Отбор пациентов с головной болью, восприимчивых к антителам, направленным против кальцитонин ген-родственного пептида

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины. Первый объект представляет собой применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента для производства лекарственного средства для снижения частоты приступов головной боли у пациента, страдающего хронической или эпизодической мигренью, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет путь с участием кальцитонин ген-родственного пептида (CGRP) и где перед введением антитела или его антигенсвязывающего фрагмента известно, что у пациента имеются аллодиния и/или гипералгезия во время острой фазы мигрени, но не во время фазы между приступами мигрени. Второй объект – способ снижения частоты приступов мигрени у вышеуказанного пациента, включающий введение вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Технический результат заключается в снижении частоты приступов головной боли у пациента при введении антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые блокируют, ингибируют, подавляют или ослабляют путь с участием CGRP, где перед введением было определено или известно, что у пациента имеются аллодиния и/или гипералгезия во время острой фазы мигрени, но не во время фазы между приступами мигрени. 2 н. и 43 з.п. ф-лы, 24 ил., 6 табл., 8 пр.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка заявляет приоритет по заявке США № 62/466158, поданной 2 марта 2017 г.; заявке США № 62/490953, поданной 27 апреля 2017 г.; заявке США № 62/514346, поданной 2 июня 2017 г.; и заявке США № 62/516406, поданной 7 июня 2017 г. Содержание каждой из упомянутых выше заявок включено в данный документ посредством ссылки в ее полном объеме.

Предпосылки

Было обнаружено, что гуманизированные моноклональные антитела против кальцитонин ген-родственного пептида (КГРП) являются эффективными в снижении частоты хронической мигрени (Dodick DW et al. (2014) Lancet Neurol. 13:1100-1107; Dodick DW et al. (2014) Lancet Neurol. 13:885-892; Bigal ME et al. (2015) Lancet Neurol. 14:1081-1090; Bigal ME et al. (2015) Lancet Neurol. 14:1091-1100; и Sun H et al. (2016) Lancet Neurol. 15:382-390). В то же время, несмотря на то, что было обнаружено, что анти-КГРП антитела, являются эффективными в лечении определенных видов головной боли, пациенты могут отвечать различным образом. Например, анти-КГРП антитело может быть полностью эффективным, частично эффективным или не эффективным вообще в лечении головной боли или предупреждении возникновения головной боли. Может быть полезным в лечении пациента, экономии времени врача и предупреждении неоправданного применения курса лечения, если до лечения анти-КГРП антителом можно определить будет ли являться применение этого антитела эффективным в лечении головной боли и/или предупреждении появления головной боли.

Таким образом, необходимы способы определения того, будет ли лечение, включающее анти-КГРП антитело, эффективным в лечение пациента, который имеет головную боль, или который имеет предрасположенность к головной боли.

Сущность изобретения

Данное изобретение относится к способам отбора пациента с головной болью, восприимчивого к лечению анти-КГРП антителом, и способам снижения частоты головной боли у отобранного пациента с помощью анти-КГРП антитела.

В одном аспекте в данном документе предложен способ снижения частоты головной боли у пациента, включающий: a) отбор пациента, головная боль которого опосредована активацией и сенсибилизацией высокопороговых (HT) нейронов; и b) введение пациенту моноклонального антитела, которое модулирует (например, блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет) путь с участием КГРП в количестве, достаточном для снижения частоты головной боли у пациента.

В другом аспекте в данном документе предложен способ снижения частоты головной боли у пациента, включающий: a) отбор пациента, у которого наблюдается гипералгезия, облегчаемая с помощью введения первого моноклонального антитела, которое модулирует (например, блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет) путь с участием КГРП; и b) введение пациенту второго моноклонального антитела, которое модулирует путь с участием КГРП в количестве, достаточном для снижения частоты головной боли у пациента.

В еще одном аспекте в данном документе предложен способ снижения частоты головной боли у пациента, включающий: a) отбор пациента, головные боли которого проявляются преимущественно в части головы (например, односторонние периорбитальные, односторонние височные или в области одного глаза); и b) введение пациенту моноклонального антитела, которое модулирует (например, блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет) путь с участием КГРП в количестве, достаточном для снижения частоты головной боли у пациента.

В другом аспекте в данном документе предложен способ снижения частоты головной боли у пациента, включающий: a) отбор пациента, который проявляет устранение гипералгезии и аллодинии в результате введения первого моноклонального антитела, которое блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет путь с участием КГРП; и b) введение пациенту второго моноклонального антитела, которое блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет путь с участием КГРП в количестве, достаточном для снижения частоты головной боли у пациента.

В одном варианте осуществления любого из способов, предложенных в данном документе, пациент представляет собой пациента с мигренью.

В дополнительном варианте осуществления любого из способов, предложенных в данном документе, пациент представляет собой пациента с хронической или эпизодической мигренью.

В одном варианте осуществления любого из способов, предложенных в данном документе, пациент имеет менингит, эпидуральное кровоизлияние, субдуральное кровоизлияние, субарахноидальное кровоизлияние или опухоль головного мозга.

В одном варианте осуществления любого из способов, предложенных в данном документе, головная боль имеет внутричерепное происхождение.

В одном варианте осуществления любого из способов, предложенных в данном документе, головная боль представляет собой мигрень. В другом варианте осуществления любого из способов, предложенных в данном документе, головная боль представляет собой мигрень с аурой.

В одном варианте осуществления любого из способов, предложенных в данном документе, пациент имеет головную боль, связанную с менингитом, эпидуральным кровоизлиянием, субдуральным кровоизлиянием, субарахноидальным кровоизлиянием или опухолью головного мозга.

В другом варианте осуществления любого из способов, предложенных в данном документе, моноклональное антитело вводят пациенту внутривенно или подкожно.

В другом варианте осуществления способы, предложенные в данном документе, дополнительно включают введение одного или нескольких дополнительных доз моноклонального антитела пациенту.

В другом варианте осуществления любого из способов, предложенных в данном документе, моноклональное антитело представляет собой анти-агонист КГРП антитело. В другом варианте осуществления любого из способов, предложенных в данном документе, моноклональное антитело представляет собой анти-рецептор КГРП антитело.

В одном варианте осуществления любого из способов, предложенных в данном документе, моноклональное антитело является человеческим или гуманизированным.

В одном варианте осуществления любого из способов, предложенных в данном документе, моноклональное антитело представляет собой антитело IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

В одном варианте осуществления любого из способов, предложенных в данном документе, пациент представляет собой человека.

В еще одном варианте осуществления моноклональное антитело вводят в то время, когда пациент не имеет мигрени. В другом варианте осуществления моноклональное антитело вводят в то время, когда пациент имеет головную боль (например, мигрень).

В другом варианте осуществления моноклональное антитело в соответствии со способами, предложенными в данном документе, вводят пациенту из или с помощью предварительно заполненного шприца, предварительно заполненного шприца с защитным устройством иглы, шприца-ручки или автоматического медицинского шприца.

В вариантах осуществления способов, предложенных в данном документе, моноклональное антитело содержит CDR H1, приведенную в SEQ ID NO:3; CDR H2, приведенную в SEQ ID NO:4; CDR H3, приведенную в SEQ ID NO:5; CDR L1, приведенную в SEQ ID NO:6; CDR L2, приведенную в SEQ ID NO:7; и CDR L3, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:11, и легкую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:12. В конкретном варианте осуществления моноклональное антитело представляет собой фреманезумаб (также обозначаемый в данном документе как «G1»).

В одном варианте осуществления моноклональное антитело вводят в дозе, составляющей от около 225 до около 900 мг, например, в дозе около 225 мг, в дозе около 675 мг, в дозе около 900 мг. Эти дозы могут быть введены пациенту один раз в месяц или один раз в квартал. Помимо этого, любая из этих доз (например, около 225, около 675 или около 900 мг) может быть введена внутривенно или подкожно. В конкретном варианте осуществления режим дозирования включает в себя начальную дозу (например, 675 мг) и дополнительно включает в себя введение пациенту дополнительной дозы, составляющей около 225 мг моноклонального антитела, один раз в месяц в каждом из двух месяцев (или трех месяцев, четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев или двенадцати месяцев), следующих за месяцем в котором пациенту вводят начальную дозу.

В одном варианте осуществления моноклональное антитело вводят в виде состава, содержащего антитело в концентрации, составляющей, по меньшей мере, около 150 мг/мл. В другом варианте осуществления моноклональное антитело вводят в объеме, составляющем менее чем 2 мл (например, около 1,8 мл, около 1,7 мл, около 1,6 мл, около 1,5 мл, около 1,4 мл, около 1,3 мл, около 1,2 мл, около 1,1 мл, около 1,0 мл, около 0,9 мл, около 0,8 мл, около 0,7 мл, около 0,6 мл, около 0,5 мл или меньше). В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело предпочтительно вводят в объеме, составляющем около 1,5 мл.

В одном варианте осуществления моноклональное антитело содержит CDR H1, приведенную в SEQ ID NO:87; CDR H2, приведенную в SEQ ID NO:88; CDR H3, приведенную в SEQ ID NO:89; CDR L1, приведенную в SEQ ID NO:84; CDR L2, приведенную в SEQ ID NO:85; и CDR L3, приведенную в SEQ ID NO:86. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:82, и вариабельную область легкой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:80. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:83, и легкую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:81.

В дополнительном варианте осуществления моноклональное антитело представляет собой эптинезумаб. Эптинезумаб может быть введен в дозе, составляющей около 100 мг, около 300 мг или около 1000 мг. Любая из этих доз (например, около 100 мг, около 300 мг или около 1000 мг) может быть введена внутривенно или подкожно.

В другом осуществления моноклональное антитело содержит CDR H1, приведенную в SEQ ID NO:93; CDR H2, приведенную в SEQ ID NO:94; CDR H3, приведенную в SEQ ID NO:95; CDR L1, приведенную в SEQ ID NO:91; CDR L2, приведенную в SEQ ID NO:92; и CDR L3, приведенную в SEQ ID NO:90. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:97, и вариабельную область легкой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:96. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:99, и легкую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:98.

В дополнительном варианте осуществления моноклональное антитело представляет собой галканезумаб. Галканезумаб может быть введен в дозе, составляющей около 120 мг или около 240 мг. Помимо этого, доза 120 мг может быть введена в объеме, составляющем около 1,5 мл, а доза 240 мг может быть введена в объеме, составляющем около 3 мл. Любая из этих доз (например, около 120 мг или 240 мг) может быть введена внутривенно или подкожно.

В другом осуществления моноклональное антитело содержит CDR H1, приведенную в SEQ ID NO:103; CDR H2, приведенную в SEQ ID NO:104; CDR H3, приведенную в SEQ ID NO:105; CDR L1, приведенную в SEQ ID NO:100; CDR L2, приведенную в SEQ ID NO:101; и CDR L3, приведенную в SEQ ID NO:102. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:107, и вариабельную область легкой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:106. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:109, и легкую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:108.

В дополнительном варианте осуществления моноклональное антитело представляет собой эренумаб. Эренумаб может быть введен в дозе, составляющей около 70 мг или около 140 мг. Помимо этого, доза 70 мг может быть введена в объеме, составляющем около 1 мл. Доза 140 мг может быть введена в объеме, составляющем около 2 мл. Любая из этих доз (например, около 70 мг или 140 мг) может быть введена внутривенно или подкожно.

В одном аспекте в данном документе предложено применение моноклонального антитела, которое модулирует (например, блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет) путь с участием КГРП, для получения лекарственного препарата для снижения частоты головной боли у пациента, головная боль которого опосредована активацией и сенсибилизацией высокопороговых (HT) нейронов.

В одном аспекте в данном документе предложено применение моноклонального антитела, которое модулирует (например, блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет) путь с участием КГРП, для получения лекарственного препарата для снижения частоты головной боли у пациента, у которого наблюдается гипералгезия, облегчаемая с помощью введения моноклонального антитела, которое модулирует (например, блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет) путь с участием КГРП.

В одном аспекте в данном документе предложено применение моноклонального антитела, которое модулирует (например, блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет) путь с участием КГРП, для получения лекарственного препарата для снижения частоты головной боли у пациента, головные боли которого проявляются преимущественно в части головы (например, односторонние периорбитальные, односторонние височные или в области одного глаза).

В одном варианте осуществления любых из путей применения, предложенных в данном документе, моноклональное антитело содержит CDR H1, приведенную в SEQ ID NO:3; CDR H2, приведенную в SEQ ID NO:4; CDR H3, приведенную в SEQ ID NO:5; CDR L1, приведенную в SEQ ID NO:6; CDR L2, приведенную в SEQ ID NO:7; и CDR L3, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления любых из путей применения, предложенных в данном документе, моноклональное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления любых из путей применения, предложенных в данном документе, моноклональное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:11, и легкую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:12.

В другом варианте осуществления любых из путей применения, предложенных в данном документе, моноклональное антитело содержит CDR H1, приведенную в SEQ ID NO:87; CDR H2, приведенную в SEQ ID NO:88; CDR H3, приведенную в SEQ ID NO:89; CDR L1, приведенную в SEQ ID NO:84; CDR L2, приведенную в SEQ ID NO:85; и CDR L3, приведенную в SEQ ID NO:86. В некоторых вариантах осуществления любых из путей применения, описанных в данном документе, моноклональное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:82, и вариабельную область легкой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:80. В некоторых вариантах осуществления любых из путей применения, описанных в данном документе, моноклональное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:83, и легкую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:81.

В другом варианте осуществления любых из путей применения, предложенных в данном документе, моноклональное антитело содержит CDR H1, приведенную в SEQ ID NO:93; CDR H2, приведенную в SEQ ID NO:94; CDR H3, приведенную в SEQ ID NO:95; CDR L1, приведенную в SEQ ID NO:91; CDR L2, приведенную в SEQ ID NO:92; и CDR L3, приведенную в SEQ ID NO:90. В некоторых вариантах осуществления любых из путей применения, описанных в данном документе, моноклональное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:97, и вариабельную область легкой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:96. В некоторых вариантах осуществления любых из путей применения, описанных в данном документе, моноклональное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:99, и легкую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:98.

В другом варианте осуществления любых из путей применения, предложенных в данном документе, моноклональное антитело содержит CDR H1, приведенную в SEQ ID NO:103; CDR H2, приведенную в SEQ ID NO:104; CDR H3, приведенную в SEQ ID NO:105; CDR L1, приведенную в SEQ ID NO:100; CDR L2, приведенную в SEQ ID NO:101; и CDR L3, приведенную в SEQ ID NO:102. В некоторых вариантах осуществления любых из путей применения, предложенных в данном документе, моноклональное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:107, и вариабельную область легкой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:106. В некоторых вариантах осуществления любых из путей применения, предложенных в данном документе, моноклональное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:109, и легкую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:108. В одном аспекте в данном документе предложен набор, содержащий: предварительно заполненный шприц, предварительно заполненный шприц с защитным устройством иглы, шприц-ручку или автоматический медицинский шприц, содержащие дозу моноклонального антитела, которое модулирует (например, блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет) путь с участием КГРП; и инструкции для определения того, опосредованы ли головные боли пациента активацией и сенсибилизацией высокопороговых (HT) нейронов.

В одном аспекте в данном документе предложено моноклональное антитело, которое блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет путь с участием кальцитонин ген-родственного пептида (КГРП), для применения в снижении частоты головной боли у пациента, при этом пациент представляет собой пациента, головные боли которого опосредованы активацией и сенсибилизацией высокопороговых (HT) нейронов. В некоторых вариантах осуществления было определено, что пациент имеет головные боли, опосредованные активацией и сенсибилизацией высокопороговых (HT) нейронов.

В другом аспекте в данном документе предложено моноклональное антитело, которое блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет путь с участием кальцитонин ген-родственного пептида (КГРП), для применения в снижении частоты головной боли у пациента, при этом пациент представляет собой пациента, у которого наблюдается гипералгезия, облегчаемая с помощью введения первого моноклонального антитела, которое блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет путь с участием КГРП. В некоторых вариантах осуществления было определено, что пациент проявляет гипералгезию. В некоторых вариантах осуществления было определено, что пациент имеет гипералгезию, которая облегчается с помощью введения первого моноклонального антитела, которое блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет путь с участием КГРП.

В еще одном аспекте в данном документе предложено моноклональное антитело, которое блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет путь с участием кальцитонин ген-родственного пептида (КГРП), для применения в снижении частоты головной боли у пациента, при этом пациент представляет собой пациента, головные боли которого проявляются преимущественно в части головы. В некоторых вариантах осуществления было определено, что пациент преимущественно испытывает головные боли в части головы.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит CDR H1, приведенную в SEQ ID NO:3; CDR H2, приведенную в SEQ ID NO:4; CDR H3, приведенную в SEQ ID NO:5; CDR L1, приведенную в SEQ ID NO:6; CDR L2, приведенную в SEQ ID NO:7; и CDR L3, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:11, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:12.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит CDR H1, приведенную в SEQ ID NO:87; CDR H2, приведенную в SEQ ID NO:88; CDR H3, приведенную в SEQ ID NO:89; CDR L1, приведенную в SEQ ID NO:84; CDR L2, приведенную в SEQ ID NO:85; и CDR L3, приведенную в SEQ ID NO:86. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:82, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:80. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:83, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:81.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит CDR H1, приведенную в SEQ ID NO:93; CDR H2, приведенную в SEQ ID NO:94; CDR H3, приведенную в SEQ ID NO:95; CDR L1, приведенную в SEQ ID NO:91; CDR L2, приведенную в SEQ ID NO:92; и CDR L3, приведенную в SEQ ID NO:90. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:97, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:96. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:99, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:98.

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело содержит CDR H1, приведенную в SEQ ID NO:103; CDR H2, приведенную в SEQ ID NO:104; CDR H3, приведенную в SEQ ID NO:105; CDR L1, приведенную в SEQ ID NO:100; CDR L2, приведенную в SEQ ID NO:101; и CDR L3, приведенную в SEQ ID NO:102. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:107, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:106. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:109, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:108.

В одном аспекте в данном документе предложен набор, содержащий: предварительно заполненный шприц, предварительно заполненный шприц с защитным устройством иглы, шприц-ручку или автоматический медицинский шприц, содержащие дозу моноклонального антитела, которое модулирует (например, блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет) путь с участием КГРП; и инструкции для определения того, испытывает ли пациент гипералгезию, облегчаемую с помощью введения моноклонального антитела, которое модулирует (например, блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет) путь с участием КГРП.

В другом аспекте в данном документе предложен набор, содержащий: предварительно заполненный шприц, предварительно заполненный шприц с защитным устройством иглы, шприц-ручку или автоматический медицинский шприц, содержащие дозу моноклонального антитела, которое блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет путь с участием КГРП; и инструкции для определения того, проявляются ли головные боли пациента преимущественно в части головы (например, односторонние периорбитальные, односторонние височные или в области одного глаза).

Краткое описание графических материалов

На Фиг. 1 продемонстрирована таблица, изображающая аффинности связывания 12 мышиных антител в отношении различных аланин-замещенных фрагментов α-КГРП человека. Аффинности связывания измеряли при 25° C с помощью Biacore в результате пропускания Fab в направлении КГРП на чипе. Значения в прямоугольниках обозначают потерю аффинности аланиновых мутантов по отношению к исходному фрагменту, 25-37 (курсив), за исключением K35A, который происходил из исходного фрагмента 19-37. “^a” указывает на то, что аффинности для фрагментов 19-37 и 25-37 представляют собой среднее среднего ± стандартное отклонение из двух независимых измерений на различных сенсорных чипах. “^b” указывает на то, что эти взаимодействия отклонялись от простой бимолекулярной модели взаимодействия вследствие двухфазной скорости диссоциации, в связи с чем их аффинности определяли с помощью модели конформационных изменений. Обозначение к шкале серых тонов: белый цвет (1,0) указывает на аффинность, соответствующую исходному соединению; светло-серый цвет (менее 0,5) указывает на более высокую аффинность, чем у исходного соединения; темно-серый цвет (более 2) указывает на более низкую аффинность, чем у исходного соединения; и черный цвет указывает на то, что связывание не выявлено.

На Фиг. 2A и 2B продемонстрирован эффект введения КГРП 8-37 (400 нмоль/кг), антитела 4901 (25 мг/кг) и антитела 7D11 (25 мг/кг) на кровоток в коже, измеряемый в виде потока клеток крови после стимуляции электрическими импульсами в течение 30 секунд. КГРП 8-37 вводили внутривенно (в/в) за 3-5 минут до стимуляции электрическими импульсами. Антитела вводили интраперитонеально (IP) за 72 часа до стимуляции электрическими импульсами. Каждая точка на графиках представляет собой AUC одной крысы, обработанной в указанных условиях. Каждая линия на графиках представляет собой среднюю AUC крыс, обработанных при указанном условии. AUC (площадь под кривой) равняется Δпоток x Δвремя. «ΔПоток» представляет собой изменение единиц поток после стимуляции электрическими импульсами; а «Δвремя» представляет собой период времени, затрачиваемый для возврата уровня потока клеток крови к уровню, характерному до стимуляции электрическими импульсами.

На Фиг. 3 продемонстрирован эффект введения различных доз антитела 4901 (25 мг/кг, 5 мг/кг, 2,5 мг/кг или 1 мг/кг) на кровоток кожи, измеряемый в виде потока клеток крови после стимуляции электрическими импульсами в течение 30 секунд. Антитела вводили внутривенно (в/в) за 24 часа до стимуляции электрическими импульсами. Каждая точка на графике представляет собой AUC одной крысы, обработанной в указанных условиях. Линия на графике представляет собой среднюю AUC крыс, обработанных при указанном условии.

На Фиг. 4A и 4B продемонстрирован эффект введения антитела 4901 (1 мг/кг или 10 мг/кг, в/в), антитела 7Е9 (10 мг/кг, в/в) и антитела 8B6 (10 мг/кг, в/в) на кровоток в коже, измеряемый в виде потока клеток крови после стимуляции электрическими импульсами в течение 30 секунд. Антитела вводили внутривенно (в/в) после стимуляции электрическими стимулами через 30 минут, 60 минут, 90 минут и 120 минут после введения антител. Ось Y представляет собой процент AUC по сравнению с уровнем AUC до того, когда антитело не вводили (время 0). Ось X представляет собой период времени (минуты) между введением антител и стимуляцией электрическими импульсами. «*» обозначает P<0,05 и «**» обозначает P<0,01 по сравнению со временем 0. Данные анализировали с помощью однофакторного ANOVA с использованием критерия для множественных сравнений Дуннетта.

На Фиг. 5 продемонстрирована аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO:1) и вариабельная область легкой цепи (SEQ ID NO:2) антитела G1. CDR в соответствии с нумерацией Кабат представлены жирным шрифтом, а CDR в соответствии с нумерацией Чотиа подчеркнуты. Аминокислотные остатки для вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи пронумерованы последовательно.

На Фиг. 6 продемонстрировано картирование эпитопов антитела G1 с помощью конкуренции пептидов с использованием Biacore. N-биотинилированный α-КГРП человека захватывали на сенсорный чип SA. Fab G1 (50 нM) в отсутствие конкурирующего пептида или, предварительно инкубированный в течение 1 часа с 10 мкM конкурирующего пептида, пропускали на чипе. Измеряли связывание Fab G1 с α-КГРП человека на чипе. Ось Y представляет собой процент связывания, блокируемый наличием конкурирующего пептида, по сравнению со связыванием в отсутствие конкурирующего пептида.

На Фиг. 7A, 7B, 7C, 7D, 7E, 7F, 7G, 7H, 7I и 7J продемонстрированы участки отведения (Фиг. 7A и 7F), рецептивные поля лица (Фиг. 7B, 7D, 7G и 7I) и рецептивные поля твердой оболочки головного мозга (Фиг. 7C, 7E, 7H и 7J) каждого из 63 тригеминоваскулярных нейронов, исследуемых в отношении эффектов КГРП-мАТ (Фиг. 7A, 7B, 7C, 7F, 7G и 7H, n = 36) или изотип-конАТ (Фиг. 7D, 7E, 7I и 7J, n = 27) у самцов и самок крыс. На Фиг. 7A и 7F продемонстрированы участки отведения, нанесенные на графиках на иллюстративном продольном срезе через первый шейный сегмент. Кружки представляют собой указанные HT и WDR нейроны. На Фиг. 7B, 7D, 7G и 7I продемонстрированы наиболее чувствительные области рецептивных полей кожи (т.е., при применении расчесывания, сдавливания и щипка) и роговицы. На Фиг. 7C, 7E, 7H и 7J продемонстрированы чувствительные к механическому воздействию рецептивные поля на твердой оболочке головного мозга, все из которых были расположены на или возле продольного синуса. Часть твердой оболочки головного мозга, изображенная на изображениях рецептивного поля, представлена с помощью пунктирной линии на врезке на Фиг. 7H. Все рецептивные поля твердой оболочки головного мозга и лица являются ипсилатеральными по отношению к регистрируемому нейрону. Сокращения: HT, высокопороговый; WDR, широкий динамический диапазон.

На Фиг. 8A, 8B, 8C, 8D, 8E, 8F и 8G продемонстрирован эффект КГРП-мАТ (Фиг. 8A, 8B, 8C и 8D) и изотип-конАТ (Фиг. 8E, 8F и 8G) в отношении спонтанной активности тригеминоваскулярных нейронов у самцов и самок крыс. На Фиг. 8A, 8D и 8F представлены графики скорости спонтанных разрядов, регистрируемой на исходном уровне (BL) и через 1-4 часа после введения КГРП-мАТ (Фиг. 8A) или изотип-конАТ (Фиг. 8E) в HT нейроны. Числа в скобках демонстрируют среднюю скорость разряда в случае 15-минутного периода времени выборки в каждой временной точке. Ширина интервала = 1 сек. На Фиг. 8B и 8C представлены гистограммы, изображающие средний (± S.E.) спонтанный разряд HT и WDR нейронов, регистрируемый на исходном уровне и через 1-4 часа после введения КГРП-мАТ у самцов (Фиг. 8B) и самок (Фиг. 8C) крыс. На Фиг. 8F и 8G представлены гистограммы, изображающие средний (± S.E.) спонтанный разряд HT и WDR нейронов, регистрируемый на исходном уровне и через 1-4 часа после введения изотип-конАТ у самцов (Фиг. 8F) и самок (Фиг. 8G) крыс. * p<0,05 по сравнению с исходным уровнем. Числа в скобках на Фиг. 8B, 8C, 8F и 8G обозначают число нейронов в каждой группе.

На Фиг. 9A, 9B, 9C, 9D, 9E и 9F представлены графики, демонстрирующие эффект КГРП-мАТ (Фиг. 9A, 9B и 9C) и изотип-конАТ (Фиг. 9D, 9E и 9F) в отношении ответа тригеминоваскулярных нейронов на вдавливание твердой оболочки головного мозга у самцов и самок крыс. На Фиг. 9A и 9D представлены графики, демонстрирующие ответы на вдавливание твердой оболочки головного мозга с помощью нити фон Фрея (VFH, 4,19 г) на исходном уровне (BL) и через 1-4 часа после введения КГРП-мАТ (Фиг. 9A) или антитела изотипического контроля (изотип-конАТ) (Фиг. 9D) в HT нейроны. Числа в скобках демонстрируют среднюю скорость разряда во время стимула. Ширина интервала = 1 сек. На Фиг. 9B и 9C представлены графики, изображающие средние (± S.E.) скорости разрядов в ответ на стимуляцию твердой оболочки головного мозга на исходном уровне и через 1-4 часа после введения лекарственных препаратов для всей совокупности нейронов, которые получали КГРП-мАТ, у самцов (Фиг. 9B) и самок (Фиг. 9C) крыс. На Фиг. 9Е и 9F представлены графики, изображающие средние (± S.E.) скорости разрядов в ответ на стимуляцию твердой оболочки головного мозга на исходном уровне и через 1-4 часа после введения лекарственных препаратов для всей совокупности нейронов, которые получали изотип-конАТ, у самцов (Фиг. 9Е) и самок (Фиг. 9F) крыс. * p<0,05 по сравнению с исходным уровнем. Числа в скобках на Фиг. 9B, 9C, 9E и 9F обозначают число нейронов в каждой группе.

На Фиг. 10A, 10B, 10С, 10D, 10Е, 10F, 10G и 10H представлены графики, демонстрирующие эффект КГРП-мАТ (Фиг. 10A, 10B, 10С и 10D) и изотип-конАТ (Фиг. 10Е, 10F, 10G и 10H) в отношении ответа центральных тригеминоваскулярных нейронов на неболевую и болевую механическую стимуляцию рецептивных полей кожи самцов и самок крыс. На Фиг. 10A, 10B, 10E и 10F представлены графики, демонстрирующие ответы на механическую стимуляцию рецептивных полей кожи HT (Фиг. 10A и 10E) и WDR (Фиг. 10B и 10F) с помощью расчесывания, сдавливания и щипка на исходном уровне (BL) и через 1-4 часа после введения КГРП-мАТ или изотип-конАТ. Числа в скобках демонстрируют среднюю скорость разряда во время каждого стимула. Ширина интервала = 1 сек. На Фиг. 10С и 10D представлены графики, изображающие средние (± S.E.) скорости разрядов в ответ на стимуляцию кожи на исходном уровне и через 1-4 часа после введения лекарственных препаратов для всей совокупности нейронов, которые получали КГРП-мАТ, у самцов (Фиг. 10С) и самок (Фиг. 10D) крыс. На Фиг. 10G и 10H представлены графики, изображающие средние (± S.E.) скорости разрядов в ответ на стимуляцию кожи на исходном уровне и через 1-4 часа после введения лекарственных препаратов для всей совокупности нейронов, которые получали изотип-конАТ, у самцов (Фиг. 10G) и самок (Фиг. 10H) крыс. Числа в скобках на Фиг. 10С, 10D, 10G и 10H обозначают число нейронов в каждой группе.

На Фиг. 11A, 11B, 11C, 11D, 11E и 11F представлены графики, демонстрирующие эффект КГРП-мАТ (Фиг. 11A, 11B и 11C) и изотип-конАТ (Фиг. 11D, 11E и 11F) в отношении ответа центральных тригеминоваскулярных нейронов на механическую стимуляцию роговицы у самцов и самок крыс. На Фиг. 11A и 11D представлены графики, демонстрирующие ответы на механическую стимуляцию роговицы в результате слабого расчесывания на исходном уровне (BL) и через 1-4 часа после введения КГРП-мАТ (Фиг. 11A) или изотип-конАТ (Фиг. 11D) в HT нейроны. Числа в скобках демонстрируют среднюю скорость разряда во время каждого стимула. Ширина интервала = 1 сек. На Фиг. 11B и 11C представлены графики, изображающие средние (± S.E.) скорости разрядов в ответ на стимуляцию роговицы на исходном уровне и через 1-4 часа после введения лекарственных препаратов для всей совокупности нейронов, которые получали КГРП-мАТ, у самцов (Фиг. 11B) и самок (Фиг. 11C) крыс. На Фиг. 11Е и 11F представлены графики, изображающие средние (± S.E.) скорости разрядов в ответ на стимуляцию роговицы на исходном уровне и через 1-4 часа после введения лекарственных препаратов для всей совокупности нейронов, которые получали изотип-конАТ, у самцов (Фиг. 11Е) и самок (Фиг. 11F) крыс. Числа в скобках на Фиг. 11B, 11C, 11E и 11F обозначают число нейронов в каждой группе.

На Фиг. 12A, 12B, 12C, 12D, 12E и 12F представлены графики, демонстрирующие эффект КГРП-мАТ (Фиг. 12A, 12B и 12C) и изотип-конАТ (Фиг. 12D, 12E и 12F) в отношении активации тригеминоваскулярных нейронов в результате распространяющейся корковой депрессии (CSD), индуцированной через 4 часа после обработки лекарственными препаратами. На Фиг. 12A и 12D представлены графики, на которых продемонстрирован разряд тригеминоваскулярных нейронов до индукции CSD (вверху), во время индукции CSD (в середине) и через 2 часа после CSD (внизу), в двух HT нейронах, которые получали КГРП-мАТ (Фиг. 12A) или изотип-конАТ (Фиг. 12D) за 4 часа до индукции CSD. Ширина интервала = 1 сек. На Фиг. 12B и 12C представлены графики, изображающие средние (± S.E.) скорости разрядов для всей совокупности HT и WDR тригеминоваскулярных нейронов, исследуемых в отношении ответов CSD после введения изотип-конАТ у самцов (Фиг. 12B) и самок (Фиг. 12C) крыс. На Фиг. 12Е и 12F представлены графики, изображающие средние (± S.E.) скорости разрядов для всей совокупности HT и WDR тригеминоваскулярных нейронов, исследуемых в отношении ответов CSD после введения КГРП-мАТ у самцов (Фиг. 12Е) и самок (Фиг. 12F) крыс. Разряд продемонстрирован на исходном уровне (через 4 часа после обработки лекарственными препаратами, до индукции CSD) и через 2 часа после CSD. * p<0,05 по сравнению с исходным уровнем. Числа в скобках на Фиг. 12B, 12C, 12E и 12F обозначают число нейронов в каждой группе.

На Фиг. 13A и 13B продемонстрировано расширение рецептивных полей кожи после появления CSD у самцов и самок крыс. Синим цветом (от верхней левой до нижней правой диагональных линий) и розовым цветом (от верхней правой до нижней левой диагональных линий) показаны рецептивные поля твердой оболочки головного мозга до и через 2 часа после индукции CSD соответственно у обработанных изотип-конАТ (Фиг. 13A) и КГРП-мАТ (Фиг. 13B) крыс.

На Фиг. 14A, 14B, 14C, 14D, 14E и 14F представлены графики, демонстрирующие, что усиленные ответы на механическую стимуляцию твердой оболочки головного мозга после CSD предупреждаются с помощью КГРП-мАТ. На Фиг. 14A и 14D представлены графики, демонстрирующие ответы на вдавливание твердой оболочки головного мозга до индукции CSD (BL) и через 2 часа после CSD в двух HT нейронах, которые получали обработку КГРП-мАТ (Фиг. 14A) или изотип-конАТ (Фиг. 14D) за 4 часа до индукции CSD. Числа в скобках демонстрируют среднюю скорость разряда во время каждого стимула. Ширина интервала = 1 сек. На Фиг. 14B, 14C, 14E и 14F представлены графики, демонстрирующие средний (± S.E.) разряд в ответ на вдавливание твердой оболочки головного мозга до индукции CSD (исходный уровень) и через 2 часа после CSD в нейронах, которые получали обработку изотип-конАТ (Фиг. 14B и 14C) или КГРП-мАТ (Фиг. 14E и 14F). Нейроны, регистрируемые у самцов, продемонстрированы на Фиг. 14В и 14E; нейроны, регистрируемые у самок, представлены на Фиг. 14C и 14F. * p<0,05 по сравнению с исходным уровнем. Числа в скобках на Фиг. 14B, 14C, 14E и 14F обозначают число нейронов в каждой группе.

На Фиг. 15A, 15B, 15C, 15D, 15E и 15F представлены графики, демонстрирующие, что усиленные ответы на механическую стимуляцию кожи после CSD предупреждаются с помощью КГРП-мАТ. На Фиг. 15A и 15D представлены графики, демонстрирующие ответы на механическую стимуляцию рецептивных полей кожи с помощью расчесывания, сдавливания и щипка до индукции CSD (BL) и через 2 часа после CSD в случае двух HT нейронах, которые получали КГРП-мАТ (Фиг. 15A) или изотип-конАТ (Фиг. 15D) за 4 часа до индукции CSD. Числа в скобках демонстрируют среднюю скорость разряда во время каждого стимула. Ширина интервала = 1 сек. На Фиг. 15B, 15C, 15E и 15F представлены графики, демонстрирующие средний (± S.E.) разряд в ответ на стимуляцию кожи до (исходный уровень) и через 2 часа после индукции CSD в НТ нейронах, которые получали обработку изотип-конАТ или КГРП-мАТ за 4 часа до индукции CSD. Нейроны, регистрируемые у самцов, продемонстрированы на Фиг. 15В и 15E; нейроны, регистрируемые у самок, представлены на Фиг. 15C и 15F. * p<0,05 по сравнению с исходным уровнем.

На Фиг. 16A, 16B, 16C, 16D, 16E и 16F представлены графики, демонстрирующие, что усиленные ответы на механическую стимуляцию роговицы после CSD предупреждаются с помощью КГРП-мАТ (только у самок). На Фиг. 16A и 16D представлены графики, демонстрирующие ответы на стимуляцию роговицы (слабое расчесывание) до индукции CSD (BL) и через 2 часа после CSD в двух HT нейронах, которые получали обработку изотип-конАТ (Фиг. 16A) или КГРП-мАТ (Фиг. 16D) за 4 часа до индукции CSD. Ширина интервала = 1 сек. На Фиг. 16B, 16C, 16E и 16F представлены графики, демонстрирующие средний (± S.E.) разряд в ответ на стимуляцию роговицы до индукции CSD (исходный уровень) и через 2 часа после CSD в нейронах, которые получали обработку изотип-конАТ (Фиг. 16B и 16C) или КГРП-мАТ (Фиг. 16E и 16F) за 4 часа до индукции CSD. Нейроны, регистрируемые у самцов, продемонстрированы на Фиг. 16В и 16E; нейроны, регистрируемые у самок, представлены на Фиг. 16C и 16F. * p<0,05 по сравнению с исходным уровнем.

На Фиг. 17 представлены таблицы, демонстрирующие результаты исследований (описанных в Примере 5) спонтанной активности HT и WDR нейронов у самцов и самок крыс в наивном состоянии и в состоянии после CSD при использовании указанных стимулов.

На Фиг. 18A, 18B и 18C представлены графики, демонстрирующие активацию a-дельта-менингеальных ноцицепторов в результате CSD. На Фиг. 18A представлены графики, демонстрирующие иллюстративный ответ со стороны отдельного a-дельта-волокна на CSD. Спонтанная активность исходного уровня нейрона показана от 0 до 60 минут, при этом скорость возбуждения нейрона после CSD показана от 60 до 120 минут. На Фиг. 18B представлена столбиковая диаграмма, демонстрирующая среднюю (± SE) величину ответа шести a-дельта-волокон, которые были активированы в результате CSD (p<0,05). На Фиг. 18C представлен график, демонстрирующий изменения частоты ответов всех шести a-дельта-нейронов.

На Фиг. 19A, 19B и 19C представлены графики, демонстрирующие активацию менингеальных ноцицепторов С-типа в результате CSD. На Фиг. 19A представлены графики, демонстрирующие иллюстративный ответ со стороны отдельного волокна С-типа на CSD. Спонтанная активность исходного уровня нейрона показана от 0 до 60 минут, при этом скорость возбуждения нейрона после CSD показана от 60 до 120 минут. На Фиг. 19B продемонстрирована средняя (± SE) величина ответа шести волокон С-типа, которые были активированы в результате CSD (p<0,05). На Фиг. 19C продемонстрированы изменения частоты ответов всех шести нейронов С-типа.

На Фиг. 20A и 20B продемонстрировано, что фреманезумаб предупреждает активацию большинства a-дельта- менингеальных ноцицепторов и некоторых менингеальных ноцицепторов C-типа. На Фиг. 20A продемонстрирован отдельный пример обработанного фреманезумабом a-дельта-волокна, показывающий отсутствие изменения спонтанной активности после CSD. На Фиг. 20B продемонстрированы примеры ответов двух менингеальных ноцицепторов C-типа на CSD после обработки фреманезумабом. Следует обратить внимание, что верхний нейрон не был активирован в результате CSD, в то время как нижний нейрон был активирован в результате CSD.

На Фиг. 21A и 21B представлены таблицы, демонстрирующие частоту активации A-дельта менингеальных ноцицепторов или менингеальных ноцицепторов С-типа в результате CSD.

На Фиг. 22A продемонстрировано, как получали регистрации отдельных нейронов из первичных афферентных ноцицепторов твердой оболочки головного мозга в ганглии тройничного нерва во время регистрации электрокортикограммной активности из каудальной коры головного мозга. Треугольник показывает участок введения пикротоксина.

На Фиг. 22B продемонстрировано, что афферентные волокна твердой оболочки головного мозга были выявлены в результате их ответа на одноимпульсную стимуляцию, применяемую в отношении твердой оболочки головного мозга, расположенной сверху поперечного синуса, и дополнительно были охарактеризованы как механочувствительные в результате их ответа на стимуляцию фон Фрея (VFH) твердой оболочки головного мозга.

На Фиг. 22C представлена столбиковая диаграмма рецептивного поля твердой оболочки головного мозга.

На Фиг. 22D представлена электрокортикограмма (верхний график) и скорость возбуждения афферентного волокна твердой оболочки головного мозга (нижний график) до и после индукции судороги пикротоксином. Треугольник показывает время введения пикротоксина.

На Фиг. 23A продемонстрирована экспериментальная модель, показывающая положения при регистрации ЭКГ в теменной коре головного мозга, регистрацию нейронов в пластинке I верхнего шейного дорсального рога и рецептивные поля нейронов твердой оболочки головного мозга и лица.

На Фиг. 23B представлен график, демонстрирующий электрическую стимуляцию твердой оболочки головного мозга.

На Фиг. 23C представлена столбиковая диаграмма, которая демонстрирует механическую стимуляцию твердой оболочки головного мозга.

На Фиг. 23D продемонстрирована регистрация ЭКГ нейрона, характеризующегося широким динамическим диапазоном (WDR) в результате его ответов на постепенную механическую стимуляцию кожи лица.

На Фиг. 23E продемонстрировано, что местное применение пикротоксина в отношении теменной коры головного мозга индуцировало судорогу коры головного мозга (верхний график) и временное подавление возбуждения нейронов, за которым следовало длительное повышение, которое продолжалось после прекращения судорожной активности.

На Фиг. 24 продемонстрировано, что анти-антагонист КГРП антитело предупреждает активацию центрального тригеминоваскулярного нейрона в результате судороги. При внутривенном введении (30 мг/кг) за четыре часа до индукции судороги TEV-48125 предупреждало активацию центрального тригеминоваскулярного нейрона, но не появление судороги. Верхняя панель демонстрирует судорожную активность в коре головного мозга. Нижняя панель демонстрирует отсутствие активности в центральном нейроне.

Подробное описание изобретения

В данном документе предложен способ снижения частоты головной боли, включающий: a) отбор пациента, головная боль которого опосредована активацией и сенсибилизацией высокопороговых нейронов; и b) введение пациенту моноклонального антитела, которое модулирует (например, блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет) путь с участием кальцитонин ген-родственного пептида (КГРП) в количестве, достаточном для снижения частоты головной боли у пациента. В одном варианте осуществления сенсибилизация высокопороговых нейронов зависит от входящих болевых сигналов от оболочек головного мозга.

Значительное число фактов подтверждает важную роль КГРП в патофизиологии мигрени. Указанные факты приводят к повсеместным попыткам разработки нового поколения лекарственных препаратов, которые снижают доступность КГРП у лиц, страдающих мигренью. В последнее время было обнаружено, что гуманизированные моноклональные анти-КГРП антитела, среди которых имеется фреманезумаб (TEV-48125), являются эффективными в снижении частоты хронической и эпизодической мигрени.

Методики внеклеточной регистрации одиночных нейронов использовали для определения эффектов TEV-48125 (30 мг/кг, в/в) и его изотипа (контроль) в отношении спонтанной и вызванной активности в наивных и CSD-сенсибилизированных центральных тригеминоваскулярных нейронах в медуллярном и верхнем шейном дорсальном роге у анестезированных самцов и самок крыс (см., например, Пример 5).

Исследование, описанное в данном документе, демонстрирует, что анти-КГРП антитело фреманезумаб (TEV-48125) приводит к ингибированию наивных высокопороговых (HT) тригеминоваскулярных нейронов, но не тригеминоваскулярных нейронов с широким динамическим диапазоном (WDR), таким образом, что ингибирующие эффекты ограничены их активацией со стороны внутричерепной твердой оболочки головного мозга, но не со стороны кожи лица или роговицы, и, что при наличии достаточного количества времени указанный лекарственный препарат приводит к предупреждению активации и сенсибилизации HT, но не WDR нейронов в результате распространяющейся корковой депрессии. Указанное ингибирование было аналогичным у самцов и самок крыс.

В случае пациентов, хронические и эпизодические мигрени которых ослабляются анти-КГРП антителами, такими как фреманезумаб, указанные результаты указывают на возможность того, что HT нейроны играют определяющую ранее непризнанную роль в инициации и переходе в хроническую форму восприятия головной боли, при этом WDR нейроны способствуют ассоциированной аллодинии и центральной сенсибилизации (см. Пример 5). В клиническом отношении указанные результаты могут способствовать объяснению терапевтических эффектов анти-КГРП антител в ослаблении головных болей внутричерепного происхождения, таких как мигрень, и головных болей, характерных для менингита, эпидурального кровоизлияния, субдурального кровоизлияния, субарахноидального кровоизлияния и определенных опухолей головного мозга. Указанный результат также объясняет то, почему данный терапевтический подход может быть неэффективным для каждого пациента, страдающего головной болью.

Определения

Используемый в данном документе термин «около» при использовании в отношении диапазонов числовых значений, граничных значений или конкретных значений используется для указания того, что перечисленные значения могут варьировать вплоть до 10% от указанного значения. Таким образом, термин «около» используется для включения вариаций ± 10% или менее, вариаций ± 5% или менее, вариаций ± 1% или менее, вариаций ± 0,5% или менее или вариаций ± 0,1% или менее от определенного значения.

Термин «антитело» представляет собой иммуноглобулиновую молекулу, способную специфически связываться с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д., с помощью по меньшей мере одного сайта распознавания антигена, расположенного в вариабельной области иммуноглобулиновой молекулы. Используемый в данном документе термин охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), одноцепочечные фрагменты (ScFv), их мутантные формы, слитые белки, содержащие часть антитела (такие как доменные антитела), а также любую другую модифицированную конфигурацию иммуноглобулиновой молекулы, которая содержит сайт распознавания антигена. Антитело включает в себя антитело любого класса, такое как IgG, IgA или IgM (или их подклассов), и антитело не должно быть какого-то определенного класса. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей антитела иммуноглобулины могут быть распределены на различные классы. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные области тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю соответственно. Структуры субъединиц и пространственные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

Используемый в данном документе термин «моноклональное антитело» или «мАТ» относится к антителу, получаемому из популяции по сути однородных антител, т.е., отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, при этом они направлены на один антигенный сайт. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые в типичном случае включают в себя различные антитела, направленные на различные детерминанты (эпитопы), каждое моноклональное антитело направлено на одну детерминанту на антигене. Определение «моноклональный» указывает на свойство антитела быть полученным из по сути однородной популяции антител и не должно истолковываться как требующее продуцирования антитела с помощью какого-либо определенного способа. Например, моноклональные антитела для применения в соответствии с данным изобретением могут быть получены с помощью гибридомного метода, описанного Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495, или могут быть получены с помощью методов рекомбинантной ДНК, описанных в патенте США № 4816567. Моноклональные антитела также могут быть выделены из фаговых библиотек, полученных с помощью методик, описанных, например, в McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554.

Используемые в данном документе «гуманизированные» антитела относятся к формам отличных от человеческих (например, мышиных) антител, которые представляют собой специфические химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, происходящую из отличного от человеческого иммуноглобулина. По большей части гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых остатки из области, определяющей комплементарность (CDR) реципиента замещены остатками из CDR отличного от человека вида (донорское антитело), такого как мышь, крыса или кролик, имеющими необходимую специфичность, аффинность и биологическую активность. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) Fv иммуноглобулина человека замещены соответствующими отличными от человеческих остатками. Помимо этого, гуманизированное антитело может содержать остатки, которые не встречаются ни в реципиентном антителе, ни в импортируемой CDR или каркасных областях, однако включены для дополнительного улучшения и оптимизации функциональных характеристик антитела. Как правило, гуманизированное антитело будет содержать по сути все из по меньшей мере одного или в типичном случае из двух вариабельных доменов, в которых все или по сути все из участков CDR соответствуют таковым отличным от человеческого иммуноглобулина и все или по сути все из областей FR происходят из консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело в оптимальном случае также будет содержать по меньшей мере часть константной области или домена иммуноглобулина (Fc), в типичном случае такового иммуноглобулина человека. Антитела могут иметь Fc-области, модифицированные, как описано в WO 99/58572. Другие формы гуманизированных антител имеют одну или несколько CDR (одну, две, три, четыре, пять, шесть), которые изменены по отношению к исходному антителу, которые также обозначаются как одна или несколько CDR, «происходящих из» одного или нескольких CDR из исходного антитела.

Используемый в данном документе термин «человеческое антитело» означает антитело, имеющее аминокислотную последовательность, соответствующую таковой антитела, продуцируемого человеком, и/или которое было получено с помощью методик для получения человеческих антител, известных в данной области техники или раскрытых в данном документе. Указанное определение человеческого антитела включает в себя антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид тяжелой цепи человека или по меньшей мере один полипептид легкой цепи человека. Один такой пример представляет собой антитело, содержащее полипептиды легкой цепи мыши и полипептиды тяжелой цепи человека. Человеческие антитела могут быть получены с помощью различных методик, известных в данной области техники. В одном варианте осуществления человеческое антитело выбирают из фаговой библиотеки, при этом фаговая библиотека экспрессирует человеческие антитела (Vaughan et al., 1996, Nat. Biotechnol., 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Человеческие антитела также могут быть получены с помощью введения локусов иммуноглобулинов человека в трансгенных животных, например, мышей, в которых эндогенные гены иммуноглобулинов были частично или полностью инактивированы. Указанный подход описан в патентах США №№ 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; и 5661016. В качестве альтернативы человеческое антитело может быть получено с помощью иммортализации B-лимфоцитов человека, которые продуцируют антитело, направленное против целевого антигена (такие B-лимфоциты могут быть извлечены из индивидуума или могут быть иммунизированы in vitro). См., например, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; и патент США № 5750373.

Используемый в данном документе термин «генетически родственный кальцитонину пептид» и «КГРП» относится к любой форме кальцитонин ген-родственного пептида и его вариантам, которые сохраняют по меньшей мере часть активности КГРП. Например, КГРП может представлять собой α-КГРП или β-КГРП. Используемый в данном документе КГРП включает в себя КГРП нативной последовательности всех видов млекопитающих, например, человеческий, собачий, кошачий, лошадиный и бычий.

Используемый в данном документе термин «анти-КГРП антитело» относится к антителу, которое модулирует биологическую активность КГРП или пути с участием КГРП, в том числе нисходящие пути, опосредованные передачей сигнала с участием КГРП, такие как связывание рецепторов и/или активация клеточного ответа в отношении КГРП. Например, анти-КГРП антитело может блокировать, ингибировать, подавлять или ослаблять путь с участием кальцитонин ген-родственного пептида (КГРП). Термин анти-КГРП антитело охватывает как «анти-антагонист КГРП антитела», так и «анти-рецептор КГРП антитела». В некоторых вариантах осуществления анти-КГРП антитело представляет собой моноклональное антитело (т.е., анти-КГРП моноклональное антитело).

«Анти-антагонист КГРП антитело» относится к антителу, которое способно связываться с КГРП и, тем самым, ингибировать биологическую активность КГРП и/или нисходящий(нисходящие) путь(пути), опосредованный(опосредованные) передачей сигнала с участием КГРП. Анти-антагонист КГРП антитело охватывает антитела, которые модулируют, блокируют, антагонизируют, подавляют или ослабляют биологическую активность КГРП, или иным образом антагонизируют путь с участием КГРП, в том числе нисходящие пути, опосредованные передачей сигнала с участием КГРП, такие как связывание рецепторов и/или активация клеточного ответа в отношении КГРП. В некоторых вариантах осуществления анти-антагонист КГРП антитело связывает КГРП и предупреждает связывание КГРП с рецептором КГРП. В других вариантах осуществления анти-антагонист КГРП антитело связывает КГРП и предупреждает активацию рецептора КГРП. Примеры анти-антагонист КГРП антител предложены в данном документе.

Термин «анти-рецептор КГРП антитело» относится к антителу, которое способно связываться с рецептором КГРП, и, тем самым, модулировать путь с участием КГРП. Примеры анти-рецептор КГРП антител предложены в данном документе (например, эренумаб).

Используемые в данном документе термины «G1», «антитело G1», «TEV-48125» и «фреманезумаб» используются взаимозаменяемо для обозначения анти-антагонист КГРП антитела, продуцируемого с помощью экспрессионных векторов, имеющих номера депонирования ATCC PTA-6867 и ATCC PTA 6866. Аминокислотная последовательность вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи показаны на Фиг. 5. Части CDR антитела G1 (в том числе CDR в соответствии с нумерацией Чотиа и Кабат) в виде диаграммы представлены на Фиг. 5. Полинуклеотиды, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепи показаны в SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи полноразмерного G1 показана в SEQ ID NO:11. Аминокислотная последовательность легкой цепи полноразмерного G1 показана в SEQ ID NO:12. Характеристика и способы получения антитела G1 (и его вариантов) описаны в Примерах 1-4 ниже, а также в публикации в соответствии с PCT № WO 2007/054809 и WHO Drug Information 30(2): 280-1 (2016), которые тем самым включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

Термины «ALD403» и «эптинезумаб» относятся к анти-антагонист КГРП антителу, которое представляет собой гуманизированное моноклональное антитело IgG1 из кроличьего предшественника. Характеристика и способы получения эптинезумаба могут быть найдены в публикации США № US 2012/0294797 и WHO Drug Information 30(2): 274-5 (2016), которые включены посредством ссылки в полном объеме.

Термины «LY2951742» и «галканезумаб» относятся к анти-антагонист КГРП антителу, которое представляет собой гуманизированное моноклональное антитело IgG4 из мышиного предшественника. Характеристика и способы получения галканезумаба могут быть найдены в публикации США № US 2011/0305711 и WHO Drug Information 29(4): 526-7 (2015), которые включены посредством ссылки в полном объеме. Дозирование и составы, ассоциированные с галканезумабом, могут быть найдены в публикации в соответствии с PCT № WO 2016/205037, которая также включена посредством ссылки в полном объеме.

Термины «AMG334» и «эренумаб» относятся к анти-рецептор КГРП антителу, которое представляет собой полностью гуманизированное антитело IgG2. Характеристика и способы получения эренумаба могут быть найдены в публикации США № US 2010/0172895, патенте США № 9102731 и WHO Drug Information 30(2): 275-6 (2016), каждое из которых включено посредством ссылки в полном объеме. Дозирование и составы, ассоциированные с эренумабом, могут быть найдены в публикации в соответствии с PCT № WO 2016/171742, которая также включена посредством ссылки в полном объеме.

Термины «полипептид», «олигопептид», «пептид» и «белок» используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения полимеров из аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты и он может прерываться не аминокислотами. Указанные термины также охватывают аминокислотный полимер, который был модифицирован естественным образом или в результате вмешательства; например, в результате образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования или любого другого преобразования или модификации, такой как конъюгация с метящим компонентом. Также в указанное определение включены, например, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислоты (в том числе, но не ограничиваясь ими, не встречающиеся в природе аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области техники. Следует понимать, что поскольку полипептиды по данному изобретению основаны на антителе, то полипептиды могут встречаться в виде одиночных цепей или ассоциированных цепей.

Термины «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к полимерам из нуклеотидов любой длины и включают в себя ДНК и РНК. Нуклеотиды могут представлять собой полинуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания, и/или их аналоги, или любой субстрат, который может быть включен в полимер с помощью ДНК- или РНК-полимеразы. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. При наличии модификация структуры нуклеотида может быть внесена до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может быть прервана ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, например, с помощью конъюгации с метящим компонентом. Другие типы модификации включают в себя, например, «кэпы», замены одного или нескольких встречающихся в природе нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как, например, модификации с незаряженными связями (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы и др.) и с заряженными связями (например, фосфотиоаты, фосфодитиоаты и др.), модификации, содержащие свободные функциональные группы, такие как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и др.), модификации с интеркаляторами (напрмер, акридин, псорален и др.), модификации, содержащие хелаторы (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т.д.), модификации, содержащие алкилаторы, модификации с модифицированными связями (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и др.), а также немодифицированные формы полинуклеотида(полинуклеотидов). Помимо этого, любая из гидроксильных групп, обычно присутствующих в сахарах, могут быть замещены, например, с помощью фосфанатных групп, фосфатных групп, защищенных стандартными защитными группами, или активированы с целью создания дополнительных связей к дополнительным нуклеотидам, или могут быть конъюгированы с твердыми подложками. 5’ и 3’ концевая OH группа может быть фосфорилирована или замещена аминами или фрагментами органических кэп-группировок из 1-20 атомов углерода. Другие гидроксилы также могут быть дериватизированы по отношению к стандартным защитным группам. Полинуклеотиды также могут содержать формы аналогов рибозных или дезоксирибозных сахаров, которые являются общеизвестными в данной области техники, в том числе, например, 2'-O-метил-, 2'-O-аллил, 2'-фтор- или 2'-азидорибозу, аналоги карбоциклических сахаров, α-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и нуклеотидные аналоги с удаленными азотистыми основаниями, такие как метилрибозид. Одна или несколько связей на основе сложного фосфодиэфира могут быть замещены альтернативными связывающими группами. Эти альтернативные связывающие группы включают в себя, но не ограничиваясь ими, варианты осуществления, в которых фосфат замещен P(O)S («тиоат»), P(S)S («дитиоат»), (O)NR₂ («амидат»), P(O)R, P(O)OR’, CO или CH₂ («формацетал»), в которых каждое R или R’ независимым образом представляет собой H или замещенный или незамещенный алкил (1-20 C), необязательно содержащий эфирную (-O-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралдил. Не все связи в полилуклеотиды должны быть одинаковыми. Предшествующее описание применяется по отношению ко всем полинуклеотидам, обозначаемым в данном документе, в том числе РНК и ДНК.

Диагностика или оценка головной боли являются хорошо известными в данной области техники. Литературные источники, такие как International Classification of Headache Disorders, 3^rd edition (ICHD-III beta version; Cephalalgia (2013) 33(9): 629-808), могут быть использованы квалифицированным практиком для оценки типа головной боли, испытываемой пациентом. Головные боли в объеме данного изобретения включают в себя головные боли внутричерепного происхождения. Неограничивающие примеры головных болей внутричерепного происхождения включают в себя мигрень (например, хроническую или эпизодическую) и головную боль, связанную с менингитом, эпидуральным кровоизлиянием, субдуральным кровоизлиянием, субарахноидальным кровоизлиянием и определенными опухолями головного мозга (при которых головная боль является результатом повышенного давления в черепе).

Например, «хроническая мигрень» относится к головной боли, возникающей в течение 15 или больше дней в месяц на протяжении более трех месяцев, которая характеризуется свойствами мигреневой головной боли в течении по меньшей мере 8 дней в месяц. Диагностические критерии хронической мигрени в соответствии с ICHD-III beta version, 2013 представляют собой следующее.

A. Головная боль (типа, подобного напряжению, и/или мигренеподобная) в течение ≥15 дней в месяц на протяжении >3 месяцев и отвечающая критериям B и C (ниже).

B. Возникновение у пациента, который имел по меньшей мере пять приступов, отвечающих определенным критериям мигрени без ауры и/или определенным критериям мигрени с аурой.

C. В течение ≥8 дней в месяц на протяжении >3 месяцев, отвечающая любому из следующего:

1. определенные критерии мигрени без ауры;

2. определенные критерии мигрени с аурой;

3. рассматривается пациентом как мигрень при наступлении и облегчается с помощью производного триптана или алкалоидов спорыньи.

D. Лучше не объясняется другим диагнозом головной боли.

Квалифицированные практики смогут легко распознать субъекта с любым из типов мигреневой головной боли, описанной в данном документе. Оценка может быть выполнена на основе субъективных измерений, таких как характеристика симптомов пациентом. Например, мигрень может быть диагностирована на основе следующих критериев: 1) эпизодические приступы головной боли, продолжающиеся от 4 до 72 часов; 2) с двумя из следующих симптомов: односторонняя боль, пульсация, усиление при движении, и боль умеренной или сильной интенсивности; и 3) один из следующих симптомов: тошнота или рвота, а также фотофобия или фонофобия (Goadsby et al., N. Engl. J. Med. 346:257-270, 2002). В некоторых вариантах осуществления оценка головной боли (например, мигрени) может быть выполнена с помощью количества часов головной боли, как описано в других разделах в данном документе. Например, оценка головной боли (например, мигрени) может быть выполнена с точки зрения ежедневного количества часов головной боли, еженедельного количества часов головной боли, ежемесячного количества часов головной боли и/или ежегодного количества часов головной боли. В некоторых случаях количество часов головной боли может быть таким, как описано субъектом.

Используемый в данном документе термин «лечение» представляет собой подход для получения благоприятных или желательных клинических результатов. В целях данного изобретения благоприятные или желательные клинические результаты включают в себя, но не ограничиваясь ими, одно или несколько из следующего: улучшение любого аспекта головной боли, в том числе уменьшение тяжести, облегчение интенсивности боли и другие ассоциированные симптомы, уменьшение частоты повторного развития, повышение качества жизни лиц, страдающих от головной боли, и снижение дозы других лекарственных препаратов, требующихся для лечения головной боли. С использованием мигрени в качестве примера другие ассоциированные симптомы включают в себя, но не ограничиваясь ими, тошноту, рвоту и чувствительность к свету, звуку и/или движению. Термины «пациент» и «субъект» используются в данном документе взаимозаменяемо. В некоторых вариантах осуществления пациент представляет собой человека.

Используемый в данном документе термин «предупреждение» представляет собой подход к остановке возникновения или существования головной боли у субъекта, который восприимчив к развитию головной боли. Например, пациент может быть ранее диагностирован хронической или эпизодической мигренью. В других примерах пациент мог быть диагностирован менингитом, эпидуральным кровоизлиянием, субдуральным кровоизлиянием, субарахноидальным кровоизлиянием или опухолью головного мозга.

«Снижение частоты возникновения головной боли» или «снижение частоты головной боли» означает любое из снижения тяжести (что может включать в себя снижение необходимости применения и/или количества (например, воздействия) других лекарственных препаратов и/или видов терапии, широко используемых для указанного патологического состояния головной боли), продолжительности и/или частоты (в том числе, например, задержки или увеличения времени до следующего приступа головной боли у индивидуума). Как понятно специалистам в данной области, индивидуумы могут варьироваться с точки зрения их ответа на лечение, и, таким образом, например, «способ снижения частоты головной боли у индивидуума» отражает введение анти-антагонист КГРП антитела на основе логически обоснованного ожидания того, что такое введение может вероятно приводить к такому снижению частоты головной боли у этого конкретно взятого индивидуума.

«Уменьшение» головной боли или одного или нескольких симптомов головной боли означает снижение или нормализацию одного или нескольких симптомов головной боли по сравнению с отсутствием введения анти-антагонист КГРП антитела. «Уменьшение» также включает в себя укорочение или снижение продолжительности симптома.

Используемый в данном документе термин «контроль головной боли» относится к поддержанию или снижению тяжести или продолжительности одного или нескольких симптомов головной боли или частоты приступов головной боли (например, мигрени) у индивидуума (по сравнению с уровнем до лечения). Например, продолжительность или тяжесть головной боли или частота приступов снижается по меньшей мере около на любое из 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или больше у индивидуума по сравнению с продолжительностью или тяжестью головной боли или частотой приступов до лечения.

Используемый в данном документе термин «количество часов головной боли» относится к количеству часов, во время которых субъект испытывает головную боль. Количество часов головной боли может быть выражено с точки зрения целых часов (например, один час головной боли, два часа головной боли, три часа головной боли и т.д.) или с точки зрения количества целых или неполных часов (например, 0,5 часов головной боли, 1,2 часа головной боли, 2,67 часов головной боли и т.д.). Один или несколько часов головной боли могут быть описаны по отношению к определенному интервалу времени. Например, «ежедневное количество часов головной боли» может относиться к числу часов головной боли, которое субъект испытывает в течение дневного интервала (например, 24-часового периода). В другом примере, например, «еженедельное количество часов головной боли» может относиться к числу часов головной боли, которое субъект испытывает в течение недельного интервала (например, 7-дневного периода). Как нетрудно понять, недельный интервал может соответствовать или может не соответствовать календарной неделе. В другом примере, например, «ежемесячное количество часов головной боли» может относиться к числу часов головной боли, которое субъект испытывает в течение месячного интервала. Как нетрудно понять, месячный интервал (например, период из 28, 29, 30 или 31 дней) может варьироваться с точки зрения числа дней в зависимости от определенного месяца и может соответствовать или может не соответствовать календарному месяцу. В еще одном примере, например, «ежегодное количество часов головной боли» может относиться к числу часов головной боли, которое субъект испытывает в течение годового интервала. Как нетрудно понять, годовой интервал (например, период из 365 или 366 дней) может варьироваться с точки зрения числа дней в зависимости от определенного года и может соответствовать или может не соответствовать календарному году.

Используемый в данном документе термин «количество дней головной боли» относится к количеству дней, во время которых субъект испытывает головную боль. Количество дней головной боли может быть выражено с точки зрения целых дней (например, один день головной боли, два дня головной боли, три дня головной боли и т.д.) или с точки зрения количества целых или неполных дней (например, 0,5 дней головной боли, 1,2 дня головной боли, 2,67 дней головной боли и т.д.). Один или несколько дней головной боли могут быть описаны по отношению к определенному интервалу времени. Например, «еженедельное количество дней головной боли» может относиться к числу дней головной боли, которое субъект испытывает в течение недельного интервала (например, 7-дневного периода). Как нетрудно понять, недельный интервал может соответствовать или может не соответствовать календарной неделе. В другом примере, например, «ежемесячное количество дней головной боли» может относиться к числу дней головной боли, которое субъект испытывает в течение месячного интервала. Как нетрудно понять, месячный интервал (например, период из 28, 29, 30 или 31 дней) может варьироваться с точки зрения числа дней в зависимости от определенного месяца и может соответствовать или может не соответствовать календарному месяцу. В еще одном примере, например, «ежегодное количество дней головной боли» может относиться к числу дней головной боли, которое субъект испытывает в течение годового интервала. Как нетрудно понять, годовой интервал (например, период из 365 или 366 дней) может варьироваться с точки зрения числа дней в зависимости от определенного года и может соответствовать или может не соответствовать календарному году.

Используемый в данном документе термин «задержка» развития головной боли означает задержку, затруднение, замедление, сдерживание, стабилизацию и/или отложение прогрессирования заболевания. Эта задержка может быть различной продолжительности во времени в зависимости от анамнеза заболевания и/или индивидуумов, подлежащих лечению. Как очевидно специалисту в данной области техники, достаточная или значительная задержка может фактически включать в себя предупреждение того, что у индивидуума не развивается головная боль. Способ, который «задерживает» развитие симптома, представляет собой способ, который снижает вероятность развития симптома в определенный промежуток времени и/или уменьшает степень симптомов в определенный промежуток времени по сравнению с ситуацией, когда способ не применяется. Такие сравнения в типичном случае основаны на клинических исследованиях с помощью значительного количества субъектов.

«Развитие» или «прогрессирование» головной боли означает начальные проявления и/или последующее прогрессирование нарушения. Развитие головной боли может быть выявлено и оценено с помощью стандартных клинических методик, как хорошо известно в данной области техники. В то же время развитие также относится к прогрессированию, которое может не подлежать выявлению. Для цели данного раскрытия развитие или прогрессирование относится к биологическому течению симптомов. «Развитие» включает в себя появление, повторное развитие и начало проявления. Используемый в данном документе термин «начало проявления» или « появление» головной боли включает в себя исходное начало проявления и/или повторное развитие.

Используемый в данном документе термин «эффективная доза» или «эффективное количество» лекарственного препарата, соединения или композиции представляет собой количество, достаточное для обеспечения благоприятных или желательных результатов. В случае профилактического применения благоприятные или желательные результаты включат в себя результаты, такие как устранение или снижение риска, уменьшение тяжести или задержку начала наступления заболевания, в том числе биохимических, гистологических и/или поведенческих симптомов заболевания, его осложнений и промежуточных патологических фенотипов, присутствующих во время развития заболевания. В случае терапевтического применения благоприятные или желательные результаты включают в себя клинические результаты, такие как снижение интенсивности боли, продолжительности или частоты приступа головной боли, и снижение одного или нескольких симптомов, возникающих в результате головной боли (биохимических, гистологических и/или поведенческих), в том числе ее осложнений и промежуточных патологических фенотипов, присутствующих во время развития заболевания, повышение качества жизни лиц, страдающих от заболевания, снижение дозы других лекарственных препаратов, требуемых для лечения заболевания, усиления эффекта другого лекарственного препарата и/или задержки прогрессирования заболевания у пациентов. Эффективная доза может быть введена в одном или нескольких введениях. Для целей данного раскрытия эффективная доза лекарственного препарата, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для осуществления профилактического или терапевтического лечения, либо прямо, либо косвенно. Как будет понятно в клиническом контексте, эффективная доза лекарственного препарата, соединения или фармацевтической композиции может быть или не может быть достигнута в сочетании с другим лекарственным препаратом, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, «эффективная доза» может рассматриваться в контексте введения одного или нескольких терапевтических агентов, и можно считать, что одно средство вводят в эффективном количестве, если, в сочетании с одним или несколькими другими средствами может быть достигнут или является достигнутым.

Используемый в данном документе термин «аллодиния» относится к боли, испытываемой пациентом и возникающей в результате стимула, который обычно не вызывает боль (International Association for the Study of Pain, 2014-2015, “Allodynia and Hyperalgesia in Neuropathic Pain”).

Используемый в данном документе термин «гипералгезия» относится к усилению боли, испытываемой пациентом в результате стимула, который обычно не вызывает боль (International Association for the Study of Pain, 2014-2015, “Allodynia and Hyperalgesia in Neuropathic Pain”).

Как аллодиния, так и гипералгезия могут различаться и количественно оцениваться специалистом в данной области техники с помощью способов, таких как, например, количественное сенсорное тестирование (QST) (Rolke (2006) et al. Pain 123: 231-243). Rolke et al. дает информацию о справочных материалах касательно QST для получения полного соматосенсорного фенотипа пациента, как в относительных, так и в абсолютных терминах. Например, Rolke et al. описывает тест на чувствительность к механической боли (MPS) в качестве средства выявления гипералгезии в результате уколов. В таком тесте MPS может быть оценена с помощью совокупности стимулов в виде уколов для получения функции стимул-ответ для вызываемой уколами боли (при этом наиболее сильное усилие при уколах составляет около в восемь раз больше по сравнению со средним порогом чувствительности к механической боли). Субъектов могут попросить дать оценку боли в случае каждого стимула по шкале «0-100», при этом «0» указывает на отсутствие боли и «100» указывает на самую большую боль. Определенное количество уколов делают субъекту через определенные интервалы с целью избежания возбуждения. После каждого укола субъект представляет числовые оценки боли. Затем MPS рассчитывают в виде геометрического среднего (показателя соединения) из всех числовых оценок для стимулов в виде уколов (Rolke et al. at p. 233).

Используемый в данном документе термин «сенсибилизация» представляет собой процесс, при котором сила стимула, которая требуется для получения ответа, снижается со временем, в то время как величина ответа возрастает.

Фраза «головная боль, испытываемая главным образом в части головы» относится к описанию пациента, имеющего головную боль (испытываемую в виде, например, боли) в определенной части головы. Примеры «части головы» включают в себя одностороннюю периорбитальную область, одностороннюю височную область, один глаз, небольшую область сзади головы (например, непосредственно сбоку от средней линии), небольшую область на макушке головы, небольшую область в середине лба, «точку» (например, 10 x 10 мм), где надглазничный нерв выходит из черепа (т.е., в медиальном конце брови), и небольшую область вдоль лба. Специалист в данной области будет способен оценить испытывает ли пациент головную боль в части головы на основании описания пациента (Noseda, R. et al. (2016) Brain. 139 (7): 1971-1986).

A. Способы и виды применения анти-КГРП антител для снижения частоты головной боли

В данном документе предложен способ снижения частоты головной боли (например, мигрени) у пациента. Указанный способ включает в себя отбор пациента, испытывающего головную боль, опосредованную активацией и сенсибилизацией высокопороговых (HT) нейронов (например, в результате распространяющейся корковой депрессии (CSD), в ответ на любую васкулярную дилатацию в оболочках головного мозга, или входящие болевые сигналы от оболочек головного мозга). Затем пациента лечат анти-КГРП антителом.

Отбор пациента включает в себя определение того, опосредована ли головная боль пациента HT нейронами. Квалифицированным практикам будет понятно, что такое определение может быть сделано с помощью любого числа путей, описанных в данном документе, например, с помощью наблюдения активности HT нейронов и/или введения моноклонального антитела, которое модулирует путь с участием КГРП для пациента, и определения того, снижает ли антитело гипералгезию (измеряемую, например, с помощью QST), и/или определения того, локализована ли головная боль пациента (например, испытываемая наиболее интенсивно или главным образом) в части головы.

В Примере 5 описаны средства, с помощью которых нейроны можно было идентифицировать и выбрать (HT и WDR нейроны) у крысы. В указанном примере дополнительно описаны наблюдения, выполненные в связи с активацией и сенсибилизацией каждого из этих типов нейронов после индукции CSD.

Пациенты, которые испытывают гипералгезию, при этом гипералгезия ослабляется (например, обращается или устраняется) при введении моноклонального антитела, которое модулирует (например, блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет) путь с участием КГРП, вероятно, отвечают на курс лечения, содержащий моноклональное антитело, которое модулирует (например, блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет) путь с участием КГРП, например, более длительный курс лечения и/или курс лечения с более высокими дозами анти-КГРП антитела. Если анти-КГРП антитело ослабляет головную боль у пациентов, страдающих гипералгезией, это подтверждает, что головная боль была опосредована HT нейронами, поскольку анти-КГРП антитело не ингибирует другой класс ноцицептивных рецепторов, WDR, как показано в Примере 5. В Примере 6 описана экспериментальная схема QST, которая является пригодной в определении того, испытывает ли пациент гипералгезию, и ослабляется ли она при лечении анти-КГРП антителом.

Аналогичным образом, пациент, который испытывает аллодиния, при этом аллодиния ослабляется (например, обращается или устраняется) при введении моноклонального антитела, которое модулирует (например, блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет) путь с участием КГРП, вероятно, отвечает на курс лечения, содержащий моноклональное антитело, которое модулирует (например, блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет) путь с участием КГРП, например, более длительный курс лечения и/или курс лечения с более высокими дозами анти-КГРП антитела.

Таким образом, пациент, который отвечает на лечение анти-КГРП антителом, может испытывать снижение, обращение или устранение как гипералгезии, так и аллодинии после первого курса лечения.

Помимо этого, известно, что высокопороговые нейроны характеризуются небольшими рецептивными полями, в то время как нейроны с широким динамическим диапазоном характеризуются большими рецептивными полями. Таким образом, головная боль, локализованная (или главным образом испытываемая) в части головы, может определять пациента, который будет отвечать благоприятным образом на лечение моноклональным антителом, которое модулирует путь с участием КГРП.

Соответственно, одна стратегия лечения включает в себя: a) отбор пациента, у которого наблюдается гипералгезия, облегчаемая в результате введения первого моноклонального антитела, которое модулирует путь с участием КГРП; и b) введение пациенту второго моноклонального антитела, которое блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет путь с участием КГРП в количестве, достаточном для снижения частоты головной боли у пациента. В таких видах лечения первые и вторые моноклональные антитела, вводимые пациенту, могут принадлежать одному и тому же типу анти-КГРП антитела или различным типам анти-КГРП антител, и каждое может быть введено пациенту внутривенно или подкожно, или и то и другое. Например, каждое из первого и второго моноклональных антител независимо может быть выбрано из анти-антагонист КГРП антитела и анти-рецептор КГРП антитела. В некоторых схемах лечения первое и второе моноклональные антитела могут представлять собой анти-антагонист КГРП антитела. В других первое моноклональное тело может представлять собой анти-антагонист КГРП антитело, в то время как второе моноклональное антитело может представлять собой анти-рецептор КГРП антитело. Первое и второе моноклональные антитела могут быть человеческими или гуманизированными. Каждое из первого и/или второго моноклональных антител может быть выбрано независимо от антител IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

В некоторых случаях первое и/или второе моноклональные антитела вводят в то время, когда пациент не имеет головной боли (например, не имеет мигрени). В других вариантах осуществления первое и/или второе моноклональное антитело вводят в то время, когда пациент испытывает головную боль (например, мигрень).

В случаях, когда пациент испытывает мигрень, введение предпочтительно происходит вскоре после начала наступления мигрени. Например, введение может происходить, когда пациент испытывает продромы (т.е., симптомы, которые предшествуют головной боли, такие как аура), но до фазы головной боли.

В еще одном варианте осуществления пациент диагностирован или был ранее диагностирован как имеющий эпизодическую или хроническую мигрень. У такого пациента первое и/или второе моноклональное антитело может быть введено тогда, когда пациент не имеет мигрени, или испытывает ранние стадии мигрени или слабую мигрень.

В другом варианте осуществления пациент диагностирован или был ранее диагностирован как имеющий менингит, эпидуральное кровоизлияние, субдуральное кровоизлияние, субарахноидальное кровоизлияние или опухоль головного мозга. В этих примерах головная боль может быть связана с менингитом, эпидуральным кровоизлиянием, субдуральным кровоизлиянием, субарахноидальным кровоизлиянием или опухолью головного мозга.

Квалифицированным практикам будет понятно, что антитело(антитела) может(могут) быть введено(введены) пациенту с помощью любого способа, известного в данной области техники. Например, антитело(антитела) может(могут) быть введено(введены) пациенту с помощью с помощью предварительно заполненного шприца, предварительно заполненного шприца с защитным устройством иглы, шприца-ручки, автоматического медицинского шприца или любой их комбинации.

Особенно пригодными в качестве первого и/или второго моноклональных антител являются анти-КГРП антитела, которые содержат а) CDR H1, приведенную в SEQ ID NO:3; CDR H2, приведенную в SEQ ID NO:4; CDR H3, приведенную в SEQ ID NO:5; CDR L1, приведенную в SEQ ID NO:6; CDR L2, приведенную в SEQ ID NO:7; и CDR L3, приведенную в SEQ ID NO:8, или включают в себя b) вариант антитела в соответствии с (a), как показано в Табл. 5. В некоторых вариантах осуществления первое и/или второе моноклональные антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления первое и/или второе моноклональные антитела содержат тяжелую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:11, и легкую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:12. Иллюстративное моноклональное антитело представляет собой фреманезумаб (также обозначаемый в данном документе как «G1»).

После отбора пациента первое и/или второе моноклональное антитело может быть введено в дозе от около 225 мг до около 900 мг, например, в дозе около 225 мг, около 250 мг, около 275 мг, около 300 мг, около 325 мг, около 350 мг, около 375 мг, около 400 мг, около 425 мг, около 450 мг, около 475 мг, около 500 мг, около 500 мг, около 525 мг, около 550 мг, около 550 мг, около 575 мг, около 600 мг, около 625 мг, около 650 мг, около 675 мг, около 700 мг, около 725 мг, около 750 мг, около 775 мг, около 800 мг, около 825 мг, около 850 мг, около 875 мг или около 900 мг. Эти дозы можно вводить пациенту один раз в месяц или один раз в квартал. При одном иллюстративном лечении режим дозирования включает в себя начальную дозу (например, 675 мг) и дополнительно включает в себя введение пациенту дополнительной дозы, составляющей 225 мг моноклонального антитела, один раз в месяц в каждом из двух месяцев (или трех месяцев, четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев или двенадцати месяцев), следующих за месяцем в котором пациент получает начальную дозу.

Первое и/или второе моноклональное антитело может быть введение в виде части любого пригодного состава и в любом объеме состава. Особенно пригодным является состав, содержащий антитело в концентрации по меньшей мере около 150 мг/мл (например, около 175 мг/мл, около 200 мг/мл, около 225 мг/мл, около 250 мг/мл, около 275 мг/мл, около 300 мг/мл, около 325 мг/мл, около 350 мг/мл, около 375 мг/мл, около 400 мг/мл, около 425 мг/мл, около 450 мг/мл или больше). Также пригодными являются составы, в которых моноклональное антитело может быть введено в объеме, составляющем менее чем 2 мл (например, около 1,8 мл, около 1,7 мл, около 1,6 мл, около 1,5 мл, около 1,4 мл, около 1,3 мл, около 1,2 мл, около 1,1 мл, около 1,0 мл, около 0,9 мл, около 0,8 мл, около 0,7 мл, около 0,6 мл, около 0,5 мл или меньше). В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело предпочтительно вводят в объеме, составляющем около 1,5 мл. Любая из доз, предложенных в данном документе (например, около 225 мг, около 675 мг или около 900 мг), может быть введена внутривенно или подкожно. Например, фреманезумаб может быть введен в дозе около 225 мг один раз в месяц или один раз в квартал, и может быть введен подкожно.

Также пригодными в способах лечения, описанных в данном документе, являются первое и/или второе моноклональные антитела, которые содержат CDR H1, приведенную в SEQ ID NO:87; CDR H2, приведенную в SEQ ID NO:88; CDR H3, приведенную в SEQ ID NO:89; CDR L1, приведенную в SEQ ID NO:84; CDR L2, приведенную в SEQ ID NO:85; и CDR L3, приведенную в SEQ ID NO:86. В некоторых вариантах осуществления первое и/или второе моноклональные антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:82, и вариабельную область легкой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:80. В некоторых вариантах осуществления первое и/или второе моноклональные антитела содержат тяжелую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:83, и легкую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:81. Примером такого антитела будет являться эптинезумаб. Указанное антитело может быть введено в дозе около 100 мг, около 150 мг, около 200 мг, около 250 мг, около 300 мг, около 350 мг, около 400 мг, около 450 мг, около 500 мг, около 600 мг, около 700 мг, около 800 мг, около 900 мг или около 1000 мг. Любая из доз, предложенных в данном документе (например, около 100 мг, около 300 мг или около 1000 мг) может быть введена внутривенно или подкожно.

Также пригодными являются первое и/или второе моноклональные антитела, которые содержат CDR H1, приведенную в SEQ ID NO:93; CDR H2, приведенную в SEQ ID NO:94; CDR H3, приведенную в SEQ ID NO:95; CDR L1, приведенную в SEQ ID NO:91; CDR L2, приведенную в SEQ ID NO:92; и CDR L3, приведенную в SEQ ID NO:90. В некоторых вариантах осуществления первое и/или второе моноклональные антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:97, и вариабельную область легкой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:96. В некоторых вариантах осуществления первое и/или второе моноклональные антитела содержат тяжелую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:99, и легкую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:98. Примером такого антитела будет являться галканезумаб. Указанное антитело может быть введено в дозе около 100 мг, около 120 мг, около 150 мг, около 200 мг, около 240 мг, около 250 мг, около 300 мг, около 350 мг, около 360 мг, около 400 мг, около 450 мг, около 480 мг, около 500 мг, около 600 мг, около 700 мг, около 800 мг, около 900 мг или около 1000 мг. Помимо этого, доза 120 мг может быть введена в объеме около 1,5 мл, а доза 240 мг может быть введена в объеме около 3 мл. Любая из доз, предложенных в данном документе (например, около 120 мг или около 240 мг), могут быть введены внутривенно или подкожно.

Также пригодными являются первое и/или второе моноклональные антитела, которые содержат CDR H1, приведенную в SEQ ID NO:103; CDR H2, приведенную в SEQ ID NO:104; CDR H3, приведенную в SEQ ID NO:105; CDR L1, приведенную в SEQ ID NO:100; CDR L2, приведенную в SEQ ID NO:101; и CDR L3, приведенную в SEQ ID NO:102. В некоторых вариантах осуществления первое и/или второе моноклональные антитела содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:107, и вариабельную область легкой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:106. В некоторых вариантах осуществления первое и/или второе моноклональные антитела содержат тяжелую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:109, и легкую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:108. Примером такого антитела будет являться эренумаб. Эренумаб может быть введен в дозе около 40 мг, около 50 мг, около 60 мг, около 70 мг, около 80 мг, около 90 мг, около 100 мг, около 110 мг, около 120 мг, около 130 мг, около 140 мг, около 150 мг, около 160 мг, около 170 мг, около 180 мг, около 190 мг, около 200 мг, около 210 мг. Помимо этого, доза 70 мг может быть введена в объеме около 1 мл. Доза 140 мг может быть введена в объеме, составляющем около 2 мл. Любая из доз, предложенных в данном документе (например, около 70 мг или около 140 мг), могут быть введены внутривенно или подкожно.

Соответственно, в определенных способах, описанных в данном документе, моноклональное антитело, подлежащее использованию в способах, описанных в данном документе, может быть выбрано из группы, состоящей из фреманезумаба, эптинезумаба, галканезумаба, эренумаба и их биоэквивалентов.

Введение анти-КГРП антитела может быть выполнено с помощью любых средств, известных в данной области техники, в том числе: перорально, внутривенно, подкожно, интраартериально, внутримышечно, интраназально (например, с ингаляцией или без ингаляции), интракардиально, интраспинально, интраторакально, интраперитонеально, интравентрикулярно, сублингвально, трансдермально и/или с помощью ингаляции. Введение может быть системным, например, внутривенно, или локальным. В некоторых вариантах осуществления начальную дозу и одну или несколько дополнительных доз вводят с помощью одного и того же пути, т.е., подкожно или внутривенно. В некоторых вариантах осуществления одну или несколько дополнительных доз вводят с помощью другого пути, чем в случае начальной дозы, т.е., начальная доза может быть введена внутривенно, а одна или несколько дополнительных доз могут быть введены подкожно.

В некоторых случаях способы, описанные в данном документе, могут дополнительно включать введение пациенту второго агента одновременно или последовательно с моноклональным антителом. Второй агент может представлять собой нестероидные противовоспалительные препараты (NSAID) и/или триптаны и/или агонист 5-гдирокситриптамин 1F рецептора (т.е., агонист серотонинового рецептора). В некоторых случаях второй агент представляет собой агент, который вводят пациенту профилактически.

Неограничивающие примеры NSAID, которые могут быть использованы в комбинации с анти-КГРП антителом, включают в себя аспирин, диклофенак, дифлузинал, этодолак, фенбуфен, фенопрофен, флуфенизал, флурбипрофен, ибупрофен, индометацин, кетопрофен, кеторолак, меклофенамовую кислоту, мефенамовую кислоту, набуметон, напроксен, оксапрозин, фенилбутазон, пироксикам, сулиндак, толметин или зомепирак, ингибиторы циклооксигеназы-2 (COX-2), селекоксиб, рофекоксиб, мелоксикам, JTE-522, L-745,337, NS398 или их фармацевтически приемлемую соль.

Неограничивающие примеры триптанов, которые могут быть использованы в комбинации с анти-КГРП антителом, включают в себя суматриптан, золмитриптан, наратриптан, ризатриптан, элетриптан, алмотриптан и афроватриптан.

Неограничивающий пример агониста 5-гидрокситриптамин 1F рецептора представляет собой ласмидитан.

Предупреждение, лечение или снижение в способах, предложенных в данном документе, могут включать в себя снижение количества часов головной боли любой тяжести, снижение количества часов мигрени любой тяжести, снижение количества дней головной боли в месяц, снижение количества дней мигрени любой тяжести в месяц, снижение применения любых лекарственных препаратов от головной боли, снижение балла инвалидности в тесте оценки влияния головной боли из 6 пунктов (HIT-6), повышение балла краткого опросника по оценке состояния здоровья из 12 пунктов (SF-12) (Ware et al., Med. Care 4:220-233, 1996), снижение балла по шкале оценки пациентом общего впечатления об изменении собственного состояния (PGIC) (Hurst et al., J. Manipulative Physiol. Ther. 27:26-35, 2004), повышение балла в инструменте 3 оценки сотрясения мозга в спорте (SCAT-3) (McCrory et al. British J. Sport. Med. 47:263-266, 2013) или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления количество дней головной боли или мигрени в месяц может быть снижено в течение по меньшей мере семи дней после однократного введения.

В некоторых вариантах осуществления количество часов головной боли или мигрени в месяц, испытываемых субъектом после указанного введения, снижается на 40 или больше часов (например, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 или больше) от уровня до введения у субъекта. Количество часов головной боли или мигрени в месяц может быть снижено на более чем 60 часов. В некоторых вариантах осуществления количество часов головной боли или мигрени, испытываемых субъектом после указанного введения, снижается на 25% или больше (например, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% или больше) по отношению к уровню до введения у субъекта. Количество часов головной боли или мигрени в месяц может быть снижено на 40% или больше. В некоторых вариантах осуществления количество дней головной боли или мигрени в месяц, испытываемых субъектом после указанного введения, снижается на три или больше дней (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше дней) от уровня до введения у субъекта. В некоторых вариантах осуществления количество дней головной боли или мигрени в месяц может быть снижено на по меньшей мере около 50% от уровня до введения у субъекта. Таким образом, в некоторых аспектах количество дней головной боли или мигрени в месяц может быть снижено на по меньшей мере около 50%, на по меньшей мере около 55%, на по меньшей мере около 60%, на по меньшей мере около 65%, на по меньшей мере около 70%, на по меньшей мере около 75%, на по меньшей мере около 80% или на по меньшей мере около 90%.

B. Анти-КГРП антитела для применения в способах лечения

В некоторых вариантах осуществления в способах, предложенных в данном документе, используется антитело, которое может представлять собой анти-антагонист КГРП антитело. Анти-антагонист КГРП антитело может относиться к любой молекуле антитела, которое модулирует (например, блокирует, подавляет или ослабляет соответственно) биологическую активность КГРП, в том числе нисходящие пути, опосредованные передачей сигнала с участием КГРП, такие как связывание и/или активация клеточного ответа в отношении КГРП.

Анти-антагонист КГРП антитело может проявлять одну или несколько из следующих характеристик: (a) связываться с КГРП; (b) блокировать связывание КГРП с его рецептором(рецепторами); (c) блокировать или снижать активацию рецепторов КГРП (в том числе, но не ограничиваясь ею, активацию цАМФ); (d) ингибировать биологическую активность КГРП или нисходящие пути, опосредованные функцией передачи сигнала с участием КГРП; (e) предупреждать, нормализовать или лечить любой аспект мигрени; (f) повышать клиренс КГРП; и (g) ингибировать (ослаблять) синтез, продуцирование или высвобождение КГРП. Анти-антагонист КГРП антитела известны в данной области техники. См., например, Tan et al., Clin. Sci. (Lond). 89:565-73, 1995; Sigma (Миссури, США), номер продукта C7113 (клон № 4901); Plourde et al., Peptides 14:1225-1229, 1993.

В некоторых вариантах осуществления антитело реагирует с КГРП таким образом, что оно ингибирует КГРП, и/или пусть с участием КГРП, в том числе нисходящие пути, опосредованные функцией передачи сигнала с участием КГРП. В некоторых вариантах осуществления анти-антагонист КГРП антитело распознает КГРП человека. В некоторых вариантах осуществления анти-антагонист КГРП антитело связывается как с α-КГРП человека, так и с β-КГРП человека. В некоторых вариантах осуществления анти-антагонист КГРП антитело связывается КГРП человека и крысы. В некоторых вариантах осуществления анти-антагонист КГРП антитело связывает C-концевой фрагмент, имеющий аминокислоты 25-37 КГРП. В некоторых вариантах осуществления анти-антагонист КГРП антитело связывает C-концевой эпитоп в пределах аминокислот 25-37 КГРП.

Анти-КГРП антитела, пригодные в данном изобретении, могут включать в себя моноклональные антитела, поликлональные антитела, фрагменты антител (например, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fc и др.), химерные антитела, биспецифичские антитела, гетероконъюгатные антитела, одноцепочечные фрагменты (ScFv), их мутантные формы, слитые белки, содержащие часть антитела (например, доменное антитело), гуманизированные антитела и любую другую модифицированную конфигурацию иммуноглобулиновой молекулы, которая содержит сайт распознавания антигена требуемой специфичности, в том числе варианты гликозилирования антител, варианты аминокислотной последовательности антител и ковалентно модифицированные антител. Антитела могут быть мышиными, крысиными, человеческими или любого другого происхождения (в том числе химерные или гуманизированные антитела).

В некоторых вариантах осуществления анти-антагонист КГРП антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления анти-антагонист КГРП антитело является гуманизированным. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления антитело является человеческим. В некоторых вариантах осуществления анти-антагонист КГРП антитело представляет собой антитело G1 (описанное в данном документе). В некоторых вариантах осуществления анти-антагонист КГРП антитело содержит одну или несколько CDR (например, одну, два, три, четыре, пять или в некоторых вариантах осуществления все шесть CDR) антитела G1 или вариантов G1, показанные в Табл. 5. В еще одних вариантах осуществления анти-антагонист КГРП антитело содержит аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную на Фиг. 5 (SEQ ID NO:1), и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную на Фиг. 5 (SEQ ID NO:2). В еще одних вариантах осуществления анти-антагонист КГРП антитело содержит полноразмерную аминокислотную последовательность тяжелой цепи, показанную в SEQ ID NO:11, и полноразмерную аминокислотную последовательность легкой цепи, показанную в SEQ ID NO:12.

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR) и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), выбранные из группы, состоящей из: (a) LCVR17 (SEQ ID NO:58) и HCVR22 (SEQ ID NO:59); (b) LCVR18 (SEQ ID NO:60) и HCVR23 (SEQ ID NO:61); (c) LCVR19 (SEQ ID NO:62) и HCVR24 (SEQ ID NO:63); (d) LCVR20 (SEQ ID NO:64) и HCVR25 (SEQ ID NO:65); (e) LCVR21 (SEQ ID NO:66) и HCVR26 (SEQ ID NO:67); (f) LCVR27 (SEQ ID NO:68) и HCVR28 (SEQ ID NO:69); (g) LCVR29 (SEQ ID NO:70) и HCVR30 (SEQ ID NO:71); (h) LCVR31 (SEQ ID NO:72) и HCVR32 (SEQ ID NO:73); (i) LCVR33 (SEQ ID NO:74) и HCVR34 (SEQ ID NO:75); (j) LCVR35 (SEQ ID NO:76) и HCVR36 (SEQ ID NO:77); и (k) LCVR37 (SEQ ID NO:78) и HCVR38 (SEQ ID NO:79). Последовательности этих областей предложены в данном документе. Другие примеры анти-КГРП антител описаны в публикациях заявки на патент США №№ US 2011/0305711 (SEQ ID NO:5, 6, 7, 12, 16, 19, 24, 29, 34 и 39), US 2012/0294802, US 2012/0294797 (SEQ ID NO:51-60), которые включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Например, могут быть использованы антитела с любой из следующих последовательностей.

Белковая последовательность вариабельной области легкой цепи АТ6 (гуманизированного) (US20120294797)

QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO:80)

Полноразмерная белковая последовательность легкой цепи АТ6 (гуманизированного) (US20120294797)

QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:81)

Белковая последовательность вариабельной области тяжелой цепи АТ6 (гуманизированного) (US20120294797)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:82)

Полноразмерная белковая последовательность тяжелой цепи АТ6, продуцированного с помощью дрожжевых грибов (US20120294797)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:83)

Белковая последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи АТ6 (гуманизированного) (US20120294797)

QASQSVYHNTYLA (SEQ ID NO:84)

Белковая последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи АТ6 (гуманизированного) (US20120294797)

DASTLAS (SEQ ID NO:85)

Белковая последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи АТ6 (гуманизированного) (US20120294797)

LGSYDCTNGDCFV (SEQ ID NO:86)

Белковая последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи АТ6 (гуманизированного) (US20120294797)

GYYMN (SEQ ID NO:87)

Белковая последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи АТ6 (гуманизированного) (US20120294797)

IGINGATYYASWAKG (SEQ ID NO:88)

Белковая последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи АТ6 (гуманизированного) (US20120294797)

GDI (SEQ ID NO:89)

Белковая последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи (US20110305711)

QQGDALPPT (SEQ ID NO:90)

Белковая последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи (US20110305711)

RASKDISKYL (SEQ ID NO:91)

Белковая последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи (US20110305711)

YTSGYHS (SEQ ID NO:92)

Белковая последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (US20110305711)

GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO:93)

Белковая последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи (US20110305711)

AIYEGTGKTVYIQKFAD (SEQ ID NO:94)

Белковая последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (US20110305711)

LSDYVSGFGY (SEQ ID NO:95)

Белковая последовательность вариабельной области легкой цепи (US20110305711)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSGYHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDALPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:96)

Белковая последовательность вариабельной области тяжелой цепи (US20110305711)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGTGKTVYIQKFADRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSDYVSGFGYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:97)

Белковая последовательность легкой цепи (US20110305711)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSGYHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDALPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:98)

Белковая последовательность тяжелой цепи (US20110305711)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGTGKTVYIQKFADRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSDYVSGFGYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG (SEQ ID NO:99)

В некоторых вариантах осуществления антитело содержит модифицированную константную область, такую как константную область, которая является иммунологически инертной, описанную в данном документе.

Аффинность связывания (K_D) анти-антагонист КГРП антитела по отношению к КГРП (такому как α-КГРП человека) может составлять от около 0,02 до около 200 нM. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания составляет любое из около 200 нМ, около 100 мM, около 50 нM, около 10 нM, около 1 нM, около 500 пM, около 100 пM, около 60 пM, около 50 пM, около 20 пM, около 15 пM, около 10 пM, около 5 пM или около 2 пM. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания составляет менее чем любое из около около 250 мM, около 200 нM, около 100 нM, около 50 нM, около 10 нM, около 1 нM, около 500 пM, около 100 пM или около 50 пM.

В некоторых вариантах осуществления анти-рецептор КГРП антитело может быть использовано в любом из способов, описанных в данном документе. Например, могут быть использованы анти-рецептор КГРП антитела, описанные в публикации заявки на патент США № 2010/0172895 и патенте США № 9102731, которые включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Таким образом, могут быть использованы антитела с любой из следующих последовательностей.

Белковая последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи (патент США № 9102731)

SGSSSNIGNNYVS (SEQ ID NO:100)

Белковая последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи (патент США № 9102731)

DNNKRPS (SEQ ID NO:101)

Белковая последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи (патент США № 9102731)

GTWDSRLSAVV (SEQ ID NO:102)

Белковая последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (патент США № 9102731)

SFGMH (SEQ ID NO:103)

Белковая последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи (патент США № 9102731)

VISFDGSIKYSVDSVKG (SEQ ID NO:104)

Белковая последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (патент США № 9102731)

DRLNYYDSSGYYHYKYYGMAV (SEQ ID NO:105)

Белковая последовательность вариабельной области легкой цепи (патент США № 9102731)

QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSTTLGITGLQTGDEADYYCGTWDSRLSAVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:106)

Белковая последовательность вариабельной области тяжелой цепи (патент США № 9102731)

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSIKYSVDSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRLNYYDSSGYYHYKYYGMAVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:107)

Белковая последовательность легкой цепи (патент США № 9102731)

MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSTTLGITGLQTGDEADYYCGTWDSRLSAVVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO:108)

Белковая последовательность тяжелой цепи (патент США № 9102731)

MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSIKYSVDSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRLNYYDSSGYYHYKYYGMAVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:109)

C. Антитело G1 и родственные антитела, полипептиды, полинуклеотиды, векторы и клетки хозяев

В данном документе предложены способы снижения частоты головной боли у пациента, в том числе с помощью композиций (например, фармацевтических композиций), содержащих антитело G1 и его варианты, показанные в Табл. 5, или полипептида, происходящего из антитела G1 и его вариантов, показанных в Табл. 5; и полинуклеотидов, содержащих последовательности, кодирующие G1 и его варианты или полипептид. В некоторых вариантах осуществления композиции, используемые в способах, предложенных в данном документе, содержат одно или несколько антител или полипепетидов (которые могут представлять собой или могут не представлять собой антитело), которые связываются с КГРП, и/или один или несколько полинуклеотидов, содержащих последовательности, кодирующие один или несколько полипептидов, которые связываются с КГРП. Эти композиции могут дополнительно содержать подходящие наполнители, такие как фармацевтически приемлемые наполнители, в том числе буферы, которые хорошо известны в данной области техники.

Анти-антагонист КГРП антитела и полипептиды, пригодные в способах, описанных в данном документе, могут быть охарактеризованы с помощью любой (одной или нескольких) из следующих характеристик: (a) способности связываться с КГРП; (b) способности блокировать связывание КГРП с его рецептором(рецепторами); (c) способности блокировать или снижать активацию рецепторов КГРП (в том числе активацию цАМФ); (d) способности ингибировать биологическую активность КГРП или нисходящие пути, опосредованные функцией передачи сигнала с участием КГРП; (e) способности предупреждать, нормализовать или лечить любой аспект головной боли (например, мигрени); (f) способности повышать клиренс КГРП; и (g) способности ингибировать (ослаблять) синтез, продуцирование или высвобождение КГРП.

В способах, описанных в данном документе, пригодны любые из следующих или композиции (в том числе фармацевтические композиции), содержащие любое из следующих: (a) антитело G1 или его варианты, показанные в Табл. 5; (b) фрагмент или область антитела G1 или его вариантов, показанные в Табл. 5; (c) легкая цепь антитела G1 или его вариантов, показанные в Табл. 5; (d) тяжелая цепь антитела G1 или его вариантов, показанные в Табл. 5; (e) одна или несколько вариабельных областей из легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела G1 или его вариантов, показанных в Табл. 5; (f) одна или несколько CDR (одна, две, три, четыре, пять или шесть CDR) антитела G1 или его вариантов, показанных в Табл. 5; (g) CDR H3 из тяжелой цепи антитела G1; (h) CDR L3 из легкой цепи антитела G1 или его вариантов, показанных в Табл. 5; (i) три CDR из легкой цепи антитела G1 или его вариантов, показанных в Табл. 5; (j) три CDR из тяжелой цепи антитела G1 или его вариантов, показанных в Табл. 5; (k) три CDR из легкой цепи и три CDR из тяжелой цепи антитела G1 или его вариантов, показанных в Табл. 5; и (l) антитело, содержащее любое из (b)-(k). В некоторых случаях способы включают в себя применение полипептидов, содержащих любой один или несколько из вышеуказанного.

Части CDR антитела G1 (в том числе CDR в соответствии с нумерацией Чотиа и Кабат) в виде диаграммы представлены на Фиг. 5. Определение областей CDR находится полностью в пределах компетенции специалиста в данной области. Квалифицированным практикам будет понятно, что CDR могут представлять собой комбинацию CDR в соответствии с нумерацией Кабат или Чотиа (также обозначаемые «комбинированные CDR» или «удлиненные CDR»). В некоторых случаях CDR представляют собой CDR в соответствии с нумерацией Кабат, а в других случаях CDR представляют собой CDR в соответствии с нумерацией Чотиа. Другими словами, в некоторых случаях, в которых пригодными являются более одной CDR, CDR могут представлять собой любое из CDR в соответствии с нумераций Кабат, Чотиа, комбинированной нумерации или их комбинации.

В способах, описанных в данном документе, может использоваться полипептид (который может представлять собой или может не представлять собой антитело), который содержит по меньшей мере одну CDR, по меньшей мере две, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или все шесть CDR, которые по сути идентичны по меньшей мере одной CDR, по меньшей мере двум, по меньшей мере трем, по меньшей мере четырем, по меньшей мере пяти или всем шести CDR G1 или его вариантов, показанных в Табл. 5. Способы могут включать применение антител, которые имеют по меньшей мере два, три, четыре, пять или шесть CDR, которые по сути идентичны по меньшей мере двум, трем, четырем, пяти или шести CDR G1 или происходят из G1. В некоторых случаях по меньшей мере одна, две, три, четыре, пять или шесть CDR являются на по меньшей мере около 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичными по меньшей мере одной, двум, трем, четырем, пяти или шести CDR G1 или его вариантов, показанных в Табл. 5.

В способах, предложенных в данном документе, может использоваться полипептид (который может представлять собой или может не представлять собой антитело), который содержит аминокислотную последовательность G1 или его вариантов, показанных в Табл. 5, который имеет любое из следующего: по меньшей мере 5 заменимых аминокислот, по меньшей мере 8 заменимых аминокислот, по меньшей мере около 10 заменимых аминокислот, по меньшей мере около 15 заменимых аминокислот, по меньшей мере около 20 заменимых аминокислот, по меньшей мере около 25 заменимых аминокислот, по меньшей мере около 30 заменимых аминокислот последовательности G1 или его вариантов, показанных в Табл. 5, при этом по меньшей мере 3 из аминокислот происходят из вариабельной области G1 (Фиг. 5) или его вариантов, показанных в Табл. 5. Например, вариабельная область может происходить из легкой цепи G1 или тяжелой цепи G1. Иллюстративный полипептид имеет заменимую аминокислоту (длины, описанные в данном документе) из вариабельных областей как тяжелых, так и легких цепей G1. В другом варианте осуществления 5 (или больше) заменимых аминокислот происходят из области, определяющей комплементарность (CDR) G1, показанного на Фиг. 5. В некоторых вариантах осуществления заменимые аминокислот происходят из вариабельной области G1.

Аффинность связывания (K_D) анти-антагонист КГРП антитела и полипептида по отношению к КГРП, используемому в способах, предложенных в данном документе (такому как α-КГРП человека), может составлять от около 0,06 до около 200 нM. Например, аффинность связывания может составлять любое из около 200 нМ, около 100 мM, около 50 нM, около 10 нM, около 1 нM, около 500 пM, около 100 пM, около 60 пM, около 50 пM, около 20 пM, около 15 пM, около 10 пM, около 5 пM или около 2 пM. В других примерах аффинность связывания составляет менее чем любое из около около 250 мM, около 200 нM, около 100 нM, около 50 нM, около 10 нM, около 1 нM, около 500 пM, около 100 пM или около 50 пM.

В способах, предложенных в данном документе, могут применяться одноцепочечные фрагменты вариабельных областей («scFv») антител, описанных в данном документе, таких как G1. Одноцепочечные фрагменты вариабельных областей получают в результате связывания вариабельных областей легких и/или тяжелых цепей с помощью короткого линкерного пептида. Bird et al. (1988) Science 242:423-426.

Гуманизированное антитело, содержащее одну или несколько CDR антитела G1 или его вариантов, показанных в Табл. 5, или одну или несколько CDR, происходящих из антитела G1 или его вариантов, показанных в Табл. 5, может быть получено с помощью любых способов, известных в данной области техники.

В некоторых случаях в способах, описанных в данном документе, может использоваться антитело G1, содержащее модификации, такие как модификации, показанные в Табл. 5, в том числе функционально эквивалентные антитела, которые значительно не влияют на их свойства, и варианты, которые имеют повышенную или сниженную активность и/или аффинность. Например, аминокислотная последовательность G1 или его вариантов, показанных в Табл. 5, может подвергаться мутированию с целью получения антитела с необходимой аффинностью связывания в отношении КГРП. Примеры модифицированных полипептидов включают в себя полипептиды с консервативными заменами аминокислотных остатков, одной или несколькими делециями или добавлениями аминокислот, которые существенно отрицательным образом не изменяют функциональную активность, или применение химических аналогов.

Модификации также включают в себя гликозилированные и негликозилированные полипептиды, а также полипептиды с другими посттрансляционными модификациями, такими как, например, гликозилирование с различными сахарами, ацетилирование и фосфорилирование. Методики для достижения указанного типа модификации хорошо известны в данной области техники.

Композиции (такие как фармацевтические композиции), содержащие полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, описанные в данном документе, могут быть использованы в описанных в данном изобретении способах. В некоторых случаях композиция может содержать экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий антитело G1 и/или любое из антител или полипептидов, описанных в данном документе. Например, композиция может содержать любой из двух или оба из полинуклеотидов, показанных в SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10. Пригодные экспрессионные векторы и способы введения полинуклеотидных композиций известны в данной области техники и дополнительно описаны в данной документе.

D. Композиции

В некоторых вариантах осуществления композиции, используемые в способе, предложенном в данном документе, содержат эффективное количество анти-КГРП антитела или происходящего из антитела пептида, описанного в данном документе. Композиция (например, лекарственный препарат или терапевтический состав) может дополнительно содержать фармацевтически приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы (Remington: The Science and practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover). Допустимые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов при используемых дозах и концентрациях.

Антитело (например, анти-антагонист КГРП или анти-рецептор КГРП антитело) и композиции на его основе, предложенные в данном документе, также могут быть использованы в сочетании с другими агентами, которые способствуют усилению и/или дополнению эффективности антитела.

E. Наборы

В данном документе также предложены наборы для применения в способах данного изобретения. Наборы могут содержать контейнеры, содержащие антитело, описанное в данном документе (например, анти-антагонист КГРП антитело (такое как гуманизированное антитело)) или полипептид, описанный в данном документе, и инструкции для применения в соответствии с любым из способов, описанных в данном документе. Как правило, эти инструкции содержат описание введения антитела для отбора и лечения пациента в соответствии с любым из способов, описанных в данном документе. Например, набор может содержать описание того, как отобрать пациента, подходящего для лечения, на основании определения того, имеет ли этот пациент головную боль (например, головную боль внутричерепного происхождения), опосредованную активацией и сенсибилизацией HT нейронов. В еще одних вариантах осуществления инструкции содержат описание того, как вводить моноклональное антитело (например, анти-КГРП антитело) пациенту с целью снижения частоты головной боли.

Соответственно, набор может содержать, например, предварительно заполненный шприц, предварительно заполненный шприц с защитным устройством иглы, шприц-ручку или автоматический медицинский шприц, содержащие дозу моноклонального антитела, которое модулирует путь с участием кальцитонин ген-родственного пептида (КГРП); и инструкции для определения того, опосредована ли головная боль пациента активацией высокопороговых (HT) нейронов. В качестве альтернативы или в качестве дополнения в инструкциях может быть описано, как определять то, проявляет ли пациент гипералгезию, ослабляемую в результате введения моноклонального антитела, которое модулирует (например, блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет) путь с участием КГРП, и/или как определять то, испытываются ли головные боли пациента главным образом в части головы (например, односторонние периорбитальные, односторонние височные или в области одного глаза).

Другой иллюстративный набор может содержать моноклональное антитело, которое модулирует путь с участием КГРП и подробные инструкции в отношении того, как назначать QST пациенту, или инструкции в отношении проведения опроса пациента и анализа ответов с целью определения того, испытывается ли головная боль пациента главным образом в части головы (например, односторонние периорбитальные, односторонние височные или в области одного глаза).

Помимо инструкций, связанных с определением респондеров, наборы могут дополнительно содержать инструкции для дальнейшего лечения моноклональным антителом (например, анти-антагонист КГРП или анти-рецептор КГРП антитело), в том числе информацию, связанную с дозой, графиком дозирования и путем введения предполагаемого лекарственного препарата (например, инструкции с целью достижения снижения частоты головной боли после того, как пациент идентифицирован в качестве респондера в соответствии с инструкциями набора).

В наборе, предложенном в данном документе, моноклональное антитело, предложенное в наборе, может содержать CDR H1, приведенную в SEQ ID NO:3; CDR H2, приведенную в SEQ ID NO:4; CDR H3, приведенную в SEQ ID NO:5; CDR L1, приведенную в SEQ ID NO:6; CDR L2, приведенную в SEQ ID NO:7; и CDR L3, приведенную в SEQ ID NO:8. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, предложенное в наборе, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, предложенное в наборе, содержит тяжелую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:11, и легкую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:12.

В качестве альтернативы или в качестве дополнения моноклональное антитело, предложенное в наборе, может содержать CDR H1, приведенную в SEQ ID NO:87; CDR H2, приведенную в SEQ ID NO:88; CDR H3, приведенную в SEQ ID NO:89; CDR L1, приведенную в SEQ ID NO:84; CDR L2, приведенную в SEQ ID NO:85; и CDR L3, приведенную в SEQ ID NO:86. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, предложенное в наборе, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:82, и вариабельную область легкой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:80. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, предложенное в наборе, содержит тяжелую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:83, и легкую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:81.

В качестве альтернативы или в качестве дополнения моноклональное антитело, предложенное в наборе, может содержать CDR H1, приведенную в SEQ ID NO:93; CDR H2, приведенную в SEQ ID NO:94; CDR H3, приведенную в SEQ ID NO:95; CDR L1, приведенную в SEQ ID NO:91; CDR L2, приведенную в SEQ ID NO:92; и CDR L3, приведенную в SEQ ID NO:90. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, предложенное в наборе, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:97, и вариабельную область легкой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:96. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, предложенное в наборе, содержит тяжелую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:99, и легкую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:98.

В качестве альтернативы или в качестве дополнения моноклональное антитело, предложенное в наборе, может содержать CDR H1, приведенную в SEQ ID NO:103; CDR H2, приведенную в SEQ ID NO:104; CDR H3, приведенную в SEQ ID NO:105; CDR L1, приведенную в SEQ ID NO:100; CDR L2, приведенную в SEQ ID NO:101; и CDR L3, приведенную в SEQ ID NO:102. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, предложенное в наборе, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:107, и вариабельную область легкой цепи, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:106. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, предложенное в наборе, содержит тяжелую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:109, и легкую цепь, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:108.

Моноклональное антитело, предложенное в наборе, может представлять собой фреманезумаб, эптинезумаб, галканезумаб, эренумаб или любой их эквивалент. Квалифицированным практикам будет понятно, что набор может содержать комбинацию любого из вышеизложенных антител.

Наборы по данному изобретению могут быть предложены в подходящей упаковке. Подходящая упаковка включает в себя, но не ограничиваясь ими, флаконы, бутыли, банки, гибкую упаковку (например, закупоренные пакеты из майлара или пластиковые пакеты) и т.п. Также предусмотрены упаковки для применения в комбинации с конкретным изделием, таким как ингалятор, устройство для назального применения (например, атомизатор) или инфузионное устройство, такое как мининасос. Набор может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может содержать мешок с раствором для внутривенного введения или флакон, имеющий пробку, прокалываемую подкожной инъекционной иглой). Контейнер может также иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может содержать мешок с раствором для внутривенного введения или флакон, имеющий пробку, прокалываемую подкожной инъекционной иглой). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой анти-антагонист КГРП антитело и/или моноклональное антитело, которое модулирует путь с участием КГРП. Контейнер может дополнительно содержать второй фармацевтически активный агент.

Наборы могут необязательно предусматривать дополнительные компоненты, такие как буферы и интерпретирующая информация. Обычно набор содержит контейнер и этикетку или листок-вкладыш(листки-вкладыши) на контейнере или вместе с контейнером.

Следующие Примеры предложены для иллюстрации, а не для ограничения данного изобретения. Понятно, что примеры и варианты осуществления, описанные в данном документе, представлены только для иллюстративных целей, и что различные модификации или изменения в их свете будут предложены специалистам в данной области техники и включены в сущность и сферу действия данной заявки. Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в данном документе, тем самым включены посредством ссылки в полном объеме для всех целей в той же степени, как если бы каждая отельная публикация, патент или патентная заявка были особо и отдельно указаны для включения посредством ссылки.

Примеры

Пример 1: Получение и характеристика моноклональных антител, направленных против КГРП

Получение анти-КГРП антител. Для получения анти-КГРП антител, которые имеют межвидовую перекрестную реактивность в случае КГРП крысы и человека, мышей иммунизировали с помощью 25-100 мкг α-КГРП или β-КГРП человека, конъюгированных с KLH в адъюванте (50 мкг на подушечку стопы, 100 мкл в общей сложности на мышь) через различные интервалы. Иммунизацию в целом осуществляли, как описано в Geerligs HJ et al., 1989, J. Immunol. Methods 124:95-102; Kenney JS et al., 1989, J. Immunol. Methods 121:157-166; и Wicher K et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89:128-135. Мышей сначала иммунизировали с помощью 50 мкг α-КГРП или β-КГРП человека, конъюгированных с KLH в CFA (полном адъюванте Фрейнда). Через 21 день мышей вторично иммунизировали с помощью 25 мкг β-КГРП человека (для мышей, сначала иммунизированных с помощью α-КГРП человека) или α-КГРП человека (для мышей, сначала иммунизированных с помощью β-КГРП человека), конъюгированных с KLH в IFA (неполном адъюванте Фрейнда). Через двадцать три дня после второй иммунизации выполняли третью иммунизацию с помощью 25 мкг α-КГРП крысы, конъюгированной с KLH в IFA. Через десять дней титры антител исследовали с помощью ИФА. Четвертую иммунизацию выполняли с помощью 25 мкг пептида (α-КГРП крысы-KLH) в IFA через 34 дня после третьей иммунизации. Конечный бустер выполняли с помощью 100 мкг растворенного пептида (α-КГРП крысы) через 32 дня после четвертой иммунизации.

Спленоциты получали от иммунизированной мыши и сливали с клетками миеломы NSO в соотношении 10:1 с использованием полиэтиленгликоля 1500. Гибриды высевали в 96-луночные планшеты в DMEM, содержащей 20% лошадиную сыворотку, и начинали отбор с помощью смеси оксалоацетат/пируват/инсулин (Sigma) и смеси гипоксантин/аминоптерин/тимидин. На 8-й день 100 мкл DMEM, содержащей 20% лошадиную сыворотку, добавляли во все лунки. Супернатанты гибридов подвергали скринингу с помощью иммунологического анализа на основе захвата антител. Определение класса антител выполняли с помощью классоспецифических вторичных антител.

Панель клеточных линий, продуцирующих моноклональные антитела, отбирали на основе их связывания с КГРП человека и крысы для дополнительной характеристики. Указанные антитела и характеристики показаны ниже в Табл. 1 и 2.

Очистка и получение фрагментов Fab. Моноклональные антитела, выбранные для дополнительной характеристики, очищали от супернатантов культур гибридом с помощью аффинной хроматографии с использованием белка A. Супернатанты уравновешивали до значения pH 8. Затем супернатанты загружали в колонку с использованием белка A MabSelect (Amersham Biosciences № 17-5199-02), уравновешенную PBS до значения pH 8. Колонку промывали с помощью 5 объемов колонки PBS, pH 8. Антитела элюировали с помощью 50 мМ цитратно-фосфатного буфера, pH 3. Элюированные антитела нейтрализовали с помощью 1 M фосфатного буфера, pH 8. Очищенные антитела диализировали с помощью PBS, pH 7,4. Концентрации антитела определяли с помощью SDS-PAGE, с использованием стандартной кривой мышиного антитела.

Fab получали с помощью папаинового протеолиза полноразмерных антител с использованием набора Immunopure Fab (Pierce № 44885) и очищали с помощью пропускания через хроматографическую колонку с использованием белка A в соответствии с инструкциями производителя. Концентрации определяли с помощью ИФА и/или ДСН-ПААГ электрофореза с использованием стандартной Fab известной концентрации (определяемой с помощью анализа аминокислот), и с помощью A280 с использованием 1OD = 0,6 мг/мл (или теоретического эквивалента на основе аминокислотной последовательности).

Определение аффинности Fab. Аффинности анти-КГРП моноклональных антител определяли либо при 25°C, либо при 37°C с помощью системы поверхностного плазмонного резонанса BIACORE3000™ (SPR) (Biacore, INC, Пискатауэй, Нью-Джерси) с использованием собственного подвижного буфера, HBS-EP (10 мM HEPES, pH 7,4, 150 мM NaCl, 3 мM EDTA, 0,005% об./об. полисорбата P20). Аффинность определяли с помощью захвата биотинилированных на N-конце пептидов КГРП (заказанных у GenScript Corporation, Нью-Джерси, или Global Peptide Services, Колорадо) с помощью предварительно иммобилизированного стрептавидина на SA чипе, и измерения кинетики связывания Fab антитела, титрованного в пределах поверхности с КГРП. Биотинилированный КГРП разводили в HBS-EP и вводили сверху чипа в концентрации менее 0,001 мг/мл. С помощью варьирующего времени потока в пределах отдельных каналов чипа, получали два диапазона плотности антигенов: <50 единиц ответа (RU) для детальных исследований кинетики и около 800 RU для исследований концентраций и скрининга. Двух- или трехкратные последовательные разведения, в типичном случае в концентрациях в диапазоне 1мкM-0,1 нM (рассчитанные при 0,1-10x оцененном K_D), очищенных Fab фрагментов вводили в течение 1 минуты при 100 мкл/мин и времени диссоциации 10 минут. После каждого цикла связывания поверхности регенерировали с помощью 25 мM NaOH в 25% об./об. этанола, который использовался в течение сотен циклов. Скорость ассоциации (k_on) и скорость диссоциации (k_off) получали одновременно с помощью подгонки данных по отношению к модели связывания Ленгмюра 1:1 (Karlsson et al. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) с использованием программы BIAevaluation. Константы диссоциации полного равновесия (K_D) или «аффинности» рассчитывали из соотношения K_D = k_off/k_on. Аффинности мышиных Fab фрагментов показаны в Табл. 1 и 2.

Картирование эпитопов мышиных анти-КГРП антител. Для определения эпитопа, который связывают анти-КГРП антитела на α-КГРП человека, аффинности связывания Fab фрагментов с различными фрагментами КГРП измеряли, как описано выше, с помощью захвата биотинилированных на N-конце фрагментов КГРП аминокислот 19-37 и аминокислот 25-37 на SA сенсорном чипе. На Фиг. 1 продемонстрированы их аффинности связывания, измеренные при 25°C. Как показано на Фиг. 1, все антитела, помимо антитела 4901, связываются с фрагментами 19-37 и 25-37 α-КГРП человека с аффинностью, аналогичной их аффинности связывания с полноразмерным α-КГРП человека (1-37). Антитело 4901 связывается с фрагментом 25-37 α-КГРП человека с аффинностью, которая в шесть раз ниже, чем при связывания с полноразмерным фрагментом α-КГРП, вследствие главным образом уменьшения скорости диссоциации. Данные указывают на то, что эти анти-КГРП антитела, как правило, связываются с C-терминальным концом КГРП.

Сканирование аланином выполняли для дополнительной характеристики аминокислот в α-КГРП человека, участвующем в связывании анти-КГРП антител. Различные варианты α-КГРП человека с единичными аланиновыми заменами получали с помощью пептидного синтеза. Их аминокислотные последовательности показаны в Табл. 3 наряду со всеми другими пептидами, используемыми в анализе Biacore. Аффинности Fab фрагментов анти-КГРП антител в отношении указанных вариантов определяли с помощью Biacore, как описано выше. Как продемонстрировано на Фиг. 1, все 12 антител целенаправленно воздействуют на C-концевой эпитоп, при этом аминокислота F37 является наиболее важным остатком. Мутация F37 до аланина приводила к значительному снижению аффинности или даже к полному нокауту связывания анти-КГРП антител с пептидом. Следующим наиболее важным аминокислотным остатком является G33, в то же время, только высокоаффинные антитела (7E9, 8B6, 10A8 и 7D11) нарушались в результате аланинового замещения в указанном положении. Аминокислотный остаток S34 также играет значительную, хотя и меньшую, роль в связывании указанных четырех высокоаффинных антител.

Таблица 1. Характеристики связывания анти-КГРП моноклональных антител с αКГРП человека и их антагонистическая активность

Антитела	KD α-КГРП человека при 25°C (нM)	KD α-КГРП человека при 37°C (нM)	Клеточное блокирование связывания α-КГРП человека с его рецептором при 25°C (измеряемое с помощью активации cAMP)	IC50 (нM, связывающие сайты) при 25° C (комн. темп.), измеряемая в анализе радиолигандного связывания
7E9	1,0	0,9	Да	2,5
8B6	1,1	1,2	Да	4,0
10A8	2,1	3,0	Да	н.о.
7D11	4,4	5,4	Да	н.о.
6H2	9,3	42	Да	12,9
4901	61	139	Да	58
14E10	80	179	Да	н.о.
9B8	85	183	Нет	н.о.
13C2	94	379	Нет	н.о.
14A9	148	581	Нет	н.о.
6D5	210	647	Нет	н.о.
1C5	296	652	Нет	н.о.

Примечание: антитело 4901 является коммерчески доступным (Sigma, № продукта C7113).

н.о. = не определено.

Таблица 2. Характеристики связывания анти-КГРП моноклональных антител с αКГРП крысы и их антагонистическая активность

Антитела	KD α-КГРП крысы при 37°C (нM)	Клеточное блокирование связывания α-КГРП крысы с его рецептором при 25°C (измеряемое с помощью активации cAMP)	Анализ блокирования подкожного нерва in vivo
4901	3,4	Да	Да
7E9	47	Да	Да
6H2	54	Нет	Нет
8B6	75	Да	Да
7D11	218	Да	Да
10A8	451	Нет	н.о.
9B8	876	Нет	н.о.
14E10	922	Нет	н.о.
13C2	> 1000	Нет	н.о.
14A9	> 1000	Нет	н.о.
6D5	> 1000	Нет	н.о.
1C5	> 1000	Нет	н.о.

«н.о.» означает, что исследование в отношении антитела не проводили.

Таблица 3. Аминокислотные последовательности фрагментов α-КГРП человека (SEQ ID NO:15-40) и родственных пептидов (SEQ ID NO:41-47). Все пептиды являются амидированными на C-конце, за исключением SEQ ID NO:36-40. Остатки, обозначенные жирным шрифтом, указывают точечные мутации.

КГРП	Аминокислотная последовательность	SEQ ID NO
1-37 (ДТ)	ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF	15
8-37	VTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF	16
19-37	SGGVVKNNFVPTNVGSKAF	17
P29A (19-37)	SGGVVKNNFVATNVGSKAF	18
K35A (19-37)	SGGVVKNNFVPTNVGSAAF	19
K35E (19-37)	SGGVVKNNFVPTNVGSEAF	20
K35M (19-37)	SGGVVKNNFVPTNVGSMAF	21
K35Q (19-37)	SGGVVKNNFVPTNVGSQAF	22
F37A (19-37)	SGGVVKNNFVPTNVGSKAA	23
25-38A	NNFVPTNVGSKAFA	24
25-37	NNFVPTNVGSKAF	25
F27A (25-37)	NNAVPTNVGSKAF	26
V28A (25-37)	NNFAPTNVGSKAF	27
P29A (25-37)	NNFVATNVGSKAF	28
T30A (25-37)	NNFVPANVGSKAF	29
N31A (25-37)	NNFVPTAVGSKAF	30
V32A (25-37)	NNFVPTNAGSKAF	31
G33A (25-37)	NNFVPTNVASKAF	32
S34A (25-37)	NNFVPTNVGAKAF	33
F37A (25-37)	NNFVPTNVGSKAA	34
26-37	NFVPTNVGSKAF	35
19-37-COOH	SGGVVKNNFVPTNVGSKAF	36
19-36-COOH	SGGVVKNNFVPTNVGSKA	37
1-36-COOH	ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKA	38
1-19-COOH	ACDTATCVTHRLAGLLSRS	39
1-13-COOH	ACDTATCVTHRLA	40
α-вариант крысы (1-37)	SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSEAF	41
α-вариант крысы (19-37)	SGGVVKDNFVPTNVGSEAF	42
β-вариант человека (1-37)	ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF	43
β-вариант крысы (1-37)	SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSKAF	44
Кальцитонин человека (1-32)	CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP	45
Амилин человека (1-37)	KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY	46
Адреномедуллин человека (1-52)	YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDK DKDNVAPRSKISPQGY	47

Пример 2 Скрининг анти-антагонист КГРП антител с помощью анализов in vitro.

Мышиные анти-КГРП антитела подвергали дополнительному скринингу в отношении антагонистической активности in vitro с помощью клеточного анализа активации цАМФ и анализа связывания.

Антагонистическая активность, измеряемая с помощью анализа цАМФ. Пять микролитров α-КГРП человека или крысы (конечная концентрация 50 нM) в присутствии или в отсутствии анти-КГРП антитела (конечная концентрация 1-3000 нM), или α-КГРП крысы или α-КГРП человека (конечная концентрация 0,1 нМ-10 мкM; в качестве положительного контроля в случае активации цАМФ) распределяли в 384-луночный планшет (Nunc, № по кат. 264657). Десять микролитров клеток (SK-N-MC человека, если использовали α-КГРП человека, или L6 крысы из ATCC, если использовали α-КГРП крысы) в буфере для стимуляции (20 мM HEPES, pH 7,4, 146 мM NaCl, 5 мM KCl, 1 мM CaCl₂, 1 мM MgCl₂ и 500 мкM 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX)) добавляли в лунки планшета. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут.

После инкубации выполняли активацию цАМФ с помощью анализа HitHunter™ Enzyme Fragment Complementation (Applied Biosystems) в соответствии с инструкцией производителя. Анализ основан на генетически сконструированном ферменте β-галактозидазе, который состоит из двух фрагментов, называемых акцептор фермента (EA) и донор фермента (ED). Если указанные два фрагмента разделены, то фермент является неактивным. Если указанные фрагменты находятся вместе, то они могут спонтанно рекомбинировать с образованием активного фермента в результате процесса, называемого комплементацией. Платформа для анализа EFC использует пептидный конъюгат ED-цАМФ, в котором цАМФ распознается анти-цАМФ. Указанный фрагмент ED способен к реассоциации с EA с образованием активного фермента. В указанном анализе анти-цАМФ антитело оптимально титруют с целью связывания с конъюгатом ED-цАМФ и ингибирования образования фермента. Уровни цАМФ в образцах клеточного лизата конкурируют с конъюгатом ED-цАМФ за связывание с анти-цАМФ антителом. Количество свободного конъюгата ED в анализе пропорционально концентрации цАМФ. Таким образом, цАФМ измеряется с помощью образования активного фермента, который количественно определяется с помощью оборота люминесцентного субстрата β-галактозидазы. Анализ активации цАМФ выполняли с помощью добавления 10 мкл буфера для лизиса и анти-цАМФ антитела (соотношение 1:1) после инкубации при комнатной температуре в течение 60 минут. Затем 10 мкл реагента ED-цАМФ добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 60 минут при комнатной температуре. После инкубации 20 мкл реагента EA и смеси CL (содержащей субстрат) (соотношение 1:1) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1-3 часов или в течение ночи при комнатной температуре. Планшет считывали при 1 секунда/лунка на инструменте PMT или 30 секунд/место на визуализаторе. Антитела, которые ингибируют активацию цАМФ с помощью α-КГРП, идентифицировали (обозначено как «да») в Табл. 1 и 2 выше. Данные в Табл. 1 и 2 указывают на то, что антитела, которые демонстрировали антагонистическую активность в анализе, как правило имеют высокую аффинность. Например, антитела, имеющие значение K_D (определенное при 25°C), составляющее около 80 нM или меньше по отношению к α-КГРП человека, или имеющие значение K_D (определенное при 37°C), составляющее около 47 нM или меньше по отношению к α-КГРП крысы, показали антагонистическую активность в указанном анализе.

Анализ радиолигандного связывания. Анализ связывания выполняли с целью измерения IC₅₀ анти-КГРП антитела в блокировании связывания КГРП с рецептором, как описано ранее. Zimmermann et al., Peptides 16:421-4, 1995; Mallee et al., J. Biol. Chem. 277:14294-8, 2002. Мембраны (25 мкг) из клеток SK-N-MC инкубировали в течение 90 минут при комнатной температуре в буфере для инкубации (50 мM Tris-HCl, pH 7,4, 5 мM MgCl₂, 0,1% BSA), содержащем 10 пM ¹²⁵I-α-КГРП человека в общем объеме, составляющем 1 мл. Для определения ингибирующих концентраций (IC₅₀) антитела или немеченый КГРП (в качестве контроля) из около в 100 раз более концентрированного рабочего раствора растворяли при различных концентрациях в буфере для инкубации и инкубировали в одно и то же время с мембранами и 10 пM ¹²⁵I-α-КГРП человека. Инкубирование прекращали в результате фильтрации с помощью стеклянного микроволокнистого фильтра (GF/B, 1 мкм), который блокировали с помощью 0,5% полиэтиленимина. Строили кривые доза-ответ и значения K_i определяли с помощью уравнения: K_i = IC₅₀/(1+([лиганд]/K_D); при этом равновесная константа диссоциации K_D = 8 пM в случае α-КГРП человека в отношении рецептора КГРП1, присутствующего в клетках SK-N-MC, и B_max = 0,025 пмоль/мг белка. Описанное значение IC₅₀ (с точки зрения молекул IgG) превращали в сайты связывания (в результате умножения его на 2), чтобы его можно было сравнить с аффинностями (K_D), определенными с помощью Biacore (см. Табл. 1).

В Табл. 1 показано значение IC₅₀ мышиных антител 7E9, 8B6, 6H2 и 4901. Данные указывают на то, что аффинность антител, как правило, коррелирует со значениями IC₅₀: антитела с более высокой аффинностью (более низкие значения K_D) имеют более низкое значение IC₅₀ в анализе радиолигандного связывания.

Пример 3: Влияние анти-антагонист КГРП антител на вазодилатацию кожи, индуцированную стимуляцией подкожного нерва крысы

С целью исследования антагонистической активности анти-КГРП антител, влияние антител на вазодилатацию кожи в результате стимуляции подкожного нерва крысы исследовали с помощью крысиной модели, описанной ранее. Escott et al., Br. J. Pharmacol. 110:772-776, 1993. В указанной крысиной модели электрическая стимуляция подкожного нерва индуцирует высвобождение КГРП из нервных окончаний, приводя к повышению кровотока в коже. Кровоток в коже стопы самцов крыс Sprague Dawley (170-300 г, от Charles River Hollister) измеряли после стимуляции подкожного нерва. Крыс поддерживали после анестезии с использованием 2% изофлурана. Бретилий тозилат (30 мг/кг, вводимый в/в) вводили в начале эксперимента с целью минимизации вазоконстрикции в результате одновременной стимуляции симпатических волокон подкожного нерва. Температуру тела поддерживали при 37°C с помощью применения ректального датчика, термостатически соединенного с терморегулируемой электрической грелкой. Соединения, в том числе антитела, положительный контроль (КГРП 8-37), и носитель (PBS, 0,01% Tween 20) вводили внутривенно через правую бедренную вену, за исключением эксперимента, показанного на Фиг. 3, исследуемое соединение и контроль вводили через хвостовую вену, и в случае экспериментов, показанных на Фиг. 2A и 2B, антитела 4901 и 7D11 вводили интраперитонеально (IP). Соединение положительного контроля КГРП 8-37 (антагонист вазодилатации), вследствие своего короткого периода полужизни, вводили за 3-5 минут до стимуляции нерва при 400 нмоль/кг (200 мкл). Tan et al., Clin. Sci. 89:656-73, 1995. Антитела вводили в различных дозах (1 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг и 25 мг/кг).

В случае экспериментов, показанных на Фиг. 2A и 2B, антитело 4901 (25 мг/кг), антитело 7D11 (25 мг/кг) или контроль носителем (PBS с 0,01% Tween 20) вводили интраперитонеально (IP) за 72 часа до стимуляции электрическими импульсами. В случае эксперимента, показанного на Фиг. 3, антитело 4901 (1 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5 мг/кг или 25 мг/кг) или контроль носителем (PBS с 0,01% Tween 20) вводили внутривенно за 24 часа до стимуляции электрическим импульсом. После введения антител или контроля носителем подкожный нерв правой задней конечности подвергали хирургическому воздействию, перерезали проксимально и покрывали пластмассовой оберткой, чтобы предупредить высыхание. Лазерный допплеровский датчик помещали на медиодорсальную сторону кожи задней лапы, которая находится в области, иннервируемой подкожным нервом. Кровоток в коже, измеряемый в виде потока клеток крови, контролировали с помощью лазерного допплеровского измерителя потока. Когда устойчивый поток исходного уровня (менее 5% вариации) устанавливался в течение по меньшей мере 5 минут, нерв помещали над платиновыми биполярными электродами и электрически стимулировали 60 импульсами (2 Гц, 10 В, 1 мс, в течение 30 секунд) и затем повторно через 20 минут. Кумулятивное изменение кровотока в коже оценивали с помощью площади под кривой поток-время (AUC, которая равноценна изменению потока, умноженному на изменение времени) для каждого ответа потока на стимуляцию электрическими импульсами. Использовали среднее ответа кровотока на две стимуляции. Животных содержали под анестезией в течение периода от одного до трех часов.

Как показано на Фиг. 2A и Фиг. 2B, повышение кровотока в результате использования электрических импульсов в отношении подкожного нерва ингибировали с помощью присутствия КГРП 8-37 (400 нмоль/кг, вводимого в/в), антитела 4901 (25 мг/кг, вводимого IP) или антитела 7D11 (25 мг/кг, вводимого IP) по сравнению с контролем. КГРП 8-37 вводили за 3-5 минут до стимуляции подкожного нерва; и антитела вводили за 72 часа до стимуляции подкожного нерва. Как показано на Фиг. 3, повышение кровотока, стимулированного с помощью использования электрических импульсов в отношении подкожного нерва, ингибировали с помощью присутствия антитела 4901 в различных дозах (1 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5 мг/кг и 25 мг/кг), вводимых внутривенно за 24 часа до стимуляции подкожного нерва.

В случае экспериментов, показанных на Фиг. 4A и 4B, подкожный нерв подвергали хирургическому воздействию до введения антител. Подкожный нерв правой задней конечности подвергали хирургическому воздействию, перерезали проксимально и покрывали пластмассовой оберткой, чтобы предупредить высыхание. Лазерный допплеровский датчик помещали на медиодорсальную сторону кожи задней лапы, которая находится в области, иннервируемой подкожным нервом. Кровоток в коже, измеряемый в виде потока клеток крови, контролировали с помощью лазерного допплеровского измерителя потока. Через тридцать-сорок пять минут после инъекции бретилия тозилата, когда устойчивый поток исходного уровня (менее 5% вариации) устанавливался в течение по меньшей мере 5 минут, нерв помещали над платиновыми биполярными электродами и электрически стимулировали (2 Гц, 10 В, 1 мс, в течение 30 секунд) и повторно через 20 минут. Среднее ответа потока кровотока на эти две стимуляции использовали для определения ответа исходного уровня (время 0) на электрическую стимуляцию. Антитело 4901 (1 мг/кг или 10 мг/кг), антитело 7E9 (10 мг/кг), антитело 8B6 (10 мг/кг) или носитель (PBS с 0,01% Tween 20) затем вводили внутривенно (в/в). Затем нерв стимулировали (2 Гц, 10 В, 1 мс, в течение 30 секунд) через 30 минут, 60 минут, 90 минут и 120 минут после введения антител или носителя. Животных содержали под анестезией в течение периода примерно трех часов. Кумулятивное изменение кровотока в коже оценивали с помощью площади под кривой поток-время (AUC, которая равноценна изменению потока, умноженному на изменение времени) для каждого ответа потока на стимуляцию электрическими импульсами.

Как продемонстрировано на Фиг. 4A, повышение кровотока, стимулированное с помощью использования электрических импульсов в отношении подкожного нерва, значительно ингибировали с помощью присутствия антитела 4901 1 мг/кг, введенного в/в, когда стимуляцию электрическими импульсами использовали через 60 минут, 90 минут и 120 минут после введения антитела, а повышение кровотока, стимулированное с помощью использования электрических импульсов в отношении подкожного нерва, значительно ингибировали с помощью присутствия антитела 4901 10 мг/кг, вводимого в/в, когда стимуляцию электрическими импульсами использовали через 30 минут, 60 минут, 90 минут и 120 минут после введения антитела. На Фиг. 4B продемонстрировано, что повышение кровотока, стимулированное электрическими импульсами в отношении подкожного нерва, значительно ингибировали с помощью присутствия антитела 7E9 (10 мг/кг, вводимого в/в), когда стимуляцию электрических импульсов использовали через 30 минут, 60 минут, 90 минут и 120 минут после введения антител, и с помощью присутствия антитела 8B6 (10 мг/кг, вводимого в/в), когда стимуляцию электрическими импульсами использовали через 30 минут после введения антител.

Эти данные указывают на то, что антитела 4901, 7E9, 7D11 и 8B6 являются эффективными в блокировании активности КГРП, измеренной с помощью вазодилатации кожи, индуцированной стимуляцией подкожного нерва крысы.

Пример 4 Характеристика анти-КГРП антитела G1 и его вариантов

Аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи анти-КГРП антитела G1 показаны на Фиг. 5. Следующие способы использовали для экспрессии и характеристики антитела G1 и его вариантов.

Используемый экспрессионный вектор. Экспрессия Fab фрагмента антител находилась под контролем индуцируемого IPTG промотора lacZ, аналогичного промотору, описанному в Barbas (2001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press pg. 2.10. Vector pComb3X), однако модификации включали в себя добавление и экспрессию следующих дополнительных доменов: константного домена легкой цепи каппа человека и константного домена CH1 иммуноглобулина человека IgG2, С-области цепи Ig гамма-2, номер доступа к белку P01859; легкой цепи каппа иммуноглобулина (Homo sapiens), номер доступа к белку CAA09181.

Получение Fab в малом масштабе. Из E. coli, трансформированной (либо с помощью компетентных в отношении электропорации клеток TG1, либо с помощью химически компетентных 10 приоритетных клеток) библиотекой Fab, единичные колонии использовали для инокуляции как основного планшета (агар LB + карбенициллин (50 мкг/мл) + 2% глюкоза), так и рабочего планшета (2 мл/лунка, 96-луночный планшет), при этом каждая лунка содержала 1,5 мл LB + карбенициллин (50 мкг/мл) + 2% глюкоза. Газопроницаемую клейкую пленку (ABgene, Сюррей, Великобритания) наносили на планшет. Оба планшета инкубировали при 30°C в течение 12-16 часов; рабочий планшет тщательно встряхивали. Основной планшет хранили при 4°C до надобности, в то время как клетки из рабочего планшета осаждали (4000 об/мин, 4°C, 20 минут) и ресуспендировали в 1,0 мл LB + карбенициллин (50 мкг/мл) + 0,5 мM IPTG с целью индукции экспрессии Fab с помощью энергичного встряхивания в течение 5 часов при 30°C. Индуцированные клетки центрифугировали при 4000 об/мин, 4°C в течение 20 минут и ресуспендировали в 0,6 мл буфера HB-SEP Biacore (10 мМ HEPES, pH 7,4, 150 мM NaCl, 3 мM EDTA, 0,005% об./об. P20). Лизис ресуспендированных в HB-SEP клеток выполняли с помощью замораживания (80°C) и последующего размораживания при 37°C. Клеточные лизаты центрифугировали при 4000 об/мин, 4°C в течение 1 часа с отделением осадка от Fab-содержащих супернатантов, которые затем фильтровали (0,2 мкм) с помощью 96-луночного фильтрационного планшета аналитической системы Millipore MultiScreen и вакуумного коллектора. Biacore использовали для анализа отфильтрованных супернатантов с помощью их инъекции в направлении КГРП на сенсорном чипе. Отобранные в отношении аффинности клоны, экспрессирующие Fab, восстанавливали из основного планшета, который обеспечивал получение матричной ДНК для ПЦР, секвенирование и получение плазмид.

Получение Fab в крупном масштабе. Для получения кинетических параметров Fab экспрессировали в более крупном масштабе следующим образом. Конические колбы Эрленмейера, содержащие 150 мл LB + карбенициллин (50 мкг/мл) + 2% глюкозу, инокулировали 1 мл «стартерной» культуры, полученной в течение ночи, из отобранного в отношении аффинности клона Fab-экспрессирующих E. coli. Остаток стартерной культуры (~3 мл) использовали для получения плазмидной ДНК (QIAprep mini-prep, набор Qiagen) для секвенирования и последующей обработки. Крупную культуру инкубировали при 30°C с помощью энергичного встряхивания до тех пор, пока не достигали OD_600nm, составляющее 1,0 (в типичном случае 12-16 ч). Клетки осаждали с помощью центрифугирования при 4000 об/мин, 4°C в течение 20 минут, и ресуспендировали в 150 мл LB + карбенициллин (50 мкг/мл) + 0,5 мM IPTG. Через 5 часов после экспрессии при 30°C клетки осаждали с помощью центрифугирования при 4000 об/мин, 4°C в течение 20 минут, ресуспендировали в 10 мл буфера HBS-EP Biacore и лизировали с помощью одного цикла замораживания (-80°C)/размораживания (37°C). Клеточные лизаты осаждали с помощью центрифугирования при 4000 об/мин, 4°C в течение одного часа и супернатант собирали и фильтровали (0,2 мкм). Отфильтрованные супернатанты загружали на колонки с сефарозой быстрого потока Ni-NTA (Qiagen, Валенсия, Калифорния), уравновешенные с помощью PBS, pH 8, затем размораживали с помощью 5 объемов колонки PBS, pH 8. Отдельные Fab элюировали в различных фракциях с помощью PBS (pH 8) + 300 мM имидазола. Фракции, содержащие Fab, объединяли и диализировали в PBS, затем количественно оценивали с помощью ИФА до характеристики аффинности.

Получение полноразмерных антител. В случае экспрессии полноразмерных антител вариабельные области тяжелых и легких цепей клонировали в экспрессионные векторы млекопитающих и трансфицировали с помощью липофектамина в клетки HEK 293 для временной экспрессии. Антитела очищали с помощью белка A с использованием стандартных способов.

Вектор pDb.CGRP.hFcGI представляет собой экспрессионный вектор, содержащий тяжелую цепь антитела G1, и является подходящим для временной или стабильной экспрессии тяжелой цепи. Вектор pDb.CGRP.hFcGI имеет нуклеотидные последовательности, соответствующие следующим областям: промоторной области цитомегаловируса мыши (нуклеотиды 7-612); синтетическому интрону (нуклеотиды 613-1679); области, кодирующей DHFR (нуклеотиды 688-1253); сигнальному пептиду гормона роста человека (нуклеотиды 1899-1976); вариабельной области тяжелой цепи G1 (нуклеотиды 1977-2621); константной области тяжелой цепи IgG2 человека, содержащей следующие мутации: от A330P331 до S330S331 (нумерация аминокислот по отношению к последовательности IgG2 дикого типа; см. Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624). Вектор pDb.CGRP.hFcGI депонировали в ATCC 15 июля 2005 г., и ему был присвоен номер доступа в ATCC PTA-6867.

Вектор pEb.CGRP.hKGI представляет собой экспрессионный вектор, содержащий легкую цепь антитела G1, и является подходящим для временной экспрессии легкой цепи. Вектор pEb.CGRP.hKGI имеет нуклеотидные последовательности, соответствующие следующим областям: промоторной области цитомегаловируса человека (нуклеотиды 2-613); интрону EF-1 человека (нуклеотиды 614-1149); сигнальному пептиду гормона роста человека (нуклеотиды 1160-1237); вариабельной области легкой цепи G1 (нуклеотиды 1238-1558); константной области каппа-цепи человека (нуклеотиды 1559-1882). Вектор pEb.CGRP.hKGI депонировали в ATCC 15 июля 2005 г., и ему был присвоен номер доступа в ATCC PTA-6866.

Анализ Biacore для определения аффинности. Аффинности моноклонального антитела G1 и его вариантов определяли либо при 25°C, либо при 37°C с помощью системы поверхностного плазмонного резонанса BIACORE3000™ (SPR) (Biacore, INC, Пискатауэй, Нью-Джерси). Аффинность определяли с помощью захвата биотинилированных на N-конце КГРП или фрагментов с помощью предварительно иммобилизированного стрептавидина (SA сенсорный чип) и измерения кинетики связывания Fab фрагментов антитела G1 или его вариантов, титрованных в направлении КГРП или фрагмента на чипе. Все анализы Biacore проводили в подвижном буфере HBS-EP (10 мM HEPES, pH 7,4, 150 мM NaCl, 3 мM EDTA, 0,005% об./об. полисорбата P20). Поверхности КГРП получали с помощью разбавления N-биотинилированного КГРП до концентрации, меньшей чем 0,001 мг/мл в буфере HBS-EP, и инъецировали его в направлении SA сенсорного чипа с использованием варьирующего времени контакта. Малоемкие поверхности, соответствующие уровням захвата <50 единиц ответа (RU), использовали для высокоразрешающих кинетических исследований, в то время как высокоемкие поверхности (около 800 RU захваченного КГРП) использовали для исследований концентрации, скрининга и определений аффинности в растворах. Кинетические данные получали с помощью разведения Fab антитела G1 последовательно с двух- или трехкратными повышениями до концентраций, находящихся в диапазоне 1 мкМ-0,1 нM (рассчитанные при 0,1-10x оцененном K_D). Образцы в типичном случае инъецировали в течение 1 минуты при 100 мкл/мин и времени диссоциации, составляющем по меньшей мере 10 минут. После каждого цикла связывания поверхности регенерировали с помощью 25 мM NaOH в 25% об./об. этанола, который использовался в течение сотен циклов. Всю титровальную серию (в типичном случае полученную дважды) подгоняли в целом по отношению к модели связывания Ленгмюра 1:1 с помощью программы BIAevaluation. Она возвращала уникальную пару кинетических констант скоростей ассоциации и диссоциации (соответственно k_on и k_off) для каждого связывающего взаимодействия, отношение которого давало константу равновесной диссоциации (K_D = k_off/k_on). Аффинности (значения K_D), определенные в этом отношении, приведены в Табл. 5 и 6.

Высокоразрешающий анализ связывающих взаимодействий с чрезвычайно низкими скоростями диссоциации. В случае взаимодействий с чрезвычайно низкими скоростями диссоциации (в частности, связывания Fab антитела G1 с α-КГРП человека на чипе при 25°C) аффинности получали в эксперименте, состоящем из двух частей. Протокол, описанный выше, использовали со следующими модификациями. Константу скорости ассоциации (k_on) определяли с помощью инъекции 2-кратных титровальных серий (дважды), находящихся в пределах 550 нM-1 нM, в течение 30 секунд при 100 мкл/мин, и обеспечения фазы диссоциации в течение лишь 30 секунд. Константу скорости диссоциации (k_off) определяли с помощью инъекции трех концентраций (высокой, средней и низкой) одной и той же титровальной серии дважды в течение 30 секунд, и обеспечения фазы диссоциации в течение 2 часов. Аффинность (K_D) каждого взаимодействия получали в результате комбинирования значений k_on и k_off, полученных в обоих типах экспериментов, показанных в Табл. 4.

Определение аффинности в растворе с помощью Biacore. Аффинность в растворе антитела G1 в случае α-КГРП крысы и α-КГРП человека F37A (19-37) измеряли с помощью Biacore при 37°C. Использовали высокоемкую поверхность чипа для КГРП (высокоаффинный α-КГРП человека выбирали для целей детекции) и подвижный буфер HBS-EP пропускали при 5 мкл/мин. Fab фрагмент антитела G1 при постоянной концентрации 5 нМ (рассчитанной составлять или быть ниже ожидаемого K_D взаимодействия в растворе) предварительно инкубировали с конкурирующим пептидом, либо α-КГРП крысы, либо α-КГРП человека F37A (19-37), в конечной концентрации, находящейся в диапазоне от 1 нМ до 1 мкМ в 3-кратных серийных разведениях. Растворы Fab антитела G1 в отсутствие или в присутствии конкурирующего пептида в растворе инъецировали в направлении КГРП на чипе и отслеживали истощение ответов связывания на поверхности чипа в результате конкуренции в растворе. Эти ответы связывания превращали в «концентрации свободного Fab» с помощью калибровочных кривой, которую строили с помощью титрования только Fab антитела G1 (5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,325 и 0 нM) в направлении КГРП на чипе. «Концентрации свободного Fab» откладывали на графике в зависимости от концентрации конкурирующего пептида в растворе, используемого для получения каждой точки данных и подгонки до модели аффинности в растворе с помощью компьютерной программы BIAevaluation. Аффинности в растворе, определенные (косвенно) подобным образом, показаны в Табл. 4 и 6, и их использовали для валидации аффинностей, полученных тогда, когда Fab инъецировали прямо в направлении N-биотинилированных КГРП в направлении SA чипа. Близкое соответствие между аффинностями, определенными с помощью этих двух способов, подтверждает то, что связывание N-биотинилированной версии КГРП с чипом не изменяет его нативной активности связывания в растворе.

В Табл. 4 ниже показаны аффинности связывания антитела G1 с α-КГРП человека, β-КГРП человека, α-КГРП крысы и β-КГРП крысы, определенные с помощью Biacore, в результате пропускания Fab фрагментов в направлении N-биотинилированных КГРП на SA чипе. Для лучшего анализа аффинностей связывающих взаимодействий с чрезвычайно медленными скоростями диссоциации, аффинности также определяли в эксперименте, состоящем из двух частей, для дополнения ориентации указанного анализа, также определяли аффинность в растворе взаимодействия α-КГРП крысы (как описано выше). Близкое соответствие аффинностей, измеренных в обоих ориентациях анализа, подтверждает то, что аффинность связывания нативного α-КГРП крысы в растворе не изменялась, когда его N-биотинилировали и связывали с SA чипом.

Таблица 4. Аффинности связывания Fab антитела G1, титрованных в направлении КГРП на чипе

КГРП на чипе	Темп. (°C)	kon (1/Mс)	koff (1/с)	KD (нM)
α-КГРП человека	25	1,86 x 105	7,80 x 10-6	0,042 (7%, n = 4)*
α-КГРП человека	37	5,78 x 105	3,63 x 10-5	0,063 (4%, n = 2)*
β-КГРП человека	37	4,51 x 105	6,98 x 10-5	0,155
α-КГРП крысы	25	5,08 x 104	6,18 x 10-5	1,22 (12%, n = 2)*
α-КГРП крысы	37	1,55 x 105	3,99 x 10-4	2,57* (KD раствора =10 (50%, n = 4)**
β-КГРП крысы	37	5,16 x 105	7,85 x 10-5	0,152

*Аффинности в случае α-КГРП (крысы и человека) определяли в высокоразрешающем эксперименте, состоящем из двух частей, в котором фазу диссоциации отслеживали в течение 2 часов (значения k_on, k_off и K_D обозначают среднее из n повторов экспериментов со стандартным отклонением, выраженным в виде процента дисперсии). Аффинности в случае β-КГРП (крысы и человека) определяли с помощью глобального анализа с использованием лишь 20-минутной фазы диссоциации, которая была не достаточно точной для количественной оценки их чрезвычайно медленных скоростей диссоциации (их скорости диссоциации являются вероятно более медленными, чем указанные в данном документе, и, таким образом, их аффинности вероятно являются даже более высокими). Fab антитела G1 диссоциировал чрезвычайно медленно от всех КГРП (за исключением α-КГРП крысы) со скоростями диссоциации, которые приближались предела разрешения анализа Biacore (особенно при 25°C).

**Аффинность в растворе, определенная с помощью измерения истощения ответов связывания, выявляемых в области КГРП на чипе в случае Fab антитела G1, предварительно инкубированного с конкурентном α-КГРП крысы в растворе.

В таблице 5 ниже показаны антитела, имеющие вариацию аминокислотной последовательности по сравнению с антителом G1 и их аффинности как в отношении α-КГРП крысы, так и в отношении α-КГРП человека. Все аминокислотные замены вариантов, показанные в Табл. 5. описаны по отношению к последовательности G1. Аффинности связывания Fab фрагментов определяли с помощью Biacore в результате их пропускания в направлении КГРП на SA чипе.

Таблица 5. Данные об аминокислотных последовательностях и аффинностях связывания для вариантов антитела G1, определенные при 37°C с помощью Biacore.

Клон	L1	L2	H2	HC-FW3	koff (1/с) α-варианта крысы	KD (нM) α-варианта крысы	koff (1/с) α-варианта человека	KD (нM) α-варианта человека
G1					3,99 x 10-4	2,57	3,63 x 10-5	0,063
M1				A100L	1,10 x 10-3		1,73 x 10-4
M2				L99A A100R	2,6 x 10-3	58	3,1 x 10-4	3
M3				L99A A100S	2,0 x 10-3	61	2,1 x 10-4	1,7
M4				L99A A100V	1,52 x 10-3	84,4	6,95 x 10-5	0,43
M5				L99A A100Y	7,35 x 10-4	40,8	3,22 x 10-5	0,20
M6				L99N	7,84 x 10-4	43,6	1,33 x 10-4	0,83
M7				L99N A100C	9,18 x 10-4	51,0	2,43 x 10-4	1,52
M8				L99N A100G	7,45 x 10-4	41,4	9,20 x 10-5	0,58
M9				L99N A100Y	н.о.	н.о.	1,00 x 10-5	0,06
M10				L99S A100S	1,51 x 10-3	83,9	1,73 x 10-4	1,08
M11				L99S A100T	4,83 x 10-3	268,3	2,83 x 10-4	1,77
M12				L99S A100V	1,94 x 10-3	107,8	1,01 x 10-4	0,63
M13				L99T A100G	1,84 x 10-3	102,2	1,86 x 10-4	1,16
M14				L99T A100K	н.о.	н.о.	1,00 x 10-5	0,06
M15				L99T A100P	1,15 x 10-3	63,9	1,58 x 10-5	0,10
M16				L99T A100S	9,96 x 10-4	55,3	1,65 x 10-4	1,03
M17				L99T A100V	2,06 x 10-3	114,4	1,85 x 10-4	1,16
M18				L99V A100G	1,22 x 10-3	67,8	7,03 x 10-5	0,44
M19				L99V A100R	н.о.	н.о.	1,00 x 10-5	0,06
M20	R28W			L99R A100L	1,44 x 10-3	80,0	1,36 x 10-4	0,85
M21	R28W			L99S	6,95 x 10-4	15,2	1,42 x 10-4	1,23
M22	R28W			L99T	1,10 x 10-3	61,1	1,16 x 10-4	0,73
M23	R28G			L99T A100V	7,99 x 10-4	44,4	1,30 x 10-4	0,81
M24	R28L			L99T A100V	1,04 x 10-3	57,8	1,48 x 10-4	0,93
M25	R28N			L99T A100V	1,4 x 10-3	76	1,4 x 10-4	1,3
M26	R28N		A57G	L99T A100V	9,24 x 10-4	51,3	1,48 x 10-4	0,93
M27	R28N T30A			L99T A100V	3,41 x 10-3	189,4	3,57 x 10-4	2,23
M28	R28N T30D		E54R A57N	L99T A100V	1,25 x 10-3	69,4	9,96 x 10-5	0,62
M29	R28N T30G			L99T A100V	3,59 x 10-3	199,4	3,80 x 10-4	2,38
M30	R28N T30G		E54K A57E	L99T A100V	6,38 x 10-3	354,4	5,90 x 10-4	3,69
M31	R28N T30G		E54K A57G	L99T A100V	3,61 x 10-3	200,6	3,47 x 10-4	2,17
M32	R28N T30G		E54K A57H	L99T A100V	2,96 x 10-3	164,4	2,71 x 10-4	1,69
M33	R28N T30G		E54K A57N S58G	L99T A100V	9,22 x 10-3	512,2	7,50 x 10-4	4,69
M34	R28N T30G		E54K A57N S58T	L99T A100V	2,17 x 10-3	120,6	6,46 x 10-4	4,04
M35	R28N T30G		E54K A57S	L99T A100V	3,99 x 10-3	221,7	3,39 x 10-4	2,12
M36	R28N T30R			L99T A100V	4,79 x 10-3	266,1	2,39 x 10-4	1,49
M37	R28N T30S		A57G	L99T A100V	1,45 x 10-3	80,6	2,26 x 10-4	1,41
M38	R28N T30W			L99T A100V	5,11 x 10-3	283,9	2,18 x 10-4	1,36
M39	R28N	G50A L56T	A57N S58Y	L99T A100V	9,95 x 10-3	552,8	4,25 x 10-4	2,66
M40	R28N	G50A L56T	E54K A57L	L99T A100V	0,36	20000,0	1,28 x 10-3	8,00
M41	R28N	G50A L56T	E54K A57N E64D	L99T A100V	4,53 x 10-3	251,7	2,10 x 10-4	1,31
M42	R28N	G50A L56T	E54K A57N H61F	L99T A100V	7,52 x 10-3	417,8	4,17 x 10-4	2,61
M43	R28N	G50A L56T	E54K A57N S58C	L99T A100V	4,53 x 10-3	251,7	2,63 x 10-4	1,64
M44	R28N	G50A L56T	E54K A57N S58E	L99T A100V	6,13 x 10-3	443	2,10 x 10-4	2,05
M45	R28N	G50A L56T	E54K A57N S58E E64D	L99T A100V	5,58 x 10-3	259	2,11 x 10-4	1,85
M46	R28N	G50A L56T	E54K A57N S58E H61F	L99T A100V	2,94 x 10-3	163,3	5,39 x 10-4	3,37
M47	R28N	G50A L56T	E54K A57N S58G	L99T A100V	8,23 x 10-3	457,2	3,32 x 10-4	2,08
M48	R28N	G50A L56T	E54K A57N S58L	L99T A100V	0,0343	1905,6	8,42 x 10-4	5,26
M49	R28N	G50A L56T	E54K A57N S58Y H61F	L99T A100V	0,0148	822,2	5,95 x 10-4	3,72
M50	R28N	G50A L56T	E54K A57R	L99T A100V	5,30 x 10-3	294,4	4,06 x 10-4	2,54
M51	R28N	L56I	E54K A57G	L99T A100V	1,18 x 10-3	65,6	1,31 x 10-4	0,82
M52	R28N	L56I	E54K A57N S58A	L99T A100V	2,29 x 10-3	127,2	2,81 x 10-4	1,76
M53	R28N	L56I	E54K A57N S58G	L99T A100V	1,91 x 10-3	106,1	3,74 x 10-4	2,34
M54	R28N T30A	G50A	E54K A57N S58P	L99T A100V	2,16 x 10-3	120,0	1,79 x 10-3	11,19
M55	R28N T30A	L56S	E54K A57N S58E E64D	L99T A100V	5,85 x 10-3	325,0	4,78 x 10-4	2,99
M56	R28N T30D	L56S	E54K A57N H61F	L99T A100V	9,35 x 10-3	519,4	4,79 x 10-4	2,99
M57	R28N T30D	L56S	E54K A57N S58E	L99T A100V	0,0104	1200	3,22 x 10-4	3,08
M58	R28N T30D	L56S	E54K A57N S58I H61F	L99T A100V	Связывание отсутствует	н.о.	1,95 x 10-3	12,19
M59	R28N T30D	L56S	E54K A57N S58N H61F	L99T A100V	0,0123	683,3	5,24 x 10-4	3,28
M60	R28N T30D	L56S	E54K A57N S58R H61F	L99T A100V	0,0272	1511,1	9,11 x 10-4	5,69
M61	R28N T30G	A51H	E54Q A57N H61F	L99T A100V	5,21 x 10-3	289,4	4,59 x 10-4	2,87
M62	R28N T30G	A51H L56T	E54K A57N S58E	L99T A100V	5,75 x 10-3	242	5,57 x 10-4	5,86
M63	R28N T30G	G50A	E54K A57N S58T	L99T A100V	2,65 x 10-3	147,2	1,50 x 10-3	9,38
M64	R28N T30G	G50A	E54K A57N S58V	L99T A100V	0,0234	1300,0	1,32 x 10-3	8,25
M65	R28N T30G	G50A L56I	E54K A57C	L99T A100V	4,07 x 10-3	226,1	8,03 x 10-4	5,02
M66	R28N T30G	L56I	E54K A57E	L99T A100V	5,11 x 10-3	283,9	5,20 x 10-4	3,25
M67	R28N T30G	L56I	E54K A57F	L99T A100V	1,71 x 10-3	95,0	8,20 x 10-4	5,13
M68	R28N T30G	L56I	E54K A57N S58D E64D	L99T A100V	6,76 x 10-3	375,6	4,28 x 10-4	2,68
M69	R28N T30G	L56I	E54K A57N S58E	L99T A100V	1,81 x 10-3	100,6	7,33 x 10-4	4,58
M70	R28N T30G	L56I	E54K A57S	L99T A100V	6,07 x 10-3	337,2	5,59 x 10-4	3,49
M71	R28N T30G	L56I	E54K A57Y	L99T A100V	2,12 x 10-3	117,8	1,28 x 10-3	8,00
M72	R28N T30G	L56S	E54K	L99T A100V	3,95 x 10-3	219,4	4,00 x 10-4	2,50
M73	R28N T30G	L56S	E54K A57N S58Y E64D	L99T A100V	3,00 x 10-3	166,7	2,55 x 10-4	1,59
M74	R28N T30G	L56S	E54K A57S	L99T A100V	6,03 x 10-3	335,0	5,97 x 10-4	3,73
M75	R28N T30G	L56S	E54K A57V	L99T A100V	1,87 x 10-2	1038,9	1,16 x 10-3	7,25
M76	R28N T30S	G50A L56T	A57G	L99T A100V	1,16 x 10-3	64,4	3,64 x 10-4	2,28
M77	R28N T30S	G50A L56T	E54K A57D	L99T A100V	0,0143	794,4	4,77 x 10-4	2,98
M78	R28N T30S	G50A L56T	E54K A57N S58T	L99T A100V	0,167	9277,8	1,31 x 10-3	8,19
M79	R28N T30S	G50A L56T	E54K A57P	L99T A100V	0,19	10555,6	1,29 x 10-3	8,06
M80	R28N T30S	L56I	E54K A57N S58V	L99T A100V	0,0993	5516,7	2,09 x 10-3	13,06
M81	R28N T30S	L56S	E54K A57N S58E	L99T A100V	4,29 x 10-3	238,3	4,90 x 10-4	3,06
M82	R28N T30V	A51H L56T	A57N	L99T A100V	6,99 x 10-3	388,3	8,77 x 10-4	5,48
M83	R28N T30V	A51H L56T	E54K A57N S58M H61F	L99T A100V	Связывание отсутствует	н.о.	9,33 x 10-4	5,83
M84	R28N T30V	A51H L56T	E54N A57N	L99T A100V	1,76 x 10-2	977,8	1,08 x 10-3	6,75

Все CDR, в том числе CDR в соответствии с нумерацией Кабат и CDR в соответствии с нумерацией Чотиа. Аминокислотные остатки пронумерованы последовательно (см. Фиг. 5). Все клоны имеют последовательности L3 + H1 + H3, идентичные G1.

K_D = k_off/k_on. Все значения k_off определяли в режиме скрининга, за исключением тех значений, которые подчеркнуты, которые получены с помощью общего анализа серии концентраций Fab (G1 анализировали в режиме высокого разрешения). Подчеркнутые значения K_D, таким образом, определяли экспериментально с помощью измерения k_on. По оценкам, другие значения k_on составляли то же самое, что и в случае M25.

н.о. = не определено.

Для определения эпитопа на α-КГРП человека, который распознается антителом G1, использовали анализы Biacore, описанные выше. α-КГРП человека приобретали в виде N-биотинилированной версии для обеспечения его высокоаффинного захвата с помощью SA сенсорных чипов. Определяли связывание Fab фрагмента G1 с α-КГРП человека на чипе в отсутствие или в присутствии пептида КГРП. В типичном случае раствор 2000:1 моль пептид/Fab (например, 10 мкM пептида в 50 нМ Fab G1) инъецировали в направлении α-КГРП человека на чипе. На Фиг. 6 продемонстрирован процент связывания, блокируемый конкурирующим пептидом. Данные, показанные на Фиг. 6, указывают на то, что пептиды, которые блокируют 100% связывание Fab G1 с α-КГРП человека, представляют собой 1-37 (ДТ), 8-37, 26-37, P29A (19-37), K35A (19-37), K35E (19-37) и K35M (19-37) α-КГРП человека; 1-37 β-КГРП (ДТ); 1-37 α-КГРП крысы (ДТ); и 1-37 β-КГРП крысы (ДТ). Все эти пептиды являются амидированными на C-конце. Пептиды F37A (19-37) и 19-37 (последний является неамидированным на C-конце) α-КГРП человека также блокировали на около 80%-90% связывание Fab G1 с α-КГРП человека. Пептид 1-36 (неамидированный на C-конце) α-КГРП человека блокировал на около 40% связывание Fab G1 с α-КГРП человека. Пептидный фрагмент 19-36 (амидированный на C-конце) α-КГРП человека; пептидные фрагменты 1-13 и 1-19 α-КГРП человека (ни один из которых не является амидированным на C-конце); и амилин, кальцитонин и адреномедуллин человека (все являются амидированными на C-конце) не конкурировали за связывание Fab G1 с α-КГРП человека на чипе. Эти данные демонстрируют то, что G1 целенаправленно воздействует на С-концевой эпитоп КГРП и то, что идентичность наиболее концевого остатка (F37) и его амидирование является важным для связывания.

Также определяли аффинности связывания Fab G1 с вариантами α-КГРП человека (при 37°C). В Табл. 6 ниже показаны аффинности, измеренные непосредственно с помощью титрования Fab G1 в направлении N-биотинилированного α-КГРП человека и вариантов на чипе. Данные в Табл. 6 указывают на то, что антитело G1 связывается с C-концевым эпитопом, при этом с F37 и G33 являются наиболее важными остатками. G1 не связывается с КГРП, когда дополнительный аминокислотный остаток (аланин) добавляется к C-концу (который является амидированным).

Таблица 6. Аффинности связывания Fab G1 в отношении α-КГРП человека и вариантов, измеренные при 37°C (см. Табл. 3 касательно их аминокислотных последовательностей)

КГРП на чипе	kon (1/Mс)	koff (1/с)	KD (нM)
1-37 (ДТ)	4,68 x 105	7,63 x 10-5	0,16 (KD высокого разрешения = 0,06)
19-37	4,60 x 105	7,30 x 10-5	0,16
25-37	3,10 x 105	8,80 x 10-5	0,28
F27A (25-37)	3,25 x 105	1,24 x 10-4	0,38
V28A (25-37)	3,32 x 105	9,38 x 10-5	0,28
P29A (25-37)	2,26 x 105	1,78 x 10-4	0,79
T30A (25-37)	1,79 x 105	8,41 x 10-5	0,47
N31A (25-37)	2,17 x 105	1,14 x 10-4	0,53
V32A (25-37)	2,02 x 105	3,46 x 10-4	1,71
G33A (25-37)	2,07 x 105	0,0291	141
S34A (25-37)	2,51 x 105	7,64 x 10-4	3,04
K35A (19-37)	2,23 x 105	2,97 x 10-4	1,33
K35E (19-37)	5,95 x 104	5,79 x 10-4	9,73
K35M (19-37)	2,63 x 105	1,34 x 10-4	0,51
K35Q (19-37)	1,95 x 105	2,70 x 10-4	1,38
F37A (25-37)	8,90 x 104	8,48 x 10-3	95 (KD раствора = 172 нМ)
38A (25-38A)	-	-	Связывание не выявлено

Приведенные выше данные указывают на то, что эпитоп, который связывает антитело G1, находится на C-терминальном конце α-КГРП человека, а аминокислоты 33 и 37 на α-КГРП человека являются важными для связывания антитела G1. Кроме того, амидирование остатка F37 является важным для связывания.

Пример 5: Селективное ингибирование тригеминоваскулярных нейронов с помощью гуманизированного моноклонального анти-КГРП антитела (фреманезумаб, TEV-48125)

Целью данного исследования было лучшее понимание того, как мАТ к КГРП фреманезумаб (TEV-48125) модулирует менингеальные сенсорные пути. Для ответа на данный вопрос регистрацию отдельных нейронов использовали для определения эффектов фреманезумаба (30 мг/кг в/в) и антитела изотипического контроля IgG2 (изотип-конАТ) в отношении спонтанной и вызванной активности в наивных и CSD-сенсибилизированных тригеминоваскулярных нейронов в ядре тройничного нерва спинного мозга анестезированных самцов и самок крыс. Исследование демонстрирует, что у представителей обоего пола фреманезумаб ингибировал наивные высокопороговые (HT) тригеминоваскулярные нейроны, но тригеминоваскулярные нейроны с широким динамическим диапазоном, и что ингибирующие эффекты в отношении нейронов были ограничены их активацией из внутричерепной твердой оболочки головного мозга, но не кожи лица или роговицы. Помимо этого, при наличии достаточного количества времени фреманезумаб предупреждает активацию и сенсибилизацию HT нейронов в результате распространяющейся корковой депрессии.

Материалы и способы

Хирургический препарат

Эксперименты одобряли постоянно действующими комитетами медицинского центра Бет-Изрейел Диаконесс и Гарвардской медицинской школы по уходу за животными, и в соответствии с руководством по содержанию и использованию лабораторных животных Национальных институтов здоровья США. Самцов и самок крыс Sprague-Dawley (250-350 г) анестезировали с помощью уретана (0,9-1,2 г/кг IP). Их снабжали ингаляционной трубкой для обеспечения искусственной вентиляции (0,1 л/мин O₂) и канюлей для внутрибедренной вены для последующей инфузии лекарственных препаратов. Крыс помещали в стереотаксический аппарат, и внутреннюю температуру поддерживали при 37°C с помощью одеяла с электрообогревом. CO₂ в конце спокойного выдоха непрерывно отслеживали и поддерживали в пределах физиологического диапазона (3,5-4,5 pCO₂). После стабилизации крыс обездвиживали с помощью рокурония бромида (10 мг/мл, 1 мл/ч непрерывной внутривенной инфузии) и насыщали их кровь кислородом. С целью стимуляции твердой оболочки черепа позже в эксперименте 5 x 5 мм отверстие осторожно вырезали в теменной и затылочной костях спереди и сзади лямбдовидного шва, непосредственно над левым поперечным синусом. Твердую оболочку головного мозга, подвергшуюся воздействию, поддерживали влажной с помощью модифицированной синтетической интерстициальной жидкости (135 мM NaCl, 5 мM KCl, 1 мM MgCl₂, 5 мM CaCl₂, 10 мM глюкозы и 10 мM Hepes, pH 7,2). Для регистрации одиночных нейронов в ядре тройничного нерва спинного мозга сегмент спинного мозга между задвижкой дна и C2 открывали от вышележащих тканей, лишали твердой оболочки головного мозга и поддерживали влажным с помощью минерального масла.

Идентификация и выбор нейронов

Для регистрации активности нейронов вольфрамовый микроэлектрод (импеданс 3-4 MΩ) погружали повторно в ядро тройничного нерва спинного мозга (STN) в поиске центральных тригеминоваскулярных нейронов, получающих конвергентный входящий сигнал от твердой оболочки головного мозга и кожи лица. Тригеминоваскулярные нейроны сначала идентифицировали на основе их ответов на электрическую стимуляцию твердой оболочки головного мозга. Их выбирали для исследования, если они проявляли дискретные сеансы возбуждения в ответ на ипсилатеральную электрическую (0,1-3,0 мA, 0,5 мсек, 0,5 Гц импульсы) и механическую (с использованием калиброванных моноволокон фон Фрея) стимуляцию подвергнувшейся воздействию твердой оболочки черепа и механическую стимуляцию кожи лица и роговицы. Рецептивные поля твердой оболочки головного мозга картировали с помощью вдавливания твердой оболочки головного мозга (с помощью 4,19 г VFH моноволокна) в точках, разделенных на 1 мм медиалетарельно и рострокаудально. Точки, в которых вдавливание твердой оболочки головного мозга приводило к ответу в ≥50% попыток, считались расположенными внутри рецептивного поля нейронов. Рецептивные поля кожи картировали с помощью использования неболевой и болевой механической стимуляции всех областей кожи лица и роговицы. Область считалась расположенной за пределами рецептивного поля, если стимул не приводил к ответу в ≥50% попыток. Ответы на механическую стимуляцию кожи определяли с помощью использования кратковременных (10 с) неболевых и болевых стимулов по отношению к наиболее чувствительной части рецептивного поля кожи. Неболевые стимулы состояли из медленного прохождения мягкой щетинной кисти в направлении рецептивного поля кожи (один 5-секундный мазок кисти от каудальной к ростральной части и один 5-секундный мазок кисти от ростральной к каудальной части) и давления, осуществляемого с помощью неплотной артериальной скобы. Неболевые стимулы состояли из щипка плотной артериальной скобой (Palecek et al., 1992, J. Neurophysiol. 67:1562-1573; Dado et al., 1994, J. Neurophysiol. 71:981-1002; Burstein et al., 1998, J. Neurophysiol. 79:964-982). Более интенсивные и продолжительные стимулы не использовали для избежания индукции длительных изменений спонтанного разряда нейронов или свойств ответа. Ответы на механическую стимуляцию роговицы состояли из слабых и медленных мазков кисти с использованием тонкой кисти (около 10 волосяных фолликул). Таким образом, идентифицировали два класса нейронов: нейроны с широким динамическим диапазоном (WDR) (нарастающим темпом восприимчивые к расчесыванию, сдавливанию и щипку) и высокопороговые (HT) нейроны (невосприимчивые к расчесыванию). Детектор колебательных сигналов в реальном времени использовали для создания и хранения шаблона для потенциала действия, вызываемого в нейроне при исследовании с помощью электрических импульсов в отношении твердой оболочки головного мозга; спайки активности, соответствующие колебательному сигналу шаблона, получали и анализировали в режиме он-лайн и офф-лайн с помощью компьютерной программы Spike 2 (CED, Кембридж, Великобритания).

Индукция и регистрация распространяющейся корковой депрессии

Распространяющуюся корковую депрессию (CSD) индуцировали механическим путем с помощью вставки стеклянной микропипетки (диаметр кончика 25 мкм) на расстояние около 1 мм в зрительную кору в течение 10 секунд. При скорости распространения 3-5 мм/мин предполагали вхождение одной волны CSD в рецептивное поле нейронов в пределах 1-2 минут после стимуляции коры. Для проверки CSD активность коры регистрировали (электрокортикограмма) с помощью стеклянной микропипетки (0,9% солевой раствор, ~1 мегом, кончик 7 мкм), расположенной непосредственно ниже поверхности коры головного мозга (примерно 100 мкм). Электрод для электрокортикограммы помещали на около 6 мм спереди по отношению к зрительной коре.

Обработка моноклональным анти-КГРП антителом фреманезумабом (TEV-48125)

Фреманезумаб (также известный как TEV-48125/ LBR-101/ RN-307) (TEVA Pharmaceutical Industries Ltd., Израиль) представляет собой гуманизированное моноклональное анти-КГРП антитело (КГРП-мАТ). Его разбавляли в солевом растворе до конечной дозы 30 мг/кг и вводили внутривенно (болюсная инъекция, суммарный объем 0,6-0,7 мл). Соответствующее антитело изотипического контроля IgG2 человека (изотип-конАТ) также разбавляли в солевом растворе до конечной дозы 30 мг/кг и вводили внутривенно (болюсная инъекция, суммарный объем 1,6-2,0 мл).

Протокол эксперимента

Протокол эксперимента включал две части. Первую часть разрабатывали для сравнения эффектов КГРП-мАТ и изотип-конАТ в отношении спонтанной и индуцированной активности наивных тригеминоваскулярных нейронов, а вторую часть разрабатывали для исследования эффектов КГРП-мАТ и изотип-конАТ в отношении активации и сенсибилизации тригеминоваскулярных нейронов с помощью CSD. Обе части включали выбор WDR и HT нейронов у самцов и самок крыс. В первой части исходный профиль нейронов определяли с помощью (a) картирования рецептивного поля твердой оболочки головного мозга, кожи и роговицы; (b) измерения ответов (среднее число спайков/сек) на механическую стимуляцию твердой оболочки головного мозга (с помощью фиксированной силы), кожи (расчесывание, сдавливание, щипок) и роговицы (расчесывание), и (c) измерения скорости спонтанного возбуждения (регистрируемого в течение 30 минут до лечения). После определения исходного уровня вводили КГРП-мАТ или изотип-конАТ и повторно картировали рецептивные поля, повторно исследовали ответы нейронов на стимуляцию твердой оболочки головного мозга, кожи и роговицы, и скорость спонтанной активности повторно выбирали через 1, 2, 3 и 4 часа после обработки. Полученные в результате значения каждого показателя затем сравнивали с соответствующими значениями исходного уровня, полученными до обработки. Во второй части CSD индуцировали через 4 часа после введения КГРП-мАТ или изотип-конАТ и еще через 2 часа (т.е., через 6 часов после обработки) повторно измеряли размер рецептивных полей, скорость спонтанной активности и величину ответа на стимуляцию твердой оболочки головного мозга, кожи и роговицы. Полученные в результате значения каждого показателя после CSD затем сравнивали с соответствующими значениями до CSD, полученными через 4 часа после обработки. Выполнение указанной части начинали только в случаях, при которых физиологическое состояние крыс (частота сердечных сокращений, давление крови, дыхание, CO2 в конце выдоха) и сигнал изоляции нейронов (отношения сигнала к шуму ≥ 1:3) были стабильными во временной точке, соответствующей 4 часам после обработки.

По окончанию каждого эксперимента получали небольшое повреждение в участке отведения (анодный DC 15 мкA в течение 15 сек) и его локализацию в дорсальном роге определяли посмертно с помощью гистологического анализа, описанного в других разделах (Zhang et al. (2011) Ann. Neurol. 69: 855-865). У каждого животного изучали только один нейрон.

Анализ данных

Для расчета величины ответа на каждый стимул среднюю частоту возбуждения, возникающую до начала первого стимула (30 минут для спонтанной активности, 10 секунд для механической стимуляции твердой оболочки головного мозга, кожи и роговицы) вычитали из средней частоты возбуждения, которое возникало во время каждого стимула. В первой части указанного исследования соответствующие значения каждого показателя (определенные через 1, 2, 3, 4 часа после обработки) сравнивали с соответствующими значениями исходного уровня, полученными до введения фреманезумаба и изотип-конАТ. Во второй части указанного исследования полученные в результате значения каждой величины (определенные через 2 часа после индукции CSD) сравнивали с соответствующими значениями, полученными до индукции CSD в 2 группах обработки (фреманезумаб и изотип-конАТ). Нейрон считали актированным, если его средняя скорость возбуждения после CSD превышала его среднюю активность исходного уровня на 2 стандартных отклонения от этого среднего значения в течение периода >10 минут, что соответствовало ≥ 33% повышению активности. Нейрон считали сенсибилизированным, если через 2 часа после возникновения CSD он проявлял усиленные ответы на по меньшей мере 3 из следующих 5 стимулов: вдавливание твердой оболочки головного мозга, расчесывание, сдавливание или щипок кожи, а также расчесывание роговицы. Средние скорости возбуждения соответствующих значений сравнивали с помощью непараметрической методов статистики (критерия ранговых знаков Уилкоксона). Двухсторонний уровень значимости принимали при 0,05.

Результаты

База данных для исследования эффектов КГРП-мАТ и изотип-конАТ в отношении спонтанной и индуцированной активности наивных тригеминоваскулярных нейронов состояла из 63 нейронов. Из них 31 классифицировали как WDR, а 32 как HT. Из 31 WDR нейронов 18 (11 у самцов, 7 у самок) исследовали до и после введения КГРП-мАТ, и 13 (7 у самцов, 6 у самок) исследовали до и после введения изотип-конАТ. Из 32 HT нейронов 18 (11 у самцов, 7 у самок) исследовали до и после введения КГРП-мАТ, и 14 (8 у самцов, 6 у самок) исследовали до и после введения изотип-конАТ.

База данных для исследования эффектов КГРП-мАТ и изотип-конАТ в отношении активации и сенсибилизации нейронов в результате CSD состояла из 50 нейронов. Из них 23 классифицировали как WDR, а 27 как HT. Из 23 WDR нейронов 13 (7 у самцов, 6 у самок) исследовали у обработанных КГРП-мАТ животных и 10 (5 у самцов, 5 у самок) у обработанных изотип-конАТ животных. Из 27 HT нейронов 14 (8 у самцов, 6 у самок) исследовали у обработанных КГРП-мАТ животных и 13 (7 у самцов, 6 у самок) у обработанных изотип-конАТ животных.

Участки отведения, рецептивные поля и классы нейронов

Участки отведения, карты рецептивных полей твердой оболочки головного мозга и кожи и типы клеток не отличались между нейронами, исследуемыми в случае применения КГРП-мАТ, и нейронами, исследуемыми в случае изотип-конАТ (Фиг. 7A-7J). Все идентифицированные участки отведения располагались в пластинках I-II и IV-V первого шейного сегмента спинного мозга и каудальной части каудального ядра. Во всех случаях наиболее чувствительная область рецептивного поля твердой коры головного мозга находилась в направлении поперечного синуса, а наиболее чувствительная область рецептивного поля кожи находилась вокруг глаза, включая роговицу в более чем 90% случаев.

Спонтанная активность наивных центральных тригеминоваскулярных нейронов

У самцов крыс внутривенное введение КГРП-мАТ приводило к снижению спонтанной активности HT, но не WDR нейронов (Фиг. 8A и 8B). В группе HT возбуждение нейронов снижалось в пределах 3-4 часов на 90% (p = 0,040). В отдельных случаях скорость возбуждения некоторых HT нейронов снижалась в пределах 1-2 часов после внутривенного введения КГРП-мАТ (Фиг. 8D). В отличие от этого, внутривенное введение изотип-конАТ не приводило к изменению спонтанной активности ни одной группы нейронов (Фиг. 8E и 8F).

У самок, в отличие от самцов, внутривенное ведение КГРП-мАТ не приводило к снижению спонтанной активности HT или WDR нейронов (Фиг. 8C). Аналогичным образом, внутривенное введение изотип-конАТ не приводило к изменению спонтанной активности ни одной группы нейронов (Фиг. 8G). Крайне важно, что скорость спонтанной активности исходного уровня (т.е., до любой обработки) HT и WDR нейронов не отличалась между самцами и самками крыс (p = 0,14). В случае HT нейронов среднее число спайков/секунду до любой обработки составляло 1,7 ± 1,1 у самцов и 1,9 ± 1,0 у самок (p = 0,55). В случае WDR нейронов среднее число спайков/секунду до любой обработки составляло 0,3 ± 0,6 у самцов и 2,2 ± 1,1 у самок (p = 0,16).

Чувствительность наивных центральных тригеминоваскулярных нейронов к вдавливанию твердой оболочки головного мозга

Как у самцов, так и у самок крыс внутривенное введение КГРП-мАТ приводило к снижению чувствительности к механической стимуляции твердой оболочки головного мозга в HT, но не WDR нейронах (Фиг. 9А-9С). У самцов возбуждение HT нейронов снижалось на 75% (p = 0,047), в то время как у самок оно снижалось на 61% (p = 0,017). Вне зависимости от пола, внутривенное введение изотип-конАТ не приводило к изменению чувствительности в отношении стимуляции твердой оболочки головного мозга ни в какой группе нейронов (Фиг. 9D-9F).

Чувствительность наивных центральных тригеминоваскулярных нейронов в отношении механической стимуляции периорбитальной кожи и роговицы

Внутривенное введение КГРП-мАТ (Фиг. 10A-10D) или изотип-конАТ (Фиг. 10E-10H) не приводило к изменению ответов HT или WDR нейронов в отношении неболевой (расчесывание, сдавливание) или болевой (щипок) механической стимуляции кожи или роговицы (Фиг. 11A-11F) у самцов или у самок крыс.

Распространяющаяся корковая депрессия

Эффекты КГРП-мАТ (n = 27) или изотип-конАТ (n = 23) в отношении активации центральных тригеминоваскулярных нейронов в результате CSD исследовали в 50 нейронах, в которых скорость возбуждения исходного уровня (т.е., среднее число спайков/сек до индукции CSD) была устойчивой и постоянной в течение нескольких часов. Скорость спонтанной активности исходного уровня (т.е., до CSD) HT и WDR нейронов не отличалась между самцами и самками крыс (p = 0,14). В случае HT нейронов среднее число спайков/секунду до индукции CSD составляло 1,2 ± 0,6 у самцов и 3,3 ± 1,7 у самок (p = 0,29). В случае WDR нейронов среднее число спайков/секунду до индукции CSD составляло 1,5 ± 0,6 у самцов и 3,5 ± 2,2 у самок (p = 0,37).

CSD-индуцированная активность в центральных тригеминоваскулярных нейронах

У самцов крыс через два часа после индукции CSD и через 6 часов после введения изотип-конАТ средняя скорость возбуждения 7 HT нейронов возрастала от 1,1 ± 0,8 спайков/сек до CSD до 10,2 ± 2,1 после CSD (p = 0,019), в то время как средняя скорость возбуждения 5 WDR нейронов не повышалась (0,5 ± 0,3 спайков/сек до CSD и 1,6 ± 0,5 после CSD; p = 0,14) (Фиг. 12A и 12B). В отличие от этого, у обработанных КГРП-мАТ крыс величина ответа 8 HT нейронов оставалась неизменной через 2 часа после индукции CSD и через 6 часов после введения КГРП-мАТ (1,2 ± 0,6 спайков/сек до CSD и 1,9 ± 1,5 после CSD, p = 0,29) (Фиг. 12D и 12E). Другими словами, ожидаемую CSD-индуцированную активацию HT нейронов предупреждали с помощью обработки КГРП-мАТ.

У самок крыс через два часа после индукции CSD и через 6 часов после введения изотип-конАТ средняя скорость возбуждения 6 HT нейронов возрастала от 1,9 ± 1,0 спайков/сек до CSD до 10,0 ± 4,5 после CSD (p = 0,027), в то время как средняя скорость возбуждения 5 WDR нейронов оставалась неизменной (2,6 ± 1,2 спайков/сек до CSD и 2,2 ± 0,9 после CSD; p = 0,73) (Фиг. 12С). В отличие от этого, у обработанных КГРП-мАТ крыс величина ответа 6 HT нейронов оставалась неизменной через 2 часа после индукции CSD и через 6 часов после введения КГРП-мАТ (3,3 ± 1,7 спайков/сек до CSD и 5,0 ± 3,4 после CSD, p = 0,45) (Фиг. 12F). Как в случае с самцами, ожидаемую CSD-индуцированную активацию HT нейронов предупреждали с помощью обработки КГРП-мАТ.

Для дополнительного исследования эффектов КГРП-мАТ на активацию WDR и HT нейронов с помощью CSD выполняли анализ по каждому случаю. Из всех обработанных КГРП-мАТ и изотип-конАТ WDR нейронов 5/13 и 4/10 активировали с помощью CSD, что составляло только 2% разницу. В отличие от этого, из всех обработанных КГРП-мАТ и изотип-конАТ HT нейронов 2/14 и 13/13 активировали с помощью CSD, что составляло 86% разницу.

CSD-индуцированная сенсибилизация

Вне зависимости от активации CSD, 11/13 HT и ни один из WDR нейронов не отвечали критериям развития сенсибилизации (определенной в разделе анализа данных). Таким образом, способность КГРП-мАТ нарушать развитие сенсибилизации после CSD присутствовала в случае HT, но не WDR нейронов.

Расширение рецептивных полей твердой оболочки головного мозга и усиленные ответы на механическую стимуляцию твердой оболочки головного мозга после CSD

В обработанной изотип-конАТ группе рецептивные поля твердой оболочки головного мозга расширялись в 5/7 HT нейронах у самцов и в 6/6 HT нейронах у самок (Фиг. 13A). Через два часа после индукции CSD (через 6 часов после введения изотип-конАТ) ответы нейронов на вдавливание твердой оболочки головного мозга с помощью VFH повышались во всех 7 HT нейронах у самцов (12,8 ± 3,9 спайков/сек до CSD и 22,0 ± 3,7 после CSD; p = 0,026) и во всех 6 HT нейронах у самок (8,5 ± 1,7 до CSD и 21,6 ± 5,1 после CSD, p = 0,047) (Фиг. 14A-14C).

В отличие от этого, в обработанной КГРП-мАТ группе расширение рецептивных полей твердой оболочки головного мозга, которое было меньше во время появления, регистрировали только в 2/8 HT нейронах у самцов и в 0/6 нейронах у самок (Фиг. 13B). Через два часа после индукции CSD (через 6 часов после введения КГРП-мАТ) ответы нейронов на вдавливание твердой оболочки головного мозга с помощью VFH сохранялись неизменными во всех HT нейронах как у самцов (1,8 ± 0,6 до CSD и 1,9 ± 1,5 после CSD; p = 0,83), так и у самок (10,5 ± 1,6 до CSD и 8,1 ± 6,4 после CSD, p = 0,72, Фиг. 14D-14F), что свидетельствовало о предупреждении сенсибилизации. Таким образом, КГРП-мАТ предупреждало развитие внутричерепной механической гиперчувствительности в HT нейронах как у самцов, так и у самок крыс.

Расширение рецептивных полей кожи и усиленные ответы на механическую стимуляцию периорбитальной кожи после CSD (т.е., центральная сенсибилизация)

В обработанной изотип-конАТ группе рецептивные поля лица расширялись в 5/7 HT нейронах у самцов и в 6/6 HT нейронах у самок (Фиг. 13A). Через два часа после индукции CSD (через 6 часов после введения изотип-конАТ) ответы на расчесывание и сдавливание значительно повышались во всех 13 HT нейронах (7 у самцов, 6 у самок) (Фиг. 15A-15C). У самцов ответы на расчесывание и сдавливание повышались от 0,0 до 18,2 ± 9,1 спайков/сек (p = 0,046) и от 16,6 ± 4,2 до 35,8 ± 9,1 спайков/сек (p = 0,045) соответственно (Фиг. 15B). У самок ответы на расчесывание и сдавливание повышались от 0,0 до 8 ± 6,5 спайков/сек (p = 0,027) и от 9,3 ± 2,7 до 31,8 ± 13,6 спайков/сек (p = 0,016) соответственно (Фиг. 15С). В отличие от этого, ответы на щипок значительно повышались во всех HT нейронах у самок (19,3 ± 5,0 спайков/сек до CSD и 45,8 ± 12,4 спайков/сек после CSD, n = 6, p = 0,027), но не у самцов (33,8 ± 7,1 спайков/сек до CSD и 52,4 ± 10,3 спайков/сек после CSD, n = 6, p = 0,068) (Фиг. 15B и 15C).

У обработанных КГРП-мАТ крыс рецептивные поля лица расширялись только в 2/8 HT нейронах у самцов и в 0/6 HT нейронах у самок (Фиг. 13В). Через два часа после индукции CSD (через 6 часов после введения КГРП-мАТ) ответы нейронов на расчесывание (p = 0,35), сдавливание (p = 0,63) и щипок (p = 0,78) сохранялись неизменными во всех HT нейронах как у самцов, так и у самок (Фиг. 15D-15F), свидетельствуя о том, что КГРП-мАТ предупреждало индукцию сенсибилизации.

Усиленные ответы на стимуляцию роговицы после CSD

У обработанных изотип-конАТ крыс ответы на стимуляцию роговицы после CSD значительно повышались у самок (7,6 ± 1,9 спайков/сек до CSD и 21,0 ± 6,4 спайков/сек после CSD, n = 6, p = 0,044), но не у самцов (11,0 ± 2,6 спайков/сек до CSD и 21,6 ± 8,7 спайков/сек после CSD, n = 7, p = 0,19) в НТ нейронах (Фиг. 16A-16C).

У обработанных КГРП-мАТ самок крыс ответ на расчесывание роговицы сохранялся неизменным в 6 HT нейронах (p = 0,51), свидетельствуя о предупреждении сенсибилизации; и, как и ожидалось, он также сохранялся неизменным в 8 HT нейронах у самцов (10,8 ± 3,3 спайков/сек до CSD и 9,4 ± 1,8 (спайков/сек после CSD, p = 0,60) (Фиг. 16D-16F). Таким образом, КГРП-мАТ предупреждало развитие гиперчувствительности роговицы в HT нейронах у самок, но не у самцов крыс.

Обсуждение

Данное исследование демонстрирует, что гуманизированное моноклональное анти-КГРП антитело фреманезумаб ингибирует активацию и сенсибилизацию HT, но не WDR тригеминоваскулярных нейронов (Фиг. 17). У самцов КГРП-мАТ ингибировало спонтанную активность наивных HT нейронов и их ответы на стимуляцию внутричерепной твердой оболочки головного мозга, но не кожи лица или роговицы, в то время как у самок оно только ингибировало их ответы на стимуляцию внутричерепной твердой оболочки головного мозга. В то же время, при наличии достаточного времени КГРП-мАТ предупреждало активацию и последующую сенсибилизацию HT нейронов с помощью CSD у обоих полов, но не частичную активацию WDR нейронов. В механическом отношении эти результаты свидетельствуют о том, что HT нейроны играют определяющую роль (не признанную ранее) в инициации восприятия головной боли и развития аллодинии и центральной сенсибилизации. В клиническом отношении результаты данного изобретения могут облегчить объяснение терапевтической эффективности КГРП-мАТ в предупреждении головных болей внутричерепного происхождения, таких как мигрень, а также то, почему указанный терапевтический подход может быть неэффективным для каждого пациента, страдающего мигренью.

В указанном исследовании изучали эффекты КГРП-мАТ в отношении чувствительности различных классов тригеминоваскулярных нейронов. Ранее Storer и коллеги показали, что антагонист КГРП-R BIBN4096BS ингибирует наивные центральные тригеминоваскулярные нейроны в отношении электрической стимуляции верхнего саггитального синуса и микроионтофоретического введения L-глутамата (Storer et al., 2004, Br. J. Pharmacol. 142:1171-1181).

Эффекты фреманезумаба в отношении HT и WDR

При внутривенном введении КГРП-мАТ приводило к снижению спонтанной активности исходного уровня в HT, но не в WDR нейронах. Принимая во внимание современные и ранние доказательства того, что WDR тригеминоваскулярные нейроны активируются множеством стимуляций твердой оболочки головного мозга, используемых для исследования патофизиологии мигрени (Davis and Dostrovsky, 1988, J. Neurophysiol. 59:648-666; Burstein et al., 1998, J. Neurophysiol. 79:964-982; Storer et al., 2004, Brit. J. Pharmacol. 142:1171-1181; Zhang et al., 2011, Ann. Neurol. 69:855-865), целесообразно сделать вывод о том, что активация только WDR является недостаточной для индуцирования восприятия головной боли у пациентов, страдающих эпизодической мигренью, головные боли которых полностью или почти полностью предупреждаются терапией КГРП-мАТ (Bigal et al., 2015, Lancet Neurol. 14:1081-1090). И, наоборот, также целесообразно считать, что активация только WDR тригеминоваскулярных нейронов может быть достаточной для индукции восприятия головной боли у тех пациентов, страдающих эпизодической мигренью, которые не получают пользу от терапии КГРП-мАТ, поскольку на головную боль могло не влиять устранение сигналов, посылаемых в таламус из HT тригеминоваскулярных нейронов.

Помимо мигрени и тригеминоваскулярной системы, считалось, что HT и WDR нейроны играют важные роли в обработке болевых стимулов и восприятии боли (Craig AD, 2002, Nat. Rev. Neurosci. 3:655-666; Craig AD, 2003, Trends Neurosci. 26:303-307; Craig AD, 2003, Annu. Rev. Neurosci. 26:1-30). В то время как большинство HT нейронов проявляют небольшие рецептипные поля и отвечают исключительно на болевые механические стимулы, большинство WDR нейронов проявляют большие рецептивные поля и отвечают как на механические, так и на термические болевые стимулы (Price et al., 1976, J. Neurophysiol. 39:936-953; Price et al., 1978, J. Neurophysiol. 41:933-947; Hoffman et al., 1981, Neurophysiology 46:409-427; Dubner and Bennett, 1983, Annu. Rev. Neurosci. 6:381-418; Bushnell et al., 1984, J. Neurophysiol. 52:170-187; Surmeier et al., 1986, J. Neurophysiol. 56:328-350; Ferrington et al., 1987, J. Physiol. (Lond) 388:681-703; Dubner et al., 1989, J. Neurophysiol. 62:450-457; Maixner et al., 1989, J. Neurophysiol. 62:437-449; Laird and Cervero, 1991, J. Physiol. 434:561-575). На основании этих различий, в целом считается, что HT нейроны в большей степени способствуют пространственному кодированию (размеру, расположению) боли и в меньшей степени способствуют кодированию модальностей боли, в то время как WDR нейроны в большей степени способствуют иррадационным качествам боли. Наряду с этим также целесообразно, что эти пациенты, невосприимчивые к фреманезумабу, представляют собой пациентов, головные боли которых влияют на большие области головы (т.е., лобную, височную, затылочную, билатеральную), в то время как пациенты, головные боли которых являются в достаточной степени локализованными небольшими и отдаленными областями, будут находиться среди респондеров.

Эффективность при головной боли

Фреманезумаб приводил к снижению восприимчивости к механической стимуляции твердой оболочки головного мозга (как у самцов, так и самок), но не неболевой и болевой стимуляции кожи и роговицы. Этот результат, наряду с тем фактом, что КГРП-мАТ также предупреждал активацию HT тригеминоваскулярных нейронов с помощью CSD, закладывает научную основу для эффективности фреманезумаба в предупреждении головных болей внутричерепного происхождения. И, наоборот, отсутствие эффектов на модулирование обработки сенсорных и ноцицептивных сигналов, которые возникают в коже лица и роговице дает прогноз того, что указанный класс лекарственных препаратов будет оказывать незначительный терапевтический эффект на лечение продолжительных болевых состояний тройничного нерва, таких как сухой глаз и индуцированная вирусом герпеса невралгия тройничного нерва. Учитывая, что фреманезумаб приводил к ингибированию активации центральных тригеминоваскулярных нейронов из твердой оболочки головного мозга (механической, CSD), но не кожи или роговицы, и что размер указанной молекулы является слишком большим для того, чтобы проникать через гематоэнцефалический барьер, целесообразно предположить, что ингибирующие эффекты, описанные выше, были вторичными по отношению к (первичному) ингибированию ответов на вдавливание твердой оболочки головного мозга и CSD в периферических тригеминоваскулярных нейронах.

Принимая во внимание широкое распространение в организме волокон с КГРП (Kruger et al., 1988, J. Comp. Neurol. 273:149-162; Kruger et al., 1989, J. Comp. Neurol. 280:291-302; Silverman and Kruger, 1989, J. Comp. Neurol. 280:303-330), их присутствие в многочисленных сегментах спинного мозга (Hansen et al., 2016, Pain 157:666-676; Nees et al., 2016, Pain 157:687-697) и в многочисленных чувствительных дорсальных корешковых ганглиях (Edvinsson et al., 1998, J. Auton. Nerv. Syst. 70:15-22; Edvinsson et al., 2001, Microsc. Res. Techniq. 53:221-228; Cho et al., 2015, J. Korean Med. Sci. 30:1902-1910; Kestell et al., 2015, J. Comp. Neurol. 523:2555-2569; Spencer et al., 2016, J. Comp. Neurol. 524:3064-3083), удивительно, что КГРП-мАТ оказывало незначительный эффект или не оказывало эффекта на ответы центральных нейронов на болевую стимуляцию кожи и роговицы. Если принимается представление о том, что КГРП-мАТ действует главным образом на периферии, то целесообразно предположить, что периферические аспекты сенсорной иннервации оболочек головного мозга и то, как указанная иннервация влияет на сенсорную передачу в дорсальном роге, отличаются от таковых, участвующих в образовании боли в коже, роговице или других видов боли (соматической). Исследования эффектов фреманезумаба в животных моделях других болевых состояний должны обеспечивать более точную интерпретацию разницы между эффектами КГРП-мАТ в твердой оболочке головного мозга и внечерепных тканях, которые не считаются такими, которые имеют другую инициирующую рль в развитии мигрени.

Ингибирование CSD-индуцированной активации и сенсибилизации

Данное исследование демонстрирует сенсибилизацию центральных тригеминоваскулярных нейронов с помощью CSD. Указанную сенсибилизацию, наблюдаемую в НТ, но не WDR нейронах, как у самцов, так и у самок, предупреждали с помощью введения КГРП-мАТ. Эти результаты указывают на то, что кожная аллодиния в приступах, предваренная аурой (Burstein et al., 2000, Ann. Neurol. 47:614-624), опосредуется с помощью HT нейронов, которые являются невосприимчивыми к неболевой механической стимуляции кожи на исходном уровне (между приступами у пациентов и до индукции CSD у животных), но становятся восприимчивыми в механическом отношении к расчесыванию после CSD. В соответствии с указанным сценарием, среди пациентов с аурой мигрени, респондеры к профилактическому лечению КГРП-мАТ не будут проявлять признаков кожной аллодинии.

Самцы и самки

В данном исследовании также изучали эффекты КГРП-мАТ как у самцов, так и у самок крыс. Несмотря на то, что в целом анализ в зависимости от пола свидетельствует о том, что терапевтическая польза данного класса лекарственных препаратов должна быть аналогичной у самцов и самок, страдающих мигренью, также показано, что в наивном состоянии КГРП-мАТ приводит к снижению спонтанной активности в НТ нейронах у самцов, но не у самок, и что после индукции сенсибилизации с помощью CSD, только HT нейроны, регистрируемые у самок, проявляли признаки сенсибилизации к болевому стимулу кожи и роговицы. Принимая во внимание то, что мигрень является более распространенной у женщин, чем у мужчин, различия могут свидетельствовать о том, что гипералгезия (а не аллодиния) более вероятно развивается у женщин, чем у мужчин во время мигрени без ауры, и что попытки снижать возбудимость нейронов с помощью КГРП-мАТ в состоянии между приступами (т.е., в качестве профилактики) могут также быть более сложными у женщин, чем у мужчин. В механическом отношении три наблюдаемых различия могли быть связаны с более высокой возбудимостью HT нейронов у самок, либо вследствие внутренних свойств этих нейронов, либо вследствие различий в силе внешних сигналов, которые они получают из периферических ноцицепторов. В то время как данные для подтверждения первой точки зрения отсутствуют, возможно, что различия в активации иммунных клеток твердой оболочки головного мозга и воспалительные молекулы у самок по сравнению с самцами (McIlvried et al. (2015) Headache 55:943-957) могут подтверждать вторую точку зрения. Касательно способности фреманезумаба приводить к снижению спонтанной активности у самцов, но не у самок крыс, можно принять во внимание данные, показывающие, что самки крыс экспрессируют меньшее рецепторов КГРП в ганглии тройничного нерва и ядре тройничного нерва спинного мозга, и более высокие уровни кодирующей КГРП мРНК в дорсальном роге (Stucky et al. (2011) Headache 51:674-692).

В конечном итоге ингибирующие эффекты КГРП-мАТ требовались только несколько часов для достижения значимости. Это сравнительно короткое время (часы, а не дни) достигали с помощью внутривенного введения.

Пример 6 Оценка респондеров к анти-КГРП антителу (TEV-48125) с помощью поведенческих и психологических инструментов

Большинство лиц, страдающих эпизодической мигренью, нуждающихся во вторичной или третичной медицинской помощи, проявляют признаки кожной аллодинии и гипералгезии во время острой фазы мигрени, но те в то время, когда боль отсутствует (Burstein R et al. (2000) Ann. Neurol. 47:614-624). В отличие от этого, пациенты с хронической мигренью, обычно проявляют признак кожной аллодинии и гипералгезию как во время острых приступов мигрени, так и во время фазы между приступами. В механическом отношении считается, что аллодиния и гипералгезия опосредованы сенсибилизацией центральных тригеминоваскулярных нейронов в ядре тройничного нерва спинного мозга (Burstein R et al. (1998) J. Neurophysiol. 79(2): 964-982; Burstein R et al. (2000) Ann. Neurol. 47: 614-624; и Lipton et al. (2008) Ann. Neurol. 63(2):148-58). В отличие от этого, пациенты с хронической мигренью, обычно проявляют признак кожной аллодинии и гипералгезию как во время острых приступов мигрени, так и во время фазы между приступами. В механическом отношении считается, что аллодиния и гипералгезия опосредованы сенсибилизацией центральных тригеминоваскулярных нейронов в ядре тройничного нерва спинного мозга (см. Burstein (1998)). В Примере 5 демонстрируется, что TEV-48125, посредством ингибирующего действия в периферических менингеальных ноцицепторах, способно предупреждать активацию и сенсибилизацию высокопороговых (HT) нейронов в ядре тройничного нерва спинного мозга в той степени, которая является намного большей, чем его способность ингибировать нейроны с широким динамическим диапазоном (WDR) (см. также Melo-Carrillo et al. (2017) J. Neurosci. 37(30): 7149-63). Принимая во внимание, что HT нейроны отвечают исключительно на болевые (болезненные) стимулы, в то время как WDR нейроны отвечают предпочтительно на болевые стимулы (т.е., их ответ на болевые стимулы является большим, чем их ответ на неболевые стимулы), целесообразно предположить, что блокада HT будет предупреждать гипералгезию более эффективно, чем аллодинию.

К настоящему времени в литературе отсутствуют примеры или предположения примеров лекарственных препаратов, которые приводят к снижению активации и сенсибилизации только одного из этих двух классов ноцицептивных рецепторов в ядре тройничного нерва спинного мозга. Принимая во внимание то, что фреманезумаб ингибирует менингеальные Aδ-, но не C-волокна, селективное ингибирование Aδ-волокон потенциально объясняет селективное ингибирование антителом HT нейронов (см. Melo-Carillo et al. (2017) J. Neurosci. 37(44): 10587-96). Кроме того, поскольку C-волокна могут не влиять на активность HT нейронов, как следствие, фреманезумаб может достигать очень избирательного эффекта в отношении восходящих ноцицептивных тригеминоваскулярных путей, активность которых зависит от высвобождения КГРП в периферии.

Не желая ограничиваться какой-либо определенной теорией, считается, что респондеры представляют собой субъектов, которым непрерывный периферический входящий сигнал требуется для поддержания центральной сенсибилизации в WDR и HT нейронах, в то время как нереспондеры представляют собой субъектов, которым непрерывный периферический входящий сигнал не требуется для поддержания центральной сенсибилизации в WDR и HT нейронах. Поскольку фреманезумаб блокирует активацию Aδ-волокон у респондеров, эта блокада может быть достаточной для того, чтобы сделать HT нейроны полностью дремлющими (т.е, прекратить их сенсибилизацию). Фреманезумаб также может приводить к снижению общего входного сигнала, который управляет состоянием сенсибилизации WDR нейронов до той степени, в которой входной сигнал, который нейроны получают только от незаблокированных C-волокон, индуцирует возбуждающие постсинаптические потенциалы (EPSP), но не фактические потенциалы действия. Состояние сенсибилизации как WDR, так и HT нейронов может быть обратимым с помощью фреманезумаба, а аллодиния/гипералгезия будет обратимой у респондеров. И, наоборот, у нересподеров сенсибилизация либо HT, либо WDR нейронов, либо обоих является полностью независимой от перифического входного сигнала, вне зависимости от того, происходит ли он в Aδ- или C-волокнах. Соответственно, нереспондеры будут проявлять аллодинию и/или гипералгезию после лечения. Ожидается, что другие анти-КГРП антитела (например, анти-КГРП антитело, описанное в данном документе) будут проявлять то же самое поведение, что и фреманезумаб.

Схема исследования

Общая стратегия: определить пороговые значения болевой чувствительности в коже (которые исследуются в случае аллодинии), и болевой шкалы в ответ на повторную сверхпороговые механические и тепловые стимулы (которые исследуются в случае гипералгезии) у пациентов, страдающих хронической мигренью, в 4 различных условиях: (a) до лечения, в то время, когда мигрень отсутствует, (b) после лечения, в то время, когда мигрень отсутствует, и при возможности (c) до и после лечения, в промежутке между острым приступом мигрени. Примечание: часть (c) не является необходимой для идентификации респондеров среди популяции CM. Она может иметь значения для идентификации респондеров среди пациентов, страдающих высокой частотой эпизодов.

Отбор и включение пациентов в исследование: индивидуумы с хронической мигренью будут рассматриваться в данном исследовании. Первичными критериями включения будут (1) возраст от 18 до 64 лет, (2) в анамнезе хроническая мигрень с аурой или без ауры, на основе Международной классификации головных болей (3-е издание), в течение по меньшей мере 3 лет, и (3) способность общаться на английском языке (с целью понимания и следования инструкциям исследования). Критерии исключения будут включать в себя: (1) менее чем пятнадцать дней головной боли в месяц; (2) беременность; (3) в анамнезе аортно-коронарное шунтирование, сердечный приступ, стенокардия, инсульт, серьезное кровотечение желудочно-кишечного тракта, заболевания язвой желудка; или хроническая болезнь почек; (5) наличие медицинских состояний, требующих применения диуретиков или ежедневных антикоагулянтов.

Открытая схема: после скрининга, который будет проводить в предварительно включенный в график день (визит 1), анамнез мигрени участников исследования будет проанализирован с помощью опросника, и будет выполнено количественное сенсорное тестирование. Визит 1 будет проходить по меньшей мере за 30 дней до визита 2, когда участник не имеет головной боли. Участникам будет дана инструкция хранить дневник ежедневный дневник головной боли в течение указанного периода.

Визит 2 будет проходить, когда участник исследования имеет мигрень, и будет включать в себя 3 цикла оценки боли и QST в случае оценки аллодинии и гипералгезии. Первый цикл оценки боли будет проходить до лечения и по меньшей мере через 2 часа после начала приступа. Пациенты будут рандомизированы с целью получения либо плацебо (антитела изотипического контроля), либо 675 мг фреманезумаба подкожно. Второй цикл оценки боли будет происходить через два часа после лечения. Третий цикл оценки боли будет происходить через 4 часа после лечения. Участникам будет дана инструкция хранить дневник ежедневный дневник головной боли в течение всего исследования.

Визит 3 будет происходить через 1 неделю после лечения и будет включать в себя анализ ежедневного дневника головной боли, оценку интенсивности головной боли и исследование QST в случае аллодинии и гипералгезии.

Визит 3 будет происходить через 4 недели после лечения и будет включать в себя анализ ежедневного дневника головной боли, оценку интенсивности головной боли и исследование QST в случае аллодинии и гипералгезии.

При каждом визите будет фиксироваться интенсивность головной боли исходного уровня, порог болевой чувствительности к количественным механическим и тепловым стимулам, а также шкалу интенсивности головной боли в ответ на сверхпороговые и тепловые стимулы.

Количественное сенсорное тестирование (QST): тестирование будет проходить в тихой комнате вдали от шума и отвлекающих факторов. Пациенты смогут выбрать наиболее удобное положение (сидя на стуле или лежа в кровати) во время сенсорного тестирования. При каждой сессии тестирования пороги болевой чувствительности к тепловой и механической стимуляции будут определяться в коже над участком, где указана боль. Указанный участок включает в себя чаще всего периорбитальные и височные области. Тепловые стимулы в отношении кожи будут подаваться с помощью 30 x 30 мм² термода (Q-Sense 2016, Medoc), прикрепленного к коже при постоянном давлении и пороговая болевая чувствительность будет определена с помощью Метода предела.

Исследование аллодинии: для определения пороговой болевой чувствительности коже дадут приспособиться к температуре 32°C в течение 5 минут и затем будут нагревать с медленной скоростью (1 °C/сек) до того момента, пока не начнет ощущаться чувство боли, в момент которой субъект останавливает действие стимула с помощью нажатия кнопки единицы ответа пациента. Каждый тепловой стимул будет повторяться три раза и среднее из регистрируемых температур будет считаться пороговым значением. Порог болевой чувствительности к механическим стимулам будет определяться с помощью совокупности из 20 калибровочных нитей фон Фрея (VFH, Stoelting). Каждому моноволокну VFH назначается номер по шкале в возрастающем порядке (1 = 0,0045 г, 2 = 0,023 г, 3 = 0,027 г, 4 = 0,07 г, 5 = 0,16 г, 6 = 0,4 г, 7 = 0,7 г, 8 = 1,2 г, 9 = 1,5 г, 10 = 2,0 г, 11 = 3,6 г, 12 = 5,4 г, 13 = 8,5 г, 14 = 11,7 г, 15 = 15,1 г, 16 = 28,8 г, 17 = 75 г, 18 = 125 г, 19 = 281 г). Поскольку существует линейная связь между логарифмом силы и ранжированным числом, то пороговые значения болевой чувствительности к механическим стимулам выражают в виде чисел VFH (№), а не их сил (г). Каждое моноволокно будет прикладываться к коже 3 раза (в течение 2 секунд), а наименьшее число VFH, способное индуцировать боль в двух из трех попыток будет считаться пороговым значением. Чувствительность кожи также будут определять с помощью регистрации восприятия субъектом мягкого прикосновения кистью к коже, которое представляет собой динамический механический стимул, отличающийся от VFH, которое представляет собой статический механический стимул, отличающийся от VFH, который представляет собой статический механический стимул.

Исследование гипералгезии: если болезненный стимул воспринимается как более болезненный, чем обычно, считается, что субъект имеет гипералгезию. Для определения того, имеет ли субъект гипералгезию, 3 сверхпороговых тепловых и механических стимула будут прикладываться к коже. Значение сверхпорогового стимула будет определяться во время исследования аллодиини, описанного выше. Например, если порог болевой чувствительности к тепловому стимулу составляет 45°C, при исследовании гипералгезии будет использоваться 46 °C. В указанном исследовании на кожу будут воздействовать 3 сверхпороговыми стимулами (1 надпороговый), при этом каждый продолжается 10 секунд и отделен 10 секундами (т.е., интервал между стимулами составляет 10 секунд). В конце каждого стимула пациент будет иметь 10 секунд для определения боли с помощью визуальной аналоговой шкалы (VAS) от 0 до 10 (o = отсутствие боли, 10 = боль, которую только можно представить). Аналогичное исследование будет проводиться с помощью сверхпороговой механической стимуляции.

Оборудование, используемое для количественного сенсорного тестирования имеет одобрение со стороны FDA. Оно является традиционно используемым неврологами, медсестрами и специалистами по изучению боли по всей стране. Оно не заключает в себе риска или дискомфорта, и поскольку оно контролируется пациентом, подача стимулов может быть остановлена в любое время.

Интерпретация QST

Аллодиния: Поскольку выявление порога болевой чувствительности зависит от входного сигнала субъективных данных, несколько алгоритмов были разработаны с целью сведения к минимуму субъективной вариации и получения результатов как можно более объективными. Эти алгоритмы включены в компьютерную программу, которая контролирует тепловой и механический сенсорный анализатор (Q-Sense 2016). У здоровых субъектов, пороги болевой чувствительности к тепловым и механическим стимулам кожи находятся в диапазоне 42-47 ^oC и 75-281 г соответственно (см. Lindblom (1994) Analysis of abnormal touch, pain, and temperature sensation in patients. в Boivie J, Hansson P, Lindblom U, eds. Touch, temperature and pain in health and disease: mechanism and assessments. Vol, 3. Progress in brain research and management. Seattle: IASP press. p 63-84; и Strigo et al. (2000) Anesthesiology 92(3): 699-707. С использованием более строгих критериев будет считаться, что субъект имеет аллодинию, если ее/его порог болевой чувствительности составляет ниже 41 ^oC в случае теплового воздействия и ниже 30 г для вдавливания в кожу с помощью калиброванных нитей фон Фрея. Соответствие критерию для любой модальности будет достаточным для определения того, что субъект имеет аллодинию (Burstein et al. (2004) Ann. Neurol. 47(5): 614-24; и Burstein et al. (2004) Ann. Neurol. 55(1): 19-26).

Гипералгезия: любое изменение оценки боли, которое составляет более 30%, будет считаться доказательством гипералгезии (например, если сверхпороговый стимул № 1 оценивается как 6/10 в соответствии с VAS, то сверхпороговый стимул № 3 будет оцениваться при 8/10 или выше).

В анализе данных будут учитываться значения порогов болевой чувствительности к механическим и тепловым стимулам до и после лечения.

Анализ данных

Анализ данных будет включать субъектов, которые завершают все 4 визита и 6 сессий исследования.

Первичный критерий эффективности представляет собой наличие или отсутствие аллодинии после вмешательства (1 месяц) у респондеров и нереспондеров. Респондеры главным образом определены как испытывающие минимальное снижение на 50% количества дней головной боли в течение месяца; нереспондеры определены как имеющие максимальное снижение на менее чем 50% количества дней головной боли в течение месяца. Вторичное определение относится к респондерам, как испытывающим минимальное снижение на 60% количества дней головной боли в течение месяца; нереспондеры определены как имеющие максимальное снижение на менее чем 40% количества дней головной боли в течение месяца. Дополнительное вторичное определение относится к респондерам, как испытывающим минимальное снижение на 75% количества дней головной боли в течение месяца; нереспондеры определены как имеющие максимальное снижение на менее чем 25% количества дней головной боли в течение месяца.

Первичный критерий эффективности будет исследоваться с помощью критерий хи-квадрата (χ²) для оценки категорийной ассоциации между наличием аллодинии (да/нет) и восприимчивостью субъектов (да/нет). Вторичные критерии эффективности представляют собой продолжительность мигрени (часы) до и после вмешательства (1 месяц) и изменения интенсивности головной боли через 2 и 4 часа после вмешательства.

Данные непрерывных вторичных критериев эффективности сначала будут исследоваться на нормальность для того, чтобы определить подойдут ли параметрические или непараметрические виды анализа. Соответственно, параметры центрального распределения (средние/медианы) будут использованы для оценки различий этих переменных между респондерами и нереспондерами.

В анализах будут также использоваться эффекты следующих факторов первичных и вторичных критериев эффективности: число лет с мигренью, число лет с CM, анамнез, ассоциированные симптомы (например, тошнота, рвота, фотофобия, фонофобия, осмофобия, аура, мышечная боль), распространенные триггеры (например, стресс, длительное бодрствование, пищевая депривация, менструация), а также анамнез острого и профилактического лечения.

Анализ мощности:

Анализ мощности был основан на критерии согласия хи-квадрат (χ²) и Z-сравнении тестов для пропорций. Включали α 5% (уровень значимости), 1-β вероятность ошибки 90% (мощность), w 0,36 (величина эффекта; критерий согласия χ²) и соотношение распределения 1:1 (Z-сравнение теста для пропорций). Стратификационный анализ включал в себя переменные Группа (плацебо и лечение), Восприимчивость (респондер и нереспондре; см. определение выше) и Аллодиния (присутствие и отсутствие). Первичная гипотеза заключалась в том, что пропорции респондеров после вмешательства (в соответствии с вышеупомянутым определением 50% снижения порога количества дней головной боли в месяц) в группах лечения и плацебо будут составлять 55% и 25% соответственно (на основании опубликованных данных Bigal et al. (2015) Lancet Neurol. 14(11): 1091-100). Указанный расчет приводил к необходимому количеству 64 субъекта в каждой из групп плацебо и лечения (df = 5; критический χ² = 11,07; параметр нецентральности λ = 16,51, Фиг. 4). Дополнительные 20% составляли потенциальных пациентов, исключенных из исследования. Таким образом, в общей сложности 77 пациента необходимо включать в каждую группу, что приведет к общему количеству 144 пациентов во всем исследовании.

Пример 7 Селективное ингибирование тригеминоваскулярных нейронов первого порядка с помощью анти-КГРП антитела (фреманезумаб)

Значительное число фактов подтверждает важную роль КГРП в патофизиологии мигрени. Указанные факты приводят к повсеместным попыткам разработки нового поколения лекарственных препаратов, которые снижают доступность КГРП у лиц, страдающих мигренью. В последнее время было обнаружено, что второе поколение лекарственных таких препаратов, КГРП-мАТ, является эффективным в снижении частоты хронической или эпизодической мигрени. С целью исследования нейральной основы для указанного терапевтического действия исследовали эффект фреманезумаба, КГРП-мАТ, на активность нейронов первого и второго порядка в менингеальном сенсорном пути. В данном исследовании показаны эффекты фреманезумаба на нейроны первого порядка в ганглии тройничного нерва (Фиг. 18A-21B).

Схема/способы:

Методики внеклеточной регистрации одиночных нейронов использовали для определения эффектов фреманезумаба (30 мг/кг, в/в) и его изотипа (контроль) в отношении активности тригеминоваскулярных нейронов первого порядка в ганглии тройничного нерва, вызванные распространяющейся корковой депрессией (CSD) у самцов крыс под анестезией уретаном. CSD индуцировали с помощью укола через 4 часа после инфузии лекарственного препарата/изотипа.

Результаты

CSD индуцировала активацию 40% нейронов, исследуемых у обработанных изотипом животных, и 20% нейронов у обработанных фреманезумабом животных. Как продемонстрировано на Фиг. 21A (a-дельта), у обработанных изотипом животных, CSD активировала 54% всех a-дельта-волокон, что было аналогичным проценту a-дельта-волокон, активированных с помощью CSD, у необработанных животных. В отличие от животных, обработанных фреманезумабом, CSD активировала только 14% всех a-дельта-волокон. Эта разница была статистически значимой (Z-тест p = 0,001). У обработанных изотипом животных (Фиг. 21B; C-тип), CSD активировала 31% всех C-волокон, что было аналогичным проценту C-волокон, активированных с помощью CSD у необработанных животных. Аналогичным образом, у животных, обработанных фреманезумабом, CSD активировала 23% всех С-волокон. Эта разница была статистически незначимой (Z-тест p>0,05).

Таким образом, эффект фреманезумаба был избирательным в отношении A-дельта-нейронов: процент A-дельта-нейронов, которые отвечали на CSD, был значимо снижен (p<0,05) от 54% (изотип) до 14% (фреманезумаб) (Фиг. 21A), в то время как процент нейронов типа C-волокон, которые отвечали на CSD, показал отсутствие значимого изменения (31% и 23%, изотип и фреманезумаб) (Фиг. 21B).

Избирательное действие фреманезумаба в отношении нейронов первого порядка А-дельта, но не типа C-волокон может облегчать понимание селективного ингибирования высокопороговых нейронов второго порядка, но не нейронов с широким динамическим диапазоном. В случае пациентов, хронические и эпизодические мигрени которых ослабляются фреманезумабом, указанные результаты указывают на возможность того, что А-дельта-нейроны играют определяющую роль в инициации и переходе в хроническую форму восприятия головной боли, при этом нейроны типа С-волокон способствуют ассоциированной аллодинии и центральной сенсибилизации.

Не желая быть связанным какой-либо определенной теорией, предложен предполагаемый механизм предупреждения мигрени с помощью анти-КГРП моноклональных антител. Вкратце, CSD индуцирует кратковременное сжатие, кратковременную дилатацию и продолжительное сжатие пиальных артерий, а также незамедлительную и задержанную активацию менингеальных ноцицепторов типа C-волокон, содержащих КГРП. При их независимой от КГРП активации менингеальные С-волокна высвобождают КГРП в твердую оболочку головного мозга, опосредуют зависимую от КГРП активацию расположенных рядом Aδ-волокон. После активации менингеальные рецепторы типа C-волокон конвергируются и активируют WDR нейроны в ядре тройничного нерва спинного мозга, в то время как Aδ-волокна конвергируются и активируют как WDR, так и HT нейроны, которые в конечном итоге передают ноцицептивные сигналы из твердой оболочки головного мозга в таламус. Отсутствие рецепторов КГРП от менингеальных C-волокон делает активацию пути с участием C-WDR независимым от КГРП, и, таким образом, невосприимчивым к анти-КГРП моноклональным антителам. В отличие от этого, наличие рецепторов КГРП на менингеальных Aδ-волокнах делает активацию пути с участием Aδ-HT зависимым от КГРП, и, таким образом, восприимчивым к анти-КГРП моноклональным антителам.

Пример 8: Анти-антагонист КГРП антитело предупреждает головные боли после приступа (PIH)

Электрофизиологические методики работы с одиночными нейронами использовали для изучения профиля ответа периферических и центральных тригеминовасклярных нейронов в ядре тройничного нерва спинного мозга в ответ на появление судорог у крыс, обработанных фреманезумабом (TEV-48125) по сравнению с необработанными крысами. Корковые электроды использовали для отслеживания величины, степени и прогрессирования эпилептиформных судорог.

Хирургический препарат и регистрация одиночных нейронов. Регистрации одиночных нейронов получали из нейронов в ганглии тройничного нерва и дорсальном роге, как описано в предыдущих исследованиях (Burstein et al. (1998) J. Neurophysiol. 79: 964-82; Strassman and Levy (2006) J. Neurophysiol. 95: 1298-306; Strassman et al. (1996) Nature 384: 560-4; Zhang et al. (2010) J. Neurosci. 30: 8807-14; и Zhang et al. (2011) Ann. Neurol. 69: 855-65). Эксперименты выполняли у взрослых крыс Sprague-Dawley (от 250 г до 350 г). Животных анестезировали с помощью уретана (1,2-1,5 г/кг), искусственно насыщали их кровь кислородом и парализовали. Контролировали температуру тела, а также CO₂ в конце спокойного выдоха и насыщения кислородом. В случае регистрации из ганглиев выполняли четыре отдельные краниотомии: над контролатеральной корой головного мозга, с целью продвижения микроэлектрода; над ипсилатеральной теменной корой головного мозга и ипсилатеральной затылочной корой головного мозга, с целью применения пикротоксина и регистрации электрокортикограммной активности; и над ипсилатеральным поперечным синусом, с целью электрической и механической стимуляции афферентов твердой оболочки головного мозга, а также применения лидокаина. В случае регистрации из дорсальных рогов выполняли те же самые виды краниометрии над ипсилатеральной корой головного мозга и ипсилательным поперечным синусом, однако не выполняли контралатеральную краниотомию. Вместо этого, выполняли ламинэктомию с целью воздействия на верхний шейный сегмент спинного мозга (C1-2) с целью регистрации с использованием микроэлектродов. Как в экспериментах с регистрацией из ганглия тройничного нерва, так и в экспериментах с регистраций из дорсальных рогов стимулом для поиска с целью обнаружения чувствительных в отношении твердой оболочки головного мозга нейронов является одноимпульсная электрическая стимуляцию, применяемая в отношении твердой оболочки головного мозга, покрывающей поперечный синус.

Индукция судорог и регистрация электрокортикограммы. Судороги индуцировали с помощью использования пикротоксина в отношении поверхности коры головного мозга (10 мкл, нанесенные на небольшой участок губки Гельфоум, в концентрации либо 5 мM, либо 100 мM, в случае очаговых или генерализованных судорог соответственно). Для проверки индукции судорог активность коры регистрировали с помощью стеклянной микропипетки (0,9% солевой раствор, ~1 мегом, кончик 7 мкм), расположенной непосредственно ниже поверхности коры головного мозга, в теменной и затылочной области.

Обработка моноклональным анти-КГРП антителом TEV-48125 TEV-48125 (TEVA Pharmaceutical Industries Ltd., Израиль) представляет собой гуманизированное моноклональное анти-КГРП антитело (КГРП-мАТ). Его разбавляли в солевом растворе до конечной дозы 30 мг/кг и вводили внутривенно (общий объем 0,8 мл) за четыре часа до индукции судороги.

Результаты. У необработанных животных индукция судорог вызывала длительную активацию периферических и центральных тригеминоваскулярных нейронов. В ганглии активность начинала повышаться через несколько минут после того, как судорога достигала своих рецептивных полей и сохранялась повышенной до тех пор, пока активность судороги продолжалась (Фиг. 22A-22D). В медуллярном дорсальном роге 28/30 (93%) нейронов были активированы в течение свыше 2 часов в результате судороги (Фиг. 23A-23E). В отличие от этого, у обработанных TEV-48125 животных только 2/13 (15%) нейронов были активированы в результате судороги (Фиг. 24).

Выводы. В данном примере показана активация тригеминоваскулярного пути в результате судороги и предупреждение такой активации с помощью TEV-48125. Поскольку тригеминоваскулярный путь опосредует головные боли после приступа (PIH), эти результаты демонстрируют, что TEV-48125 может предупреждать PIH при профилактическом введении. Крайне важно, что результаты показывают, что у необработанных животных индукция судороги вызывала длительную активацию в 28/30 (93%) нейронах, в то время как у обработанных TEV-48125 животных только 2/13 (15%) нейронов были активированы в результате судороги.

Последовательности антител

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи G1 (SEQ ID NO:1)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPGKGLEWVAEIRSESDASATHYAEAVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCLAYFDYGLAIQNYWGQGTLVTVSS

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи G1 (SEQ ID NO:2)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQAPRLLIYGASNRYLGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSYNYPYTFGQGTKLEIK

CDR H1 G1 (удлиненная CDR) (SEQ ID NO:3)

GFTFSNYWIS

CDR H2 G1 (удлиненная CDR) (SEQ ID NO:4)

EIRSESDASATHYAEAVKG

CDR H3 G1 (SEQ ID NO:5)

YFDYGLAIQNY

CDR L1 G1 (SEQ ID NO:6)

KASKRVTTYVS

CDR L2 G1 (SEQ ID NO:7)

GASNRYL

CDR L3 G1 (SEQ ID NO:8)

SQSYNYPYT

Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи G1 (SEQ ID NO:9)

GAAGTTCAGCTGGTTGAATCCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCAGGTGGTTCCCTGCGTCTGTCCTGCGCTGCTTCCGGTTTCACCTTCTCCAACTACTGGATCTCCTGGGTTCGTCAGGCTCCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCTGAAATCCGTTCCGAATCCGACGCGTCCGCTACCCATTACGCTGAAGCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCCCGTGACAACGCTAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGTGCTGAAGACACCGCTGTTTACTACTGCCTGGCTTACTTTGACTACGGTCTGGCTATCCAGAACTACTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCCTCC

Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи G1 (SEQ ID NO:10)

GAAATCGTTCTGACCCAGTCCCCGGCTACCCTGTCCCTGTCCCCAGGTGAACGTGCTACCCTGTCCTGCAAAGCTTCCAAACGGGTTACCACCTACGTTTCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGTCAGGCTCCTCGTCTGCTGATCTACGGTGCTTCCAACCGTTACCTCGGTATCCCAGCTCGTTTCTCCGGTTCCGGTTCCGGTACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGGAACCCGAAGACTTCGCTGTTTACTACTGCAGTCAGTCCTACAACTACCCCTACACCTTCGGTCAGGGTACCAAACTGGAAATCAAA

Аминокислотная последовательность тяжелой цепи полноразмерного антитела G1 (в том числе модифицированного IgG2, описанного в данном документе) (SEQ ID NO:11)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPGKGLEWVAEIRSESDASATHYAEAVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCLAYFDYGLAIQNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Аминокислотная последовательность легкой цепи полноразмерного антитела G1 (SEQ ID NO:12)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQAPRLLIYGASNRYLGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSYNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи полноразмерного антитела G1 (в том числе модифицированного IgG2, описанного в данном документе) (SEQ ID NO:13)

GAAGTTCAGCTGGTTGAATCCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCAGGTGGTTCCCTGCGTCTGTCCTGCGCTGCTTCCGGTTTCACCTTCTCCAACTACTGGATCTCCTGGGTTCGTCAGGCTCCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCTGAAATCCGTTCCGAATCCGACGCGTCCGCTACCCATTACGCTGAAGCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCCCGTGACAACGCTAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGTGCTGAAGACACCGCTGTTTACTACTGCCTGGCTTACTTTGACTACGGTCTGGCTATCCAGAACTACTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCCTCCGCCTCCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAGTAA

Нуклеотидная последовательность легкой цепи полноразмерного антитела G1 (SEQ ID NO:14)

GAAATCGTTCTGACCCAGTCCCCGGCTACCCTGTCCCTGTCCCCAGGTGAACGTGCTACCCTGTCCTGCAAAGCTTCCAAACGGGTTACCACCTACGTTTCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGTCAGGCTCCTCGTCTGCTGATCTACGGTGCTTCCAACCGTTACCTCGGTATCCCAGCTCGTTTCTCCGGTTCCGGTTCCGGTACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGGAACCCGAAGACTTCGCTGTTTACTACTGCAGTCAGTCCTACAACTACCCCTACACCTTCGGTCAGGGTACCAAACTGGAAATCAAACGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCGCGCGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGCTAA

Сравнение аминокислотных последовательностей КГРП человека и крысы (α-КГРП человека (SEQ ID NO:15); β-КГРП человека (SEQ ID NO:43); α-КГРП крысы (SEQ ID NO:41); и β-КГРП крысы (SEQ ID NO:44))

NH2-ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-CONH2 (α-КГРП человека)

NH2-ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-CONH2 (β-КГРП человека)

NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSEAF-CONH2 (α-КГРП крысы)

NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSKAF-CONH2 (β-КГРП крысы)

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи LCVR17 (SEQ ID NO:58)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSEYHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGDALPPTFGQGTKLEIK

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи HCVR22 (SEQ ID NO:59)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGTGDTRYIQKFAGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLSDYVSGFSYWGQGTLVTVSS

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи LCVR18 (SEQ ID NO:60)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSEYHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGDALPPTFGQGTKLEIK

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи HCVR23 (SEQ ID NO:61)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGTGKTVYIQKFAGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLSDYVSGFSYWGQGTLVTVSS

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи LCVR19 (SEQ ID NO:62)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSGYHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDALPPTFGGGTKVEIK

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи HCVR24 (SEQ ID NO:63)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGTGKTVYIQKFADRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSDYVSGFGYWGQGTTVTVSS

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи LCVR20 (SEQ ID NO:64)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIDKYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSEYHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGDALPPTFGQGTKLEIK

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи HCVR25 (SEQ ID NO:65)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGTGKTVYIQKFAGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLSDYVSGFGYWGQGTLVTVSS

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи LCVR21 (SEQ ID NO:66)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDKYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSGYHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDALPPTFGGGTKVEIK

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи HCVR26 (SEQ ID NO:67)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAIYEGTGKTVYIQKFAGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLSDYVSGFGYWGQGTTVTVSS

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи LCVR27 (SEQ ID NO:68)

QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKR

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи HCVR28 (SEQ ID NO:69)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи LCVR29 (SEQ ID NO:70)

QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKR

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи HCVR30 (SEQ ID NO:71)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи LCVR31 (SEQ ID NO:72)

QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIKR

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи HCVR32 (SEQ ID NO:73)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGINDNTYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи LCVR33 (SEQ ID NO:74)

QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGQPPKQLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCNDAAAYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTEVVVKR

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи HCVR34 (SEQ ID NO:75)

QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCSVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWIGVIGINGATYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи LCVR35 (SEQ ID NO:76)

QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIKR

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи HCVR36 (SEQ ID NO:77)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGINGATYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVTVSS

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи LCVR37 (SEQ ID NO:78)

QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSTTLGITGLQTGDEADYYCGTWDSRLSAVVFGGGTKLTVL

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи HCVR38 (SEQ ID NO:79)

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSIKYSVDSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDRLNYYDSSGYYHYKYYGMAVWGQGTTVTVSS

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> БЕТ ИЗРЕЙЭЛ ДИКОНИСС МЕДИКАЛ СЕНТЕР, ИНК.

<120> ОТБОР ПАЦИЕНТОВ С ГОЛОВНОЙ БОЛЬЮ, ВОСПРИИМЧИВЫХ К АНТИТЕЛАМ,

НАПРАВЛЕННЫМ ПРОТИВ КАЛЬЦИТОНИН ГЕН-РОДСТВЕННОГО ПЕПТИДА

<130> 43612-0017WO1

<140> PCT/US2018/020536

<141> 2018-03-01

<150> 62/516,406

<151> 2017-06-07

<150> 62/514,346

<151> 2017-06-02

<150> 62/490,953

<151> 2017-04-27

<150> 62/466,158

<151> 2017-03-02

<160> 109

<170> Версия PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 122

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Ser Glu Ser Asp Ala Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu

50 55 60

Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Leu Ala Tyr Phe Asp Tyr Gly Leu Ala Ile Gln Asn Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 2

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Lys Arg Val Thr Thr Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Leu Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 3

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Ile Ser

1 5 10

<210> 4

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 4

Glu Ile Arg Ser Glu Ser Asp Ala Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu Ala

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 5

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 5

Tyr Phe Asp Tyr Gly Leu Ala Ile Gln Asn Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 6

Lys Ala Ser Lys Arg Val Thr Thr Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 7

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 7

Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Leu

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 8

Ser Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 9

<211> 366

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 9

gaagttcagc tggttgaatc cggtggtggt ctggttcagc caggtggttc cctgcgtctg 60

tcctgcgctg cttccggttt caccttctcc aactactgga tctcctgggt tcgtcaggct 120

cctggtaaag gtctggaatg ggttgctgaa atccgttccg aatccgacgc gtccgctacc 180

cattacgctg aagctgttaa aggtcgtttc accatctccc gtgacaacgc taagaactcc 240

ctgtacctgc agatgaactc cctgcgtgct gaagacaccg ctgtttacta ctgcctggct 300

tactttgact acggtctggc tatccagaac tactggggtc agggtaccct ggttaccgtt 360

tcctcc 366

<210> 10

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 10

gaaatcgttc tgacccagtc cccggctacc ctgtccctgt ccccaggtga acgtgctacc 60

ctgtcctgca aagcttccaa acgggttacc acctacgttt cctggtacca gcagaaaccc 120

ggtcaggctc ctcgtctgct gatctacggt gcttccaacc gttacctcgg tatcccagct 180

cgtttctccg gttccggttc cggtaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctggaaccc 240

gaagacttcg ctgtttacta ctgcagtcag tcctacaact acccctacac cttcggtcag 300

ggtaccaaac tggaaatcaa a 321

<210> 11

<211> 448

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Ser Glu Ser Asp Ala Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu

50 55 60

Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Leu Ala Tyr Phe Asp Tyr Gly Leu Ala Ile Gln Asn Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys

210 215 220

Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 12

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 12

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Lys Arg Val Thr Thr Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Leu Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 13

<211> 1347

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 13

gaagttcagc tggttgaatc cggtggtggt ctggttcagc caggtggttc cctgcgtctg 60

tcctgcgctg cttccggttt caccttctcc aactactgga tctcctgggt tcgtcaggct 120

cctggtaaag gtctggaatg ggttgctgaa atccgttccg aatccgacgc gtccgctacc 180

cattacgctg aagctgttaa aggtcgtttc accatctccc gtgacaacgc taagaactcc 240

ctgtacctgc agatgaactc cctgcgtgct gaagacaccg ctgtttacta ctgcctggct 300

tactttgact acggtctggc tatccagaac tactggggtc agggtaccct ggttaccgtt 360

tcctccgcct ccaccaaggg cccatctgtc ttcccactgg ccccatgctc ccgcagcacc 420

tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttcccaga acctgtgacc 480

gtgtcctgga actctggcgc tctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag 540

tcctcaggtc tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc catccagcaa cttcggcacc 600

cagacctaca cctgcaacgt agatcacaag ccaagcaaca ccaaggtcga caagaccgtg 660

gagagaaagt gttgtgtgga gtgtccacct tgtccagccc ctccagtggc cggaccatcc 720

gtgttcctgt tccctccaaa gccaaaggac accctgatga tctccagaac cccagaggtg 780

acctgtgtgg tggtggacgt gtcccacgag gacccagagg tgcagttcaa ctggtatgtg 840

gacggagtgg aggtgcacaa cgccaagacc aagccaagag aggagcagtt caactccacc 900

ttcagagtgg tgagcgtgct gaccgtggtg caccaggact ggctgaacgg aaaggagtat 960

aagtgtaagg tgtccaacaa gggactgcca tccagcatcg agaagaccat ctccaagacc 1020

aagggacagc caagagagcc acaggtgtat accctgcccc catccagaga ggagatgacc 1080

aagaaccagg tgtccctgac ctgtctggtg aagggattct atccatccga catcgccgtg 1140

gagtgggagt ccaacggaca gccagagaac aactataaga ccacccctcc aatgctggac 1200

tccgacggat ccttcttcct gtattccaag ctgaccgtgg acaagtccag atggcagcag 1260

ggaaacgtgt tctcttgttc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta tacccagaag 1320

agcctgtccc tgtctccagg aaagtaa 1347

<210> 14

<211> 645

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полинуклеотид

<400> 14

gaaatcgttc tgacccagtc cccggctacc ctgtccctgt ccccaggtga acgtgctacc 60

ctgtcctgca aagcttccaa acgggttacc acctacgttt cctggtacca gcagaaaccc 120

ggtcaggctc ctcgtctgct gatctacggt gcttccaacc gttacctcgg tatcccagct 180

cgtttctccg gttccggttc cggtaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctggaaccc 240

gaagacttcg ctgtttacta ctgcagtcag tcctacaact acccctacac cttcggtcag 300

ggtaccaaac tggaaatcaa acgcactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttccctcca 360

tctgatgagc agttgaaatc cggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

ccgcgcgagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatccgg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacc 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagttctc cagtcacaaa gagcttcaac cgcggtgagt gctaa 645

<210> 15

<211> 37

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 15

Ala Cys Asp Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu

1 5 10 15

Ser Arg Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val

20 25 30

Gly Ser Lys Ala Phe

35

<210> 16

<211> 30

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 16

Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu Ser Arg Ser Gly Gly Val Val

1 5 10 15

Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe

20 25 30

<210> 17

<211> 19

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 17

Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser

1 5 10 15

Lys Ala Phe

<210> 18

<211> 19

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 18

Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Ala Thr Asn Val Gly Ser

1 5 10 15

Lys Ala Phe

<210> 19

<211> 19

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 19

Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser

1 5 10 15

Ala Ala Phe

<210> 20

<211> 19

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 20

Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser

1 5 10 15

Glu Ala Phe

<210> 21

<211> 19

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 21

Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser

1 5 10 15

Met Ala Phe

<210> 22

<211> 19

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 22

Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser

1 5 10 15

Gln Ala Phe

<210> 23

<211> 19

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 23

Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser

1 5 10 15

Lys Ala Ala

<210> 24

<211> 14

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 24

Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe Ala

1 5 10

<210> 25

<211> 13

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 25

Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe

1 5 10

<210> 26

<211> 13

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 26

Asn Asn Ala Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe

1 5 10

<210> 27

<211> 13

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 27

Asn Asn Phe Ala Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe

1 5 10

<210> 28

<211> 13

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 28

Asn Asn Phe Val Ala Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe

1 5 10

<210> 29

<211> 13

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 29

Asn Asn Phe Val Pro Ala Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe

1 5 10

<210> 30

<211> 13

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 30

Asn Asn Phe Val Pro Thr Ala Val Gly Ser Lys Ala Phe

1 5 10

<210> 31

<211> 13

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 31

Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Ala Gly Ser Lys Ala Phe

1 5 10

<210> 32

<211> 13

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 32

Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Ala Ser Lys Ala Phe

1 5 10

<210> 33

<211> 13

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 33

Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ala Lys Ala Phe

1 5 10

<210> 34

<211> 13

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 34

Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Ala

1 5 10

<210> 35

<211> 12

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 35

Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe

1 5 10

<210> 36

<211> 19

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 36

Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser

1 5 10 15

Lys Ala Phe

<210> 37

<211> 18

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 37

Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser

1 5 10 15

Lys Ala

<210> 38

<211> 36

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 38

Ala Cys Asp Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu

1 5 10 15

Ser Arg Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val

20 25 30

Gly Ser Lys Ala

35

<210> 39

<211> 19

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 39

Ala Cys Asp Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu

1 5 10 15

Ser Arg Ser

<210> 40

<211> 13

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 40

Ala Cys Asp Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala

1 5 10

<210> 41

<211> 37

<212> Белок

<213> Rattus sp.

<400> 41

Ser Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu

1 5 10 15

Ser Arg Ser Gly Gly Val Val Lys Asp Asn Phe Val Pro Thr Asn Val

20 25 30

Gly Ser Glu Ala Phe

35

<210> 42

<211> 19

<212> Белок

<213> Rattus sp.

<400> 42

Ser Gly Gly Val Val Lys Asp Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser

1 5 10 15

Glu Ala Phe

<210> 43

<211> 37

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 43

Ala Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu

1 5 10 15

Ser Arg Ser Gly Gly Met Val Lys Ser Asn Phe Val Pro Thr Asn Val

20 25 30

Gly Ser Lys Ala Phe

35

<210> 44

<211> 37

<212> Белок

<213> Rattus sp.

<400> 44

Ser Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu

1 5 10 15

Ser Arg Ser Gly Gly Val Val Lys Asp Asn Phe Val Pro Thr Asn Val

20 25 30

Gly Ser Lys Ala Phe

35

<210> 45

<211> 32

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 45

Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe

1 5 10 15

Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro

20 25 30

<210> 46

<211> 37

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 46

Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu

1 5 10 15

Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val

20 25 30

Gly Ser Asn Thr Tyr

35

<210> 47

<211> 52

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 47

Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys

1 5 10 15

Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln

20 25 30

Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser

35 40 45

Pro Gln Gly Tyr

50

<210> 48

<400> 48

000

<210> 49

<400> 49

000

<210> 50

<400> 50

000

<210> 51

<400> 51

000

<210> 52

<400> 52

000

<210> 53

<400> 53

000

<210> 54

<400> 54

000

<210> 55

<400> 55

000

<210> 56

<400> 56

000

<210> 57

<400> 57

000

<210> 58

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 58

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Glu Tyr His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ala Leu Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 59

<211> 119

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 59

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Glu Gly Thr Gly Asp Thr Arg Tyr Ile Gln Lys Phe

50 55 60

Ala Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Ser Asp Tyr Val Ser Gly Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 60

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 60

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Glu Tyr His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ala Leu Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 61

<211> 119

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 61

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Glu Gly Thr Gly Lys Thr Val Tyr Ile Gln Lys Phe

50 55 60

Ala Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Ser Asp Tyr Val Ser Gly Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 62

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 62

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Gly Tyr His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ala Leu Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 63

<211> 119

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 63

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Glu Gly Thr Gly Lys Thr Val Tyr Ile Gln Lys Phe

50 55 60

Ala Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Ser Asp Tyr Val Ser Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 64

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 64

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Pro Ile Asp Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Glu Tyr His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ala Leu Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 65

<211> 119

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 65

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Glu Gly Thr Gly Lys Thr Val Tyr Ile Gln Lys Phe

50 55 60

Ala Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Ser Asp Tyr Val Ser Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 66

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 66

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Gly Tyr His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ala Leu Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 67

<211> 119

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 67

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Glu Gly Thr Gly Lys Thr Val Tyr Ile Gln Lys Phe

50 55 60

Ala Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Ser Asp Tyr Val Ser Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 68

<211> 113

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 68

Gln Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr His Asn Thr

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Gln Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Asp Cys Thr

85 90 95

Asn Gly Asp Cys Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 69

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 69

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Val Ile Gly Ile Asn Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Thr Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 70

<211> 113

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 70

Gln Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asp Asn Asn

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Gln Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Asp Cys Ser

85 90 95

Ser Gly Asp Cys Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 71

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 71

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Asp Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Val Ile Gly Ile Asn Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Thr Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 72

<211> 113

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 72

Gln Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asp Asn Asn

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Gln Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Asp Cys Ser

85 90 95

Ser Gly Asp Cys Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 73

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 73

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Asp Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Val Ile Gly Ile Asn Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Thr Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 74

<211> 113

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 74

Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly Ser

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr His Asn Thr

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Gln Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln

65 70 75 80

Cys Asn Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Asp Cys Thr

85 90 95

Asn Gly Asp Cys Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

Arg

<210> 75

<211> 109

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 75

Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Tyr

20 25 30

Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Val Ile Gly Ile Asn Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met

65 70 75 80

Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly

85 90 95

Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105

<210> 76

<211> 113

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 76

Gln Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr His Asn Thr

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Gln Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Asp Cys Thr

85 90 95

Asn Gly Asp Cys Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 77

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 77

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Val Ile Gly Ile Asn Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Thr Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 78

<211> 110

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 78

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Thr Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Arg Leu

85 90 95

Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 79

<211> 130

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 79

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Phe Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Ser Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Leu Asn Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr His Tyr

100 105 110

Lys Tyr Tyr Gly Met Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 80

<211> 113

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 80

Gln Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr His Asn Thr

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Gln Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Asp Cys Thr

85 90 95

Asn Gly Asp Cys Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 81

<211> 219

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 81

Gln Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr His Asn Thr

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Gln Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Asp Cys Thr

85 90 95

Asn Gly Asp Cys Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 82

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 82

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Val Ile Gly Ile Asn Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Thr Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 83

<211> 441

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 83

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Val Ile Gly Ile Asn Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Thr Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

100 105 110

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

115 120 125

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

130 135 140

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

145 150 155 160

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

180 185 190

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Ala Arg

195 200 205

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

210 215 220

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

225 230 235 240

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

245 250 255

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

260 265 270

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

275 280 285

Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

290 295 300

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

305 310 315 320

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

325 330 335

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

340 345 350

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

355 360 365

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

370 375 380

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

385 390 395 400

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

405 410 415

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

420 425 430

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 84

<211> 13

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 84

Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr His Asn Thr Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 85

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 85

Asp Ala Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 86

<211> 13

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 86

Leu Gly Ser Tyr Asp Cys Thr Asn Gly Asp Cys Phe Val

1 5 10

<210> 87

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 87

Gly Tyr Tyr Met Asn

1 5

<210> 88

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 88

Ile Gly Ile Asn Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 89

<211> 3

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 89

Gly Asp Ile

1

<210> 90

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 90

Gln Gln Gly Asp Ala Leu Pro Pro Thr

1 5

<210> 91

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 91

Arg Ala Ser Lys Asp Ile Ser Lys Tyr Leu

1 5 10

<210> 92

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 92

Tyr Thr Ser Gly Tyr His Ser

1 5

<210> 93

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 93

Gly Tyr Thr Phe Gly Asn Tyr Trp Met Gln

1 5 10

<210> 94

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 94

Ala Ile Tyr Glu Gly Thr Gly Lys Thr Val Tyr Ile Gln Lys Phe Ala

1 5 10 15

Asp

<210> 95

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 95

Leu Ser Asp Tyr Val Ser Gly Phe Gly Tyr

1 5 10

<210> 96

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 96

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Gly Tyr His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ala Leu Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 97

<211> 119

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 97

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Glu Gly Thr Gly Lys Thr Val Tyr Ile Gln Lys Phe

50 55 60

Ala Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Ser Asp Tyr Val Ser Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 98

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 98

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Gly Tyr His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Ala Leu Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 99

<211> 445

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 99

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Gly Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Glu Gly Thr Gly Lys Thr Val Tyr Ile Gln Lys Phe

50 55 60

Ala Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Ser Asp Tyr Val Ser Gly Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440 445

<210> 100

<211> 13

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 100

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 101

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 101

Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser

1 5

<210> 102

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 102

Gly Thr Trp Asp Ser Arg Leu Ser Ala Val Val

1 5 10

<210> 103

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 103

Ser Phe Gly Met His

1 5

<210> 104

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 104

Val Ile Ser Phe Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Ser Val Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 105

<211> 21

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 105

Asp Arg Leu Asn Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr His Tyr Lys Tyr

1 5 10 15

Tyr Gly Met Ala Val

20

<210> 106

<211> 110

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 106

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Thr Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln

65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Arg Leu

85 90 95

Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 107

<211> 130

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 107

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Phe Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Ser Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Leu Asn Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr His Tyr

100 105 110

Lys Tyr Tyr Gly Met Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 108

<211> 238

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 108

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val

20 25 30

Ser Ala Ala Pro Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser

35 40 45

Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

50 55 60

Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

65 70 75 80

Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Thr Thr Leu

85 90 95

Gly Ile Thr Gly Leu Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly

100 105 110

Thr Trp Asp Ser Arg Leu Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe

130 135 140

Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys

145 150 155 160

Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala

165 170 175

Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys

180 185 190

Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro

195 200 205

Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu

210 215 220

Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

225 230 235

<210> 109

<211> 478

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

полипептид

<400> 109

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

35 40 45

Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Phe Asp Gly Ser Ile Lys

65 70 75 80

Tyr Ser Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

85 90 95

Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

100 105 110

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Leu Asn Tyr Tyr Asp Ser

115 120 125

Ser Gly Tyr Tyr His Tyr Lys Tyr Tyr Gly Met Ala Val Trp Gly Gln

130 135 140

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

145 150 155 160

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

165 170 175

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

180 185 190

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

195 200 205

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

210 215 220

Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

225 230 235 240

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val

245 250 255

Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe

260 265 270

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

275 280 285

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

290 295 300

Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

305 310 315 320

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val

325 330 335

Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

340 345 350

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

355 360 365

Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

370 375 380

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

385 390 395 400

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

405 410 415

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp

420 425 430

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

435 440 445

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

450 455 460

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470 475

<---

1. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента для производства лекарственного средства для снижения частоты приступов головной боли у пациента, страдающего хронической или эпизодической мигренью, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет путь с участием кальцитонин ген-родственного пептида (CGRP) и где перед введением антитела или его антигенсвязывающего фрагмента известно, что у пациента имеются аллодиния и/или гипералгезия во время острой фазы мигрени, но не во время фазы между приступами мигрени.

2. Применение по п.1, где пациент страдает эпизодической мигренью.

3. Применение по п.1, где пациент страдает хронической мигренью.

4. Применение по п.1, где известно, что у пациента имеются аллодиния или гипералгезия во время острой фазы мигрени, но не во время фазы между приступами мигрени.

5. Применение по п.4, где отсутствие аллодинии или гипералгезии во время фазы между приступами мигрени определено количественным сенсорным тестированием (QST).

6. Применение по п.1, дополнительно включающее определение перед введением антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, имеет ли пациент аллодинию и гипералгезию во время острой фазы мигрени, но не во время фазы между приступами мигрени.

7. Применение по п.6, где отсутствие аллодинии и/или гипералгезии во время фазы между приступами мигрени определено количественным сенсорным тестированием (QST).

8. Применение по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело-антагонист против CGRP.

9. Применение по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело против рецептора CGRP.

10. Применение по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой моноклональное антитело, гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, выбранный из Fab, Fab', F(ab')2, Fv или ScFv.

11. Применение по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

CDR H1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3;

CDR H2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4;

CDR H3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5;

CDR L1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6;

CDR L2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7; и

CDR L3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8.

12. Применение по п.11, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и

вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

13. Применение по п.12, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

14. Применение по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

CDR H1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 87;

CDR H2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 88;

CDR H3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 89;

CDR L1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 84;

CDR L2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 85; и

CDR L3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 86.

15. Применение по п.14, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82, и

вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80.

16. Применение по п.15, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83, и

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81.

17. Применение по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

CDR H1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93;

CDR H2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 94;

CDR H3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 95;

CDR L1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 91;

CDR L2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 92; и

CDR L3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 90.

18. Применение по п.17, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97, и

вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96.

19. Применение по п.18, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 99, и

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98.

20. Применение по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

CDR H1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 103;

CDR H2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 104;

CDR H3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 105;

CDR L1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 100;

CDR L2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 101; и

CDR L3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 102.

21. Применение по п.20, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107, и

вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106.

22. Применение по п.21, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 109, и

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 108.

23. Применение по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят, когда у пациента нет мигрени.

24. Способ снижения частоты приступов мигрени у пациента, страдающего хронической или эпизодической мигренью, где известно, что у пациента имеются аллодиния и/или гипералгезия во время острой фазы мигрени, но не во время фазы между приступами мигрени, где способ включает введение пациенту антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое блокирует, ингибирует, подавляет или ослабляет путь с участием кальцитонин ген-родственного пептида (CGRP).

25. Способ по п.24, где пациент страдает эпизодической мигренью.

26. Способ по п.24, где пациент страдает хронической мигренью.

27. Способ по п.24, где отсутствие аллодинии или гипералгезии во время фазы между приступами мигрени определено количественным сенсорным тестированием (QST).

28. Способ по п.24, дополнительно включающий определение перед введением антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, имеет ли пациент аллодинию и/или гипералгезию во время острой фазы мигрени, но не во время фазы между приступами мигрени.

29. Способ по п.28, где отсутствие аллодинии и/или гипералгезии во время фазы между приступами мигрени определено количественным сенсорным тестированием (QST).

30. Способ по п.24, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело-антагонист против CGRP.

31. Способ по п.24, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело против рецептора CGRP.

32. Способ по п.24, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой моноклональное антитело, гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, выбранный из Fab, Fab', F(ab')2, Fv или ScFv.

33. Способ по п.24, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

CDR H1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3;

CDR H2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4;

CDR H3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5;

CDR L1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6;

CDR L2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7; и

CDR L3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8.

34. Способ по п.33, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и

вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

35. Способ по п.34, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

36. Способ по п.24, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

CDR H1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 87;

CDR H2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 88;

CDR H3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 89;

CDR L1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 84;

CDR L2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 85; и

CDR L3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 86.

37. Способ по п.37, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82, и

вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80.

38. Способ по п.37, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83, и

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81.

39. Способ по п.24, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

CDR H1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 93;

CDR H2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 94;

CDR H3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 95;

CDR L1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 91;

CDR L2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 92; и

CDR L3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 90.

40. Способ по п.39, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 97, и

вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96.

41. Способ по п.40, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 99, и

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 98.

42. Способ по п.24, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

CDR H1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 103;

CDR H2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 104;

CDR H3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 105;

CDR L1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 100;

CDR L2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 101; и

CDR L3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 102.

43. Способ по п.42, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107, и

вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106.

44. Способ по п.43, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 109, и

легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 108.

45. Способ по п.24, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят, когда у пациента нет мигрени.