Способ оценки оксидативного стресса при метаболическом синдроме

Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии и эндокринологии. Способ оценки оксидативного стресса при метаболическом синдроме включает определение активности ферментов антирадикальной защиты и интенсивности свободно-радикального окисления. Определяют уровень концентрации активных продуктов тиобарбитуровой кислоты (ТБК-АП) в нМ*МДА/мл, определяют уровень церулоплазмина (ЦП) в мг/мл и активность каталазы (КА) в мкМ*л/сек. Далее определяют коэффициент перекисного окисления липидов (ПОЛ_к) как отношение КА к ТБК-АП. Затем вычисляют коэффициент антиоксидантной активности (АО_к) как отношение содержания ЦП к КА. При значении коэффициента ПОЛ_к равном 3 у.е. и значении коэффициента АО_к равном 2,5 у.е. диагностируют баланс между свободными радикалами и антиоксидантами. При значении коэффициента ПОЛ_к менее 3 у.е. и значении коэффициента АО_к менее 2,5 у.е. диагностируют усиление свободно-радикального повреждения и недостаток антиоксидантов. При увеличении значения коэффициента АО_к более 2,5 у.е. и значении коэффициента ПОЛ_к более 3 у.е. определяют адекватную реакцию антиоксидантной системы на свободно-радикальное повреждение. Изобретение позволяет выполнять экспресс-оценку оксидативного стресса, повышает информативность и точность диагностики, дает возможность проводить мониторинг антиоксидантной терапии. 3 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии и эндокринологии, и может быть использовано для определения оксидативного стресса при метаболического синдроме и его кардиоваскулярных осложнениях, в частности, при гипертонической болезни и ишемической болезни сердца.

Повышение продукции производных свободно-радикального окисления и перекисного окисления липидов, равно как и истощение антиоксидантных защитных механизмов, приводит к развитию оксидативного стресса (Liguori I., Russo G., Curcio F., Bulli G., Aran L., Della-Morte D., Gargiulo G., Testa G., Cacciatore F., Bonaduce D., Abete P. Oxidative stress, aging, and diseases. Clinical Interventions in Aging. 2018; 13: 757-772). Проблема диагностики оксидативного стресса является достаточно актуальной (Beharry K.D., Cai C.L., Henry М.М., Chowdhury S., Valencia G.B., and Aranda J.V. Co Enzyme Q10 and n 3 Polyunsaturated Fatty Acid Supplementation Reverse Intermittent Hypoxia Induced Growth Restriction and Improved Antioxidant Profiles in Neonatal. Rats. Antioxidants (Basel). 2017; 16; 6(4):103.). В настоящее время для оценки оксидативного стресса используют отдельные показатели антиоксидантной системы, индексы свободно-радикальных реакций, интенсивность которых в организме чаще всего оценивают по уровню продуктов перекисного окисления в сыворотке крови, активных продуктов тиобарбитуровой кислоты. Тем не менее, определение выраженности оксидативного стресса затруднено из-за отсутствия четких критериев, что приводит к неадекватной оценке полученных данных и их интерпретации, снижает точность оценки.

Известны ряд индексов для оценки окислительного стресса при различных заболеваниях и состояниях (Колесникова Л.И., Мадаева И.М., Семенова Н.В., Гребенкина Л.А., Солодова Е.И. Оценка окислительного стресса у женщин с нарушениями в постменопаузе с использованием интегрального показателя. Клиническая лабораторная диагностика. 2014; 12:29-32), (Колесникова Л.И, Толпыгина О.А., Курашова Н.А., Гребенкина Л.А., Долгих М.И, Дашиев Б.Г. Коэффициент окислительного стресса у мужчин репродуктивного возраста при бесплодии. Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2011; 5 (81):72-75). При этом, в вышеприведенных способах используется большое количество показателей, оперирование сложными формулами, что требует больших временных затрат, нет возможности осуществлять экспресс-оценку, необходимую для контроля лечения и профилактики заболеваний, индуцированных оксидативным стрессом.

Известен способ оценки оксидативного стресса при метаболическом синдроме (Сорокина Ю.А., Ловцова Л.В. Коэффициенты окислительного стресса как способ персонифицирования фармакотерапии в дебюте СД 2 типа. Universum: Медицина и фармакология: электрон, научн. журн. 2015; 1(14) с. 4), включающий определение гликированного гемоглобина, С-пептида, уровней гликемии, показателей перекисного окисления липидов - малонового диальдегида, триеновых конъюгатов, диеновых конъюгатов и окислительной модификации альдегид-динитрофенилгидразона, кетон-инитрофенилгидразона, общей антиоксидантной активности, максимальной интенсивности индуцированной хемилюминесценции, активности антиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы и каталазы, с последующей оценкой полученных результатов по интегральному показателю функционирования ферментов антирадикальной защиты и спектрофотометрическим данным по формуле.

К недостаткам данного способа относятся следующие: малая информативность, не может широко использоваться в клинике, так как в большей степени диагностика ориентирована на больных сахарным диабетом и учитывает узкоспецифические показатели - гликированный гемоглобин, уровень гликемии, изменяющиеся только при данном заболевании, необходимость определения большого количества показателей увеличивает временные параметры оценки оксидативного стресса, не высокая точность, так как диеновые и триеновые конъюгаты являются нестойкими соединениями, что затрудняет их определение.

В качестве прототипа выбран способ оценки оксидативного стресса при метаболическом синдроме (Патент РФ №2436101; Опубл. 2011), включающий определение в комплексе активности супероксиддисмутазы (СОДi) и каталазы (KATi) в гемолизате, оценку изменения этих показателей относительно нормы, которая соответствует значениям СОДk=0,16±0,02 и KATk=115,55±9,41, и при значении соотношения этих показателей, равном 1,000±0,002, определяют отсутствие дисбаланса функционирования ферментов антирадикальной защиты, а при других значениях дополнительно определяют степень выраженности окислительного стресса по максимуму и площади вспышки хемилюминесценции, с последующей оценкой дисбаланса функционирования ферментов антирадикальной защиты, вычисляя интегральный показатель функционирования ферментов антирадикальной защиты ИПФФАРЗi обследуемого в единицах соотношения каталаза/супероксиддисмутаза по формуле, и при значении ИПФФАРЗi ниже 70,0 ед. определяют недостаточность каталазы, а при значении ИПФФАРЗi выше 130,0 ед. определяют недостаточность супероксиддисмутазы.

К недостаткам прототипа можно отнести такие, как длительность оценки, в связи с использованием большого количества показателей, не высокая информативность, так как супероксиддисмутаза и каталаза являются преимущественно внутриклеточными антиоксидантами, и не учитываются плазменные антиоксиданты, имеющие существенное значение в защите от свободных радикалов, что не позволяет полностью оценить все звенья антиоксидантной системы, приводящие к развитию и формированию оксидативного стресса, необходимость применения дополнительного оборудования при использовании метода люминесценции.

Проведенный патентно-информационный поиск не выявил способов оценки оксидативного стресса при метаболическом синдроме с существенными признаками заявляемого способа.

Вышеописанный уровень техники свидетельствует о том, что при оценке оксидативного стресса при метаболическом синдроме проблемой является малоинформативность, низкая точность и длительность диагностики, что не позволяет своевременно корректировать лечебную тактику у больных с данной патологией, оптимизировать контроль терапии и проводить действенную профилактику.

Техническим результатом, достигаемым изобретением, является повышение эффективности и информативности оценки основных аспектов оксидативного стресса, возможность проведения ускоренного скрининга.

Разработка способа комплексной экспресс-оценки с учетом как внутриклеточных, так и внеклеточных звеньев оксидативного стресса во взаимодействии их с продуктами перекисного окисления липидов, позволяет решить вышеуказанную проблему.

Предлагается, как и в прототипе, определять активность ферментов антирадикальной защиты и интенсивность свободно-радикального окисления.

Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что в способе оценки оксидативного стресса при метаболического синдроме, включающем определение активности ферментов антирадикальной защиты и интенсивности свободно-радикального окисления, согласно изобретению, определяют уровень концентрации активных продуктов тиобарбитуровой кислоты (ТБК-АП), определяют уровень церулоплазмина (ЦП) и активность каталазы (KA), далее определяют коэффициент перекисного окисления липидов (ПОЛ_к) как отношение КА к ТБК-АП, затем вычисляют коэффициент антиоксидантной активности (АО_к) как отношение содержания ЦП к КА, и при значении коэффициента ПОЛ_к равном 3 у.е., а значении коэффициента АО_к равном 2,5 у.е. диагностируют баланс между свободными радикалами и антиоксидантами, при значении коэффициента ПОЛ_к менее 3 у.е. и значении коэффициента АО_к менее 2,5 у.е. диагностируют усиление свободно-радикального повреждения и недостаток антиоксидантов, а при увеличении значения коэффициента АО_к более 2,5 у.е. и значении коэффициента ПОЛ_к более 3 у.е. определяют адекватную реакцию антиоксидантной системы на свободно-радикальное повреждение.

Причинно-следственная связь между совокупностью существенных признаков и обеспечиваемым изобретением техническим результатом, состоит в следующем: определение отношения КА, увеличивающейся при высоких концентрациях супероксидных радикалов, которые усиливают образование простагландинов из арахидоновой кислоты, к содержанию активных продуктов тиобарбитуровой кислоты (ТБК-АП), имеющей способность реагировать с малоновым альдегидом, промежуточным продуктом этапа энзиматического окисления арахидоновой кислоты и конечным продуктом окислительной деградации липидов, позволяет прослеживать все основные этапы перекисного окисления липидов (ПОЛ), а определение отношения содержания концентрации плазменного антиоксиданта ЦП, являющегося важнейшим представителем плазменной антиоксидантной системы, к КА позволяет характеризовать уровень состоятельности данной системы.

Использование комплексной оценки оксидативного стресса путем определения концентрации внеклеточных антиоксидантов плазменного антиоксиданта церулоплазмина и анализа соотношений внутри- и внеклеточных антиоксидантов, позволяет оценить количественные взаимосвязи основных звеньев антиоксидантной системы при развитии метаболического синдрома, а вычисление коэффициента ПОЛ_к, позволяет соотнести уровень антиоксидантной защиты со степенью перекисного окисления липидов и оценить степень свободно-радикального повреждения, что повышает достоверность полученных результатов, информативность оценки, дает возможность выполнения ускоренной диагностики и проведения мониторинга антиоксидантной терапии для своевременной ее коррекции.

Заявляемый способ оценки оксидативного стресса разработан впервые.

Способ заключается в следующем.

У обследуемых людей берут венозную кровь и общепринятым методом получают сыворотку крови, в которой определяют содержание активных продуктов тиобарбитуровой кислоты ТБК-АП, активность каталазы КА и уровень церулоплазмина ЦП.

Интенсивность свободно-радикального окисления липидов в сыворотке крови оценивают по концентрации ТБК-АП. Уровень концентрации ТБК-АП определяют в нМ*МДА/мл по цветной реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой в присутствии ионов Fe³⁺ (Гаврилов В.Б. Анализ методов определения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с тиобарбитуровой кислотой. Вопр. мед. химии, 1987; 1:118-122).

Активность каталазы КА определяют в мкМ*л/сек по остаточному количеству перекиси водорода после ее инкубации с биологическим материалом при рН 7,4 и 25°С (Павлюченко И.И., Луговая И.А., Федосов С.Р., Басов А.А., Быков М.И. Активность ферментов антирадикальной защиты в эритроцитах и в раневом отделяемом у больных с осложненным течением сахарного диабета // XIV международная конференция «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Ялта-Гурзуф; 2006:281-287).

Определяют уровень церулоплазмина ЦП в мг/л модифицированным методом Ревина, основанным на окислении р-фенилендиамина при участии церулоплазмина с остановкой реакции раствором фтористого натрия и измерением оптической плотности при 540 нм. (Горячковский А.М. Клиническая биохимия. Одесса: Астропринт. 1998:395-397).

Далее определяют коэффициент перекисного окисления липидов ПОЛ_к. Для этого вычисляют отношение КА к ТБК-АП. По величине коэффициента ПОЛ_к прослеживают степень свободно-радикального повреждения.

Затем определяют коэффициент антиоксидантной активности АО_к путем вычисления отношения содержания ЦП к КА. По полученному значению коэффициента АО_к судят о состоятельности плазменной антиоксидантной системы.

У здоровых испытуемых для определения коэффициента ПОЛ_к и коэффициента АО_к в норме производили забор крови и определяли в сыворотке крови уровень концентрации ТБК-АП, КА и уровень ЦП для каждого донора. Находили среднестатистические значения ПОЛ_к и АО_к, которые принимали за норму, при этом величина коэффициента ПОЛ_к составила 3 у.е., а величина коэффициента АО_к составила 2,5 у.е., что свидетельствовало о балансе между свободными радикалами и антиоксидантами, а, следовательно, о нормальном состоянии антиоксидантной системы.

При получении значений коэффициента ПОЛ_к менее 3 у.е. и коэффициента АО_к менее 2,5 у.е. у обследуемых больных диагностируют усиление свободно-радикального повреждения и недостаток антиоксидантов. Увеличение значений коэффициента АО_к более 2,5 у.е. и коэффициента ПОЛ_к более 3 у.е. свидетельствует о благоприятном признаке адекватной реакции антиоксидантной системы, и указывает на включение церулоплазмина в систему антирадикальной защиты.

Заявляемый способ позволяет комплексно оценить и проанализировать выраженность оксидативного стресса, учитывая стадии его развития и формирования, а также проводить скрининг оксидативного стресса у различных групп обследуемых.

Способ был использован у 259 пациентов с гемодинамическими нарушениями при метаболическом синдроме, из них у 96 пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) и 163 пациентов с гипертонической болезнью (ГБ), подтвержденными ранее диагнозами в лечебных учреждениях. Пациенты были разделены на 2 группы: 1-я группа - пациенты с ИБС, 2-я группа - пациенты с ГБ.

У пациентов всех групп производили забор крови и определяли показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы, вычисляли коэффициент ПОЛ_к и коэффициент АО_к.

После этого у больных ИБС и ГБ соответствующих групп проводили курс терапии длительностью 21 день, после чего вновь определяли указанные коэффициенты. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием вариационной статистики с вычислением средних величин (М), их стандартными отклонениями (m) и оценкой t-критерия Стьюдента, если распределение отличалось от нормального, то использовали U-критерий Манна-Уитни. Достоверными считали показатели при р<0,05. Данные расчеты выполняли в среде электронных таблиц Microsoft Office Excel.

В обеих группах до лечения коэффициент ПОЛ_к составил 1±0,003 у.е., а коэффициент АО_к составил 0,92±0,004 у.е. у больных ГБ и 0,85±0,002 у.е. у больных ИБС, что свидетельствует о выраженных расстройствах в антиоксидантной системе у данных групп больных, и приводит к изменениям изучаемых показателей и их соотношений - к снижению как коэффициента ПОЛ_к за счет увеличения ТБКА-АП, так и к снижению коэффициента АО_к.

После лечения у больных 1 и 2 групп наблюдался рост коэффициента ПОЛк, который составил 1,18±0,07у.е. у больных ГБ, и 1,76±0,09 у.е. у больных ИБС. Данное увеличение происходило за счет снижения уровня ТБК-АП, вследствие уменьшения концентрации липидных перекисей под влиянием терапии. Коэффициент АО_к оставался сниженным до конца курса терапии и не превышал 0,95±0,003 у.е. в группе больных с ГБ и 0,88±0,004 у.е. в группе больных с ИБС. При хронических заболеваниях происходит снижение уровня меди в тканях, вследствие этого нарушается синтез медьзависимой супероксиддисмутазы и происходит усиление процессов ПОЛ в тканях. Восстановление концентрации церулоплазмина нормализует уровень меди в тканях и снижает процессы ПОЛ. Установлено, что рост уровня церулоплазмина является относительно медленным процессом (Ващенко В.И., Ващенко Т.Н. Биология и фармакология церулоплазмина: от эксперимента до лекарственной терапии. Обзоры по клинич. фармакол. и лек. терапии. 2008; 1:1254-1269), в связи с чем коррекция оксидативного стресса должна носить длительный характер и проводиться повторяющимися курсами терапии.

Способ подтверждается следующими клиническими примерами.

Пример 1.

Пациент К., 37 лет. Жалоб нет, проходит плановую диспансеризацию. Пациентом было подписано добровольное информированное согласие на проведение диагностики по заявляемому способу. Была проведена оценка оксидативного стресса. Получены следующие результаты: КА составила 120,5 мкМ*л/сек., уровень ТБК-АП составил 39,9 нМ*МДА/мл, содержание ЦП было равно 302.2 мг/л. Коэффициент ПОЛ_к, составил 3,0 у.е., и коэффициент АО_к - 2.5 у.е.. У обследуемого пациента не наблюдалось дисбаланса между продуктами перекисного окисления липидов и антиоксидантами, что свидетельствовало об отсутствии нарушений в антиоксидантной системе.

Пример 2.

Пациент Л., 58 лет. Клинически установленный диагноз метаболического синдрома. Жалобы на увеличение массы тела, увеличение окружности живота. Пациентом было подписано добровольное информированное согласие на проведение диагностики по заявляемому способу. У пациента была проведена оценка оксидативного стресса. Активность каталазы КА составила 194,52 мкМ*л/сек., уровень ТБК-АП составил 137.56 нМ*МДА/мл, содержание ЦП - 158 мг/л. Коэффициент ПОЛ_к составил 1,41 у.е., коэффициент АО_к - 0,81 у.е. У пациента наблюдается усиление перекисного окисления липидов, на что указывает снижение ПОЛ_к меньше 3 и уменьшение плазменного звена антиоксидантной системы, на что указывает снижение коэффициент АО_к ниже 2,5 у.е. У пациента имеется дисбаланс работы ферментов антирадикальной защиты. Пример 3.

Пациент С., 38 лет. Клинически установленный диагноз гипертонической болезни I степени. Жалобы на снижение работоспособности, повышение артериального давления до 145/90 мм рт. ст. Пациентом было подписано добровольное информированное согласие на проведение диагностики по заявляемому способу. У пациента была проведена оценка оксидативного стресса. КА составила 125,03 мкМ*л/сек., уровень ТБК-АП составил 40.50 нМ*МДА/мл, содержание ЦП - 410 мг/л. Коэффициент ПОЛ_к составил 3,16 у.е., коэффициент АО_к - 3,3 у.е. Повышение коэффициентов ПОЛ_к и АО_к свидетельствовало об адекватной реакции антиоксидантной системы у пациента, и указывало на активизацию плазменного звена антирадикальной защиты.

Использование заявляемого способа дает возможность оценить выраженность оксидативного стресса при метаболическом синдроме и его кардиоваскулярных осложнениях, повышает скорость оценки и позволяет определять индивидуальный подход к медикаментозной коррекции, проводить скрининг терапии.

Способ оценки оксидативного стресса при метаболическом синдроме, включающий определение активности ферментов антирадикальной защиты и интенсивности свободно-радикального окисления, отличающийся тем, что определяют уровень концентрации активных продуктов тиобарбитуровой кислоты (ТБК-АП) в нМ*МДА/мл, определяют уровень церулоплазмина (ЦП) в мг/мл и активность каталазы (КА) в мкМ*л/сек, далее определяют коэффициент перекисного окисления липидов (ПОЛ_к) как отношение КА к ТБК-АП, затем вычисляют коэффициент антиоксидантной активности (АО_к) как отношение содержания ЦП к КА, и при значении коэффициента ПОЛ_к равном 3 у.е. и значении коэффициента АО_к равном 2,5 у.е. диагностируют баланс между свободными радикалами и антиоксидантами, при значении коэффициента ПОЛ_к менее 3 у.е. и значении коэффициента АО_к менее 2,5 у.е. диагностируют усиление свободно-радикального повреждения и недостаток антиоксидантов, а при увеличении значения коэффициента АО_к более 2,5 у.е. и значении коэффициента ПОЛ_к более 3 у.е. определяют адекватную реакцию антиоксидантной системы на свободно-радикальное повреждение.