Способ постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, а именно к лабораторным методам исследований, и касается способа постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Способ включает: нанесение 50 мкл положительной сыворотки на фиксированный мазок взвеси лимфоцитов, выделенных центрифугированием на градиенте плотности урографина; инкубацию во влажной камере в термостате при 37-38°С 30 минут; трехкратное промывание дистиллированной водой; подсушивание и нанесение в красящем титре люминесцирующей сыворотки против глобулинов быка. Далее повторное помещение мазка во влажную камеру в термостат на 15-20 минут; трехкратное промывание дистиллированной водой; просушивание и просмотр в люминесцентном микроскопе с использованием четырехкрестовой системы для оценки интенсивности свечения; контроль реакции осуществляют с отрицательной сывороткой и физиологическим раствором. Предлагаемый способ способствует сокращению времени проведения исследования и уменьшению трудозатрат работы специалиста, позволяет выявить вирус ВЛКРС на ранних стадиях развития заболевания. Может быть использован как альтернативный метод ПНР диагностики. 2 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, а именно к лабораторным методам исследований, и может быть использовано для выявления инфицированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) путем исследования клеточной взвеси лимфоцитов с помощью реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ).

В настоящее время в государственных программах по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота основу диагностики составляют серологические методы исследования - реакция иммунодиффузии (РИД) и иммуноферментный анализ (ИФА); гематологические, клинические и патоморфологические методы служат для уточнения диагноза.

Ни РИД, ни более чувствительный ИФА метод диагностики в ряде случаев не дают адекватного ответа о зараженности. Так, при развитии заболевания у одного и того же животного может волнообразно подниматься и снижаться уровень антител, а в некоторых случаях протекать без их образования, что не позволяет полностью выявить всех животных-вирусоносителей [Крикун В.А. Лейкоз крупного рогатого скота и иммунологическая толерантность // Ветеринария. - 2002. - № 6. - С. 7-9.]. Помимо этого, эти методы не позволяют отличать колостральные антитела от активных антител, продуцирующихся при вирусной инфекции.

Методом, обладающим максимальной чувствительностью и высокой специфичностью, позволяющим более эффективно выявлять инфицированных ВЛКРС животных, а также отличать инфицированных телят от телят с колостральными антителами является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако широкое применение этого метода в диагностике лейкоза сдерживается, прежде всего, высокой стоимостью оборудования и реактивов для ПЦР.

Известен способ выделения лимфоцитов из крови крупного рогатого скота с помощью центрифугирования в градиенте плотности урографина [B.C. Власенко, М.А. Бажин и др. Оценка иммунного статуса у крупного рогатого скота при лейкозе: методические рекомендации. - Омск, 2010. - С. 9-10.]. Выделение лимфоцитов осуществляют следующим образом: из 76 или 60%-ного урографина с помощью дистиллированной воды получают 17%-ный раствор, доводя плотность до 1,092 г/см³. В пробирки Флоринского с помощью шприца с длинной иглой вносят по 1-2 мл 17%-ного раствора урографина, на который наслаивают по 1-2 мл смеси равных объемов крови и раствора Версена, а затем центрифугируют по 20-30 минут при 420 g, если кровь от взрослых животных, или при 600 g, если кровь от молодых животных. После центрифугирования лимфоциты концентрируются в виде матового диска на границе двух жидкостей, а гранулоциты и эритроциты оседают на дно пробирки. Образовавшийся слой лимфоцитов извлекают шприцем с длинной иглой. Способ позволяет осуществлять выделение лимфоидной популяции клеток из цельной крови, обеспечивая быстрый и прямой доступ к максимальному числу клеток при изучении их количественных и функциональных характеристик при различных состояниях организма.

Для идентификации ВЛКРС также используют прямой и непрямой варианты иммунофлюоресценции с помощью исследования мазков крови и измененных органов, краткосрочных и перевиваемых культур крови и тканей. Особенно можно отметить реакцию непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), ставшую наряду с ИФА и полимеразной цепной реакцией (ПЦР) неотъемлемой частью протокола исследований большинства заболеваний инфекционной природы. Помимо высокой чувствительности иммунофлюоресцентного метода, его специфичности, универсальности, экономичности, а также скорости постановки диагноза, важным его преимуществом является возможность прямой детекции патогена, в отличие от косвенной, при которой определяется уровень специфических антител.

Известен способ постановки РНИФ, включающий исследование краткосрочных и длительно живущих культур лейкоцитов, использование в качестве антител сыворотки больной коровы и меченой флюоресцеин-5-изотиоционатом (ФИТЦ) кроличьей сыворотки против глобулинов быка [Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.Ф., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 2001. - С. 398]. Однако при использовании культур лейкоцитов от лейкозных животных происходит дегенерация и отмирание части клеток, что значительно засоряет препарат продуктами распада клеток.

Наиболее близким техническим решением к заявленному является способ постановки реакции [Новикова Н.Н., Байсеитов С.Т., Власенко B.C., Красиков А.П. Применение реакции непрямой иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота: методические рекомендации. - Омск, 2020. - С. 8-9.], включающий нанесение 50 мкл положительной сыворотки на фиксированный мазок крови (испытуемая проба), инкубацию во влажной камере в термостате при 37-38°С в течение 30 минут для образования комплекса антиген-антитело. После этого мазок трижды промывают дистиллированной водой от не связавшихся антител, подсушивают и наносят в красящем титре люминесцирующую сыворотку против глобулинов быка. Затем снова помещают во влажную камеру в термостат при температуре 37-38°С на 15-20 минут. По истечении этого времени мазки трижды отмывают дистиллированной водой, просушивают и просматривают в люминесцентном микроскопе с обязательными контролями реакции (с отрицательной сывороткой и физиологическим раствором).

Индикация лейкозного антигена в мазках крови позволяет увидеть не только светящийся антиген-антительный комплекс внутри лимфоцитов, но и все форменные элементы, фиксированные на стекле. Сложность учета реакции состоит в том, что у зараженного животного, при отсутствии лимфоцитоза в поле зрения объектива микроскопа мы можем увидеть только эритроциты или наблюдать от одного до трех лейкоцитов, которые представлены как гранулоцитами, так и моноцитами без специфического люминесцирующего свечения. В рекомендациях по технике постановке реакции указано, что при отрицательной реакции следует просматривать мазок в 30 полях зрения микроскопа, что создает усиленную нагрузку для исследователя.

Техническим результатом изобретения является повышение точности и достоверности, а также сокращение времени анализа мазков.

Техническим решением способа постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота является: выделение лимфоцитов из крови крупного рогатого скота центрифугированием в градиенте плотности рентгеноконтрастного вещества (урографина). Из выделенной взвеси лимфоцитов делают мазок типа «высушенной капли», высушивают, фиксируют в этиловом спирте 20 минут, затем наносят 50 мкл положительной сыворотки, инкубируют во влажной камере в термостате при 37-38°С 30 минут, трижды промывают дистиллированной водой, подсушивают и наносят в красящем титре люминесцирующую сыворотку против глобулинов быка. Затем снова помещают во влажную камеру в термостат на 15-20 минут, трижды отмывают дистиллированной водой, просушивают и просматривают в люминесцентном микроскопе. Также осуществляют контроль реакции с отрицательной сывороткой и физиологическим раствором. Для оценки интенсивности свечения используют четырех крестовую систему:

(++++) - очень яркая люминесценция, четко контрастирующая на темном фоне;

(+++) - яркая люминесценция;

(++) или (+) - слабое свечение;

(-) - отсутствие люминесценции.

За положительный результат принимают специфическое свечение антигена с оценкой в четыре, три креста.

Отличительными признаками предложенного способа является то, что для приготовления мазков используется взвесь лимфоцитов, выделенная центрифугированием на градиенте плотности урографина. Предлагаемый способ позволит повысить точность и достоверность метода за счет освобождения от балластных элементов и использования в реакции высокой концентрации лимфоцитов, в которых локализуется вирус лейкоза крупного рогатого скота, а также значительно сократит затраты времени на микроскопию мазков.

Сущность изобретения поясняется на конкретных примерах выполнения способа.

Пример 1. Исследование молодняка крупного рогатого скота

В хозяйстве с широким распространением лейкоза (до 70% инфицированных коров) после предварительного исследования поголовья с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) отбирают кровь от 33 голов молодняка крупного рогатого скота, родившихся от матерей-вирусоносителей, разного возрастного периода: до 1,5 и 3-4 месяцев. Проводят исследование крови с помощью РНИФ путем ее постановки по общепринятой методике и по предлагаемому способу.

Результаты исследований представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, в 11 пробах телят в возрасте до 1,5 мес, в которых был выявлен ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота, в 100 % случаев была отмечена положительная реакция в РНИФ в мазках с клеточной взвесью, тогда как в мазках крови только у 8 из 11 голов.

У молодняка 3-4-месячного возраста установлено совпадение результатов ПЦР с РНИФ независимо от способа ее постановки.

С помощью модифицированного метода постановки РНИФ в 3-х из 10-и (в 30,0% случаев) ПЦР-отрицательных проб был выявлен ВЛКРС и только в 2-х общепризнанным способом. Сходная картина наблюдалась при исследовании проб крови молодняка 3-4-месячного возраста, в которых дополнительно установлено соответственно 20 и 10% носителей ВЛКРС.

Все это свидетельствовало о более высокой точности и достоверности предлагаемого нами метода.

Пример 2. Исследование коров

Отбирают кровь от 20 голов крупного рогатого скота в возрасте от 3 до 5 лет из хозяйства с широким распространением лейкозной инфекции. В качестве контроля используют 10 коров этого же возраста из благополучного по данному заболеванию хозяйства. Проводят диагностическое исследование крови всех животных с помощью реакции иммунной диффузии (РИД), а также РНИФ путем ее постановки по общепринятой методике и по предлагаемому способу.

Результаты исследований представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, в неблагополучном по лейкозу хозяйстве (А) с помощью РИД было идентифицировано 12 носителей ВЛКРС. Все РИД-позитивные животные также имели положительную РНИФ как при постановке реакции с цельной кровью, так и с клеточной взвесью.

С помощью РНИФ, проводимой по предлагаемому способу, дополнительно выявлено 4 (50%) вирусоносителя, тогда как при использовании мазков крови установлена только одна положительная проба.

Следует отметить, что при исследовании коров из благополучного хозяйства (Б) была отмечена отрицательная реакция с использованием как РИД, так и обоих вариантов РНИФ.

Таким образом, предложенный нами способ постановки РНИФ повышает точность и достоверность, при этом существенно облегчая процесс интерпретации результатов при микроскопии. Окрашивая лимфоциты без балластных элементов, мы концентрируем вирус лейкоза в них. Объектив микроскопа настраиваем только на мазок в одном поле зрения и сразу учитываем результат по наличию или отсутствию специфического люминесцирующего свечения.

Специалист, занимающийся микроскопией, затрачивает на визуализацию одного мазка крови 15-30 минут рабочего времени, т.е. в среднем минуту на просмотр одного поля зрения из рекомендуемых 30-и полей при отрицательном результате. При исследовании мазка крови без лимфоцитоза, даже при положительном результате на ВЛКРС, чтобы увидеть антиген в лимфоцитах приходится просматривать от 5 до 10 полей зрения в поисках специфического люминесцирующего свечения, что занимает 5-10 минут и более. Выделение лимфоцитов позволяет сконцентрировать антиген, который можно увидеть с помощью РНИФ в 1-2 полях зрения, что сокращает время проведения люминесцентной микроскопии максимум до 2-х минут (в 7,5-15 раз).

Следовательно, предлагаемый способ постановки РНИФ способствует сокращению времени проведения исследования и уменьшению трудозатрат работы специалиста, позволяет выявить вирус ВЛКРС на ранних стадиях развития заболевания. Может быть использован, как альтернативный метод ПЦР диагностики.

Способ постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, включающий нанесение 50 мкл положительной сыворотки на фиксированный мазок, инкубацию во влажной камере в термостате при 37-38°С 30 минут, трехкратное промывание дистиллированной водой, подсушивание и нанесение в красящем титре люминесцирующей сыворотки против глобулинов быка, повторное помещение мазка во влажную камеру в термостат на 15-20 минут, трехкратное промывание дистиллированной водой, просушивание и просмотр в люминесцентном микроскопе с использованием четырехкрестовой системы для оценки интенсивности свечения, контроль реакции осуществляют с отрицательной сывороткой и физиологическим раствором, для оценки интенсивности свечения используют четырехкрестовую систему, отличающийся тем, что для приготовления мазка используется взвесь лимфоцитов, выделенных из крови центрифугированием на градиенте плотности урографина.