Гуманизированное моноклональное антитело, специфически связывающиеся с rbd s белка вируса sars-cov-2, средство и способ для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом sars-cov-2

Группа изобретений относится к области биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Создано гуманизированное моноклональное антитело, которое специфически связывается с RBD S белка вируса SARS-CoV-2 и обладает вируснейтрализующей активностью, а также создано средство и способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2. Гуманизированное моноклональное антитело имеет аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 1 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 2. Также раскрыт способ терапии и экстренной профилактики вирусной инфекции SARS-CoV-2. Группа изобретений расширяет арсенал средств, обладающих вируснейтрализующей активностью и протективной активностью в отношении различных штаммов вируса SARS-CoV-2. 3 н.п. ф-лы, 7 ил., 7 табл., 10 пр.

 

Область техники

Группа изобретений относится к области биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Создано гуманизированное моноклональное антитело, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2 и обладающие вируснейтрализующей активностью, также предложено средство и способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2.

Предшествующий уровень техники.

31 декабря 2019 года во Всемирную организацию здравоохранения (ВОЗ) поступила информация о вспышке пневмонии неизвестной этиологии в городе Ухань (Китайская Народная Республика). Возбудителем заболевания оказался одноцепочечный РНК-содержащий вирус SARS-CoV-2, относящийся к семейству Coronaviridae, к линии Beta-CoV B.

Коронавирус SARS-CoV-2 может передаваться воздушно-капельным, воздушно-пылевым, контактным, фекально-оральным способами, а также через контаминированные предметы и поверхности (фомиты), через кровь, от матери ребенку и от животных к человеку (Механизмы передачи вируса SARS-CoV-2 и их значение для выбора мер профилактики, Резюме научных исследований, 9 июля 2020 г. ВОЗ). За несколько месяцев вирус распространился по всему миру, и в январе 2020 года ВОЗ объявила эпидемию, связанную с SARS-CoV-2, чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения международного значения, а в марте 2020 года охарактеризовала распространение болезни как пандемию.

Заболевание, которое вызывает SARS-CoV-2 получило собственное название COVID-19. Это потенциально тяжёлая острая респираторная инфекция, которая может протекать как в легкой, так и в тяжелой форме, и сопровождаться такими осложнениями, как пневмония, острый респираторный дистресс-синдром, острая дыхательная недостаточность, острая сердечная недостаточность, острая почечная недостаточность, септический шок, кардиомиопатии, и др. В настоящее время число заболевших COVID-19 более 185 млн человек, а погибших- более 4 млн человек и эти числа продолжают расти. Очевидно, что во всем мире в настоящее время есть острая необходимость в разработке безопасных и эффективных средств профилактики и лечения.

Кроме того, с конца 2020 года начали появляться новые варианты вируса SARS-CoV-2, содержащие точечные аминокислотные замены, позволяющие приобретать частичную или полную резистентность к иммунному ответу, выработанному на исходный вариант вируса. Один из таких новых вариантов В.1. 617.2 Delta, впервые изолированный в Индии, способен индуцировать образование клеточного синцития, что дополнительно помогает уходит от вирус-нейтрализующих антител.

Одним из перспективных подходов к терапии коронавирусной инфекции является применение антител против определенных антигенных детерминант вируса. Это обусловлено двумя основными причинами: высокой специфичностью антител и технологичностью их промышленного производства. (В.С. Смирнов, Арег А. Тотолян. Некоторые возможности иммунотерапии при коронавирусной инфекции. Инфекция и иммунитет 2020, Т. 10, № 3, с. 446-458).

В настоящее время в мире проводится более 50 клинических исследований, связанных с моноклональными антителами (Deb P, Molla MMA, Saif-Ur-Rahman KM. An update to monoclonal antibody as therapeutic option against COVID-19. Biosaf Health. 2021 Apr;3(2):87-91. doi: 10.1016/j.bsheal.2021.02.001. Epub 2021 Feb 10. PMID: 33585808; PMCID: PMC7872849). (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2590053621000197#s0005).

В настоящий момент разрешено к экстренному использованию два препарата на основе моноклональных антител. 21 ноября 2020 года Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) выдало разрешение на экстренное использование (EUA) препарата REGEN-COV (Regeneron Pharmaceuticals), для лечения COVID-19 от легкой до умеренной степени у людей в возрасте от двенадцати лет и старше с массой тела не менее 40 кг (88 фунтов) с положительными результатами прямого тестирования на вирус SARS-CoV-2 и которые имеют высокий риск развития тяжелой формы COVID-19. Сюда входят лица в возрасте 65 лет и старше или лица, страдающие определенными хроническими заболеваниями. REGEN-COV состоит из двух моноклональных антител: казиривимаба (REGN10933) и имдевимаба (REGN10987), которые связываются с неперекрывающимися эпитопами S белка SARS-CoV-2. Результаты клинических исследований данного препарата показали, что он способен снижать вирусную нагрузку, с большим эффектом у пациентов, у которых иммунный ответ еще не был инициирован или у которых исходно была высокая вирусная нагрузка (Weinreich DM, Sivapalasingam S, Norton T, Ali S, Gao H, Bhore R, Musser BJ, Soo Y, Rofail D, Im J, Perry C, Pan C, Hosain R, Mahmood A, Davis JD, Turner KC, Hooper AT, Hamilton JD, Baum A, Kyratsous CA, Kim Y, Cook A, Kampman W, Kohli A, Sachdeva Y, Graber X, Kowal B, DiCioccio T, Stahl N, Lipsich L, Braunstein N, Herman G, Yancopoulos GD; Trial Investigators. REGN-COV2, a Neutralizing Antibody Cocktail, in Outpatients with Covid-19. N Engl J Med. 2021 Jan 21; 384(3):238-251. doi: 10.1056/NEJMoa2035002. Epub 2020 Dec 17. PMID: 33332778; PMCID: PMC7781102).

Другой препарат на основе моноклонального антитела - бамланивимаб (LY-CoV555,

разработчик: Eli Lilly) получил разрешение FDA на экстренное применение для лечения COVID-19 от легкой до умеренной степени тяжести у не госпитализированных взрослых и детей. Однако результаты клинических исследований неоднозначны. Среди госпитализированных пациентов с COVID-19 одновременное применение бамланивимаба с ремдесивиром не было эффективно. (ACTIV-3/TICO LY-CoV555 Study Group, Lundgren JD, Grund B, Barkauskas CE, Holland TL, Gottlieb RL, Sandkovsky U, Brown SM, Knowlton KU, Self WH, Files DC, Jain MK, Benfield T, Bowdish ME, Leshnower BG, Baker JV, Jensen JU, Gardner EM, Ginde AA, Harris ES, Johansen IS, Markowitz N, Matthay MA, ∅stergaard L, Chang CC, Davey VJ, Goodman A, Higgs ES, Murray DD, Murray TA, Paredes R, Parmar MKB, Phillips AN, Reilly C, Sharma S, Dewar RL, Teitelbaum M, Wentworth D, Cao H, Klekotka P, Babiker AG, Gelijns AC, Kan VL, Polizzotto MN, Thompson BT, Lane HC, Neaton JD. A Neutralizing Monoclonal Antibody for Hospitalized Patients with Covid-19. N Engl J Med. 2021 Mar 11;384(10):905-914. doi: 10.1056/NEJMoa2033130. Epub 2020 Dec 22. PMID: 33356051; PMCID: PMC7781100). Клинические исследования на амбулаторных пациентах показали, что только одна из трех доз исследуемого препарата (2800 мг LY-CoV555) достоверно ускоряла естественное снижение вирусной нагрузки. (Chen P, Nirula A, Heller B, Gottlieb RL, Boscia J, Morris J, Huhn G, Cardona J, Mocherla B, Stosor V, Shawa I, Adams AC, Van Naarden J, Custer KL, Shen L, Durante M, Oakley G, Schade AE, Sabo J, Patel DR, Klekotka P, Skovronsky DM; BLAZE-1 Investigators. SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody LY-CoV555 in Outpatients with Covid-19. N Engl J Med. 2021 Jan 21;384(3):229-237. doi:10.1056/NEJMoa2029849. Epub 2020 Oct 28. PMID: 33113295; PMCID: PMC7646625).

Наилучший эффект наблюдался при комбинированной терапии двумя моноклональными антителами: бамланивимаб и этесевимаб. (Gottlieb RL, Nirula A, Chen P, Boscia J, Heller B, Morris J, Huhn G, Cardona J, Mocherla B, Stosor V, Shawa I, Kumar P, Adams AC, Van Naarden J, Custer KL, Durante M, Oakley G, Schade AE, Holzer TR, Ebert PJ, Higgs RE, Kallewaard NL, Sabo J, Patel DR, Klekotka P, Shen L, Skovronsky DM. Effect of Bamlanivimab as Monotherapy or in Combination With Etesevimab on Viral Load in Patients With Mild to Moderate COVID-19: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 2021 Feb 16;325(7):632-644. doi: 10.1001/jama.2021.0202. PMID: 33475701; PMCID: PMC7821080).

Кроме того, перспективным направлением для терапии и экстренной профилактики инфекционных заболеваний является использование однодоменных антител (наноантител), которые в природе можно найти у представителей семейства верблюдовые. Благодаря относительно небольшому размеру однодоменные антитела обладают благоприятными биофизическими свойствами и дешевле в производстве, чем стандартные моноклональные антитела. Они могут быть получены с использованием прокариотических или эукариотических систем экспрессии. Их небольшой размер, а также длинные, определяющие комплементарность участки тяжелой цепи позволяют им нацеливаться на вогнутые эпитопы. Кроме того, наноантитела можно распылять и доставлять прямо в легкие пациента с Covid-19 с помощью ингалятора, что представляет собой лучшую альтернативу внутривенно вводимым классическим антителам (Ram Sasisekharan. Preparing for the Future - Nanobodies for Covid-19? April 22, 2021 N Engl J Med 2021; 384:1568-1571 DOI: 10.1056/NEJMcibr2101205).

В настоящее время нет препаратов на основе однодоменных антител, разрешенных к применению для лечения COVID-19.

Известно решение (CN 112500480 A, опуб. 16.03.2021), в котором разработаны варианты однодоменного антитела против вируса SARS-CoV-2, соответствующий вектор экспрессии, а также линия клеток, способная экспрессировать вышеуказанные варианты однодоменного антитела, и способ получения вариантов данного антитела.

Известно решение (CN 111825762 A, опуб. 27.10.2020), в котором разработано несколько вариантов наноантитела к домену RBD S белка вируса SARS-COV-2, а также способ применения вариантов наноантитела для приготовления лекарственных средств для ингибирования вирусной инфекции SARS-COV-2 и приготовлении реагентов или наборов для тестирования вируса SARS-COV-2.

В патенте (CN 112094342 A, опуб. 18.12.2020) представлено биэпитопное специфическое антитело, происходящее из альпака, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с доменом RBD SARS-CoV-2 с высоким сродством, что может использоваться для профилактики, лечения и / или диагностики инфекции SARS-CoV-2.

Известно решение (CN 112062839 A, опуб. 11.12.2020), в котором описано создание наноантитела к S белку SARS-CoV-2, а также способ его использования для приготовления реагента для лечения и / или диагностики инфекции, вызванной коронавирусом SARS-CoV-2.

Также известно решение (CN 112062840 A, опуб. 11.12.2020), предусматривающее разработку наноантитела к S белку SARS-CoV-2, а также способ его использования для приготовления реагента для лечения и / или диагностики инфекции, вызванной коронавирусом SARS-CoV-2.

В патенте (CN 111303279 A, опуб.19.09.2020) описано создание гуманизированного однодоменного антитела против коронавируса SARS-CoV-2, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей однодоменное антитело, а также создание кассеты экспрессии, рекомбинантного вектора, рекомбинантной бактерии или линии трансгенных клеток, содержащей вышеописанную молекулу нуклеиновой кислоты. Кроме того, разработан способ применения однодоменного антитела или созданной молекулы нуклеиновой кислоты или созданной экспрессионной кассеты, рекомбинантного вектора, рекомбинантной бактерии или линии трансгенных клеток при производстве продукта, который может применяться для предотвращения и / или лечение заболеваний, вызванных инфицированием новым коронавирусом SARS-CoV-2; а также для подавления заражения новым коронавирусом SARS-CoV-2. При этом продукт может: связываться с новым коронавирусом SARS-CoV-2; обнаруживать связывание нового коронавируса SARS-CoV-2; связываться с белком S нового коронавируса SARS-CoV-2; обнаруживать белок S нового коронавируса SARS-CoV-2. Также разработана фармацевтическая композиция, содержащая созданное однодоменное антитело и фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавитель или носитель.

Данное решение, как наиболее близкое к заявляемому, было выбрано авторами патента за прототип. Однако, недостатком прототипа является отсутствие данных по возможности применения полученных антител для терапии заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2 других вариантов (например, вариант Delta), кроме того, однодоменные антитела быстро выводятся из организма в следствии низкой молекулярной массы и, таким образом, требуют многократного введения.

Таким образом, в уровне техники существует потребность в создании препарата для терапии и экстренной профилактики заболевания, вызываемого вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, лишенного указанного недостатка.

Раскрытие сущности изобретения

Технической задачей заявленной группы изобретений является расширение арсенала средств для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2.

Технический результат заключается в создании гуманизированного моноклонального антитела, обладающего вируснейтрализующей активностью и протективной активностью в отношении различных штаммов вируса SARS-CoV-2. А также технический результат заключается в создании эффективного способа терапии или экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся во введении эффективного средства, включающего разработанное гуманизированное моноклональное антитело.

Указанная технический задача решается тем, что создано гуманизированное моноклональное антитело для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, и имеет аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 1 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 2.

Кроме того, создано средство для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, содержащее разработанное гуманизированное моноклональное антитело в эффективном количестве, а также фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.

А также разработан способ терапии или экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся во введении в организм млекопитающих в эффективном количестве гуманизированного моноклонального антитела.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена электрофореграмма анализа гуманизированного моноклонального антитела XRH19.

1 - образец гуманизированного моноклонального антитела XRH19 в денатурированных условиях;

2 - маркер молекулярного веса;

3 - образец гуманизированного моноклонального антитела XRH19 в неденатурированных условиях;

На фиг. 2 представлено схематическое изображение гуманизированного моноклонального антитела XRH19.

На фиг. 3 представлены результаты анализа специфической активности гуманизированного моноклонального антитела XRH19 в непрямом ИФА.

Ось ординат - оптические единицы, ОД450нм;

Ось абсцисс - концентрация антитела XRH19, мкг/мл;

- уровень сигнала антитела XRH19 на бычий сывороточный альбумин (отрицательный контроль);

- уровень сигнала антитела XRH19 на RBD.

На фиг. 4 представлена хроматограмма ВЭЖХ пробы гуманизированного моноклонального антитела XRH19 в буфере №2.

Ось ординат - единицы оптической плотности 280нм, mAu;

Ось абсцисс - время удерживания пиков, мин.

На фиг. 5 представлены результаты выживаемости животных, которым вводили гуманизированное моноклональное антитело XRH19 и животных из группы плацебо в течение 15 суток после заражения вирусом SARS-CoV-2 штамма hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020.

Ось ординат - выживаемость, %;

Ось абсцисс - время после заражения животных вирусом SARS-CoV-2, дни;

- мыши, получившие гуманизированное моноклональное антитело XRH19 (10 мг/кг) спустя 1 час после заражения вирусом;

- мыши, получившие гуманизированное моноклональное антитело XRH19 (20 мг/кг) спустя 1 час после заражения вирусом;

- мыши, получившие фосфатно-солевой буфер (PBS) спустя 1 час после заражения вирусом.

На фиг. 6 представлены результаты анализа изменения веса животных, которым вводили гуманизированное моноклональное антитело XRH19 и животных из группы плацебо в течение 15 суток после заражения вирусом SARS-CoV-2 вариант Delta. В каждой временной точке для каждой группы животных вес представлен в виде арифметического среднего.

Ось ординат - изменение веса животных от начального, %;

Ось абсцисс - время после заражения животных вирусом SARS-CoV-2, дни;

- мыши, получившие гуманизированное моноклональное антитело XRH19 10 мг/кг спустя 1 час после заражения вирусом;

- мыши, получившие гуманизированное моноклональное антитело XRH19 10 мг/кг спустя 6 часов после заражения вирусом;

- мыши, получившие гуманизированное моноклональное антитело XRH19 20 мг/кг спустя 1 час после заражения вирусом;

- мыши, получившие гуманизированное моноклональное антитело XRH19 20 мг/кг спустя 6 часов после заражения вирусом;

- мыши, получившие фосфатно-солевой буфер (PBS) спустя 1 часов после заражения вирусом;

- мыши, получившие фосфатно-солевой буфер (PBS) спустя 6 часов после заражения вирусом.

На фиг. 7 представлены результаты выживаемости животных, которым вводили гуманизированное моноклональное антитело XRH19, и животных из группы плацебо в течение 15 суток после заражения вирусом SARS-CoV-2 вариант Delta.

Ось ординат - выживаемость, %;

Ось абсцисс - время после заражения животных вирусом SARS-CoV-2, дни;

- мыши, получившие гуманизированное моноклональное антитело XRH19 10 мг/кг спустя 1 час после заражения вирусом;

- мыши, получившие гуманизированное моноклональное антитело XRH19 10 мг/кг спустя 6 часов после заражения вирусом;

- мыши, получившие гуманизированное моноклональное антитело XRH19 20 мг/кг спустя 1 час после заражения вирусом;

- мыши, получившие гуманизированное моноклональное антитело XRH19 20 мг/кг спустя 6 часов после заражения вирусом;

- мыши, получившие фосфатно-солевой буфер (PBS) спустя 1 часов после заражения вирусом;

- мыши, получившие фосфатно-солевой буфер (PBS) спустя 6 часов после заражения вирусом.

Осуществление изобретения.

Технической задачей заявленной группы изобретений является создание гуманизированного моноклонального антитела для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2. Моноклональные антитела, обладающие высокой специфичностью к RBD S-белка вируса SARS-CoV-2 и обладающие вирус-нейтрализующей активностью, рассматриваются в качестве перспективных средств для терапии и экстренной профилактики COVID 19.

Для этого было разработано гуманизированное моноклональное антитело (XRH19), специфически связывающихся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей и протективной активностью в отношении различных штаммов вируса SARS-CoV-2, имеющее аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:1 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO:2. Гуманизированное моноклональное антитело может применятся для терапии и экстренной профилактики заболевания COVID 19.

Для получения гуманизированного моноклонального антитела XRH19 осуществляли иммунизацию мышей линии Balb/c рекомбинантным RBD вируса SARS-CoV-2, полученным в клеточной линии СНО и очищенным металл-аффинной и эксклюзионной хроматографией. Эффективность иммунизации подтверждали оценкой титра специфических к RBD антител в сыворотке крови мышей. Далее у мышей выделяли спленоциты, которые затем сливали с линией мышиной миеломы Sp2/0-Ag-14, получая таким образом, гибридомы. Селекцию гибридом проводили на питательной среде RPMI-1640 («Sigma», США) с добавлением HAT Media Supplement (Hybri-Max®, «Sigma», США). Отбор клонов, продуцирующих антитела специфичные к RBD, осуществляли методом твердофазного ИФА.

Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, возможно использование не только спленоцитов, а также цельной крови, лимфатических узлов клеток и органов иммунизированного животного, экспрессирующих моноклональные антитела. Также специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения возможно использование синтетических библиотек последовательностей моноклональных антител.

В результате селекции и отбора клонов, был отобран клон гибридомы, продуцирующий мышиное моноклональное антитело XR19, специфичное к RBD и обладающее выраженной вирус-нейтрализующей и протективной активностью в отношении вируса SARS-CoV-2, в том числе варианта Delta. Далее участки генома отобранного клона гибридомы, кодирующие антиген-связывающие участки (CDR домены) антитела XR19 были сиквенированы и использованы для создания гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19. Таким образом, были получены нуклеотидные последовательности кодирующие гуманизированное моноклональное антитело GamXRH19 (SEQ ID NO: 1 тяжелая цепь и SEQ ID NO: 2 легкая цепь).

Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения последовательности моноклональных антител, специфических к RBD вируса SARS-CoV-2, могут содержать в себе аминокислотные замены, которые не сказываются на вторичной и третичной структуре моноклональных антител и не влияют на их способность связывать и нейтрализовать RBD вируса SARS-CoV-2. Более того, поскольку в связывании с антигеном участвуют только антигенсвязывающие участки (CDR домены) то, как известно специалистам в данной области, любой иммуноглобулин или его аналог, содержащий такие же аминокислотные последовательности CDR доменов могут быть использованы в целях осуществления данного изобретения. Более того, последовательности CDR доменов могут содержать замены/делеции/вставки аминокислот, которые при парном выравнивании аминокислотных последовательностей обеспечивают гомологичность не менее 70% и не оказывают качественного влияния на способность связываться с антигеном. Таким образом, все иммуноглобулины или их аналоги, содержащие последовательности CDR доменов, гомология которых составляет не менее 70% с предлагаемыми последовательностями могут быть использованы в целях осуществления данного изобретения.

Гуманизированное моноклональное антитело XRH19 (изотип IgG1 человека), специфически связывающееся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей и протективной активностью, было получено путем экспрессии нуклеотидной последовательности тяжелой и легкой цепи в клетках-продуцентах СНО.

Нуклеотидные последовательности тяжелой и легкой цепи гуманизированного моноклонального антитела XRH19 были созданы генно-инженерным путем на основе нуклеотидной последовательности иммуноглобулина G1 человека и нуклеотидных последовательностей антиген-связывающих участков антитела XR19. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая гуманизированное моноклональное антитело, может отличаться, основываясь на принципе вырожденности генетического кода. Таким образом, все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотную последовательность гуманизированного моноклонального антитела XRH19 (SEQ ID NO:1 тяжелая цепь и SEQ ID NO:2 легкая цепь), могут быть использованы в целях осуществления настоящего изобретения.

С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, содержащая нуклеиновые кислоты, с нуклеотидными последовательностями гуманизированного моноклонального антитела XRH19 (SEQ ID NO:3 тяжелая цепь и SEQ ID NO:4 легкая цепь) и экспрессирующая гуманизированное моноклональное антитело XRH19 (SEQ ID NO: 1 тяжелая цепь и SEQ ID NO: 2 легкая цепь). Таким образом, была получена: клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая гуманизированное моноклональное антитело XRH19. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие эукариотические системы экспрессии.

Кроме того, авторами патента разработан способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 (в том числе варианта Delta), заключающийся в системном введении в организм млекопитающих в эффективном количестве гуманизированного моноклонального антитела XRH19.

Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Получение иммуногена - рецептор-связывающего домена (RBD) S белка вируса SARS-CoV-2.

На первом этапе работы был получен иммуноген - рецептор-связывающий домен (RBD) S белка вируса SARS-CoV-2. Для этого аминокислотную последовательность рецептор-связывающего домена (RBD) поверхностного Spike-белка вируса SARS-CoV-2 (а.о. 319 - 541, UniProtKB: locus SPIKE_SARS2, accession P0DTC2) модифицировали c N-конца сигнальным пептидом щелочной фосфатазы SEAP (MLLLLLLLGLRLQLSLGI) и с С-конца последовательностью глицин-серинового линкера и гистидиновой метки (GSHHHHHHHHH). На основе аминокислотной последовательности получили нуклеотидную последовательность, которая была синтезирована ЗАО «Евроген». После этого нуклеотидную последовательность полученного полипептида клонировали в плазмиду для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих. Далее, культуру клеток CHO тарифицировали полученной плазмидой с помощью набора CHO Gro (Mirus Bio, США) в соответствии с протоколом производителя. Затем клетки культивировали в колбах Эрленмейера в течение 10 дней. По истечении этого срока культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000g. Рецептор-связывающий домен (RBD) очищали металл-аффинной хроматографией на системе AKTA start («GE Healthcare Life Sciences», США), используя колонки HisTrap FF 5 мл («GE Healthcare Life Sciences», США) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера на 20 мМ фосфат натрия, 500 мМ натрия хлорид (рН=7,2) проводили на колонке ХК 26/100 («GE Healthcare Life Sciences», США), упакованной сорбентом Superdex 200 pg («GE Healthcare Life Sciences», США). Таким образом, в результате проведенной работы был получен очищенный рекомбинантный RBD S белка вируса SARS-CoV-2.

Пример 2. Получение моноклонального антитела XR19.

Мышей линии BALB/c (10 самок 5-6-недельного возраста массой 15-20 г) иммунизировали препаратом рекомбинантного RBD вируса SARS-CoV-2, полученного в примере 1. Схема иммунизации включала 4 подкожные инъекции антигена с интервалом введения 21 день. Доза препарата составила 50 мкг на инъекцию. Через 18 дней после последней инъекции осуществляли взятие крови из параорбитального синуса и определяли титр специфических антител с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Для этого планшеты сенсибилизировали антигеном, в 50 мМ карбонат-бикарбонатном буфере с pH 9,6. Образцы крови мышей разбавляли 10-кратным титрованием в буфере для ИФА (0.1М фосфатно-солевой буфер с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (Serva, Германия) и 0,1% Твин 20 (Serva, Германия) и инкубировали в лунках планшет в течение 30 минут при 37°С. Лунки отмывали трехкратным внесением 0,9% натрия хлорида с добавлением 0,1% Твин 20 (отмывочного буфера) и добавляли антитела против иммуноглобулинов мыши, меченые пероксидазой хрена (кат. № AS302-HRP, Хема, Россия) в рабочем разведении на 30 минут при 37°С. После 5-кратной отмывки отмывочным буфером в лунки добавляли хромоген-субстратную смесь (кат. № R055, Хема, Россия) на 15 минут, останавливали реакцию 5% раствором серной кислоты и считывали оптическую плотность при 450 нм на планшетном ридере HyPo (Biosan, Латвия). Удовлетворительным считали титр антител не менее 1:100 000.

Далее животным с наибольшим уровнем продукции антител через 20 дней после иммунизации делали внутрибрюшную инъекцию (бустер-доза) антигена в количестве 50 мкг. На четвертые сутки с момента бустерной инъекции селезенку асептически извлекали, спленоциты получали путем перфузии средой RPMI1640 (Sigma-Aldrich, США).

Процедуру слияния иммунных спленоцитов и клеток миеломы SP2/0-Ag14 проводили по методике, предложенной G.Kohler и C.Milstein в модификации De St.Fazekas, S.Groth и D.Scheidegger. В качестве индуктора слияния клеток использовали 50% раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1450 (Sigma-Aldrich, США). Гибридные клетки культивировали in vitro в СО2-инкубаторе при температуре 37°C и содержании диоксида углерода равном 5%. Для культивирования использовали ростовую среду RPMI-1640, содержащую 2 мМ L-глютамина, с добавлением 20% фетальной телячьей сыворотки (Thermo Scientific, США) и 80 мг/л гентамицина (Россия). С целью проведения селекции гибридных клеток в ростовую среду добавляли HAT (Sigma-Aldrich, США), содержащий гипоксантин (Н), аминоптерин (А) и тимидин (т) в рабочем разведении.

Первичный скрининг гибридных культур проводили, начиная с 10-х суток после гибридизации. Специфическую активность антителопродукции гибридных культур определяли в культуральной жидкости без разведения методом ИФА аналогично описанному в разделе «Контроль иммунного ответа» трижды с интервалом 2-3 дня по мере интенсивности роста клеток. Пробы считали положительными, если оптическая плотность в лунках с исследуемыми образцами превышала на 0,5 значение оптической плотности в контрольных лунках со средой культивирования.

Клонирование культур гибридных клеток проводили методом лимитирующих разведений при расчетной посевной концентрации одна клетка на лунку. Продуцирующую активность отдельных клонов определяли, начиная с 10-х суток, дважды с интервалом три дня методом иммуноферментного анализа по схеме, описанной выше. После выделения положительных клонов их клетки размножали в достаточном количестве, образцы замораживали в ростовой среде RPMI, содержащей 20% фетальной телячьей сыворотки и 8% диметилсульфоксида (Serva, Германия), и помещали на хранение в контейнер с жидким азотом.

Культуральные и секреторные свойства полученных клонов изучали в процессе культивирования in vitro в 24-луночных планшетах (Flow Laboratories, Великобритания) в течение десяти пассажей.

После клонирования образцы культуральной жидкости от моноклональных культур изучали методом конкурентного ИФА. Рекомбинантный белок - рецептор ACE2 (Vaxine, Австралия) сорбировали в лунках планшет в концентрации 0,5 мкг/мл в 0,1М фосфатном буфере, pH 7,2 в течение 12-16 часов при температуре +4 С. После однократной отмывки отмывочным буфером (см Контроль иммунного ответа) планшет в лунки вносили 50 мкл образцов культуральной жидкости и 50 мкл разведения белка RBD, меченого пероксидазой хрена (Faizyme, ЮАР) и инкубировали 30 минут при 37 С. После 5х кратной отмывки отмывочным буфером реакцию проявляли с помощью хромоген-субстратной смеси и фотометрии при 450 нм. В контрольной лунке вместо образца культуральной жидкости помещали среду культивирования. Отбирали культуры, которые давали максимальное ингибирование взаимодействия ACE2 и RBD-пероксидаза (не менее 90%). Методику вторичного скрининга повторяли у выбранных клонов на всех этапах получения моноклональных антител с целью получения антител, в итоге выбрали моноклональное антитело XR19, дающее максимальную удельную активность ингибиции.

Далее, проводили сиквенирование отобранного клона гибридомы, для определения нуклеотидных последовательностей кодирующих. Для этого, клетки гибридомы линии XR19 лизировали с помощью 1 мл TRIzol reagent (Thermofisher scientific) c последующим выделением тотальной РНК. 5 мкг тотальной РНК использовали для синтеза кДНК с помощью набора SuperScript IV TM first-strand synthesis system (Invitrogen). Последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи амплифицировали методом ПЦР с использованием панели праймеров, специфично отжигающихся в начале и конце последовательностей вариабельных доменов мыши. Полученные ПЦР-продукты секвенировали по Сэнгеру на приборе Genetic Analyzer 3500 Applied Biosystems.

Таким образом, были получены последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела XR19, представленные в таблице 1.

Таблица. 1. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи антитела XR19.

Нуклеотидная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи	CAGGTGCAACTGCAACAGAGTGGAGCTGAACTTGTCAGACCTGGCACCTCTGTGAAGGTGAGCTGCAAAGCATCAGGCTATGCCTTCACCAACTACCTGATCGAGTGGGTGAAGCAGAGACCAGGACAAGGTCTCGAGTGGATTGGGATGATCAATCCTGGCAGTGGAGTGACCAACTACGATGAGAAGTTCAAAGGGAAAGCCACACTGACTGCCGACAAGAGCTCTAGCACAGTCTACATGCAGTTGAGCAGTCTGACCTCTGATGACTCAGCAGTGTACTTCTGTGCCACCTACTACAGGTATGACGATGCCTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACAGTGAGCGCT
Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи	QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGMINPGSGVTNYDEKFKGKATLTADKSSSTVYMQLSSLTSDDSAVYFCATYYRYDDAYWGQGTLVTVSA
Нуклеотидная последовательность вариабельного домена легкой цепи	GACATTCAGATGACACAGTCTCCTGCCAGTCTGTCAGCCAGCGTTGGAGAGACTGTGACCATCACCTGTGGTGCAAGCGAGAACATCTATGGCGTTCTGAACTGGTACCAGAGGAAGCAAGGCAAGTCTCCACAGTTGCTGATCTATGGAGCTACCAACCTTGCTGATGGCATGAGTAGCAGGTTCTCAGGCAGTGGCTCAGGCAGACAGTACAGTCTGAAGATCAGCTCACTTCATCCTGACGATGTTGCCACCTACTACTGTCAGAACGTGCTCTCCAGT
Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи	DIQMTQSPASLSASVGETVTITCGASENIYGVLNWYQRKQGKSPQLLIYGATNLADGMSS

Таким образом в данном примере было получено мышиное моноклональное антитело XR19, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2.

Пример 3. Гуманизация мышиного моноклонального антитела XR19.

Далее аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела XR19 были гуманизированы при помощи биоинформатического ресурса Abisys database (http://www.abysis.org/abysis/). Полученные аминокислотные последовательности гуманизированного моноклонального антитела XR19 (GamXRH19), представлены в таблице 2.

Таблица 2. Гуманизированные нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи антитела GamXRH19.

Гуманизированная аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи	QVQLQQSGAELVKPGASVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQAPGQGLEWIGMINPGSGVTNYDEKFKGRVTLTADKSTSTVYMQLSSLTSDDTAVYFCATYYRYDDAYWGQGTLVTVSA
Гуманизированная аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGVLNWYQRKPGKSPKLLIYGATNLADGMSSRFSGSGSGRQYTLTISSLQPEDFVATYYCQNVLS

Таким образом, в данном примере была проведена гуманизация мышиного моноклонального антитела и были получены аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи гуманизированного моноклонального антитела XRH19.

Пример 4. Получение, нуклеиновых кислот, клетки-продуцента и гуманизированного моноклонального антитела XRH19.

Далее, был разработан дизайн аминокислотной последовательности полноразмерных тяжелых и легких цепей гуманизированного антитела XRH19. Аминокислотная последовательность гуманизированной тяжелой представлена SEQ ID NO: 1 и аминокислотная последовательность гуманизированной легкой представлена SEQ ID NO: 2.

На основе аминокислотных последовательностей были получены нуклеотидные последовательности антитела XRH19, которые были синтезированы в компании ЗАО «Евроген». Полученные нуклеотидные последовательности клонировали в вектор для экспрессии в эукариотических клетках. Далее проводили трансфекцию клеток линии СНО полученными экспрессионными векторами с использованием системы CHO Gro (Mirus Bio, США) в соответствии с протоколом производителя. Клетки культивировали в колбах Эрленмейера в течение 10 дней. После чего культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000g. Антитело очищали аффинной хроматографией на системе AKTA start (Cytiva, Швеция), используя колонки MAbSelect SuRe 1 мл (Cytiva, Швеция) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера проводили на колонке ХК 26/100 (Cytiva, Швеция), упакованной сорбентом Superdex 200 pg (Cytiva, Швеция). Чистоту полученного препарата гуманизированного моноклонального антитела XRH19, определяли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях и денатурирующих условиях (фиг. 1). Схематичное изображение гуманизированного моноклонального антитела XRH19 представлено на фиг. 2.

Таким образом, в результате проведенной работы были получены нуклеиновые кислоты, имеющие нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую и легкую цепи гуманизированного моноклонального антитела XRH19 (SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4), клетка продуцент гуманизированного моноклонального антитела XRH19 и гуманизированное моноклональное антитело XRH19, имеющее конечную аминокислотную последовательность тяжелых и легких цепей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.

Пример 5. Изучение специфической активности гуманизированного моноклонального антитела XRH19 в непрямом ИФА.

Для определения специфической активности антитела XRH19 метод непрямого ИФА. Для этого рекомбинантный RBD S белка вируса SARS-CoV-2 иммобилизовали в лунке иммунологического планшета в 50,0 мМ карбонатно-бикарбонатном буфере в течение ночи. Не связавшийся белок удаляли, а лунку блокировали 5% раствором сухого молока в фосфатном буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем лунки промывали 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере и добавляли раствор 5% раствором сухого молока в фосфатном буфере, содержащим различные разведения гуманизированного моноклонального антитела XRH19. Каждое разведение вносили в 3-х повторах, инкубировали 1 час при 37°С при слабом перемешивании. Затем проводили 3-кратную отмывку 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере. После отмывки вносили раствор конъюгата, меченного перексидазой и инкубировали 1 час при 37°С при слабом перемешивании. Далее проводили 5-х кратную отмывку 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере. Далее вносили раствор субстрата ТМБ и инкубировали 10 мин при комнатной температуре без перемешивания, после чего реакцию останавливали добавлением раствора серной кислоты и проводили измерение на спектрофотометре. Результаты исследования представлены на фиг. 3. Было продемонстрировано, что антитело XRH19 обладает специфической активность в концентрации как минимум 3,3 нг/мл.

Таким образом, в данном примере была изучена специфическая активность антитела XRH19 в непрямом ИФА и определена его минимальная рабочая концентрация.

Пример 6. Определение константы аффинности гуманизированного моноклонального антитела XRH19.

Константы взаимодействия (KD) гуманизированного моноклонального антитела XRH19 определяли путем детекции изменения показателей поверхностного плазмонного резонанса на приборе Biacore3000 (General Electric, Швеция). Для этого рекомбинантный RBD S-белка вирусма SARS-CoV-2 ковалентно иммобилизировали на поверхности декстранового матрикса чипа СМ5 (General Electric, Швеция), а затем пропускали над поверхностью чипа различные концентрации полученного антитела XRH19. Обработку данных и вычисление констант проводили в автоматическом режиме при помощи программы Bioevaluation (General Electric, Швеция). В результате константа равновесной диссоциации XRH19 составила 4*10^-9М, что демонстрирует высокую аффинность антитела к рекомбинантному RBD.

Таким образом, в данном примере была продемонстрирована высокая аффинность антитела XRH19 к рекомбинантный RBD S-белка вируса SARS-CoV-2.

Пример 7. Определение вируснейтрализующей активности гуманизированного моноклонального антитела XRH19, в отношении различных штаммов вируса SARS-CoV-2.

Целью данного эксперимента являлась оценка способности разработанного гуманизированного моноклонального антитела XRH19 нейтрализовать вирус SARS-CoV-2 различных штаммов. На первом этапе работы подготовили образцы антитела XRH19 в культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой. Затем полученные образцы антител смешивали со 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2 различных штаммов, инкубировали 1 час при 37°С и добавляли к клеткам Vero E6. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За вируснейтрализующий титр антитела принимали высшее их разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х. В результате были определены следующие рабочие вируснейтрализующие концентрации, представленные в таблице 3.

Таблица. 3. Вирус-нейтрализующие титры гуманизированного моноклонального антитела RH19 в отношении вируса SARS-CoV-2 различных штаммов.

Штамм вируса SARS-CoV-2	Минимальная вирус-нейтрализующая концентрация
SARS-CoV-2 strains B.1.1.1 (PMVL-1, S: D614G; hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020)	80 нг/мл
B.1.617.2 (T19R G142D E156G F157del R158del L452R T478K D614G P681R D950N) Delta	20 нг/мл

Таким образом, в данном примере продемонстрирована выраженная вирус-нейтрализующая активность гуманизированного моноклонального антитела XRH19 в отношении вируса SARS-CoV-2, в том числе варианта Delta.

Пример 8. Получение средства, содержащего гуманизированное моноклональное антитело XRH19.

Средство для терапии и экстренной профилактики заболевания COVID-19 на основе гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 получали путем подбора формулирующего буфера. Для сравнения использовали различные физиологические буферные системы, представленные в таблице 4.

Таблица 4. Состав буферных систем для разработки средства.

Название	Состав
Буфер №1	Трис 20мМ, Хлорид натрия 150 мМ, полисорбат 80 0,05%, рН 7,5
Буфер №2	Фосфат натрия 20мМ, Хлорид натрия 150 мМ, полисорбат 80 0,05%, рН 7,2
Буфер №3	Трис 20мМ, цитрат натрия 150 мМ, полисорбат 80 0,05%, рН 7,2
Буфер №4	Трис 20мМ, глицин 200 мМ, полисорбат 80 0,05%, рН 7,0

Гуманизированное моноклональное антитело GamXRH19 переводили в каждую буферную систему при помощи эксклюзионной хроматографии на сорбенте Superdex 200 pg и ужимали до концентрации 20 мг/мл. Далее образцы инкубировали при 37°С в течение недели и далее анализировали их стабильность и чистоту при помощи ВЭЖХ. Результаты анализа представлены в таблице 5. Примеры хроматограмм ВЭЖХ анализа представлены на фиг. 4.

Таблица. 5. Процентное содержание целевых и примесных пиков гуманизированного моноклонального антитела XRH19 в различных буферных растворах.

Название	Буфер №1	Буфер №2	Буфер №3	Буфер №4
Процентное содержание целевого пика XRH19	88,8 %	95,95%	88,55 %	82,61 %
Процентное содержание суммы примесных пиков XRH19	11,2 %	4,05 %	11,45 %	17,39 %

В результате было продемонстрировано что наибольшая стабильность антитела XRH19 наблюдается в буфере №2: Фосфат натрия 20мМ, Хлорид натрия 150 мМ, полисорбат 80 0,05%, рН 7,2.

Таким образом, в данном примере было получено средство на основе гуманизированного моноклонального антитела XRH19 и подобран оптимальный буферный.

Пример 9. Способ терапии и экстренной профилактики заболевания COVID-19 при помощи гуманизированного моноклонального антитела XR19.

Терапевтическую эффективность и эффективность при экстренной профилактике, гуманизированного моноклонального антитела XRH19 оценивали на модели инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, у АСЕ2-трансгенных мышей. Данные животные были выбраны, так как они высоко чувствительны к инфекции SARS-CoV-2. Летальность животных после заражения вирусом SARS-CoV-2 составляет 100%.

В работе использовали вирус SARS-CoV-2 штамма hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020, изолированный в 2020 году в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России, хранящийся в Государственной коллекции вирусов. Инфекционный титр вируса 10⁷ TCID50/мл и 3,5х10⁷ БОЕ/мл. Животных заражали вирусом SARS-CoV-2 интраназально в дозе 10⁵ TCID50 на животное, далее вводили средство, содержащее гуманизированное моноклональное антитело XRH19 или плацебо, согласно таблице 6.

Таблица 6. Дизайн экспериментального изучения эффективности гуманизированного моноклонального антитела XRH19.

Препарат	Доза препарата	Путь введения	Время введения	Инфицирование интраназально в дозе TCID50	Оценка эффективности
XRH19	10 мг/кг	в/б	Через 1 час после заражения	105	5 шт.	Анализ выживаемости
XRH19	20 мг/кг	в/б	Через 1 час после заражения	105	5 шт.
Плацебо	-	в/б	Через 1 час после заражения	105	5 шт.

В течение 30 суток после заражения оценивали выживаемость животных.

На фиг. 5 представлены данные выживаемости животных после заражения вирусом SARS-CoV-2 штамма hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020. В результате исследования было показано, что однократное системное введение на основе гуманизированного моноклонального антитела XRH19 в дозе 10 и 20 мг/кг животным через час после заражения позволяет защитить животных от инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2 штамма hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020.

Таким образом, можно сделать вывод, что гуманизированное моноклональное антитело XRH19 может быть использовано для терапии и экстренной профилактики заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2.

Пример 10. Способ терапии и экстренной профилактики заболевания COVID-19, вызванного вирусом SARS-CoV-2 варианта Delta при помощи гуманизированного моноклонального антитела XR19.

В работе использовали вирус SARS-CoV-2 варианта Delta B.1.617.2 (T19R G142D E156G F157del R158del L452R T478K D614G P681R D950N), изолированный в 2021 году в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России, хранящийся в Государственной коллекции вирусов. Инфекционный титр вируса 10⁷ TCID50/мл и 3,5х10⁷ БОЕ/мл. Животных заражали вирусом SARS-CoV-2 интраназально в дозе 10⁵ TCID50 на животное, далее вводили препарат моноклональных антител или плацебо, согласно таблице 7.

Таблица 7. Дизайн экспериментального изучения эффективности гуманизированного моноклонального антитела XRH19 против вируса SARS-CoV-2 варианта Delta.

Препарат	Доза препарата	Путь введения	Время введения	Инфицирование интраназально в дозе TCID50	Оценка эффективности
XRH19	10 мг/кг	в/б	Через 1 час после заражения	105	5 шт.	Анализ динамики веса. Анализ выживаемости
XRH19	20 мг/кг	в/б	Через 1 час после заражения	105	5 шт.
XRH19	10 мг/кг	в/б	Через 6 часов после заражения	105	5 шт.
XRH19	20 мг/кг	в/б	Через 6 часов после заражения	105	5 шт.
Плацебо	-	в/б	Через 1 час после заражения	105	5 шт.
Плацебо	-	в/б	Через 6 час после заражения	105	5 шт.

В течение 30 суток после заражения оценивали вес и выживаемость животных.

На фиг. 6 представлены данные динамики веса животных после заражения вирусом SARS-CoV-2 варианта Delta. На фиг. 7 представлены данные выживаемости животных после заражения вирусом SARS-CoV-2 варианта Delta. В результате исследования было показано, что однократное системное введение средства на основе гуманизированного моноклонального антитела XRH19 в дозе 10 и 20 мг/кг животным через час и через 6 часов после заражения позволяет защитить животных от инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2 варианта Delta, при этом, падения веса животных более чем на 10% не наблюдалось. В контрольной группе животных после заражения получивших плацебо наблюдалось снижение массы тела. К 10 суткам все животные из группы контроля погибли.

Таким образом, можно сделать вывод, что полученное гуманизированное моноклональное антитело XRH19 может быть использовано для терапии и экстренной профилактики заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2 в том числе варианта Delta.

Специалисту очевидно, что данное антитело может быть использовано для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, различных вариантов. При этом антитело может вводиться подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутрибрюшинно и интраназально.

Экспериментальные данные показывают, антитела могут вводиться человеку в концентрации от 1 до 100 мг/мл.

Промышленная применимость

Все приведенные примеры подтверждают эффективность созданного гуманизированного моноклонального антитела, обладающего вируснейтрализующей активностью, и обладающего терапевтическими и протективными свойствами против вируса SARS-CoV-2 различных вариантов и их промышленную применимость.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России

<120> Гуманизированное моноклональное антитело, специфически связывающиеся

с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, средство и способ для терапии и

экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2.

<160> 4

<170> BISSAP1.3.6

<210> 1

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> аминокислотная последовательность тяжелой цепи

гуманизированного моноклонального антитела XRH19

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Asn Pro Gly Ser Gly Val Thr Asn Tyr Asp Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 2

<211> 215

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> аминокислотная последовательность легкой цепи

гуманизированного моноклонального антитела XRH19

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Val

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 3

<211> 1341

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> нуклеотидная аминокислотная последовательность тяжелой цепи

гуманизированного моноклонального антитела XRH19

<400> 3

CAGGTGCAAC TGCAACAGAG TGGAGCTGAA CTTGTCAAGC CAGGAGCCAG TGTGAAGGTC 60

AGCTGCAAAG CCTCTGGCTA TGCCTTCACC AACTACCTGA TCGAGTGGGT GAAGCAAGCT 120

CCCGGACAAG GCTTAGAGTG GATTGGCATG ATCAATCCAG GCAGTGGAGT CACCAACTAT 180

GATGAGAAGT TCAAAGGCAG AGTGACCCTG ACAGCTGACA AGAGCACCTC CACAGTGTAC 240

ATGCAGCTGA GTAGCCTCAC CTCAGATGAC ACAGCAGTGT ACTTCTGTGC CACCTACTAC 300

AGGTATGACG ATGCCTACTG GGGACAGGGC ACCCTGGTCA CAGTGAGCGC TGCCAGCACC 360

AAGGGTCCCT CCGTGTTTCC ACTTGCTCCC AGCTCTAAGT CCACCTCTGG AGGCACAGCA 420

GCACTTGGCT GTCTGGTGAA GGACTACTTT CCTGAACCAG TGACTGTCTC CTGGAACAGT 480

GGAGCCTTGA CCAGCGGAGT CCACACCTTC CCTGCTGTCC TGCAGAGCTC TGGACTGTAC 540

AGTCTCTCTA GTGTCGTGAC AGTCCCCAGC TCCAGCCTTG GCACACAGAC CTACATCTGC 600

AACGTCAATC ACAAACCCAG CAACACCAAA GTGGACAAGA GAGTGGAACC TAAGTCCTGT 660

GACAAGACCC ACACCTGTCC ACCTTGTCCT GCTCCAGAGC TGCTTGGAGG TCCAAGCGTG 720

TTCCTGTTTC CTCCCAAACC TAAGGACACC CTGATGATCT CCAGGACACC AGAAGTGACC 780

TGTGTCGTTG TGGACGTCTC TCACGAGGAT CCTGAGGTGA AGTTCAACTG GTATGTGGAT 840

GGTGTGGAGG TCCACAATGC CAAGACCAAA CCCAGAGAGG AACAGTACAA CAGCACCTAC 900

AGAGTCGTGA GTGTGTTGAC CGTGCTGCAT CAAGACTGGC TGAATGGCAA GGAATATAAG 960

TGCAAAGTGA GCAACAAAGC ACTTCCTGCT CCCATCGAGA AGACCATCTC CAAAGCCAAA 1020

GGACAACCTA GAGAACCTCA AGTCTACACC CTGCCACCCT CCAGAGAAGA GATGACCAAA 1080

AACCAAGTGT CTCTGACCTG TCTTGTCAAA GGCTTCTATC CCTCTGACAT TGCTGTGGAG 1140

TGGGAGAGCA ATGGACAACC TGAGAACAAC TATAAGACCA CACCACCTGT CCTGGACAGT 1200

GATGGCTCCT TCTTTCTGTA TAGTAAGCTG ACAGTGGACA AGAGCAGGTG GCAGCAAGGC 1260

AATGTCTTCT CCTGCAGTGT GATGCATGAA GCCTTGCACA ACCACTACAC CCAGAAGAGC 1320

CTGTCTTTGT CTCCTGGCAA G 1341

<210> 4

<211> 645

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> нуклеотидная аминокислотная последовательность легкой цепи

Гуманизированного моноклонального антитела XRH19

<400> 4

GACATTCAGA TGACACAGTC TCCTTCCAGT CTGTCAGCCA GCGTTGGAGA CAGAGTGACC 60

ATCACCTGTG GTGCAAGCGA GAACATCTAT GGCGTTCTGA ACTGGTACCA GAGGAAGCCA 120

GGCAAGTCTC CAAAGTTGCT GATCTATGGA GCTACCAACC TTGCTGATGG CATGAGTAGC 180

AGGTTCTCAG GCAGTGGCTC AGGCAGACAG TACACTCTGA CCATCAGCTC ACTTCAACCT 240

GAAGATTTCG TTGCCACCTA CTACTGTCAG AACGTGCTCT CCAGTCCCAG GACCTTTGGA 300

GGTGGCACCA AGCTCGAGAT CAAGAGGACA GTTGCAGCTC CCAGCGTGTT CATCTTTCCA 360

CCCTCTGATG AACAGCTCAA ATCTGGCACA GCCAGTGTGG TGTGCTTGCT GAATAATTTC 420

TATCCGAGAG AAGCCAAGGT CCAGTGGAAG GTGGACAACG CTCTCCAGAG CGGCAATTCT 480

CAAGAGAGCG TGACTGAGCA AGACTCCAAG GACAGCACCT ACTCTCTGAG CTCCACACTG 540

ACCCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAGCAC AAGGTGTATG CCTGTGAGGT CACCCATCAG 600

GGCTTGAGCT CTCCTGTGAC CAAGTCCTTC AATAGAGGAG AGTGC 645

<---

1. Гуманизированное моноклональное антитело, специфически связывающееся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей и протективной активностью в отношении вируса SARS-CoV-2, имеющее аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 1 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 2.

2. Средство для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, содержащее гуманизированное моноклональное антитело по п.1 в эффективном количестве, а также фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.

3. Способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся в системном введении эффективного количества средства по п.2.