Способ комплексной переработки вегетативной части тополя бальзамического методом биоконверсии

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ обработки почек, которую проводят путем гидродистилляции, твердый остаток почек и измельченные до 2-3 мм однолетние побеги экстрагируют 96% этиловым спиртом. Высушенные после спиртовой экстракции твердые остатки почек и побегов (шрот) смешивают с предварительно высушенными и измельченными до 2-3 мм листьями (опада) тополя в соотношении (1:1:1 по массе), полученный субстрат увлажняют до 70%, стерилизуют и подвергают биодеструкции, используя споровую суспензию гриба Trichoderma spp. (сибирского штамма К6-15). Культивирование грибов проводят в течение 7-14 суток при температуре (+28)°C с получением биопрепаратов типа Триходермин на основе штамма К6-15 Trichoderma spp., содержащих споры 4,2⋅10⁸-3,6⋅10⁹ спор/г и до 20% гуминовых кислот (в зависимости от состава субстрата и продолжительности культивирования). Способ позволяет получить биопрепарат с высоким титром спор и наличием в составе гуминовых веществ, которые можно использовать для гумификации почвы. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 пр.

 

Группа изобретений относится к экологии, биотехнологической промышленности, сельскому хозяйству, а именно к способам переработки вегетативной части тополя методом биоконверсии с получением ценных для народного хозяйства продуктов, в частности биопрепарата типа Триходермин и препарата для гумификации почвы.

К вегетативной части относятся листья (зеленые и опавшие) и почки с побегами.

Известен способ получения триходермина (RU 2607785 С2, МПК C12N 1/14, A01N 63/04, C12R 1/885, 10.01.2017), который заключается в культивировании штаммов гриба Trichoderma longibrachiatum на синтетических средах с добавлением мелассы в течение 4-5 сут. Биопрепарат содержит от 2⋅10⁹ до 4⋅10⁹ КОЕ/см³.

Недостатком этого способа является использование только полусинтетических сред.

Известен способ получения триходермина (RU 2035145 С1, МПК A01N 63/04, C12N 1/14, C12R 1/885, 20.05.1995) путем глубинного культивирования микроскопических грибов Trichoderma lignorum на питательной среде, содержащей источники углерода (глицерин и зеленая патока), органического азота (гидролизат белково-витаминного концентрата), фосфаты, сернокислый магний, азотнокислый аммоний и воду. Полученный препарат имеет титр хламидоспор 1,0⋅10⁹ спор/мл.

Недостатком этого способа является использование только полусинтетических сред и глубинное культивирование, требующее введение дополнительной обработки культуральной жидкости с целью выделения грибной биомассы и последующей сушки этой биомассы, а также наличие отхода производства в виде фильтрата, который необходимо утилизировать.

Известен способ получения биопрепарата для обработки растений (RU 2658430 С1, МПК A01N, А01С 1/06, C12N 1/14, C12R 1/885, 26.12.2016). Способ предусматривает культивирование штамма мицелиального гриба Trichoderma asperellum OPF-19 на жидкой полусинтетический питательной среде с добавлением дрожжевого экстракта, патоки, или других углеводсодержащих продуктов (меласса, гидрол, или солодовый экстракт). Продолжительность культивирования составляет 50-55 ч. По окончании культивирования осуществляют розлив продукта через фильтр из нейлоновой сетки с диаметром отверстий 0,2-0,5 мм с получением жидкого биопрепарата.

Недостатком этого способа является использование полусинтетических сред, глубинное культивирование, требующее введение дополнительной обработки культуральной жидкости (фильтрации) с целью выделения грибной биомассы, а также наличие отхода в виде отработанной (отфильтрованной) культуральной жидкости, которую необходимо утилизировать.

Известен способ производства микробиологических препаратов с использованием микроорганизмов видов Trichoderma lignorum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii (RU 2077204 С1, МПК A01N 63/00, A01N 63/04, A61K 35/66, A61K 35/74, C12N 1/00, C12N 1/14, C12N 1/20, C12R 1/42, C12R 1/465, C12R 1/885, 20.04.1997). Способ предусматривает подготовку посевной культуры микроорганизмов из штамма-продуцента и питательной среды, содержащей водорастворимые углеводы, источник органического азота, соли и воду, в которой содержание водорастворимых углеводов не менее 2% по массе, аминного азота не менее 0,0005% по массе, всего углеводов не более 18% по массе, общего азота не более 2,7% по массе, внесения посевной культуры в питательную среду, ее культивирование и выделение целевого продукта из культуральной жидкости. Культуральную жидкость вводят в созревающий или зрелый биогумус.

Недостатком этого способа является низкий титр препарата на основе грибов рода Trichoderma (1-2⋅10⁷ спор/г), необходимость введения в культуральную жидкость (в процессе культивирования или на этапе завершения) зрелого или созревающего биогумуса, а также использование синтетических сред.

Известен способ получения и применения препарата триходермина от фитопатогенов на основе гриба Trichoderma harzianum, штамм ВКМ Р-2477Д (RU 2094991 С1, МПК A01N 63/04, A01G 7/00, 10.11.1997). Способ получения препарата предполагает выращивание микромицета на увлажненных зернах ячменя или пшеницы в бутылях или банках в течение 5-7 сут, сушку и размол биопрепарата на шаровой мельнице с последующим смешением полученного порошка с водой и карбоксиметилцеллюлозой для получения препарата пастообразной консистенции.

Недостатком данного способа является неизвестный титр препарата, ограниченность применения из-за пастообразной консистенции конечного продукта и использование пищевого сырья.

Наиболее близким по существу к предлагаемому является способ комплексной переработки вегетативной части тополя бальзамического (RU 2322501 С1, МПК С12Р 1/02, С11В 1/10, С11В 9/02, С11С 1/00, C09F 1/00, 20.04.2008). Данный способ предусматривает использование послеэкстракционных остатков вегетативной части тополя в качестве субстрата для культивирования грибов рода Trichoderma (штамм Красноярский и Маганский). Вегетативную часть тополя (почки с побегами) обрабатывают водой методом гидродистилляции. Полученный твердый остаток подвергают экстракции 94-96%-м этиловым спиртом с получением экстракта и шрота. Шрот увлажняют кубовой жидкостью, полученной после гидродистилляции, и подвергают биодеструкции грибами рода Trichoderma. На выходе получают препарат с титром спор до 5,2⋅10⁸ спор/г.

Недостатком известного способа является использование ограниченной сырьевой базы в виде шрота почек с побегами, а также низкий титр спор в получаемом биопрепарате.

Задачей данного изобретения является использование различных субстратов, состоящих из шрота почек, однолетних побегов и листьев (опада) тополя, получение более высокого титра спор в биопрепарате.

Технический результат заключается в получении методом биоконверсии из зеленых и опавших листьев, почек и побегов тополя бальзамического биопрепаратов, необходимых для народного хозяйства.

Технический результат достигается тем, что в способе комплексной переработки вегетативной части тополя бальзамического методом биоконверсии, включающем обработку растительного сырья водой путем гидродистилляции с выделением эфирного масла и твердого остатка, экстракцию твердого остатка 96%-м этиловым спиртом с получением спиртового экстракта и последующую биодеструкцию грибами рода Trichoderma, согласно изобретению, в качестве растительного сырья используют почки, однолетние побеги и листья (опада) тополя, обработку почек проводят путем гидродистилляции, подсушенный твердый остаток почек и измельченные до 2-3 мм однолетние побеги экстрагируют 96%-м этиловым спиртом. Высушенные после спиртовой экстракции твердые остатки почек и побегов (шрот) смешивают с предварительно высушенными и измельченными до 2-3 мм листьями (опада) тополя в соотношении (1:1:1 по массе), полученный субстрат увлажняют до 70%, стерилизуют и подвергают биодеструкции, используя споровую суспензию гриба Trichoderma spp. (сибирского штамма К6-15). В качестве субстрата для биоконверсии используют не только смешанный субстрат, но отдельно зеленые и опавшие листья тополя. Культивирование грибов проводят в течение 7-14 суток при температуре (+28)°C с получением биопрепаратов типа Триходермин на основе штамма К6-15 Trichoderma spp., содержащих споры 4,2⋅10⁸-3,6⋅10⁹ спор/г (в зависимости от состава субстрата и продолжительности культивирования). При культивировании в течение 14 суток в процессе биоконверсии субстратов получают биопрепарат с содержанием до 20% гуминовых веществ, который можно использовать для гумификации почвы.

Однолетние побеги измельчают до 2-3 мм. Почки тополя подвергают гидродистилляции в результате получают эфирное масло и твердый остаток. Подсушенный твердый остаток почек после гидродистилляции и однолетние побеги далее экстрагируют 96%-м этиловым спиртом. Полученный шрот побегов и почек подсушивают и смешивают с опавшими листьями тополя бальзамического, предварительно высушенными и измельченными до 2-3 мм листьями тополя в соотношении 1:1:1 по массе. Затем смешанный субстрат увлажняют до 70% водопроводной водой, стерилизуют в автоклаве 30 мин под давлением 1,01⋅10⁵ МПа. Засев осуществляют споровой суспензией штамма К6-15 грибов рода Trichoderma spp. с титром 1⋅10⁶ спор на 1 г абсолютно сухого субстрата (а.с.с.) Культивирование проводят в стационарных условиях в термостате при температуре 28°С в течение 10-14 суток с получением биопрепаратов типа Триходермин на основе грибов Trichoderma spp. (штамм К6-15), содержащих споры 4,2⋅10⁸-3,6⋅10⁹ спор/г (в зависимости от состава субстрата и продолжительности культивирования) и до 20% гуминовых веществ.

Сравнение результатов испытаний заявленного способа с прототипом представлено в таблице 1.

Ниже приведены примеры, реализующие изобретение.

Пример 1. 6 г почек тополя бальзамического (влажность 43%) помещают в аппарат Клевенджера для выделения эфирных масел. Твердый остаток почек 2,8 г (на абсолютно сухое вещество) после гидродистилляции и 5 г однолетних побегов, предварительно измельченных до 2-3 мм, экстрагируют 96%-м этиловым спиртом с получением спиртового экстракта и твердых остатков (шрота) массой 1,8 г (на абсолютно сухое вещество).

Полученный шрот побегов и почек смешивают с опавшими листьями тополя бальзамического, предварительно высушенными и измельченными до 2-3 мм, в соотношении 1:1:1 по массе. 5,5 г а.с.с. растительного смешанного субстрата увлажняют до 70% водопроводной водой и помещают в чашки Петри, стерилизуют в автоклаве 30 мин под давлением 1,01⋅10⁵ Па несколько раз и засевают споровой суспензией сибирского штамма К6-15 Trichoderma spp. с титром 1⋅10⁶ спор на 1 г а.с.с. Культивирование споровой суспензии сибирского штамма К6-15 Trichoderma spp. проводят в стационарных условиях в термостате при температуре 28°С в течение 14 суток. В процессе биоконверсии субстрата получают биопрепарат 4,8 г а.с.с. типа Триходермин с тиром спор 8,6⋅10⁸-1,2⋅10⁹ спор/г. В продукте биоконверсии к 14-м суткам культивирования грибов происходит накопление до 15% гуминовых веществ.

Пример 2. 5,5 г а.с.с. опавших листьев тополя измельчают до 2-3 мм, увлажняют водопроводной водой до 70%, помещают в чашки Петри, стерилизуют в автоклаве 30 мин под давлением 1,0⋅10⁵ Па и засевают споровой суспензией штамма К6-15 Trichoderma spp. с титром 1⋅10⁶ спор на 1 г а.с.с. Культивирование споровой суспензии штамма К6-15 Trichoderma spp. проводят в стационарных условиях в термостате при температуре 28°С в течение 14 суток. Получают биопрепарат 5,2 г а.с.с. типа Триходермин с титром 7,1⋅10⁸ спор/г и содержанием до 15% гуминовых веществ.

Пример 3. 5,5 г а.с.с. зеленых листьев тополя измельчают до 2-3 мм, увлажняют водопроводной водой до 70%, помещают в чашки Петри, стерилизуют в автоклаве 30 мин под давлением 1,01⋅10⁵ Па несколько раз и засевают споровой суспензией сибирского штамма К6-15 Trichoderma spp. с титром 1⋅10⁶ спор на 1 г а.с.с. Культивирование споровой суспензии сибирского штамма К6-15 проводят в стационарных условиях в термостате при температуре 28°С в течение 14 суток. Получают биопрепарат 4,5 г а.с.с. типа Триходермин с титром спор 2,1-3,6 10⁹ спор/г. В продукте биоконверсии на 14-е сутки культивирования накапливается 20% гуминовых веществ.

Данное изобретение, способ комплексной переработки вегетативной части тополя бальзамического методом биоконверсии, позволяет расширить сырьевую базу производства за счет включения в переработку листьев тополя, в том числе опада, получить более высокий титр спор в биопрепарате, что улучшает его качество.

Способ позволяет переработать растительные отходы в ценные продукты для сельского хозяйства и снизить экологическую нагрузку на окружающую среду.

1. Способ комплексной переработки вегетативной части тополя бальзамического методом биоконверсии, включающий обработку растительного сырья водой путем гидродистилляции с выделением эфирного масла и твердого остатка, экстракцию твердого остатка 94-96% этиловым спиртом с получением спиртового экстракта и последующую биодеструкцию грибами рода Trichoderma, отличающийся тем, что в качестве растительного сырья используют почки, однолетние побеги и листья (опад) тополя, обработку почек проводят путем гидродистилляции, подсушенный твердый остаток почек и измельченные до 2-3 мм однолетние побеги экстрагируют 96% этиловым спиртом, подсушенные твердые остатки почек и побегов (шрот) после экстракции смешивают с предварительно высушенными и измельченными до 2-3 мм опавшими листьями в соотношении (1:1:1 по массе), полученный субстрат увлажняют до 70%, стерилизуют и подвергают биодеструкции, используя споровую суспензию гриба Trichoderma spp. (сибирского штамма К6-15).

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве субстрата для биоконверсии используют не только смешанный субстрат, но отдельно зеленые и опавшие листья тополя.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование грибов проводят в течение 7-14 сут при температуре (+28)°C с получением биопрепаратов типа Триходермин на основе грибов Trichoderma spp. (штамм К6-15), содержащих споры 4,2⋅10⁸-3,6⋅10⁹ спор/г (в зависимости от состава субстрата и продолжительности культивирования) и гуминовые вещества.