманизированном антителе и снижения вследствие этого потенциальной иммуногенности. Тем не менее, замены также могут обуславливать изменения аффинности, и значительного уменьшения значений аффинности предпочтительно избегают. Положения для замены в пределах CDR и подлежащие замене аминокислоты также можно выбрать эмпирическим путем.

[0086] Антитела также характеризуют согласно системе нумерации IMGT, которая четко определенна в уровне техники. Длина (по числу аминокислот, т.е. по числу занимаемых положений) является важным и исходным понятием IMGT-ONTOLOGY (http://www.imgt.org). По значениям длины CDR-IMGT характеризуют IG и V-ОБЛАСТИ TR генов зародышевой линии и V-ДОМЕНЫ реаранжированных генов, кДНК и белки.

[0087] Например, антитела можно характеризовать согласно схеме нумерации Chothia http://www.bioinf.org.uk/abs/. Схема нумерации Chothia является идентичной схеме Kabat, однако происходят вставки в CDR-L1 и CDR-H1 в структурно определенных положениях. Схема нумерации Chothia основана на положении структурных областей петель. Это означает, что топологически эквивалентные остатки в этих петлях получают одинаковую метку (в отличие от схемы Kabat).

[0088] Тот факт, что изменение одной аминокислоты в остатке CDR может привести к утрате функционального связывания (Rudikoff, S. etc. (1982) "Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79(6): 1979-1983), обеспечивает возможность систематической идентификации альтернативных функциональных последовательностей CDR. В одном предпочтительном способе получения таких вариантов CDR полинуклеотид, кодирующий CDR, подвергают мутации (например, посредством случайного мутагенеза или с помощью сайт-направленного способа (например, с амплификацией, опосредованной полимеразной цепной реакцией, с праймерами, которые кодируют мутантный локус)) с получением CDR, имеющего замененный аминокислотный остаток. Путем сравнения идентичности исходной (функциональной) последовательности CDR по соответствующему остатку с идентичностью варианта последовательности CDR с заменой (нефункционального) для этой замены можно определить вес замены согласно BLOSUM62.iij. В системе BLOSUM представлена матрица аминокислотных замен, создаваемая путем анализа базы данных последовательностей в отношении достоверных выравниваний (Eddy, S.R. (2004) "Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?", Nature Biotech. 22(8): 1035-1036; Henikoff, J.G. (1992) "Amino acid substitution matrices from protein blocks", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 10915-10919; Karlin, S. et al. (1990) "Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 2264-2268; Altschul, S.F. (1991) "Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective", J. Mol. Biol. 219, 555-565. В настоящее время наиболее совершенной базой данных BLOSUM является база данных BLOSUM62 (BLOSUM62.iij). В таблице 1 представлены значения веса замен согласно BLOSUM62.iij (чем больше вес, тем более консервативной является замена и, следовательно, более вероятно, что замена не будет влиять на функцию). Если эпитопсвязывающий фрагмент, содержащий полученную в результате CDR, не может связываться с тау-белком, например, то полагают, что вес замены, согласно BL.OSUM62.iij, свидетельствует о ее недостаточной консервативности, и выбирают и производят новую замену-кандидата, имеющую больший вес замены. Так, например, если исходный остаток представлял собой глутамат (Е), а нефункциональный заменяющий остаток представлял собой гистидин (Н), то вес замены, согласно BLOSUM62.NJ, будет равен 0, а более консервативные изменения (например, аспартат, аспарагин, глутамин или лизин) являются предпочтительными.

[0089] Таким образом, настоящее изобретение предусматривает применение случайного мутагенеза для идентификации улучшенных CDR. В контексте настоящего изобретения консервативные замены могут быть определены как замены в пределах классов аминокислот, отраженных в одной или нескольких из таблиц 2, 3 или 4.

[0090] Группы более консервативных замен включают валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин и аспарагин-глутамин.

[0091] Дополнительные группы аминокислот также могут быть составлены с применением принципов, описанных, например, в Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (2^nd Ed. 1993), W.H. Freeman and Company.

[0092] В качестве альтернативы можно применять технологию фагового дисплея для повышения (или снижения) аффинности CDR. В этой технологии, называемой созреванием аффинности, используется мутагенез или «прогулка по CDR» и повторный отбор с применением антигена-мишени или его антигенного эпитопсвязывающего фрагмента для идентификации антител, имеющих CDR, которые связываются с более высокой (или более низкой) аффинностью с антигеном по сравнению с первоначальным или исходным антителом (см., например, Glaser et al. (1992) J. Immunology 149:3903). Мутагенез целых кодонов, а не отдельных нуклеотидов, приводит к получению полуслучайного набора аминокислотных мутаций. Можно конструировать библиотеки, состоящие из пула вариантов клонов, каждый из которых отличается изменением одной аминокислоты в одном CDR и который содержит варианты, представляющие каждую возможную аминокислотную замену для каждого остатка CDR. Мутанты с повышенной (или пониженной) аффинностью связывания с антигеном можно подвергнуть скринингу путем приведения в контакт иммобилизованных мутантов с меченым антигеном. Для идентификации мутантных антител с повышенной или пониженной аффинностью к антигену можно применять любой известный из уровня техники способ скрининга (например, ELISA) (см. Wu et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 95:6037; Yelton et al., 1995, J. Immunology 155:1994). Возможно также применять "прогулку по CDR", в ходе которой легкая цепь подвергается случайному мутагенезу (см. Schier et al., 1996, J. Mol. Bio. 263:551).

[0093] Способы осуществления такого созревания аффинности описаны, например, в Krause, J.С. et al. (2011) "An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody", MBio. 2(1) pii: e00345-10. doi: 10.1128/mBio.00345-10; Kuan, C.T. et al. (2010) "Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas", Int. J. Cancer 10.1002/ijc.25645; Hackel, B.J. et al. (2010) "Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes", J. Mol. Biol. 401(1):84-96; Montgomery, D.L. et al. (2009) "Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41", MAbs 1(5): 462-474; Gustchina, E. et al. (2009) "Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth", Virology 393(1): 112-119; Finlay, W.J. et al. (2009) "Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy: Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions", J. Mol. Biol. 388(3): 541-558; Bostrom, J. et al. (2009) "Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development", Methods Mol. Biol. 525: 353-376; Steidl, S. et al. (2008) "In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification", Mol. Immunol. 46(1): 135-144; и Barderas, R. et al. (2008) "Affinity Maturation Of Antibodies Assisted By In Silico Modeling", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 105(26): 9029-9034.

[0094] Таким образом, последовательность вариантов CDR охватываемых антител или их эпитопсвязывающих фрагментов может отличаться от последовательности CDR исходного антитела, вариантов С10-2 и С10.2 благодаря заменам; например, замененным 4 аминокислотным остаткам, 3 аминокислотным остаткам, 2 аминокислотным остаткам или 1 аминокислотному остатку. Согласно варианту осуществления настоящего изобретения дополнительно предусматривается, что аминокислоты в CDR-областях можно заменять посредством консервативных замен, определенных в 3 таблицах выше. Например, кислый остаток Asp можно заменить на Glu без значительного влияния на характеристики связывания антитела.

[0095] Как используется в данном документе, говорят, что антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент "специфически" связываются с областью другой молекулы (т.е. эпитопом), если они реагируют или ассоциируют с этим эпитопом чаще, быстрее, с большей длительностью и/или с большей аффинностью или авидностью по сравнению с альтернативными эпитопами. Также при прочтении этого определения следует понимать, что, например, антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с первой мишенью, могут не связываться со второй мишенью или могут делать это не специфически или не преимущественно. Используемый в данном документе термин "связывание" применительно к связыванию антитела с предварительно определенным антигеном в типичном случае относится к связыванию с аффинностью, соответствующей KD, составляющей приблизительно 10^-7 М или меньше, как, например, приблизительно 10^-8 М или меньше, как, например, приблизительно 10^-9 М или меньше, при определении с помощью, например, технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе BIAcore® 3000 с применением антигена в качестве лиганда и антитела в качестве анализируемого вещества, и к связыванию с предварительно определенным антигеном с аффинностью, соответствующей KD, по меньшей мере в десять раз более низкой, как, например, по меньшей мере в 100 раз более низкой, например, по меньшей мере в 1000 раз более низкой, как, например, по меньшей мере в 10000 раз более низкой, например, по меньшей мере в 100000 раз более низкой, чем для его аффинности связывания с неспецифичным антигеном (например, BSA, казеином), отличным от предварительно определенного антигена, или близкородственным антигеном. Степень, на которую аффинность является более низкой, зависит от KD антитела, так что если KD антитела является очень низкой (то есть антитело является высокоспецифическим), то степень, на которую аффинность к антигену является более низкой, чем аффинность к неспецифическому антигену, может быть по меньшей мере 10000-кратной.

[0096] Термин "kd" (с-1 или 1/с), используемый в данном документе, относится к константе скорости диссоциации для конкретного взаимодействия антитела и антигена. Указанное значение также называют значением koff.

[0097] Термин «ka» (М-1×с-1 или 1/М⋅с), используемый в данном документе, относится к константе скорости диссоциации для конкретного взаимодействия антитела и антигена.

[0098] Термин «KD» (М), используемый в данном документе, относится к равновесной константе диссоциации для конкретного взаимодействия антитела и антигена, получаемой путем деления kd на ka.

[0099] Термин «KA» (М-1 или 1/М), используемый в данном документе, относится к равновесной константе ассоциации для конкретного взаимодействия антитела и антигена, получаемой путем деления ka на kd.

[00100] В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу к тау-белку или его эпитопсвязывающему фрагменту, которые проявляют одно или несколько следующих свойств:

(i) практически отсутствующей способности к связыванию с нефосфорилированным тау-белком;

(ii) практически отсутствующей способности к связыванию с тау-белком, фосфорилированным в S404 и не фосфорилированным в S396;

(iii) способности к связыванию с тау-белком, фосфорилированным в S396;

(iv) способности к связыванию с тау-белком, фосфорилированным как в S396, так и в S404;

(v) способность к селективному проведению различий между фосфорилированными остатками S396 и S404 тау-белка, так что они практически не способны связываться с фосфорилированным остатком 404 (pS404);

(vi) способности к связыванию с гиперфосфорилированным тау-белком из головного мозга людей с болезнью Альцгеймера;

(vii) способности к проведению различий между патологическим и непатологическим человеческим тау-белком и/или

(viii) способности к специфичному уменьшению полос гиперфосфорилированного тау-белка размером 64 кДа и 70 кДа по меньшей мере на 90% без уменьшения при этом полосы тау-белка размером 55 кДа более чем на 10% при применении согласно описанному в данном документе с иммуноистощенными экстрактами от трансгенных мышей rTg4510 или способности к специфичному уменьшению полос фосфорилированного в S396 гиперфосфорилированного тау-белка по меньшей мере на 90% без уменьшения при этом полос негиперфосфорилированного тау-белка более чем на 10% при применении согласно описанному в данном документе с экстрактами головного мозга, полученными посмертно от людей с AD.

[00101] Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения высокоспецифичных высокоаффинных антител, где способ предусматривает стадии:

(A) проведения инъекции иммуногена млекопитающему с тем, чтобы иммунизировать указанное млекопитающее;

(B) повторения указанной иммунизации указанного млекопитающего два или более раз;

(C) скрининга образца сыворотки от указанного повторно иммунизированного млекопитающего на наличие необходимых высокоспецифичных высокоаффинных антител, но в значительно меньшей степени способных связываться с другим белком; и

(D) извлечения указанных высокоспецифичных высокоаффинных антител.

[00102] Таким образом, настоящее изобретение относится к высокоспецифичному высокоаффинному антителу к патогенному гиперфосфорилированному тау-белку, содержащему гиперфосфорилированный остаток S396. Такие антитела могут быть получены с помощью адаптации вышеуказанного способа получения высокоспецифичных высокоаффинных антител к следующему:

(A) проведения инъекции иммуногена млекопитающему, при этом указанный иммуноген предусматривает дифосфорилированный пептид, содержащий 18-40, как, например, 18-30, как, например, 20-30 последовательных аминокислотных остатков, содержащих (SEQ ID NO: 2), охватывающий остатки 386-410 тау-белка 2N4R, с тем, чтобы иммунизировать указанное млекопитающее;

(B) повторения указанной иммунизации указанного млекопитающего два или более раз;

(C) проведения скрининга образца сыворотки крови от указанного многократно иммунизированного млекопитающего в отношении наличия высокоспецифичных высокоаффинных антител, способных связываться с патогенным гиперфосфорилированным тау-белком, содержащим фосфорилированный остаток S396, но в значительно меньшей степени способных связываться с непатогенным тау-белком; и

(D) извлечения указанных высокоспецифичных высокоаффинных антител.

[00103] Как используется в данном документе, "практически отсутствующая способность" к связыванию с молекулой тау-белка означает более чем 20% различие, более чем 40% различие, более чем 60% различие, более чем 80% различие, более чем 100% различие, более чем 150% различие, более чем 2-кратное различие, более чем 4-кратное различие, более чем 5-кратное различие или более чем 10-кратное различие в функциональных характеристиках по сравнению с выявляемым связыванием, опосредованным эталонным антителом.

[00104] Термины "селективный" и "иммуноселективный", когда речь идет о способностях к связыванию, которыми обладает антитело к тау-белку в отношении двух эпитопов, подразумеваются как означающие то, что для наблюдаемого связывания в насыщающих условиях проявляется по меньшей мере 80% различие, по меньшей мере 95% различие и наиболее предпочтительно 100% различие (т.е. отсутствие выявляемого связывания с одним эпитопом). Термины "селективный" и "иммуноселективный", когда речь идет об антителе к тау-белку, дополнительно подразумеваются как означающие то, что антитело связывается с гиперфосфорилированным тау-белком из головного мозга людей с болезнью Альцгеймера и способно различать патологический и непатологический человеческий тау-белок.

[00105] Термины "экстрагируемая в TBS" (S1), "экстрагируемая в высокосолевом растворе/саркозиле" (S3) и "нерастворимая в саркозиле" (Р3) фракции означают фракции, получаемые с помощью биохимического фракционирования тау-белка, описанного в данном документе.

[00106] Термин "нормальный тау-белок" относится к нормальному тау-белку головного мозга, содержащему 2-3 моля фосфата на моль белка.

[00107] Термин "гиперфосфорилированный тау-белок" относится к полифосфорилированным молекулам тау-белка, соответствующим индуцированному полианионными молекулами сдвигу подвижности в вестерн-блоттинге, или к молекулам тау-белка, имеющим более пяти, шести или семи фосфорилированных сериновых, треониновых или тирозиновых сайтов.

[00108] Термин "тау-белок, имеющий фосфорилированный остаток 396" относится к гиперфосфорилированному тау-белку, в котором сериновый остаток 396 является фосфорилированным.

[00109] Термин "трансгенное животное, отличное от человека" относится к животному, отличному от человека, имеющему геном, содержащий один или несколько человеческих трансгенов или трансхромосом, кодирующих тяжелую и/или легкую цепь (интегрированных или не интегрированных в природную геномную ДНК животного), которое способно экспрессировать полностью человеческие антитела. Например, трансгенная мышь может иметь трансген, кодирующий человеческую легкую цепь, и либо трансген, кодирующий человеческую тяжелую цепь, либо трансхромосому, кодирующую человеческую тяжелую цепь, вследствие чего у мыши вырабатывается человеческое антитело к тау-белку при иммунизации антигенным тау-белка и/или клетками, экспрессирующими тау-белок. Трансген, кодирующий человеческую тяжелую цепь, может быть интегрирован в хромосомную ДНК мыши, как в случае с трансгенными мышами, например, мышами HuMAb, такими как мыши НСо7 или HCol2, или трансген, кодирующий человеческую тяжелую цепь, может сохраняться внехромосомно, как в случае с трансхромосомными мышами KM, описанными в WO 02/43478. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши (в совокупности называемые в данном документе "трансгенными мышами") способны вырабатывать несколько изотипов моноклональных антител человека к данному антигену (таких как IgG, IgA, IgM, IgD и/или IgE), подвергаясь V-D-J-рекомбинации и переключению изотипа.

[00110] Трансгенное животное, отличное от человека, также можно использовать для получения антител к специфическому антигену путем введения генов, кодирующих такое специфичное антитело, например, путем формирования функциональной связи генов с геном, экспрессируемым в молоке животного.

[00111] Термин "лечение" или "осуществление лечения", используемый в данном документе, означает облегчение, замедление, ослабление или устранение прогрессирования или тяжести заболевания или нарушения или облегчение, замедление, ослабление или устранение одного или нескольких симптомов или побочных эффектов такого заболевания или нарушения. Для целей настоящего изобретения "лечение" или "осуществление лечения", дополнительно означает подход для получения полезных или желаемых клинических результатов, при этом "полезные или желаемые клинические результаты" включают без ограничения облегчение симптома, снижение степени нарушения или заболевания, стабилизированное (т.е. не ухудшающееся) состояние заболевания или нарушения, задержку или замедление прогрессирования состояния заболевания или нарушения, облегчение или смягчение состояния заболевания или нарушения и ремиссию заболевания или нарушения, либо частично, либо полностью.

[00112] "Эффективное количество", применяемое в отношении антитела или его эпитопсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, относится к количеству, которое при введении в необходимых дозах и в течение необходимых периодов времени является достаточным для достижения намеченного биологического эффекта или желаемого терапевтического результата, в том числе без ограничения клинических результатов. Фраза "терапевтически эффективное количество", применяемая в отношении антитела или его эпитопсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, подразумевается как означающая количество антитела или его эпитопсвязывающего фрагмента, которое является достаточным для облегчения, смягчения, стабилизации, устранения, замедления, ослабления или задержки прогрессирования состояния нарушения или заболевания или симптома нарушения или заболевания. В варианте осуществления способ по настоящему изобретению предусматривает введение антитела или его эпитопсвязывающего фрагмента в комбинациях с другими соединениями. В таком случае "эффективное количество" представляет собой количество комбинаций, достаточное для того, чтобы вызывать желаемый биологический эффект.

[00113] Терапевтически эффективное количество антитела к тау-белку или его эпитопсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние заболевания, возраст, пол и масса индивидуума, а также от способности антитела к тау-белку или его эпитопсвязывающего фрагмента вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором терапевтически благоприятные эффекты превосходят любые токсические или пагубные эффекты антитела или части антитела.

[00114] Как указано выше, настоящее изобретение, в частности, относится к моноклональным антителам или их эпитопсвязывающим фрагментам и к абсолютно новому способу получения таких молекул (и, следовательно, таких их эпитопсвязывающих фрагментов). Эта возможность выделять моноклональные антитела с помощью нового способа представлена в данном документе на примере его применения для выделения моноклональных антител, способных специфически связываться с фосфорилированным сериновым остатком 396 (P-S396, pS396, ^{p}S396) человеческого тау-белка (SEQ ID NO: 1). Эти антитела дополнительно характеризуются своей способностью к проведению различий между фосфорилированными остатками серином-396 и серином-404 (P-S404, pS404), так что они не связываются с тау-белком с фосфорилированным серином-404, за исключением случаев, когда тау-белок также фосфорилирован по остатку 396.

[00115] Антитела по настоящему изобретению или их эпитопсвязывающий фрагмент были получены и выделены путем применения нового способа, который способствует отбору pS396-специфичных антител. Дополнительно, посредством применения этой весьма строгой процедуры отбора клонов антител были получены антитела, которые являются не только высокоспецифичными в отношении S396, но также и высокоселективными в отношении фосфорилированного эпитопа pS396. Эти антитела уникальным образом распознают тау-белок из головного мозга с болезнью Альцгеймера. Процедура скрининга обеспечивает идентификацию антител, обладающих функциональной и терапевтической полезностью.

[00116] Индуцировали выработку антител к дифосфорилированному пептиду (SEQ ID NO: 2), охватывающему остатки 386-408 тау-белка 2N4R. Мышей иммунизировали фосфорилированным пептидом. После получения достаточных титров антител мышей умерщвляли и получали гибридомы. Гибридомы подвергали скринингу с помощью дот-блот-анализа и MSD-ELISA с иммобилизованным патологическим и непатологическим человеческим тау-белком. Способность к проведению различий между патологическим и непатологическим человеческим тау-белком в ходе дот-блот-анализа и вестерн-блот-анализа применяли для отбора гибридом. Отбирали шестнадцать клонов, из которых извлекали четыре гибридомных клона, которые вырабатывали антитела, характеризующиеся чрезвычайно высокими способностями к связыванию с патологическим материалом человеческого тау-белка.

[00117] Специфичное связывание с патологическим и непатологическим тау-белком также определяли путем выделения тау-белка из пораженного заболеванием и не пораженного заболеванием головного мозга людей с AD и иммобилизации этого материала на планшетах для MSD-ELISA (пример 4).

[00118] Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к моноклинальному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, образование которых происходит в ответ на дифосфорилированный пептид, содержащий по меньшей мере 18, как, например, по меньшей мере 20, последовательных аминокислотных остатков в пределах (SEQ ID NO: 2), охватывающего остатки 386-410 тау-белка 2N4R. В этом аспекте настоящего изобретения образование моноклонального антитела или его эпитопсвязывающего фрагмента в типичном случае вызывается в ответ на дифосфорилированный пептид, содержащий 18-40, как, например, 18-30, как, например, 20-30, последовательных аминокислотных остатков, содержащих (SEQ ID NO: 2), охватывающий остатки 386-410 тау-белка 2N4R.

[00119] Дополнительный аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, обладающие специфичностью в отношении фосфорилированного тау-белка (pTau) от пациентов, пораженных AD, по сравнению со здоровыми контрольными субъектами в соответствующей возрастной группе, так что указанные моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент характеризуются различием в специфичности в отношении фосфорилированного тау-белка (pTau) от пациентов, пораженных AD, по сравнению с тау-белком от здоровых контрольных субъектов в соответствующей возрастной группе, представляющим собой более чем 50-кратное, как, например, более чем 100-кратное повышение специфичности в отношении материала, пораженного AD, по сравнению с материалом от здоровых контрольных субъектов в основанном на ELISA анализе для выявления фосфорилированного тау-белка (pTau) в гомогенатах головного мозга от субъектов с AD и от здоровых контрольных субъектов с применением специфической схемы 1 ELISA или MSD для фосфорилированных и мультимерных молекул, описанной в данном документе.

[00120] Связанный аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, обладающие специфичностью в отношении тау-белка из материала, пораженного AD, так что указанные моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент характеризуются различием в специфичности в отношении материала, пораженного AD, по сравнению с материалом от здоровых контрольных субъектов в соответствующей возрастной группе, представляющим собой более чем 50-кратное, как, например, более чем 100-кратное повышение специфичности в отношении материала, пораженного AD, по сравнению с материалом от здоровых контрольных субъектов в основанном на ELISA или MSD анализе для выявления фосфорилированного тау-белка (pTau) в гомогенатах головного мозга от субъектов с AD и от здоровых контрольных субъектов с применением специфической схемы 1 ELISA для фосфорилированных и мультимерных молекул.

[00121] Способ выполнения схемы 1 ELISA или MSD включает стадии А) обеспечения захвата патологических антигенных человеческих тау-белков из образцов головного мозга от субъектов с AD на планшетах, покрытых С10-2; В) инкубирования антигенных тау-белков с возрастающими концентрациями pS396-специфичных антител и С) выявления остаточного свободного антигенного тау-белка, захваченного иммобилизованным С10.2, с помощью меченых SULFO-TAG антител к человеческому (общему) тау-белку от MSD.

[00122] Более конкретно, стадия А включает покрытие планшетов MSD (в типичном случае в течение ночи при 4°С) антителом С10-2, в типичном случае при 0,5 мкг/мл (захватывающим антителом) в буфере для покрытия, блокирование (в типичном случае в течение 1 часа при комнатной температуре) и промывание, в типичном случае 3 раза. Стадия В включает смешивание образцов лизата Р3 (в типичном случае разбавленного при 1:1000=2-4 мкг/мл общего белка) и/или S1(p) (в типичном случае разбавленного при 1:300=20-40 нг/мл общего белка) из материала от субъектов с AD (объединенных от 3 пациентов) с антителом, специфичным к пептидному эпитопу pS396, в ступенчато изменяющихся концентрациях и инкубирование (в типичном случае в течение 1 часа при комнатной температуре). Реакционные смеси затем инкубируют в течение 2 часов в планшетах, подготовленных на стадии А. Стадия С включает выявление тау-белка, захваченного С10-2, с помощью меченного SULFO-TAG антитела к человеческому тау-белку (в типичном случае при 1:50) от MSD согласно инструкциям производителя. Планшеты анализируют на SECTOR® S600 от MSD. Р3 из материала от субъектов с AD и S1(p) из материала от субъектов с AD тестируют согласно аналогичной схеме.

[00123] Дополнительный вариант осуществления направлен на антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с фосфорилированным сериновым остатком 396 человеческого тау-белка (SEQ ID NO: 1), которые были получены или произведены в линии клеток, такой как линия человеческих клеток, линия клеток млекопитающего, отличного от человека, линия клеток насекомого, дрожжей или бактерии.

[00124] Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с фосфорилированным остатком 396 человеческого тау-белка (SEQ ID NO: 1), получают в линии клеток СНО, линии клеток HEK, линии клеток BHK-21, линии мышиных клеток (такой как линия клеток миеломы), линии клеток фибросаркомы, линии клеток PER.C6, линии клеток HKB-11, линии клеток САР и линии человеческих клеток HuH-7.

[00125] Характеристики специфичной аффинности и свойств связывания вариантов С10-2 и С10.2 получали с применением пептидов 386-410 тау-белка (2R4N), фосфорилированных либо не фосфорилированных в положении 396 или 404. Путем применения протокола специфичной иммунизации и скрининга, вкратце изложенного в настоящей заявке, получают высокоспецифичные в отношении фосфосерина-396 (pS396) антитела.

[00126] Для демонстрации того, что антитела являются специфичными в отношении патологического тау-белка, также получали характеристики антител С10-2 с помощью иммуногистохимического анализа. Антитела проявляют высокоспецифичное связывание с нейрофибриллярными клубками в образцах головного мозга от субъектов с болезнью Альцгеймера (клубки тау-белка) и в срезах от трансгенных по тау-белку мышей Tg4510, экспрессирующих человеческий (P301L) мутантный тау-белок. Связывание с тканью из контрольных образцов головного мозга людей и из образцов головного мозга нетрансгенных мышей не наблюдается, что демонстрирует то, что антитела специфически связываются с человеческим тау-белком, и в частности, с тау-белком, ассоциированным с альцгеймеровской патологией.

Антитело C10-2

[00127] Один аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

[00128] Дополнительный аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12; и

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11.

[00129] Альтернативно определенный, используя определение согласно IMGT, один аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 40;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 41;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 43;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 44; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 45.

[00130] Альтернативно определенный, используя определение согласно Chotia, один аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 52;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 53; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 54.

[00131] Показана уникальная способность антител по настоящему изобретению к распознаванию тау-белка, ассоциированного с характерной для заболевания патологией. Сравнивали связывание патологического и непатологического тау-белка. Сравнение проводят в отношении пяти опубликованных антител к тау-белку: hACI-2B6, IPN002, HJ8.5, 2.10.3 и 4Е4. Антитело 2.10.3 является коммерчески доступным рекомбинантным моноклональным антителом, которое специфически связывается с тау-белком, фосфорилированным по серину-422 (pS422). HJ8.5 является коммерчески доступным моноклональным антителом, которое распознает N-концевую область только человеческого тау-белка (эпитоп, соответствующий аминокислотным остаткам 25-30). Антитело относится к изотипу IgG2b. Терапевтическое антитело к тау-белку NI-105-4Е4 является коммерчески доступным антителом. В таблице показано, что выделенные антитела проявляют исключительно высокую степень специфичности и селективности в отношении человеческого патологического тау-белка. Эта селективность превосходит селективность любого из сравниваемых антител, показанных в таблице 5.

[00132] При насыщении антитело С10-2 проявляет более чем 100-кратную селективность в отношении Р3 тау-белка, выделенной из образцов головного мозга людей с AD.

[00133] Для демонстрации того, что отобранные антитела обладают функциональной и терапевтической полезностью, антитела тестировали в анализах агрегации тау-белка in vitro и в клетке (пример 8). Эти анализы представляют собой функциональные анализы, в которых демонстрируется, что антитела способны препятствовать процессу патологической агрегации тау-белка. Клетки HEK293 транзиентно трансфицируют человеческим тау-белком P301L-FLAG (4R0N). Затем клетки подвергают воздействию экстрактов, содержащих тау-белок, из образцов головного мозга людей с AD или из образцов головного мозга трансгенных Tg4510. Это воздействие патологического тау-белка способствует поглощению тау-белка клетками и его внутриклеточной агрегации. Как иммуноистощение препаратов тау-белка с помощью антитела С10-2, так и непосредственная обработка клеток этими антителами способны обеспечивать существенное уменьшение образования агрегатов тау-белка.

[00134] Терапевтическую полезность антитела С10-2 также оценивали у мышей, экспрессирующих человеческий тау-белок/PS1. Эта мышиная модель является более подходящей животной моделью заболевания AD, в которой патология AD образуется лишь в позднем возрасте (в возрасте 12-18 месяцев). Тем не менее, у мышей проявляется гиперфосфорилирование тау-белка до появления патологии плотных клубков. Мышам инъецировали дозу 15 мг/кг два раза в неделю в течение длительного периода 13 недель. У мышей, обработанных антителом, проявляется существенное уменьшение уровня фосфорилированного тау-белка, что указывает на то, что при длительной обработке с помощью С10-2 будет уменьшаться патология клубков и, таким образом, последующая нейродегенерация in vivo.

[00135] Антитела по настоящему изобретению специфично удаляют гиперфосфорилированный тау-белок из экстрактов головного мозга мышей rTg4510 с помощью способов иммуноистощения. Кроме того, антитела по настоящему изобретению не удаляют нормальный тау-белок из гомогенатов, тогда как коммерчески доступное антитело Tau5 удаляет. В отличие от коммерческих антител, связывающихся с тау-белками, в которых имеет место фосфорилирование по остатку 404 или как по остатку 404, так и по остатку 396, антитела по настоящему изобретению специфично удаляют на 95% гиперфосфорилированный тау-белок, который фосфорилирован по серину-396. Эксперименты (пример 12) демонстрируют, что несмотря на то, что антитело по настоящему изобретению удаляет лишь очень небольшую долю общего тау-белка в гомогенате головного мозга (8%), антитела, тем не менее, специфично удаляют гиперфосфорилированный тау-белок (на 90%). Соответственно, один аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с патогенным гиперфосфорилированным тау-белком. Дополнительно, в экспериментах, в которых гиперфосфорилированный тау-белок удаляли с помощью антитела по настоящему изобретению, активность затравочного действия устраняется. При удалении гиперфосфорилированного тау-белка из гомогенатов гомогенаты больше не индуцируют затравочное действие с формированием патологии тау-белка. Было выдвинуто предположение, что при уменьшении затравочного действия уменьшается развитие образования клубков и прогрессирование таупатий, в том числе болезни Альцгеймера. Соответственно, дополнительный аспект настоящего изобретения направлен на антитело по настоящему изобретению для применения в уменьшении прогрессирования AD или интенсивности симптомов AD.

Антитело D55E

[00136] Один аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу D55E. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 28; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

[00137] Дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело D55E, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12;

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13.

[00138] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело D55E, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим по меньшей мере одно из:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

и дополнительно содержащим

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 28; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

Антитело D55Q

[00139] Другой аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу D55Q. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 29; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

[00140] Дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело D55Q, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12; и

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14.

[00141] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело D55Q, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим по меньшей мере одно из:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

и дополнительно содержащим

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 29; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

Антитело D55S

[00142] Другой аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу D55S. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 30; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

[00143] Дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело D55S, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12; и

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15.

[00144] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело D55S, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим по меньшей мере одно из:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

и дополнительно содержащим

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 30; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

Исследования с применением антитела D55S, антитела D55Q, антитела D55E указывают на то, что мутация этого остатка приводит к образованию антитела с неизменными свойствами связывания по сравнению с указанными антителами до и после обработки при низком значении рН в течение длительного периода времени при комнатной температуре, что указывает на то, что изомеризация отсутствует при низком значении рН или что любой изомеризованный белок имеет неизменные свойства связывания по сравнению с предварительной обработкой.

Антитело N32S

[00145] Другой аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу N32S. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 31;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

[00146] Дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N32S, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16; и

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11.

[00147] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N32S, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 31;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

и дополнительно содержащим по меньшей мере одно из

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

[00148] Альтернативным определением антитела N32S, используя определение согласно IMGT, является моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 46;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 47;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 43;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 44; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 45.

[00149] Дополнительным альтернативным определением антитела N32S, используя определение согласно Chotia, является моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 31;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 52;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 53; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 54.

[00150] Как можно увидеть из фигуры 1, IC₅₀ антитела N32S (черные кружки) является уменьшенной по сравнению с антителом С10-2: рассчитано, что IC50 N32S составляет 44 нМ. Это заметное улучшение по сравнению с С10-2 не было ожидаемым. Как подтверждается фигурой 1, один аспект настоящего изобретения направлен на антитело, которое ингибирует Р3 из материала от субъектов с AD в жидкофазном анализе ингибирования, описанном в данном документе, таким образом, что сигнал уменьшается на 50% при концентрации антитела, составляющей 100 нМ или меньше. В одном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению характеризуется IC50, составляющей от 0,1 нМ до 100 нМ, как, например, концентрацией 50 нМ или меньше, как, например, от 0,1 нМ до 50 нМ, исходя из жидкофазного анализа ингибирования захвата антигенов Р3 из материала от субъектов c AD.

[00151] Данные, полученные при применении антитела N32S, указывают, что мутация в положении 32 легкой цепи антитела С10-2 или CDR1 LC антитела С10-2 по типу замены на серии приводит к повышенной кажущейся аффинности (IC₅₀) в анализах ингибирования пептида. Кроме того, мутация в положении 32 по типу замены на серии или глутамин (антитело N32S и антитело N32Q) устраняет дезамидирование как в положении 32, так и 34, как показано на фигуре 20. Специфическая активность, определенная в рамках исследований затравочного действия и агрегации in vitro, сохраняется как в варианте N32S, так и N32Q.

[00152] Возможность потенциального дезамидирования идентифицировали в С10-2 в положении, которое может привести к неоднородности партий белков. С10-2 характеризовались неоднородным связыванием с антигенами Р3 из материала от субъектов с AD, при этом незначительная доля с высокой кажущейся аффинностью (2-5 нМ) и преобладающим связыванием с низкой кажущейся аффинностью (200-1000 нМ) (фигура 1). Неоднородное связывание может отражать различные субпопуляции дезамидированных и недезамидированных С10-2. Вариант получали с помощью замены (N32S), которая предотвращала дезамидирование. Показано улучшенное связывание по активности, как указано в целом по сниженной IC50 (более высокой кажущейся аффинности) по сравнению с С10-2. Вводили дополнительную замену А101Т, приводящую к однородному связыванию по типу, характеризующемуся высокой кажущейся аффинностью. Улучшенная активность связывания как у N32S, так и у N32S-А101Т свидетельствует о том, что с помощью вышеописанных мутаций получают более стабильные и однородные антитела.

Антитело N32Q

[00153] Другой аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу N32Q. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

Специфическая активность, определенная в рамках исследований затравочного действия и агрегации in vitro, сохраняется как в варианте N32S, так и N32Q.

Антитело N34S

[00157] Другой аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу N34S. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ IDNO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ IDNO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

[00158] Дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N34S, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18; и

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11.

[00159] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N34S, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

(с) CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5;

и дополнительно содержащим по меньшей мере одно из

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

Антитело N34Q

[00160] Другой аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу N34Q. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ IDNO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ IDNO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ IDNO: 8.

[00161] Дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N34Q, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19; и

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11.

[00162] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N34Q, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

и дополнительно содержащим по меньшей мере одно из

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

Антитело N32S. N34S

[00163] Другой аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу N32S, N34S. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 35;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

[00164] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N32S, N34S, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим: (а) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20; и

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11.

[00165] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N32S, N34S, относится к моноклинальному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 35;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

и дополнительно содержащим по меньшей мере одно из

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

Антитело N32Q. N34S

[00166] Другой аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу N32Q, N34S. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 36;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

[00167] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N32Q, N34S, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21;

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11.

[00168] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N32Q, N34S, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 36;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

и дополнительно содержащим по меньшей мере одно из

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

Антитело N32Q. N34Q

[00169] Другой аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу N32Q, N34Q. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 37;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(с) CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ IDNO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

[00170] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N32Q, N34Q, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 22; и

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11.

[00171] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N32Q, N34Q, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 37;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

и дополнительно содержащим по меньшей мере одно из

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

Антитело N32S. N34Q

[00172] Другой аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу N32S, N34Q. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 38;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

[00173] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N32S, N34Q, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 23; и

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11.

[00174] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N32S, N34Q, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 38,

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

и дополнительно содержащим по меньшей мере одно из

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

Антитело А101Т

[00175] Другой аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу А101Т. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39.

[00176] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело А101Т, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12; и

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24.

[00177] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело А101Т, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим по меньшей мере одно из:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

(с) CDR3 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5;

и дополнительно содержащим

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39.

[00178] Данные, полученные при применении антитела А101Т, указывают на то, что мутация тяжелой цепи антитела С10-2 или CR3 тяжелой цепи антитела С10-2 приводит к двукратному повышению связывания пептида и 10-20-кратному повышению связывания с материалом РЗ. Дополнительно, варианты, содержащие мутацию А101Т, характеризуются повышенной специфической активностью в анализах затравочного действия in vitro.

Антитело N32S. А101Т

[00179] Другой аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу N32S, А101Т. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 31;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39.

[00180] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N32S, А101Т, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим: (а) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16;

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24.

[00181] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N32S, А101Т, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 31; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39;

и дополнительно содержащим по меньшей мере одно из

(b) CDR2 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

и дополнительно содержащим по меньшей мере одно из

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6; и

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7.

[00182] Используя определение согласно IMGT, антитело N32S, А101Т представляет собой моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 46;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 47;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 49;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 50; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 51.

[00183] Используя определение согласно Chotia, антитело N32S, А101Т представляет собой моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 31;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 55;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 56; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 57.

[00184] Как можно увидеть из фигуры 1, IC50 антитела N32S, А101Т (белые кружки) является существенно уменьшенной по сравнению с антителом С10-2: рассчитано, что IC50 N32S, А101Т составляет 14 нМ. Это заметное улучшение по сравнению с С10-2 не было ожидаемым. Исходя из фигуры 1, один аспект настоящего изобретения направлен на антитело, которое ингибирует РЗ из материала от субъектов с AD в жидкофазном анализе ингибирования, описанном в данном документе, таким образом, что сигнал уменьшается на 50% при концентрации, составляющей 100 нМ антитела или меньше, как, например, от 10 нм до 100 нМ антитела, как, например, при концентрации, составляющей 50 нМ или меньше, как, например, от 10 нМ до 50 нМ антитела. Как показано на фигуре 20, антитело N32S, А101 является очень стабильным в отношении дезамидирования. Как показано на фигуре 19, антитело N32S, А101Т характеризовалось более выраженным уменьшением агрегации.

Антитело N32Q. А101Т

[00185] Другой аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу N32Q, А101Т. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие: (a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: б;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39.

[00186] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N32Q, А101Т, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17; и

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24.

[00187] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N32Q, А101Т, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39;

и дополнительно содержащим по меньшей мере одно из

(b) CDR2 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

и дополнительно содержащим по меньшей мере одно из

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6; и

(е) CDR2 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7.

Антитело N32S. D55E

[00188] Другой аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу N32S, D55E. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 31;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 28; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

[00189] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N32S, D55E, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16;

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13.

[00190] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N32S, D55E, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 31; и

(е) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 28;

и дополнительно содержащим по меньшей мере одно из

(b) CDR2 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

и дополнительно содержащим по меньшей мере одно из

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

Антитело N32Q. D55E

[00191] Другой аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу N32Q, D55E. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 28; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

[00192] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N32Q, D55E, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17;

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13.

[00193] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N32Q, D55E, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32; и

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 28;

и дополнительно содержащим по меньшей мере одно из

(b) CDR2 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

и дополнительно содержащим по меньшей мере одно из

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8.

Антитело N34S, А101Т

[00194] Другой аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу N34S, А101Т. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39.

[00195] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N34S, А101Т, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24.

[00196] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N34S, А101Т, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39;

и дополнительно содержащим по меньшей мере одно из

(b) CDR2 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

и дополнительно содержащим по меньшей мере одно из

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6; и

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7.

Антитело N34Q. А101Т

[00197] Другой аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу N34Q, А101Т. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4,

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ IDNO: 7; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39.

[00198] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N34Q, А101Т, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19; и

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24.

[00199] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело N34Q, А101Т, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39;

и дополнительно содержащим по меньшей мере одно из

(b) CDR2 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

и дополнительно содержащим по меньшей мере одно из

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7.

Антитело D55E. А101Т

[00200] Другой аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу D55E, А101Т. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие: (a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 28; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39.

[00201] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело D55E, А101Т, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12; и

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 25.

[00202] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело D55E, А101Т, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим по меньшей мере одно из:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

и дополнительно содержащим

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 28; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39.

Антитело D55Q. А101Т

[00203] Другой аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу D55Q, А101Т. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 29; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39.

[00204] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело D55Q, А101Т, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12; и

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 26.

[00205] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело D55Q, А101Т, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим по меньшей мере одно из:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4; и

(с) CDR3 легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5;

и дополнительно содержащим

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 29; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39.

Антитело DS5S. А101Т

[00206] Другой аспект настоящего изобретения относится к варианту антитела С10-2, антителу D55S, А101Т. Этот аспект настоящего изобретения направлен на моноклональное антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, содержащие:

(a) CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3;

(b) CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4;

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 30; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39.

[00207] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело D55S, А101Т, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим:

(a) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12; и

(b) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 27.

[00208] Альтернативно определенный дополнительный вариант осуществления аспекта настоящего изобретения, направленного на антитело D55S, А101Т, относится к моноклональному антителу или его эпитопсвязывающему фрагменту, содержащим по меньшей мере одно из:

(d) CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6;

(e) CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 29; и

(f) CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39.

Антитело D55S, А101Т