Антитела для лабораторной диагностики концентрации интерлейкина-11
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к антителу, специфичному к ИЛ-11 человека и модельных животных, таких как яванская макака, или его антигенсвязывающему фрагменту, а также к содержащему его конъюгату. Изобретение эффективно для определения в пробах концентрации ИЛ-11 человека и модельных животных, таких как яванская макака. 3 н.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, иммунологии и медицины и может найти применение для лабораторной диагностики концентрации интерлейкина-11 в биологических жидкостях.
Уровень техники
Интерлейкин-11 (ИЛ-11) является плейотропным цитокином, относящимся к семейству интерлейкина-6 (ИЛ-6). Зрелый белок состоит из 178 аминокислотных остатков и имеет небольшую молекулярную массу (около 19 кДа). Гомология последовательности аминокислот ИЛ 11 человека и яванской макаки (Macacafascicularis) составляет 93,8% (Sokolov A.S. et al., Molecules 2016, 21, 1632). Рецепторами ИЛ-11 выступают мультисубъединичные мембранные комплексы, состоящие из a- (IL-11RA) и β-субъединиц (glycoprotein 130, gp 130). Специфическое связывание лиганда с субъединицей IL-11RA вызывает конформационное изменение последней, приводящее к увеличению ее сродства к gp 130. Гомодимеризация молекул gp 130 в составе мультимерного комплекса запускает передачу сигнала внутрь клетки посредством активации сигнальных каскадов JAKs/STAT 1,3, ERK/RAS и mTor/PI3K (Negahdaripour М. et al., Cytokine Growth Factor Rev. 2016;32:41-61).
ИЛ-11 непосредственно стимулирует пролиферацию клеток-предшественников мегакариоцитов и индуцирует созревание мегакариоцитов, что приводит к увеличению продукции тромбоцитов. Кроме этого он стимулирует эритропоэз, миелопоэз, лимфопоэз и развитие остеокластов, активирует синтез белков острой фазы гепатоцитами и ингибирует адипогенез.
Помимо участия ИЛ-11 в физиологически важных процессах, он вовлечен в патогенез ряда заболеваний, в том числе онкологических. Необходимость поиска новых маркеров для проведения диагностики заболеваний на возможно более ранних сроках, особенно это касается онкологических заболеваний, не вызывает сомнений.
Показано, что в плазме больных раком поджелудочной железы достоверно наблюдается повышенный уровень ИЛ-11 (Ren C.L. et al., Tumor Biol. 2014,35:11467-11472).
ИЛ-11 появляется в бронхоальвеолярной лаважной жидкости у больных раком легких, в том числе на фоне хронической обструктивной болезни легких (Pastor M.D. et al., J Thorac Oncol. 2016 Dec; 11 (12):2183-2192).
Спонтанные внутримозговые кровоизлияния сопровождаются повышением содержания ИЛ-11 в плазме крови и спинномозговой жидкости, более того уровень данного цитокина коррелирует со смертностью от данного заболевания (Fang H.Y. et al., Surg Neurol. 2005;64(6):511-7; Tu C.J. et al., J Int Med Res. 2011;39(4): 1265-74).
Концентрация ИЛ-11 сыворотке крови повышается у больных с приступами острого панкреатита и находится в прямой зависимости от их тяжести (Chen С.С. et al., Gut 1999;45:895-899).
Исходя из вышеизложенного ИЛ-11 может рассматриваться в качестве нового независимого маркера, мониторинг уровня которого в биологических жидкостях позволит диагностировать и следить за течением заболеваний, ассоциированных с экспрессией данного цитокина.
Повышенный уровень ИЛ-11 в семенной жидкости увеличивает оплодотворяющую способность сперматозоидов, поэтому содержание ИЛ-11 может быть одним из контрольных параметров качества эякулята при проведении вспомогательных репродуктивных технологий (Seshadri S. et al., Andrologia. 2011 Dec;43(6):378-86).
Из патента РФ RU 2318829 С2 известны нейтрализующие химерные или гуманизированные анти-ИЛ-6-антитела, содержащие не менее одного гипервариабельного участка тяжелой или легкой цепи мышиного моноклонального антитела CLB-8. Предпочтительными антителами согласно изобретению являются антитела, которые связываются с участком молекулы ИЛ-6, отвечающим за связывание с gp 130 (сайт 1). Описаны последовательности ДНК, кодирующие гипервариабельные участки 1-3 легкой и тяжелой цепей мышиного моноклонального антитела CLB-8, а также их аминокислотные последовательности. Раскрыт состав лекарственных препаратов на основе указанных антител и их применение для лечения онкологических или иных заболеваний, опосредуемых ИЛ-6. Однако описанные в данном патенте антитела не являются специфичными к интерлейкину-11, и, следовательно, не могут использоваться для диагностики или лечения заболеваний, ассоциированных с ИЛ-11.
В патенте США US 6998123 (В1) описан способ лечения или облегчения симптомов патологических состояний, при которых наблюдается снижение плотности костной ткани, при помощи введения пациенту эффективного количества анти-ИЛ-11 антител, которые блокируют образование мультимерного лиганд-рецепторного комплекса на поверхности клеток. Термин «анти- ИЛ-11 антитело» в данном патенте применяется для определения нейтрализующих химерных, гуманизированных или гибридных моноклональных антител, а также фрагментов антител, способных связываться с антигеном. В патенте приводятся результаты использования только одного типа молекул анти-ИЛ-11 антител на мышиной модели: у мышей с удаленными обоими яичниками после внутрибрюшинного введения афинно очищенных поликлональных антител козы против ИЛ-11 мыши наблюдается больший объем губчатой костной ткани в бедренной кости по сравнению с контрольной группой животных. В документе не приведено описание строения используемых антител, в том числе аминокислотной последовательности, а также деталей их получения. Указанный способ применения анти-ИЛ-11 антител относится к терапии заболеваний, при этом отсутствует информация о потенциальном использовании данных анти-ИЛ-11 антител в диагностике патологических состояний, при которых наблюдается снижение плотности костной ткани.
Раскрытие изобретения
Целью настоящего изобретения является устранение вышеуказанных недостатков аналогов анти-ИЛ-11 антител путем создания настоящего изобретения.
Изобретение представляет собой антитела, специфичные к ИЛ-11 человека и модельных животных, таких как яванская макака, или их производные, или антигенсвязывающие фрагменты антител, в которых вариабельные домены тяжелой и легкой цепей содержат одну из следующих комбинаций аминокислотных последовательностей гипервариабельных участков:
Антитела, соответствующие изобретению, могут быть полной длины или могут содержать только антиген-связывающий фрагмент (например, фрагмент Fab, F(ab')2).
Антитела могут быть моноклональными химерными, гуманизированными или гибридными, различных классов и подклассов, наиболее предпочтительно IgG1 или IgG4.
Термин «антитело», используемый здесь, предназначен для определения полноразмерных молекул иммуноглобулина, состоящих из четырех полипептидных цепей (две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи), связанных дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный участок (сокращенный здесь как VH) и константный участок, содержащий три домена CH1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельный участок (сокращенный здесь как VL) и константный участок, содержащий один домен CL. Участки VH и VL состоят из трех гипервариабельных участков, которые окружены четырьмя более консервативными каркасными участками. Гипервариабельные участки называют также участками, определяющими комплементарность, и обозначают как CDR (complementarity determining regions), поскольку именно они образуют антигенсвязывающие центры молекулы антитела. Каркасные участки (FR, framework regions) обычно не принимают участия в связывании антигена, но имеют существенное значение для укладки V-домена, которая обеспечивает адекватную конформацию антигенсвязывающего центра.
Термин «антиген-связывающий фрагмент» антитела (или просто «фрагмент антитела»), используемый здесь, относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связывать антиген ИЛ-11 человека и модельных животных. Примеры связывающих фрагментов, охватываемые термином "антиген-связывающий фрагмент" антитела, включают (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')2, бивалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанные дисульфидным мостиком в районе петли. Далее, антитело или его антиген-связывающий фрагмент могут быть частью более крупных молекул иммуноадгезии, образованных ковалентной или нековалентной связью антитела или фрагмента антитела с одним или более белком или пептидом.
В одном варианте осуществления изобретение представляет собой полноразмерное антитело подкласса IgG1, обозначаемое U13, у которого аминокислотные последовательности гипервариабельных участков вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей соответствуют комбинации # 1.
В другом варианте осуществления изобретение представляет собой полноразмерное антитело подкласса IgG1, обозначаемое L1, у которого аминокислотные последовательности гипервариабельных участков вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей соответствуют комбинации # 2.
В еще одном варианте осуществления изобретение представляет собой Fab фрагмент, обозначаемый Fab3, у которого аминокислотные последовательности гипервариабельных участков вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей соответствуют комбинации # 1.
В другом варианте осуществления изобретение представляет собой Fab фрагмент, обозначаемый Fab11, у которого аминокислотные последовательности гипервариабельных участков вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей соответствуют комбинации # 2.
Еще одним объектом настоящего изобретения являются производные антител или их фрагментов, например, гибридные белки. В качестве молекул слияния могут выступать другие полипептиды, например, биотин и белки с ферментативной активностью, такие как пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза, а также органические или неорганические молекулы, например, флуоресцентные метки (например, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, хлорид 5-диметиламин-1-нафталинсульфонила, фикоэритрин и т.п.), радиоактивные метки (например, изотопы Р-32 и I-125) или хемилюминесцентные метки (например, люминол и его производные).
В еще одном варианте осуществления изобретение представляет собой антитело U13, конъюгированное с молекулой биотина, обозначаемое U13-bio.
В еще одном варианте осуществления изобретение представляет собой антитело L1, конъюгированное с молекулой биотина, обозначаемое L1-bio.
Антитела, или их антигенсвязывающие фрагменты, или их производные, соответствующие изобретению, обладают хотя бы одним из следующих свойств:
1) способны специфически связываться с ИЛ-11 человека и модельных животных, таких как яванская макака;
2) способны связываться с ИЛ-11 с высокой аффинностью: равновесная константа диссоциации (Kd) равна 1×10-8 М или меньше, и кинетическая константа диссоциации (Koff) 1×10-4c-1 или меньше, определенные, например, с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса;
3) величина равновесной константы диссоциации при связывании ИЛ-11 человека отличается от величины Kd связывания ИЛ-11 модельных животных, таких как яванская макака, не более 10 раз;
4) молекулы с разным набором гипервариабельных участков не конкурируют между собой за связывание с ИЛ-11
Антитела U13 и L1 имеют следующие параметры связывания ИЛ-11 человека:
1) Kd, равная 1,0×10-11 М и 5,0×10-10 М, соответственно;
2) Koff, равная 2,0×10-6 с-1 и 8,0×10-5 с-1, соответственно.
Антитела U13 и L1 имеют следующие параметры связывания ИЛ-11 яванской макаки:
3) Kd, равная 7,0×10-11 М и 2,0×10-10 М, соответственно;
4) Koff, равная 7,0×10-6 с-1 и 2,0×10-5 с-1, соответственно.
Антитела могут быть получены общепринятыми методами, например, иммунизацией соответствующим антигеном животных, или гибридомной технологией, или при помощи технологии генной инженерии. Методы получения антител описаны в литературе: Zola, Н. (CRC Press, 1987). Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques; John G.R. Hurrell (CRC Press, 1982). Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications.
Фрагменты антител получают расщеплением антител соответствующими протеолитическими ферментами, например, папаином и пепсином, а также при помощи технологии рекомбинантной ДНК.
Для отбора рекомбинантных антител требуемой специфичности используют такие технологии, как фаговый дисплей. Чаще всего для фагового дисплея используют нитчатые фаги Ff семейства (М13, fd, f1). Нуклеотидные последовательности, кодирующие фрагменты антител, например, Fab или scFv, объединяют в составе фагового генома или фагмид с частью гена одного из пяти белков оболочки бактериофагов, наиболее часто используют рШ и pVIII. В результате фаговые частицы экспрессируют в составе капсида копии корового белка с пришитой к ним полипептидной последовательностью фрагмента антител. Отбор как правило осуществляют в виде нескольких последовательных раундов, каждый из которых включает сорбцию фаговых частиц, экспрессирующих соответствующие фрагменты антител, на носителях с иммобилизованным антигеном, отмывку несвязавшихся частиц, элюирование оставшихся связанными и размножение полученных фагов в бактериальных клетках. Выделяют и секвенируют фаговую ДНК или фагмиды. Фаговый дисплей широко описан в литературе: Bradbury A.R., Marks J.D. Antibodies from phage antibody libraries. J. Immunol. Methods 2004, 290, 29-49; Ledsgaard, L. et al. Basics of Antibody Phage Display Technology. Toxins 2018, 10, 236; John M. Walker. The Protein Protocols Handbook. Springer, 2007.
Технология рекомбинантной ДНК подразумевает получение экспрессионных генетических конструкций, кодирующих цепи антитела под контролем соответствующих регуляторных элементов в одном или разных несущих векторах. Регуляторные элементы представляют собой промоторные последовательности и сигнальные последовательности, например, сигналы полиаденилирования, которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепи антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, в работе Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, vol. 185, Edited by David V. Goeddel, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Экспрессионные конструкции одну или более переносят общепринятыми методами в клетки, пригодные для экспрессии и предпочтительно секреции антител в культуральную среду. Клетками продуцентами полноразмерных антител предпочтительно являются клетки млекопитающих линий СНО (клетки яичников китайского хомячка), SP2/0 (клетки мышиной миеломы) или HEK293 (клетки человеческой эмбриональной почки). Данные клеточные линии пригодны как для получения линий, стабильно экспрессирующих целевое антитело, так и для наработки антител лишь некоторое время (транзиентная экспрессия). Фрагменты антител, например, Fab, производят в бактериях, дрожжах, нитчатых грибах и линиях клеток насекомых. Трансформированные клетки культивируют общепринятыми методами и выделяют антитела, их фрагменты из культуральной среды. Стандартные способы с применением рекомбинантной ДНК используются для получения генов тяжелой и легкой цепей, включения этих генов в рекомбинантные экспрессионные векторы и введения векторов в клетки-хозяина так, как описано Sambrook, J., Fritsch Е. F., and Т. Maniatis. Molecular cloning: A laboratory manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel F., Brent R. et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (2003).
Производные антител и их фрагментов получают в том числе в результате химической модификации с использованием активированных производных молекул слияния. Например, самым распространенным и универсальным методом биотинилирования является химическая модификация с использованием активированных производных биотина, таких как биотинил-N-гидроксисукцинимид (BNHS), при этом биотин присоединяется по ε - аминогруппам остатков лизина в молекуле антител и их фрагментов. Подробное описание биотинилирования приведено в литературе, например, Diamandis Е. Р and Christopoulos Т K (1991) The biotin-(strept)avidin system principles and applications in biotechnology Chn Chem 37, 625-636.
Следующий аспект изобретения касается способа определения в пробах наличия и концентрации ИЛ-11 человека и модельных животных, таких как яванская макака, заключающийся в том, что 1) исследуемый образец, содержащей ИЛ-11, приводят в контакт с антителами, или их фрагментами, или производными, являющимися объектами настоящего изобретения, и 2) оценивают наличие и концентрацию иммунных комплексов антител, или их фрагментов, или производных с антигеном (ИЛ-11).
В качестве проб, в которых необходимо определить наличие или концентрацию ИЛ-11, могут быть образцы биологических жидкостей (например, кровь, плазма, сыворотка) и кусочки ткани, полученные в результате биопсии, организма человека и модельных животных, например, яванской макаки, а также образцы супернатантов клеточных культур, растворы очищенных рекомбинантных ИЛ-11 человека и животных, например, яванской макаки.
Для лабораторной диагностики наличия и концентрации ИЛ-11 в образцах биологических жидкостей, супернатантах клеточных культур и растворах очищенного ИЛ-11 может быть использован широкий круг методов иммуноанализа, среди которых иммуноблоттинг, иммуноферментный, радиоиммунный и иммунофлуоресцентный анализ, иммунотурбодиметрия. В образцах тканей для определения наличия ИЛ-11 используют метод иммуногистохимии.
В зависимости от дизайна эксперимента антитела, их производные или фрагменты, соответствующие настоящему изобретению, могут использоваться по отдельности или попарно друг с другом.
В еще одном варианте осуществления изобретение представляет собой сэндвич-вариант иммуноанализа с использованием пар антител U13 и L1, а также их конъюгатов, например, U13-bio или L1-bio. Антитела U13 и L1 и их конъюгаты специфически распознают разные неперекрывающиеся участки молекулы ИЛ-11 (эпитопы), благодаря чему между ними отсутствует конкуренция за связывание с антигеном. Данный способ анализа позволяет добиться высокой чувствительности, точности и специфичности при определении антигена даже в гетерогенных образцах, таких как биологические жидкости и ткани, супернатанты клеточных культур.
Биологический образец может быть подвергнут предварительной обработке или же непосредственно приведен в контакт, по меньшей мере, с одним захватывающим антителом в условиях, способствующих контакту с эпитопом.
В соответствии с предпочтительным способом реализации захватывающие антитела подвергают иммобилизации на твердой фазе. В качестве неограничивающих примеров твердой фазы можно использовать микропланшеты, в особенности микропланшеты из полистирола типа тех, что выпускают фирмы Thermo scientific NUNC (Дания) и Corning-Costar (CIIIA). Использование твердой фазы позволяет увеличить чувствительность метода благодаря удалению веществ, не участвующих в реакции, за счет иммобилизации на твердой фазе одного из компонентов реакционной смеси.
В качестве детектирующего антитела, как правило, используют конъюгированные антитела, направленные против другого эпитопа ИЛ-11.
Предлагаемый способ ИФА включает в себя фиксацию на поверхности лунок пластикового планшета захватывающих антител против ИЛ-11; блокирование неспецифических мест связывания; внесение в лунки исследуемого материала и инкубирование планшета; отмывку буферным раствором от молекул антигена, несвязавшихся с захватывающими антителами; внесение в лунки детектирующих антител и инкубирование планшета; отмывку буферным раствором от молекул детектирующих антител, несвязавшихся с комплексом антиген-антитело на поверхности твердой фазы; определение концентрации иммунных комплексов.
Если детектирующие антитела представляют собой конъюгат с ферментом, то концентрацию иммунных комплексов определяют по активности ферментной метки: вносят в реакционную смесь соответствующий хромогенный субстрат и определяют содержание окрашенных продуктов ферментативных реакций по изменению оптической плотности раствора при определенной длине волны. Благодаря способности одной молекулы фермента катализировать превращение большого числа молекул субстрата достигается высокая чувствительность метода.
Если детектирующие антитела представляют собой конъюгат с биотином, то иммунные комплексы детектируют, например, при помощи биотинсвязывающих белков, например, авидина яичного белка или стрептавидина, сшитых с флуоресцентной, хемилюминесцентной или ферментной меткой.
Экспериментальные данные иммуноанализа сэндвич-типа преимущественно представляют в виде графика зависимости величины сигнала от концентрации антигена (ИЛ-11) в пробе, построенному при помощи калибровочных растворов с известной концентрацией антигена. Для изготовления калибровочных растворов может быть использован раствор высокоочищенного рекомбинантного ИЛ-11 человека или модельных животных, или референсный препарат ИЛ-11 NIBSC 92/788, рекомендованный ВОЗ в качестве стандарта. При отсутствии лимитирующих факторов в рабочем диапазоне метода должна существовать прямая линейная зависимость между величиной сигнала и концентрацией антигена. Однако реальные кривые сэндвич-анализов могут иметь в разной степени искаженный вид, поэтому проводят линеаризующие преобразования, например, используют логарифмический масштаб величин по оси абсцисс и/или ординат.
Концентрацию антигена в исследуемой пробе определяют по калибровочному графику, исходя из измеренной величины сигнала.
Нижеследующие рисунки и примеры раскрывают изобретение, не ограничивая его.
Краткое описание рисунков
На Рис. 1А представлен график зависимости среднего значения оптической плотности при длине волны 492 нм от логарифма по основанию 2 концентрации ИЛ-11 человека в калибровочных растворах (в нг/мл) для определения концентрации ИЛ-11 человека в пробах методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием сэндвич-пары анти-ИЛ-11: захватывающих антител U13, адсорбированных на пластике в лунках 96-луночного микропланшета, и детектирующих антител L1-bio, конъюгированных с биотином.
На Рис. 1Б представлен график зависимости среднего значения оптической плотности при длине волны 492 нм от логарифма по основанию 2 концентрации ИЛ-11 человека в калибровочных растворах (в нг/мл) для определения концентрации ИЛ-11 человека в пробах методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием сэндвич-пары анти-ИЛ-11: захватывающих антител L1, адсорбированных на пластике в лунках 96-луночного микропланшета, и детектирующих антител U13-bio, конъюгированных с биотином.
На Рис. 2А представлен сенсограммы и теоретические кривые взаимодействия антитела U13 с ИЛ-11 человека (верхняя панель) и яванской макаки (нижняя панель), согласно данным метода поверхностного плазмонного резонанса (НИР). Лиганды ковалентно пришиты на поверхности сенсорного чипа за аминогруппы. Концентрации нанесения антител в рабочем буфере: 15, 12.9, 8.57 нМ. Анализ данных проведен в программе ProteOn Manager 3.0 в рамках схемы бивалентного аналита.
На Рис. 2Б представлен сенсограммы и теоретические кривые взаимодействия антитела L1 с ИЛ-11 человека (верхняя панель) и яванской макаки (нижняя панель), согласно данным метода поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Лиганды ковалентно пришиты на поверхности сенсорного чипа за аминогруппы. Концентрации нанесения антител в рабочем буфере: 10, 8.57, 2.58 нМ. Анализ данных проведен в программе ProteOn Manager 3.0 в рамках схемы бивалентного аналита.
Пример 1
Определение концентрации ИЛ-11 человека методом иммуноферментного анализа с использованием сэндвич-пары антител L1 и U13-bio, или U13 и L1-bio
I. Сорбция захватывающих антител на твердой фазе В лунки 96-луночного планшета из полистерола помещают по 100 мкл фосфатно-солевого буфера рН 7,2-7,4 (1xPBS), содержащего 1-2 мкг антител L1 или U13. Закрытый крышкой планшет выдерживают в течение 16-18 часов при температуре +(5±3)°С или в течение 2-6 часов при температуре +(37±2)°С при постоянном встряхивании/перемешивании. Содержимое лунок удаляют без промывания или лунки промывают от несвязавшихся молекул антител 1-3 раза буфером 1xPBS, содержащим 0,05-0,1% полисорбата 20 (1xPBST), по 250-300 мкл.
II. Блокировка мест неспецифичного связывания на твердой фазе В лунки планшета помещают по 250 мкл буфера 1xPBST, содержащего 0,5-1,0% бычьего сывороточного альбумина или яичного овальбумина, или обезжиренного молока. Закрытый крышкой планшет выдерживают в течение 1-2 часов при температуре +(37±2)°С или при комнатной температуре при постоянном встряхивании/перемешивании.
Содержимое лунок удаляют и лунки промывают 1-3 раза буфером 1xPBST по 250-300 мкл.
III. Инкубация с антигеном
В лунки планшета помещают по 100 мкл проб биологических жидкостей, либо двукратных разведений стандарта ИЛ-11 человека. Разведения антигена должны быть приготовлены на основе 1xPBST, содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина или яичного овальбумина, или нежирного молока, поскольку полисорбат 20 снижает неспецифичное связывание белковых молекул друг с другом и с поверхностью планшета, а белок препятствует протеолизу антигена. Исследуемый раствор и стандартные разведения антигена вносят по 2-3 повторности, используя по две (три) лунки на каждое разведение белка. Закрытый крышкой планшет выдерживают в течение 0,5-2 часов при температуре +(37±2)°С или при комнатной температуре при постоянном встряхивании/перемешивании. Содержимое лунок удаляют и лунки промывают 3-5 раза буфером 1xPBST по 250-300 мкл.
IV. Инкубация с детектирующими антителами
В лунки планшета помещают по 100 мкл буфера 1xPBST, содержащего 0,1% бычьего сывороточного альбумина или яичного овальбумина, или нежирного молока, и не менее 2 мкг/мл антител U13-bio или L1-bio, конъюгированных с биотином (в паре с адсорбированными антителами L1 используют антитела U13-bio, а с антителами U13 - антитела L1-bio). Закрытый крышкой планшет выдерживают в течение 30-60 мин при температуре +(37±2)°С или при комнатной температуре при постоянном встряхивании/перемешивании. Содержимое лунок удаляют и лунки промывают 3-5 раз буфером 1xPBST по 250-300 мкл.
V. Детектирование иммунных комплексов на твердой фазе
В лунки планшета помещают по 100 мкл буфера 1xPBST, содержащего конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена (например, Thermo Fisher, кат. № N100). Оптимальная концентрация конъюгированного стрептавидина как правило указывается производителем данного реагента (обычно составляет не менее 1/4 000). Закрытый крышкой планшет выдерживают в течение 30-45 мин при температуре +(37±2)°С или при комнатной температуре при постоянном встряхивании/перемешивании. Содержимое лунок удаляют и лунки промывают 3-5 раз буфером 1xPBST по 250-300 мкл.
В лунки вносят по 100 мкл раствора субстрата пероксидазы хрена и инкубируют при комнатной температуре и постоянном перемешивании 5-15 мин в защищенном от света месте. В качестве субстрата пероксидазы хрена может быть использован OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride), например, Thermo Fisher, кат. №34006, в буфере, содержащем пероксид водорода, например, Thermo Fisher, кат. №34062.
Проводят остановку реакции внесением в каждую лунку по 50 мкл 10% раствора серной кислоты. После этого сразу приступают к измерению оптической плотности раствора при соответствующей длине волны (для субстрата OPD 492 нм) с использованием планшетного спектрофотометра.
Интерпретацию результатов проводят следующим образом. Строится график зависимости средних значений оптической плотности калибровочных растворов, рассчитанных по нескольким повторным измерениям, от логарифма концентрации ИЛ-11. Определяется формула области линейного участка (формула линии тренда), с помощью которой определяется численное значение концентрации ИЛ-11 в исследуемых пробах в зависимости от значений их оптической плотности.
Полученные результаты приведены на Рис. 1, где на Рис. 1А представлены результаты, полученные с использованием сэндвич-пары антител U13 и L1-bio, а на Рис. 1Б - с использованием сэндвич-пары антител L1 и U13-bio.
Под «правильностью» методики понимают степень близости среднего значения концентрации ИЛ-11 в исследуемых пробах, полученного на основании серии результатов измерений, к принятому опорному значению. В качестве опорного значения используют действительное значение концентрации аналита (ИЛ-11) в пробе, рассчитанное с учетом концентрации аналита в исходном растворе, измеренной одним из фармакопейных методов определения концентрации белка (например, спектрофотометрическим анализом) или указанной в паспорте, и степени разведения исходного раствора в процессе приготовления пробы.
Среднее значение концентрации аналита 
рассчитывают по формуле:
где Xi - результат i-го измерения концентрации,
n - количество измерений концентрации аналита в пробах одного и того же однородного образца.
Правильность (Т) выражают в процентах среднего значения концентрации ИЛ-11 в пробах от опорного значения, для расчета используют формулу:
где Xt - действительное значение концентрации аналита (ИЛ-11) в пробах одного и того же однородного образца.
Истинное значение величины правильности методики иммуноферментного анализа, описанной в Примере 1, с вероятностью 95% лежит в промежутке от 80 до 115%) с использованием сэндвич-пары антител U13 и L1-bio, и в промежутке от 90 до 110%. с использованием сэндвич-пары антител L1 и U13-bio.
Для расчета доверительного интервала, в который попадают величины правильности, рассчитанные для концентраций аналита в рабочем диапазоне конкретной методики иммуноанализа, используют методы математической статистики, например, через критическое значение критерий Стьюдента.
Пример 2
Измерение величин кинетических и равновесных констант ассоциации/диссоциации комплекса ИЛ-11 человека или модельных животных с антителами U13 и L1 методом поверхностного плазмонного резонанса
Измерение проводят при температуре +(25±1)°С, используя спектрометр Bio-Rad ProteOn™ XPR36. Для этого лиганд (ИЛ-11 человека или яванской макаки) иммобилизуют на поверхности чипа ProteOn™ GLH #176-5013 через аминогруппы. Контроль степени завершенности фазы иммобилизации лиганда на чипе проводят по кинетике сигнала ППР.
В перпендикулярном направлении наносят на чип раствор аналита (антител U13 или L1) в рабочем буфере (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,05% Tween 20, рН 7.4) в пяти различных концентрациях белка от 2,0 нМ до 20 нМ, а на одну дорожку - рабочий буфер в качестве контроля. Контроль степени завершенности фазы диссоциации комплекса проводят по величине снижения сигнала ППР.
Поверхность чипа регенерируют после цикла связывания с аналитом пропусканием через чип 10 мМ глицин рН 2.0 в течение 300 сек.
Расчет констант взаимодействия лиганда с аналитом проводят в стандартной программе Bio-Rad ProteOn Manager 3.0 с использованием простейшей схемы бивалентного аналита для не менее трех концентраций аналита.
Полученные результаты приведены на Рис. 2.
Пример 3
Получение полноразмерных антител
Получение Fab-фрагментов антител проводили с использованием технологии на основе трех фаговых библиотек компании ООО «Антерикс», г. Пущино: Fab2h-library, Fab5h-library, Fab7h-library.
Технология фагового дисплея описана в литературе, например, Bazan, J., I. Calkosinski, and A. Gamian, Phage display-a powerful technique for immunotherapy: 1. Introduction and potential of therapeutic applications. Hum Vaccin Immunother, 2012. 8(12): p. 1817-28.
Из исходного разнообразия фаговых библиотек в ходе трех раундов селекции были отобраны фаговые частицы, содержащие на своей поверхности Fab-фрагменты антител, специфически связывающихся с ИЛ-11 человека и макаки. Использованы две схемы селекции, отличающиеся порядком презентации антигенов (ИЛ-11 человека - ИЛ-11 макаки - ИЛ-11 человека и ИЛ-11 макаки - ИЛ-11 человека - ИЛ-11 человека).
Фагмиды из бактериальных клеток, инфицированных отобранными вирионами, выделяли при помощи набора QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen, #27106) и секвенировали.
Последовательности, кодирующие домены VL, VH, CL и СН1 антител, из отобранных фагмид были переклонированы в вектор pLL4 (Addgene plasmid #107208) для экспрессии в клетках Е. coli штамма BL-21(DE3) Fab-фрагментов, несущих 8XHis метку на С-конце. Выделение и очистку фрагментов антител из клеточного лизата проводили с помощью металл-хелатной хроматографии. Скрининг Fab-фрагментов на предмет их специфичности к ИЛ-11 человека и макаки проводили при помощи ИФА.
Для создания полноразмерных антител последовательность, кодирующую VH домен, клонировали в экспрессионный вектор рТТ5, содержащий последовательности, кодирующие константные области IgG1 человека (CH1, СН2, СН3), в то время, как последовательность, кодирующую VL домен, клонировали в экспрессионный вектор рТТ5, содержащий последовательности, кодирующие константные области k-легкой цепи человека (CL).
Наработку антител проводили в системе транзиентной экспрессии в эукариотических клетках линии СНО-3Е7 (RRID:CVCL_JY74), адаптированных для продукции белков млекопитающих. Клетки СНО-3Е7 котрансфицировали полученными плазмидами с использованием полиэтиленимина (PEI, polyethylenimine). Выделение и очистку антител из культуральной среды проводили с помощью аффинной хроматографии с использованием сорбента с иммобилизованным белком A (HiTrap rProtein A FF, GE Healthcare Life Sciences), имеющим высокое сродство к иммуноглобулинам класса G. Полученные антитела были диализованы и стерилизованы фильтрацией через 0,22 мкм фильтр. Сродство полученных антител к ИЛ-11 было проверено с помощью ИФА и спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса.
Использованные в работе рутинные методы широко описаны в литературе (Barbas CF, Wagner J (1995). Synthetic Human Antibodies: Selecting and Evolving Functional Proteins. Methods. 8 (2): 94-103. doi: 1.0.1006/meth. 1995.9997; Barbas CF (1995). Synthetic human antibodies. Nat. Med. 1 (8): 837-839. doi:10.1038/nm0895-837. PMID 7585190; Wild D. The Immunoassay Handbook (4th edition). Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. 2013; Greenfield E.A., Antibodies. A laboratory manual. Second edition. 2014).
Последовательность тяжелой цепи HCDR1
SEQ ID № 1:Phe Thr Phe Thr Gly Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg;
Последовательность тяжелой цепи HCDR2
SEQ ID № 2:Val Ser Ser Ile Ser Ser Tyr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser;
Последовательность тяжелой цепи HCDR3
SEQ ID № 3:Cys Ala Arg Glu Ser Leu His Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln;
Последовательность легкой цепи LCDR1
SEQ ID № 4:Gln Ser Val Ser Ser Ser;
Последовательность легкой цепи LCDR2
SEQ ID № 5:Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr;
Последовательность легкой цепи LCDR3
SEQ ID № 6:Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Tyr Ala Pro Ile Thr Phe Gly Gln;
Последовательность тяжелой цепи HCDR1
SEQ ID № 7:Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg;
Последовательность тяжелой цепи HCDR2
SEQ ID № 8:Val Ser Thr Ile Ala Ser Ser Asn Ser Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser;
Последовательность тяжелой цепи HCDR3
SEQ ID № 9:Cys Ala Arg Glu Ser Trp Ser Glu Gly Trp Trp Pro Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln;
Последовательность легкой цепи LCDR3
SEQ ID № 10:Cys Gln Gln Tyr Glu Thr Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln.
1. Антитело, специфичное к ИЛ-11 человека и модельных животных, таких как яванская макака, или его антигенсвязывающий фрагмент, в которых вариабельные домены тяжелой и легкой цепей содержат одну из следующих комбинаций аминокислотных последовательностей гипервариабельных участков:
# 1:
HCDR1: SEQ ID №1,
HCDR2: SEQ ID №2,
HCDR3: SEQ ID №3,
LCDR1: SEQ ID №4,
LCDR2: SEQ ID №5,
LCDR3: SEQ ID №6,
и/или
#2:
HCDR1: SEQ ID №7,
HCDR2: SEQ ID №8,
HCDR3: SEQ ID №9,
LCDR1: SEQ ID №4,
LCDR2: SEQ ID №5,
LCDR3: SEQ ID №10.
2. Конъюгат для определения в пробах концентрации ИЛ-11 человека и модельных животных, таких как яванская макака, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, конъюгированный с биотином.
3. Способ определения в пробах концентрации ИЛ-11 человека и модельных животных, таких как яванская макака, заключающийся в том, что:
1) исследуемый образец, содержащей ИЛ-11, приводят в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по п. 1,
2) оценивают концентрацию иммунных комплексов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п. 1 с антигеном ИЛ-11.
