Способ подавления адгезивных свойств холерных вибрионов
Владельцы патента RU 2763400:
Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ подавления адгезивных свойств холерных вибрионов, включающий введение 3 мг/л диклофенака в один из двух флаконов объемом 50 мл, контаминированных взвесью 104 м.к./мл холерных вибрионов и с 4-мя хитиновыми пластинами размером 0,3×0,3 см, выдерживание при 28°С до двух суток; через 2-12-24-48 часов пластины хитина достают из флаконов, трехкратно промывают в физиологическом растворе, затем каждую пластину помещают в емкость 1,5 мл с 0,5 мл дистиллированной воды, проводят температурный лизис клеток при 99°С в течение 30 мин и выделение ДНК; а затем методом ПЦР определяют количество клеток холерного вибриона в супернатанте, адгезированных на хитине, в контрольном флаконе без диклофенака и во флаконе с диклофенаком, рассчитывают показатель адгезии и степень подавления адгезии культур холерных вибрионов. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов подавления адгезии холерных вибрионов и ее оценки. 2 табл., 2 пр.
Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для снижения адгезивных свойств холерных вибрионов.
Известно, что начальный этап патогенеза холеры заключается во взаимодействии с клетками эпителия тонкого кишечника путем адгезии. В тоже время известна способность холерных вибрионов формировать биопленку на твердом субстрате: камнях, хитиновых панцирях ракообразных, где холерные вибрионы переживают неблагоприятные условия внешней среды. Для человека биопленки могут являться средством инфицирования при употреблении загрязненной планктоном воды или необработанных морепродуктов. В связи с этим актуальным является поиск препаратов, снижающих адгезивную активность возбудителей, и способов ее изучения.
Известен способ ингибирования адгезии бактерий на сетчатых имплантах в комбинации с биоцидами (1). Однако этот способ не может быть применен в отношении возбудителя холеры.
Известен способ подавления пищевыми минералами адезивной способности Vibrio cholerae, включающий воздействие субингибирующих концентраций минералов: цинка, селена и марганца (2) а также способ оценки адгезивных свойств холерных вибрионов Vibrio cholerae El Tor и Vibrio cholerae O139 на клеточной культуре Hu Tu -80 (3).
Однако эти способы являются трудоемкими и требуют для изучения адгезии использования лабораторных животных или перевиваемой клеточной культуры.
Известен способ моделирования биопленок, формируемых Vibrio cholerae 01 серогруппы на поверхности хитина (4), включающий использование хитина в виде пластин речного рака, на поверхности которых образуются как простые, так и сложные биопленки Vibrio cholerae, анализ последних проводят в ПЦР с использование праймеров к INDEL-локусу 1699, подтверждая присутствие клеток токсигенного штамма в составе сложной биопленки и способность колонизировать поверхность хитина.
Однако этот способ не эффективен в возможности подавлять и изучать адгезивные свойства Vibrio cholerae, так как его задача состояла в разработке способа моделирования биопленок.
За прототип выбран способ определения степени ингибирующей способности сахаров на процесс адгезии холерных вибрионов (5) включающий инкубацию исследуемой культуры с эритроцитами, причем адгезию холерных вибрионов проводят в присутствии ингибитора, в качестве которого используют углеводы,
Недостатком этого способа является необходимость использования эритроцитов, отсутствие возможности динамических наблюдений за влиянием веществ на процесс адгезии, а также невозможность сопоставить концентрацию адгезированных клеток с их концентрацией в свободном (планктонном) состоянии.
Техническая задача предполагаемого изобретения состояла в разработке нового эффективного способа подавления адгезии холерных вибрионов и ее оценки.
Поставленная техническая задача достигается тем, что в способе подавления адгезии холерных вибрионов, включающем использование препарата, понижающего экспрессию генов регуляции адгезии, в качестве ингибитора используют диклофенак в концентрации 3 мг/л, который вводят в один из двух флаконов объемом 50 мл контаминированных взвесью 104 микробных клеток холерных вибрионов/мл и 4-х хитиновых пластин размером 0,3×0,3 см, которые помещают в оба флакона и выдерживают при температуре 28°С до двух суток, а через 2-12-24-48 часов пластины хитина достают из флаконов, трехкратно промывают в физиологическом растворе, после этого каждую пластину помещают в отдельную емкость 1,5 мл, содержащую 0,5 мл дистиллированной воды, и проводят температурный лизис клеток и выделение ДНК, путем прогревания при 99°С в течение 30 мин, а затем методом ПЦР определяют количество клеток холерного вибриона в супернатанте и количество адгезированных на хитине клеток в контрольном флаконе (без диклофенака) и во флаконе с диклофенаком, затем рассчитывают показатель адгезии культур холерных вибрионов по формуле
, где ПА - показатель адгезии;
Nx - количество ДНК, адгезированного на хитине;
Nc - количесто ДНК в супернатанте,
причем если ПА без воздействия диклофенака больше, чем ПА в присутствии диклофенака, значит, препарат подавил адгезию, а степень подавления адгезии определяют по коэффициенту КИ по формуле
, где ПА - показатель адгезии;
ПАд - показатель адгезии в присутствии диклофенака,
при этом за слабую степень ингибирующей активности принимают КИ в пределах от 0-1,5, среднюю степень - в пределах 1,6-2,0, высокую - более 2,1.
Способ осуществляется следующим образом.
Для проведения способа подавления адгезии холерных вибрионов используют препарат, понижающий экспрессию генов регуляции адгезии, а именно производное фенилуксусной кислоты-диклофенак в концентрации 3 мг/л (субингибирующая концентрация).
При этом в роли субстрата для адгезии холерных вибрионов применяют хитин, полученный из пластин речного рака Astacus astacus размером 0,3×0,3 см.
Первоначально готовят 18-часовую агаровую культуру холерных вибрионов, для этого изучаемый штамм высевают на агар Мартена и готовят взвесь по стандарту мутности до конечной концентрации 104 м.к./мл.
Затем в два флакона объемом 50 мл с речной автоклавированной водой, контаминированной взвесью 104 м.к./мл холерных вибрионов, помещают пластины хитина в количестве 4 шт. в каждый флакон и выдерживают при температуре 28°С до двух суток. Причем в один флакон предварительно добавляют раствор диклофенака до концентрации 3 мг/л. Через 2-12-24-48 часов пластины хитина достают из флаконов, трехкратно промывают в физиологическом растворе и каждую пластину переносят в пробирку емкостью 1,5 мл, содержащую 0,5 мл дистиллированной воды. После этого проводят температурный лизис клеток путем прогревания кипячением пластин до 99°С в течение 30 минут и выделение ДНК.
Следующий этап способа заключается в определении количества клеток холерного вибриона в супернатанте каждого флакона и количества адгезированных на хитин клеток как во флаконе с диклофенаком, так и без него (контрольный) при помощи метода ПЦР согласно МУ 2.3.256-09.
Затем рассчитывают показатель адгезии который определяют по формуле
где ПА - показатель адгезии;
Nx - количество ДНК, адгезированного на хитин;
Nc - количество ДНК в супернатанте,
Если ПА без воздействия диклофенака больше, чем ПА в присутствии диклофенака, значит, диклофенак подавляет адгезию.
Степень подавления адгезии определяют по коэффициенту ингибиции КИ, который равен отношению показателя адгезии (ПА) без воздействия препарата диклофенака к показателю адгезии в присутствии диклофенака (ПАд):
Интерпретацию результатов проводят по шкале ингибирующей активности, при этом за слабую степень ингибирующей активности принимают КИ в пределах от 0 до 1,5, среднюю степень - в пределах 1,6-2,0, высокую - более 2,1.
Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что адгезию холерных вибрионов подавляют в присутствии ингибитора, который понижает экспрессию генов регуляции адгезии, в качестве которого используют производное фенилуксусной кислоты -диклофенак в концентрации 3 мг/л. Использование изобретения позволяет уменьшить прикрепление клеток (адгезию) холерного вибриона к субстрату in vitro.
Пример 1
Изучали воздействие диклофенака в концентрации 3 мг/л на адгезивные свойства штаммов: V. cholerae O1 El Tor 19191 (ctx+, tcp+, выделен от человека в 2010 г., г. Москва), V. cholerae O1 El Tor 19667 (ctx+, tcp+, выделен от человека в 2012 г., г. Москва), V. cholerae О1 El Tor 19241 (ctx+, tcp+, выделен из воды, 2011 г., Ростовская область). Культуры взяты из коллекции Ростовского противочумного института.
В шесть флаконов с речной автоклавированной водой (по 50 мл), контаминированной взвесью 104/мл микробных клеток бактерий (на каждый штамм по два флакона), помещают пластины речного рака Astacus astacus размером 0,3×0,3 см в количестве 4 штук в каждый флакон и выдерживают при t 28±2°С до 2 суток, при этом в один флакон из двух для каждого штамма предварительно добавляют раствор диклофенака до концентрации 3 мг/л. Через 2-12-24-48 ч пластинки хитина достают из флаконов, трехкратно промывают в физиологическом растворе. Количество клеток холерного вибриона в супернатанте и количество адгезированных на хитин клеток в контрольном флаконе (без диклофенака) и во флаконе с диклофенаком определяют методом ПЦР по количеству ДНК. Затем по формуле рассчитывают показатель адгезии культур холерных вибрионов и коэффициент ингибиции. По шкале ингибирующей активности проводят интерпретацию результатов (см. таблицу 1).
n* - число клеток ДНК увеличенное в 103.
Как видно из таблицы, в первые часы воздействия (до 12 часов) диклофенак обладает высокой степенью ингибирующей активности (КИ 2,1-10,7) в отношении всех трех штаммов. Наибольшее значение индекса адгезии наблюдается в отношении штамма V. cholerae O1 El Tor 19191 при 12 часовом воздействии диклофенака. Через 48 часов коэффициент ингибиции соответствовал наименьшему значению в изученной группе штаммов и составил 1,45, при этом в отношении этого штамма показатель адгезии в присутствии диклофенака в интервале времени 2-48 часов составлял 0,1-0,11.
Пример 2
Изучали воздействие диклофенака в концентрации 150 мг/л (исходя из максимальной суточной дозы препарата для человека) на адгезивные свойства штаммов V. cholerae O1 El Tor 19667 (ctx+, tcp+, выделен от человека в 2012 г., г. Москва). Культура взята также из коллекции Ростовского противочумного института.
В два флакона с речной автоклавированной водой (по 50 мл), контаминированной взвесью 104/мл микробных клеток бактерий, помещают пластины речного рака Astacus astacus размером 0,3×0,3 см в количестве 4 штук в каждый флакон и выдерживают при t 28±2°С до 2 суток, при этом в один флакон предварительно добавляют раствор диклофенака до концентрации 150 мг/л. Через 2-12-24-48 ч пластинки хитина достают из флаконов, трехкратно промывают в физиологическом растворе. Количество клеток холерного вибриона в супернатанте и количество адгезированных на хитин клеток в контрольном флаконе (без диклофенака) и во флаконе с диклофенаком определяют методом ПЦР по количеству ДНК. По формуле рассчитывают показатель адгезии культур холерных вибрионов и коэффициент ингибиции. По шкале ингибирующей активности проводят интерпретацию результатов (см. таблицу 2).
По таблице 2 видно, что в присутствии диклофенака в концентрации 150 мг/л показатель адгезии ниже, чем без диклофенака. Диклофенак в концентрации 150 мг/л обладает средней степенью ингибирующей активности при экспозиции 2-12 ч и низкой степенью - при экспозиции 24-48 ч.
Использование предполагаемого изобретения с помощью нового и эффективного способа позволяет снизить адгезию холерных вибрионов, которая является начальным этапом патогенеза инфекции и биопленкообразования и оценить ее динамику при разном времени экспозиции при изучении исследуемых штаммов.
Источники информации
1. Кузнецова М.В., Паршаков А.А., Афанасьевская Е.В., Самарцев В.А. Ингибирования адгезии бактерий Staphylococcus на сетчатых имплантах в комбинации с биоцидами (in vitro)// Антибиотики и химиотерапия. - 2017. - Т.62, №1-2. - С. 12-20.
2. Bhattaram V., Upadhyay A., Yin Н.-В., Mooyottu Sh., Venkitanarayanan К. Effect of Dietary Minerals on Virulence Attributes of Vibrio cholerae/Front Microbiol. 2017 May 19;8:911.
3. «Способ оценки адгезивных свойств холерных вибрионов Vibrio cholerae El Tor и Vibrio cholerae 0139 на клеточной культуре Hu Tu -80». Патент RU №2595423, кл. C12Q 1/02, опубл. 10.07.2016 г., бюл. №24.
4. «Способ моделирования биопленок, формируемых Vibrio cholera 01 серогруппы на поверхности хитина». Патент №2685878, кл. C12N 11/00, опубл. 23.04.2019 г., бюл. №12.
5. «Способ определения степени ингибирующей способности сахаров на процесс адгезии холерных вибрионов». Патент RU 2288274, кл. C12Q 1/04, опубликовано 27.11. 2006, бюл. №33.
6. Abbas Н.А. Inhibition of virulence factors of Pseudomonas aeruginosa by diclofenac sodium. Roum Arch Microbiol Immunol. 2015;74(3-4):79-85.
Способ подавления адгезивных свойств холерных вибрионов, включающий использование ингибитора, понижающего экспрессию генов регуляции адгезии, отличающийся тем, что в качестве ингибитора используют диклофенак в концентрации 3 мг/л, который вводят в один из двух флаконов объемом 50 мл контаминированных взвесью 104 микробных клеток холерных вибрионов/мл и 4-х хитиновых пластин размером 0,3×0,3 см, которые помещают в оба флакона и выдерживают при температуре 28°С до двух суток, а через 2-12-24-48 часов пластины хитина достают из флаконов, трехкратно промывают в физиологическом растворе, после этого каждую пластину помещают в отдельную емкость 1,5 мл, содержащую 0,5 мл дистиллированной воды, и проводят температурный лизис клеток и выделение ДНК путем прогревания при 99°С в течение 30 мин, а затем методом ПЦР определяют количество клеток холерного вибриона в супернатанте, количество адгезированных на хитине клеток в контрольном флаконе без диклофенака и во флаконе с диклофенаком, затем рассчитывают показатель адгезии культур холерных вибрионов по формуле
, где ПА - показатель адгезии;
Nx - количество ДНК, адгезированного на хитине;
Nc - количесто ДНК в супернатанте,
причем если ПА без воздействия диклофенака больше, чем ПА в присутствии диклофенака, значит, препарат подавил адгезию, а степень подавления адгезии определяют по коэффициенту КИ по формуле
, где ПА - показатель адгезии;
ПАд - показатель адгезии в присутствии диклофенака,
при этом за слабую степень ингибирующей активности принимают КИ в пределах от 0-1,5, среднюю степень - в пределах 1,6-2,0, высокую - более 2,1.
