Способ ранней диагностики глиомы

Изобретение относится к области медицинской диагностики. Предложен способ ранней диагностики глиомы, включающий выбор последовательности ДНК-олигонуклеотидных зондов, комплементарной к участкам кольцевой РНК, ассоциированной с развитием глиомы, и последующую регистрацию кольцевой РНК, циркулирующей в крови пациента, с помощью биосенсора нанопроволочного чипа. По образованию комплексов между указанными последовательностями ДНК-олигонуклеотидных зондов и комплементарными им участками кольцевой РНК диагностируют глиому. Изобретение обеспечивает надежность диагностики при повышении чувствительности и быстродействия на уровне нескольких минут. 1 ил., 3 табл., 1 пр.

 

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской диагностики, и может быть использовано для ранней диагностики злокачественных новообразований.

Злокачественное новообразование (опухоль) - это образование, которое возникает при бесконтрольном делении и росте клеток в различных органах или тканях организма, способных к инвазии в прилежащие ткани и метастазированию в отдаленные органы. Современное предположение о том, что является причинами возникновения злокачественных новообразований заключается в мультфакториальности заболевания. Таким образом, причинами развития онкопатологий могут быть: наследственная предрасположенность, снижение иммунитета, некоторые заболевания и инфекции, а также воздействие факторов окружающей среды.

В настоящее время проблема борьбы со злокачественными новообразованиями является одной из наиболее актуальных в медицине. На современном этапе развития клинической онкологии основной тенденцией является стремление к выявлению злокачественных опухолей на раннем этапе их развития, что является важным условием эффективности лечения и обеспечивает пятилетнюю выживаемость в 70-100% случаев. Вместе с тем, диагностика ранних форм злокачественных новообразований из-за слабовыраженной симптоматики сложна. Необходимо всестороннее клиническое обследование больных с применением комплексных методов, а также формирование групп повышенного риска развития злокачественных новообразований и наблюдение за этой категорией пациентов.

Глиома является наиболее распространенной онкологической патологией центральной нервной системы и характеризуется высокой агрессивностью, рецидивом и смертностью. Высокая смертность обусловлена отсутствием эффективных методов лечения и диагностических тестов.

Во многих случаях для дифференциальной диагностики необходимо проводить комплексное инструментальное обследование. В настоящее время хорошо известно, что успехи клинической диагностики опухолей основываются на комплексном использовании различных методов исследования. Постоянно совершенствующимся методом диагностики является ультразвуковое исследование. Его достоинствами являются высокая разрешающая способность, быстрота постановки диагноза и безвредность.

Так, известен способ диагностики злокачественных новообразований (а.с.№1639242, МПК G01N 33/49), который заключается в проведении двукратного ультразвукового облучения плазмы в течение трех минут. В этом диагностическом методе перед первым облучением регистрируют уровень темнового тока, а второе облучение начинают при достижении плазмой исходного уровня темнового тока, затем определяют площади интенсивностей свечения первого и второго пика. Злокачественное новообразование диагностируют при соотношении пиков 2,5 и более.

Недостатками данного изобретения является значительное увеличение времени исследования, а длительное воздействие ультразвука на исследуемый образец плазмы крови приводит к перегреву и частой деструкции, что увеличивает число ошибочных диагнозов. Также при применении указанного способа высока вероятность ошибок из-за неконтролируемых всплесков свечения, возникающих в начале первого воздействия ультразвука на исследуемую жидкость, это приводит к гипердиагностике рака. Кроме того, в этом способе отсутствует контроль температуры, что также может приводить к большим погрешностям в диагностике.

Другой способ выявления злокачественных новообразований (RU №2077269, кл. A61B 8/00, G01N 33/49) основан на ультразвуковом облучении эталонной жидкости и плазмы крови, включающий определение времени убывания интенсивности свечения от момента максимальной интенсивности до исходного уровня. При этом дополнительно измеряют дискретное изменение интенсивности свечения во времени, график полученной зависимости аппроксимируют двумя пересекающимися прямыми, по которым определяют время нарастания интенсивности от исходного уровня до максимального и максимальное значение интенсивности, затем определяют среднюю скорость нарастания интенсивности свечения плазмы в соответствии с представленными математическими выражениями, при этом в качестве эталонной жидкости используется буферный раствор.

Недостатками указанного способа являются жестко установленная зависимость между временем нарастания интенсивности свечения и температурой исследуемой жидкости, что приводит к ошибкам диагностики, так как для одной и той же жидкости при различных температурах определено различное время нарастания. Кроме того, в данном способе температура жидкости не контролируется, а время убывания свечения до исходного значения определяется интенсивностью ультразвука, чувствительностью фотоприемника и помехозащищенностью ультразвуковой ячейки. Также метод не позволяет фиксировать высоту столба жидкости, что приводит к различному соотношению стационарной/динамической ультразвуковой волны и, тем самым, к различному характеру свечения, не имеющего отношения к индивидуальным диагностическим свойствам исследуемой жидкости. Высока вероятность ошибок из-за неконтролируемых всплесков свечения, возникающих в начале первого воздействия ультразвука на исследуемую жидкость, приводит к гипердиагностике рака, что также является ограничением этого метода. В способе отмечено значительное увеличение времени проведения диагностики, что неприемлемо при проведении массовых измерений.

Существующие на сегодняшний день инструментальные методы обследования и сопряженные с ними диагностические процедуры не являются совершенными. Основными методами скрининга являются клинический осмотр и биопсия.

Биопсия, предоставляет возможность определения типов клеток, подверженных пролиферации, гистологических характеристик, генетических повреждений и других особенностей, связанных с развитием онкологического процесса. Однако метод биопсийного исследования ограничен неопределенной интерпретацией результатов, неэффективен на ранней стадии заболевания, а также является инвазивным методом, который вызывает дискомфорт у пациента. В настоящее время диагностика глиомы в основном ограничивается визуализацией, включая магниторезонансную и компьютерную томографии, которые обычно проводятся, когда заболевание находится поздней стадии [Lai N.S., et al. (2015) Br. J. Cancer, 112(7), 1241-1246.]. МРТ является дорогостоящим диагностическим методом, кроме того абсолютными противопоказаниями к проведению МРТ является присутствие в теле пациента кардиостимулятора или других программируемых имплантированных устройств. Пациентам, которые страдают клаустрофобией (боязнью закрытых пространств) также не рекомендуют использование МРТ, поскольку панические приступы во время нахождения в тоннеле аппарата могут не позволить провести исследование.

Большинство белковых маркеров присутствуют в крови в низкой (менее 10^-13 М) и ультранизкой концентрации (менее 10^-15 М) [Lisitsa A.V., Ponomarenko E.A., Lokhov P.G., Archakov A.I. Postgenomic Medicine: Alternative to Biomarkers. Annals of the Russian Academy of Medical Sciences. 2016;71(3):255-260]. Так, исследования по валидации биомаркера для диагностики опухоли мозга были проведены многими научными группами и достигли достаточного прогресса [Lai N.S., et al. (2015) Br. J. Cancer, 112(7), 1241-1246., Westphal M., Lamszus K. (2015) Nat. Rev. Neurol., 11(10), 556-566.]. Тем не менее, нет исследований, направленных на поиск потенциальных биомаркеров для диагностики и прогноза развития заболевания после терапии, особенно после лучевой терапии, которая является одной из важных стратегий лечения глиомы. Циркулирующие опухолевые биомолекулы, включая ДНК и белки, являются многообещающими маркерами в диагностике глиомы, но чувствительность этих маркеров низкая [Wei X, Chen D, Lv T, Li G, Qu S (2016), Mol. Neurobiol., 53(1), 163-170].

Применение стандартных иммуногистохимических, иммуноаффинных методов (ИФА) в клинической диагностике ограничено для высокочувствительной белковой регистрации вследствие их: (1) низкой концентрационной чувствительности, не менее 10^-13-10^-14 моль/л, (2) необходимостью использования ферментных и флуоресцентных меток; (3) зачастую невозможностью проводить мультиплексные анализы нескольких серологических маркеров; (4) высокой стоимостью используемых реагентов и оборудования.

Часто большая часть идентифицированных белков не является продуктом опухолевых клеток, а относится к неспецифическим белкам воспаления. Так, несмотря на широкое распространение в практическом здравоохранении использование анализа на простат-специфичный антиген, этот тест зачастую приводит к ложноположительной диагностике из-за его недостаточной специфичности [Lead time and overdiagnosis in prostate-specific antigen screening: importance of methods and context. Draisma G., et. al. J Natl Cancer Inst 2009; 101: 374-383]. Поэтому вопрос использования этих белков в качестве онкомаркеров является дискуссионным.

Близким к вышеописанным методам ранней диагностики онкопатологий является метод, основанный на использовании нанопроволочного чипа к биосенсору, описанный в [Attomolar detection of extracellular microRNAs released from living prostate cancer cells by a plasmonic nanowire interstice sensor. Siyeong Ya., et. al. Nanoscale, 2017; 9: 17387-17395]. Однако это устройство позволяет проводить диагностику опухолевых заболеваний только по анализу клеток. Невозможность использования крови для определение микроРНК является недостатком этого метода, поскольку получение крови менее болезненно, чем биопсия. Кроме того, в работе использован подход на основе плазменного резонанса, что требует для регистрации раковых клеток использование дополнительных дорогостоящих оптических элементов.

Биосенсор, содержащего нанопроволоки из полианилина, также, может быть, использован для диагностики [Detection of MicroRNAs Using Target-Guided Formation of Conducting Polymer Nanowires in Nanogaps. Yi Fan. et al. J. AM. CHEM. SOC., 2007; 129(17): 5437-5443]. Однако полианилиновые нанопроволоки, которые являются полимерами, недостаточно стойки к внешним условиям. Более того, этот сенсор позволяет проводить анализ только раковых клеток, а не крови пациента.

Как правило, для нанопроволочной детекции молекул, ассоциированных с развитием онкологических заболеваний, обычно используется микроРНК (миРНК) как ранний маркер развития заболевания. Однако недостаток использования миРНК для диагностики рака заключается в том, что миРНК являются короткими молекулами (18-22 нуклеотидов), которые дают возможность регистрировать маркеры заболевания, но с недостаточно высокой чувствительностью, которая требуется для ранней диагностики.

Способ, продемонстрировавший возможность специфичной детекции миРНК-126 (маркера рака легких) в клеточной культуре при концентрации 10^-16 М с помощью нанопроволочного биосенсора описан в работе [Multiplexed detection of lung cancer biomarkers in patients serum with CMOS-compatible silicon nanowire arrays. Gao A. et al. Biosensors and Bioelectronics.2017; 91: 482-488].

Прототипом настоящего изобретения является способ диагностики онкологических заболеваний, включающий регистрацию миРНК, содержащихся в крови пациента с диагнозом рак молочной железы или рак яичников. Регистрацию миРНК проводят с использованием нанопроволочного чипа (НП-чип), на поверхности которого ковалентно иммобилизуют совокупность ДНК-олигонуклеотидных зондов, комплементарных к миРНК, ассоциированным с развитием рака молочной железы или рака яичников. Такой НП-чип инкубируют с в образце, содержащем миРНК, выделенных из плазмы крови пациента. При этом образуются комплексы между иммобилизованными ДНК зондами и специфичными им миРНК. Это событие сопровождается изменением величины тока, протекающего через сенсорные элементы НП-чипа. (RU 2696114, кл. А61В 8/08, опубл. 31.07.2019 г.)

Данный способ выявления микроРНК имеет следующие недостатки: (1) небольшая длина нуклеотидной последовательности микроРНК, (2) небольшой отрицательный заряд микроРНК, определяемый суммарным зарядом нуклеотидов, входящих в эту нуклеиновую кислоту, (3) влияние целого спектра объектов с разным зарядовым состоянием в растворе биологической жидкости.

Техническим результатом предлагаемого в настоящем изобретении способа ранней диагностики глиомы является обеспечение надежности диагностики при повышении чувствительности и быстродействия на уровне нескольких минут.

Для достижения заявленного технического результата предлагается способ ранней диагностики глиомы, включающий выбор последовательности ДНК-олигонуклеотидных зондов

5’-(NH2)-(T)₁₀GGGTGGGCAGGGAGGGTGGAGCGGGTT

TGTTCCAAGTGCCCCAGCCTCTC,

или

5’-(NH2)-(T)₁₀ACACTGAGGGCGGTGACCCCATCCTC

CGCTGGGTCCCGATAGAGCTCGCT,

или

5’-(NH2)-(T)₁₀AAAGCGCGGACGTGAGGCAGCAGTGCC

TCGATGAACGGGTGGAACTCATC,

комплементарной к участкам кольцевой РНК, ассоциированной с развитием глиомы, и последующую регистрацию кольцевой РНК, циркулирующей в крови пациента, с помощью биосенсора нанопроволочного чипа по изменению тока, протекающего через биосенсор, в момент образования после инкубации поверхности нанопроволочного чипа в образце крови пациента, комплексов между указанными последовательностями ДНК-олигонуклеотидных зондов, и комплементарными им участками кольцевой РНК.

НП-чип к биосенсору содержит на своей поверхности массив нанопроволок, которые являются чувствительными элементами. Особенностью сформированных нанопроволок является использование встроенного оксида кремния, кремниевой подложки в качестве подзатворного диэлектрика и тылового затвора, который регулирует чувствительность прибора. Эти составляющие обеспечивают нанопроволочные структуры функциями полевого транзистора.

НП-чип был изготовлен с помощью CMOS (complementary metal-oxide-semiconductor) технологии построения электронных схем со структурой металл-диэлектрик-полупроводник методом газофазного восстановления и литографии. Такой биосенсор характеризуется чувствительностью на субфемтомолярном уровне, быстродействием - порядка нескольких минут, низкой чувствительностью к контаминациям.

Кольцевая РНК (кРНК) принадлежит к классу некодирующих РНК, которые в отличие от линейных РНК образуют ковалентно замкнутые кольца. Они отвечают за ошибки в сплайсинге и рассматриваются как низкосодержащиеся, но имеющие важные функции в регуляции генов.

Также кРНК привлекают внимание тем, что могут быть использованы как биомаркеры для диагностики и определения стадии таких патологий как рак предстательной железы, рак желудка, колоректальный рак, рак мочевого пузыря и др. [Li, Y.; Zheng, Q.; Bao, Ch.; Li, Sh.; Guo, W.; Zhao, J.; Chen, D.; Gu, J.; He, X.; Huang, Sh. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Research 2015, 25, 981-984.; Xia, Q.; Ding, T.; Zhang, G.; Li, Z.; Zeng, L.; Zhu, Y.; Guo, J.; Hou, J.; Zhu, T.; Zheng, J.; Wang, J. Circular RNA Expression Profiling Identifies Prostate Cancer- Specific circRNAs in Prostate Cancer.Cell. Physiol. Biochem 2018, 50(5), 1903-1915].

Еще одним преимуществом использования кРНК для диагностики онкологических заболеваний является их стабильность. Структура кРНК имеет высокой консервативной последовательностью и поэтому обладает пониженной способностью к деградации рибонуклеазами по сравнению с длинными линейными РНК молекулами.

В известных способах в качестве молекул-зондов используется олигонуклеотидные зонды, в частности РНК или ДНК фрагменты, которые наиболее распространены для производства диагностических систем. Однако РНК-зонды характеризуются невысокой стабильностью к воздействию внешних условий, в частности к процедуре отмывки поверхности чипа от молекул партнеров. Поэтому при изготовлении стабильных НП-чипов, предназначенных для многоразового использования, вместо РНК-зондов, в предлагаемом способе ранней диагностики онкологических заболеваний используются ДНК-олигонуклеотиды (о-ДНК), так как они обладают повышенной стабильностью к воздействию внешних условий. НП-чип к биосенсору содержит на своей поверхности массив ннопроволок, которые являются чувствительными элементами. Особенностью сформированных нанопроволок является использование встроенного оксида кремния, кремниевой подложки в качестве подзатворного диэлектрика и тылового затвора, который регулирует чувствительность прибора.

Эти составляющие обеспечивают нанопроволочные структуры функциями полевого транзистора.

НП-чип был изготовлен с помощью CMOS (complementary metal-oxide-semiconductor) технологии построения электронных схем со структурой металл-диэлектрик-полупроводник методом газофазного восстановления и литографии. Такой биосенсор характеризуется чувствительностью на субфемтомолярном уровне, быстродействием - порядка нескольких минут, низкой чувствительностью к контаминациям.

Особенностью и существенными признаками предлагаемого способа как необходимого условия проведения ранней диагностики гликомы является:

- выбор последовательности о-ДНК-зондов, комплементарной к участкам кРНК, непосредственно выделенной из крови пациента;

- использование биоспецифических участков кРНК, выделенной из образца крови пациента, ассоциированной с развитием глиомы;

- иммобилизация на поверхности НП-чипа выбранных о-ДНК-зондов;

- образование комплексов между биоспецифическими участками кРНК и иммобилизованными на поверхности НП-чипа молекулами о-ДНК-зондами;

- измерение сигнала изменения тока, протекающего через чувствительные элементы НП-чипа, в момент образования комплексов между иммобилизованными на их поверхности молекулами о-ДНК-зондами и биоспецифичными участкам кРНК.

Предлагаемая в настоящем изобретении диагностическая тест-система выявления кРНК, ассоциированного с развитием глиомы, позволяет повысить чувствительность обнаружения циркулирующей в крови кРНК как минимум до уровня 10^-15 М (без амплификации), что соответствует ранней стадии развития онкопатологии за короткий промежуток времени - порядка десяти минут.

Проведенный анализ уровня техники показал, что в современных диагностических тест-системах онкологических заболеваний не использованы технические решения с использованием биоспецифичных участков кРНК в качестве маркеров онкологического заболевания, таким образом, предлагаемое техническое решение, соответствует критерию «новизна».

При анализе известных аналогов не обнаружены предложения, включающих совокупность существенных признаков, изложенных в формуле изобретения, из чего следует, что для специалистов, занимающихся диагностикой онкологических заболеваний, оно явным образом не следует из уровня техники и, следовательно, соответствует критерию «изобретательский уровень».

ПРИМЕР 1.

Способ ранней диагностики онкологического заболевания – глиомы осуществлялся следующим образом.

Для подготовки НП-чипа экспериментально выбиралась последовательность о-ДНК-зондов, комплементарная последовательности кРНК, циркулирующей в крови пациента с предполагаемым диагнозом глиома (табл. 1).

Таблица 1

Наименование ДНК-олигонуклеотидов	Последовательность ДНК-олигонуклеотида
«probe_1»	5’-(NH2)-(T)10GGGTGGGCAGGGAGGGTGGAGCGGGTT TGTTCCAAGTGCCCCAGCCTCTC
«probe_2»	5’-(NH2)-(T)10ACACTGAGGGCGGTGACCCCATCCTC CGCTGGGTCCCGATAGAGCTCGCT
«probe_3»	5’-(NH2)-(T)10AAAGCGCGGACGTGAGGCAGCAGTGCC TCGATGAACGGGTGGAACTCATC

Для функционализации НП-чипа с помощью бифункционального кросс-линкера на основе сукцинимидного эфира проводилась ковалентная иммобилизация на поверхность нанопроволок оДНК-зондов – «probе_1», «probе_2», «probe_3». (табл.1).

Выделение кРНК из плазмы крови пациента проводили с использованием набора ExtractRNA (Евроген, ВС032). Реагент в составе набора представляет собой монофазный водный раствор фенола и гуанидин-изо-тиоцианата и служит для быстрого лизиса клеток. Это не исключает использование и другого способа безгуанидинового выделения кРНК из крови, например, на основе фенол-хлороформной экстракции или фенольной экстракции.

Электрические измерения проводились с помощью 10-ти канальной системы сбора и сохранения данных на основе аналого-цифрового преобразователя. Во время измерений поверхность нанопровлочных структур чипа была использована в качестве управляющего электрода (затвора транзистора). В предлагаемом способе использовались НП-чипы n-типа проводимости.

Комплементарные к о-ДНК зондам последовательности кРНК приведены в табл. 2.

Таблица 2

Наименование ДНК-олигонуклеотидов	Соответствующая кРНК
«cs_1»	Circ-SHKBP1 [He QR, Zhao LN, Liu YH, Liu XB, Zheng J, Yu H, et al Circ-SHKBP1 regulates the angiogenesis of U87 glioma-exposed endothelial cells through miR-544a/FOXP1 and miR-379/FOXP2 pathways. Mol Ther Nucleic Acids. 2018;10:331–48]
«cs_2»	circRNA CIRCNFIX [Xu HY, Zhang Y, Qi L, Ding LJ, Jiang H, Yu HQ NFIX circular RNA promotes glioma progression by regulating miR-34a-5p via notch signaling pathway. Front Mol Neurosci. 2018;11:225]
«cs_3»	Hsa_circ_0074362 [Song XF, Zhang NB, Han P, Moon BS, Lai RK, Wang K, et al Circular RNA profile in gliomas revealed by identification tool UROBORUS. Nucleic Acids Res. 2016;44:e87]

Непосредственно предлагаемый способ ранней диагностики глиомы осуществлялся следующим образом.

В буферный раствор (7 мкл), содержащий кРНК, выделенные из плазмы крови пациента с диагнозом глиома, добавляли в измерительную кювету, содержащую 100 мкл буферного раствора. Поверхность НП-чипа была иммобилизирована олигонуклеотидным зондом «probe_1» (табл.1).

Временные зависимости тока I_ds(t) регистрировались при напряжении на затворе транзисторов V_g=50 В и напряжении исток-сток V_ds=0,1 В в режиме реального времени. Полученные результаты представлялись в виде зависимостей I_ds(t), отражающих разностный сигнал между рабочим (с иммобилизованным о-ДНК зондом - «probe_1») и контрольным (не содержащим молекул-зондов) НП-чипа биосенсора ((I_ds).

Результаты предлагаемого способа при использовании НП-чипа приведены на рисунке 1, где кривая 1 показывает изменение сигнала тока, соответствующего диагностике образца 1 (табл.3), полученного от пациента с предполагаемым диагнозом глиома (черная линия, маркер ■), а кривая 2 - изменение сигнала тока, соответствующего диагностике образца 36 (талб. 3), полученного от здорового добровольца (черная линия, маркер •). Стрелками указано добавление раствора с кРНК (а) и отмывочного буферного раствора(в).

Характеристика обследованных пациентов с выявленным онкологическим заболеванием - глиомой приведена в таблице 3. Пациенты после обследования с помощью предлагаемого способа проходили стандартное обследование в клинике, где им ставился окончательный диагноз, приведенный в таблице 3 в колонке “Стадия”.

Таблица 3

			НП-сенсор
Образец	Патология	Стадия	«probe 1»	«probe 2»	«probe 3»
№1	глиома	1	+	+	+
№2	глиома	1	+	+	+
№36	здоровый доброволец	-	-	-	-
№37	здоровый доброволец	-	-	-	-
«+» - есть сигнал; «-» - нет сигнала

--->

Перечень последовательностей нуклеодитов кольцевой РНК

<110> Federalnoe gosudarstvennoe biudzhetnoe nauchnoe uchrezhdenie

Nauchno-issledovatelskii institut biomeditsinskoi khimii imeni

V N Orekhovicha IBMKH

<120> Sposob diagnostiki gliomy

<140> 2021113365

<141> 08.09.2021

<400>

SEQ ID 1

GTCCAGGAGGTGCAGCCCATCACCAGTTATGACGCGGCAGGCTCCTTCCTCCTC

CTGGGCTGCAACAACGGCTCCATTTACTACGTGGGTGAGCAGCAGCCTGTGTCCC

GGGTGCCCGAGACCCTCCCCTGGGAGAGGGGAAGGGAGGGAGAGAGGCTGGGGC

ACTTGGAACAAACCCGCTCCACCCTCCCTGCCCACCCCAGATGTGCAGAAGTTCCC

CTTGCGCATGAAAGACAACGACCTCCTTGTCAGCGAGCTCTATCGGGACCCAGCGG

AGGATGGGGTCACCGCCCTCAGTGTCTACCTCACCCCCAAGACCA (151-201)

SEQ ID 2

GTCCAGGAGGTGCAGCCCATCACCAGTTATGACGCGGCAGGCTCCTTCCTCCT

CCTGGGCTGCAACAACGGCTCCATTTACTACGTGGGTGAGCAGCAGCCTGTGTC

CCGGGTGCCCGAGACCCTCCCCTGGGAGAGGGGAAGGGAGGGAGAGAGGCTGGG

GCACTTGGAACAAACCCGCTCCACCCTCCCTGCCCACCCCAGATGTGCAGAAGTTC

CCCTTGCGCATGAAAGACAACGACCTCCTTGTCAGCGAGCTCTATCGGGACCCAG

CGGAGGATGGGGTCACCGCCCTCAGTGTCTACCTCACCCCCAAGACCA (251-351)

SEQ ID 3

GATGAGTTCCACCCGTTCATCGAGGCACTGCTGCCTCACGTCCGCGCTTTCTC

CTACACCTGGTTCAACCTGCAGGCGCGGAAGCGCAAGTACTTCAAGAAGCATGA

AAAGCGGATGTCGAAGGACGAGGAGCGGGCGGTGAAGGACGAGCTGCTGGGCGA

AAGCCCGAGATCAAGCAGAAGTGGGCATCCCGGCTGCTGGCCAAGCTGCGCAAG

GACATCCGGCCCGAGTTCCGCGAGGACTTCGTGCTGACCATCACGGGCAAGAAGCC

CCCCTGCTGCGTGCTCTCCAACCCCGACCAGAAGGGCAAGATCCGGCGGATTGAC

TGCCTGCGCCAGGCTGACAAGGTGTGGCGGCTGGACCTGGTCATGGTGATTTTGTTT

AAGGGGATCCCCCTGGAAAGTACTGATGGGGAGCGGCTCTACAAGTCGCCTCAGTG

CTCGAACCCCGGCCTGTGCGTCCAGCCACATCACATTGGAGTCACAATCAAAGAAC

TGGATCTTTATCTGGCTTACTTTGTCCACACTCCGG (1-50)

Последовательности нуклеотидов участка кольцевой РНК,комплементарные

последовательности кольцевой РНК, циркулирующей в крови пациента

с предполагаемым диагнозом глиома

<110> Federalnoe gosudarstvennoe biudzhetnoe nauchnoe uchrezhdenie

Nauchno-issledovatelskii institut biomeditsinskoi khimii imeni

V N Orekhovicha IBMKH

<120> Sposob diagnostiki gliomy

<140> 2021113365

<141> 08.09.2021

<400>

SEQ ID 1 GAGAGGCTGGGGCACTTGGAACAAACCCGCTCCACCCTCCCTGCCCACCC (151-201)

SEQ ID 2 AGCGAGCTCTATCGGGACCCAGCGGAGGATGGGGTCACCGCCCTCAGTGT (251-351)

SEQ ID 3 GATGAGTTCCACCCGTTCATCGAGGCACTGCTGCCTCACGTCCGCGCTTT (1-50)

<---

Способ ранней диагностики глиомы, включающий выбор последовательности ДНК-олигонуклеотидных зондов

5'-(NH2)-(T)₁₀GGGTGGGCAGGGAGGGTGGAGCGGGTT

TGTTCCAAGTGCCCCAGCCTCTC,

или

5'-(NH2)-(T)₁₀ACACTGAGGGCGGTGACCCCATCCTC

CGCTGGGTCCCGATAGAGCTCGCT,

или

5'-(NH2)-(T)₁₀AAAGCGCGGACGTGAGGCAGCAGTGCC

TCGATGAACGGGTGGAACTCATC,

комплементарной к участкам кольцевой РНК, ассоциированной с развитием глиомы, и последующую регистрацию кольцевой РНК, циркулирующей в крови пациента, с помощью биосенсора нанопроволочного чипа по изменению тока, протекающего через биосенсор, в момент образования после инкубации поверхности нанопроволочного чипа в образце крови пациента комплексов между указанными последовательностями ДНК-олигонуклеотидных зондов и комплементарными им участками кольцевой РНК.