Комбинации для лечения рака, включающие abx196

Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики, а именно к способу лечения рака, включающему введение терапевтически эффективного количества противоопухолевой фармацевтической комбинации, включающей (i) соединение АВХ196 формулы (I)

(I)

и (ii) антитело, специфичное к PD-1, и/или химиотерапевтический агент, выбранный из доксорубицина или сорафениба; к способу лечения рака, включающему введение указанной комбинации, где АВХ196 входит в состав вакцины, содержащей противоопухолевый антиген; к способу лечения рака, включающему введение АВХ196 в комбинации с антителом, специфичным к PD-1 и/или химиотерапевтическим агентом, выбранным из доксорубицина или сорафениба; к препарату для применения при лечении рака, включающему указанную комбинацию. Группа изобретений обеспечивает повышение эффективности способов лечения рака за счет синергетического действия компонентов комбинации. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 12 ил., 32 табл., 7 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым терапиям для лечения раковых заболеваний.

Уровень техники

Рак является ведущей причиной смертности, несмотря на годы исследований и успехи в лечении.

Существует много способов лечения, включая химиотерапию и иммунотерапию. Однако даже если эти способы лечения могут быть эффективными в некоторых случаях, они, как правило, очень длительные, и часто имеют место рецидивы. Кроме того, они ответственны за многочисленные побочные действия, которые ухудшают качество жизни пациентов.

Новые способы лечения действуют в аспектах канцерологии, которые открыты ранее, таких как участие иммунной системы в защите от рака. Однако эти способы лечения не всегда достаточно эффективны.

Таким образом, существует важная потребность в повышении эффективности существующих терапий, в частности, химиотерапии и/или иммунотерапии, предпочтительно со снижением побочного действия этих терапий.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение возникло из неожиданного открытия авторов изобретения, что использование специфического агониста NKT, а именно, производного α–галактозилцерамида АВХ196 формулы (I)

(I),

в комбинации с другими известными противораковыми лечениями, в частности, с химиотерапией и/или иммунотерапией, делает возможным существенное повышение эффективности этих известных способов лечения, в частности, против агрессивных раковых заболеваний.

В частности, авторы изобретения обнаружили, что применение композиции вакцины, включающей соединение АВХ196 формулы (I)

(I)

и противоопухолевый антиген, в комбинации с другими известными противораковыми лечениями, в частности, с химиотерапией и/или иммунотерапией, делает возможным существенное повышение эффективности этих известных способов лечения, в частности, против агрессивных раковых заболеваний.

Авторы изобретения действительно показали на мышиной модели меланомы, что применение композиции вакцины, включающей соединение АВХ196 и противоопухолевый антиген Trp2, в комбинации с доксорубицином или анти-PD-1 моноклональными антителами повышает противоопухолевое действие этих соединений.

Авторы изобретения также показали на мышиных моделях, что применение АВХ196 в комбинации с доксорубицином, сорафенибом или анти-PD-1 моноклональными антителами повышает противоопухолевое действие этих соединений при меланоме, колоректальном раке, раке мочевого пузыря и гепатокарциноме и повышает выживаемость мышиных моделей.

Таким образом, настоящее изобретение относится к противоопухолевой фармацевтической комбинации, включающей

(i) соединение АВХ196 формулы (I)

(I)

и

(ii) по меньшей мере один химиотерапевтический агент и/или по меньшей мере один иммунотерапевтический агент,

для применения при лечении рака. В одном воплощении указанная противоопухолевая фармацевтическая комбинация дополнительно включает опухолевый антиген. В отдельном воплощении соединение АВХ196 формулы (I)

(I)

заключается в композиции вакцины (iii), дополнительно включающей опухолевый антиген.

Другим объектом изобретения является композиция вакцины, включающая соединение АВХ196 формулы (I)

(I)

и опухолевый антиген, для применения в комбинации с по меньшей мере одним химиотерапевтическим агентом и/или по меньшей мере одним иммунотерапевтическим агентом при лечении рака.

Изобретение также относится к соединению АВХ196 формулы (I)

(I)

для применения в комбинации с по меньшей мере одним химиотерапевтическим агентом и/или по меньшей мере одним иммунотерапевтическим агентом при лечении рака. В одном воплощении указанная комбинация дополнительно включает опухолевый антиген.

Другим объектом изобретения является комбинированный препарат, включающий

i) одну или несколько единиц дозировки соединения АВХ196 формулы (I)

(I)

и

(ii) одну или несколько единиц дозировки по меньшей мере одного химиотерапевтического агента и/или по меньшей мере одного иммунотерапевтического агента,

для применения при лечении рака.

В одном воплощении в указанном комбинированном препарате соединение АВХ196 формулы (I)

(I)

заключается в вакцине, также включающей опухолевый антиген.

В одном воплощении, когда соединение АВХ196, определенное выше, заключается в композиции вакцины согласно описанным выше целям изобретения, в указанной композиции вакцины его используют как адъювант.

В частности, индекс обработанные/контроль, в процентах (Т/С (%)), полученный для комбинации АВХ196 с по меньшей мере одним химиотерапевтическим агентом и/или по меньшей мере одним иммунотерапевтическим агентом, ниже, чем Т/С (%), полученный для по меньшей мере одного химиотерапевтического агента и/или по меньшей мере одного иммунотерапевтического агента, когда они используются отдельно. В одном воплощении Т/С (%) комбинации по изобретению ниже или равен 42%.

Индекс обработанные/контроль, в процентах (Т/С (%)), можно вычислить путем деления среднего объема обработанной опухоли на средний объем контрольной опухоли и умножения результата на 100. Например, получают медианный объем обработанной опухоли после введения комбинации АВХ196 с по меньшей мере одним химиотерапевтическим агентом и/или по меньшей мере одним иммунотерапевтическим агентом согласно изобретению, и получают медианный объем опухоли после введения среды для указанной комбинации, причем указанные объемы оценивают в одно и то же время.

Осуществление изобретения

Противоопухолевая фармацевтическая комбинация

Соединение АВХ196 формулы (I)

(I),

используемое согласно изобретению, представляет собой α–галактозилпроизводное, которое, как известно, стимулирует NKT (природные киллерные Т)-клетки. Согласно настоящему изобретению, термин «соединение АВХ196» также относится к фармацевтически приемлемым солям. Термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к солям, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства АВХ196, и которые не являются биологически или иначе нежелательными. Обзор о фармацевтически приемлемых солях см. в Berge et al. ((1977) J. Pharm. Sd, vol. 66, 1).

Используемые в настоящем описании термины «комбинация», «терапевтическая комбинация» или «фармацевтическая комбинация» определяют или фиксированную комбинацию в одной стандартной лекарственной форме или набор частей для комбинированного введения. В отдельном воплощении соединение АВХ196 или композиция вакцины, определенная ниже, и по меньшей мере один химиотерапевтический агент и/или по меньшей мере один иммунотерапевтический агент, определенные ниже, могут вводиться независимо в одно и то же время или по отдельности в пределах временных интервалов, которые делают возможной демонстрацию синергетического действия партнеров по комбинации.

В частности, когда соединение АВХ196 или композицию вакцины используют в комбинации с химиотерапевтическим агентом, их можно вводить независимо в одно и то же время или по отдельности с временными интервалами. Подобным образом, когда соединение АВХ196 или композицию вакцины используют в комбинации с иммунотерапевтическим агентом, их можно вводить независимо в одно и то же время или по отдельности с временными интервалами.

Кроме того, когда соединение АВХ196 или композицию вакцины используют в комбинации с одним или несколькими химиотерапевтическими агентами, каждый из компонентов комбинации может быть введен независимо в одно и то же время или по отдельности с временными интервалами, или некоторые из компонентов комбинации могут быть введены независимо в одно и то же время, в то время как другие компоненты комбинации могут быть введены по отдельности с временными интервалами.

Подобным образом, когда соединение АВХ196 или композицию вакцины используют в комбинации с одним или несколькими иммунотерапевтическими агентами, каждый из компонентов комбинации может быть введен независимо в одно и то же время или по отдельности с временными интервалами, или некоторые из компонентов комбинации могут быть введены независимо в одно и то же время, в то время как другие компоненты комбинации могут быть введены по отдельности с временными интервалами.

Подобным образом, когда соединение АВХ196 или композицию вакцины используют в комбинации с химиотерапевтическим агентом и иммунотерапевтическим агентом, каждый из компонентов комбинации может быть введен независимо в одно и то же время или по отдельности с временными интервалами, или некоторые из компонентов комбинации могут быть введены независимо в одно и то же время, в то время как другие компоненты комбинации могут быть введены по отдельности с временными интервалами.

Составные части, из которых состоит комбинация, могут вводиться одновременно, частично одновременно, по отдельности или с промежутком во времени с тем, чтобы получить максимальную эффективность комбинации; возможно для каждого введения изменение его длительности от быстрого введения до непрерывной перфузии.

Таким образом, соединения комбинации по изобретению могут быть введены в состав двух, трех или больше отдельных фармацевтических композиций.

Выбранный промежуток времени между по меньшей мере одним введением соединения АВХ196 или композиции вакцины, определенной ниже в разделе «Композиция вакцины», и по меньшей мере одним введением одного химиотерапевтического агента, определенного ниже в разделе «Химиотерапевтический агент», предпочтительно составляет примерно 4 дня.

Предпочтительно по меньшей мере один химиотерапевтический агент, определенный ниже в разделе «Химиотерапевтический агент», вводят через 4 дня после введения соединения АВХ196 или композиции вакцины, определенной ниже в разделе «Композиция вакцины». Предпочтительно по меньшей мере один химиотерапевтический агент, определенный ниже в разделе «Химиотерапевтический агент», вводят за 4 дня до введения соединения АВХ196 или композиции вакцины, определенной ниже в разделе «Композиция вакцины».

Выбранный промежуток времени между по меньшей мере одним введением соединения АВХ196 или композиции вакцины, определенной ниже в разделе «Композиция вакцины», и по меньшей мере одним введением одного химиотерапевтического агента, определенного ниже в разделе «Химиотерапевтический агент», предпочтительно составляет примерно 7 дней.

Предпочтительно по меньшей мере один химиотерапевтический агент, определенный ниже в разделе «Химиотерапевтический агент», вводят через 7 дней после введения соединения АВХ196 или композиции вакцины, определенной ниже в разделе «Композиция вакцины». Предпочтительно по меньшей мере один химиотерапевтический агент, определенный ниже в разделе «Химиотерапевтический агент», вводят за 7 дней до введения соединения АВХ196 или композиции вакцины, определенной ниже в разделе «Композиция вакцины».

Композиции, используемые в контексте изобретения, предпочтительно являются композициями, которые можно вводить внутривенно. Однако такие композиции могут вводиться перорально, подкожно или интраперитонеально в случае локально-региональных терапий. В одном воплощении такие композиции вводят интратуморально.

Термин «комбинированный препарат» определяется в настоящем описании как относящийся в особенности к «набору частей» в том смысле, что участники комбинации (i) и (ii), определенные выше, могут быть дозированы независимо или путем применения в различных фиксированных концентрациях с установленными количествами участников комбинации, т.е. одновременно или в различные моменты времени (это также применимо для различных компонентов участника (i), когда используют как химиотерапевтический агент, так и иммунотерапевтический агент, или когда используют несколько химиотерапевтических агентов и/или несколько иммунотерапевтических агентов). Затем, например, части набора частей могут быть введены одновременно или хронологически дифференцировано, т.е. в различные моменты времени и с равными или различными временными интервалами для любой части набора частей.

Участников комбинации комбинированного препарата по изобретению предпочтительно включают в стандартную лекарственную форму. Термин «лекарственная единица» относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных дозировок для пациентов-людей и других млекопитающих, причем каждая единица содержит предварительно установленное количество активного(ых) материала(ов), вычисленное для получения желательного терапевтического действия, необязательно в ассоциации с подходящим фармацевтическим эксципиентом.

Отношение общих количеств участника комбинации (i) к участнику комбинации (ii) (или если применимо, к различным компонентам участника комбинации (ii)), которые вводятся в комбинированном препарате, может изменяться, например, для того, чтобы удовлетворить потребности субпопуляции пациентов, которых лечат, или потребности отдельного пациента.

Композиция вакцины

Композиция вакцины, используемая в контексте изобретения, включает соединение АВХ196 формулы (I)

(I)

и опухолевый антиген.

«Опухолевым антигеном» в настоящем описании обозначается антиген, экспрессированный исключительно на, ассоциированный с или сверхэкспрессированный в опухолевой ткани. Примеры опухолевых антигенов включают, но без ограничения, 5-α-редуктазу, α-фетопротеин (AФП), AM-1, APC, APRIL, ген антигена меланомы В (BAGE), β-катенин, Bcl12, Bcr-Abl, брахиурию, CA-125, каспазу-8 (CASP-8, также известную как FLICE), катепсин S, CD19, CD20, CD21/рецептор комплемента 2 (CR2), CD22/BL-CAM, CD23/FcεRII, CD33, CD35/рецептор комплемента 1 (CRT), CD44/PGP-1, CD45/общий лейкоцитарный антиген (LCA), CD46/мембранный кофакторный белок (MCP), CD52/CAMPATH-1, CD55/фактор ускорения распала (DAF), CD59/протектин, CDC27, CDK4, карциноэмбриональный антиген (CEA), c-myc, циклооксигеназу-2 (cox-2), удаленный ген при колоректальном раке (DCC), DcR3, E6/E7, CGFR, EMBP, Dna78, фарнезилтрансферазу, фактор роста фибробластов 8a (FGF8a), фактор роста фибробластов 8b (FGF8b), FLK-1/KDR, рецептор фолиевой кислоты, G250, семейство генов антигена меланомы G (GAGE-семейство), гастрин 17, гастрин-рилизинг гормон, ганглиозид 2 (GD2)/ганглиозид 3 (GD3)/ганглиозидмоносиаловую кислоту-2 (GM2), гонадотропин-высвобождающий гормон (GnRH), UDP-GlcNAc:R₁Man(α1-6)R₂[GlcNAc – Man(α1-6)]β1,6-Ν-ацетилглюкозаминилтрансферазу V (GnTV), GP1, gp100/Pme1-17, gp-100-in4, gp15, gp75/трирозинзависимый белок 1 (gp75/TRP-1), хорионический гонадотропин человека (hCG), гепараназу, Her2/neu, EGFR, вирус опухоли молочной железы человека (HMTV), 70 кД белок теплового шока (HSP70), обратную транскриптазу теломеразы человека (hTERT), рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 (IGFR-1), рецептор интерлейкина-13 (IL-13R), индуцибельную синтазу оксида азота (iNOS), Ki67, KIAA0205, K-ras, H-ras, N-ras, KSA, LKLR-FUT, семейство генов, кодирующих антигены меланомы (MAGE-семейство, включающее по меньшей мере MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3 и MAGE-4), маммаглобин, MAP17, мелан-A/антиген меланомы, узнаваемый T-клетками-1 (MART-1 ), мезотелин, MIC A/B, MT-MMPs, муцин, тестис-специфический антиген NY-ESO-1, остеонектин, p15, P170/MDR1, p53, p97/меланотрансферрин, PAI-1, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), PRAME, пробазин, прогенипоэтин, простатспецифический антиген (PSA), простатспецифический мембранный антиген (PSMA), кислую простатическую фосфатазу (PAP), RAGE-1, Rb, RCAS1, SART-1, SSX-семейство, STAT3, STn, TAG-72, трасформирующий фактор роста α (TGF-α), трасформирующий фактор роста β (TGF-β), uPA, uPAR, TNF-α конвертирующий фермент (TACE), тимозин-β-15, фактор некроза опухоли α (TNF-α), TP1, TRP-2, тирозиназу, сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), ZAG, p16INK4, PD-1, PD-L1, PD-L2, глипикан-3, клаудин-3, клаудин-4, BMCA и глутатион-S-трансферазу (GST).

Предпочтительно указанным опухолевым антигеном является TRP-2.

В одном воплощении последовательность указанного опухолевого антигена выбирают из группы, включающей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, предпочтительно SEQ ID NO: 3.

Предпочтительно опухолевый антиген выбирают в соответствии с конкретным раком, от которого лечат. Специалист знает, какой опухолевый антиген конкретно ассоциируется с определенным раком. Например, специалисту хорошо известно, что опухолевый антиген TRP-2 экспрессируется раковыми клетками меланомы.

Соответственно, в определенном предпочтительном воплощении опухолевым антигеном является TRP-2, и рак, от которого лечат, представляет собой меланому.

Композиция вакцины, используемая в контексте изобретения, может включать дополнительные адъюванты. Дополнительные адъюванты, иные чем АВХ196, хорошо известны специалистам и включают соли алюминия, эмульсии масло-в-воде, такие как неполный адъювант Фрейнда или MF59®, лиганды PRR, лиганды TLR3 и RLR, такие как поли(I:C), лиганды TLR4, такие как LPS или монофосфориллипид A (MPLA), лиганды TLR5, такие как флагеллин, лиганды TLR7/8, такие как имидазохинолины, лиганды TLR9, такие как CpG-олигодезоксинуклеотиды, и лиганды NOD2, такие как мурамилдипептид (MDP).

Однако так как соединение АВХ196 может присутствовать в качестве адъюванта в композиции вакцины, используемой в контексте изобретения, в предпочтительном воплощении композиция вакцины включает соединение АВХ196 только в качестве адъюванта. В предпочтительном воплощении соединение АВХ196 используют в качестве адъюванта в указанной композиции вакцины согласно изобретению.

Химиотерапевтические агенты

Используемый в настоящем описании термин «химиотерапевтический агент» относится к любому ингибирующему рост клеток соединению или цитотоксическому соединению, используемому в противораковой химиотерапии. Понятно, что такое соединение не является антигеном. Такие химиотерапевтические агенты хорошо известны специалистам и включают

- алкилирующие агенты, включая азотные аналоги горчичного газа, такие как циклофосфамид, изофосфамид , мехлорэтанамин, хлорамбуцил и мелфалан; этиленамины и метилмеламины, такие как тиотепа; производные метилгидразина, такие как прокарбазин; алкилсульфонаты, такие как бусульфан; нитрозомочевины, такие как кармузин или ломузин; тиазины, такие как дакарбазин и темозоломид; координационные комплексы платины, такие как цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин;

- антиметаболиты, включая аналоги фолиевой кислоты, такие как метотрексат; аналоги пиримидина, такие как фторурацил, цитарабин, гемцитабин и капецитабин; пуриновые аналоги, такие как меркаптопурин, пентостатин, кладрибин и флударабин;

- винкаалкалоиды, такие как винбластин, винорелбин и винкристин;

- таксаны, такие как паклитаксел и доцетаксел;

- эпиподофиллотоксины, такие как этопозид и тенипозид;

- каптотецины, такие как топотекан и иринотекан;

- противораковые антибиотики, такие как дактиномицин, даунорубицин, доксорубицин, пликомицин и эпирубицин;

- антрацендионы, такие как митоксантрон, митомицин и блеомицин;

- митотические ингибиторы, такие как доластатин;

- ферменты, такие как L-аспарагиназа;

- замещенные мочевины, такие как гидроксимочевина;

- дифференцирующие агенты, такие как третионин;

- ингибиторы протеинкиназ, такие как иматиниб или бриостатин;

- ингибиторы протеасом, такие как гефитиниб и бортезомиб;

- гормоны и антагонисты, включая адренокортикальные супрессанты, такие как аминоглутетимид; адренокортикостероиды, такие как преднизон; прогестины, такие как мегестрола ацетат и медроксипрогестерон; эстрогены, такие как диэтилстильбэстрол; антиэстрогены, такие как тамоксифен, идаксифен, дротоксифен, циндоксифен, триоксифен, ICI 182780, ЕМ-800 и торемифен; ингибиторы ароматазы, такие как анастрозол, летрозол и эксеместан; андрогены, такие как тестостерона пропионат; антиандрогены, такие как флутамид; и гонадотропин-высвобождающие агенты, такие как лейпролид.

Конечно, можно использовать любую подходящую комбинацию химиотерапевтических агентов, в зависимости от типа рака.

В предпочтительном воплощении по меньшей мере один химиотерапевтический агент выбирают из группы, включающей доксорубицин, циклофосфамид, эпирубицин, идарубицин, митоксантрон и оксалиплатин. В одном воплощении по меньшей мере один химиотерапевтический агент представляет собой доксорубицин или ингибитор киназы, такой как сорафениб. Предпочтительно по меньшей мере один химиотерапевтический агент представляет собой доксорубицин или сорафениб, предпочтительнее доксорубицин.

По меньшей мере один химиотерапевтический агент, используемый в контексте изобретения, может быть введен в фармацевтическую композицию, которая также может включать фармацевтически приемлемые эксципиенты, определенные ниже.

Если используют комбинацию различных химиотерапевтических агентов, эти химиотерапевтические агенты могут быть включены в одну фармацевтическую композицию или в отдельные фармацевтические композиции.

По меньшей мере один химиотерапевтический агент, используемый в контексте изобретения, может быть введен любым подходящим путем, хорошо известным специалисту. Как представляют специалисты в данной области техники, фармацевтические композиции, включающие химиотерапевтический(е) агент(ы), могут быть соответственно составлены, чтобы быть совместимыми с предполагаемым(и) путем(путями) введения. Примеры подходящих путей введения включают парентеральное, например, внутривенное, интрадермальное, подкожное, внутримышечное, интраперитонеальное, пероральное (например, трансбуккальное, ингаляционное, назальное введение и спрей для легких), трансдерамальное (топическое), трансмышечное, внутриглазное и ректальное введение.

Предпочтительно по меньшей мере один химиотерапевтический агент, используемый в контексте изобретения, вводят внутривенно.

Схема применения химиотерапевтического агента, используемого в контексте изобретения, будет зависеть от конкретного используемого агента. Такие схемы применения хорошо известны специалистам. Они типично объединяют определенную концентрацию вводимого химиотерапевтического агента и определенную схему введения.

Например, доксорубицин предпочтительно вводят внутривенной инфузией 3-5 мин в дозе 40-75 мг/м² на цикл, причем каждый цикл отделяется от предыдущего цикла интервалом в 3-4 недели, и циклы предпочтительно повторяют до достижения максимальной общей дозы 550 мг/м².

Однако, так как комбинированное применение соединения АВХ196 или комбинации вакцины, определенной выше в разделе «Композиция вакцины», с химиотерапевтическим агентом повышает существенно и синергично противораковое действие указанного химиотерапевтического агента, возможно снижение дозы и/или длительности введения химиотерапевтического агента по сравнению со стандартными схемами применения.

Соответственно, в предпочтительном воплощении по меньшей мере один химиотерапевтический агент вводят по схеме применения в меньшем количестве, чем по стандартной схеме применения, рекомендованной для этого химиотерапевтического агента, в частности, используемого одного или в комбинации с другим химиотерапевтическим агентом и/или иммунотерапевтическим агентом.

Иммунотерапевтические агенты

Используемый в настоящем описании термин «иммунотерапевтический агент» относится к противораковому агенту, который опосредует противоопухолевое действие путем инициирования новой или усиления существующей иммунной реакции против раковых клеток, такому как антитела или лимфоциты, таргетирующие опухолевый антиген. Иммунотерапевтический агент можно классифицировать как «активный» или «пассивный» на основании его способности (ре)активировать иммунную систему хозяина против злокачественных клеток.

В одном воплощении указанный иммунотерапевтический агент не является антигеном.

Предпочтительно иммунотерапевтический агент представляет собой антитело, специфическое к опухолевому антигену, определенному выше в разделе «Композиция вакцины».

«Антитело» может представлять собой природное или обычное антитело, в котором две тяжелые цепи соединены друг с другом дисульфидными связями, и каждая тяжелая цепь соединена с легкой цепью дисульфидной связью. Используемый в настоящем описании термин «антитело» обозначает обычные антитела и их фрагменты, а также однодоменные антитела и их фрагменты, в частности, вариабельную тяжелую цепь однодоменных антител, и химерные, гуманизированные, биспецифические или мультиспецифические антитела.

При использовании в настоящем описании антитела также включают «однодоменные антитела», которые представляют собой антитела, чьи определяющие комплементарность участки являются частью однодоменного полипептида. Примеры однодоменных антител включают тяжелоцепочечные антитела, по природе лишенные легких цепей, однодоменные антитела, образованные от обычных четырехцепочечных антител, генно-инженерные однодоменные антитела. Однодоменные антитела могут быть получены от любого вида, включая, но без ограничения, мышь, человека, верблюда, ламу, козу, кролика и корову. Однодоменные антитела могут представлять собой встречающиеся в природе однодоменные антитела, известные как тяжелоцепочечные антитела, по природе лишенные легких цепей, такие, как продуцируемые видом Camelidae, например, верблюдом, дромадером, ламой, альпакой и гуанако.

Вариабельная тяжелая цепь таких однодоменных антител, лишенных легких цепей, известна в технике как «VHH» или «нанотело». Подобно обычным VH доменам, VHH содержат четыре FR и три CDR. Нанотела имеют преимущество примерно в десять раз меньшего размера, чем молекулы IgG, и как следствие, можно получить складчатые нанотитела экспрессией in vitro, достигая в то же время высокого выхода. Кроме того, нанотела очень устойчивы и резистентны к действию протеаз.

Термин «моноклональное антитело» или «mAb», используемый в настоящем описании, относится к молекуле антитела одного аминокислотного состава, которая направлена против специфического антигена.

Моноклональное антитело может продуцироваться одним клоном В-клеток или гибридомой, но оно также может быть рекомбинантным, т.е., полученным белковой инженерией.

Термин «химерное антитело» относится к генно-инженерному антителу, которое содержит один или больше участков из одного антитела и один или больше участков из другого(их) антитела(антител). В частности, химерное антитело включает VH домен и VL домен антитела, полученного от животного, не являющегося человеком, в ассоциации с СН доменом и CL доменом другого антитела, в частности, человеческого антитела. В качестве животного, не являющегося человеком, можно использовать любое животное, такое как мышь, крыса, хомяк, кролик или подобное. Химерное антитело также может обозначать мультиспецифическое антитело, имеющее специфичность к по меньшей мере двум различным антигенам. В одном воплощении химерное антитело имеет вариабельные домены мышиного происхождения и константные домены человеческого происхождения.

Термин «гуманизированное антитело» относится к антителу, которое сначала является полностью или частично происходящим не от человека, и которое модифицировано для замены некоторых аминокислот, в частности, в каркасных участках тяжелой и легкой цепей, для того, чтобы избежать или минимизировать иммунный ответ у людей. Константные домены гуманизированного антитела являются по большей части человеческими СН и CL доменами. В одном воплощении гуманизированное антитело имеет константные домены человеческого происхождения.

«Фрагменты» (обычных) антител включают часть интактного антитела, в частности, антигенсвязывающий участок или вариабельный участок интактного антитела. Примеры фрагментов антитела включают Fv, Fab, F(ab')₂, Fab', dsFv, (dsFv)₂, scFv, sc(Fv)₂, диатела, биспецифические и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Фрагмент обычного антитела также может представлять собой однодоменное антитело, такое как тяжелоцепочечное антитело или VHH.

Термин «Fab» обозначает фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу примерно 50000 Да и антигенсвязывающую активность, в котором примерно половина N-концевой стороны Н цепи и вся L цепь, из числа фрагментов, полученных обработкой IgG протеазой, папаином, соединены вместе через дисульфидную связь.

Термин «F(ab')₂» относится к фрагменту антитела, имеющему молекулярную массу примерно 100000 Да и антигенсвязывающую активность, который несколько крупнее, чем Fab, связанный через дисульфидную связь шарнирного участка, из числа фрагментов, полученных обработкой IgG протеазой, пепсином.

Термин «Fab’» относится к фрагменту антитела, имеющему молекулярную массу примерно 50000 Да и антигенсвязывающую активность, который получают разрезанием дисульфидной связи шарнирного участка фрагмента F(ab')₂.

Одноцепочечный полипептид Fv (“sсFv”) ковалентно связывается с гетеродимером VH::VL, который обычно экспрессируется из слияния генов, включающего гены, кодирующие VH и VL, соединенные пептидкодирующим линкером. Человеческий фрагмент scFv включает CDR, которые удерживаются в соответствующей конформации, в частности, путем использования методов рекомбинации генов. Двухвалентные и поливалентные фрагменты антител могут образоваться спонтанно путем ассоциации одновалентных scFv, или могут быть генерированы путем соединения одновалентных scFv пептидным линкером, таким как двухвалентный sc(Fv)₂.

«dsFv» представляет собой гетеродимер VH::VL, стаблизированный дисульфидной связью.

«(dsFv)₂» обозначает два dsFv, соединенных пептидным линкером.

Термин «биспецифическое антитело» или «BsAb» обозначает антитело, которое объединяет антигенсвязывающие сайты двух антител в одной молекуле. Таким образом, BsAb способны связывать два различных антигена одновременно.

Термин «мультиспецифическое антитело» обозначает антитело, которое объединяет антигенсвязывающие сайты двух или больше антител в одной молекуле.

Термин «диатела» относится к небольшим фрагментам антитела с двумя антигенсвязывающими сайтами, включающим вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL), в одной и той же полипептидной цепи (VH-VL). За счет использования линкера, который слишком короток, чтобы допустить образование пары между двумя доменами в одной и той же цепи. домены усиливаются для образования пары с комплементарными доменами другой цепи и образуют два антигенсвязывающих сайта.

В отдельном воплощении иммунотерапевтический агент, используемый в контексте изобретения, представляет собой моноклональное антитело или его фрагмент, в частности, фрагмент, выбранный из группы, включающей Fv, Fab, F(ab')₂, Fab', dsFv, (dsFv)₂, scFv, sc(Fv)₂, диатела и VHH.

Наиболее предпочтительно иммунотерапевтический агент, используемый в контексте изобретения, представляет собой моноклональное антитело.

Предпочтительно иммунотерапевтический агент, используемый в контексте изобретения, представляет собой антитело, в частности, моноклональное антитело, специфическое к опухолевому антигену, выбранному из группы, включающей Her2/neu, EGFR, VEGF, CD20, CD52, CD33, TACE, катепсин S, uPA, uPAR, PD-1, глипикан-3, клаудин-3, клаудин-4, BMCA и CTLA4. В особенно предпочтительном воплощении иммунотерапевтический агент, используемый в контексте изобретения, представляет собой антитело, в частности, моноклональное антитело, специфическое к PD-1. В одном воплощении иммунотерапевтический агент, используемый в контексте изобретения, представляет собой антитело, выбранное из группы, включающей антитела анти-PD-1, анти-CTLA-4, анти-PD-L1, анти-GITR, анти-CD38, анти-4-1BB, анти-OX40, анти-LAG3 и анти-TIM-3.

В особенно предпочтительном воплощении иммунотерапевтический агент представляет собой моноклональное анти-PD-1 антитело.

Примеры моноклональных антител, специфичеких к вышеуказанным опухолевым антигенам, являются антителами, хорошо известными специалистам, и включают ритуксимаб, трастузумаб (герцептин), алемтузунаб, кетуксимаб, пантитумумаб, бевацизумаб, ипилимумаб, ниволумаб (также известный как MBS-936558, MDX-1106 или анти-PD-1 антитело ONO-4538), пембролизумаб (также известный как анти-PD-1 антитело MK-3475), пидилизумаб (также известный как анти-PD-1 антитело CT-011), анти-PD-1 антитело BMS-936559, анти-PD-1 антитело MPDL3280A, анти-PD-1 антитело MEDI4736, анти-PD-1 антитело MSB0010718C, анти-TACE антитело D1(A12), анти-TACE антитело A9, антитело против катепсина S Fsn0503h, анти-uPAR антитело ATN-658 или анти-BMCA антитело J6M0.

Предпочтительно иммунотерапевтический агент, используемый в контексте изобретения, выбирают из группы, включающей ниволумаб, пембролизумаб и пидилизумаб.

Иммунотерапевтический агент, используемый в контексте изобретения, также может представлять собой конъюгат, включающий моноклональное тело, определенное выше, и химиотерапевтический агент, определенный выше в разделе «Химиотерапевтический агент».

В другом воплощении иммунотерапевтический агент, используемый в контексте изобретения, представляет собой адоптивно перенесенную Т-клетку.

В контексте изобретения термин «адоптивный перенос клеток» относится к варианту противораковой иммунотерапии на основе клеток, которая вообще включает (1) сбор циркулирующих или инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, (2) их селекцию/модификацию/рост/активацию ex vivo и (3) их (повторное)введение пациентам, наиболее часто после прекондиционирования с применением лимфодеплеции и в комбинации с иммуностимуляторами.

По меньшей мере один иммунотерапевтический агент, используемый в контексте изобретения, может быть включен в фармацевтическую композицию, которая также включает фармацевтически приемлемые эксципиенты, определенные ниже.

Если используют комбинацию различных иммунотерапевтических агентов, эти иммунотерапевтические агенты могут быть включены в одну фармацевтическую композицию или в отдельные фармацевтические композиции.

По меньшей мере один иммунотерапевтический агент, используемый в контексте изобретения, можно вводить любым подходящим путем, хорошо известным специалисту. Как известно специалистам в данной области техники, фармацевтическая(ие) композиция(и), включающая(ие) иммунотерапевтический агент, может быть составлена соответственно, чтобы быть совместимой с предполагаемы(ыми) путем(ями) введения. Примеры подходящих путей введения включают парентеральное, например, внутривенное, интрадермальное, подкожное, внутримышечное, интраперитонеальное, пероральное (например, трансбуккальное, ингаляционное, назальное введение и спрей для легких), трансдермальное (топическое), трансмукозальное, внутриглазное и ректальное введение.

В одном воплощении по меньшей мере один иммунотерапевтический агент, используемый в контексте изобретения, вводят внутривенно или интратуморально. Предпочтительно по меньшей мере один иммунотерапевтический агент, используемый в контексте изобретения, вводят внутривенно.

Схема применения иммунотерапевтического агента, используемого в контексте изобретения, будет зависеть от конкретного используемого агента. Такие схемы применения хорошо известны специалисту. В них типично комбинируются определенная концентрация вводимого иммунотерапевтического агента и определенная схема введения.

Например, ниволумаб предпочтительно вводят внутривенной инфузией в течение 60 мин в дозе 3 мг/кг массы тела каждые две недели.

Иммунотерапевтический агент, используемый в контексте изобретения, предпочтительно вводить в течение цикла, включающего несколько введений, причем каждое введение предпочтительно отделяется временным интервалом в 3-4 дня.

Однако, так как комбинированное применение соединения АВХ196 или композиции вакцины, определенной выше в разделе «Композиция вакцины», с иммунотерапевтическим агентом повышает существенно и синергично противораковое действие указанного иммунотерапевтического агента, возможно снижение дозы и/или длительности введения используемого иммунотерапевтического агента по сравнению со стандартными схемами применения.

Соответственно, в предпочтительном воплощении по схеме применения вводят меньше по меньшей мере одного иммунотерапевтического агента, чем по стандартной схеме применения, рекомендованной для этого иммунотерапевтического агента, в частности, используемого одного или в комбинации с другим иммунотерапевтическим агентом и/или химиотерапевтическим агентом.

Фармацевтическая комбинация и/или композиция вакцины, используемая в контексте изобретения, может дополнительно включать фармацевтически приемлемые эксципиенты.

«Фармацевтический» или «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным элементам и композициям, которые не вызывают вредную, аллергическую или иную неблагоприятную реакцию, когда вводятся млекопитающему, в особенности человеку, в соответствующем случае. Термин «фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент» относится к нетоксичному твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, разбавителю, инкапсулирующему материалу или вспомогательной композиции любого типа.

Фармацевтическую комбинацию и/или композицию вакцины, используемую в контексте изобретения, можно вводить любым подходящим путем, известным специалисту. Как известно специалистам в данной области техники, фармацевтическая комбинация и/или композиция вакцины может быть соответственно составлена для того, чтобы быть совместимой с предполагаемым путем введения. Примеры подходящих путей введения включают парентеральное, например, внутривенное, интрадермальное, подкожное, вунтримышечное, интраперитонеалльное, пероральное (например, трансбуккальное, ингаляционное, назальное или спрея для легких), трансдермальное (топическое), трансмукозальное, внутриглазное и ректальное введение.

Предпочтительно фармацевтическую комбинацию и/или композицию вакцины, используемую в контексте изобретения, вводят внутривенно, внутримышечно, подкожно, интраназально или интратуморально, предпочтительнее внутривенно. В одном воплощении фармацевтическую комбинацию и/или композицию вакцины, используемую в контексте изобретения, вводят внутривенно или интратуморально.

Фармацевтическую комбинацию и/или композицию вакцины, используемую в контексте изобретения, можно вводить пациенту, нуждающемуся в этом, один раз или насколько раз (включая например, первую дозу и затем одну или несколько бустерных доз). Предпочтительно композицию вакцины, используемую в контексте изобретения, вводят только один раз (и таким образом нет необходимости в каком-либо введении какой-либо бустерной дозы).

Фармацевтическая комбинация и/или композиция вакцины, используемая в контексте изобретения, может доставляться в дозах соединения АВХ196 по меньшей мере 0,2 мкг/пациент. В одном воплощении фармацевтическая комбинация и/или композиция вакцины, используемая в контексте изобретения, может доставляться в дозах соединения АВХ196 по меньшей мере 3 нг/кг, например, от 3 нг/кг до 5 нг/кг. Эффективные дозы будут также изменятся в зависимости от пути введения, а также возможности совместного применения с другими агентами.

Лечение рака

Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества противораковой фармацевтической комбинации, определенной выше в разделе «Противоопухолевая фармацевтическая комбинация», включающей

(i) соединение АВХ196 формулы (I)

(I)

и

(ii) по меньшей мере один химиотерапевтический агент, определенный выше в разделе «Химиотерапевтический агент», и/или по меньшей мере один иммунотерапевтический агент, определенный выше в разделе «Иммунотерапевтический агент». В одном воплощении указанное соединение АВХ196 заключается в вакцинной композиции, дополнительно включающей опухолевый антиген, определенный выше в разделе «Композиция вакцины».

Настоящее изобретение также относится к применению

(i) соединения АВХ196 формулы (I)

(I)

и

(ii) по меньшей мере одного химиотерапевтического агента, определенного выше в разделе «Химиотерапевтический агент», и/или по меньшей мере одного иммунотерапевтического агента, определенного выше в разделе «Иммунотерапевтический агент»,

для изготовления противоопухолевой фармацевтической комбинации, предназначенной для лечения рака. В одном воплощении указанное соединение АВХ196 заключается в вакцинной композиции, дополнительно включающей опухолевый антиген, определенный выше в разделе «Композиция вакцины».

Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака, включающему введение, в частности, совместное введение, пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения АВХ196 формулы (I)

(I)

в комбинации с терапевтически эффективным количеством по меньшей мере одного химиотерапевтического агента, определенного выше в разделе «Химиотерапевтический агент», и/или по меньшей мере одного иммунотерапевтического агента, определенного выше в разделе «Иммунотерапевтический агент». В одном воплощении указанное соединение АВХ196 заключается в вакцинной композиции, дополнительно включающей опухолевый антиген, определенный выше в разделе «Композиция вакцины».

Настоящее изобретение также относится к применению соединения АВХ196 формулы (I)

(I)

и опухолевого антигена, определенного выше в разделе «Композиция вакцины», для изготовления композиции вакцины, предназначенной для лечения рака, в комбинации с по меньшей мере одним химиотерапевтическим агентом, определенным выше в разделе «Химиотерапевтический агент», и/или по меньшей мере одним иммунотерапевтическим агентом, определенным выше в разделе «Иммунотерапевтический агент».

Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака, включающему введение, в частности, совместное введение, пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения АВХ196 формулы (I)

(I)

в комбинации с (а) терапевтически эффективным количеством опухолевого антигена, определенного выше в разделе «Композиция вакцины», и (b) терапевтически эффективным количеством по меньшей мере одного химиотерапевтического агента, определенного выше в разделе «Химиотерапевтический агент», и/или по меньшей мере одного иммунотерапевтического агента, определенного выше в разделе «Иммунотерапевтический агент».

Настоящее изобретение также относится к применению соединения АВХ196 формулы (I)

(I)

для изготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, в комбинации с (а) опухолевым антигеном, определенным выше в разделе «Композиция вакцины», и (b) по меньшей мере одним химиотерапевтическим агентом, определенным выше в разделе «Химиотерапевтический агент», и/или по меньшей мере одним иммунотерапевтическим агентом, определенным выше в разделе «Иммунотерапевтический агент».

Во всех вышеуказанных аспектах изобретения соединение АВХ196, когда заключено в композиции вакцины, может использоваться как адъювант.

Термин «совместное введение» или «комбинированное введение», используемый в настоящем описании, определяется как охватывающий введение выбранных терапевтических агентов для одного пациента, и предназначен для включения схем лечения, в которых агенты необязательно вводятся одним путем введения или в одно и то же время.

Согласно изобретению термин «субъект» или «субъект, нуждающийся в этом» предназначен для обозначения человека или млекопитающего, не являющегося человеком, или подобного, пораженного раком.

В контексте изобретения термин «лечащий» или «лечение» обозначает реверсию, облегчение, ингибирование развития или предотвращение расстройства или состояния, к которому применим такой термин, или одного или нескольких симптомов такого расстройства или состояния.

«Терапевтически эффективным количеством» соединения по изобретению обозначают количество соединения, достаточное для лечения рака (например, ограничения роста или замедления или блокировки метастазов опухоли) при разумном отношении польза/риск, приемлемом для любого консервативного лечения. Однако следует иметь в виду, что общее суточное применение соединений по настоящему изобретению будет определяться лечащим врачом в рамках здравого медицинского суждения. Конкретный уровень терапевтически эффективной дозы для любого определенного субъекта будет зависеть от ряда факторов, включая расстройство, от которого лечат, и тяжесть расстройства, активность конкретных используемых соединений, специфическую используемую комбинацию, возраст, массу тела, состояние здоровья, пол и питание субъекта, время введения, путь введения и скорость экскреции конкретных используемых соединений, длительность лечения, лекарственные средства, используемые в комбинации или по совпадению с конкретными используемыми соединениями, и подобные факторы, хорошо известные в медицине. Например, для специалиста в данной области техники разумно начинать с доз соединений на уровнях ниже требуемых для достижения желательного терапевтического действия, и постепенно повышать дозировку до достижения желательного действия.

Противоопухолевая фармацевтическая комбинация согласно изобретению особенно применима для лечения раковых заболеваний.

Противоопухолевую фармацевтическую комбинацию по изобретению можно использовать для лечения заметной раковой опухоли в любой фазе ее развития, включая рак в его запущенной фазе развития. В частности, противоопухолевую фармацевтическую комбинацию по изобретению можно использовать для лечения очень агрессивных раковых заболеваний.

Конкретнее, термин «лечение рака», используемый в настоящем описании, включает по меньшей мере один из следующих признаков: ослабление симптомов, связанных с раком, уменьшение объема раковой опухоли (например, снижение роста опухоли), стабилизация состояния раковой опухоли (например, ингибирование роста опухоли), предотвращение дальнейшего распространения рака (например, метастазирования), предотвращение появления или рецидива рака, задержка или замедление развития рака (например, снижение роста опухоли) или улучшение статуса рака (например, снижение размера опухоли).

Используемый в настоящем описании термин «рак» или «раковая опухоль» относится к расстройству, при котором популяция клеток перестает, в различной степени, реагировать на контрольные механизмы, которые обычно управляют пролиферацией и дифференцировкой. Раком называют различные типы злокачественных неоплазм и опухолей, включая первичные опухоли, и метастазирование опухоли. Неогрничивающими примерами раковых заболеваний, которые можно лечить комбинациями по настоящему изобретению, являются лимфопролиферативные расстройства, рак молочной железы, рак яичников, рак предстательной железы, рак шейки матки, эндометриальный рак, рак костей, рак печени, рак желудка, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак щитовидной железы, рак головы и шеи, рак центральной нервной системы, рак периферической нервной системы, рак кожи, рак почек, гепатоцеллюлярная карцинома, гепатома, гепатобластома, рабдомиосаркома, эзофагеальный рак, тиреоидная карцинома, ганглиобластома, хордома, ангиосаркома, эндотелиосаркома, опухоль Юнига, лейомиосаркома, рабдотелиосаркома, инвазивная протоковая карцинома, папиллярная аденокарцинома, меланома, сквамозная карцинома, базальноклеточная карцинома, аденокарцинома, почечно-клеточная карцинома, гипернефрома, гипернефроидный рак, рак желчных протоков, хориокарцинома, семинома, эмбриональная карцинома, опухоль Вильмса, опухоль яичка, рак легких, включая мелкоклеточный, не-мелкоклеточный и крупноклеточный рак легких, карцинома мочевого пузыря, глиома, астроциома, медулобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, ретинобластома, нейробластома, карцинома толстой кишки, карцинома прямой кишки, злокачественные образования кроветворной системы, включая все типы лейкоза и лимфомы, включая острый миелогенный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, тучноклеточный лейкоз, множественную миелому, миелоидную лимфому, ходжкинскую лимфому, неходжкинскую лимфому и гепатокарциному.

Предпочтительно рак, который лечат в контексте настоящего изобретения, выбирают из группы, включающей меланому, рак почек, гепатокарциному, рак поджелудочной железы и рак легких.

В одном воплощении рак, который лечат в контексте настоящего изобретения, выбирают из группы, включающей меланому, гепатокарциному, рак мочевого пузыря и колоректальный рак.

Наиболее предпочтительно рак, который лечат в контексте настоящего изобретения, представляет собой меланому.

Комбинированная терапия может обеспечить терапевтическое преимущество с точки зрения дифференциальной токсичности, связанной с отдельными лечениями. Например, лечение одним химиотерапевтическим агентом или одним иммунотерапевтическим агентом может привести к определенной токсичности, которая не видна с АВХ196 или с композицией вакцины по изобретению. Как таковая, эта дифференциальная токсичность может позволить назначать каждое лечение в дозе, в которой токсичность не проявляется или минимальна, так что вместе комбинированная терапия обеспечивает терапевтическую дозу, избегая в то же время токсичности каждого из составляющих комбинацию агентов. Кроме того, так как терапевтическое действие, достигнутое в результате комбинированной терапии, является усиленным, дозы каждого из агентов даже можно снизить еще, снижая таким образом ассоциированную токсичность в еще большей степени.

В особенно предпочтительном воплощении способ лечения рака согласно изобретению включает одно введение, предпочтительно внутривенно, соединения АВХ196 или композиции вакцины по изобретению, определенной выше в разделе «Композиция вакцины», затем через 4 дня одно введение, предпочтительно внутривенной инфузией, химиотерапевтического агента, определенного выше в разделе «Химиотерапевтический агент», в частности, доксорубицина.

В другом воплощении способ лечения рака согласно изобретению включает одно введение, предпочтительно внутривенно, соединения АВХ196 или композиции вакцины по изобретению, определенной выше в разделе «Композиция вакцины», затем через 7 дней первое введение, предпочтительно внутривенной инфузией, иммунотерапевтического агента, определенного выше в разделе «Иммунотерапевтический агент», в частности, ниволумаба, предпочтительно с последующим 4 днями позже вторым введением, предпочтительно внутривенной инфузией, указанного иммунотерапевтического агента, предпочтительно с последующим 3 днями позже третьим введением, предпочтительно внутривенной инфузией, указанного иммунотерапевтического агента, также предпочтительно с последующим 4 днями позже четвертым введением, предпочтительно внутривенной инфузией, указанного иммунотерапевтического агента.

Настоящее изобретение будет также поясняться с помощью фигур и примеров ниже.

Краткое описание фигур

Фигура 1. Средний и медианный объем опухолей В16-F10, приживленных мышам C57BL/6, обработанным в примере 1 TRP2-ABX196 в D3, анти-PD-1 антителами в D10, D14, D17 и D21 или комбинацией TRP2-ABX196 и анти-PD-1 антител.

Фигура 2. Выживание мышей C57BL/6 с опухолями В16-F10 и обработанных в примере 1 TRP2-ABX196, анти-PD-1 антителами или комбинацией TRP2-ABX196 и анти-PD-1 антител.

***: p < 0,001; ****: p < 0,0001; n.s.: незначимый.

Фигура 3. Средний и медианный объем опухолей В16-F10, приживленных мышам C57BL/6, обработанным в примере 1 TRP2-ABX196 в D3, доксорубицином в D7 или комбинацией TRP2-ABX196 и доксорубицина.

Фигура 4. Выживание мышей C57BL/6 с опухолями В16-F10 и обработанных в примере 1 TRP2-ABX196, доксорубицином или комбинацией TRP2-ABX196 и доксорубицина.

Фигура 5. Средний объем опухоли (мм³) у мышей с B16F10 из примера 5 при воздействии среды, моноклональных анти-PD-1 антител, АВХ196, введенных i.v., или комбинации моноклональных анти-PD-1 антител и АВХ196, введенной i.v.. Среднее +/- ср.-кв.ош.

Фигура 6. Средний объем опухоли (мм³) у мышей с B16F10 из примера 5 при воздействии среды, моноклональных анти-PD-1 антител, АВХ196, введенных i.t., или комбинации моноклональных анти-PD-1 антител и АВХ196, введенной i.t.. Среднее +/- ср.-кв.ош.

Фигура 7. Выживание мышей с опухолями В16-F10 из примера 5 при воздействии среды, моноклональных анти-PD-1 антител, АВХ196, введенных i.v., или комбинации моноклональных анти-PD-1 антител и АВХ196, введенной i.v.. Среднее +/- ср.-кв.ош.

Фигура 8. Выживание мышей с опухолями В16-F10 из примера 5 при воздействии среды, моноклональных анти-PD-1 антител, АВХ196, введенных i.t., или комбинации моноклональных анти-PD-1 антител и АВХ196, введенной i.t.. Среднее +/- ср.-кв.ош.

Фигура 9. Средний объем опухоли (мм³) у мышей с СТ-26 из примера 6 при воздействии среды, моноклональных анти-PD-1 антител, АВХ196, введенных i.v., или комбинации моноклональных анти-PD-1 антител и АВХ196, введенной i.v.. Среднее +/- ср.-кв.ош.

Фигура 10. Средний объем опухоли (мм³) у мышей с МВТ-2 из примера 6 при воздействии среды, моноклональных анти-PD-1 антител, АВХ196, введенных i.v., или комбинации моноклональных анти-PD-1 антител и АВХ196, введенной i.v.. Среднее +/- ср.-кв.ош.

Фигура 11. Выживание мышей с МВТ-2 из примера 6 при воздействии среды (2), моноклональных анти-PD-1 антител (4), АВХ196, введенных i.v. (3), или комбинации моноклональных анти-PD-1 антител и АВХ196 (1).

Фигура 12. Инвазия опухоли в печень, %, в каждой из групп мышей из примера 7 в день 20. G1: среда; G2: сорафениб; G3: сорафениб+ABX196; G4: доксорубицин; G5 доксорубицин + ABX196; G6: анти-PD-1; G7 анти-PD-1 + ABX196.

Описание последовательностей

SEQ ID NO:	Последовательность	Описание
1	KFGWTGPDCNRKKPA GGNCSVYDFFVWLHYY	Аминокислотная последовательность пептида Cl II- TRP2180-188
2	KFGWTGPDCNRKKPA	Аминокислотная последовательность эпитопа класса II
3	SVYDFFVWL	Аминокислотная последовательность иммунодоминантного пептида родственного тирозиназе белка 2 опухольассоциированного антигена
4	GGGSVYDFFVWLGGGSSKFGWTGPDCNRKKPA	Аминокислотная последовательность пептида, включающего последовательность иммунодоминантного белка из TRP2

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Данный пример показывает, что композиция вакцины, включающая соединение АВХ196 и опухолевый антиген, повышает противораковое действие химиотерапевтических агентов, таких как доксорубицин, или иммунотерапевтических агентов, таких как анти-PD-1 антитела.

1. Материалы и методы

1.1. Соединения

Используемая композиция вакцины включает пептид CI II-TRP2_180-188 и адъювант ABX196.

Пептид Cl II-TRP2_180-188 с последовательностью KFGWTGPDCNRKKPA GG NCSVYDFFVWLHYY (SEQ ID NO: 1) состоит из эпитопа класса II (KFGWTGPDCNRKKPA (SEQ ID NO: 2)), слитого с иммунодоминантным пептидом из родственного тирозиназе белка 2 опухольассоциированного антигена, который сверхэкспрессируется в меланоците (SVYDFFVWL (SEQ ID NO: 3)).

Адъювант ABX196 имеет свойство активировать NKT клетки.

Используемый химиотерапевтический агент представляет собой доксорубицин (DOXO CELL, Cell Pharm).

Используемый иммунотерапевтический агент представляет собой анти-PD-1 антитело (см. BE0146, BioXcell; клон RMP1-14, реактивность мышь; изотип Rat IgG2a; условия хранения +4°C).

1.2. Среды для соединений

Доксорубицин разводят в NaCl, 0,9%.

Анти-PD-1 антитело получают в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) или другой подходящей среде согласно рекомендациям изготовителя.

Пептид Cl II-TRP2 (5 мг/пробирка) ресуспендируют в ДМСО в концентрации 50 мг/мл.

Адъювант ABX196 предоставляют в виде раствора 250 мкг/мл.

Конечную композицию вакцины, содержащей пептид Cl II-TRP2 и ABX196, получают в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS).

Раствор среды, используемый в группе 1 в день 3 (см. раздел 2.1.2.), содержит ДМСО, разведенный в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), в такой же конечной концентрации, как для вакцины CL II-TRP2/ABX196.

1.3. Дозы для обработки

Пептид CL II-TRP2 вводят в дозе 50 мкг на мышь вместе с 1 мкг адъюванта ABX196.

Анти-PD-1 антитело вводят в дозе 10 мг/кг.

Доксорубицин вводят в дозе 12 мг/кг.

1.4. Пути введения

Композицию вакцины инъецируют внутривенным путем в каудальную вену мышей (IV, болюс).

Анти-PD-1 антитело инъецируют в брюшную полость мышей (интраперитонеально, IP).

Доксорубицин инъецируют внутривенно в каудальную вену мышей (IV, болюс).

Во всех группах композицию вакцины вводят в объеме дозы 10 мл/кг/введ (т.е., одной мыши, весящей 20 г, вводят 200 мкл композиции вакцины) согласно самой последней массе мыши.

1.5. Раковые клеточные линии и условия культивирования

1.5.1. Раковые клеточные линии

Клеточная линия, которую используют, детализирована ниже в таблице 1.

Таблица 1. Используемая клеточная линия

Клеточная линия	Тип	Вид	Источник
B16-F10	Меланома	мышь	ATCC a

^a Американская коллекция типовых культур, Манассас, Вирджиния, США

Клеточная линия B16-F10 установлена из метастаза в легких, появившегося от спонтанно возникшей меланомы у мыши C57BL/6J.

1.5.2. Условия культивирования клеток

Клетки выращивают в виде монослоя при 37°C в увлажненной атмосфере (5% CO₂, 95% воздух) в их соответствующей культуральной среде (см. таблицу ниже). Культуральная среда представляет собой DMEM, содержащую 2 мM L-глутамина (см. BE12-702F, Lonza, Verviers, Бельгия) с добавлением 10% сыворотки плода коровы (см. 3302, Lonza). Опухолевые клетки прилипают к пластиковым колбам. Для использования в экспериментах клетки отделяют от колб для выращивания путем 5-минутной обработки трипсином-версеном (см. BE17-161E, Lonza) в среде Хенкса без кальция или магния (см. BE10-543F, Lonza) и нейтрализуют путем добавления полной культуральной среды. Клетки считают в гемоцитометре, и оценивают их жизнеспособность эксклюзионным анализом с 0,25% трипановым синим.

1.6. Использование животных

1.6.1. Животные

От JANVIER LABS (Le Genest-Saint-Isle, France) получают 95 здоровых самок мышей C57BL/6 (C57BL/6J) в возрасте 6-7 недель. Животных поддерживают в статусе здоровья SPF согласно указаниям FELASA.

Содержание животных и экспериментальные процедуры осуществляют согласно Правилам Франции и Европейским правилам и руководству NRC по обращению и использованию лабораторных животных.

1.6.2. Условия содержания

Животных держат в помещениях в условиях регулирования окружающей среды:

- температура 22 ± 2°C,

- влажность 55 ± 10%,

- световой период (12 час свет/12 час темнота),

- фильтр для воздуха HEPA,

- 15-кратный обмен воздуха без рециркуляции.

Загоны для животных обеспечиваются стерильным и адекватным пространством с подстилками, кормом и водой, окружающим и социальным обогащением (групповое содержание), как описано далее:

- верхний фильтр поликарбонатный, клетки по евростандарту типа III или типа IV,

- подстилка из стержней кукурузных початков (см. LAB COB 12, SERLAB, Франция),

- облученный корм, 25 кГр (Ssniff^® Soest, Германия),

- полный корм для иммунокопетентных грызунов - экструдат R/M-H,

- стерильная фильтрованная через 0,2-мкм фильтр вода,

- обогащение окружающей среды (SIZZLE-dri kraft - D20004 SERLAB, Франция).

2. Обработки

2.1. Исследование противоопухолевой активности новой вакцины в комбинации с PD-1 таргетирующим антителом или доксорубицином на мышах с подкожной меланомой В16-F10

2.1.1. Индукция опухолей В16-F10 у животных

Опухоли индуцируют подкожной инъекцией 1×10⁶ клеток B16-F10 в 200 мкл буфера PBS в правый бок 95 самкам C57BL/6. День инъекции опухолевых клеток в бравый бок принимают за D0.

2.1.2. Схема обработки

Затем в D3 90 из девяносто пяти (95) распределяют согласно их массе тела на 6 групп, каждая по 15 животных (группы 1-6).

Выполняют статистическую проверку (дисперсионный анализ, ANOVA) для проверки однородности между группами с использованием программы Vivo Manager® (Biosystemes, Couternon, Франция).

Животные из группы 1 получают одну IV инъекцию среды, используемой для композиции вакцины, в день 3 и 4 IP введения среды, используемой для анти-PD-1 антитела, в день 10, 14, 17 и 21.

Животные из группы 2 получают одну IV инъекцию 50 мкг Cl II-TRP2 вместе с 1 мкг ABX196 в день 3.

Животные из группы 3 получают 4 IP введения анти-PD-1 антитела в день 10, 14, 17 и 21.

Животные из группы 4 получают одну IV инъекцию 50 мкг Cl II-TRP2 вместе с 1 мкг ABX196 в день 3 и 4 IP введения анти-PD-1 антитела в день 10, 14, 17 и 21.

Животные из группы 5 получают одну IV инъекцию доксорубицина 12 мг/кг в день 7.

Животные из группы 6 получают одну IV инъекцию 50 мкг Cl II-TRP2 вместе с 1 мкг ABX196 в день 3 и одну IV инъекцию доксорубицина 12 мг/кг в день 7.

Схема обработки суммирована в таблице 2 ниже.

Таблица 2. Схемы обработки

Группа	Число животных	Обработка	Доза	Путь	Схема обработки
1	15	Среда	-	IV/IP	D3-IV/дважды×2 IP
2	15	CL II-TRP2/ABX196	50 мкг/1мкг	IV	Q1D×1 в D3
3	15	Анти-PD-1 Ab	10 мг/кг	IP	Дважды×2 в D10/D14/D17/D21
4	15	CL II-TRP2/ABX196	50 мкг / 1мкг	IV	Q1D×1 в D3
Анти-PD-1 Ab	10 мг/кг	IP	Дважды×2 в D10/D14/D17/D21
5	15	Доксорубицин	12 мг/кг	IV	Q1D×1 в D7
6	15	CL II-TRP2/ABX196	50 мкг / 1мкг	IV	Q1D×1 в D3
Доксорубицин	12 мг/кг	IV	Q1D×1 в D7
ВСЕГО	90

Мониторинг животных выполняют так, как описано в разделе 2.2.

2.2. Мониторинг животных

2.2.1. Клинический мониторинг

Жизнеспособность и поведение регистрируют каждый день. Массу тела измеряют дважды в неделю до инъекции опухолевых клеток и затем трижды в неделю. Длину и ширину опухоли измеряют штангенциркулем трижды в неделю, и объем опухоли оценивают по формуле

Tumor volume – Объем опухоли, width – ширина, length – длина

2.2.2. Гуманные конечные точки:

- признаки боли, страдания или дистресса; поза боли, маска боли, поведение,

- опухоль, превышающая 10% от нормальной массы тела (взятая в расчет отдельная опухоль), но не превышающая 1500 мм³ (в расчет принимают сумму объема опухоли на правом боку/MFP и объема опухоли на левом боку/MFP),

- опухоли, препятствующие амбуляции или питанию,

- изъязвленная опухоль или эрозия ткани,

- 20% потеря массы тела, остающаяся в течение 2 дней подряд,

- плохое состояние тела, истощение, кахексия, обезвоживание,

- длительное отсутствие произвольных реакций на внешние раздражители,

- учащенное затрудненное дыхание, анемия, значительное кровотечение,

- неврологические признаки: движение по кругу, конвульсии, паралич,

- стойкое снижение температуры тела,

- аномальное вздутие живота.

2.2.3. Аутопсия

Выполняют аутопсию (макроскопическое исследование) всех животных, уничтоженных в исследовании, и, если возможно, всех умирающих при эвтаназии или обнаруженных мертвыми животных.

2.3. Процедуры для животных

2.3.1. Анестезия

Используют анестезию газом изофлюраном для инокуляции опухолей и i.v. инъекции.

2.3.2. Эвтаназия

Эвтаназию животных выполняют путем передозировки газа для анестезии (изофлюрана) с последующим смещением шейных позвонков или обескровливанием.

3. Обработка данных

3.1. Параметры здоровья

Определяют указанные далее критерии здоровья с использованием программы Vivo Manager® (Biosystemes, Couternon, Франция).

- Предоставляют массу тела отдельных животных и среднюю.

- Изменение средней массы тела (MBWC): вычисляют средние изменения массы обработанных животных в процентах (масса в день B минус масса в день A, деленное на массу в день A). Интервалы, в которых вычисляют MBWC, выбирают как функцию из кривых масса тела – дни измерения массы тела.

3.2. Параметры эффективности

Эффективность обработки оценивают в терминах действия композиции вакцины на объем опухоли у обработанных животных относительно контрольных животных. Определяют следующие критерии оценки противоопухолевой эффективности с использованием программы Vivo Manager® (Biosystemes, Couternon, Франция):

- предоставляют отдельные, средние и медианные объемы опухолей;

- предоставляют число мышей без опухолей.

Также контролируют выживание мышей и используют как параметр эффективности. Вычерчивают кривые выживания.

Вычисляют показатель процент обработанных/контроль (Т/С (%)) путем деления медианного объема обработанной опухоли на медианный объем контрольной опухоли в день 14 и умножения на 100. Т/С (%), равный или меньше 42%, рассматривают как показатель значимой противоопухолевой активности по ветви оценки лекарственного средства от разделения противораковой обработки (NCI).

Tumor Volume Median_treated – Медианный объем опухоли_обраб

Tumor Volume Median_vehicle – Медианный объем опухоли_среда

Ингибирование роста опухоли также отражает противоопухолевую эффективность и вычисляется, следуя формуле

treated dayx – обработанные, дни, vehicle dayx – среда, дни

vehicle initial – среда, начальный

%TGI выше 50% рассматривается как активный.

3.3. Статистический анализ

Анализируют средние объемы опухолей в определенное время для всех обработок с помощью программы GrapadPrism (версия 6.07) с использованием критерия Крускала-Уоллиса. За значимым различием между всеми обработками (P < 0,05) следует парное сравнение с использованием критерия множественного сравнения Данна. Выживание анализируют с использование логрангового (Мантеля-Кокса) критерия с помощью программы GrapadPrism (версия 6.07). За значимым различием между всеми обработками (P < 0,05) следует парное сравнение с использованием логрангового (Мантеля-Кокса) критерия.

4. Результаты

4.1. Исследование противораковой активности композиции вакцины по изобретению (TRP2-АВХ196) в комбинации с таргетирующим PD-1 антителом или доксорубицином на мышах с подкожной меланомой В16-F10

4.1.1. Параметры токсичности

Строят кривые средней массы тела, и исследуют действие обработки на массу тела отдельных мышей.

Не наблюдают ухудшения общего статуса, и клинический статус у обработанных мышей во время исследования остается хорошим для любой группы обработки.

Для трех групп мышей, которых иммунизировали TRP2-ABX196, через два дня после иммунизации определяют существенную потерю массы, т.е., приблизительно 10%. Потеря массы является временной у всех мышей, и они быстро восстановили массу на пятый день.

За исключением мышей, обработанных комбинацией TRP2-ABX196 и доксорубицина, у которых масса тела стабилизировалась в период обработки, оценка массы тела схожа во всех других группах обработки.

Таким образом, за исключением временной потери массы после иммунизации вакциной TRP2-ABX196 одной или в комбинации, все обработки переносятся мышами C57BL/6J с опухолью B16-F10.

4.1.2. Анализ противоопухолевой активности

Кривые отдельных, средних и медианных объемов опухолей приводятся на фигурах 1 и 3.

Кривые выживания мышей приводятся на фигурах 2 и 4.

Суммарное медианное время выживания в днях приводится ниже в таблице 3.

Таблица 3. Медианное выживание (дни) в экспериментальых группах

Группа обработки	Медианное выживание (дни)
Среда	17
TRP2-ABX196	21
Анти-PD-1 Ab	17
TRP2-ABX196 + анти-PD-1 Ab	28
Доксорубицин	21
TRP2-ABX196 + доксорубицин	26

Статистический анализ объема опухолей в D17 показан ниже в таблице 4.

Таблица 4. Статистический анализ роста опухолей между обработками на D17

Общее сравнение всех обработок на D17: величина P < 0,0001 (критерий Крускала-Уоллиса).

Парные сравнения между обработками: величина P согласно критерию множественного сравнения Данна.

Группы обработки	Среда	TRP2-ABX196	α-PD-1	TRP2-ABX196 + α-PD-1	Доксо.	TRP2-ABX196 + доксо.
Среда	-	ns	ns	***	ns	***
TRP2-ABX196	ns	-	ns	ns	ns	ns
α-PD-1	ns	ns	-	***	ns	****
TRP2-ABX196 + α-PD-1	***	ns	***	-	ns	ns
Доксо.	ns	ns	ns	ns	-	*
TRP2-ABX196 + Доксо.	***	ns	****	ns	*	-

α-PD-1 : анти-PD-1 антитело; доксо.: доксорубицин

*: P < 0,05; ***: P < 0,001; ****: P < 0,0001

ns – незначимый

Статистический анализ объема опухолей в D19 показан ниже в таблице 5.

Таблица 5. Статистический анализ роста опухолей между обработками на D19

Общее сравнение всех обработок на D19: величина P < 0,0001 (критерий Крускала-Уоллиса).

Парные сравнения между обработками: величина P согласно критерию множественного сравнения Данна.

Группы обработки	Среда	TRP2-ABX196	α-PD-1	TRP2-ABX196 + α-PD-1	Доксо.	TRP2-ABX196 + доксо.
Среда	-	ns	ns	ns	ns	**
TRP2-ABX196	ns	-	ns	ns	ns	ns
α-PD-1	ns	ns	-	**	ns	***
TRP2-ABX196 + α-PD-1	ns	ns	**	-	ns	ns
Доксо.	ns	ns	ns	ns	-	*
TRP2-ABX196 + Доксо.	**	ns	***	ns	*	-

α-PD-1 : анти-PD-1 антитело; доксо.: доксорубицин

*: P < 0,05; **: P < 0,01; ***: P < 0,001, ****: P < 0,0001

ns – незначимый

Статистический анализ объема опухолей в D17 и D19 в трех подгруппах показан ниже в таблице 6.

Таблица 6. Статистический анализ роста опухолей между тремя подгруппами на D17 и D19.

Статистический анализ для трех групп с TRP2-ABX196 в качестве эталонной группы.

	D17	D19
Величина P – критерий Крускала-Уоллисаa	0,0228	0,0121
TRP2-ABX196 + Anti-PD-1 Abb	*	ns
TRP2-ABX196 + доксорубицинb	*	**

^a: три группы (рассматривают TRP2-ABX196, TRP2-ABX196 + анти-PD-1 Ab и TRP2-ABX196 + доксорубицин), ns – незначимый

^b: критерий множественного сравнения Данна с TRP2-ABX196 в качестве эталонной группы

*: P < 0,05; **: P < 0,01; ***: P < 0,001; ****: P < 0,0001

ns – незначимый

Статистический анализ выживания мышей показан ниже в таблице 7.

Таблица 7. Статистический анализ выживания мышей между обработками.

Общее сравнение всех кривых выживания: P* < 0,0001.

Суммирование попарных сравнений.

Группы обработки	TRP2-ABX196	α-PD-1	TRP2-ABX196 + α-PD-1	Доксо.	TRP2-ABX196 + доксо.
Среда	0,0001**	0,279	< 0,0001	0,0015	< 0,0001
α-PD-1	-	0,0002	0,0710	0,624	0,22
Доксо.			< 0,0001	-	0,1285

α-PD-1 : анти-PD-1 антитело; доксо.: доксорубицин

* логранговый (Мантеля-Кокса) критерий

** : жирные цифры относятся к значимому различию между сравниваемыми группами (P < 0,05).

Таблица 8. Показатель противоопухолевой активности в день 14

	TRP2/ABX196	Анти-PD-1	Доксорубицин	TRP2/ABX196 + анти-PD-1	TRP2/ABX196 + доксорубицин
T/C	33,5	99,8	56,3	11,8	15,4
TGI	63,1	22,5	52,7	90,5	78,5

Анализ противоопухолевой активности TRP2-ABX196 в комбинации с анти-PD-1 Ab

Мышей с опухолями В16-F10 обрабатывают в D3 вакциной TRP2-ABX196, анти-PD-1 Ab в D10, D14, D17 и D21 или их комбинацией. Кинетика роста опухолей показана на фигуре 1.

Как ожидалось, не имеется противоопухолевой активности, связанной с обработкой анти-PD-1 Ab, по сравнению с группой, обработанной средой. Эти наблюдения подтверждаются величинами Т/С и TG1, показывающими, что анти-PD-1 демонстрирует какую-нибудь активность (таблица 8; Т/С > 42%, и TG1 < 50%). Напротив, обработка мышей TRP2-ABX196 показывает более медленный рост опухолей В16-F10 по сравнению с ростом в группе, обработанной средой. Величины Т/С и TG1 отражают противоопухолевую активность TRP2/ABX196 (таблица 8; Т/С < 42%, и TG1 > 50%). Противоопухолевая активность TRP2/ABX196 дополнительно улучшается в комбинации с анти-PD-1 антителом с полной стабилизацией роста опухолей до дня 14 в последней группе, как также показывают величины Т/С и TG1 (таблица 8), которые ниже 15% и выше 90%, соответственно. Эти величины показывают высокоэффективную обработку после следования указаниям NCI, Т/С ниже 15% показывает высокий потенциал обработки.

Строгий и полный статистический анализ роста опухолей в D17 (таблица 5) показывает значимое различие в объеме опухолей между всеми группами и высоко значимое уменьшение объема опухоли в группе мышей, обработанных вакциной TRP2-ABX196 и анти-PD-1 антителом, только в сравнении с группой, обработанной средой.

С целью повышения мощности статистического анализа и выявления различия в комбинированной группе против группы, обработанной вакциной, выполняют последующий статистический анализ с тремя группами, т.е., TRP2-ABX196, TRP2-ABX196 + анти-PD-1 Ab и TRP2-ABX196 + доксорубицин (таблица 6). Этот анализ показывает значимое уменьшение объема опухолей в D17 между TRP2-ABX196 и TRP2-ABX196 в комбинации с анти-PD-1 антителом, хотя это различие не достигает значимости в день 19.

Выживание мышей иллюстрирует фигура 2. Выживание мышей, обработанных TRP2-ABX196 и TRP2-ABX196 в комбинации с анти-PD-1 антителом, существенно повышается по сравнению с группой, обработанной средой (таблица 7), в то время как для комбинированной обработки повышение приближается к значимости (P = 0,0710) по сравнению с одной вакциной TRP2-ABX196.

Анализ противоопухолевой активности TRP2-ABX196 в комбинации с доксорубицином

Мышей с опухолями В16-F10 обрабатывают в D3 вакциной TRP2-ABX196, доксорубицином в D7 или их комбинацией. Кинетика роста опухолей показана на фигуре 3.

Мыши, обработанные одним доксорубицином, показывают слабое и незначительное (таблицы 4 и 5) уменьшение роста опухолей по сравнению с группой, обработанной средой. Даже если TGI несколько превышает 50%, величина Т/С остается определенно до 42%, показывая недостаточность противоопухолевого действия доксорубицина. Мыши, обработанные комбинацией TRP2-ABX196 с доксорубицином, показывают полную стабилизацию роста опухолей до дня 14; уменьшение объема опухолей в D17 и D19 достигает значимости против группы, обработанной средой, после полного статистического анализа эксперимента (таблицы 4 и 5). Синергетическое действие TRP2-ABX196 и доксорубицина также демонстрируется величинами Т/С и TGI, которые < 42% и > 50%, соответственно (таблица 8).

После последующего статистического анализа с тремя группами (таблица 6) обнаруживают значимое различие в объеме опухолей в D17 и D19 между TRP2-ABX196 и TRP2-ABX196 в комбинации с доксорубицином.

Выживание мышей иллюстрирует фигура 4. Выживание мышей, обработанных TRP2-ABX196 в комбинации с доксорубицином, существенно повышается по сравнению с группой, обработанной средой (таблица 7), в то время как выживание не достигает значимости по сравнению с обработкой каждым средством по отдельности.

Синтез медианного выживания для всех экспериментальных групп показан в таблице 3.

5. Выводы

Целью этого примера было объединить вакцину TRP2-ABX196 или с анти-PD-1 антителом или химиотерапевтическим агентом доксорубицином, известным как вызывающим иммуногенную гибель клеток.

Испытываемые соединения, или каждое в отдельности или в комбинации, хорошо переносятся животными, и не регистрируются ни тяжелая токсичность, ни гибель, связанные с лекарственными средствами.

Временную потерю массы тела, близкую к 10%, наблюдают во всех группах, получавших вакцину TRP2-ABX196, но все мыши быстро восстанавливают свою нормальную массу, т.е., в дни со 2 по 5 после единственной инъекции вакцины.

Выживание мышей, обработанных вакциной TRP2-ABX196, значимо повышается по сравнению с группой, обработанной средой. Для обеих групп с комбинацией противоопухолевая активность дополнительно повышается, когда сравнивают с одной вакциной с медианным выживанием 21 день, которое повышается до 28 и 26 дней, когда сравнивают комбинацию с анти-PD-1 антителом или доксорубицином соответственно. Повышение выживания приближается к значимому с комбинацией вакцины TRP2-ABX196 и анти-PD-1 антитела (P = 0,071) против одной вакцины. Даже если обработки TRP2/ABX196 и доксорубицином показывают противоопухолевое действие, эти обработки улучшаются с помощью комбинации по изобретению (ABX196 плюс анти-PD-1 или плюс доксорубицин), что отражает отношение T/C, которое ниже 16%, когда мышей обрабатывают комбинациями (см. таблицу 8). При величине ниже 15% обработку рассматривают как высоко активную, следуя указаниям NCI. В то же время TGI (ингибирование роста опухоли) составляет до 78% при наличии обработок комбинациями, демонстрируя, что обработка комбинацией является высоко активной.

Эти результаты являются выдающимися в контексте сильной агрессивности модели В16-F10 и ее весьма плохой иммуногенности. Достойно внимания, что эксперимент выполнялся с большим числом инъецированных опухолевых клеток, т.е. один миллион на животное, что может потенциально пояснить, почему не наблюдалось регрессии опухолей.

ПРИМЕР 2

В этом примере описывается специфическое действие, получаемое с композицией вакцины по изобретению, включающей АВХ196 в качестве адъюванта, по сравнению с другими композициями вакцин, включающими в качестве адъюванта другие производные α–галактозилцерамида.

Материалы и методы

Эксперимент выполняют так, как описано в примере 1, за исключением того, что мышам вводят 5×10⁵ клеток В16-F10.

Другим используемым производным α–галактозилцерамида является α–GalCer следующей формулы

.

- Схема обработки в первом эксперименте следующая:

Группа	Число животных	Обработка	Доза	Путь	Схема обработки
1	15	Среда	-	IV	Q1D×1 в D7/D10
2	15	ABX196	100 нг	IV	Q1D×1 в D10
3	15	α-GalCer	100 нг	IV	Q1D×1 в D10
4	15	доксорубицин	12 мг/кг	IV	Q1D×1 в D7
5	15	доксорубицин	12 мг/кг	IV	Q1D×1 в D7
ABX196	100 нг	IV	Q1D×1 в D10
6	15	доксорубицин	12 мг/кг	IV	Q1D×1 в D7
α-GalCer	100 нг	IV	Q1D×1 в D10
ВСЕГО	90

- Схема обработки во втором эксперименте следующая:

Группа	Число животных	Обработка	Доза	Путь	Схема обработки
1	15	Среда	-	IV	Q1D×1 в D7/D10
2	15	ABX196	10 нг	IV	Q1D×1 в D10
3	15	α-GalCer	10 нг	IV	Q1D×1 в D10
4	15	ABX196	100 нг	IV	Q1D×1 в D10
5	15	α-GalCer	100 нг	IV	Q1D×1 в D10
6	15	доксорубицин	12 мг/кг	IV	Q1D×1 в D7
7	15	доксорубицин	12 мг/кг	IV	Q1D×1 в D7
ABX196	10 нг	IV	Q1D×1 в D10
8	15	доксорубицин	12 мг/кг	IV	Q1D×1 в D7
ABX196	100 нг	IV	Q1D×1 в D10
9	15	доксорубицин	12 мг/кг	IV	Q1D×1 в D7
		α-GalCer	10 нг	IV	Q1D×1 в D10
10	15	доксорубицин	12 мг/кг	IV	Q1D×1 в D7
α-GalCer	100 нг	IV	Q1D×1 в D10
ВСЕГО	150

- Схема обработки в третьем эксперименте следующая:

Группа	Число животных	Обработка	Доза	Путь	Схема обработки
1	15	Среда	-	IV/IP	D3-IV/дважды×2 IP
2	15	TRP2/ABX196	50 мкг / 1мкг	IV	Q1D×1 в D3
3	15	Анти-PD-1 Ab	10 мг/кг	IP	дважды×2 в D10/D14/D17/D21
4	15	TRP2/ABX196	50 мкг / 1мкг	IV	Q1D×1 в D3
		Анти-PD-1 Ab	10 мг/кг	IP	дважды×2 в D10/D14/D17/D21
5	15	TRP2/αGalCer	50 мкг / 1 мкг	IV	Q1D×1 в D3
6	15	TRP2/αGalCer	50 мкг / 1 мкг	IV	Q1D×1 в D3
Анти-PD-1 Ab	10 мг/кг	IP	дважды×2 в D10/D14/D17/D21
ВСЕГО	90

- Схема обработки в четвертом эксперименте следующая:

Группа	Число животных	Обработка	Доза	Путь	Схема обработки
1	10	Среда	-	IV/IP	D3-IV/дважды×2 IP
2	10	TRP2/ABX196	50 мкг / 1мкг	IV	Q1D×1 в D3
3	10	TRP2/ABX196	50 мкг / 1мкг	IV	Q1D×1 в D3
		Анти-PD-1 Ab	10 мг/кг	IP	дважды×2 в D10/D14/D17/D21

В D12 и D16 по 5 мышей в группе умерщвляют и вскрывают.

Опухоль собирают, и выполняют анализ проточной цитометрией следующих популяций:

Т-цитотоксические популяции CD45⁺/CD3⁺/CD8⁺/TNFα/перфорин/гранзим;

популяции Treg CD45⁺/CD3⁺/CD4⁺/CD8^-/FoxP3.

ПРИМЕР 3

1. ЦЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценка противоопухолевой активности ABX196 и α-Gal-Cer, определенного в примере 2, на эктопической модели меланомы B16-F10.

Оценка противоопухолевой активности при обработке ABX196 и α-Gal-Cer в комбинации с доксорубицином на эктопической модели меланомы B16-F10.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эсперимент проводят так же, как в примере 1, за исключением перечисленного далее.

Среды для испытываемых и эталонных веществ

Доксорубицин разбавляют в растворе NaCl, 0,9%.

АВХ196 предоставляют в виде раствора 250 мкг/мл.

α-Gal-Cer предоставляют в виде раствора 1 мг/мл.

Разбавление АВХ196 или α-GalCer выполняют в буфере PBS.

Раствор среды, используемый в группе 1 в день 7, содержит ДМСО, разведенный в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), в той же конечной концентрации, что и АВХ196.

Дозы для обработки

Соединения АВХ196 и α-Gal-Cer вводят в дозе 10 или 100 нг на мышь.

Доксорубицин вводят в дозе 12 мг/кг.

Пути введения

Испытываемое вещество вводят внутривенной инъекцией в каудальную вену мыши (IV, болюс).

Доксорубицин вводят внутривенной инъекцией в каудальную вену мыши (IV, болюс).

Во всех группах испытываемые вещества (АВХ196 и α-Gal-Cer) вводят при объеме дозы 5 мл/кг/введ (т.е., одной мыши, весящей 20 г, вводят 100 мкл раствора испытываемого вещества), согласно самой последней массе мыши. Доксорубицин вводят при объеме дозы 10 мл/кг/введ.

3. ПЛАН ЭКСПЕРИМЕНТА И ОБРАБОТКИ

3.1.1. Индукция опухоли В16-F10 у животных

Опухоль индуцируют подкожной инъекцией 5×10⁵ клеток B16-F10 в 200 мкл буфера PBS в правый бок у ста девяносто пяти (195) самок C57BL/6. День инъекции опухолевых клеток в правый бок принимают за D0.

3.1.2. Схема обработки

Затем в D7 сто пятьдесят (150) животных из ста девяносто пяти (195) распределяют согласно их объему опухоли на 10 групп по 15 животных (группы 1-10). Если объем в D7 слишком мал, в частности, у мышей с опухолями, не поддающимися измерению, распределение выполняют согласно их массе тела.

Статистическую проверку (дисперсионный анализ) выполняют для проверки однородности между группами с использованием программы Vivo Manager® (Biosystemes, Couternon, Франция).

Схема обработки суммируется в таблице ниже.

Группа	Число животных	Обработка	Доза	Путь	Схема обработки
1	15	Среда	-	IV	Q1D×1 в D7/D10
2	15	ABX196	10 нг	IV	Q1D×1 в D10
3	15	α-GalCer	10 нг	IV	Q1D×1 в D10
4	15	ABX196	100 нг	IV	Q1D×1 в D10
5	15	α-GalCer	100 нг	IV	Q1D×1 в D10
6	15	доксорубицин	12 мг/кг	IV	Q1D×1 в D7
7	15	доксорубицин	12 мг/кг	IV	Q1D×1 в D7
ABX196	10 нг	IV	Q1D×1 в D10
8	15	доксорубицин	12 мг/кг	IV	Q1D×1 в D7
ABX196	100 нг	IV	Q1D×1 в D10
9	15	доксорубицин	12 мг/кг	IV	Q1D×1 в D7
α-GalCer	10 нг	IV	Q1D×1 в D10
10	15	доксорубицин	12 мг/кг	IV	Q1D×1 в D7
α-GalCer	100 нг	IV	Q1D×1 в D10

Животные из группы 1 получают одну IV инъекцию среды для испытываемого вещества в день 7 и 10.

Животные из группы 2 получают одну IV инъекцию 10 нг ABX196 в день 10.

Животные из группы 3 получают одну IV инъекцию 10 нг α-Gal-Cer в день 10.

Животные из группы 4 получают одну IV инъекцию 100 нг ABX196 в день 10.

Животные из группы 5 получают одну IV инъекцию 100 нг α-Gal-Cer в день 10.

Животные из группы 6 получают одну IV инъекцию доксорубицина 12 мг/кг в день 7.

Животные из группы 7 получают одну IV инъекцию доксорубицина 12 мг/кг в день 7 и одну IV инъекцию 10 нг ABX196 в день 10.

Животные из группы 8 получают одну IV инъекцию доксорубицина 12 мг/кг в день 7 и одну IV инъекцию 100 нг ABX196 в день 10.

Животные из группы 9 получают одну IV инъекцию доксорубицина 12 мг/кг в день 7 и одну IV инъекцию 10 нг α-Gal-Cer в день 10.

Животные из группы 10 получают одну IV инъекцию доксорубицина 12 мг/кг в день 7 и одну IV инъекцию 100 нг α-Gal-Cer в день 10.

ПРИМЕР 4

1. ЦЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Часть 1. Оценка противоопухолевой активности комбинаций вакцины CL II-TRP2/ABX196 или CL II-TRP2/α-Gal-Cer с анти-PD-1 антителом на эктопической модели меланомы B16-F10.

Часть 2. Характеризация иммунных инфильтратов в опухолях B16-F10 мышей, обработанных вакциной CL II-TRP2/ABX196 одной или в комбинации с обработкой анти-PD-1 антителом.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Часть 1 эксперимента такая же, как пример 1, за исключением перечисленного далее.

Среды для испытуемых и эталонных веществ

Анти-PD-1 антитело получают в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) или другой подходящей среде согласно рекомендациям изготовителя.

Пептид CL II-TRP2 (5 мг/пробирка) ресуспендируют в ДМСО в концентрации 50 мг/мл.

Адъювант ABX196 предоставляют в виде раствора 250 мкг/мл.

Адъювант α-Gal-Cer предоставляют в виде раствора 1 мг/мл.

Конечную композицию вакцины, содержащую пептид CL II-TRP2 и ABX196, получают в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS).

Раствор среды, используемый в группе 1 в день 3, содержит ДМСО, разведенный в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), в той же конечной концентрации, как для вакцины CL II-TRP2/ ABX196.

Дозы для обработки

Пептид CL II-TRP2 вводят в дозе 50 мкг на мышь вместе со 100 нг адъюванта АВХ196 или α-Gal-Cer.

Анти-PD-1 антитело вводят в дозе 10 мг/кг.

Пути введения

Испытываемое вещество вводят внутривенной инъекцией в каудальную вену мыши (IV, болюс).

Анти-PD-1 антитело вводят в брюшную полость мыши (интраперитонеально, IP).

Во всех группах испытываемое вещество вводят при объеме дозы 5 мл/кг/введ (т.е., одной мыши, весящей 20 г, вводят 100 мкл раствора испытываемого вещества), согласно самой последней массе мыши.

Анти-PD-1 антитело вводят при объеме дозы 10 мл/кг/введ.

3. ПЛАН ЭКСПЕРИМЕНТА И ОБРАБОТКИ

Часть 1. Исследование противоопухолевой активности вакцины в комбинации с таргетирующим PD-1 антителом на мышах с подкожной меланомой В16-F10

i. Индукция опухолей В16-F10 у мышей

Опухоль индуцируют подкожной инъекцией 5×10⁵ клеток B16-F10 в 200 мкл буфера PBS в правый бок у ста пятидесяти шести (156) самок C57BL/6. День инъекции опухолевых клеток в правый бок принимают за D0.

ii. Схема обработки

В D3 сто двадцать (120) животных из ста пятидесяти шести (195) распределяют согласно их массе тела на 9 групп по 15 животных (группы 1-6 АСТ2) и 3 группы по 10 животных (группы 1-2 АСТ3).

Статистическую проверку (дисперсионный анализ) выполняют для проверки однородности между группами с использованием программы Vivo Manager® (Biosystemes, Couternon, Франция).

Животные из группы 1 получают одну IV инъекцию среды для испытываемого вещества в день 3 и 4 IP введения среды для эталонного вещества (антитело) в день 10, 14, 17 и 21.

Животные из группы 2 получают одну IV инъекцию 50 мкг CL II-TRP2 вместе со 100 нг ABX196 в день 3.

Животные из группы 3 получают 4 IP введения анти-PD-1 антитела в день 10, 14, 17 и 21.

Животные из группы 4 получают одну IV инъекцию 50 мкг CL II-TRP2 вместе со 100 нг ABX196 в день 3 и 4 IP введения анти-PD-1 антитела (антитело) в день 10, 14, 17 и 21.

Животные из группы 5 получают одну IV инъекцию 50 мкг CL II-TRP2 вместе со 100 нг α-Gal-Cer в день 3.

Животные из группы 6 получают одну IV инъекцию 50 мкг CL II-TRP2 вместе со 100 нг α-Gal-Cer в день 3 и 4 IP введения анти-PD-1 антитела (антитело) в день 10, 14, 17 и 21.

Схема обработки суммируется в таблице ниже.

Группа	Число животных	Обработка	Доза	Путь	Схема обработки
1	15	Среда	-	IV/IP	D3-IV/дважды ×2 IP
2	15	CL II-TRP2/ABX196	50 мкг / 100 нг	IV	Q1D×1 в D3
3	15	Анти-PD-1 Ab	10 мг/кг	IP	Дважды ×2 в D10/D14/D17/D21
4	15	CL II-TRP2/ABX196	50 мкг / 100 нг	IV	Q1D×1 в D3
Анти-PD-1 Ab	10 мг/кг	IP	Дважды ×2 в D10/D14/D17/D21
5	15	CL II-TRP2- α-Gal-Cer	50 мкг / 100 нг	IV	Q1D×1 в D3
6	15	CL II-TRP2- α-Gal-Cer	50 мкг / 100 нг	IV	Q1D×1 в D3
Анти-PD-1 Ab	10 мг/кг	IP	Дважды ×2 в D10/D14/D17/D21
ВСЕГО	90

Часть II. Характеризация иммунных Т-клеточных инфильтратов в опухолях меланомы B16-F10 мышей, обработанных вакциной в комбинации с таргетирующим PD-1 антителом.

Животные из группы 1 получают одну IV инъекцию среды для испытываемого вещества в день 3 и 4 IP введения среды для эталонного вещества (антитело) в день 10, 14, 17 и 21.

Животные из группы 2 получают одну IV инъекцию 50 мкг CL II-TRP2/ABX196 вместе со 100 нг АВХ196 в день 3.

Животные из группы 3 получают одну IV инъекцию 50 мкг CL II-TRP2/ABX196 вместе со 100 нг АВХ196 в день 3 и 4 IP введения анти-PD-1 антитела в день 10, 14, 17 и 21.

Схема обработки суммирована в таблице ниже.

Группа	Число животных	Обработка	Доза	Путь	Схема обработки
1	10	Среда	-	IV/IP	D3-IV/дважды ×2 IP
2	10	CL II-TRP2/ABX196	50 мкг / 100 нг	IV	Q1D×1 в D3
3	10	CL II-TRP2/ABX196	50 мкг / 100 нг	IV	Q1D×1 в D3
Anti-PD-1 Ab	10 мг/кг	IP	Q1D×2 в D10/D14

Иммунные Т-клеточные инфильтраты в опухоли оценивают в D13 и D17. В момент окончания собирают опухоли от 5 мышей из каждой группы. Для группы 2 и 3 собирают уравновешенное соотношение опухолей отвечающих и неотвечающих мышей в каждый день сбора, т.е. D13 и D17.

После извлечения из мышей каждую опухоль взвешивают и переносят в пробирки с культуральной средой RPMI. Опухоль механически разрушают шпателем на мелкие кусочки размером в несколько мм и окончательно крошат с помощью поршня 1-мл шприца на сито 70 мкм (см. 352350, FALCON). Затем клетки считают после окрашивания трипаном синим, и один миллион клеток центрифугируют и ресуспендируют в буфере для окрашивания (PBS (см. 17-516F, Lonza), 0,2% BSA (см. A7030, Sigma, Saint-Quentin-Fallavier, Франция), 0,02% NaN₃ (см. S2002, Sigma)).

Антитела, направленные против выбранных маркеров, добавляют к суспензии опухолевых клеток согласно условиям, описанным поставщиком для каждого антитела. На клеточной поверхности детектируют маркеры CD45, CD3, CD4, CD8. Маркеры FoxP3, TNF-альфа, перфорин, гранзим детектируют внутри клеток после пермеабилизации клеток. Изотипические контрольные антитела используют в каждом случае в качестве отрицательного контроля. Панель антител, используемых для измерения двух следующих популяций, приводятся в таблице ниже.

Клеточная популяция Treg CD45+/CD3+/CD4+/CD8-/FoxP3+

Т-Цитотоксические популяции CD45+/CD3+/CD8+/TNF-α/Перфорин/Гранзим

Специфич ность	Эталон	флуорохром	Поставщик	Стандарт изотипа	Изотип	флуорохром	Поставщик
FoxP3	130-093-014	PE	Miltenyi Biotec	A07796	IgG1	PE	Beckman Coulter
CD8a	553036	PerCP	BD Biosciences	553933	IgG2a	PerCP	BD Biosciences
CD3	561389	V450	BD Biosciences	560457	IgG2	V450	BD Biosciences
CD4	130-102-444	VioGreen	Miltenyi Biotec	130-102-659	IgG2b	VioGreen	Miltenyi Biotec
CD45	557659	APC-Cy7	BD Biosciences	552773	IgG2b	APC-Cy7	BD Biosciences
TNF-альфа	506308	APC	biolegend	400412	IgG1	APC	biolegend
Перфорин	12-9392-82	PE	eBioscience	12-4321	IgG2a	PE	eBioscience
Гранзим	11-8898-82	FITC	ebioscience	553988	IgG2b	FITC	BD Biosciences

Смесь клеток и антител инкубируют в течение 20-30 минут при комнатной температуре в темноте, промывают и ресуспендируют в 200 мкл буфера для окрашивания. Все образцы до анализа проточной цитометрией хранят на льду и защищают от света.

Окрашенные клетки анализируют с помощью проточного цитометра CyFlow^® space (LSR II, BD Biosciences), снабженного 3 лазерами с возбуждением при длинах волн 405, 488 и 633 нм. Данные проточной цитометрии получают до тех пор, пока или не зарегистрируют 10000 mCD45+ событий для каждого образца или для максимальной длительности 2 минуты.

ПРИМЕР 5. Исследование АВХ196, вводимого внутривенно или внутримышечно в комбинации с анти-PD-1 антителами

1. ЦЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполняют на сингенной in vivo мышиной модели с опухолью меланомой В16-F10. Опухолевые клетки В16-F10 инокулируют подкожно иммунокометентным мышам С57BL/6.

Опухолевые клетки В16-F10 инокулируют подкожно в день 0 путем инъекции в правый бок 8-10-недельным самкам мышей С57BL/6, и затем животных произвольно определяют в группы контроля (обработка средой PBS) и обработок.

В случае обработки анти-PD-1 антителами мышам инъецируют анти-PD-1 антитела интраперитонеально (IP) в дни 6, 9, 15 и 21. Кроме того, вводят АВХ196, одно введение в 1 дозе внутривенно или внутримышечно, в день 10, когда средний размер опухоли достигает 100 мм³.

Фармакологические группы животных для оценки противоопухолевой активности организуют следующим образом:

- контрольная группа, обрабатываемая средой (PBS согласно схеме обработки анти-PD-1),

- группа, обрабатываемая анти-PD-1 (в 1 дозе, интраперитонеальное введение),

- группа, обрабатываемая АВХ196 (в 1 дозе, внутривенное (iv) введение в день 10),

- группа, обрабатываемая комбинацией (АВХ196 в 1 дозе, внутривенное (iv) введение в день 10, в комбинации с анти-PD-1 антителами в 1 дозе, интраперитонеальное (ip) введение),

- группа, обрабатываемая АВХ196 (в 1 дозе, интратуморальное (it) введение в день 10),

- группа, обрабатываемая комбинацией (АВХ196 в 1 дозе, интратуморальное (it) введение в день 10, в комбинации с анти-PD-1 антителами в 1 дозе, интраперитонеальное (ip) введение),

причем

на группу приходится 14-15 мышей,

всего 90 мышей для оценки эффективности in vivo.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ПРОЦЕДУРА

2.1. Животные

Мыши (Mus musculus), штамм C57BL/6, самки

Поставщик Charles River Laboratories - BP 0109 - F 69592 L'Arbresle Cedex.

Используют животных в возрасте 8 и 10 недель. Шестинедельных мышей помещают в условия для акклиматизации примерно на 14 дней (опухолевые клетки В16F10 имплантируют в возрасте 8 недель). Для этой стадии используют 90 животных.

Вентиляцию и обдув воздухом выполняют с высокой оборачиваемостью (8-20 объемов/час, в зависимости от плотности содержащихся животных), и регулируют температуру в интервале 22-25^оС. влажность поддерживают между 40 и 70%. Искусственное освещение поддерживают 12 часов в день. Количество и доступ к корму (гранулы) и питью (водопроводная вода) контролируют ежедневно. Мышей содержат в общих клетках по 10 животных на клетку (2 клетки по 820 см). Клетки один раз в неделю обновляет ухаживающий за животными.

2.2. Мониторинг животных

Объем опухоли и массу тела животных измеряют и регистрируют три раза в неделю. Объем опухоли, превышающий 2000 мм³, и потерю массы тела больше, чем на 15% относительно начальной массы животного, рассматривают как конечные точки.

Подобным образом, если мышь (i) истощена или (ii) ее шерстяной покров больше не чистый (волос ломается и не блестит)), (iii) становится менее подвижной, это также рассматривается как конечная точка. Когда по меньшей мере наступает одно из этих состояний, тогда мышей умерщвляют путем смещения шейных позвонков.

Для минимизации боли, страдания и беспокойства, связанных с моделью, животных контролируют каждые 2 дня. Наблюдение включает достоверные критерии, такие как потеря массы (15%) и изменение состояния. Делаются улучшения окружающей среды для минимизации беспокойства (пластиковые пробирки).

Обезболивающие процедуры

Для этапов операций (подкожная инъекция опухолевых клеток) дают наркоз с использованием интраперитонеальной инъекции кетамина (0,33 мг/мл) и ксилазина (33,6 мкг/мл).

2.3. Процедура имплантации раковых клеток меланомы

- Линия раковых клеток

Клетки меланомы В16F10 культивируют in vitro согласно указаниям поставщика в RPMI 1640 с добавлением FBS в конечной концентрации 10%. Перед имплантацией мышам оценивают жизнеспособность клеток с использованием эксклюзии трипана синего, и получают клеточную суспензию согласно числу жизнеспособных клеток.

- Индукция опухолей меланомы В16F10 у мышей

Клетки В16F10 имплантируют подкожно в правый бок иммунокомпетентным мышам С57BL/6 (8-недельные самки). Процедура имплантации описывается далее (все стадии выполняют в условиях стерильного ламинарного потока).

Мышам (масса тела около 20 г) дают наркоз путем интраперитонеальной инъекции 90 мкл анестетика (т.е., 1,5 мг/кг кетамина и ксилазина, 150 мкг/кг). Имплантируемые клетки ресуспендируют в стерильном PBS, и объем, необходимый для имплантации, загружают в 1-мл шприц с иглой 25G (1000000 клеток/100 мкл).

2.4. Фармакологические обработки

- Обработка анти-PD-1 антителами

Применяют схему обработки анти-PD-1 моноклональными антителами (а-PD-1) – 100 мкг i.p. инъекцией. Обработку повторяют 4 раза в дни 6, 9, 12, 15 и 18.

Для i.p. инъекций используют иглу 27G.

Материалы:

- анти-PD-1 моноклональные антитела (а-PD-1) – (клон RMP1-14);

- препарат анти-PD-1 моноклональных антител для i.p. введения;

- анти-PD-1 mAb, растворенные в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS).

Используют PBS по Дульбекко для растворения анти-PD-1 Ab в концентрации 1,0 мг/мл (объем 100 мкл). Затем исходный раствор делят на аликвоты (количество для обработки на 1 день) и хранят при -20°С).

- Обработка АВХ 196

АВХ 196 вводят в день 10 или

- внутривенной (i.v.) инъекцией в дозе 100 нг на мышь, или

- интратуморальной (i.t.) инъекцией в дозе 10 нг на мышь.

Материалы

АВХ 196 для i.v. введения

АВХ196 предоставляют в виде раствора в концентрации 250 мкг/мл в PBS. Получают раствор АВХ196 1 мкг/мл и хранят при 4°С. В день 10 100 мкл 1 мкг/мл раствора АВХ196 инъецируют в хвостовую вену мышей из групп 3 и 4.

АВХ 196 для i.t. введения

АВХ196 предоставляют в виде раствора в концентрации 250 мкг/мл в PBS. Получают раствор АВХ196 0,4 мкг/мл и хранят при 4°С. В день 10 животным из групп 5 и 6 дают наркоз, и инъецируют 25 мкл 0,4 мкг/мл раствора АВХ196 в опухоль.

Сводка фармакологических обработок

Группа	Линия опухол. клеток	Обработка	n	Хозяин	Доза	Схема	Путь
1	B16F10	Среда	20	C57BL/6	PBS	Дни 6, 9, 12, 15 и 18	i.p
2	B16F10	Анти-PD-1 mAb	20	C57BL/6	100 мкг	Дни 6, 9, 12, 15 и 18	i.p
3	B16F10	ABX196	20	C57BL/6	100 нг	День 10	i.v
4	B16F10	Анти-PD-1 mAb +ABX196	20	C57BL/6	100 мкг Анти-PD-1 mAb	Дни 6, 9, 12, 15 и 18	i.p
100 нг ABX196	День 10	i.v
5	B16F10	ABX196	20	C57BL/6	10 нг	День 10	i.t
6	B16F10	Анти-PD-1 mAb +ABX196	20	C57BL/6	100 мкг Анти-PD-1 mAb	Дни 6, 9, 12, 15 и 18	i.p
10 нг ABX196	День 10	i.t

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

Начиная с дня 6 после инокуляции клеток В16F10, все экспериментальные группы контролируют 3 раза в неделю в течение 4 недель на следующие параметры:

- размер опухоли: измеряют физически 3 раза в неделю,

- масса тела: контролируют 3 раза в неделю, и

- выживание: предоставляют графиком Каплана-Мейера, 3 раза в неделю.

Вычисление показателя противоопухолевой активности такое же, как в примере 1 для показателя Т/С (%) и TGI (%).

1. Оценка противоопухолевой реакции

а) Объем опухоли

Результаты приводятся на фигурах 5 и 6, которые показывают средний объем опухоли (мм³) у мышей с В16F10 при воздействии различных обработок после внедрения опухоли.

В частности, результаты показывают, что комбинация анти-PD-1 Ab и АВХ196 согласно изобретению является более эффективной при снижении объема опухоли, чем один АВХ196 или одни анти-PD-1 Ab, вводимые или i.v. или i.t..

Результаты также показаны ниже в таблицах.

Статистический анализ среднего объема опухоли в день 17 между 6 испытываемыми группами

Непарный двусторонний t-критерий с коррекцией по Уэлчу

Среда является эталонными группами. Среднее +/- ст.-кв.ош.. Логранговый (Мантеля-Кокса) критерий применяют с использованием Graph Pad Prism→Mean +/- ст.-кв.ош.. Логранговый (Мантеля-Кокса) критерий является значимым; * p<0,05 ; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001; NS – незначимый.

b) Выживание

Результаты приводятся на фигурах 7 и 8, показывающих выживание мышей с В16F10, подвергнутых различным обработкам после введения опухолей.

В частности, результаты показывают, что комбинация анти-PD-1 Ab и АВХ196 согласно изобретению приводит к более высокому проценту выживания, чем один АВХ196 или одни анти-PD-1 Ab, вводимые или i.v. или i.t..

с) Показатель противоопухолевой активности

	ABX196 iv	Анти-PD-1	ABX196 it	Анти-PD-1 + ABX196 iv	Анти-PD-1 + ABX196 it
T/C	51	76	53	42	37

Вывод

Данное исследование имеет целью оценить благоприятное действие АВХ196 в комбинации с блокадой PD-1 на сингеничной мышиной модели меланомы.

Анти-PD-1 антитело не оказывает действия даже при введении дополнительной дозы в день 18. Отсутствие действия наблюдают как на объеме опухоли (фигуры 5 и 6), так и на уровнях выживания (фигуры 7 и 8).

Также наблюдают временное действие АВХ196 в каждые моменты времени после его введения (или iv или it), которое не переходит в существенное действие.

Однако интересно то, что наблюдают синергетическое действие АВХ196 и анти-PD-1 Ab. Действительно, АВХ196 способен усиливать анти-PD-1 действие, которое было совсем неэффективным. Такое синергетическое действие наблюдают как при iv, так и при it введении АВХ196. В частности, его наблюдают на уровнях объема опухоли (фигуры 5 и 6) со значимым различием между анти-PD-1 и анти-PD-1 + ABX196 (iv или it) (p=0,012 и 0,0245 соответственно). Данные по выживанию ясно показывают благоприятное действие комбинирования ABX196 и анти-PD-1 Ab по сравнению со средой.

Пример 6. Определение противоопухолевой активности ABX196, вводимого системно одного или в комбинации с анти-PD-1 антителом, при раке толстой кишки и раке мочевого пузыря

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.1. Испытываемые и эталонные вещества

1.1.1. Испытываемые вещества

ABX196

1.1.2. Эталонные вещества

Анти-PD-1 антитело (см. BE0146, BioXcell; клон RMP1-14, реактивность мышь; изотип Rat IgG2a; условия хранения +4°C).

1.1.3. Среды для испытываемого и эталонного веществ

Анти-PD-1 антитело получают в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) или другой подходящей среде согласно рекомендациям изготовителя.

Адъювант ABX196 предоставляют в виде раствора 250 мкг/мл.

1.2. Дозы для обработки

ABX196 вводят в дозе 100 нг на мышь. Анти-PD-1 антитело вводят в дозе 10 мг/кг.

1.3. Пути введения

Испытываемое вещество инъецируют внутривенным путем в каудальную вену мышей (IV, болюс).

Анти-PD-1 антитело инъецируют в брюшную полость мышей (интраперитонеально, IP).

Во всех группах ABX196 вводят в фиксированном объеме дозы 100 мкл (т.е., приблизительно 5 мл/кг/введ для мыши, весящей 20 г.

Анти-PD-1 антитело вводят в объеме дозы 10 мл/кг/введ.

1.4. Раковые клеточные линии и условия культивирования

1.4.1. Раковая клеточная линия

Клеточные линии, которые используют, детализированы в таблице ниже.

Клеточная линия	Тип	Вид	Источник
CT-26	Аденокарцинома толстой кишки	мышь	ATCC a
MBT-2	Карцинома мочевого пузыря	мышь	ATCC a

a Американская коллекция типовых культур, Манассас, Вирждиния, США

Клеточная линия СТ-26 представляет собой недифференцированную клеточную линию карциномы толстой кишки, вызванной N-нитрозо-N-метилуретаном (NNMU) у мышей BALB/C.

Мышиную клеточную линию MBT-2 получают от вызванной карциногеном опухоли мочевого пузыря у мышей C3H/HeJ. Клеточную линию MBT-2 предоставил Dr Cozzi, Memorial Sloan Kettering Cancer Center (New York, USA).

1.4.2. Условия культивирования клеток

Опухолевые клетки выращивают в виде монослоя при 37°C в увлажненной атмосфере (5% CO₂, 95% воздух). Культуральной средой является RPMI 1640, содержащая 2 мM L-глутамина (см. BE12-702F, Lonza, Verviers, Бельгия) с добавлением 10% сыворотки плода коровы (см. 3302, Lonza). Опухолевые клетки прилипают к пластиковым колбам. Для использования в экспериментах клетки отделяют от колб для выращивания путем 5-минутной обработки трипсином-версеном (см. BE17-161E, Lonza) в среде Хенкса без кальция или магния (см. BE10-543F, Lonza) и нейтрализуют путем добавления полной культуральной среды.

Клетки считают, и оценивают их жизнеспособность эксклюзионным анализом с 0,25% трипановым синим.

1.5. Животные

Получают шестьдесят три (63) здоровые самки мышей BALB/c в возрасте 6-7 недель из CHARLES RIVER (L'Arbresles) для каждой модели, сингеничной для этого штамма мышей (т.е., CT-26), и 68 (шестьдесят восемь) здоровых самок мышей C3H/HeJ (C3H/HeOuJ) в возоасте 6-7 недель получают из The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine) для модели MBT-2.

Животных поддерживают в статусе здоровья SPF согласно руководству FELASA. Содержание животных и экспериментальные процедуры осуществляют согласно Правилам Франции и Европейским правилам и руководству NRC по обращению и использованию лабораторных животных. Условия содержания животных такие же, как в примере 1.

2. ПЛАН ЭКСПЕРИМЕНТА И ОБРАБОТКИ

2.1. Индукция опухолей СТ-26 и МВТ-2 у животных

Опухоли индуцируют подкожной инъекцией 1×10⁶ клеток CT-26 в 200 мкл RPMI 1640 в правый бок 63 самкам мышей BALB/C. Опухоли MBT-2 индуцируют подкожной инъекцией 1×10⁶ клеток в 200 мкл RPMI 1640 в правый бок шестидесяти восьми (68) самкам.

2.2. Схема обработки

Обработку начинают, когда средний объем опухолей достигает 80-120 мм³. Сорок восемь (48) животных из шестидесяти трех (63) для модели СТ-26 или шестьдесят восемь (68) для модели МВТ-2 распределяют согласно объему их индивидуальной опухоли на 4 группы по 12 животных каждая с использованием программы Vivo Manager® (Biosystemes, Couternon, Франция). Статистическую проверку (дисперсионный анализ, ANOVA) выполняют для проверки гомогенности между группами. Схема обработки следующая:

- животные из группы 1 получают IV инъекцию среды для АВХ196 и IP инъекцию среды для анти-PD-1 антитела,

- животные из группы 2 получают IV инъекцию 100 нг АВХ196,

- животные из группы 3 получают дважды в неделю введение анти-PD-1 антитела,

- животные из группы 4 получают IV инъекцию 100 нг АВХ196 и дважды в неделю введение анти-PD-1 антитела.

Схема обработки суммирована в таблице ниже.

Группа	Число животных	Обработка	Доза (мг/кг/введ)	Путь введ.	Схема обработки
1	12	Среда для ABX196	-	IV
Среда для анти-PD-1 Ab	-	IP	Дважды×2
2	12	ABX196	100 нг	IV	Q1D×1
3	12	Анти-PD-1 Ab	10	IP	Дважды×2
4	12	ABX196	100 нг	IV	Q1D×1
анти-PD-1 Ab*	10	IP	Дважды×2

* IP инъекцию анти-PD-1 Ab начинают после первого IV введения ABX196 (сопутствующее введение) без какой-либо задержки.

2.3. Мониторинг животных

2.3.1. Клинический мониторинг

Все данные исследования, включая измерения массы тела, объема опухолей, клинические записи и регистрацию смертности и обработку, включаются в список и вносятся в базу данных Vivo Manager® database (Biosystemes, Dijon, Франция).

Жизнеспособность и поведение регистрируют каждый день. Массу тела измеряют дважды в неделю. Длину и ширину опухоли измеряют штангенциркулем дважды в неделю, и объем опухоли оценивают по формуле

.

Tumor volume – Объем опухоли, width – ширина, length – длина

2.4. Статистическая проверка

Все статистические анализы выполняют с использованием программы Vivo Manager® (Biosystemes, Dijon, Франция). Статистический анализ средней массы тела, MBWC, среднего объема опухоли и распределения, среднего объема опухоли V, среднего времени достижения V и среднего времени удвоения опухоли выполняют с использованием ANOVA. Парные критерии применяют с использованием коррекции по Бонферрони/Данну в случае значимых результатов ANOVA. Логранговый критерий (Каплана-Мейера) используют для сравнения кривых выживания. Величину р < 0,05 рассматривают как значимую.

2.5. Гуманные конечные точки

Гуманные конечные точки являются теми же, что в примере 1.

2.6. Аутопсия

Выполняют аутопсию (макроскопическое исследование) всех животных, уничтоженных в исследовании, и, если возможно, всех умирающих при эвтаназии или обнаруженных мертвыми животных.

2.7. Анестезия

Используют анестезию газом изофлюраном для всех процедур: инокуляции опухолей и i.v. инъекции.

2.8. Аналгезия

При всех процедурах обезболивания оказывают немедикаментозную помощь. Кроме того, может быть оказана медикаментозная помощь, не влияющая на исследования (топическая обработка), по рекомендации лечащего ветеринара.

2.9. Эвтаназия

Эвтаназию животных выполняют путем передозировки газа для анестезии (изофлюрана) с последующим смещением шейных позвонков или обескровливанием.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Противоопухолевая активность обработок, проверенных на мышах с подкожными СТ-26 колоректального рака

На фигуре 9 приводятся результаты, показывающие средний объем опухоли (мм³) у мышей с СТ-26, подвергнутых различным обработкам после введения опухолей. В частности, результаты показывают, что комбинация анти-PD-1 Ab с АВХ196 согласно изобретению является более эффективной при уменьшении объема опухоли, чем один АВХ196 или одно анти-PD-1 Ab.

Показатели противоопухолевой активности приводятся в таблице ниже.

	ABX196	Анти-PD-1	ABX196 + анти-PD-1
T/C	51	58	40
TGI	72	42	80

3.2. Противоопухолевая активность обработок, проверенных на мышах с подкожными МВТ-2 рака мочевого пузыря

На фигуре 10 приводятся результаты, показывающие средний объем опухоли (мм³) у мышей с МВТ-2, подвергнутых различным обработкам после введения опухолей. В частности, результаты показывают, что комбинация анти-PD-1 Ab с АВХ196 согласно изобретению является более эффективной при уменьшении объема опухоли, чем один АВХ196 или одно анти-PD-1 Ab.

Показатели противоопухолевой активности приводятся в таблице ниже.

	ABX196	Анти-PD-1	ABX196+анти-PD-1
T/C	57	78	36
TGI	43	22	64

3.3. Выживание

Результаты, показывающие выживание мышей с МВТ-2, подвергнутых различным обработкам после введения опухолей, приводятся на фигуре 11 и в таблице ниже.

Медианное выживание (дни) мышей с МВТ-2 из экспериментальных групп

Обработка	Медианное выживание (дни)
Среда	23
ABX196	27
Анти-PD-1	28
ABX196 + анти-PD-1	34

Комбинирование АВХ196 с анти-PD-1 антителами значимо улучшает выживание мышей по сравнению с обработкой одним АВХ196 или одними анти-PD-1 антителами.

Статистический анализ выживания мышей при различных обработках

Общее сравнение всех кривых выживания: величина p 0,0045 (***)(лонгранговый (Мантеля-Кркса) критерий)

Сумма парных сравнений

NS – незначимое

4. Вывод

Проверенные обработки или одним средством или в комбинации хорошо переносятся животными, и не зарегистрированы ни токсичность, ни гибель животных, связанные с лекарственным средством.

Противоопухолевая активность АВХ196 плюс анти-PD-1 при колоректальным раке

Задержка роста опухоли у мышей, обработанных АВХ196 плюс анти-PD-1, существенно улучшается по сравнению с группой, обработанной средой (см. фигуру 9). Отношение Т/С и TGI ясно показывают синергетическое действие АВХ196 и анти-PD-1 антител. Только группа с обработкой АВХ196 + анти-PD-1 показывает Т/С <42%.

Противоопухолевое действие при раке мочевого пузыря

Комбинация АВХ196 + анти-PD-1 антитела значимо снижает рост опухоли (см. фигуру 10). Отношение Т/С и TGI ясно показывают синергию АВХ196 и анти-PD-1 антител. Выживание мышей, обработанных АВХ196 + анти-PD-1, существенно улучшено по сравнению с группой, обработанной средой (см. фигуру 11). В случае групп, обработанных комбинацией, противоопухолевая активность дополнительно улучшается, когда сравнивается с одним АВХ196 или одними анти-PD-1 с медианным выживанием в 27 или 28 дней, которое повышается до 34 дней, когда АВХ196 комбинируют с анти-PD-1 антителом.

Пример 7. Оценка противоопухолевой активности АВХ196 в комбинации с доксорубицином или сорафенибом или анти-PD-1 антителом на ортотипической модели Нера 1-6 гепатокарциномы

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.1. Испытываемые и эталонные вещества

1.1.1. Испытываемые вещества

ABX196

1.1.2. Эталонные вещества

Доксорубицин DOXO CELL,Cell Pharm.

Сорафениб (Nexavar®, Bayer Pharma, 200 мг/пил).

Анти-PD-1 антитело (см. BE0146, BioXcell; клон RMP1-14, реактивность мышь; изотип Rat IgG2a; условия хранения +4°C).

1.2. Среды для испытываемого и эталонных веществ

Анти-PD-1 антитело получают в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) или другой подходящей среде согласно рекомендациям изготовителя.

В каждый день введения мышам пилюли сорафениба измельчают и растворяют сначала в ДМСО (см. 41640, Fluka, Sigma, Saint Quentin Fallavier, Франция), затем в твине 20 (см. P9416, Sigma), после чего добавляют раствор NaCl (0,9%) (конечное отношение ДМСО/твин 20/NaCl (0,9%): 5/5/90 об./об.) для достижения соответствующей концентрации 10 мг/мл.

ABX196 предоставляют в виде раствора 250 мкг/мл. Разбавление ABX196 выполняют в буфере PBS.

Раствор среды, используемый в группе 1 в день 5, содержит ДМСО, разведенный в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), в такой же конечной концентрации, как для ABX196.

1.3. Дозы для обработки

ABX196 вводят в дозе 100 нг на мышь.

Доксорубицин вводят в дозе 12 мг/кг.

Анти-PD-1 антитело вводят в дозе 10 мг/кг.

Сорафениб вводят в дозе 100 мг/кг.

1.4. Пути введения

АВХ196 инъецируют внутривенным путем в каудальную вену мышей (IV, болюс).

Доксорубицин вводят внутривенно в каудальную вену мышей (IV, болюс).

Анти-PD-1 антитело инъецируют в брюшную полость мышей (интраперитонеально, IP).

Сорафениб вводят с помощью перорального зонда (per os) через канюлю.

Во всех группах АВХ196 вводят в фиксированном объеме дозы 100 мкл (приблизительно 5 мл/кг/введ для мыши, весящей 20 г). Доксорубицин, анти-PD-1 антитело и сорафениб вводят в объеме дозы 10 мл/кг/введ согласно самой последней массе мыши.

1.5. Раковые клеточные линии и условия культивирования

1.5.1. Раковая клеточная линия

Клеточная линия, которую используют, детализирована в таблице ниже.

Клеточная линия	Тип	Источник
Нера 1-6	Гепатоцеллюлярная карцинома	АТССа

a: Американская коллекция типовых культур, Манасса, Вирджиния, США

Клеточная линия Hepa 1-6 является производным гепатомы мыши BW7756, появившейся у мыши C57/L.

1.5.2. Условия культивирования клеток

Опухолевые клетки выращивают в виде монослоя при 37°C в увлажненной атмосфере (5% CO₂, 95% воздух). Культуральной средой является DMEM, содержащая 4 мM L-глутамина (см. BE12-604F, Lonza, Verviers, Бельгия), 4,5 г/л глюкозы и 1 мМ NaPyr, с добавлением 10% сыворотки плода коровы (см. 3302, Lonza). Клетки прилипают к пластиковым колбам.

Для использования в экспериментах опухолевые клетки отделяют от колбы для выращивания путем 5-минутной обработки трипсином-версеном (см. BE17-161E, Lonza) в среде Хенкса без кальция или магния (см. BE10-543F, Lonza) и нейтрализуют путем добавления полной культуральной среды. Клетки считают в гемоцитометре, и оценивают их жизнеспособность эксклюзионным анализом с 0,25% трипановым синим.

1.5.3. Животные

Получают сто (100) здоровых самок мышей C57BL/6 (C57BL6J) в возрасте 5-6 недель из JANVIER LABS (Le Genest-Saint-Isle).

Животных поддерживают в статусе здоровья SPF согласно руководству FELASA. Содержание животных и экспериментальные процедуры осуществляют согласно Правилам Франции и Европейским правилам и руководству NRC по обращению и использованию лабораторных животных. Условия содержания животных такие же, как в примере 1.

1.6. Магнитно-резонансная томография

Все эксперименты по получению изображений выполняют на горизонтальном магните 4.7T (PharmaScan, Bruker Biospin GmbH, Германия), снабженном активно защищенной градиентной системой. Все МР-изображения обрабатывают с помощью ParaVision (PV5.1, Bruker Biospin).

1.6.1. Катушки и приспособления для укладки

Мышей укладывают ничком в предназначенном для мышиного тела приспособлении, которое плавно вдвигают в объемную катушку (внутренний диаметр 38 мм) в Pharmascan.

1.6.2. Анестезия и физиологический мониторинг

Во время всех определений мышам непрерывно дают наркоз с использованием изофлюрана (Minerve, Bondoufle, Франция) в смеси с воздухом через наконечник. Частоту дыхания мыши непрерывно контролируют с использованием датчика давления, установленного на животе. Физиологические сигналы контролируют по ноутбуку, установленному вслед за станцией МРТ, и соединенному с датчиками оптоволоконными кабелями (SA Instruments, США).

1.6.3. Последовательность получения МР-изображений

Калибровка и установка

После укладки животного в магнит получают пробные изображения для целей калибровки. Получают сагиттальные, корональные и аксиальные срезы. В начале такого сбора данных выполняют автоматическую настройку для оптимизации shim, RF мощности и амплификации сигнала МР.

Тип	ТЕ/TR (мс)	Размер матрицы	FOV (мин)	Нет срезов	Толщина среза/зазор (мм)	Без усреднений
FLASH	6/100	128 × 128	60 × 60	NA	1/NA	1

Последовательность, используемая на этой стадии, имеет следующие характеристики, где

ТЕ – время эхо, TR – время повторения, FOV – поле обзора.

1.6.4. Т2-взвешенное (T2w) анатомическое изображение – аксиальная ориентация

Анатомические изображения получают с использованием последовательности T2w RARE. Последовательность, используемая на этой стадии, имеет следующие характеристики:

Тип	ТЕ/TR (мс)	Размер матрицы	FOV (мин)	Нет срезов	Толщина среза/зазор (мм)	Без усреднений
RARE (фактор Rare 8)	38/2880	256 × 192	37 × 28	15	0,8/0,8	3

При необходимости размер FOV и параметры последовательности адаптируют для получения наилучших результатов по изображению.

1.6.5. Обработка изображений

Все МР-изображения переносят на рабочую станцию на основе Windows® для анализа под ImageJ. Инвазию в опухоль оценивают полуколичественно визуальной оценкой процента опухоли во всей печени.

2. ПЛАН ЭКСПЕРИМЕНТА И ОБРАБОТКИ

2.1. Индукция опухолей Нера 1-6 у животных внутриселезеночной инъекцией

Один миллион (1x10⁶) опухолевых клеток в 50 мкл среды RPMI 1640 трансплантируют внутриселезеночной инъекцией 100 мышам 100 C57BL/6. Коротко, делают небольшой разрез под ребром в левом боку. Временно выводят селезенку на поверхность тела. Селезенку кладут на слой стерильной марли, и под визуальным контролем инъецируют клеточную суспензию иглой 27 размера. После инокуляции клеток селезенку иссекают. День инъекции опухолевых клеток принимают за D0.

2.2. Схема обработки

Обработку начинают в D5. Девяносто девять (99) животных из ста (100) распределяют согласно их массе тела в 3 группы по 13 животных и 6 групп по 12 животных с использованием программы Vivo Manager® (Biosystemes, Couternon, Франция). Статистическую проверку (дисперсионный анализ, ANOVA) выполняют для проверки гомогенности между группами.

Схема обработки следующая:

- животные из группы 1 получают одну IV инъекцию среды для АВХ196 в день 5,

- животные из группы 2 получают одно ежедневное РО введение сорафениба по 100 мкг/кг/введ в течение 21 дня подряд, начиная с дня 5,

- животные из группы 3 получают одну IV инъекцию 100 нг АВХ196 в день 5 и одно ежедневное РО введение сорафениба по 100 мкг/кг/введ в течение 21 дня подряд, начиная с дня 5,

- животные из группы 4 получают одну IV инъекцию доксорубицина 12 мг/кг в день 5,

- животные из группы 5 получают одну IV инъекцию 100 нг АВХ196 и одну IV инъекцию доксорубицина 12 мг/кг в день 5,

- животные из группы 6 получают 4 IP введения анти-PD-1 антитела в день 7, 10, 14 и 17 (дважды в неделю × 2),

- животные из группы 7 получают одну IV инъекцию 100 нг АВХ196 в день 5 и 4 IP введения анти-PD-1 антитела в день 7, 10, 14 и 17 (дважды в неделю × 2).

Схема обработки суммирована в таблице ниже.

Группа	Число животных	Обработка	Доза (мг/кг/введ)	Путь введ.	Схема обработки
1	13	Среда	NA	IV	Q1D×1 в D5
2	13	Сорафениб	100		Q1D×21, начиная с D5
3	12	ABX196	100 ng	IV	Q1D×1 в D5
Сорафениб	100		Q1D×21, начиная с D5
4	12	Доксорубицин	12	IV	Q1D×1 в D5
5	12	ABX196	100 ng	IV	Q1D×1 в D5
Доксорубицин	12	IV	Q1D×1 в D5
6	12	Анти-PD-1	10	IP	Дважды×2 в D7/D10/D14/D17
7	12	ABX196	100 ng	IV	Q1D×x1 в D5
Анти-PD-1	10	IP	Дважды×2 в D7/D10/D14/D17

2.3. Забор крови

В D7 и D22 собирают приблизительно по 120 мкл крови пункцией яремной вены в пробирки для взятия крови с активатором коагуляции. После взятия образцов пробирки центрифугируют при 1300 g в течение 10 минут при комнатной температуре, и получают сыворотку. Образцы сыворотки хранят в полипропиленовых пробирках при -80°С. Все образцы сыворотки, собранные в D22, анализируют ELISA для определения уровней АФП в кровотоке (дозировка мышиного a-фетопротеина/АФП, см. MAFP00, RD Systems).

2.4. Время получения изображений МРТ

В D19 и D20 получают изображения для 5 мышей из групп 1-8 (40 животных в день). Затем выполняют полуколичественный анализ.

2.5. Терминация мышей

Во время конечной терминации мышей (примерно D60) взвешивают печень. Число метастаз оценивают макроскопически, и регистрируют локализацию, внешний вид (форму, цвет, консистенцию) и размер каждой из них. Получают макроскопическую фотографю печени.

Печени/Опухоли всех животных, умерщвленных по этическим причинам или при конечной терминации, разрезают на срезы толщиной 4 мм и фиксируют в 4% нейтральном забуференном формалине в течение 24 час – 48 час и затем заливают парафином (Histosec®, Merck, Darmstadt, Германия).

2.6. Мониторинг животных

2.6.1. Клинический мониторинг

Все данные исследования, включая измерения массы тела животных, клинические записи и регистрацию смертности и обработку, включаются в список и вносятся в базу данных Vivo Manager® database (Biosystemes, Dijon, Франция).

Жизнеспособность и поведение регистрируют каждый день. Массу тела измеряют дважды в неделю.

2.6.2. Гуманные конечные точки

Диаметр живота доходит до 25 мм

Признаки боли, страдания или дистресса; поза боли, маска боли, поведение

Опухоли, препятствующие амбуляции или питанию

20% потеря массы тела, остающаяся в течение 3 дней подряд

Плохое состояние тела, истощение, кахексия, обезвоживание

Длительное отсутствие произвольных реакций на внешние раздражители

Опухоль, превышающая 10% от нормальной массы тела (взятая в расчет отдельная опухоль), но не превышающая 1500 мм³ (в расчет принимают сумму объема опухоли на правом боку/MFP и объема опухоли на левом боку/MFP),

Учащенное затрудненное дыхание, анемия, значительное кровотечение

Неврологические признаки: движение по кругу, конвульсии, паралич

Стойкое снижение температуры тела

Аномальное вздутие живота

2.6.3. Аутопсия

Выполняют аутопсию (макроскопическое исследование) всех животных, уничтоженных в исследовании, и, если возможно, всех умирающих при эвтаназии или обнаруженных мертвыми животных.

2.6.4. Операции

Хирургические методы описаны в операционных процедурах, одобренных IACUC.

2.6.5. Анестезия

Используют анестезию газом изофлюраном для всех процедур: операции и забора крови.

2.6.6. Анальгезия

Протокол мультимодальной анальгезии смесями капрофен/бупреноприн или ксилокаин/бупреноприн адаптируют для тяжести хирургической процедуры. При всех процедурах обезболивания оказывают немедикаментозную помощь. Кроме того, может быть оказана медикаментозная помощь, не влияющая на исследования (топическая обработка), по рекомендации лечащего ветеринара.

2.6.7. Эвтаназия

Эвтаназию животных выполняют путем передозировки газа для анестезии (изофлюрана) с последующим смещением шейных позвонков или обескровливанием.

3. ПРЕДОСТАВЛЕНИЕ ДАННЫХ

3.1. Параметры здоровья

Определяют указанные далее критерии здоровья с использованием программы Vivo Manager® (Biosystemes, Couternon, Франция).

- Масса тела отдельных животных и/или средняя (или медианная) масса.

- Изменение средней массы тела (MBWC): вычисляют средние изменения массы обработанных животных в процентах (масса в день B минус масса в день A, деленное на массу в день A). Интервалы, в которых вычисляют MBWC, выбирают как функцию кривых масса тела и дни измерения массы тела.

3.2. Параметры эффективности

Эффективность обработки оценивают в терминах действия вещества на объем опухоли у обработанных животных относительно контрольных животных. Определяют следующие критерии оценки противоопухолевой эффективности:

- измерение отдельной и/или средней (или медианной) инвазии опухоли в печень в D19-20 с использованием изображения МРТ;

- измерение а-фетопротениа, циркулирующего в плазме, в D22;

- масса печени, измеренная при терминации;

- кривые выживания;

- медианное время выживания.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Инвазия опухоли

На фигуре 12 приводятся результаты, показывающие процент инвазии опухоли в печень в каждой из групп обработки в день 20.

Статистический анализ инвазии опухоли в печень между средой и каждой группой в день 20

Критерий Крускала-Уоллиса – величина р < 0,0001 (****)

Парное сравнение по критерию Данна

Критерий множественных сравнений Данна	Среднее ранговое разл.	Значимое?	Итог
Среда vs. сорафениба	8,644	Нет	ns
Среда vs. ABX196 / сорафениб	29,35	Да	**
Среда vs. доксорубицина	28,52	Да	**
Среда vs. ABX196 / доксорубицин	27,83	Да	*
Среда vs. анти-PD-1	28,14	Да	**
Среда vs. ABX196 / анти-PD-1	32,77	Да	***

Живые животные и инвазия опухоли в день 61

Группа	Фракция живых	Фракция без обнаруживаемых метастаз
1. Среда	4/13	3/13
2. Сорафениб	5/13	5/13
3. Сорафениб+ABX196	11/12	10/12
4. Доксорубицин	9/12	9/12
5. Доксорубицин+ABX196	8/12	6/12
6. Анти-PD-1	11/12	10/12
7. Анти-PD-1+ABX196	12/12	12/12

Вывод

Этот эксперимент показывает, что комбинации, включающие химиотерапевтический агент или иммунотерапевтический агент и АВХ196, являются более эффективными, чем каждый компонент комбинации, взятый отдельно.

Как видно на фигуре 12, при обработке комбинациями, включающими АВХ196, инвазия опухоли меньше. Уменьшение инвазии опухоли приводит к лучшему выживанию.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ABIVAX

<120> Combinations including АВХ196 for the treatment of cancer

<130> ВЕТ16Р2086

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 31

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of peptide Cl II- TRP2(180-188)

<400> 1

Lys Phe Gly Trp Thr Gly Pro Asp Cys Asn Arg Lys Lys Pro Ala Gly

1 5 10 15

Gly Asn Cys Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu His Tyr Tyr

20 25 30

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of Class II epitope

<400> 2

Lys Phe Gly Trp Thr Gly Pro Asp Cys Asn Arg Lys Lys Pro Ala

1 5 10 15

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of an immunodominant peptide from

the tumor associated antigen tyrosinase-related protein-2

<400> 3

Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu

1 5

<210> 4

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of a peptide comprising the sequence

of an immunodominant peptide from TRP2

<400> 4

Gly Gly Gly Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Ser Lys Phe Gly Trp Thr Gly Pro Asp Cys Asn Arg Lys Lys Pro Ala

20 25 30

<---

1. Способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества противоопухолевой фармацевтической комбинации, включающей

(i) соединение АВХ196 формулы (I)

(I)

и

(ii) по меньшей мере один химиотерапевтический агент и/или по меньшей мере один иммунотерапевтический агент,

причем указанный по меньшей мере один иммунотерапевтический агент не является антигеном,

причем указанный по меньшей мере один иммунотерапевтический агент является антителом, специфичным к PD-1, и

причем указанный по меньшей мере один химиотерапевтический агент является доксорубицином или сорафенибом.

2. Способ по п.1, причем соединение АВХ196 формулы (I)

(I)

содержится в композиции вакцины (iii), дополнительно включающей опухолевый антиген.

3. Способ по п. 1 или 2, причем соединение АВХ196 формулы (I) (i)

(I)

или

композиция вакцины (iii) и по меньшей мере один химиотерапевтический агент и/или по меньшей мере один иммунотерапевтический агент (ii) вводятся отдельно.

4. Способ по п. 1 или 2, причем соединение АВХ196 формулы (I)

(I)

или

композиция вакцины (iii) и по меньшей мере один химиотерапевтический агент и/или по меньшей мере один иммунотерапевтический агент (ii) вводятся одновременно.

5. Способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества композиции вакцины, включающей соединение АВХ196 формулы (I)

(I)

и опухолевый антиген, в комбинации с терапевтически эффективным количеством по меньшей мере одного химиотерапевтического агента и/или с терапевтически эффективным количеством по меньшей мере одного иммунотерапевтического агента,

причем указанный по меньшей мере один иммунотерапевтический агент не является антигеном,

причем указанный по меньшей мере один иммунотерапевтический агент является антителом, специфичным к PD-1, и

причем указанный по меньшей мере один химиотерапевтический агент является доксорубицином или сорафенибом.

6. Способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения АВХ196 формулы (I)

(I)

в комбинации с терапевтически эффективным количеством по меньшей мере одного химиотерапевтического агента и/или терапевтически эффективным количеством по меньшей мере одного иммунотерапевтического агента,

причем указанный по меньшей мере один иммунотерапевтический агент не является антигеном,

причем указанный по меньшей мере один иммунотерапевтический агент является антителом, специфичным к PD-1, и

причем указанный по меньшей мере один химиотерапевтический агент является доксорубицином или сорафенибом.

7. Способ по п.6, причем указанная комбинация дополнительно включает противоопухолевый антиген.

8. Комбинированный препарат для применения при лечении рака, включающий

i) одну или несколько единиц дозирования соединения АВХ196 формулы (I)

(I)

и

(ii) одну или несколько единиц дозирования по меньшей мере одного химиотерапевтического агента и/или по меньшей мере одного иммунотерапевтического агента,

причем указанный по меньшей мере один иммунотерапевтический агент не является антигеном,

причем указанный по меньшей мере один иммунотерапевтический агент является антителом, специфичным PD-1, и

причем указанный по меньшей мере один химиотерапевтический агент является доксорубицином или сорафенибом.

9 Комбинированный препарат для его применения по п.8, причем соединение АВХ196 формулы (I)

(I)

содержится в вакцине, также включающей опухолевый антиген.

10. Способ по п. 1 или 2, причем иммунотерапевтический агент представляет собой моноклональное анти-PD-1 антитело.

11. Способ по п. 1 или 2, причем рак выбирают из группы, включающей меланому, гепатокарциному, колоректальный рак и рак мочевого пузыря.

12. Способ по п.5, причем иммунотерапевтический агент представляет собой моноклональное анти-PD-1 антитело.

13. Способ по п.5, причем рак выбирают из группы, включающей меланому, гепатокарциному, колоректальный рак и рак мочевого пузыря.

14. Способ по п.6, причем иммунотерапевтический агент представляет собой моноклональное анти-PD-1 антитело.

15. Способ по п.6, причем рак выбирают из группы, включающей меланому, гепатокарциному, колоректальный рак и рак мочевого пузыря.