Фармацевтическая композиция, содержащая аттенуированные штаммы streptococcus pneumoniae, и ее применение

Изобретение относится к применению фармацевтической композиции, содержащей аттенуированный штамм Streptococcus pneumoniae для профилактики или лечения воспалительного заболевания, выбранного из астмы, пневмонии, сепсиса, воспалительных заболеваний кишечника, гастроэнтерита и колита. При этом аттенуированный штамм Streptococcus pneumoniae содержит мутантный ген pep27, в котором удалены нуклеотидные остатки в положениях 1–53 нуклеотидной последовательности pep27, описанной в SEQ ID NO: 1. Указанная фармацевтическая композиция индуцирует экспрессию иммунизации, связанную с генами в легких и селезенке, тем самым обеспечивая профилактику и/или лечение связанных с воспалением заболеваний. 7 з.п. ф-лы, 28 ил., 1 табл., 2 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей аттенуированный штамм Streptococcus pneumoniae, и ее применению для профилактики или лечения воспалительных заболеваний, респираторных вирусных инфекций или бактериальных инфекционных заболеваний.

Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей ослабленный штамм Streptococcus pneumoniae, и ее применению для профилактики или лечения аллергических заболеваний.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно опубликованным данным, интраназальное или пероральное введение антигенов индуцирует регуляторные T-клетки (Treg), которые, в свою очередь, индуцируют толерантность слизистой оболочки в органах-мишенях (Faria and Weiner, 2005). Также описано (Faria and Weiner, 2005), что индукция толерантности слизистой оболочки подавляет разные аутоиммунные заболевания, в том числе атеросклероз у мышей (Maron et al., 2002). Соответственно, принцип толерантности слизистой оболочки можно применять к животным и людям. Множественная стимуляция слизистой оболочки путем введения антигена побуждает Т-клетки секретировать противовоспалительные цитокины, такие как IL-10 или TGF-β1, чтобы защитить ткани и индуцировать толерантность слизистой оболочки (Faria and Weiner, 2005; Weiner, 2001). Чтобы поддерживать иммунную толерантность на поверхности слизистой оболочки, предпочтительно индуцируют определенный тип клеток Treg, однако механизм их индукции остается неясным.

Между тем, используемые в настоящее время мукозальные вакцины обладают слишком низкой эффективностью, чтобы вызвать достаточный иммунный ответ без адъювантов. Мукозальные адъюванты используют для антигенов, которые при отдельном введении вызывают низкую иммунную толерантность. Примером мукозального адъюванта может служить субъединица B холерного токсина (CTB) (Faria and Weiner, 2005). Однако эффект усиления иммунитета под действием холерного токсина после интраназальной инокуляции подразумевает распознавание и опосредование бактерий (Kim et al., 2016) и, следовательно, важную роль микроорганизмов в потенцировании, свидетельствуя о том, что при необходимости аттенуированные бактерии можно использовать в качестве адъюванта. Другими словами, концепция применения мукозальных вакцин без адъювантов до сих пор не доказана.

Кроме того, в предыдущих документах нигде не сообщалось, могут ли мукозальные вакцины оказывать влияние на разные другие заболевания, помимо заболеваний, непосредственно связанных с антигенами, используемыми в вакцинах. Существующая в настоящее время иммунотерапия защищает только от антигенов, используемых при вакцинации. В частности, для профилактики пневмококковой инфекции используют 23-валентные полисахаридные вакцины или 13-валентные конъюгатные вакцины. Однако 23-валентная полисахаридная вакцина не может индуцировать продукцию иммунологических клеток памяти, а 13-валентная конъюгатная вакцина может защищать только от 13 из 90 или более серотипов (Kalin, 1998).

Астма является одним из самых распространенных хронических заболеваний у детей и взрослых в мире (Anandan et al., 2010). Приблизительно 300 миллионов человек во всем мире страдают от астмы, что приводит к значительным медицинским расходам (WHO, 2007). По прогнозам, число больных астмой в мире будет увеличиваться с каждым годом, и к 2025 году число заболевших увеличится еще на 100 миллионов человек. Согласно статистическим данным Центров США по контролю и профилактике заболеваний, в 1980 году количество пациентов с астмой составляло 3,1% населения США, а в 2010 году оно возросло до 8,4%, при этом тенденция к увеличению продолжается (https://www.cdc.gov/asthma).

Кроме того, 70% пациентов с астмой также страдают от аллергии [методическое руководство GINA, 2016]. В 2015 году астма была диагностирована у 1,66 млн человек в Южной Корее (статистика Службы просмотра и оценки медицинского страхования за 2015 год), что ставит ее на шестое место по уровню заболеваемости в первой десятке хронических заболеваний, встречающихся среди населения Южной Кореи.

Возникновение астмы и других аллергических заболеваний тесно связано с изменениями окружающей среды, обусловленными западным образом жизни и урбанизацией (методическое руководство GINA, 2016). Астма представляет собой гетерогенное заболевание, имеющее разные причины, обычно вызываемые воспалением. У пациентов, страдающих от астмы, наблюдаются сходные симптомы, но в их основе лежат разные механизмы (методическое руководство GINA, 2016; Национальная образовательная и превентивная программа по бронхиальной астме, 2007). Кроме того, виды воспаления дыхательных путей отличаются друг от друга, в зависимости от типов астмы (методическое руководство GINA, 2016). Типичным механизмом патогенеза астмы является эозинофильное воспаление дыхательных путей, опосредованное иммуноглобулином Е (IgE), а результаты многочисленных исследований патологии и астмы сфокусированы на связанных с Th2 приобретенных иммунных реакциях (методическое руководство GINA, 2016). Однако проводимые в последнее время исследования сосредоточены на врожденном иммунитете, микробиомах, микробах, присутствующих в организме, и т.п. (Bjorksten et al., 2001; Kalliomaki et al., 2001; Penders et al., 2007; Hilty et al., 2010; Green et al., 2014; and Ozturk et al., 2017).

По данным Американского фонда астмы и аллергии (http://www.aafa.org/), доступные в настоящее время лекарства, используемые для оказания медицинской помощи при астме, могут только уменьшить симптомы, но не могут полностью вылечить астму. Астма характеризуется гиперчувствительностью дыхательных путей (AHR), обуславливающей эпизоды чрезмерного сужения бронхов. Несмотря на то, что регулярное введение глюкокортикостероидов путем ингаляции значительно снизило смертность в последние годы, астма по-прежнему является причиной примерно 250000 смертей в год во всем мире и характеризуется высоким уровнем заболеваемости (Suissa et al., 2000). В зависимости от частоты проявления симптомов астму подразделяют на легкую (1-2 раза в месяц), умеренную (1-2 раза в неделю) и тяжелую (симптомы астмы проявляются ежедневно). При тяжелых симптомах требуется ежедневное введение 3-4 препаратов. Даже легкие симптомы нуждаются в регулярном лечении. Поскольку астма является воспалением дыхательных путей, вызывающим сужение бронхов, больные астмой при одышке должны сразу же распылять на горло бронхолитическое средство посредством ингалятора. Кроме того, некоторые из пациентов с астмой и пациентов с тяжелой астмой совсем не реагируют на кортикостероидные гормоны, так что они могут страдать от заболевания в течение всей своей жизни или умереть, не испытывая каких-либо клинических эффектов (Durham et al., 2011). Недавно поступившие в продажу средства против IL-5 могут облегчать астматические симптомы при введении один раз в четыре недели. Тем не менее лекарственные средства или способы лечения, позволяющие полностью вылечить или предотвратить астму, еще не разработаны или не описаны.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА

Были разработаны профилактические и терапевтические методы лечения воспалительных заболеваний, обусловленных такими воспалительными факторами, как заболевания кишечника, инфекции, атеросклероз и эпителиальные поражения, однако они ограничиваются использованием определенных маркеров, связанных с воспалением или заболеванием. В данной связи, поскольку предполагается, что иммунитет слизистой оболочки предотвращает заболевания слизистой оболочки и воспалительные заболевания, настоящее изобретение предлагает новую противовоспалительную и защитную терапию против разных заболеваний, преимуществом которой является развитие мукозального иммунитета под действием пневмококковых цельноклеточных вакцин. Кроме того, в настоящем изобретении доказано, что вакцину, которую вводят в слизистую оболочку для оптимизации иммунной толерантности мукозального иммунитета, можно использовать в качестве нового терапевтического средства для профилактики или лечения воспаления кишечника и инфекционных заболеваний.

Кроме того, в настоящем изобретении разработан новый способ защиты от широкого спектра воспалительных заболеваний, включающих вирусные и бактериальные инфекционные заболевания дыхательных путей, а также расстройства, вызванные воспалением кишечника и инфекцией и воспалением дыхательных путей, путем инокуляции цельноклеточной пневмококковой вакцины на слизистую оболочку.

Кроме того, существующие в настоящее время лекарства против астмы подразделяются на средства, облегчающие симптомы путем расширения суженных дыхательных путей (бронходилататоры), и средства, контролирующие заболевание путем подавления воспаления дыхательных путей, что позволяет предотвратить приступы астмы (противовоспалительные средства). Однако лекарства не могут полностью излечить или предотвратить астму. Таким образом, настоящее изобретение предлагает в качестве средства для предотвращения или лечения аллергических заболеваний, включающих астму, фармацевтическую композицию, содержащую Streptococcus pneumoniae, и, в частности, фармацевтическую композицию, содержащую штамм Streptococcus pneumoniae, который достаточно ослаблен, чтобы гарантировать безопасность даже при интраназальном введении, внутрибрюшинной инъекции и внутривенной инъекции, что позволяет преодолеть недостаток, заключающийся в том, что применение Streptococcus pneumoniae в фармацевтических композициях, таких как вакцины, требует инактивации Streptococcus pneumoniae, или разделения и очистки отдельных компонентов Streptococcus pneumoniae вследствие высокой токсичности бактерий.

Однако цели, которые должны быть достигнуты в настоящем изобретении, не ограничиваются вышеизложенными, и другие, не упомянутые, цели могут стать очевидными для специалистов в данной области техники из нижеследующего описания.

ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ

Настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения воспалительного заболевания, вирусного инфекционного заболевания дыхательных путей или бактериальных инфекционных заболеваний, отличных от Streptococcus pneumoniae, которая содержит аттенуированный штамм Streptococcus pneumoniae.

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается применение штамма Streptococcus pneumoniae, ослабленного мутацией гена pep27, для профилактики или лечения разных аллергических заболеваний, включающих аллергическое респираторное заболевание, и используемой для этого фармацевтической композиции.

Решения, изложенные выше, являются только иллюстративными и не должны рассматриваться как ограничивающие настоящее изобретение. Помимо вышеописанных иллюстративных вариантов осуществления могут существовать другие варианты осуществления и примеры, которые разъясняются с помощью чертежей и в описании.

ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ

Согласно настоящему изобретению, инокуляция пневмококковой цельноклеточной вакцины на слизистую оболочку индуцирует экспрессию иммунизации, связанную с генами в легких и селезенке, тем самым обеспечивая профилактику и/или лечение связанных с воспалением заболеваний.

В частности, хотя обычные вакцины могут обеспечивать защиту только от конкретных антигенных ингредиентов, ожидается, что использование пневмококковой мукозальной вакцины согласно настоящему изобретению обеспечит широкий спектр профилактических и терапевтических эффектов, в том числе защитные механизмы против воспалительных заболеваний других органов, а также вирусных и бактериальных инфекционных заболеваний. Кроме того, при введении в слизистую оболочку пневмококковая цельноклеточная вакцина согласно настоящему изобретению может обеспечивать защитные эффекты против разных заболеваний даже в отсутстви какого-либо адъюванта, в отличие от обычных вакцин для слизистой оболочки.

Настоящее изобретение предлагает способ профилактики или лечения аллергических заболеваний, включая астму, с использованием мутанта Streptococcus pneumoniae pep27. В частности, вакцинация мутантом Streptococcus pneumoniae pep27 может обеспечить профилактику или лечение аллергических респираторных заболеваний, включающих в себя астму, аллергический ринит, синусит и хроническую обструктивную болезнь легких, а также других аллергических заболеваний, таких как крапивница, конъюнктивит, аллергия на пыльцу и атопия.

Кроме того, мутант Streptococcus pneumoniae pep27 в соответствии с настоящим изобретением обладает преимуществом, гарантирующим безопасность даже при интраназальном введении, внутрибрюшинной инъекции и внутривенной инъекции, поскольку мутант является аттенуированным в достаточно степени.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 и 2 приведены схематические диаграммы, показывающие результаты анализа функционирования вакцины против Streptococcus pneumoniae в легких (фиг. 1) и селезенке (фиг. 2), полученные с помощью анализа системной биологии в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Мышей иммунизируют мутантом THpep27 (Δpep27) каждые две недели в общей сложности три раза. Через две недели после последней иммунизации выделяют легкие и селезенки и из них извлекают общую РНК. Экспрессию генов определяют методом высокопроизводительного секвенирования и затем анализируют с помощью Ingenuity Pathway Analysis. На фиг. 1 показано, что гены иммунизированной легочной ткани подавляют гастроэнтерит и аномалию толстой кишки, а на фиг. 2 показано защитное действие гена селезенки против инфекции вируса гриппа.

На фиг.3 приведена схематическая диаграмма результата анализа системной биологии в легком в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Мышей интраназально инокулируют мутантным штаммом Δpep27 каждые две недели в общей сложности три раза. На 7-й день после последней иммунизации мРНК выделяют из легкого и подвергают высокопроизводительному секвенированию. Изображены результаты сетевого IPA-анализа данных о последовательностях в легких, свидетельствующие об индукции IL-6, IL-23R, MUC2, IFN типа 1 и TGF бета, но о пониженной регуляции CCR3.

На фиг.4-6 показаны результаты эксперимента, целью которого является определение, может ли иммунизация Δpep27 индуцировать клетки Treg у мышей в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Фиг. 4: мышей (n=3) интраназально иммунизируют Δpep27 каждые две недели в общей сложности три раза и на 7-й день после последней иммунизации клетки селезенки выделяют, метят флуоресцентными клеточными маркерами против Th1 (CD4, Tbet), Th2 (CD4, GATA3), Th17 (CD4, RORγt) и Treg (CD4, Foxp3) и затем детектируют методом проточной цитометрии. На фиг.5 и 6 показаны уровни цитокинов в спленоцитах (фиг.5) и сыворотке (фиг.6), полученных на 7-й день после последней иммунизации, измеренные методом ELISA. Статистическую значимость определяют с помощью ANOVA; * P<0,05, ** P<0,01.

На фиг.7 и 8 показаны результаты эксперимента, в котором мышей иммунизируют Δpep27, чтобы индуцировать IL-10 и IL-17 в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Мышей (n=3) иммунизируют путем интраназальной инокуляции Δpep27 каждые две недели в общей сложности три раза. На 7-й день после последней иммунизации мРНК выделяют из легкого и используют для измерения уровней экспрессии генов IL-17 (фиг.7) и IL-10 (фиг.8) методом кПЦР. Статистическую значимость определяют с помощью ANOVA; * P<0,05.

На фиг. 9 показаны результаты эксперимента, в котором мышей иммунизируют Δpep27, чтобы активировать Т-клетки центральной памяти и Tfh-клетки памяти в селезенке в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Мышей (n=3) иммунизируют интраназально Δpep27 каждые две недели в общей сложности три раза. На 7-й день после последней иммунизации спленоциты выделяют и метят флуоресцентными клеточными маркерами против Т-клеток центральной памяти (CD4, CCR7, CD62L) и Tfh-клеток памяти (CD4, CXCR5, CCR7). Затем флуоресцентные маркеры детектируют методом проточной цитометрии. Статистическую значимость определяют с помощью ANOVA; * P<0,05.

На фиг. 10 и 11 показаны результаты эксперимента, в котором мышей иммунизируют Δpep27, чтобы индуцировать экспрессию иммуноглобулинов разных подтипов в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Мышей (n=6) иммунизируют интраназально Δpep27 каждые две недели в общей сложности три раза. На 7-й день после последней иммунизации в сыворотке (фиг. 10) и жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BAL) (фиг. 11) определяют титры антител против целых клеток пневмококка трех типов. Статистическую значимость определяют с помощью ANOVA; * Р<0,05, ** Р<0,01.

На фиг. 12-15 показаны результаты эксперимента, целью которого является определение, может ли иммунизация Δpep27 защитить от вторичной пневмококковой инфекции после инфекции гриппа в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Мышей (9-10 на группу) иммунизируют интраназально Δpep27 еженедельно в общей сложности три раза. Через одну неделю после последней иммунизации мышей заражают интраназально вирусом гриппа. Образцы крови берут из ретроорбитального синуса и затем анализируют их на цитокины (фиг. 12), или через неделю после последней иммунизации у мышей собирают сыворотку и анализируют уровни IgG против определенных антигенов методом ELISA (фиг. 13). Значимые различия между двумя группами определяют с помощью непарного t-критерия; *** р<0,001. Через десять дней после заражения гриппом мышей инфицируют Streptococcus pneumoniae D39 интраназальным путем и затем регистрируют выживаемость в течение 14 дней (фиг. 14). Статистическую значимость определяют с помощью критерия Ментеля-Кокса; ** р<0,005. Через двадцать четыре часа после заражения Streptococcus pneumoniae D39 гомогенаты легких инкубируют в сыворотке для подсчета бактерий (фиг. 15). Статистическую значимость определяют с помощью одностороннего ANOVA.

На фиг. 16 и 17 показаны результаты эксперимента, в котором вакцину Δpep27 тестируют на ингибиторную активность в отношении репликации вируса гриппа в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Мышей (10 на группу) иммунизируют интраназально вирусом гриппа и затем регистрируют массу тела в течение 11 дней (фиг. 16). Статистическую значимость определяют с помощью одностороннего ANOVA; *** р<0,001. Через пять дней после заражения гриппом собирают супернатанты гомогенатов легких и измеряют титры вируса в каждой группе путем определения TCID₅₀/мл (фиг. 17). Значимость определяют с помощью одностороннего ANOVA; *** р <0,001.

На фиг. 18 показаны результаты эксперимента, целью которого является определение, может ли иммунизация Δpep27 предотвратить инфекцию грамотрицательных бактерий в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Мышей (3/группу) иммунизируют интраназально Δpep27 три раза. Через десять дней после последней иммунизации мышей инфицируют K. pneumoniae. Число бактерий в отдельных органах определяют через 24 часа после инфицирования K. pneumoniae путем распределения на планшетах с кровяным агаром; ** Р<0,01.

На фиг.19 показаны результаты эксперимента, целью которого является определение, может ли иммунизация Δpep27 предотвратить инфекцию грамположительных бактерий в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Мышей (3/группу) иммунизируют интраназально Δpep27 три раза. Через десять дней после последней иммунизации мышей инфицируют Staphylococcus aureus. Число бактерий в отдельных органах определяют через 24 часа после инфицирования S. aureus путем распределения на планшетах с кровяным агаром; * Р<0,05.

На фиг. На фиг.20 и 21 показаны результаты эксперимента, целью которого является определение, может ли иммунизация Δpep27 уменьшать потерю массы в результате индуцированного декстрансульфатом натрия (DSS) воспалительного заболевания кишечника в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Мышей (n=5 на группу) иммунизируют интраназально мутантным штаммом Δpep27 три раза, а затем перорально вводят 5% DSS в питьевой воде для индукции колита (воспалительного заболевания кишечника). У иммунизированных мышей наблюдается уменьшение потери массы (фиг. 20). В данной связи процент потери основной массы тела регистрируют в течение 9 дней после обработки DSS. Статистическую значимость определяют с помощью одностороннего анализа ANOVA с последующим проведением теста Бонферрони. Клинический индекс активности заболевания оценивают ежедневно до завершения терапии на 9 день (фиг. 21). Прогрессирование колита оценивают путем измерения потери массы, консистенции стула, ректального кровотечения и/или количества общей крови в стуле. Кроме того, у мышей ежедневно регистрируют осложнения (пилоэрекцию и летаргию).

На фиг. 22 и 23 показаны результаты эксперимента, целью которого является определение, может ли иммунизация Δpep27 предотвратить колит, вызванный декстрансульфатом натрия (DSS), в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Мышей (n=5 на группу) иммунизируют интраназально Δpep27 три раза и затем перорально вводят 5% DSS в питьевой воде, чтобы индуцировать колит (воспалительное заболевание кишечника). У иммунизированных мышей наблюдается снижение потери массы (фиг. 20). Толстую кишку исследуют на 9 день после обработки DSS. Длину (фиг. 22) и массу (фиг. 23) ободочной кишки измеряют на 9-й день после обработки DSS.

На фиг. 24 показаны результаты эксперимента, целью которого является определение, может ли иммунизация Δpep27 подавлять экспрессию генов воспалительных цитокинов в толстой кишке в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Мышам Balb c дают 5% DSS в питьевой воде в течение 14 дней, чтобы вызвать воспалительное заболевание кишечника. В качестве отрицательного контроля используют PBS+воду. Уровни экспрессии мРНК IL-1β, IL-6, IL-17A и TNF-α измеряют методом количественной ПЦР в режиме реального времени. Экспериментальные данные выражают как среднее±SEM. При Р<0,05 результат считается значимым.

На фиг. 25 показан временной график тестирования мутантного штамма Δpep27 на способность предотвращать аллергическое заболевание (А) и результаты тестирования мутантного штамма Δpep27 на способность ингибировать секрецию разных аллергических цитокинов (В) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

На фиг. 26 показаны результаты гистохимического окрашивания, свидетельствующие о способности мутантного штамма Δpep27 предотвращать аллергическое заболевание в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

На фиг. 27 показан временной график тестирования мутантного штамма Δpep27 на терапевтическое действие в отношении аллергического заболевания (А) и результаты тестирования, свидетельствующие о способности мутантного штамма Δpep27 ингибировать секрецию разных аллергических цитокинов (В) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

На фиг. 28 показаны результаты гистохимического окрашивания, свидетельствующие о терапевтическом эффекте мутантного штамма Δpep27 в отношении аллергического заболевания в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения будут описаны более полно со ссылкой на прилагаемые чертежи. Однако изобретение может быть осуществлено в разных других формах и не должно рассматриваться как ограниченное изложенными здесь вариантами осуществления; скорее, эти варианты осуществления приведены таким образом, чтобы настоящее описание было исчерпывающим и завершенным и полностью передавало концепцию изобретения специалистам в данной области техники. На чертежах элементы, не относящиеся к описанию, будут опущены для ясности.

Во всем описании, если однозначно не указано иное, слово "содержать" и его вариации, такие как "содержит" или "содержащий", следует понимать как подразумевающее включение указанных элементов, но не исключение каких-либо других элементов.

Слова, обозначающие степень, такие как "примерно", "по существу" и т.п., используются в настоящем описании в смысле "при или почти при, когда указаны допустимые отклонения при изготовлении, конструировании и использовании материалов, соответствующие указанным обстоятельствам", для предотвращения неправомерного использования недобросовестным нарушителем преимуществ описания изобретения, где точные или абсолютные цифры указаны для облегчения понимания изобретения. Термины "стадия чего-либо", которые используются во всем описании, не означают "стадия для".

На протяжении всего описания термин "сочетание", включенный в описание Маркуша, обозначает смесь или сочетание одного или нескольких из компонентов, стадий, операций и/или элементов, выбранных из группы, состоящей из компонентов, стадий, операций и/или элементов, описанных в группе Маркуша, и тем самым означает, что настоящее изобретение включает в себя один или несколько компонентов, стадий, операций и/или элементов, выбранных из группы Маркуша.

На протяжении всего описания выражение "A и/или B" означает "A, B или A и B".

На протяжении всего описания "Streptococcus pneumoniae", также называемый пневмококком, представляет собой грамположительную бактерию рода Streptococcus и относится к семейству Streptococcus, поскольку бактерии, по-видимому, образуют цепи, так как деление их клеток происходит с течением времени вдоль одной оси. Указанная бактерия известна как основная причина пневмонии.

В настоящем описании "Pep27" обозначает пептид, который состоит из 27 аминокислотных остатков и секретируется транспортерной системой vex, вызывая ингибирование роста и апоптоз. Более подробно, экспрессия pep27 индуцирует программируемую гибель клеток S. pneumoniae посредством передачи сигнала, запускаемого через мембраносвязанную гистидин-протеинкиназу vncS и регулятор ответа vncR, который является цитоплазматическим эффектором (Novak et al., 1999). Гены pep27 или кодируемые ими белки могут обозначаться по-разному, варьируя от одного серотипа Streptococcus pneumoniae к другому, также может существовать небольшое различие в нуклеотидной или пептидной последовательности pep27. Однако при условии, что он будет выполнять по существу описанную выше функцию, любой ген pep27 можно подвергнуть мутациям и использовать независимо от серотипов для получения аттенуированного штамма Streptococcus pneumoniae по настоящему изобретению. В частности, в настоящем изобретении можно использовать любой ген Streptococcus pneumoniae, который функционально совпадает с геном pep27. Более конкретно, ген pep27 по настоящему изобретению может представлять собой измененный в результате мутации ген, кодирующий пептидную последовательность pep27, описанную в SEQ ID NO: 1.

Используемый здесь термин "аттенуация" предназначен для обозначения модификации вирулентного штамма с получением менее вирулентного штамма или более слабого патогена. Такой аттенуированный штамм представляет собой штамм, обладающий значительно более низкой вирулентностью, связанной с клиническими заболеваниями, но при этом еще способный реплицироваться в организме хозяина. В частности, аттенуированный штамм по настоящему изобретению имеет такую низкую вирулентность или патогенность, которая позволяет вводить его в качестве вакцины. Более конкретно, штаммы пневмококка по настоящему изобретению ослаблены до такой степени, что они не могут вызывать клинические заболевания, но могут реплицироваться в организме хозяина. Аттенуированный мутант можно получить с помощью разных методов, таких как точечная мутация, обмен последовательностями между родственными вирусами или делеция нуклеотидов.

В настоящем описании термин "мутация" используется для обозначения всех действий, вызывающих изменение генетической функции гена. Более подробно, термин "мутация" относится к количественному или качественному изменению гена среди разных биологических вариаций.

В настоящем описании термин "аллергия" используют в применении к ряду расстройств, заболеваний или аномальных состояний, вызванных повышенной чувствительностью иммунной системы к определенным веществам, то есть чрезмерной реакцией иммунной системы на чужеродные вещества. Аллергические заболевания, против которых можно использовать композицию по настоящему изобретению, представляют собой заболевания, возникающие, в частности, в результате немедленной гиперчувствительности I типа и замедленной гиперчувствительности IV типа. Примеры гиперчувствительности I типа включают бронхиальную астму, ринит, атопический дерматит, конъюнктивит, тимпанит, крапивницу и анафилактический шок. Контактная гиперчувствительность, контактный дерматит, бактериальная аллергия, грибковая аллергия, вирусная аллергия, лекарственная аллергия, тиреоидит и аллергический энцефалит относятся к замедленной гиперчувствительности IV типа. Немедленная гиперчувствительность типа I делится на две стадии: на стадии 1 воздействие аллергена нарушает баланс между ответом Th1, которая характеризуется продукцией IL12 и IFN-γ, которые подавляют секрецию IgE и IgG1 и увеличивают секрецию IgG2a, и ответом Th2, который приводит к продукции IL-4, IL-5 и IL-13 при смещении Th2, так что IL-4 и IL-13 продуцируются в ответ на Th2-доминантный иммунный ответ, побуждая В-клетки продуцировать аллерген-специфический IgE, который, в свою очередь, связывается с поверхностью тучных клеток и базофилов, тем самым готовя их к развитию аллергии. Тучные клетки и базофилы, покрытые IgE, являются сенсибилизированными к аллергену; 2 стадия развития аллергии подразделяется на ранний ответ и поздний ответ. В раннем ответе тучные клетки, активированные при повторном воздействии аллергена, подвергаются дегрануляции, в ходе которой клетки высвобождают гистамин, метаболиты липидов, цитокины и т.д. из своих гранул, вызывая расширение сосудов и т.д. В позднем ответе нейтрофилы, эозинофилы, макрофаги, клетки Th2, базофилы и т.д. проникают в соответствующие ткани, вызывая воспаление, проявляющееся в виде атопического дерматита, ринита, астмы и т.п.

В настоящем описании термин "профилактика" относится ко всем действиям, которые подавляют или задерживают начало заболевания путем введения композиции в соответствии с настоящим изобретением.

В настоящем описании термин "лечение" или "лечить" относится ко всем действиям, предпринимаемым для улучшения или полезного изменения симптома, связанного с заболеванием, путем введения композиции в соответствии с настоящим изобретением.

В настоящем описании термин "вакцина" относится к биологическому препарату, содержащему антигенное вещество, напоминающее микроорганизм или вирус, вызывающий заболевание, и способное обеспечить активный приобретенный иммунитет против такого заболевания. Вакцины часто получают из ослабленных или убитых бактерий или вирусов. Введение вакцин называют вакцинацией и проводят с целью обеспечения искусственно приобретенной иммуногенности против конкретной инфекции. При стимуляции вакциной иммунная система индивидума активируется и начинает вырабатывать антитела. Сенсибилизация сохраняется, и при повторном заражении антитела могут эффективно генерироваться в течение короткого времени, обеспечивая подавление заболевания. Между тем, благодаря принципу иммунной толерантности, вакцина, содержащая аттенуированный Streptococcus pneumoniae согласно настоящему изобретению, может не только защищать от конкретного антигенного вещества, но также проявлять профилактическое и терапевтическое воздействие на широкий спектр заболеваний, включая вирусные и бактериальные инфекционные заболевания, в отличие от обычных вакцин.

Термин "ermB", используемый в данном документе, обозначает ген, который обеспечивает устойчивость к макролидам. Макролиды представляют собой класс заменителей пенициллина в терапии заболеваний, вызываемых Streptococcus pneumoniae, и включают эритромицин, кларитромицин и азитромицин.

Далее приводится подробное описание фармацевтической композиции, содержащей аттенуированный штамм Streptococcus pneumoniae в соответствии с настоящим изобретением, и ее применение для профилактики или лечения воспалительных заболеваний, а также респираторных вирусных или бактериальных инфекционных заболеваний со ссылкой на иллюстративные варианты осуществления и чертежи. Однако настоящее описание не следует понимать как ограниченное иллюстративными вариантами осуществления и чертежами.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики или лечения воспалительных заболеваний, респираторных вирусных инфекционных заболеваний, инфекционных заболеваний, вызванных бактериями, отличными от Streptococcus pneumoniae, причем композиция содержит ослабленный штамм Streptococcus pneumoniae. Например, фармацевтическая композиция может включать вакцинную композицию.

Согласно варианту осуществления, аттенуированный штамм Streptococcus pneumoniae может представлять собой штамм, из которого удален весь ген pep27, или его часть. Например, могут быть удалены, без ограничения, нуклеотидные остатки в положениях с 1 по 53 нуклеотидной последовательности pep27, описанной в SEQ ID NO: 1.

В соответствии с вариантом осуществления аттенуированный штамм Streptococcus pneumoniae может содержать мутантный ген pep27, в котором нуклеотидные остатки в положениях с 1 по 53 нуклеотидной последовательности pep27, описанной в SEQ ID NO: 1, удалены и замещены кассетой ermB, однако настоящее изобретение не ограничивается таким штаммом. Например, аттенуированный штамм Streptococcus pneumoniae может представлять собой аттенуированный штамм Streptococcus pneumoniae, содержащий мутантный ген pep27, раскрытый в патенте Кореи № 10-1252911.

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения воспалительные заболевания могут быть выбраны, без ограничения, из астмы, бронхита, ринита, воспалительных заболеваний кишечника, гастроэнтерита, колита, болезни Крона, панкреатита, атеросклероза и артрита. Например, профилактика или лечение воспалительных заболеваний может быть результатом снижения экспрессии гена, связанного с воспалением, такого как ген, связанный с воспалением толстой кишки. Воспалительные заболевания могут быть связаны, например, с кишечными и респираторными инфекционными заболеваниями, но не ограничиваются ими.

Респираторные инфекционные заболевания могут быть вызваны респираторным вирусом, который может быть выбран, например, из метапневмовируса, коронавируса, энтеровируса, респираторно-синцитиального вируса, аденовируса, бокавируса, риновируса и вируса гриппа. Профилактика или лечение инфекционных заболеваний, вызванных респираторным вирусом, может быть результатом подавления репликации вирусов.

Например, вирус гриппа может представлять собой вирус гриппа A, B или C, не ограничиваясь их конкретными подтипами.

Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может обеспечивать неспецифическую по отношению к вирусу защитную функцию. В данном контексте фармацевтическая композиция может обеспечивать защитную функцию против вирусов гриппа и других вирусов, включающих в себя, без ограничения, респираторно-синцитиальный вирус и риновирус.

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения бактериальные инфекционные заболевания могут быть выбраны из заболеваний, вызываемых инфекцией грамположительных бактерий, грамотрицательных бактерий и других инфекционных бактерий, но не ограничиваются ими. Например, профилактика или лечение бактериальных инфекционных заболеваний может быть следствием подавления инфекции грамположительных бактериальных и/или грамотрицательных бактерий.

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения грамположительные бактерии могут быть выбраны из Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Clostridium tetani и Bacillus anthracis, тогда как грамотрицательные бактерии могут быть выбраны из Salmonella spp. Shigella, Klepsiella pneumoniae, E.coli и Vibrio cholerae, но не ограничиваются ими. Например, грамположительные бактерии могут представлять собой Staphylococcus aureus.

В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может обеспечивать иммунизацию независимым от серотипа образом, но не ограничивается этим. В соответствии с настоящим описанием, фармацевтическая композиция, которая обеспечивает иммунизацию независимым от серотипа образом, представляет собой фармацевтическую композицию, которая индуцирует продукцию антител независимо от антигенов, но не продукцию антител, специфичных для конкретных антигенов.

В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения аллергическое заболевание может представлять собой аллергическое респираторное заболевание, выбранное из астмы, аллергического ринита, синусита и хронического обструктивного заболевания легких, но не ограничивается ими.

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения примеры аллергического заболевания включают, без ограничения, пищевую аллергию, аллергический тимпанит, анафилактический шок, контактную гиперчувствительность, аллергический контактный дерматит, бактериальную аллергию, грибковую аллергию, вирусную аллергию, лекарственную аллергию и аллергический энцефалит, помимо крапивницы, конъюнктивита, аллергии на пыльцу и атопии.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может подавлять продукцию цитокина Th1 и/или цитокина Th2, которые оба ответственны за иммунную гиперчувствительность. В соответствии с данным описанием цитокин Th1 может быть выбран из интерферона-гамма (IFN-γ), фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) и интерлейкина-12 (IL-12), а цитокин Th2 может быть выбран из интерлейкина-4 (IL-4), интерлейкина-5 (IL-5) и интерлейкина-13 (IL-13), без каких-либо ограничений.

Уровни цитокина Th1 и/или цитокина Th2 можно измерять в жидкостях организма, таких как жидкость бронхоальвеолярного лаважа или сыворотка, без каких-либо ограничений.

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может быть неинвазивной для легкого, селезенки, крови или головного мозга без каких-либо ограничений. Используемый здесь термин "неинвазивный" означает, что фармацевтическая композиция не проникает в другие системные участки, отличные от органов, тканей и клеток, в которые непосредственно вводят фармацевтическую композицию, или, несмотря на проникновение в другие системные участки, быстро выводится из них, в отличие от термина "инвазивный", который относится к композиции, способной проникать в другие системные участки, отличные от органов, тканей и клеток, в которые непосредственно вводят фармацевтическую композицию, таким образом, повреждая организм человека.

Используемый здесь термин "введение" предназначен для обозначения введения композиции по настоящему изобретению индивидууму конкретным надлежащим способом. Для введения композиции по настоящему изобретению можно использовать любой способ, обеспечивающий доставку композиции в целевую ткань. Например, введение можно осуществлять, без ограничения, пероральным, внутрибрюшинным, внутривенным, внутримышечным, подкожным, внутрикожным, интраназальным, внутрилегочным, интраректальным, внутрипузырным, трансдермальным и внутрислизистым способами.

В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию можно вводить, без каких-либо ограничений, внутрибрюшинным или интрамукозальным способом. Местоположение слизистой оболочки, в которую вводят фармацевтическую композицию, конкретно не ограничивается. Специалист в данной области может правильно выбрать среди участков тела местоположение для введения через слизистую оболочку.

В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может быть сконфигурирована, без каких-либо ограничений, для введения через слизистую оболочку носоглотки. Вакцинацию через слизистую оболочку носоглотки можно проводить, например, без ограничения, с использованием аэрозоля или капель.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, обладающая эффективной иммуногенностью в отношении индивидуума даже после введения через слизистую оболочку, позволяет устранить недостаток обычных композиций, которые нужно вводить подкожно с помощью шприца, и имеет преимущество перед обычными композициями с точки зрения введения детям, которые боятся инъекций шприцем, но без каких-либо ограничений. Нет никаких ограничений по индивидууму, которому можно вводить фармацевтическую композицию по настоящему изобретению. Индивидуум может включать в себя, без ограничения, млекопитающих, таких как люди, крысы, мыши, домашние птицы и т.д. Кроме того, вакцинную композицию по настоящему изобретению нужно вводить в фармацевтически эффективном количестве. Фармацевтически эффективное количество композиции по настоящему изобретению варьирует в зависимости от пола, площади поверхности тела и возраста пациента, вида и тяжести заболевания, чувствительности к лекарству, способа и частоты введения, скорости выведения, времени введения, продолжительности лечения, типа клеток-мишеней, уровня экспрессии и других факторов, хорошо известных в области фармацевтики, которые могут быть легко определены специалистами в данной области.

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может дополнительно содержать, без каких-либо ограничений, фармацевтически приемлемый носитель или адъювант.

Примеры носителя, подходящего для применения в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включают, без ограничения, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, камедь акации, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, аморфную целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло.

В настоящем изобретении можно использовать, без ограничения, любой адъювант, обычно используемый в данной области техники. Примеры адъюванта включают, без ограничения, связывающую субъединицу холерного токсина, соли алюминия, липидную эмульсию (MF-59), синтетический детергент (Tween), микросферы, липосомы и мукоадгезивные полимеры. Также можно использовать новые формы адъювантов, если они уже разработаны.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно получить, без ограничения, в виде лекарственных форм, например, пероральных лекарственных форм, таких как порошки, гранулы, таблетки, капсулы, суспензии, эмульсии, сиропы, аэрозоли и т.д., лекарственных форм для наружного применения, суппозиториев или стерильных инъекций, с помощью традиционных способов. Более подробно, для получения композиции можно использовать, без каких-либо ограничений, традиционные разбавители или вспомогательные вещества, такие как наполнители, средства, увеличивающие объем, связующие средства, увлажнители, дезинтегрирующие средства, поверхностно-активные вещества и т.д.

Например, твердые средства, обеспечивающие пероральное введение композиции по настоящему изобретению, могут находиться в виде таблеток, пилюль, порошков, гранул, капсул и т.п. Эти твердые средства получают с использованием по меньшей мере одного вспомогательного вещества, такого как крахмал, карбонат кальция, сахароза, лактоза или желатин. Кроме того, к простому наполнителю можно добавить смазывающее средство, такое как стеарат магния, тальк и т.п. Жидкие средства, обеспечивающие пероральное введение, включают суспензии, растворы для внутреннего применения, эмульсии, сиропы и т.п. В дополнение к простому традиционно используемому разбавителю, такому как вода или жидкий парафин, жидкие средства, обеспечивающие пероральное введение композиции по настоящему изобретению, могут содержать, без ограничения, разные жидкие вещества, такие как увлажнители, подсластители, ароматические средства, консерванты и т.п.

Парентеральные лекарственные формы композиции по настоящему изобретению могут включать стерильные водные растворы, неводные растворы, суспензии, эмульсии, лиофилизированные формы и суппозитории. Что касается неводных растворов и суспензий, они могут быть получены с использованием пропиленгликоля, полиэтиленгликоля, растительных масел, таких как оливковое масло, или инъецируемых сложных эфиров, таких как этилолеат, без каких-либо ограничений.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Лучшего понимания настоящего изобретения можно достичь с помощью нижеследующих примеров, которые приведены для иллюстрации, однако их не следует рассматривать как ограничение настоящего раскрытия.

[ПРИМЕР 1] Анализ ингибиторного потенциала аттенуированного штамма Streptococcus pneumoniae THpep27 в отношении воспалительного заболевания, респираторного вирусного инфекционного заболевания или инфекционного заболевания, вызванного бактериями, отличными от Streptococcus pneumoniae

1. Материалы и методы

Получение аттенуированного штамма Streptococcus pneumoniae THpep27

Мутантный штамм Streptococcus pneumoniae THpep27, используемый в примерах настоящего изобретения, представляет собой штамм, описанный Choi SY et al. (Inactivated pep27 mutant as an effective mucosal vaccine against a secondary lethal pneumococcal challenge in mice. Clin Exp Vaccine Res. 2013), который аналогичен pep27-мутантному штамму Streptococcus pneumoniae, раскрытому в корейском патенте № 10-1252911, за исключением того, что для его селекции не используют маркер устойчивости к эритромицину (ermAM).

Чеширскую кассету (инвентарный номер GenBank FJ981645), несущую маркер устойчивости к эритромицину (ermAM), который можно использовать в качестве временного маркера селекции, амплифицируют с использованием праймеров (5'-TGG CTT ACC GTT CGT ATA G-3'(SEQ ID NO: 2) и 5'-TCG ATA CCG TTC GTA TAA TGT-3'(SEQ ID NO: 3)), которые были предоставлены доктором Дональдом Моррисоном (Университет Иллинойса в Чикаго), и лигируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с вышестоящими и нижестоящими последовательностями, амплифицированными с использованием праймеров (5'-TCT CTA TCG GCC TCA AGC AG-3'(SEQ ID NO: 4) и 5'-CTA TAC GAA CGG TAA GCC A GAT TTT CAC CAC TGC TTT CG-3'(SEQ ID NO: 5) и 5'-ACA TTA TAC GAA CGG TAT CGA AAG GCC AGC AAG AGA CTA-3' (SEQ ID NO: 6) и 5'-CTG CGA GGC TTG CAC TGT AG-3'(SEQ ID NO: 7) из геномной ДНК D39, которая служит в качестве матрицы. Затем продукт лигирования используют для трансформации D39 с получением мутанта pep27.

Чеширскую кассету разрезают путем добавления 1% L-фукозы (Sigma, St. Louis, MO, USA). Обработанные фукозой культуры распределяют по чашкам с кровяным агаром THY с получением отдельных колоний. Присутствие Чеширских кассет в каждой колонии подтверждают методом ПЦР с использованием следующих праймеров: 5'-TCT CTA TCG GCC TCA AGC AG-3' (SEQ ID NO: 8) и 5'-CTG CGA GGC TTG CAC TGT AG-3' (SEQ ID NO: 9). Мутантную (THpep27) последовательность подтверждают нуклеотидным секвенированием (Cosmo, Seoul, Korea), а также методом иммуноблоттинга с использованием антитела против Pep27 (данные не показаны).

Чтобы подтвердить мутацию THpep27 на уровне РНК, РНК выделяют из бактерий на ранней экспоненциальной фазе с использованием традиционного метода горячего фенола. После удаления ДНК с помощью ДНКазы I (Takara, Tokyo, Japan) один микрограмм бактериальной РНК подвергают обратной транскрипции в кДНК с использованием случайных праймеров (Takara). ПЦР с обратной транскрипцией проводят с использованием рекомендуемого праймера в соответствии с инструкциями производителя (Super Bio, American Building Restoration Products Inc., Franklin, WI, USA).

Получение других бактериальных штаммов

Штаммы Streptococcus pneumoniae, используемые в настоящем описании, приведены в Таблице 1 ниже.

[Таблица 1]

Штамм	Характеристика	Ссылка
D39	Инкапсулированный тип, серотип 2	(Avery et al., 1944)
A66.1	Серотип 3	(McDaniel et al., 1984)
TIGR4	Серотип 4	(Aaberge et al., 1995)
BG7322	Серотип 6B	(Briles et al., 1992)
THpep27	D39 △pep27:: Cheshire ermB Emr	(Choi et al., 2013)

Штаммы S. pneumoniae серотипа 2 (D39) дикого типа, серотипа 3 (A66.1), серотипа 6B (BG7322) и мутантный штамм THpep27 (D39 Δpep27) культивируют способом, обычно используемым в лаборатории (Kim et al., 2012). Streptococcus pneumoniae культивируют в течение ночи при 37°С на чашках с кровяным агаром и затем при 37°С в течение 3 часов в бульоне Тодда-Хьюитта с добавлением 0,5% дрожжевого экстракта (THY; Difco Laboratories). Каждую из культур штаммов Streptococcus pneumoniae надлежащим образом разбавляют и вводят интраназально (т.е.) в количестве 10 мкл мышам CD1.

S. aureus (ATCC 25923) и K. pneumoniae (ATCC 9997), которые были приобретены в Корейском центре культур микроорганизмов (KCCM, Seoul), культивируют в течение ночи при 37°С в бульоне с сердечно-мозговым экстрактом (BHI), содержащем дефибринированную овечью кровь, и затем переносят в свежий бульон BHI, в котором бактерии культивируют при 37°С до OD₅₅₀=0,5.

Штамм вируса гриппа A/California/04/2009 (H1N1) культивируют в яйцах, как описано ранее (Shim et al., 2013).

Исследование инфекции in vivo

Четырехнедельных самцов мышей CD1, BALB/c (Orient, Korea) используют для экспериментов по инфицированию. Использование животных в экспериментах одобрено Комитетом по этике отношений к животным Университета Сонгюнгван в соответствии с принципами Корейского закона о защите животных.

В исследовании эффективности вакцины мышей вакцинируют интраназально (и.н.), используя 1×10⁷-1×10⁸ КОЕ штамма Δpep27, каждые одну или две недели в общей сложности три раза и измеряют время выживания. Через одну-две недели после последней иммунизации мышам интраназально вводят 1×10⁷-1×10⁸ вирулентного штамма D39 или 6B. Выживание зараженных мышей регистрируют четыре раза в день в течение первых пяти дней, два раза в день в течение следующих пяти дней и один раз в день в течение до 14 дней после заражения.

Для оценки способности к ингибированию колонизации мышам интраназально инокулируют 1×10⁷-1×10⁸ КОЕ штамма Δpep27 каждые две недели в общей сложности три раза. Через одну-две недели после последней вакцинации мышей заражали 5×10⁶-1×10⁷ КОЕ Streptococcus pneumoniae. После умерщвления мышей в заранее установленное время из них удаляли гортань в асептических условиях и гомогенизируют ее с помощью гомогенизатора (PRO Scientific Inc., Oxford, CT, USA, модель 200 с двойной изоляцией) при максимальной скорости в 1 мл PBS (в отсутствии крови) на льду и получают серийные разведения в стерильном PBS. Разведения распределяют по чашкам с кровяным агаром, содержащим 5-10 мкг/мл гентамицина, чтобы провести отбор Streptococcus pneumoniae. Затем чашки инкубируют при 37°С в течение примерно 18 часов в атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% СО₂, и считают образовавшиеся колонии. Данный эксперимент проводят дважды и используют средние значения результатов измерения.

Чтобы проверить, может ли вакцина Δpep27 защитить от инфекции S. aureus и K. pneumoniae, мышей иммунизируют интраназально три раза Δpep27. Через десять дней после последней иммунизации Δpep27 мышей интраназально инфицируют суспензией 1×10⁸ или 2×10⁶ КОЕ S. aureus или K. pneumoniae в 50 мкл PBS. Затем, через 24 и 48 часов после заражения, собирают легочные и носовые лаважи, гомогенизируют и серийно разводят до подходящей степени. Серийные разведения помещают на чашки с кровяным агаром BHI, культивируют в течение ночи при 37°С и считают клетки.

Эксперимент по инфицированию вирусом и Streptococcus pneumoniae

Мышей (самцы BALB/c, 6-8 недель, Koatech, Korea) иммунизируют суспензией, содержащей примерно 1×10⁸ КОЕ Δpep27 в 50 мкл PBS, еженедельно в общей сложности три раза. Через десять дней после последней иммунизации мышей интраназально инфицируют суспензией вируса гриппа H1N1 в 50 мкл PBS в смертельной дозе (LD) 0,02 с последующим ежедневным мониторингом массы тела. Через 10-12 дней после заражения гриппом мышей интраназально инфицируют суспензией 1×10⁸ КОЕ D39 в 50 мкл PBS и измеряют выживаемость.

Выделение спленоцитов

Мышей интраназально иммунизируют 1×10⁷-1×10⁸ КОЕ Δpep27 (мутантный штамм THpep27) каждые две недели в общей сложности три раза. Через неделю после последней иммунизации выделяют селезенку и полученные спленоциты обрабатывают антителами против CD3e (5 мкл/мл; eBioscience) и антителами против CD28 (3 мкл/мл; eBioscience) с целью стимуляции Т-лимфоцитов (Bashour et al., 2014). После инкубации в течение 24 часов клетки собирают и в культуральной среде измеряют уровни цитокинов.

Измерение цитокинов

Уровни интерлейкина (IL)-17, фактора некроза опухоли (TNF)-α, интерферона (IFN)-γ, IL-4 и IL-10 в бронхоальвеолярном лаваже (BAL), сыворотке и спленоцитах измеряют с использованием набора для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя.

Титр антител IgG и определение подтипа Ig

Мышей интраназально иммунизируют 1×10⁷-1×10⁸ КОЕ Δpep27 каждые две недели в общей сложности три раза. Через семь дней после последней иммунизации получают образцы сыворотки крови из ретро-орбитального синуса и хранят при -80°С до проведения ELISA. Антитела титруют, как описано ранее (Roche et al., 2007; Kim et al., 2012; Cohen et al., 2013), и определяют подтипы Ig с использованием набора ELISA для изотипирования мышиных Ig (eBioscience, USA).

В исследованиях коинфекции титры IgG в сыворотке измеряют методом ELISA с использованием 96-луночных иммунопланшетов, покрытых лизатами Streptococcus pneumoniae (D39, A66.1 и BG7322), или капсулами серотипа 2, или очищенным белком PspA (1 мкг/мл) в PBS (Kim et al., 2012; Cohen et al., 2013).

Подсчет вирусов и бактерий в легких

После интраназальной иммунизации Δpep27 мышей (BALB/c четыре/группы) инфицируют вирусом гриппа H1N1 или H3N2, как описано выше. После этого легочные образцы собирают и анализируют, как сообщалось ранее (Shim et al., 2013).

Через пять дней после заражения вирусом гриппа легкие мышей пропускают через сито 70 мкм с последующим центрифугированием. Полученный таким образом супернатант хранят при -80°С до титрования. Для титрования вируса высевают суспензию клеток MDCK в среде MEM (1% БСА, не содержащей IgG, 1× пенициллин-стрептомицин) при плотности 2×10⁴ клеток/лунку в 96-луночные планшеты, которые затем инкубируют при 37°С в течение 4 часов. После этого культивируемые клетки инфицируют 2-кратными серийными разведениями супернатанта гомогената легкого и инкубируют в течение ночи. Затем после удаления супернатанта определяют титр вируса с использованием антитела против гриппа A с TCID₅₀/мл (Wu et al., 2015).

ПЦР в режиме реального времени

Из выделенных и культивированных перитонеальных макрофагов выделяют общую РНК с использованием RNAiso plus (TAKARA, Japan). ОТ-ПЦР проводят с использованием набора для одностадийной ОТ-кПЦР (Enzynomics, Корея). Используют ген-специфические праймеры со следующими последовательностями: ген IL-10 (прямой [F]: 5'-AGC CAC CTC ATG CTA GAG C (SEQ ID NO: 10), обратный [R]: 5'-GCC TGG TCT GGC ATC ACT AC (SEQ ID NO: 11)); ген IL-1β (F: 5'-CTG GTG TGT GAC GTT CCC AT (SEQ ID NO: 12), R: 5'-TGT CGT TGC TTG GTT CTC CT (SEQ ID NO: 13)); и ген TNF-α (F: 5'-CAC AAG ATG CTG GGA CAG TGA (SEQ ID NO: 14), R: 5'-TCC TTG ATG GTG GTG CAT GA (SEQ ID NO: 15)). Ген GAPDH (праймер F: 5'-TGC ATC CTG CAC CAC CAA (SEQ ID NO: 16), R: 5'-TCC ACG ATG CCA AAG TTG TC (SEQ ID NO: 17)) используют в качестве контроля.

ПЦР проводят по следующей программе: выдерживание; 95°C, 10 мин; 40 циклов 95°C, 15 сек; 55°C, 30 сек, и 72°C, 30 сек; кривая плавления (95°C 15 сек; 60°C, 1 мин; 95°C, 15 сек).

Высокопроизводительное секвенирование

Чтобы измерить экспрессию генов, индуцированную в легких и селезенке после иммунизации Δpep27, мышей (Balb/c, возраст 4 недели) интраназально вакцинируют 1×10⁷-1×10⁸ КОЕ Streptococcus pneumoniae Δpep27 (THpep27: Choi et al., 2013) без анестезии каждые две недели в общей сложности три раза. РНК выделяют из легких и селезенки с помощью реагента тризол (Invitrogen) и конструируют библиотеки секвенирования с использованием 500 нг общей РНК. Для использования в последующем секвенировании библиотеку РНК конструируют с использованием набора для получения библиотек LEXOGEN Quant-Seq (№ по кат. 001.24) в соответствии со стандартным протоколом. Экспрессию гена измеряют методом высокопроизводительного секвенирования с использованием Illumina NextSeq 500.

Стадия обработки ДНК

Распознавание азотистых оснований проводят с помощью программного обеспечения Illumina Casava1.8. Прочтения последовательностей организовывают для адаптерных последовательностей с последующей фильтрацией прочтений последовательностей низкой сложности и низкого качества с помощью fastx_trimmer. Полученные прочтения картируют на полном геноме mm10, используя Bowtie2. Извлечение прочтения и нормализацию данных проводят с использованием edgeR. Эксперименты и анализ системной биологии с использованием Inwayuity Pathway Analysis проводят в e-Biogen (Seoul, Korea).

Данные анализа экспрессии генов помещают в NCBI [регистрационный номер GEO GSE93718] (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

Измерение защитного потенциала против воспалительного заболевания кишечника

После анестезии путем внутрибрюшинной инъекции 100 мкл кетамина мышей (самцы C57BL/6, возраст 4 недели) интраназально вакцинируют 1×10⁷-1×10⁸ КОЕ Δpep27 еженедельно в общей сложности три раза. У мышей измеряют массу тела и случайным образом распределяют их на четыре экспериментальные группы по две на группу. В серии экспериментов используют следующие экспериментальные группы мышей: контроль, не обработанные декстрансульфатом натрия (DSS), экспериментальный контроль, обработанные только 5% DSS, экспериментальная группа, иммунизированные только Pep27, и группа, обработанная Pep27+5% DSS. Мышам дают DSS (5%, масс/объем), имеющий среднюю молекулярную массу 5000 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA), в течение 14 дней подряд для индукции энтероколита (Wirtz et al., 2007). В связи с этим раствор DSS ежедневно заменяют свежим. Мышам контрольной группы дают пить только водопроводную воду.

Всем мышам в контрольной группе и экспериментальной контрольной группе вводят носитель (физиологический раствор) в количествах, эквивалентных количествам, вводимым группам, получающим DSS, таким же способом, как и группе, получающей DSS, в течение периода исследования.

<Анализ иммунизации ΔPep27 на ингибирование DSS-индуцированного энтероколита у мышей>

Образцы кишечника с воспалительным заболеванием (IBD)

Через четырнадцать дней после введения 5% DSS экспериментальных животных подвергают эвтаназии путем асфиксии CO₂ с последующей лапаротомией. Всю толстую кишку от слепой кишки до заднего прохода удаляют и разделяют на проксимальный, средний и концевой участки. Отобранные ткани отделяют, промывают фосфатно-солевым буфером (PBS) и хранят при -80°C до анализа.

Количественное определение фрагментов толстой кишки (индекс активности заболевания: DAI)

Прогрессирование колита ежедневно оценивают путем измерения количества питья, потери веса, консистенции стула, ректального кровотечения, наличия общей крови в стуле. Также оценивают клинические симптомы. Мышей также ежедневно проверяют на заболеваемость (усталость и вялость).

Указанные параметры оценивают в соответствии с критериями, предложенными ниже, которые используют для расчета среднесуточного индекса активности заболевания (DAI) для каждого животного, как предлагалось в предыдущих отчетах (Wirtz et al., 2007; Jawhara and Poulain, 2007).

Кроме того, воспаление толстой кишки оценивают невооруженным глазом путем измерения длины ободочной кишки, которая остается нерастянутой и простирается от сигмовидного соединения до анального края. Подробные патогенные заключения дают для каждой группы. Систему, в которой ткани визуально оценивают по шкале от 0 до 5 баллов, используют для определения времени, за которое орган, пораженный наиболее сильным воспалением, претерпевает изменение, а также степени изменения.

Систему оценки патологии, проверенную ранее (Jawhara and Poulain, 2007; Xu et al., 2007), модифицируют для оценки колита. Все эксперименты повторяют не менее двух раз и результаты рассчитывают для всех групп следующим образом:

1) Потеря массы: без изменений, 0; <5%, 1; 6-10%, 2; 11-20%, 3; >20%, 4;

2) Консистенция стула: нормальные или хорошо сформированные катыши, 0; тестообразные жгуты, не прилипающие к анусу (не липкие, пастообразные, полусформировавшиеся), 1; липкая жидкость, которая остается прилипшей к анусу, 2; липкий с кровью, 3; совсем жидкий, кровянистый или отсутствие способности к дефекации через 10 мин, 4;

3) Ректальное кровотечение: нет крови, 0; видимая кровь в анусе или прямой кишке, 1; видимая кровь на шерсти, 2; значительное кровотечение из прямой кишки, 4;

4) Общий вид: нормальный, 0; покрытые слизью, 1; вялые с пилоэрекцией, 2; вялые и сгорбленные, 3; неподвижные и слабые, 4.

Статистический анализ

Все данные выражены в виде средних значений независимых измерений с двойными повторами ± стандартное отклонение. Статистическое сравнение проводят с помощью одностороннего анализа ANOVA с последующим тестом Бонферрони. Все значения P<0,05 считают значимыми.

2. Результаты

2-1. Случай № 1: анализ HTS и системной биологии указывает на способность к защите от основных поражений.

2-1-1. Иммунизация Δpep27 защищает мышей от разных поражений.

Системный биологический анализ в легких показывает, что интраназальная иммунизация Δpep27 защищает от гастроэнтерита и предотвращает аномальное изменение состояния толстой кишки (фиг. 1). Кроме того, системный биологический анализ в селезенке показывает, что иммунизация Δpep27 защищает от инфекции вируса гриппа (фиг. 2).

2-1-2. Иммунизация Δpep27 индуцирует клетки Treg.

Системный биологический анализ в легких также показывает, что иммунизация Δpep27 индуцирует экспрессию TGF-β в легких (фиг. 3). На фиг. 3 зеленый цвет означает подавление экспрессии генов, а красный означает индукцию экспрессии генов. Чтобы подтвердить индукцию Treg в результате инокуляции Δpep27, спленоциты инокулированных мышей анализируют с помощью FACS. Как можно видеть, иммунизация Δpep27 увеличивает популяцию клеток Th2, Th17 и Treg, однако клетки Th1 остаются практически неизменными (фиг.4), что позволяет предположить, что такие индуцированные клетки Treg играют определенную роль в иммунной толерантности. Чтобы подтвердить индукцию Treg, измеряют уровни цитокинов в спленоцитах и сыворотке. В соответствии с вышеизложенным, наблюдается значительная индукция интерферона (IFN)-γ, IL-4, IL-17 и IL-10 в селезенке (фиг.5). Кроме того, значительная индукция IFN-γ, IL-17 и IL-10 также наблюдается в сыворотке, но без существенного изменения уровня IL-4 (фиг. 6). Полученные результаты подразумевают, что индукция клеток Treg приводит к выработке противовоспалительного цитокина IL-10, что усиливает иммунную толерантность.

2-1-3. Индукция IL-10 в результате иммунизации Δpep27

Чтобы подтвердить иммунный толерантный ответ, измеряют уровни мРНК IL-10 и IL-17 в легочной жидкости и жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BAL). Соответственно, иммунизация Δpep27 значительно увеличивает уровни мРНК как IL-10, так и IL-17 в легких (фиг. 7 и 8).

2-1-4. Индукция анамнестической реакции в результате иммунизации Δpep27

Чтобы определить, вызывает ли интраназальная вакцинация анамнестическую реакцию, спленоциты собирают у иммунизированных мышей и анализируют на анамнестическую реакцию. Устанавливают, что иммунизация Δpep27 увеличивает популяцию Т-клеток центральной памяти (CD4, CCR7, CD62L) и Tfh-клеток памяти (CD4, CXCR5, CCR7) в селезенке (фиг. 9).

Чтобы подтвердить анамнестическую реакцию еще раз, измеряют титры антител разных подтипов сывороточных иммуноглобулинов. Как и ожидалось, иммунизация вакциной Δpep27 индуцирует экспрессию разных подтипов иммуноглобулинов, таких как IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3 (фиг. 10). Кроме того, уровень антител IgG против целых клеток пневмококка трех типов также значительно повышается при вакцинации (фиг. 11). Таким образом, подтверждают, что интраназальная вакцинация вызывает анамнестическую реакцию.

2-2. Случай 2: Защита от коинфекции вирусами гриппа

Streptococcus pneumoniae и вирус гриппа A (IAV) являются основными причинами респираторной инфекции (Bosch et al., 2013, Shak et al., 2013). Streptococcus pneumoniae или IAV сами вызывают респираторное заболевание, но смертность увеличивается в результате вторичных инфекций, возникающих после заражения вирусом гриппа (Mina and Klugman, 2013). Однако существующая в настоящее время пневмококковая полисахаридная конъюгатная вакцина, PCV 13, не может эффективно защищать от вторичной пневмококковой инфекции (Metzger et al., 2015).

2-2-1. Защита от вторичной пневмококковой инфекции в результате иммунизации Δpep27

Ранее было показано, что интраназальная инокуляция Δpep27 может индуцировать IgG и защищать мышей от гетерологичной пневмококковой инфекции (Kim et al., 2012). В настоящем изобретении проводят исследование, чтобы определить, может ли иммунизация Δpep27 повысить титры антител против целых бактериальных клеток, а также специфических антигенов. Результаты демонстрируют, что интраназальная инокуляция Δpep27 увеличивает титры IgG против штаммов капсульных серотипов 3 и 6В, а также целых клеток серотипа 2 (D39). Это увеличение значительно превышает уровень, наблюдающийся у неиммунизированных контролей, свидетельствуя о том, что иммунизация Δpep27 индуцирует гуморальный иммунитет против гомологичных и гетерологичных пневмококковых штаммов (фиг. 11). Что касается уровней цитокинов после заражения гриппом, все уровни INF-γ, TNF-α и IL-1β в иммунизированных экспериментальных группах значительно ниже, чем у неиммунизированных контролей, свидетельствуя о том, что иммунизация Δpep27 индуцирует иммунную толерантность 12). Когда были определены титры IgG против специфических антигенов, таких как белок PspA и капсульный полисахарид серотипа 2, оказалось, что иммунизация Δpep27 повышает титры антител против белка PspA, но не антител против капсульного полисахарида серотипа 2 (фиг. 13).

Чтобы исследовать защитный эффект интраназальной иммунизации Δpep27 против вторичной пневмококковой инфекции, мышей заражают 0,02 летальной дозой (LD50) вируса гриппа H1N1. Через десять дней после заражения вирусом гриппа мышей инфицируют вирулентным пневмококковым штаммом D39 и регистрируют уровень выживаемости. В то время как невакцинированные мыши (PBS/H1N1) умирают от пневмонии после инфекции D39, большинство назально иммунизированных мышей (THpep27/H1N1) успешно выживают после инфекции D39 (фиг. 14). Этот результат позволяет предположить, что интраназальная иммунизация Δpep27 может защитить мышей от вторичной пневмококковой инфекции, а также от инфекции вируса гриппа.

Если мышей инфицируют Streptococcus pneumoniae после интраназальной иммунизации, в легких всех вакцинированных мышей обнаруживают гораздо меньше бактерий, чем у невакцинированных контролей (фиг. 15), из чего можно сделать вывод, что интраназальная иммунизация Δpep27 также успешно защищает мышей от вторичной пневмококковой инфекции после гриппозной инфекции.

2-2-2. Снижение числа вирусов и бактерий в легких в результате иммунизации Δpep27

Чтобы установить, ослабляет ли иммунизация Δpep27 вирусную нагрузку вируса гриппа, определяют потерю массы тела после заражения вирусом гриппа. Интересно, что ни у одной из мышей, вакцинированных Δpep27, не наблюдается потеря массы после заражения гриппом, тогда как у невакцинированных мышей наблюдается значительная потеря массы (фиг. 16). Поскольку вакцинация Δpep27 защищает от потери массы в результате инфекции вируса гриппа, было проведено дополнительное исследование, чтобы проверить, может ли вакцинация Δpep27 влиять на репликацию вируса гриппа в легких путем определения TCID₅₀ легких у мышей, инфицированных гриппом. Удивительно, что у вакцинированных мышей были обнаружены значительно более низкие титры вируса в легких, чем у невакцинированных контрольных мышей (фиг. 17). Эти результаты демонстрируют, что интраназальная вакцинация Δpep27 не только защищает от пневмококковой инфекции, но также значительно ослабляет инфекцию вируса гриппа.

2-3. Случай 3: Защита от других бактериальных инфекций путем иммунизации Δpep27

2-3-1. Защита от инфекции грамотрицательных бактерий путем иммунизации Δpep27

Чтобы выяснить, может ли иммунизация Δpep27 предотвратить колонизацию других бактерий, мышей вакцинируют Δpep27, а затем инфицируют грамотрицательной бактерией Klebsiella pneumoniae с последующим подсчетом бактерий в тканях. Через двадцать четыре часа после заражения в легких и сыворотке у вакцинированных групп было обнаружено значительно более низкое число Klebsiella pneumoniae, чем у невакцинированных контролей (фиг. 18). Результаты демонстрируют, что вакцинация Δpep27 может предотвратить инфекцию грамотрицательных бактерий.

2-3-2. Защита от инфекции грамположительных бактерий путем иммунизации Δpep27

Чтобы снова исследовать, может ли вакцинация Δpep27 предотвратить колонизацию других бактерий, мышей вакцинируют Δpep27 и затем инфицируют грамположительной бактерией Staphylococcus aureus с последующим подсчетом жизнеспособных бактерий в тканях. Интересно, что в жидкости легочного и назального лаважа у животных, вакцинированных Δpep27, было обнаружено значительно меньше колоний, чем у невакцинированных контролей (фиг. 19). Этот результат демонстрирует, что вакцинация Δpep27 может предотвратить инфекцию других бактерий, таких как грамположительные бактерии.

2-4. Случай 4: защита от воспалительных заболеваний кишечника

Феномен пероральной иммунной толерантности исследуют при таких заболеваниях человека, как ревматоидный артрит (РА), аллергические заболевания, диабет, атеросклероз, колит (Faria and Weiner, 2005). Описано, что интраназальная инокуляция эффекторным белком (SseB), полученным из Salmonella, индуцирует кишечные и системные ответы IgA, Th1 и Th17, после чего бактериальные нагрузки в тканях кишечника и в селезенке уменьшаются даже при пероральной летальной инфекции (Pigny et al., 2016). Однако нигде ранее не сообщалось о введении интраназальных вакцин для защиты от воспалительных заболеваний кишечника.

2-4-1. Защита от воспалительных заболеваний кишечника путем вакцинации Δpep27

Чтобы исследовать, может ли вакцинация Δpep27 подавлять воспалительное заболевание кишечника, мышей иммунизируют интраназально вакциной с последующим индуцированием колита с помощью DSS. В результате эксперимента индекс активности заболевания ухудшается с девятого дня после добавления 5% DSS к питьевой воде, с сопутствующим значительным снижением массы тела у мышей. В то время как у мышей, получающих только 5% DSS, наблюдается значительная потеря массы, в экспериментальной группе, иммунизированной Δpep27 и получающей 5% DSS, снижение массы тела значительно меньше, чем в группе, получающей только DSS (фигура 20).

Сравнение оценок общего клинического индекса активности заболевания (p<0,05, односторонний ANOVA с последующим тестом Бонферрони, лечение DSS в течение 6-9 дней) демонстрирует, что группа, получающая только 5% DSS, набирает значительно более высокие баллы по консистенции стула, чем экспериментальная группа, получающая Δpep27+5% DSS (фигура 21). Таким образом, результаты показывают, что после начала DSS-индуцированного колита заболевание усугубляется в группе, получающей только DSS, с высоким показателем клинической активности заболевания, тогда как колит в вакцинированной группе был таким же легким, как и в нормальной группе.

Уменьшение длины толстой кишки используют в качестве маркера воспаления в модели колита, вызванного DSS. На практике длина толстой кишки в группах, получающих DSS, значительно снижена (фиг. 22). Соответственно, в группе, получающей DSS, значительно увеличивается отношение массы толстой кишки к длине толстой кишки, но в группе, вакцинированной Δpep27, наблюдается почти нормальное соотношение по сравнению с группой, получающей DSS (фиг. 23).

2-4-2. Ингибирование воспалительных цитокинов путем вакцинации Δpep27

Чтобы подтвердить восстановительный эффект вакцинации Δpep27 на воспаление кишечника, измеряют уровни мРНК цитокинов в толстой кишке. Результаты эксперимента показывают, что в группе, вакцинированной Δpep27, наблюдается значительное снижение уровня мРНК провоспалительного IL-1β по сравнению с неиммунизированным контролем (фиг. 24). Кроме того, интраназальная вакцинация подавляет уровни мРНК IL-17A, TNF-α и IL-6 по сравнению с неиммунизированным контролем (фиг. 24), демонстрируя, что интраназальная вакцинация ингибирует экспрессию цитокинов.

[Пример 2] Анализ ингибиторного потенциала аттенуированного штамма Streptococcus pneumoniae THpep27 в отношении аллергического заболевания

1. Материалы и методы

1.1. Аттенуированный штамм Streptococcus pneumoniae THpep27

Штамм Streptococcus pneumoniae Δpep27 представляет собой штамм, описанный Choi SY et al. (Inactivated pep27 mutant as an effective mucosal vaccine against a secondary lethal pneumococcal challenge in mice. Clin Exp Vaccine Res. 2013), который аналогичен pep27-мутантному штамму Streptococcus pneumoniae, раскрытому в корейском патенте № 10-1252911, за исключением того, что для его селекции не используют маркер устойчивости к эритромицину (ermAM).

Чеширскую кассету (инвентарный номер GenBank FJ981645), несущую маркер устойчивости к эритромицину (ermAM), который можно использовать в качестве временного маркера селекции, амплифицируют с использованием праймеров (5'-TGG CTT ACC GTT CGT ATA G-3'(SEQ ID NO: 2) и 5'-TCG ATA CCG TTC GTA TAA TGT-3'(SEQ ID NO: 3)), которые были предоставлены доктором Дональдом Моррисоном (Университет Иллинойса в Чикаго), и лигируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с вышестоящими и нижестоящими последовательностями, амплифицированными с использованием праймеров (5'-TCT CTA TCG GCC TCA AGC AG-3'(SEQ ID NO: 4) и 5'-CTA TAC GAA CGG TAA GCC A GAT TTT CAC CAC TGC TTT CG-3'(SEQ ID NO: 5) и 5'-ACA TTA TAC GAA CGG TAT CGA AAG GCC AGC AAG AGA CTA-3' (SEQ ID NO: 6) и 5'-CTG CGA GGC TTG CAC TGT AG-3'(SEQ ID NO: 7) из геномной ДНК D39, которая служит в качестве матрицы. Затем продукт лигирования используют для трансформации D39 с получением мутанта pep27.

Чеширскую кассету разрезают путем добавления 1% L-фукозы (Sigma, St. Louis, MO, USA). Обработанные фукозой культуры распределяют по чашкам с кровяным агаром THY с получением отдельных колоний. Присутствие Чеширских кассет в каждой колонии подтверждают методом ПЦР с использованием следующих праймеров: 5'-TCT CTA TCG GCC TCA AGC AG-3' (SEQ ID NO: 8) и 5'-CTG CGA GGC TTG CAC TGT AG-3' (SEQ ID NO: 9). Мутантную (THpep27) последовательность подтверждают нуклеотидным секвенированием (Cosmo, Seoul, Korea), а также методом иммуноблоттинга с использованием антитела против Pep27 (данные не показаны).

Чтобы подтвердить мутацию THpep27 на уровне РНК, РНК выделяют из бактерий на ранней экспоненциальной фазе с использованием традиционного метода горячего фенола. После удаления ДНК с помощью ДНКазы I (Takara, Tokyo, Japan) один микрограмм бактериальной РНК подвергают обратной транскрипции в кДНК с использованием случайных праймеров (Takara). ПЦР с обратной транскрипцией проводят с использованием рекомендуемых праймеров в соответствии с инструкциями производителя (Super Bio, American Building Restoration Products Inc., Franklin, WI, USA).

Полученный таким образом мутантный штамм Streptococcus pneumoniae THpep27 культивируют в бульоне THY (бульон Тодда-Хьюитта, содержащий 0,5% дрожжевого экстракта; Difco Laboratories) при 37°С до тех пор, пока OD₅₅₀ не достигнет 0,3 (1×10⁸ КОЕ/мл). Собранную бактериальную культуру промывают PBS и затем разводят отфильтрованным PBS до конечной концентрации 1×10⁸ КОЕ/50 мкл для использования при иммунизации.

1.2. Экспериментальные животные

Самок мышей BALB/c (пять недель, Orient, Korea) получают и затем перед использованием акклиматизируют в течение 7 дней в камере для животных. Смесь 4:1 кетамина (инъекция кетамина, Yuhan Corporation, Korea) и ксилазина (Rompun, Bayer Korea Ltd.) разбавляют в 2 раза PBS. Мышей анестезируют путем внутрибрюшинной инъекции 100 мкл разведенного раствора. После анестезии проводят заражение и вакцинацию и затем эксперименты с использованием животных в соответствии с принципами Комитета по этике отношений к животным Университета Сонгюнгван.

1.3. Анализ профилактического эффекта мутанта pep27 в отношении астмы

1) Мышей разделяют на три группы (n=7/группу): нормальная группа, получающая стерильную воду (PBS); группа, у которой индуцируют астму с использованием OVA (овальбумина) и которая затем получает стерильную воду; и группа, у которой астму индуцируют после вакцинации мутантом pep27 (Δpep27).

2) На 0, 7 и 14 день после начала эксперимента мышей анестезируют и интраназально (и.н.) вакцинируют Δpep27 в количестве 1×10⁸ КОЕ/50 мкл. На 38 и 49 дни после начала эксперимента мышей сенсибилизируют путем внутрибрюшинной инъекции 100 мкл сенсибилизирующего раствора, который получают путем перемешивания с 50 мкг OVA (альбумин из куриного яичного белка, Sigma Chemical Co., USA) и 2 мг квасцов (гидрат гидроксида алюминия, Thermo Co., USA) в 100 мкл 0,9% физиологического раствора (pH 4,0, Dyne Bio Inc., Korea) в течение 4 часов при 4°C. Затем каждую мышь заражают 25 мкл 0,4 мг/мл раствора OVA в физиологическом растворе каждый день в течение шести дней с 59 по 64 день путем добавления по каплям 12,5 мкл раствора в каждую из обеих интраназальных областей (в конечном счете OVA вводят в общем количестве 10 мкг/мышь), чтобы вызвать астму. Через двадцать четыре часа после последнего заражения OVA экспериментальных животных умерщвляют, собирали жидкость бронхоальвеолярного лаважа (BALF) и измеряют уровни цитокинов. Ткани легких разрезают, фиксируют и окрашивают гематоксилин-эозином (H&E) (фиг.25 и 26).

1.4. Анализ терапевтического эффекта в отношении астмы

1) Мышей разделяют на три группы (n=7/группу): нормальная группа, получающая стерильную воду (PBS); группа, у которой индуцируют астму с использованием OVA (овальбумина) (группа с индуцированной астмой); и группа, у которой индуцируют астму и затем проводят вакцинацию мутантом pep27 (Δpep27) (группа лечения астмы).

2) Группа с индуцированной астмой: Коротко говоря, все группы, кроме нормальной группы, сенсибилизируют на 0 и 10 день после начала эксперимента путем внутрибрюшинного введения 100 мкл сенсибилизирующего раствора, который получают путем перемешивания 50 мкг OVA (альбумина из куриного яичного белка, Sigma Chemical. Co., USA) и 2 мг квасцов (гидрат гидроксида алюминия, Thermo Co., USA) в 100 мкл 0,9% физиологического раствора (pH 4,0, Dyne Bio Inc., Korea) в течение 4 часов при 4°C. Десять дней спустя мышей заражают 25 мкл 0,4 мг/мл раствора OVA в физиологическом растворе каждый день в течение шести дней с 20 по 25 день путем введения 12,5 мкл раствора в каждую из обеих интраназальных областей (общее количество OVA составляет 10 мкг/мышь). Нормальной группе дают только физиологический раствор (фиг. 27А).

3) Экспериментальная группа лечения астмы: Через одну неделю после такой же обработки OVA, как и в пункте 2), мышей иммунизируют интраназально Δpep27 в количестве 1×10⁸ КОЕ/50 мкл один раз в неделю в общей сложности три раза. В течение трех недель лечения мышей обрабатывают и.н. OVA в дозе 10 мкг/25 мкл за три дня до введения вакцины три раза в неделю (всего 9 раз), чтобы вызвать астму. Через неделю после последней вакцинации мышей последний раз обрабатывают OVA и через 24 часа их умерщвляют (фиг. 27B).

1.5. Гистохимический анализ

Ткань легких и бронхов выделяют и фиксируют 10% (об./об.) формальдегидом с последующим блокированием парафином. Блокированные парафином ткани разрезают на срезы толщиной 4 мкм и затем окрашивают H&E. Окрашенные H&E ткани фотографируют с помощью оптического микроскопа. Гистохимический анализ был поручен KNOTUS Co., Ltd. (Korea) (фиг. 28).

1.6. Анализ цитокинов

Жидкость бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) собирают и измеряют в ней уровни цитокинов. Коротко говоря, трахею мыши обнажают, и в трахею вставляют катетер. Через катетер в бронхиолы медленно закапывают 1,0 мл PBS для BAL и отсасывают примерно 0,9 мл. Эту жидкость загружают как есть, а затем извлекают жидкость лаважа. Процедуру повторяют еще дважды, чтобы получить BALF общим объемом 0,8 мл. Полученный BALF центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут при 4°C. Затем супернатант отделяют как BALF для измерения уровня цитокинов и хранят при -70°C в морозильной камере до использования. Уровни цитокинов в BALF измеряют с использованием набора ELISA (ELISA Ready-SET-Go!, eBioscience, San Diego).

1.7. Статистика

Экспериментальные данные выражают в виде среднего значения±стандартное отклонение. Статистическую обработку для измерений цитокинов проводят с помощью одностороннего ANOVA. Статистическое сравнение каждой группы проводят по критерию Бонферрони (* P≤0,05; ** P≤0,01; *** P≤0,001). Все значения P<0,05 считают значимыми.

2. Результаты

2.1. Профилактическая эффективность мутанта pep27 (Δpep27) против астмы

2.1.1. Ингибирование индуцированной астмой секреции цитокинов путем вакцинации Δpep27

Измерение уровней цитокинов в альвеолах с использованием набора ELISA показало, что соответствующие уровни индуцирующих аллергию цитокинов IL-4, IL-5 и IL-13 (цитокин Th2; Cho et al., 2002) в группе, вакцинированной Δpep27, были значительно ниже, чем в группе с астмой, и примерно такими же низкими, как и в нормальной группе (фиг. 25).

2.1.2. Подавление отека дыхательных путей при астме путем вакцинации Δpep27

При аллергических заболеваниях дыхательных путей аллергены вызывают воспаление, делая дыхательные пути необычайно толстыми (фиг. 26, группа с астмой). После иммуногистохимического окрашивания воспалительных клеток (гематоксилин-эозин, HE) и бокаловидных клеток (иодная кислота-реактив Шиффа, PAS) при 400 увеличении наблюдают, что в группе, вакцинированной Δpep27, клетки характеризуются значительно меньшим воспалением, чем в группе с астмой, причем уровень воспаления аналогичен контрольному (фиг. 26, вакцинированная группа).

2.2. Терапевтическая эффективность мутанта pep27 (Δpep27) в отношении астмы

2.2.1. Терапевтическая эффективность вакцины Δpep27 обусловлена подавлением связанных с астмой цитокинов

Мышей иммунизируют вакциной Δpep27 один раз в неделю в общей сложности три раза и через одну неделю после последней иммунизации количественно определяют уровни цитокинов в BALF мышей (фиг. 27A). Уровни цитокинов Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) заметно повышены в группе с астмой, но примерно одинаковые в вакцинированной группе и в нормальной группе (фиг. 27B).

2.2.2. Терапевтическая эффективность вакцины Δpep27 обусловлена подавлением легочного воспаления

После завершения эксперимента легкие мышей окрашивают гематоксилин-эозином (HE). В группе, вакцинированной Δpep27 (C) наблюдается значительное подавление воспаления по сравнению с группой, в которой индуцирована астма (B). В частности, в вакцинированной группе наблюдается почти такая же морфология, что и в нормальном контроле (А), поскольку инфильтрация и мукозальная секреция воспалительных клеток около бронхов и кровеносных сосудов подавляются (фиг. 28).

3. Обсуждение

В статьях, в которых сообщается о профилактике/лечении астмы с помощью микроорганизмов, раскрыто, что вдыхание инактивированных Mycobacterium phlei подавляет гиперчувствительность бронхов у детей с умеренной астмой (Ming et al., 2013) и ингибирует экспрессию IL-23R, регулируя воспаление дыхательных путей, опосредованное γΔT-клетками, продуцирующими IL-17, и таким образом снимая астму (Ming et al., 2017). Кроме того, описано, что интраназальная иммунизация аттенуированным штаммом коклюша BPZE1 снижает у мышей аллергическое воспаление дыхательных путей и гиперчувствительность кожи к контакту и, следовательно, может использоваться для профилактики и лечения таких заболеваний (Li et al., 2012). Как описано, иммунизация дифтерийным или аттенуированным столбнячным токсином по отдельности или в сочетании с цельноклеточной вакциной против коклюша подавляет иммунные ответы Th2, индуцированные аллергеном на мышиной модели, и, таким образом, может использоваться для подавления воспаления дыхательных путей или гиперчувствительности ( et al., 2006).

Кроме того, инфекция Streptococcus pneumoniae индуцирует регуляторные Т-клетки, подавляя тем самым аллергические заболевания дыхательных путей (Preston et al., 2011). Кроме того, интраназальная иммунизация присутствующими в настоящее время в продаже конъюгатными вакцинами Streptococcus pneumoniae ингибирует прогрессирование аллергического заболевания дыхательных путей, но при внутримышечной инъекции не было получено никакого эффекта (Thorburn et al., 2010). Таким образом, было обнаружено, что инъекция полисахаридов и аттенуированного токсина Streptococcus pneumoniae в дыхательные пути подавляет аллергическое заболевание дыхательных путей и индуцирует регуляторные Т-клетки, которые ингибируют возникновение аллергических заболеваний дыхательных путей, в результате чего устраняются и подавляются иммунные ответы на аллергены (Thorburn et al. al., 2013). Тем не менее, поскольку все бактерии, используемые для профилактики и лечения астмы, очень токсичны, за исключением аттенуированного Bordetella pertussis, необходимо использовать инактивированные бактерии или их определенные компоненты. Кроме того, описано, что интраназальная иммунизация проявляет более высокий ингибирующий эффект на аллергические реакции дыхательных путей, чем подкожная иммунизация (Takabayashi et al., 2003).

Инфекция Bordetella pertussis индуцирует Th1-ответы (активацию IFN-γ) на моделях аллергических заболеваний дыхательных путей у мышей, которые могут усугублять воспаление (Ennis et al., 2004; Cho et al., 2002; Kumar et al., 2004). Следовательно, необходимо подавлять аллергические реакции, не повышая экспрессию IFN-γ. Измерение профилактических эффектов в отношении астмы после закапывания убитых Streptococcus pneumoniae в дыхательные пути показало, что индукция реакции Th1 происходит без значительного подавления уровней IL-5 и IL-13, поэтому экспрессия IFN-γ значительно повышена (Preston et al., 2007; Gibson et al., 2012; патент США № 8226959). То есть, несмотря на подавление ответов Th2, индукция ответов Th1 не может исключать возможность усугубления воспаления. Так, Gibson et al. (2012; патент США № 8226959) фокусируются на отдельных компонентах Streptococcus pneumoniae, которые оказывают ингибирующее действие на аллергические заболевания дыхательных путей.

Однако при использовании аттенуированного мутанта pep27 (Δpep27) по настоящему изобретению можно значительно подавлять экспрессию цитокинов Th2 (IL-13 и IL-4), а также цитокина Th1 (IFN-γ) до нормальных уровней, сходных с уровнями в нормальной группе с точки зрения гистологических оценок. Следовательно, полагают, что фармацевтическая композиция, содержащая аттенуированный штамм Streptococcus pneumoniae в соответствии с настоящим изобретением, является более безопасным средством для профилактики или лечения аллергических заболеваний, чем обычные вакцины или лекарственные средства.

Вышеприведенное описание примерных вариантов осуществления предоставлено с целью иллюстрации, и специалистам в данной области техники должно быть понятно, что различные изменения и модификации могут быть сделаны без изменения технической концепции и существенных признаков примерных вариантов осуществления. Таким образом, ясно, что вышеописанные примерные варианты осуществления являются иллюстративными во всех аспектах и не ограничивают настоящее изобретение. Например, каждый компонент, описанный как имеющий один тип, может быть реализован распределенным способом. Аналогично, компоненты, описанные как подлежащие распределению, могут быть реализованы комбинированным образом.

Следует понимать, что вышеизложенное является иллюстрацией настоящего изобретения и не должно рассматриваться как ограничение раскрытыми конкретными вариантами осуществления, и что модификации раскрытых вариантов осуществления, а также других вариантов осуществления предназначены для включения в объем приложенной формулы изобретения. Изобретение определяется нижеследующей формулой изобретения, причем в нее должны быть включены эквивалентные пункты.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> RESEARCH & BUSINESS FOUNDATION SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY

<120> ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ АТТЕНУИРОВАННЫЕ ШТАММЫ

Streptococcus pneumonia, И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> 19P0801

<150> KR 10-2017-0053512

<151> 2017-04-26

<150> KR 10-2018-0029765

<151> 2018-03-14

<150> PCT/KR 2018/004800

<151> 2018-04-25

<160> 17

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 84

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> pep27 of Streptococcus pneumoniae D39

<400> 1

atgagaaagg aatttcacaa cgttttatct agtgatcagt tacttacaga caaaaggcca 60

gcaagagact ataatagaaa atag 84

<210> 2

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер 1

<400> 2

tggcttaccg ttcgtatag 19

<210> 3

<211> 21

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер 2

<400> 3

tcgataccgt tcgtataatg t 21

<210> 4

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220><223> праймер 3

<400> 4

tctctatcgg cctcaagcag 20

<210> 5

<211> 39

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер 4

<400> 5

ctatacgaac ggtaagccag attttcacca ctgctttcg 39

<210> 6

<211> 39

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220><223> праймер 5

<400> 6

acattatacg aacggtatcg aaaggccagc aagagacta 39

<210> 7

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220><223> праймер 6

<400> 7

ctgcgaggct tgcactgtag 20

<210> 8

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер 7

<400> 8

tctctatcgg cctcaagcag 20

<210> 9

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер 8

<400> 9

ctgcgaggct tgcactgtag 20

<210> 10

<211> 19

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> IL-10 праймер F

<400> 10

agccacctca tgctagagc 19

<210> 11

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> IL-10 праймер R

<400> 11

gcctggtctg gcatcactac 20

<210> 12

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> IL-1b праймер F

<400> 12

ctggtgtgtg acgttcccat 20

<210> 13

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> IL-1b праймер R

<400> 13

tgtcgttgct tggttctcct 20

<210> 14

<211> 21

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220><223> TNF-a праймер F

<400> 14

cacaagatgc tgggacagtg a 21

<210> 15

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> TNF-a праймер R

<400> 15

tccttgatgg tggtgcatga 20

<210> 16

<211> 18

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> GAPDH праймер F

<400> 16

tgcatcctgc accaccaa 18

<210> 17

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> GAPDH праймер R

<400> 17

tccacgatgc caaagttgtc 20

<---

1. Применение фармацевтической композиции, содержащей аттенуированный штамм Streptococcus pneumoniae, и дополнительно содержащей фармацевтически приемлемые наполнители, для профилактики или лечения воспалительного заболевания, выбранного из астмы, пневмонии, сепсиса, воспалительных заболеваний кишечника, гастроэнтерита и колита,

где фармацевтическая композиция индуцирует экспрессию иммунизации, связанную с генами в легких и селезенке, тем самым обеспечивая профилактику и/или лечение связанных с воспалением заболеваний, и

где аттенуированный штамм Streptococcus pneumoniae содержит мутантный ген pep27, в котором удалены нуклеотидные остатки в положениях 1-53 нуклеотидной последовательности pep27, описанной в SEQ ID NO: 1.

2. Применение по п.1, где фармацевтическая композиция обеспечивает иммунизацию серотип-независимым образом.

3. Применение по п.1, где аттенуированный штамм Streptococcus pneumoniae подавляет продукцию цитокина Th1 или цитокина Th2.

4. Применение по п.3, где

цитокин Th1 выбран из интерферона-гамма (IFN-γ), фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) и интерлейкина-12 (IL-12), и

цитокин Th2 выбран из интерлейкина-4 (IL-4), интерлейкина-5 (IL-5) и интерлейкина-13 (IL-13).

5. Применение по п.1, где фармацевтическая композиция является неинвазивной для легких, селезенки, крови или мозга.

6. Применение по п.1, где фармацевтическая композиция сконфигурирована для введения подкожным или интрамукозальным способом.

7. Применение по п.1, где фармацевтическая композиция сконфигурирована для введения интраназальным способом.

8. Применение по п.1, где фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель или адъювант.