Способ дифференциации причин развития фиброза печени начального уровня при хронических вирусных гепатитах в и с

Изобретение относится к медицине, в частности к способам лабораторной диагностики заболеваний печени, и может найти применение для уточнения причины фиброза печени в клинико-лабораторных условиях. Решается задача разработки способа определения причин развития фиброза печени, который позволяет сократить количество измеряемых показателей с одновременным повышением чувствительности и сохранением требуемой специфичности. В качестве определяемых белковых продуктов предложено использовать цитокины CCL2/MCP-1, CCL8/MCP-2, IFNγ. Их концентрацию определяют в плазме крови и по соответствию концентрации маркера пороговым значениям диагностируют причину фиброза печени. В результате анализа были получены следующие пороговые значения для дифференциальной диагностики хронического гепатита В и хронического гепатита С: CCL2/MCP-1 - 245,3 пг/мл, CCL8/MCP-2 - 21,5 и 28,0 пг/мл, IFNγ - 2,5 пг/мл. Использование данного алгоритма для диагностики стадий фиброза печени позволяет достигнуть чувствительности метода 83,3-86,2% при достаточной специфичности. 1 ил., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к способам лабораторной диагностики заболеваний печени, и может найти применение в клинико-лабораторных условиях для уточнения типа вирусного гепатита, вызывающего повреждение печени у пациентов.

Лабораторная диагностика повреждений печени при хронических вирусных гепатитах - сложный комплекс из десятков разнообразных тестов, начиная от инструментально-аппаратных, биохимических, серологических, иммунологических, заканчивая самыми сложными молекулярно-биологическими исследованиями. Среди существующих групп гепатотропных агентов, повреждающих печеночную ткань, особое место занимают возбудители вирусных гепатитов, в т.ч. хронических вирусных гепатитов В и С. Всемирная организация здравоохранения насчитывает в мире более 400 млн. носителей вируса гепатита В (ГВ) и около 150-200 млн. носителей вируса гепатита С (ГС). По самым осторожным оценкам ВОЗ, ежегодно хронические вирусные гепатиты вызывают около 1 млн. смертей [Информационные бюллетени о гепатите ВОЗ https://www.who.int/topics/hepatitis/factsheets/ru/].

Распространенность хронических вирусных гепатитов в Российской Федерации является серьезной проблемой для системы здравоохранения, в том числе для лабораторной службы, поскольку по состоянию на конец 2013 г. было официально зарегистрировано 559000 больных хроническим вирусным гепатитом В (ХВГВ) и 529792 больных хроническим вирусным гепатитом С (ХВГС) [Вирусные гепатиты в Российской Федерации. Аналитический обзор. 9-ый выпуск. СПб., Изд-во Института Пастера, 2013 г.]. Вследствие этого велико и число исследований, выполняемых в клинико-диагностических лабораториях, как для выявления нарушения функций печени, так и для установления этиологии заболевания, вызывающих подобные нарушения.

Гепатит С - антропонозная вирусная инфекция, характеризующаяся преимущественным поражением печени, преобладанием стертых и субклинических форм в острой фазе и выраженной склонностью к хронизации (до 80%). Отличительной особенностью вируса ВГС является способность к длительной персистенции в организме, что объясняется его генетической неоднородностью, высокой изменчивостью и возможностью внепеченочной репликации в местах, недоступных для иммунного надзора - лимфоузлах, селезенке, моноцитах. Развивающееся в результате заболевание отличается длительным (12-14 лет) периодом бессимптомного течения с дальнейшим прогрессированием в цирроз и рак печени [Инфекционные болезни и эпидемиология: учебник / В.И. Покровский [и др.] - 3-е изд., испр. и доп.- М. ГЭОТАР-Медиа, 2012. - 1008 с.].

Гепатит В - острое инфекционное заболевание, поражающее печень, вызываемое вирусом гепатита В (ВГВ) обладающим высокой тропностью к гепатоцитам и способное переходить в хроническую форму, исходом которого является цирроз печени. Хронизация гепатита В происходит у 90% детей, инфицированных при рождении, 25-50% детей, инфицированных в 1-5 лет, и 1-5% людей, инфицированных в старшем детском и зрелом возрасте. Более чем у 20% заразившихся в зрелом возрасте больных развивается цирроз или рак печени [Гончикова С.Л., Убеева И.П., Николаев С.М. Иммунологические аспекты патогенеза вирусных гепатитов, Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, 2010, №2 (72): 17-22].

Согласно современным представлениям, при вирусных гепатитах, повреждение печеночной ткани в большей степени является результатом реализации иммунного ответа, а не цитопатического действия вируса. Управляющую роль в развитии иммунных реакций играют цитокины, специальные пептиды иммунной системы, отдельную группу которых составляют хемокины - молекулы, регулирующие клеточную миграцию. Они участвуют в тканевом гомеостазе, развитии ткани, в частности, в продукции коллагена, ангиогенезе, процессах пролиферации и репарации. При гепатите в печени усиленно продуцируются провоспалительные хемокины, вызывая миграцию лейкоцитов с периферии в печеночную паренхиму, что вызывает активацию иммунных процессов в очаге воспаления [Семенов А.В., с соавт., 2015, Ming-Hui Li, at al., 2017]. Вследствие этого уровни содержания цитокинов и хемокинов в периферической крови могут служить биомаркерами для различных форм поражений печени.

Известен способ диагностики фиброза печени при хроническом гепатите С по нескольким сывороточным маркерам [Способ диагностики фиброза печени при хроническом вирусном гепатите С (RU 2557927), опубл. 2015]. Способ основан на определении в сыворотке крови пациентов содержания факторов ГГТ, TIMP-1, TIMP-2, ММР-9 и цитокина TGF-β2. По соотношению измеренных параметров устанавливается наличие у пациента степени фиброза F0-1, либо F3-4. Метод позволяет уточнить степень развития фиброза, но только при установленном диагнозе «хронический гепатит С».

Известен лабораторный способ дифференциальной диагностики хронического гепатита С и различных форм аутоиммунных заболеваний печени по экспрессии фактора bcl-2 в ткани печени [Способ дифференциальной диагностики аутоиммунных заболеваний печени (RU 2566723), опубл. 2015 г.]. Суть метода заключается в определении процентного содержание bcl-2-позитивных эпителиальных клеток в желчных протоках при хроническом гепатите С и различных АИЗП методами иммуногистохимии. Авторами заявлен диапазон значений, характерный для выбранных заболеваний. К недостаткам метода можно отнести необходимость проведения пункционной биопсии для пациентов. Также метод не позволяет определить другие варианты вирусных гепатитов, кроме хронического гепатита С.

Наиболее близким по своей сущности к методу, предлагаемому в данном изобретении, является алгоритм оценки причины развития фиброза печени при хроническом гепатите В и некоторыми аутоиммунными формами гепатитов с использованием цитокинов CCL8/MCP-2, CXCL10/IP-10, IFNγ [Способ дифференциации фиброза печени при хроническом вирусном гепатите в и аутоиммунными поражениями печени (RU 2701723), опубликован 2019]. Способ основан на определении в сыворотке крови содержания цитокинов CCL8/MCP-2, CXCL10/IP-10 и IFNγ с последующим проведением ступенчатого дискриминантного анализа, позволяющего указать в качестве причины развития фиброза у пациента либо хронический гепатит В, либо аутоиммунное заболевание печени. У пациентов с фиброзом печени, метод позволяет в качестве причины дифференцировать хронический гепатит В и аутоиммунные заболевания печени, но не другие формы вирусных гепатитов.

Задача настоящего изобретения заключается в разработке способа дифференциации причин развития начальных форм фиброза (F0-1) у пациентов с хроническим вирусным гепатитом В или хроническим вирусным гепатитом С, который позволяет разделить пациентов, благодаря определению трех цитокинов в плазме крови (CCL2/MCP-1, CCL8/MCP-2, IFNγ).

Изобретение позволит расширить арсенал средств, используемых для дифференциации причин развития начальных форм фиброза печени при вирусных гепатитах В и С.

Решение поставленной задачи достигается тем, что производится взятие образца периферической крови пациента, центрифугирование пробы с отделением плазмы с последующим диагностированием заболевания по содержанию белковых продуктов в плазме крови. Авторами предложено в качестве определяемых белковых продуктов использовать цитокины CCL2/MCP-1, CCL8/MCP-2, IFNγ. Их концентрацию определяют в плазме крови и по соответствию концентрации маркера пороговым значениям диагностируют наличие хронического гепатита В либо хронического гепатита С.

Для оценки диагностической ценности анализируемых биомаркеров, для них был проведен анализ характеристических кривых (receiver operating characteristic curve - ROC) и определены значения площади под кривой -AUC (Area Under the Curve). Было установлено, что самостоятельно ни один из выделенных показателей не обладает высокой чувствительностью, что исключает возможность их изолированного использования с диагностической целью. Далее был применен метод построения деревьев решений в программе JMP 14.0, на основе полученных результатов которого было установлено, что совместное определение трех маркеров CCL2/MCP-1, CCL8/MCP-2, IFNγ является достаточным для оценки причин развития фиброза печени у больных. Значения AUC для трех цитокинов были более 0,7, что говорит о хорошем качестве выбранной модели.

В результате анализа были получены следующие пороговые значения для дифференциации причины развития начальной формы фиброза между хроническим гепатитом В и хроническим гепатитом С: CCL2/MCP-1 - 245,3 пг/мл, CCL8/MCP-2 - 21,5 и 28,0 пг/мл, IFNγ - 2,5 пг/мл. Использование данного алгоритма для диагностики позволяет достигнуть чувствительности метода 83,3%, при достаточной специфичности.

Сущность изобретения поясняется чертежом, где на фигуре 1 представлено дерево решений для разделения групп больных с начальными формами фиброза, вызванными хроническим гепатитом В и хроническим гепатитом С.

Изобретение реализуется следующим способом.

Пример 1. Выбор порогового значения содержания цитокинов.

Для расчетов пороговых значений использовали значения содержания цитокинов CCL2/MCP-1, CCL8/MCP-2, IFNγ в группах больных с хроническим гепатитом В и хроническим гепатитом С. Образцы периферической крови забирали в вакуумную пробирку с антикоагулянтом K2 ЭДТА, центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин для отделения плазмы, которую отбирали в пробирки типа «Эппендорф», замораживали и хранили при -80°С до проведения эксперимента. Для определения содержания цитокинов в плазме крови использовали технологию мультиплексного иммуноферментного анализа по стандартным методикам согласно инструкциям производителя (Millipore, США). Статистическую обработку проводили с применением программ GRAPH Pad Prism 6.02 и JMP 14.0. Для оценки диагностической ценности анализируемых цитокинов был применен метод построения деревьев решений, на основе полученных результатов которого было установлено, что совместное определение трех маркеров CCL2/MCP-1, CCL8/MCP-2, IFNγ является достаточным для дифференцировки заболевания, вызвавшего развитие фиброза печени у больных.

Оценку проводят по следующему алгоритму: на первой стадии необходимо оценить концентрацию CCL8/MCP-2, значения которого <21,5 пг/мл указывают в качестве причины развития фиброза ХГВ, значения ≥21,5 пг/мл - на принадлежность к подгруппе, с преимуществом ХГС. Далее, необходимо оценить концентрацию CCL2/MCP-1, значение <245,3 пг/мл указывает на принадлежность к первой подгруппе, с преимуществом ХГС, ≥245,3 пг/мл - ко второй, с преимуществом ХГВ. В первой подгруппе необходимо вновь оценить концентрацию CCL8/MCP-2, значения которого <28,0 пг/мл (т.е. в промежутке от 21,5 пг/мл включительно до 28,0 пг/мл) указывают на ХГВ, значения ≥28,0 пг/мл - на ХГС; во второй подгруппе необходимо оценить концентрацию IFNγ, значения которого <2,5 пг/мл указывают на ХГС, значения ≥2,5 пг/мл - на ХГВ.

Пример 2. Диагностика Больная А., 27 лет

Диагноз: хронический вирусный гепатит В (HbsAg(+), HbcorAB(+), HbeAb(+)), с минимальной степенью морфологической активности. Противовирусную терапию не получала. В ноябре 2015 года произведена эластография печени, фиброз печени не выявлен, установлена нулевая стадия (F0) по шкале METAVIR. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров: CCL2/MCP-1=149,0 пг/мл, CCL8/MCP-2=24,1 пг/мл, IFNγ=2,9 пг/мл. Таким образом, у больной значение CCL8/MCP-2 ≥22,9 пг/мл, но <28,0 пг/мл, а значение CCL2/MCP-1 <245,3 пг/мл, что соответствует начальной степени фиброза печени при ХВГВ и совпадает с данными серологического исследования.

Больная П., 56 лет

Диагноз: хронический вирусный гепатит В (HbsAg(+), HbcorAB(+)), с минимальной степенью морфологической активности. Противовирусную терапию не получала. В ноябре 2016 года произведена эластография печени, выявлен фиброз печени, начальная стадия (F0-1) по шкале METAVIR. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров: CCL2/MCP-1=372,4 пг/мл, CCL8/MCP-2=32,6 пг/мл, IFNγ=6,39 пг/мл. Таким образом, у больной значение CCL8/MCP-2 ≥22,9 пг/мл, значение CCL2/MCP-1 ≥245,3 пг/мл и значение IFNγ ≥2,5 пг/мл, что соответствует начальной степени фиброза печени при ХВГВ и совпадает с данными серологического исследования.

Способ дифференциации причин развития фиброза печени начального уровня при хронических вирусных гепатитах В (ХГВ) и С (ХГС) с использованием биомаркеров, концентрацию которых измеряют в плазме крови и определяют в качестве причины развития фиброза печени один из вышеуказанных гепатитов на основе математического алгоритма, заключающегося в том, что измеряют значения трех биомаркеров, в качестве которых используют цитокины CCL2/MCP-1, CCL8/MCP-2, IFNγ, причем математический алгоритм анализа полученных результатов включает от двух до трех стадий в зависимости от полученных значений концентраций биомаркеров, а причину развития фиброза печени устанавливают путем сопоставления полученной концентрации биомаркеров с пороговыми значениями по следующему алгоритму: на первой стадии оценивают концентрацию CCL8/MCP-2, значения которого <21,5 пг/мл указывают в качестве причины развития фиброза ХГВ, значения ≥21,5 пг/мл - на принадлежность к подгруппе, с преимуществом ХГС, на второй стадии оценивают концентрацию CCL2/MCP-1, значение <245,3 пг/мл указывает на принадлежность к первой подгруппе, с преимуществом ХГС, ≥245,3 пг/мл - ко второй, с преимуществом ХГВ, на третьей стадии в первой подгруппе необходимо вновь оценить концентрацию CCL8/MCP-2, значения которого в диапазоне от 21,5 пг/мл включительно до 28,0 пг/мл указывают на ХГВ, значения ≥28,0 пг/мл - на ХГС; во второй подгруппе оценивают концентрацию IFNγ, значения которого <2,543 пг/мл указывают на ХГС, значения ≥2,543 пг/мл - на ХГВ.