Бессывороточная среда "вниизж" для культивирования клеток почки сирийского хомячка внк-21 и получения иммуногенных компонентов культуральных вирусов ящура и бешенства для изготовления вакцин

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к разработке бессывороточной среды «ВНИИЗЖ», применяемой для культивирования клеток почки сирийского хомячка ВНК-21 и получения иммуногенных компонентов культуральных вирусов ящура и бешенства для изготовления вакцин. Адаптацию перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21 к выращиванию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» проводят с уменьшением количества сыворотки крови КРС с 5 до 0% в течение 6 последовательных пассажей. Культивирование адаптированных клеток линии ВНК-21 в разработанной бессывороточной среде осуществляют в течение 3 последовательных пассажей, при этом за 48 ч концентрация клеток увеличивается до 5,68-5,94 млн клеток/мл при посевной концентрации 0,6-0,7 млн/мл. С применением разработанной бессывороточной среды культивируют клетки линии ВНК-21, которые позволяют получать антиген вируса ящура с концентрациями 146S и 146S+75S в инактивированной суспензиями 0,79-0,85 и 0,95-1,06 соответственно, а также антиген вируса бешенства с концентрациями рибонуклеопротеина и гликопротеина 0,64-0,72 и 0,66-0,73 соответственно, для изготовления безопасных и высокоиммуногенных противоящурных и антирабических вакцин. 3 ил., 19 табл., 6 пр.

 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к разработке бессывороточной среды «ВНИИЗЖ», применяемой для культивирования клеток почки сирийского хомячка ВНК-21 и получения иммуногенных компонентов культуральных вирусов ящура и бешенства для изготовления вакцин.

Вирус ящура остается важным патогеном диких и домашних плотоядных животных более 120 лет после его выявления, с ежегодными затратами на производственные потери и вакцинацию, которые оцениваются в 5,3-17 миллиардов евро в год. Контроль и искоренение затруднены, потому что ящур очень заразен для самых разных видов, генетически и антигенно разнообразен [1].

Ящур вызывается РНК-содержащим вирусом, который принадлежит к порядку Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus [2]. Вирус ящура характеризуется высокой антигенной изменчивостью за счет мутаций в генах капсидных белков [1].

Культивирование вируса ящура в перевиваемой суспензионной клеточной линии почки сирийского хомячка (ВНК-21), применяемой для изготовления противоящурных вакцин, позволяет получать четыре варианта структурных компонентов с разными значениями констант седиментации:

1) 146S компонент (полные частицы), состоящие из одной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждая из которых представлена комплексом белков VP₁ (1D), VP₂ (1B), VP₃ (1С), VP₄ (1A); отвечает за иммуногенные свойства антигена;

2) 75S частицы («пустые» капсиды), лишенные РНК и включающие в себя 60 копий, состоящих из полипептидов VP₀ (1АВ), VP₁ (1D), VP₃ (1С); отвечают за иммуногенные свойства антигена;

3) 12S частицы (капсомеры), представленные структурными белками VP₁ (1D), VP₂ (1B), VP₃ (1C);

4) 3,8S субъединицы, представленные неструктурным белком VP_g [1, 3].

Система мер по борьбе и профилактике ящура включает вакцинацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной и угрожаемых зонах Российской Федерации [1]. Для этого требуется изготовление противоящурных вакцин в промышленных масштабах. Рутинная вакцинация против данного заболевания проводится во многих странах или зонах, признанных свободными от ящура с вакцинацией, и в странах, где данная болезнь является эндемичной. Кроме того, многие страны, свободные от болезни, не отказываются от проведения иммунизации животных и имеют свои собственные стратегические запасы инактивированных вирусных препаратов, содержащих высокие концентрации 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов [2]. Такие запасы антигена обеспечивают возможность поставки полученных вакцин в чрезвычайной ситуации и в короткие сроки. Исходя из этого, потребность в получении иммуногенных компонентов вируса ящура высока для изготовления противоящурных вакцин и обеспечения эпизоотической безопасности отдельных стран и целых регионов.

Традиционные противоящурные инактивированные вакцины должны включать в свой состав определенные количества иммуногенных компонентов вируса ящура, полученные в результате репродукции вируса в чувствительной клеточной линии, с добавлением адъюванта и дополнительных соединений [2].

Для получения 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура применяют перевиваемую суспензионную клеточную линию из почки сирийского хомячка ВНК-21, свободную от контаминирующих микроорганизмов [1, 2].

Бешенство - зоонозная инфекция с острым вирусным энцефалитом, с почти 100%-ной летальностью, высокий показатель среди известных инфекционных заболеваний [4].

Возбудителем данной болезни является вирус бешенства порядка Mononegavirales, семейства Rhabdoviridae, рода Lyssavirus, вида Rabies lyssavirus [5].

Геном вируса представлен несегментированной одноцепочечной негативной молекулой РНК длиной около 12000 н.о. Нуклеиновая кислота кодирует 5 основных белков, расположенных в консервативном линейном порядке: нуклеопротеин (N-белок), фосфопротеин (Р-белок), матриксный белок (М-белок), гликопротеин (G-белок), РНК-зависимую РНК-полимеразу (L-белок) [9]. Вирион вируса бешенства имеет пулевидную форму длиной 130-250 нм и диаметром 60-100 нм. Он состоит из следующих функциональных структур: RNP-комплекс (рибонуклеопротеин), расположенный внутри вириона, и внешняя белково-липидная составляющая. RNP-комплекс представляет собой внутренний нуклеокапсид, который включает в себя геномную РНК, прочно связанную с нуклеопротеидом и фосфопротеином, а также вирусную полимеразу. Рибонуклеопротеин является важным иммуногенным компонентом вакцинных препаратов против бешенства. В RNP-комплексе содержится 4% РНК к 96% белка [2]. Снаружи вириона располагается двухслойная липидная оболочка с «шипами» гликопротеина. Матричный белок находится между RNP-комплексом и внешней составляющей вириона, конденсирует нуклеопротеин и взаимодействует с эндодоменом гликопротеином [4].

Белки вируса бешенства полифункциональны. Нуклеопротеин защищает вирусный геном от активности клеточной РНКазы и взаимодействует с L- и Р-белками во время транскрипции и репликации. Фосфопротеин отвечает за правильное позиционирование L-белка и действует как шаперон во время синтеза нуклеопротеина, образуя N-P-комплекс, который предотвращают самоагрегацию N-белка и связывание с клеточной РНК. Матриксный белок является структурным элементом, который связывается с рибонуклеопротеином и цитоплазматическим доменом гликопротеина для облегчения процесса сборки вирусных частиц. Гликопротеин - единственный вирусный белок, расположенный на поверхности вириона. Он обеспечивает связывание с рецепторами клетки-хозяина, индуцирует эндоцитоз, а также взаимодействует с М-белком, облегчая морфогенез вирионов. L-белок выполняет функции, необходимые для транскрипции и репликации генома [4].

Постэкспозиционная профилактика может обеспечить практически полное излечение от болезни при своевременном и правильном применении и доступна уже более века. Тем не менее, данное заболевание по-прежнему ежегодно приводит к гибели десятков тысяч людей и животных из-за плохой доступности соответствующих биологических препаратов, особенно в развивающихся странах тропической Азии и Африки [2]. Как и при любом инфекционном заболевании эффективные программы борьбы с бешенством опираются на строгий лабораторный надзор, надежные диагностические инструменты и высокоэффективные биологические препараты, в том числе антирабические вакцины [4].

Главными иммуногенными компонентами инактивированного вируса бешенства в антирабических вакцинах являются специфичные рибонуклеопротеин и гликопротеин [4].

Культивирование клеток осуществляют с применением различных ростовых сред, содержащих питательные вещества, факторы роста и гормоны, а также соединения, которые регулируют водородный показатель (рН) и осмотическое давление в клетках [6]. В зависимости от необходимости добавления сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС) выделяют несколько типов сред:

- основные (базовые) среды (basal media), требующие добавления 10% сыворотки крови КРС;

- улучшенные среды (advanced media), требующие добавления 1-5% сыворотки крови КРС;

- бессывороточные среды (serum-free medium), не требующие добавления сыворотки [7, 8].

Для культивирования перевиваемой суспензионной линии клеток ВНК-21 применяют преимущественно улучшенные среды. Качественный и количественный состав улучшенной среды отражен в таблице 1 (среда №1) (прототип) [6]. Представленная среда включает в себя белки, пептиды и липиды, входящие в состав сыворотки крови КРС (5,0%), гидролизата белков крови (15-20 мл/л) и перевара по Хоттингеру (2-10 мл/л), 8 протеиногенных аминокислот, глюкозу, 8 витаминов и витаминоподобных соединений, минеральные соли.

При использовании данной улучшенной ростовой среды для выращивания клеток линии ВНК-21 с посевной концентрацией 0,6-0,7 млн клеток/мл за 48 ч получают суспензии с содержанием 4,0-4,3 млн клеток/мл [6, 7].

Для репродукции вирусов ящура и бешенства применяют поддерживающую среду, содержащую 2,0% сыворотки крови КРС. Качественный и количественный состав данной среды представлен в таблице 2 [6, 7]. Она включает белки, пептиды и жиры, входящие в состав сыворотки крови КРС (2,0%), гидролизата белков крови (5,0 мл/л) и перевара по Хоттингеру (2 мл/л), 4 протеиногенных аминокислоты, глюкозу, 8 витаминов и витаминоподобных соединений, а также минеральные соли. При использовании данной среды для репродукции вируса ящура с суспензии, содержащей 1 млн клеток ВНК-21, получают следующий урожай 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов: 0,57-0,72 и 0,71-0,88 мкг/мл, соответственно [6, 7, 8]. При использовании указанной среды для репродукции вируса бешенства с 1 млн клеток ВНК-21 получают следующий урожай иммуногенных рибонуклеопротеина и гликопротеина: 0,45-0,50 и 0,50-0,52 мкг/мл, соответственно.

Однако данную среду (среды, содержащие сыворотку крови КРС), используют как для культивирования клеток ВНК-21, так и для репродукции вирусов ящура и бешенства в присутствии сыворотки крови КРС, обнаруживает ряд недостатков:

- сыворотка крови может быть цитотоксичной, поскольку содержит фермент полиаминоксидазу, действующую на полиамины (спермин, спермидин), являющиеся продуктами секреции быстро пролиферирующих клеток;

- значительная вариабельность состава сывороток крови разных партий;

- сыворотка может содержать недостаточное количество специфических ростовых факторов, что вызывает необходимость их дополнительного введения в состав базовой среды;

- сыворотка крови может быть контаминирована вирусами, что является дополнительным неизвестным фактором, который невозможно контролировать;

- сыворотка является самой дорогой составляющей питательной среды [6, 7, 8].

Все перечисленные проблемы могут быть разрешены путем удаления сыворотки крови КРС и других продуктов животного происхождения с переходом на применение бессывороточных сред.

В течение последних трех десятилетий сыворотки крови КРС постепенно стали заменять другими добавками или использованием бессывороточных сред с определенным химическим составом. Ряд составов бессывороточной среды был описан для клеточных линий млекопитающих и насекомых, а также для первичных культур [7]. Однако переход на бессывороточную среду по-прежнему требует трудоемкого обзора литературы и поиска подходящей композиции среды для культивирования клеточных линий и репродукции вирусов. Все коммерчески доступные бессывороточные среды доступные в настоящее время у основных дистрибьюторов (например, АТСС, ЕСАСС и DMSZ), включены в базу данных [9].

Бессывороточные среды имеют ряд следующих преимуществ по сравнению со средами, содержащими сыворотку крови КРС: улучшение воспроизводимости результатов получения урожая клеточной культуры и иммуногенных компонентов вирусов вследствие стабильности состава среды; снижение риска заражения культуры вирусами, бактериями, грибами и микоплазмами; облегчение очистки продуктов клеточного метаболизма; снижение влияния дополнительных протеинов на результаты биологических исследований; отсутствие цитотоксического влияния сыворотки по причине ее отсутствия. Поэтому в последние 2-3 десятилетия учеными ведущих научных институтов ведутся интенсивные исследования по разработке бессывороточных питательных сред для культивирования клеточных культур и получению высокого урожая иммуногенных компонентов вирусов [10].

При этом в настоящее время универсальных питательных сред не разработано по объективной причине: наличие специфических биологических потребностей каждой культуры клеток и вирусов, которые репродуцируются в различных клетках и требуют определенного уникального состава сред [4, 5].

На сегодняшний день известно несколько способов культивирования клеток линии ВНК-21 и получения иммуногенных компонентов вирусов ящура и бешенства в ней с применением бессывороточных сред.

В 1975 году американский исследователь Л. Дэвид Томей зарегистрировал противоящурную вакцину [11], которую получали путем выращивания клеток линии ВНК-21 в питательной ростовой среде без L-глутамина и сыворотки крови КРС. Качественный и количественный состав данной термостабильной среды отражен в таблице 3. Данная среда включает в свой состав 17 протеиногенных аминокислот, глюкозу, 10 витаминов и витаминоподобных соединений, метилцеллюлозу и феноловый красный.

Среду стерилизовали автоклавированием в течение 30 минут (120°С, 1 бар) при рН 4,3 и хранят при температуре 4°С до момента использования. Суспензию клеток линии ВНК-21 выращивали при температуре 35°С и рН 7,0-7,2 в указанной среде.

При использовании данной бессывороточной ростовой среды для выращивания клеток линии ВНК-21 с посевной концентрацией 0,6-0,7 млн клеток/см³ за 48 ч получали 3,0-3,5 млн клеток/см³ (табл. 7).

Доза заражения вирусом ящура составляла 0,10 ТЦД₅₀/клетка. Репродукцию вируса осуществляли в течение 12 часов, после этого определяли количество иммуногенных компонентов возбудителя ящура. С 1 млн клеток концентрация 146S компонента вируса ящура составляла 0,41-0,65 мкг/мл, 146S+75S компонентов - 0,64-0,73 мкг/мл [11] (табл. 7).

Доза заражения вирусом бешенства составляла 0,10 ККИД₅₀/клетка. Репродукцию осуществляли в течение 48 часов, после этого определяли количество иммуногенных компонентов возбудителя бешенства. С 1 млн клеток концентрация рибонуклеопротеина вируса бешенства составляла 0,40-0,44 мкг/мл, гликопротеина - 0,42-0,46 мкг/мл (табл. 7).

В 1997 году Motono Mitsuru, Yamamoto Ryohel, Takase Kozo, Miyahara Tokuji была представлена бессывороточная среда [12], пригодная для животных клеток, в том числе ВНК-21, и получения на их основе иммуногенных компонентов вирусов ящура и бешенства. Состав данной среды отражен в таблице 4, из которой видно, что данная среда включает в свой состав фактор роста фибробластов (0,5-20,0 нг/мл), инсулин (0,1-20,0 мкг/мл), 17 протеиногенных аминокислот, глюкозу, 9 витаминов и витаминоподобных соединений, неорганические соли и краситель феноловый красный. Фактор роста фибробластов - белок, способствующий пролиферации широкого спектра клеток. Концентрация данного компонента составляет от 0,5 до 20,0 нг/мл. Инсулин - гормон белковой природы, образуется в β-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы. Оказывает многогранное влияние на обмен веществ практически во всех тканях. Основное действие инсулина заключается в регулировании углеводного обмена, в частности, утилизации глюкозы в клетке. Количество инсулина, добавляемого в среду, составляет 0,1-20,0 мкг/мл, но 10 мкг/мл также достаточно для активного деления и роста клеток, а также с экономической точки зрения.

Применение данной бессывороточной ростовой среды для выращивания клеток линии ВНК-21 с посевной концентрацией 0,6-0,7 млн клеток/см³ за 48 ч позволяет получать урожай 3,8-4,2 млн клеток/см³. С 1 млн клеток концентрация 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура составляет 0,50-0,75 и 0,70-0,87 мкг/мл, соответственно, а концентрация рибонуклеопротеина и гликопротеина вируса бешенства - 0,45-0,55 и 0,43-0,57 мкг/мл, соответственно (табл. 7).

В 2011 году авторами Ren Zhang, Wenqing Chen, Jlanchao Wang была зарегистрирована бессывороточная среда для выращивания клеток ВНК-21 и репродукции в них вирусов ящура и бешенства - CN 102115729-2011 (среда №2) [13] {наиболее близкий прототип). Данная среда включает в свой состав основную культуральную среду, содержащую необходимый набор протеиногенных аминокислот, минеральных солей, глюкозу, витамины, и дополнительно следующие компоненты в пересчете на 100 л среды: 100-200 г соевого белка, 100-200 г растительного белка семейства бобовых, 0-100 г картофельного белка, 0-200 г пшеничного глютенового белка и 50-100 г рисового белка (табл. 5).

При использовании представленной бессывороточной ростовой среды для выращивания клеток линии ВНК-21 с посевной концентрацией 0,6-0,7 млн клеток/см³ за 48 ч получали 4,0-4,3 млн клеток/см³ (табл. 7). Клетки, выращенные в данной среде, имели высокую плотность культуры, а среда - низкую себестоимость по сравнению с бессывороточной средой, отраженной в патентах US 4049494 (А) [11], JP H09154571 (А) [12].

С 1 млн клеток концентрации 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура составляла 0,51-0,75 и 0,74-0,89 мкг/мл, соответственно, а концентрация рибонуклеопротеина и гликопротеина вируса бешенства - 0,46-0,52 и 0,49-0,58 мкг/мл, соответственно (табл. 7).

В 2013 году Zhang Shu и L.V. Hongliang зарегистрировали способ получения очищенной противоящурной вакцины CN 103374547 с применением бессывороточной среды [14]. Качественный и количественный состав среды отражен в таблице 6 и включает в себя 9 протеиногенных аминокислот, сахарозу, 4 варианта солей и краситель феноловый красный.

При использовании представленной бессывороточной ростовой среды для выращивания клеток линии ВНК-21 с посевной концентрацией 0,6-0,7 млн клеток/см³ за 48 ч получали 3,5-4,0 млн клеток/см³ (табл. 7).

Клетки линии ВНК-21 заражали вирусом ящура в дозе 0,10-0,50 ТЦД₅₀/клетка. С 1 млн клеток концентрация 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура составляла 0,43-0,54 и 0,65-0,75 мкг/мл, соответственно, а концентрация рибонуклеопротеина и гликопротеина вируса бешенства - 0,41-0,49 и 0,40-0,45 мкг/мл, соответственно (табл. 7).

Представленные бессывороточные среды для получения иммуногенных компонентов вирусов ящура и бешенства имеют следующие недостатки: 1) за 48 ч культивирования клеток линии ВНК-21 с посевной концентрацией 0,6-0,7 млн клеток/мл получают суспензию с концентрацией не более 4,3 млн клеток/мл; 2) концентрация 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура при использовании данных сред с 1 млн клеток составляет не более 0,75 и 0,89 мкг/мл, соответственно; 3) концентрация рибонуклеопротеина и гликопротеина вируса бешенства при использовании данных сред с 1 млн клеток составляет не более 0,52 и 0,58 мкг/мл, соответственно. В связи с этим целесообразно разработать такую композицию бессывороточной среды, которая: 1) позволит за 48 ч с посевной концентрацией клеток 0,6-0,7 млн клеток/мл получать урожай клеток линии ВНК-21 более 4,3 млн клеток/мл, 2) даст возможность накапливать при репродукции вируса ящура 146S и 146S+75S иммуногенные компоненты с количествами более 0,75 и 0,89 мкг/мл, соответственно, с 1 млн клеток при изготовлении противоящурных вакцин; 3) позволит накапливать при репродукции вируса бешенства рибонуклеопротеин и гликопротеин с количествами более 0,52 и 0,58 мкг/мл, соответственно, с 1 млн клеток при изготовлении антирабических вакцин.

Проблемой являлось отсутствие бессывороточной среды для изготовления противоящурных и антирабических вакцин, которая позволит устранить вышеуказанные недостатки.

На сегодняшний день данная проблема была решена благодаря разработке бессывороточной среды «ВНИИЗЖ» с новой композицией состава, что позволит повысить урожай клеток перевиваемой суспензионной линии ВНК-21 без снижения размера клетки, повысить накопление 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура, увеличить урожай рибонуклеопротеина и гликопротеина по сравнению с бессывороточными средами, представленными выше.

Сущность изобретения заключается в композиционном составе бессывороточной среды «ВНИИЗЖ» для получения иммуногенных компонентов вирусов ящура и бешенства, необходимых для производства противоящурных и антирабических вакцин. Состав заявляемой бессывороточной среды отличается особой композицией компонентов в определенных концентрациях, что позволяет получать высокие урожаи клеточной линии ВНК-21 (более 4,3 млн клеток/мл); проводить репродукцию культурального вируса ящура с накоплением 146S и 146S+75S компонентов более 0,75 и 0,89 мкг/мл, соответственно, с 1 млн клеток и осуществлять репродукцию культурального вируса бешенства с накоплением рибонуклеопротеина и гликопротеина с концентрацией более 0,52 и 0,58 мкг/мл, соответственно, с 1 млн клеток.

Для культивирования клеток линии ВНК-21 и получения иммуногенных компонентов вирусов ящура и бешенства применяли улучшенную среду (среда №1) и наиболее близкий прототип бессывороточную среду CN 102115729-2011 (среда №2) [13]. По сравнению с прототипами бессывороточная среда «ВНИИЗЖ» (среда №3) для получения иммуногенных компонентов культуральных вирусов ящура и бешенства для изготовления вакцин позволяет: 1) культивировать клетки линии ВНК-21 и за 48 ч с посевной концентрации клеток 0,6-0,7 млн клеток/мл получать урожай клеток линии ВНК-21 от 5,68 до 5,94 млн клеток/мл; 2) накапливать при репродукции вируса ящура 146S и 146S+75S иммуногенные компоненты с количествами 0,79-0,85 и 0,95-1,06 мкг/мл, соответственно, с 1 млн клеток при изготовлении противоящурных вакцин; 3) накапливать при репродукции вируса бешенства рибонуклеопротеин и гликопротеин с концентрациями 0,64-0,72 и 0,66-0,73 мкг/мл, соответственно, с 1 млн клеток при изготовлении антирабических вакцин.

Ключевым элементом заявляемой композиции бессывороточной среды «ВНИИЗЖ» для получения иммуногенных компонентов культуральных вирусов ящура и бешенства для изготовления вакцин является адаптация перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21 к выращиванию в представленной бессывороточной среде в течение 6 последовательных пассажей с уменьшением количества сыворотки крови КРС с 5 до 0%, культивирование клеток данной линии в разработанной бессывороточной среде, репродукция вируса ящура в адаптированной клеточной культуре ВНК-21 и получение иммуногенных компонентов вируса в высоких концентрациях для изготовления противоящурных вакцин, репродукция вируса бешенства в адаптированной клеточной культуре ВНК-21 и получение иммуногенных компонентов вируса в высоких концентрациях для изготовления антирабических вакцин.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в: 1) адаптации клеток суспензионной перевиваемой линии ВНК-21 к культивированию в разработанной бессывороточной среде для получения иммуногенных компонентов культуральных вирусов ящура и бешенства для изготовления вакцин, 2) репродукции вируса ящура в культуре клеток, адаптированной к данной бессывороточной среде, для получения более высоких концентраций 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов, используемых для изготовления противоящурных вакцин; 3) репродукции вируса бешенства в культуре клеток, адаптированной к данной бессывороточной среде, для получения более высоких концентраций рибонуклеопротеина и гликопротеина вируса, используемых для изготовления антирабических вакцин.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в увеличении количеств 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура, рибонуклеопротеина и гликопротеина иммуногенных компонентов вируса бешенства при производстве противоящурных и антирабических вакцин.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Концентрации клеток перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21 при адаптации в течение 6 последовательных пассажей к выращиванию в бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» для получения иммуногенных компонентов культуральных вирусов ящура и бешенства для изготовления вакцин.

Фиг. 2 - Концентрации 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов культурального вируса ящура в неинактивированных (А) и инактивированных (Б) суспензиях после репродукции в клетках линии ВНК-21, адаптированных к культивированию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ».

Фиг. 3 - Концентрации рибонуклеопротеина и гликопротеина культурального вируса бешенства в суспензиях после репродукции в клетках линии ВНК-21, адаптированных к культивированию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ».

Бессывороточная среда «ВНИИЗЖ» для получения иммуногенных компонентов культуральных вирусов ящура и бешенства для изготовления вакцин представляет собой светло-серый мелкодисперсный порошок, который хорошо растворяется в очищенной воде без образования осадка. Качественный и количественный состав разработанной бессывороточной среды отражен в таблице 8, из данных которой видно, что по сравнению с бессывороточной средой CN 102115729-2011 [13] (наиболее близкий прототип) суммарные количества аминокислот выше. Они складывались из содержания свободных аминокислот, добавляемых как самостоятельный компонент в среду, а также из растительных белков, прошедших ферментативный гидролиз. Концентрации протеиногенных аминокислот L-аланина, L-аргинина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-изолейцина, L-лейцина, L-лизина, L-триптофана, L-метионина, L-пролина, L-серина, L-тирозина, L-треонина, L-фенилаланина, L-цистина в разработанной среде было на 134, 65, 69, 56, 80, 85, 66, 73, 216, 81, 484, 39, 25,. 25, 82, 55, 99, 39, 111, 18 мг/л больше, соответственно, по сравнению с прототипом. Увеличено содержание витаминов и витаминоподобных веществ, а именно в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» концентрации инозитола, никотинамида, пантотената кальция, пиридоксаля гидрохлорида, рибофлавина, тиамина гидрохлорида, фолиевой кислоты и холина хлорида на 0,2; 0,3; 0,3; 0,5; 0,05; 0,2; 0,5; 0,5 мг/л больше, соответственно, чем в прототипе. В разработанную среду добавлен митоген инсулин бычий в концентрации 3,0 мг/л. В прототипной среде данный компонент отсутствует. Концентрация глюкозы медицинской и минеральных солей одинаково для двух бессывороточных сред, за исключением, хлорида железа (II) (0,05 мг/л), хлорида меди (II) (0,05 мг/л), хлорида хрома (III) (0,05 мг/л), которые присутствуют только в бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» и необходимы для полноценной работы ферментного звена антиоксидантной системы клеток почки сирийского хомячка [7]. Для поддержания определенной степени вязкости, которую создает сыворотка крови КРС в улучшенных питательных средах, разработанная бессывороточная среда «ВНИИЗЖ» включает в свой состав безопасный полимерный органический компонент Pluronic F-68 (0,13%).

Наиболее важными строительными компонентами разработанной бессывороточной среды «ВНИИЗЖ» для клеток и структур вирусов ящура и бешенства являются аминокислоты, которые играет существенную роль в процессах жизнедеятельности [17, 18].

В состав разработанной бессывороточной среды также включили бычий инсулин, который регулирует поглощение, запасание и утилизацию глюкозы, аминокислот и жирных кислот, ингибирует распад протеинов и липидов. Бычий инсулин - это гормон, имеет вид двуцепочной полипептидной цепи, синтезируется β-клетками островков поджелудочной железы. Молекулярная масса 5,8 кДа, α- и β-цепи соединяются двумя межцепочными дисульфидными связями. В α-цепи присутствует внутрицепочный дисульфидный мостик. Бычий инсулин применяется как фактор роста при культивировании широкого спектра клеток млекопитающих. Бычий инсулин используется для дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток (MSCs) в адипоциты [19].

Показано, что предложенный состав бессывороточной среды «ВНИИЗЖ», разработанной в «Федеральном центре охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») является оптимальным для культивирования и поддержания клеточной линии ВНК-21, используемой для производства вирусных вакцин, подходит для экспрессии вирусов ящура и бешенства и накопления их иммуногенных компонентов в высоких концентрациях. При достижении линией клеток ВНК-21 необходимой концентрации, вирус может быть добавлен непосредственно в биореактор, без замены питательной среды за счет чего достигается высокая эффективность производства вирусных частиц.

На первом этапе работы готовят раствор разработанной бессывороточной среды «ВНИИЗЖ». Для этого к 9,5 л очищенной воды (Milli-Q®) медленно добавляют 200 г порошка разработанной бессывороточной среды «ВНИИЗЖ» при медленном помешивании (300 об/мин) в течение 10 минут. Измеряют значение водородного показателя, которое равно 6,95±0,02 и доводят рН до 7,10-7,20 с помощью 7,5%-ого раствора гидрокарбоната натрия. Конечный объем доводят до 10 л. Полученную среду подвергают стерилизационной фильтрации с применением мембранного фильтра Millipore Express® Plus (0,22 мкм, полиэфирсульфон).

Проводят адаптацию перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21 к выращиванию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» в течение 6 последовательных пассажей в колбах Эрленмейера перед масштабированием в биореакторе. Для адаптации используют суспензию клеток ВНК-21 1 пассажа после криозаморозки. Посевная концентрация клеток перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21 составляет 0,6-0,7 млн клеток/мл. В качестве ростовой среды используют улучшенную среду, состав которой отражен в таблице 1. Ежедневно в улучшенную среду (прототип) добавляют объема разработанной бессывороточной среды «ВНИИЗЖ» и в течение 5 пассажей (240 ч) концентрация сыворотки крови КРС уменьшается по схеме: 5,0%→2,5%→1,25%→0,625%→0,3125%. Затем проводят осаждение клеток при 1000 об./мин для того, чтобы их освободить от среды с сывороткой крови КРС и полностью перевести в разработанную бессывороточную среду «ВНИИЗЖ» без добавления сыворотки (шестой пассаж). Иными словами, осуществляют полный перевод клеток на выращивание в бессывороточной среде «ВНИИЗЖ».

Перевод клеток к бессывороточным условиям культивирования затрагивает биохимические и морфологические характеристики клеточных линий. В ходе исследования через 48 ч в течение 6 последовательных пассажей оценивали концентрацию клеток и анализировали их размеры с помощью световой микроскопии.

Клетки линии ВНК-21, адаптированные к бессывороточной среде, состав которой представлен в таблице 5 (наиболее близкий прототип), получены ранее и хранились в банке ФГБУ «ВНИИЗЖ».

На следующем этапе проводят культивирование клеток линии ВНК-21 с бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» при рН 7,10-7,20 и умеренном обогащении среды очищенным воздухом в процессе барботирования. Посевная концентрация клеток составляет 0,6-0,7 млн/мл. Продолжительность каждого пассажа составляет 48 ч. Через указанный промежуток времени определяют конечную концентрацию клеток и сравнивают ее с контролем. В качестве контроля используют клетки перевиваемой суспензионной линии ВНК-21, выращенные согласно «Промышленному регламенту на производство вакцины против ящура различных типов» с применением улучшенной среды, состав которой отражен в таблице 1 (прототип), а также клетки адаптированные к бессывороточной среде, состав которой представлен в таблице 5 (наиболее близкий прототип).

На следующем этапе работы проводят репродукцию вируса ящура в перевиваемой суспензионной линии клеток ВНК-21 (1 среда (прототип), 2 среда CN 102115729-2011 (наиболее близкий прототип) и среда 3 - бессывороточная среда «ВНИИЗЖ»).). Доза заражения каждой среды вирусом ящура составляет 0,05 ТЦД₅₀/клетка. Культивирование вируса проводят в указанных питательных средах при рН 7,5-7,7. Водородный показатель регулируют с помощью раствора гидрокарбоната натрия. Репродукцию вируса ящура оценивают по количеству клеток, подвергнутых специфическому разрушению, и выражают в %.

После культивирования вируса ящура в обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) подтверждают штаммоспецифичность [2].

В обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) исследуют полученные суспензии вируса ящура и определяют концентрацию 146S иммуногенного компонента [15]. Количество 146S+75S иммуногенных компонентов определяют в реакции связывания комплемента (РСК) [20].

Проводят процесс инактивации антигена вируса ящура. В качестве инактиванта первого порядка используют 1,2-аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ) в концентрации 0,025-0,050%. Инактивацию осуществляют в течение 12 ч при температуре 37°С.

Оценивают полноту процесса инактивации антигена вируса ящура в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2].

Определяют концентрации 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура в инактивированной суспензии с помощью реакции связывания комплемента (РСК), которую проводят в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2, 20]. Осуществляют пересчет концентрации иммуногенных компонентов с 1 млн клеток.

Для изготовления эмульсионной вакцины используют антигенный материал с содержанием 146S иммуногенных компонентов вируса ящура не менее 3,0 мкг/мл. Необходимую концентрацию иммуногенных компонентов в эмульсионной вакцине получают путем концентрирования антигена методом проточной ультрафильтрации. Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата антигена вируса ящура, полученного на трех различных средах (3 разные вакцины» и масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG в соотношении 50/50 по массе, соответственно.

Полученные вакцинные препараты исследуют на безвредность и стерильность в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2].

Методом твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА) в блокирующем варианте оценивают отсутствие неструктурных белков вируса ящура в конечном продукте [21]. Для этого проводят иммунизацию свиней породы ландрас по 3 головы на каждую из трех вакцин. На 14 день после иммунизации от животных отбирают кровь, получают сыворотки и их тестируют с использованием тест-системы для ИФА «PrioCHECK^® FMDV NS ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Для контрольных и исследуемых образцов вакцины после проведения реакции на спектрофотометре-ридере измеряют значения оптических плотностей и преобразовывают их в процент ингибиции, пользуясь формулой:

PI=(1-ОП_S/ОП_КО)*100,

где, PI - процент ингибиции (%),

ОП_S - оптическая плотность исследуемой сыворотки крови,

ОП_КО - оптическая плотность отрицательного контроля.

Сыворотки крови свиней в отношении наличия антител к неструктурным белкам вируса ящура следует считать положительными, если значение PI≥50%, отрицательными - при PI<50%. При этом значение оптической плотности отрицательного контроля должно быть >1,000. Процент ингибиции слабоположительного контроля должен составлять >50,00%, положительного контроля - >70,00% [22].

Вакцинные препараты исследуют на животных для оценки безвредности. Для тестирования вакцин на безвредность 6 головам свиней (по 2 на вакцину) внутримышечно в область верхней трети шеи в дозе 6,0 см (трехкратная доза) вводят препарат и наблюдают за клиническим состоянием животного в течение 6 суток. Вакцина признается безвредной в том случае, если все животные по итогам наблюдения остаются клинически здоровыми, и на месте введения препарата не происходит некроза тканей.

До иммунизации и 21 сутки после последнего введения противоящурных вакцин от свиней отбирают кровь и получают сыворотки, которые исследуют на наличие вируснейтрализующих антител (ВНА) с применением реакции микронейтрализации (РМН) вируса по стандартной процедуре [2].

Вакцины исследуют также на иммуногенность и проводят оценку протективных свойств конечного продукта. Иммуногенную дозу (ИмД₅₀) рассчитывают по формуле Кербера:

ИмД₅₀ в см³ = 10^{lgД-lgd⋅(ΣI/N-0,5)}

где, Д - доза вакцины,

d - шаг разведения (для свиней - 5),

I - количество защищенных животных,

N - количество зараженных животных, испытанных для одного разведения.

Количество протективных доз (ПД₅₀) рассчитывают по формуле:

ПД₅₀ = прививная доза / ИмД₅₀ [2].

На следующем этапе проводят репродукцию вируса бешенства в клетках перевиваемой суспензионной линии ВНК-21, (1 среда (прототип), 2 среда CN 102115729-2011 (наиболее близкий прототип) и среда 3 - бессывороточная среда «ВНИИЗЖ»). Доза заражения вирусом каждой среды составляет 0,05 ККИД₅₀/клетка. Культивирование вируса проводят в указанных средах при рН 7,4-7,6. Водородный показатель регулируют с помощью раствора гидрокарбоната натрия. Культивирование вируса проводят в течение 48 ч.

После культивирования вируса бешенства в обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) подтверждают штаммоспецифичность [2].

В реакции иммунофлуоресценции (РИФ) определяют титр инфекционной активности вируса, который должен быть не ниже 6,0 lg ККИД₅₀/мл.

Проводят процесс инактивации антигена вируса бешенства. В качестве инактиванта первого порядка используют 1,2-аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ) в концентрации 0,05% (от объема). Инактивацию осуществляют в течение 12 ч при температуре 37°С. Оценивают полноту процесса инактивации антигена вируса бешенства в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2].

В обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) исследуют полученные суспензии вируса бешенства и определяют концентрацию рибонуклеопротеина [23]. Количество гликопротеина вируса бешенства оценивают методом ИФА [21]. Осуществляют пересчет концентрации иммуногенных компонентов с 1 млн клеток.

Для изготовления антирабической эмульсионной вакцины используют антигенный материал с содержанием рибонуклеопротеина и гликопротеина вируса бешенства не менее чем по 3,0 мкг/мл каждого. Необходимую концентрацию иммуногенных компонентов в эмульсионной вакцине получают путем концентрирования антигена методом проточной ультрафильтрации. Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата антигена вируса и масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG в соотношении 40/60 по массе, соответственно.

Полученный вакцинный препарат исследуют на ареактогенность, безвредность и стерильность в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2].

Наличие поствакцинальных антител исследуют после иммунизации крупного рогатого скота полученными вакцинами. Испытания осуществляют на десяти головах КРС в возрасте 1 года со средней массой 200 кг. Животных прививают вакциной в дозе 2,0 см³ внутримышечно однократно. Для оценки напряженности поствакцинального антирабического иммунитета у животных, в соответствии с рекомендациями МЭБ (OIE), применяют реакцию нейтрализации в монослойной культуре клеток ВНК-21 (модификация реакции - FAVN (Fluorescent antibody virus neutralization)), выражая значения титра антирабических антител в МЕ/см³ [2]. Для анализа использовали положительный сывороточный контрольный стандарт, разведенный до иммуногенности 0,5 МЕ/мл, и отрицательный сывороточный контрольный стандарт с иммуногенностью <0,1 МЕ/мл [2].

Оценку протективных свойств не проводят по этическим соображениям, чтобы не подвергать животных смертельному заболеванию.

Статистическую обработку данных проводили с применением средних значений и стандартного отклонения, учитывая коэффициент Стьюдента [24].

Пример 1. Адаптация перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21 к культивированию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ».

На первом этапе работы готовили раствор разработанной бессывороточной среды «ВНИИЗЖ». Для этого к 9,5 л очищенной воды (Milli-Q®) медленно добавляют 200 г порошка разработанной бессывороточной питательной среды при медленном помешивании (300 об/мин) в течение 10 минут. Измеряли значение водородного показателя, которое равно 6,95±0,02 и доводили рН до 7,10-7,20 с помощью 7,5%-ого раствора гидрокарбоната натрия. Конечный объем доводили до 10 л. Полученную среду подвергали стерилизационной фильтрации с применением мембранного фильтра Millipore Express® Plus (0,22 мкм, полиэфирсульфон).

Проводили адаптацию перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21 к выращиванию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» в течение 6 последовательных пассажей в колбах Эрленмейера. Для адаптации использовали суспензию клеток ВНК-21 первого пассажа после криозаморозки. Посевная концентрация клеток перевиваемой суспензионной клеточной линии составляла 0,70 млн клеток/мл. Ежедневно в улучшенную среду (среда №1) добавляли объема бессывороточной среды «ВНИИЗЖ» и в результате в течение 5 последовательных пассажей концентрация сыворотки крови КРС уменьшалась по схеме: 5,0%→2,5%→1,25%→0,625%→0,3125%. Затем проводили осаждение клеток при 1000 об./мин, чтобы их освободить от среды с сывороткой крови КРС и полностью перевести в бессывороточную среду «ВНИИЗЖ». В качестве контроля использовали клетки линии ВНК-21, выращенные с применением улучшенной среды (среда №1), состав которой отражен в таблице 1 (прототип), а также клетки линии ВНК-21, адаптированные к выращиваю в бессывороточной среде CN 102115729-2011 (среда №3 - наиболее близкий прототип). В ходе исследования через каждые 48 ч в течение 5 последовательных пассажей оценивали концентрацию клеток и анализировали их размеры с помощью световой микроскопии (таблица 9, фиг. 1).

Из данных таблицы 9 и фиг. 1 следует, что контрольные клетки линии ВНК-21, выращенные в улучшенной среде (среда №1), с посевной концентрацией 0,70 млн клеток/мл через 48, 96, 144, 192, 240, 288 ч при уменьшении количества сыворотки крови КРС с 5 до 0% имели конечную концентрацию 4,20; 2,84; 2,21; 1,48; 0,95; 0,62 млн клеток/мл. Данные по адаптации клеток линии ВНК-21 к среде CN 102115729-2011 (среда №2) были также получены и составляли: 4,20; 4,25; 4,31; 4,35; 4,52; 4,70 млн клеток/мл. Клетки линии ВНК-21 с посевной концентрацией 0,70 млн клеток/мл через 48, 96, 144, 192, 240, 288 ч при уменьшении количества сыворотки крови КРС с 5 до 0% и замене ее на бессывороточную среду «ВНИИЗЖ» (среда №3) имели концентрацию 4,25; 4,32; 4,68; 5,02; 5,39; 5,65 млн клеток/мл, что в 1,01; 1,52; 2,12; 3,39; 5,67; 9,11 раз выше по сравнению с прототипом (среда №1) и в 1,01; 1,02; 1,08; 1,15; 1,19; 1,20 раз выше по сравнению с наиболее близким прототипом (среда №2). Результаты исследований также показали, что клетки, выращенные в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» - среда №3 (количество сыворотки 0% через 6 пассажей), имели размер 10-14 мкм (не менее, чем в контролях). Таким образом, была проведена адаптация клеток линии ВНК-21 к выращиванию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» в течение 6 последовательных пассажей (288 ч).

Пример 2. Процесс культивирования клеток перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21 в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ».

После адаптации клеток линии ВНК-21 к бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» проводили культивирование клеток в биореакторах объемом 6 л в течение 3 последовательных пассажей, каждый из которых длился 48 ч. Выращивание клеток осуществляли при рН 7,0-7,2, умеренном обогащении среды очищенным воздухом в процессе барботирования. Посевная концентрация клеток составляла 0,70 млн клеток/мл. Через каждые 48 ч определяли конечную концентрацию клеток и сравнивали ее с контролем. В качестве контроля использовали клетки линии ВНК-21, выращенные с применением улучшенной среды, состав которой отражен в таблице 1 (5% сыворотки крови КРС) (прототип) и клетки, адаптированные к бессывороточной среде CN 102115729-2011 (наиболее близкий прототип). Исследования проводили в трех повторениях. Полученные результаты представлены в таблице 10.

Из данных, отраженных в таблице 10, видно, что клетки линии ВНК-21, адаптированные к бессывороточной среде «ВНИИЗЖ», в течение 3 последовательных пассажей по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом имели большую концентрацию в среднем на 35,0 и 21,5%, соответственно.

Пример 3. Получение иммуногенных компонентов культурального вируса ящура штамма Азия-1/Шамир/89 с применением перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21, адаптированной к выращиванию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ».

В полученных клетках линии ВНК-21, адаптированных к выращиванию в бессывороточной среде «ВНИИЗЖ», проводили репродукцию вируса ящура штамма Азия-1/Шамир/89 в биореакторах объемом 40 л. Доза заражения вирусом составляла 0,05 ТЦД₅₀/клетка. Культивирование вируса осуществляли при рН 7,5-7,7. Водородный показатель регулировали с помощью раствора гидрокарбоната натрия. Цитопатическое действие (ЦПД) оценивали по количеству клеток, подвергнутых специфическому разрушению. Исследование проводили в трех повторениях. Культивирование осуществляли до 95% цитопатического действия. В качестве контроля использовали клетки линии ВНК-21, выращенные в улучшенной среде, состав которой представлен в таблице 1 (среда №1 - прототип), а также в бессывороточной среде CN 102115729-2011 (среда №2 - наиболее близкий прототип). Время репродукции вируса ящура для всех случаях составляло 10,5-11,0 ч.

После культивирования вируса ящура в ОТ-ПЦР подтверждали штаммоспецифичность [2]. В результате исследования в суспензии подтверждено наличие только вируса ящура штамма Азия-1/Шамир/89.

Исследовали полученные суспензии вируса ящура и определяли концентрацию 146S в обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) и 146S+75S иммуногенных компонентов в РСК (фиг. 2А) [15].

Проводили процесс инактивации антигена вируса ящура. В качестве инактиванта первого порядка использовали 1,2-аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ) в концентрации 0,050%. Инактивацию осуществляли в течение 12 ч.

Оценивали полноту процесса инактивации антигена вируса ящура при инокуляции перевиваемой монослойной клеточной линии из почки свиньи IB-RS-2 в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2].

После подтверждения полноты инактивации антигена вируса ящура определяли концентрации 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура в инактивированной суспензии с помощью РСК, которую проводили в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2, 16]. Осуществляли пересчет концентрации иммуногенных компонентов с 1 млн клеток (фиг. 2Б).

Результаты определения концентрации 146S и 146S+75S компонентов вируса ящура отражены в таблице 11 и на фиг. 2, из которой следует, что количества 146S частиц в неинактивированной суспензии, полученных с помощью разработанной бессывороточной среды, больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 18-38 и 13-55%, соответственно. Концентрации 146S частиц в инактивированной суспензии, полученных с помощью разработанной среды «ВНИИЗЖ», больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 20-36 и 13-49%, соответственно. Накопления 146S+75S частиц в неинактивированной суспензии, полученных с помощью разработанной среды «ВНИИЗЖ», больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 20-34 и 19-28%, соответственно. Концентрации 146S+75S иммуногенных компонентов в инактивированной суспензии, полученных с помощью разработанной бессывороточной среды, больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 23-32 и 26-30%, соответственно. Иными словами, разработанная бессывороточная среда «ВНИИЗЖ» и клетки линии ВНК-21, к ней адаптированные, позволяют значительно увеличить накопление 146S и 146S+75S иммуногенных частиц вируса ящура по сравнению с прототипными вариантами.

Пример 4. Изготовление и исследование противоящурной инактивированной эмульсионной вакцины из штамма Азия-1/Шамир/89, получение иммуногенных компонентов которого проведено с применением перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21, адаптированной к выращиванию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ».

Проводили получение трех противоящурных инактивированных эмульсионных вакцин из штамма Азия-1/Шамир/89: 1) из антигена, полученного в клетках линии ВНК-21, выращенных в улучшенной среде с 5% сыворотки крови КРС (прототип); 2) из антигена, полученного в клетках линии ВНК-21, выращенных в бессывороточной среде CN 102115729-2011 (наиболее близкий прототип); 3) из антигена, полученного в клетках линии ВНК-21, выращенных в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ». Для изготовления трех вакцинных препаратов использовали инактивированные антигены вируса ящура штамма Азия-1/Шамир/89, полученные в примере 3. Концентрация 146S и 146S+75S иммуногенных частиц вируса ящура представлена в таблице 11. Для вакцин №1, 2, 3 концентрация 146S компонентов составляла 0,71; 0,75 и 0,85 мкг/мл, соответственно, концентрация 146S+75S компонентов соответствовала значениям 0,86; 0,84 и 1,06 мкг/мл. Требованием для антигена при изготовлении противоящурной вакцины является концентрация 146S иммуногенных компонентов не менее 3,0 мкг/мл. После концентрирования в 10 раз содержание 146S компонентов для вакцин №1, 2, 3 составило 7,10; 7,50 и 8,50 мкг/мл, соответственно. После данного процесса концентрация 146S+75S компонентов для вакцин №1, 2, 3 составила 8,60; 8,40 и 10,60 мкг/мл, соответственно.

В качестве масляного адъюванта применяли Montanide ISA-206 («Seppic») в количестве 500000,0-575000,0. Эмульсионные вакцины получали путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата антигена вируса ящура и масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG в соотношении 50/50 по массе, соответственно.

Полученные вакцинные препараты исследовали на авирулентность для подтверждения отсутствия инфекционности антигена. Вакцины разрушали и отделяли антиген, которым инокулировали перевиваемую монослойную клеточную линию из почки свиньи IB-RS-2. Выявили, что по итогам 3 последовательных пассажей в культуре клеток IB-RS-2 вирулентный вирус ящура не был выявлен, иными словами, препараты безвредны.

Проводили оценку стерильности с помощью высевов на твердые и жидкие питательные среды. При использовали соево-казеинового агара (СКА), соево-казеинового бульона (СКБ), тиогликолевой среды (ТГС) подтвердили стерильность всех вакцинных препаратов.

Методом твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА) [17, 18] оценивали отсутствие антител к неструктурным белкам вируса ящура в конечном продукте. Тремя вакцинами иммунизировали свиней и на 14 сутки после инокуляции отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их указанным методом. Результаты исследования представлены в таблице 12. Из которой следует, что при исследовании сывороток после введения животным вакцины №1 средняя оптическая плотность составляет 1,080±0,007, процент ингибиции (PI) - 3,282±0,609% (РК 50%); для вакцины №2 средняя оптическая плотность - 1,020±0,003, процент ингибиции (PI) - 8,674±0,284% (PI<50%); для вакцины №3 средняя оптическая плотность - 1,070±0,003, процент ингибиции (PI) - 4,238±0,288% (PI<50%). Иными словами, было доказано отсутствие неструктурных белков вируса ящура в полученных противоящурных инактивированных эмульсионных вакцинах.

Для тестирования каждой из трех вакцин на безвредность по 5 голов КРС внутримышечно в область верхней трети шеи в дозе 6,0 см³ (трехкратная доза) иммунизировали препаратами данных вакцин, и наблюдали за клиническим состоянием животных в течение 6 суток. Вакцины признаны безвредными, поскольку все животные по итогам наблюдения оставались клинически здоровыми, и на месте введения препарата не отмечено некроза тканей.

Иммуногенность каждой из трех вакцин исследовали на 17 головах свиней количественным методом с контрольным заражением против гомологичного штамма Азия-1/Шамир/89 (генетическая линия A/ASIA/Shamir) вируса ящура. Для иммунизации животных готовили по 3 образца каждой из вакцин: 1) противоящурную эмульсионную вакцину без разведения; 2) вакцину, разбавленную «Плацебо» в соотношении 1:5; 3) вакцину, разбавленную «Плацебо» в соотношении 1:25. Приготовленные образцы вводили внутримышечно в верхнюю треть шеи в дозе 2,0 см³. Свиньи с порядковыми номерами с 1 по 5 инокулировали вакциной без разведения, животным с номерами с 6 по 10 вводили вакцину, разведенную 1:5, животным с номерами с 11 по 15 - вакцину, разведенную 1:25, животных с номера 16 и 17 - не иммунизировали (контрольная группа). Спустя 21 сутки после иммунизации от вакцинированных животных отбирали кровь и полученные сыворотки анализировали в РМН с целью определения уровня вируснейтрализующих антител (ВНА). Результаты исследования отражены в таблицах 13-15, из которой следует, что при введении цельной дозы вакцины №1, а также в разведениях 1/5 и 1/25 средний титр антител составил 5,40±0,14; 3,80±0,21 и 2,65±0,22 log₂, соответственно, для вакцины №2 в цельном виде, в разведениях 1/5 и 1/25 титры антител составили 5,88±0,21; 3,81±0,14 и 3,00±0,38 log₂, соответственно, для вакцины №3 в цельном виде и в разведениях 1/5 и 1/25 титры антител составили 6,81±0,25; 4,38±0,27 и 3,13±0,42 log₂, соответственно.

Свиней заражали гомологичным штаммом Азия-1/Шамир/89 в слизистую оболочку языка в дозе 10^4,0 ИД₅₀/0,20 см³ (в две точки по 0,10±0,05 см³). В течение 7 суток после заражения за животными вели наблюдение и ежедневно измеряли температуру. Через 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и проводили патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения, характерные для ящура.

По результатам наличия/отсутствия генерализованных признаков ящура у зараженных животных определяли иммуногенную дозу и количество протективных доз. Иммуногенная доза (ИмД₅₀) и количество протективных доз (PD₅₀) для вакцины №1 составляли 0,13 и 15,43, для вакцины №2 - 0,09 и 21,28, для вакцины №3 - 0,07 и 29,37. Следовательно, вакцинный препарат №3 обладал наиболее высокой иммуногенностью. Данный факт является доказательством того, что разработанная бессывороточная среда «ВНИИЗЖ» позволяет получать противоящурную инактивированную вакцину с высокими значениями иммуногенной активности.

Таким образом, с применением разработанной бессывороточной средой «ВНИИЗЖ» возможно получать противоящурную инактивированную вакцину, которая является безвредной, стерильной, свободной от неструктурных белков и высокоиммуногенной.

Пример 5. Получение иммуногенных компонентов культурального вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ с применением перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21, адаптированной к выращиванию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ».

В полученных клетках линии ВНК-21, адаптированных к выращиванию в бессывороточной среде «ВНИИЗЖ», проводили репродукцию вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в биореакторах объемом 6 л. Доза заражения вирусом составляла 0,05 ККИД₅₀/клетка. Культивирование вируса осуществляли при рН 7,4-7,6. Водородный показатель регулировали с помощью раствора гидрокарбоната натрия. Исследование проводили в трех повторениях. Культивирование осуществляли в течение 48 ч. В качестве контроля использовали клетки линии ВНК-21, выращенные в улучшенной среде, состав которой представлен в таблице 1 (среда №1 - прототип) и в бессывороточной среде CN 102115729-2011 (среда №2 - наиболее близкий прототип).

После культивирования вируса бешенства в ОТ-ПЦР подтверждали штаммоспецифичность [2]. В результате исследования в суспензии подтверждено наличие только вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ.

Проводили процесс инактивации антигена вируса бешенства. В качестве инактиванта первого порядка использовали 1,2-аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ) в концентрации 0,05%. Инактивацию осуществляли в течение 12 ч при температуре 37°С.

Определяли полноту процесса инактивации антигена вируса бешенства в РИФ в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2].

Исследовали полученные суспензии вируса бешенства и определяли концентрации специфических рибонуклеопротеина (в обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ)) [23] и гликопротеина (в ИФА) [15]. Осуществляли пересчет концентрации иммуногенных компонентов с 1 млн клеток.

Результаты определения концентрации иммуногенных компонентов вируса бешенства отражены в таблице 16 и на фиг. 3, из которой следует, что количества рибонуклеопротеина в вирусной суспензии, полученные с помощью разработанной бессывороточной среды «ВНИИЗЖ», больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 42-44 и 38-39%, соответственно. Накопления гликопротеина вируса бешенства в вирусной суспензии, полученного с помощью предложенной среды, больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 32-40 и 26-35%, соответственно. Следовательно, разработанная бессывороточная среда «ВНИИЗЖ» и клетки линии ВНК-21, к ней адаптированные, позволяют значительно увеличить накопление иммуногенных компонентов вируса бешенства по сравнению с прототипными вариантами.

Пример 6. Изготовление и исследование антирабической инактивированной эмульсионной вакцины из штамма ВНИИЗЖ, получение иммуногенных компонентов которого проведено с применением перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21, адаптированной к выращиванию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ».

Проводили получение трех антирабических инактивированных эмульсионных вакцин из штамма ВНИИЗЖ: вакцина №1 - из антигена, полученного в клетках линии ВНК-21, выращенных в улучшенной среде с 5% сыворотки крови КРС (среда №1 - прототип); вакцина №2 - из антигена, полученного в клетках линии ВНК-21, выращенных в бессывороточной среде CN 102115729-2011 (среда №2 - наиболее близкий прототип); вакцина №3 - из антигена, полученного в клетках линии ВНК-21, выращенных в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» (среда №3). Для изготовления вакцинных препаратов использовали инактивированные антигены вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ, полученные в примере 5. Концентрации рибонуклеопротеина и гликопротеина вируса бешенства представлены в таблице 16. Для вакцин №1, 2, 3 концентрация рибонуклеопротеина была равна 0,50; 0,52 и 0,72 мкг/мл, соответственно, концентрация гликопротеина соответствовала значениям 0,52; 0,58 и 0,73 мкг/мл. Требованием для антигена при изготовлении антирабической вакцины является концентрация рибонуклеопротеина и гликопротеина не менее 3,0 мкг/мл каждого. После концентрирования в 8 раз содержание рибонуклеопротеина вируса бешенства для вакцин №1, 2, 3 составило 4,00; 4,16 и 5,76 мкг/мл, соответственно. После данного процесса концентрация гликопротеина вируса бешенства для вакцин №1, 2, 3 составила 4,16; 4,64 и 5,84 мкг/мл, соответственно.

В качестве масляного адъюванта применяли Montanide ISA-61 VG («Seppic»). Эмульсионные вакцины получали путем диспергирования на приборе Silverson L5 концентрата антигена вируса бешенства и масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG в соотношении 40/60 по массе, соответственно.

Проводили оценку стерильности с помощью высевов на твердые и жидкие питательные среды. При использовали соево-казеинового агара (СКА), соево-казеинового бульона (СКБ), тиогликолевой среды (ТГС) подтвердили стерильность всех вакцинных препаратов.

Оценку ареактогенности и безвредности каждой антирабической инактивированной эмульсионной культуральной вакцины проводили на КРС, МРС, свиньях, собаках, кошках и кроликах.

Вакцины вводили всем видам животных внутримышечно в дозе, рекомендованной для каждого вида животных. Прививная доза 2,0 см³ предназначена для КРС, 1,0 см³ - для овец и коз, взрослых собак крупных и средних пород, 0,5 см³ - для кошек, щенков с 2-х месячного возраста всех пород и для взрослых собак мелких пород (болонки, таксы и др.). За животными осуществляли клиническое наблюдение. Температуру тела измеряли в течение 7 суток после инъекции, затем через 10 и 14 суток после вакцинации. Критерием оценки клинического наблюдения было развитие или отсутствие общей и местной реакции на введение испытуемых препаратов. По результатам исследования все испытуемые животные были клинически здоровы, общей и местной реакции на введение препаратов не было выявлено. Незначительное повышение температуры тела (0,2-0,5°С) у животных было отмечено в 1-2 сутки после введения вакцины №3. В течение этого времени наблюдения разница температур (ΔT=T_max-Т_{на 0 день после вакцинации}) У КРС составила 0,3-0,5°С, у МРС - 0,3-0,4°С, у свиней - 0,2-0,5°С, у собак - 0,2-0,5°С, у кошек - 0,3-0,5°С. Начиная с 3 суток температура животных была в норме. Местная реакция (отек, болезненность, хромота) у целевых видов животных не отмечена. Таким образом, по результатам исследований три антирабические инактивированные эмульсионные культуральные вакцины являются безвредными и аректогенными препаратами для целевых видов животных.

Проводили исследование гуморального иммунитета трех полученных эмульсионных инактивированных антирабических вакцин. Испытания представленных вакцин проводили на десяти головах КРС черно-пестрой породы в возрасте 1 года со средней массой 200 кг. Животных прививали вакцинами в дозе 2,0 см³ внутримышечно однократно, разделив КРС на группы по 5 голов: первую инокулировали цельной дозой вакцин, вторую - разведением вакцин на 1/15 М растворе ФБР в 4 раза, третью - разведением вакцин на 1/15 М растворе ФБР в 16 раз. Для оценки напряженности поствакцинального антирабического иммунитета у животных, в соответствии с рекомендациями МЭБ (OIE), применяли реакцию нейтрализации в монослойной культуре клеток ВНК-21 (модификация реакции - FAVN (Fluorescent antibody virus neutralization)), выражая значения титра антирабических антител в МЕ/мл [2]. Для анализа использовали положительный сывороточный контрольный стандарт, разведенный до иммуногенности 0,5 МЕ/см³, и отрицательный сывороточный контрольный стандарт с иммуногенностью <0,1 МЕ/см³ [2].

В соответствии с международными требованиями, защитным является уровень вируснейтрализующих антител (ВНА) против вируса бешенства ≥0,50 МЕ/см³ [2]. В реакции нейтрализации оценивали сыворотки крови от КРС до и на 21 сутки после вакцинации.

До иммунизации в крови животных антирабические антитела не были выявлены. Уровень антирабических вируснейтрализующих антител у КРС после введения одной дозы (2,0 см³) полученных вакцин отражен в таблицах 17-19, из которой следует, что при введении вакцины №1 - цельной и в разведениях 1/4 и 1/16 средний титр антител составил 24,14±1,84; 7,22±0,61 и 2,3±±0,30 МЕ/мл, соответственно, для вакцины №2 в цельном виде, в разведениях 1/4 и 1/16 титры антител были незначительно выше по сравнению с иммунным ответом на первую вакцину и составили 24,88±1,86; 7,60±0,50 и 2,92±0,18 МЕ/мл, соответственно, для вакцины №3 в цельном виде и в разведениях 1/4 и 1/16 титры антител составили 30,82±1,10; 10,44±0,73 и 4,10±0,32 МЕ/мл, соответственно.

Следует отметить, что вакцина №3, для изготовления которой антиген вируса бешенства был получен с применением разработанной бессывороточной среды «ВНИИЗЖ», позволяла на 21 сутки после инокуляции индуцировать более высокий иммунный ответ (в среднем на 5,94 МЕ/мл выше для цельной вакцины, на 2,84 МЕ/мл - для разведения вакцины 1/4 и на 1,18 МЕ/мл - для разведения вакцины 1/16). Так, вакцинный препарат №3 обладал наиболее высокой иммуногенностью. Данный факт является доказательством того, что разработанная бессывороточная среда «ВНИИЗЖ» позволяет получать антирабическую инактивированную вакцину с высокими значениями иммуногенной активности.

Таким образом, с применением разработанной бессывороточной среды «ВНИИЗЖ» возможно получать антирабическую инактивированную вакцину, которая является безвредной, стерильной, ареактогенной и высоко иммуногенной.

Основным преимуществом предлагаемого изобретения является применение бессывороточной среды «ВНИИЗЖ» для адаптации клеток перевиваемой суспензионной линии ВНК-21 к выращиванию в данной среде без наличия сыворотки крови животных, для культивирования клеток линии ВНК-21 с целью получения суспензий большей концентрацией клеток, для репродукции вирусов ящура и бешенства с целью повышения количеств иммуногенных компонентов для производства безопасных и высокоиммуногенных противоящурных и антирабических вакцин.

Предлагаемое изобретение позволяет получать антиген вируса ящура с концентрациями 146S иммуногенного компонента по сравнению с прототипами большими на 18-39 и 13-55%, соответственно, и 146S+75S иммуногенного компонента - на 20-34 и 19-28%, соответственно. Предлагаемое изобретение позволяет получать антиген вируса бешенства с концентрациями рибонуклеопротеина по сравнению с прототипами большими на 42-44 и 38-39%, соответственно, и гликопротеина - на 32-40 и 26-35%, соответственно.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Бессывороточная среда «ВНИИЗЖ» для культивирования клеток почки сирийского хомячка ВНК-21 и получения иммуногенных компонентов культуральных вирусов ящура и бешенства для изготовления вакцин»:

1. Пономарев А.П., Узюмов В.Л., Груздев К.Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

2. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. Paris, 2017.

3. Способ определения концентрации 146S компонента вируса ящура в сырье для вакцины с применением метода ОТ-ПЦР-РВ / М.И. Доронин, A.M. Тимина, Д.А. Лозовой, В.А. Стариков, Д.В. Михалишин, Н.Н. Медведева, А.В. Борисов // Ветеринария сегодня. - 2018. - №2. - С. 26-35.

4. Груздев К.Н., Метлин А.Е. Бешенство животных. - Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2019. - 394 с.

5. Молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса бешенства, выделенных на территории Западной Сибири // А.В. Зайковская, B.А. Терновой, В.И. Аксенов, Ю.Н. Рассадкин // Вестник РАМН. - №2. - 2005. - С. 31-35.

6. Влияние изменений аминокислотного состава гидролизата белков крови на продуктивность клеточной линии ВНК-21/2-17 и количество иммуногенных компонентов вируса ящура / М.А. Шевченко, М.Н. Гусева, Д.А. Лозовой, М.И. Доронин [и др.] // Ветеринария сегодня. - 2018. - №1. - C. 55-59.

7. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. Практическое руководство. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. - 691 с.

8. Трошкова Г.П. Бессывороточная питательная среда для культивирования клеток VERO / Г.П. Трошкова, Л.Д Мартыней, Е.В. Кирова [и др.] // - Фундаментальные исследования. - 2005. - №5 - С. 94-94.

9. Официальный сайт Good Cell Culture. Animal Cell Culture - http://www.goodcellculture.com. (Дата обращения 01.11.2020).

10. Шаманская T.B. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток EX VIVO в различных питательных средах (обзор литературы и собственный опыт) / Т.В. Шаманская, Е.Ю. Осипова, Б.Б. Пурбуева [и др.] // Онкогематология. - 2010. - №3. - С. 65-71.

11. Патент US №4049494 (А), 04.09.1975. Vaccine production process // L. David Tomei, Buffalo N.Y.

12. Патент JPH №09154571 (A), 17.06.1997. Бессывороточная среда для производства антигенов вирусов. // Motono Mitsuri, Yamamoto Ryohei, Takase Kozo, Miyahra Tokuji.

13. Патент CN №102115729, 06.07.2011. Способ получения вакцины с применением среды без сыворотки крови животных // Ren Zhang, Wenqing Chen, Jlanchao Wang.

14. Патент CN №103374547, 30.10.2013. Способ получения очищенной вакцины против ящура с применением бессывороточных сред // Zhang Shu, L.V. Hongliang.

15. Патент РФ №2619878/13, 18.05.2017. Способ определения концентрации 1468-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Патент России №2016140460/15. 2017. Бюл. №14 / Лозовой Д.А., Михалишин Д.В., Доронин М.И. [и др.].

16. Синютина С.Е. Биохимия белков и ферментов. - Тамбов: ТГУ им. Г. Р. Державина, 2010. - 385 с.

17. Биохимия человека: [Учеб.]: В 2 т./ Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В. Родуэлл; Пер. с англ. к. ф.-м. н. В.В. Борисова и Е.В. Дайниченко Под ред. д. х. н. Л. М. Гинодмана. - М.: Мир, 2004.

18. Chen, W.W., Neipel, М., Sorger, Р.K. Classic and contemporary approaches to modeling biochemical reactions (англ.) // Genes Dev: journal. - 2010. -Vol. 24, no. 17. - P. 1861-1875.

19. Wollmer A., Dieken M. L., Federwisch M., De Meyts P. Insulin & related proteins structure to function and pharmacology (англ.). - Boston: Kluwer Academic Publishers, 2002. - ISBN 1-4020-0655-1.

20. Бондаренко А.Ф. Качественный и количественный иммунохимический анализ вирусных белков. - Суздаль, 1994. - 92 с.

21. Сухарьков Андрей Юрьевич. Разработка методов оценки оральной антирабической вакцинации животных: диссертация... кандидата биологических наук: 03.02.02 / Сухарьков Андрей Юрьевич; [Место защиты: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных»]. - Владимир, 2014. - 141 с.

22. Comparative evaluation of non-structural protein-antibody detecting ELISAs for foot-and-mouth disease sero-surveillance under intensive vaccination/G.K. Sharma, J.K. Mohapatra, S. Mahajan [et al] // J. Virol. Methods. - 2014. - V. 207. - P. 22-28.

23. Доронин М.И. Опосредованное определение концентрации рибонуклеопротеина вируса бешенства в сырье для вакцин методом амплификации и гибридизационно-флуоресцентной детекции ампликонов / М.И. Доронин, Д.В. Михалишин, Н.С. Мудрак, А.В. Борисов, К.Н. Груздев // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. - 2021. - №3. - С. 14-19.

24. Тукшаитов, Р.Х. Основы оптимального представления статистических показателей на графиках, диаграммах и в таблицах. / Р.Х. Тукшаитов. - К.: Типография КГЭУ, 2006. - 227 с.

Бессывороточная среда для культивирования клеток почки сирийского хомячка ВНК-21 и получения иммуногенных компонентов культуральных вирусов ящура и бешенства для изготовления вакцин, отличающаяся тем, что содержит следующие компоненты: набор белков растительного происхождения, включающий соевый белок, белок бобовых, картофельный белок, пшеничный глютеновый, рисовый и кукурузный белок в общей концентрация 3000 мг/л; 21 протеиногенную аминокислоту в общей концентрация 3431 мг/л, витамины и витаминоподобные вещества, включающие инозитол 6,2 мг/л, никотинамид 3,3 мг/л, пантетонат кальция 3,3 мг/л, пиридоксаля гидрохлорид 3,5 мг/л, рибофлавин 0,35 мг/л, тиамина гидрохлорид 3,2 мг/л, фолиевую кислоту 3,5 мг/л, холина хлорид 3,5 мг/л; митоген - бычий инсулин 3 мг/л; глюкозу 3500 мг/л, минеральные вещества, включающие неорганические водорастворимые соли калия, натрия, магния и кальция с общей концентрацией 9350 мг/л, хлорид железа (II) 1 мг/л.