Способ выявления видов возбудителей дирофиляриоза dirofilaria repens и dirofilaria immitis с помощью пцр в режиме реального времени

Изобретение относится к области медицинской паразитологии, ветеринарии, биотехнологии. Описан способ диагностики возбудителей дирофиляриоза, включающий ПЦР в режиме реального времени с помощью предлагаемых праймеров, специфичных для каждого вида дирофилярий и состоящих из двух пар видовых праймеров:

для Dirofilaria repens

(F2690DR) 5’- АAGTGTTGATGGTCAACCTGAA-3’

(R2812DR) 5’- GTAGAACGCATATTCTGAGT-3’

для Dirofilaria immitis

(F2690DI) 5’- GAGTGTAGAGGGTCAGCCTGAG-3’

(R2812DI) 5’- GTAGAACGTATATTCTGAAC- 3’.

Выявление осуществляют автоматически в ходе проведения ПЦР на мониторе компьютера в виде кривых и в численных значениях, отражающих накопление продуктов амплификации специфичных для D. repens и D. immitis со специфическими праймерами. В случае наличия в пробе ДНК D. Repens, будет выявляться положительная реакция с праймерами F2690DR/R2812DR, а в случае наличия в пробе ДНК D. Immitis, будет выявляться положительная реакция с праймерами F2690DI/R2812DI. Предварительно подготавливают исследуемую ДНК. Для этого осуществляют промывку нативных гельминтов однократно в стерильном 0,9% растворе NaCl, далее замораживание при температуре -20±2°С. Затем механическое перетирание и гомогенизация до получения однородной суспензии, из которой выделяют ДНК с использованием набора М-Сорб-кровь («НПФ СИНТОЛ», Россия) для постановки ПЦР. Кроме того, ПЦР проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит: 10-кратный ПЦР буфер с EVAGreen – 2,5 мкл; 25 мМ MgCl2 - 2,5 мкл; 2,5 мМ смесь dNTP – 2,5 мкл; праймер видовой F (1 О.Е.) - 1 мкл; праймер видовой R (1 О.Е.) – 1 мкл; ДНК-Taq-полимераза (5 Ед/мкл) – 0,3 мкл, деионизованная вода – 12,2 мкл. При этом ПЦР проводят с соблюдением режимов:

- денатурация при 95°С - 5 мин (1 цикл);

- затем 45 циклов амплификации, включающих: денатурацию при 95°С - 10 с, отжиг при 60°С - 10 с, синтез при 72°С - 30 с;

- дополнительный блок «Melt curve» при температурном режиме 60 – 90°С - 10 мин (1 цикл), дискретность 0,5°С/10 с;

- хранение при 10°С.

Изобретение может быль использовано при молекулярно-генетической диагностике возбудителей дирофиляриоза, а также для межвидовой дифференциации видов Dirofilaria repens и Dirofilaria immitis. Технический результат предлагаемого изобретения заключается в достоверном выявлении видов возбудителей дирофиляриоза D. repens и D. Immitis. 3 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 пр.

 

Предполагаемое изобретение относится к области медицинской паразитологии, ветеринарии, а именно молекулярной диагностики, и может быль использовано при молекулярно-генетической диагностике возбудителей дирофиляриоза, а также для межвидовой дифференциации видов Dirofilaria repens и Dirofilaria immitis.

Одной из актуальных проблем стран умеренного климата является единственный трансмиссивный гельминтоз, встречающийся у жителей данных территорий – дирофиляриоз. Частота инвазии человека двумя основными патогенами данного вида (Dirofilaria repens и Dirofilaria immitis) значительно варьирует в различных странах. Этот факт можно объяснить преобладанием того или иного вида дирофилярий у окончательных хозяев – животных семейства псовых и кошачьих, а также особенностями энтомологической структуры векторов трансмиссии дирофилярий в зависимости от природно-климатических условий территорий (1). Длительное наблюдение за динамикой видового состава дирофилярий у наиболее эпидемиологически значимого источника инвазии для человека – домашних собак - свидетельствует об изменении структуры видов, паразитирующих у данных животных. При этом, несмотря на увеличение доли D. immitis у дефинитивных хозяев, на юге России инвазия данным гельминтом населения регистрируются крайне редко, преимущественно отмечаются случаи инвазии человека D. repens. Данный факт можно объяснить гиподиагностикой инвазии D. immitis людей (2).

До недавнего времени в диагностике дирофиляриоза человека D. repens в качестве «золотого стандарта» использовалась гистологическая идентификация удаленных гельминтов согласно методических указаний (МУ 3.2.3469 - 17 «Профилактика дирофиляриоза», Москва 2018). Этот анализ требует высокого профессионального уровня специалистов и оказывается ненадежным - в случае если нематоды повреждены, то вид D. immitis может быть ошибочно принята за D. repens, и наоборот. Кроме того, микроскопия при масштабных эпизоотологических и энтомологических исследованиях зараженности собак и комаров филяриями является крайне трудоемким и длительным способом исследования (3).

Известен способ идентификации дирофилярий D. repens и D. immitis на основе использовании полимеразной цепной реакции ПЦР (4,5), заключающийся в том, что для идентификации ДНК были предложены видоспецифические праймеры: для D. immitis: прямой (F, forvard) 5’–TGATTGGTGGTTTTGGTAA–3’ и обратный (R, revers) 5’–ATAAGTACGAGTATCAATATC– 3’; для D. repens: прямой 5’–CCGGTAGACCATGGCATTAT–3’ и обратный 5’–CGGTCTTGGACGTTTGGTTA– 3’. Однако применение данного метода при проверке последовательностей, указанных в базе данных GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), показало несостоятельность (неспецифичность) олигонуклеотидных последовательностей видов D. repens и D. immitis, приводящая к большому проценту ложноположительных результатов анализа.

За прототип выбран способ идентификации ДНК дирофилярий с помощью ПЦР с применением других праймеров (6): D. repens: DIR3: F 5'-CCGGTAGACCATGGCATTAT-3'DIR-4: R 5'-CGGTCTTGGACGTTTGGTTA-3' и D. immitis: COIintF5'-TGATTGGTGGTTTTGGTAA-3' и COIintR5'-ATAAGTACGAGTATCAATATC-3'. Недостатком способа также является его низкая специфичность. Проверка прямого праймера с помощью онлайн ресурса «NCBI BLAST» показала, что праймер не является специфичным, а это, в свою очередь, исключает получение традиционного специфического ампликона строго определенного размера. Установлено, что представленные последовательности олигонуклеотидов присутствуют в геноме как у D. repens и D. immitis, так и в геноме других животных, что так же может привести к ложноположительным результатам анализа.

Таким образом, известные способы подтверждают, что сложность выбора олигодезоксирибонуклеотидов для ПЦР состоит в том, что они должны обладать строгой видовой специфичностью. В случае использования ПЦР праймеров, не имеющих видовой специфичности, возможны ложноотрицательные результаты. В случае, если выбранные олигодезоксирибонуклеотидные праймеры имеют сродство к нецелевым последовательностям ДНК, то возможны ложноположительные результаты.

Технической задачей предполагаемого изобретения является разработка простого и достоверного способа выявления видов возбудителя дирофиляриоза Dirofilaria repens и Dirofilaria immitis с помощью ПЦР в режиме реального времени.

Поставленная задача достигается тем, что способ выявления видов возбудителей дирофиляриоза Dirofilaria repens и Dirofilaria immitis осуществляется с помощью ПЦР в режиме реального времени, включающем выделение хромосомной ДНК из исследуемого материала, постановку ПЦР со специфическими праймерами и учет полученных результатов, амплификацию исследуемой ДНК проводят с помощью предлагаемых праймеров, специфичных для каждого вида дирофилярий, и состоящих из двух пар видовых праймеров:

для Dirofilaria repens

(F2690DR) 5’-АAGTGTTGATGGTCAACCTGAA-3’

(R2812DR) 5’- GTAGAACGCATATTCTGAGT-3’

для Dirofilaria immitis

(F2690DI) 5’- GAGTGTAGAGGGTCAGCCTGAG-3’

(R2812DI) 5’- GTAGAACGTATATTCTGAAC- 3’

выявление осуществляют автоматически в ходе проведения ПЦР на мониторе компьютера в виде кривых и в численных значениях, отражающих накопление продуктов амплификации специфичных для D. repens и D. immitis со специфическими праймерами; в случае наличия в пробе ДНК D. repens, будет выявляться положительная реакция с праймерами F2690DR/R2812DR, а в случае наличия в пробе ДНК D.immitis, будет выявляться положительная реакция с праймерами F2690DI/R2812DI.

При этом проводят предварительную подготовку исследуемой ДНК, которая включает: промывку нативных гельминтов однократно в стерильном 0,9% растворе NaCl, далее замораживание при температуре -20±2°С; затем механическое перетирание и гомогенизацию до получения однородной суспензии, из которой выделяют ДНК с использованием набора М-Сорб-кровь («НПФ СИНТОЛ», Россия) для постановки ПЦР.

Кроме того, ПЦР проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит:

10-кратный ПЦР буфер с EVAGreen– 2,5 мкл; 25 мМ MgCl2 - 2,5 мкл; 2,5 мМ смесь dNTP – 2,5 мкл; праймер видовой F (1 О.Е.) - 1 мкл; праймер видовой R (1 О.Е.) – 1 мкл; ДНК-Taq-полимераза (5 Ед/мкл) – 0,3 мкл, деионизованная вода – 12,2 мкл.

При этом ПЦР проводят с соблюдением режимов:

- денатурация при 95°С -5 мин (1 цикл);

- затем 45 циклов амплификации, включающих: денатурацию при 95 °С - 10 с., отжиг при 60°С - 10 с., синтез при 72°С - 30 с.;

- дополнительный блок «Melt curve» при температурном режиме 60 – 90°С - 10 мин (1 цикл), дискретность 0,5°С/10 с.;

- хранение при 10°С.

Обоснование выбора праймеров

Важнейшим этапом при разработке способа выявления видов возбудителей дирофиляриоза Dirofilaria repens и Dirofilaria immitis с помощью ПЦР в режиме реального времени, обеспечивающим получение корректного результата, является правильный подбор праймеров.

Получение праймеров осуществляли на основе известных последовательностей видов D. repens и D. immitis, представленных в базе данных GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), при помощи программного обеспечения «Bioedit Sequence Alignment Editor» (версия 7.2.5). Полученные последовательности двух пар праймеров тестировали на специфичность с помощью онлайн ресурса «NCBI BLAST» (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).

В результате были выбраны следующие олигонуклеотидные праймеры:

специфичные для D. repens 5’-AAGTGTTGATGGTCAACCTGAA-3’ (F2690DR) и 5’- GTAGAACGCATATTCTGAGT-3’ (R2812DR) - представленная последовательность олигонуклеотидов присутствует в генах только у D. repens и совпадает на 100% именно с представителями дирофилярий вида repens, что исключает вероятность ложноположительных результатов анализа.

специфичные для D. immitis 5’- GAGTGTAGAGGGTCAGCCTGAG-3’ (F2690DI) и 5’- GTAGAACGTATATTCTGAAC- 3’ (R2812DI) - представленная последовательность олигонуклеотидов присутствует в генах только у D. immitis и совпадает на 100% с представителями дирофилярий вида immitis, что исключает вероятность ложноположительных результатов анализа.

Химический синтез олигонуклеотидов заданной структуры и концентрации осуществлялся в ЗАО «Евроген», г. Москва.

В результате идентификации специфических для каждого вида участков ДНК удалось сконструировать набор высоко специфических праймеров для выявления D. repens и D. immitis в ПЦР в режиме реального времени, состоящий из двух для каждого вида дирофилярий праймеров, позволяющих выявить виды возбудителя дирофиляриоза. В случае положительной реакции синтезируется ДНК-фрагменты, по которым определяют вид возбудителя дирофиляриоза в режиме реального времени - результаты выводятся автоматически на монитор компьютера в виде кривых и в численных значениях.

Предлагаемый способ выявления видов возбудителей дирофиляриоза Dirofilaria repens и Dirofilaria immitis с помощью ПЦР в режиме реального времени заключается в следующем:

1) проведении одностадийной реакций амплификации с праймерами к возбудителям дирофиляриоза,

2) получении и оценке результатов ПЦР в режиме реального времени.

На основании анализа полученных данных делается вывод о принадлежности исследуемого гельминта к одному из видов возбудителя дирофиляриоза: D. repens или D. immitis.

Объектом защиты предполагаемого изобретения является два набора олигонуклеотидных праймеров - для Dirofilaria repens F2690DR/R2812DR и для Dirofilaria immitis F2690DI/R2812DI, предназначенных для проведения двух реакций амплификации.

Способ осуществляется следующим образом.

Перед постановкой ПЦР проводят предварительную подготовку материала (выделение ДНК). Материалом для исследования служат взрослые половозрелые особи и личинки гельминтов. Первоначально нативных гельминтов промывают однократно в стерильном 0,9% растворе NaCl, далее замораживают при температуре -20±2°С (в таком состоянии можно длительно сохранять пробы для исследования). Перед выделением ДНК гельминтов в замороженном состоянии механически перетирают и гомогенизируют до получения однородной суспензии, из которой выделяют ДНК с использованием набора М-Сорб-кровь («НПФ СИНТОЛ», Россия). Работы проводят согласно требований методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».

Приготовление ПЦР смеси для проведения реакции осуществляют с использованием набора реагентов для проведения ПЦР в присутствии EVAGreen («НПФ СИНТОЛ», Россия).

Готовят две реакционные смеси:

- отдельно для праймеров к D.repens :

(F2690DR) 5’-АAGTGTTGATGGTCAACCTGAA-3’

(R2812DR) 5’- GTAGAACGCATATTCTGAGT-3’

10-кратный ПЦР буфер с EVAGreen– 2,5 мкл; 25 мМ MgCl2 - 2,5 мкл; 2,5 мМ смесь dNTP – 2,5 мкл; праймер F2690DR (1 О.Е.) - 1 мкл; праймер R2812DR (1 О.Е.) – 1 мкл; ДНК-Taq-полимераза (5 Ед/мкл) – 0,3 мкл, деионизованная вода – 12,2 мкл. Итого 22 мкл реакционной смеси и 3 мкл ДНК на 1 пробу. Конечный объем реакционной смеси равен 25 мкл

- отдельно к праймерам D. immitis.

(F2690DI) 5’- GAGTGTAGAGGGTCAGCCTGAG-3’

(R2812DI) 5’- GTAGAACGTATATTCTGAAC- 3’

10-кратный ПЦР буфер с EVAGreen– 2,5 мкл; 25 мМ MgCl2 - 2,5 мкл; 2,5 мМ смесь dNTP – 2,5 мкл; праймер F2690DI (1 О.Е.) - 1 мкл; праймер R2812DI (1 О.Е.) – 1 мкл; ДНК-Taq-полимераза (5 Ед/мкл) – 0,3 мкл, деионизованная вода – 12,2 мкл. Итого 22 мкл реакционной смеси и 3 мкл ДНК образца на 1 пробу. Конечный объем реакционной смеси равен 25 мкл.

Условия проведения реакции

ПЦР реакция (амплификация) проходит с соблюдением следующих температурных режимов:

- денатурация при 95°С -5 мин (1 цикл);

- затем 45 циклов амплификации, включающих: денатурацию при 95°С - 10 с., отжиг при 60°С - 10 с., синтез при 72°С - 30 с.;

- дополнительный блок «Melt curve» при температурном режиме 60 – 90°С - 10 мин (1 цикл), дискретность 0,5°С/10 с.;

- хранение при 10°С.

Учет результатов происходит автоматически в ходе проведения ПЦР и выводится на монитор компьютера в виде кривых и в численных значениях, отражающих накопление продуктов амплификации специфичных для D. repens и D. immitis. В случае наличия в пробе ДНК D. repens, будет выявляться положительная реакция с праймерами F2690DR/R2812DR, а в случае наличия в пробе ДНК D. immitis, будет выявляться положительная реакция с праймерами F2690DI/R2812DI. За положительный результат принимается кривая, дуга которой начинается до 31 Ct. (цикла), за отрицательный результат принимается прямая линия или кривая после 31 Ct.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами:

Пример 1. ПЦР-анализ ДНК представителей видов D. immitis и D. repens с предложенными праймерами. Амплификацию проводят для подтверждения возможности специфического выявления видов D. immitis и D. repens.

Материалом для исследования послужили взрослые особи гельминтов D. repens и D. immitis, выделенные от людей. Видовая принадлежность гельминтов подтверждена паразитологическими методами (микроскопическими и неполного гельминтологического вскрытия).

Выделение ДНК. Первоначально нативных гельминтов промывают однократно в стерильном 0,9% растворе NaCl, далее замораживают при температуре -20±2°С. Перед выделением ДНК гельминтов в замороженном состоянии механически перетирают и гомогенизируют до получения однородной суспензии, из которой выделяют ДНК с использованием набора М-Сорб-кровь («НПФ СИНТОЛ», Россия).

Работы проводят согласно требований методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».

Исследуются следующие пробы, содержащие (таблица 1):

1 и 6 – ДНК возбудителя D. immitis;

2 и 5 – ДНК возбудителя D. repens;

3 – смесь ДНК возбудителей D.immitis + D.repens;

4 – ДНК A. lumbricoides;

7 - положительный контроль (К+) D. repens;

8 – положительный контроль (К+) D. immitis;

9 – отрицательный контроль (К-).

В таблице представлены пробы, исследуемые в ПЦР в примере. С каждой пробой поставлена ПЦР с двумя парами праймеров F2690DR/R2812DR и F2690DI/R2812DI.

Приготовление ПЦР смеси:

- отдельно для праймеров к D. repens :

(F2690DR) 5’-АAGTGTTGATGGTCAACCTGAA-3’

(R2812DR) 5’- GTAGAACGCATATTCTGAGT-3’

10-кратный ПЦР буфер с EVAGreen– 2,5 мкл; 25 мМ MgCl2 - 2,5 мкл; 2,5 мМ смесь dNTP – 2,5 мкл; праймер F2690DR (1 О.Е.) - 1 мкл; праймер R2812DR (1 О.Е.) – 1 мкл; ДНК-Taq-полимераза (5 Ед/мкл) – 0,3 мкл, деионизованная вода – 12,2 мкл. Итого 22 мкл реакционной смеси и 3 мкл ДНК на 1 пробу. Конечный объем реакционной смеси равен 25 мкл

- отдельно к праймерам D. immitis.

(F2690DI) 5’- GAGTGTAGAGGGTCAGCCTGAG-3’

(R2812DI) 5’- GTAGAACGTATATTCTGAAC- 3’

10-кратный ПЦР буфер с EVAGreen– 2,5 мкл; 25 мМ MgCl2 - 2,5 мкл; 2,5 мМ смесь dNTP – 2,5 мкл; праймер F2690DI (1 О.Е.) - 1 мкл; праймер R2812DI (1 О.Е.) – 1 мкл; ДНК-Taq-полимераза (5 Ед/мкл) – 0,3 мкл, деионизованная вода – 12,2 мкл. Итого 22 мкл реакционной смеси и 3 мкл ДНК образца на 1 пробу. Конечный объем реакционной смеси равен 25 мкл.

Условия проведения реакции

ПЦР реакция (амплификация) проходит с соблюдением следующих температурных режимов:

- денатурация при 95°С -5 мин (1 цикл);

- затем 45 циклов амплификации, включающих: денатурацию при 95°С - 10 с., отжиг при 60°С - 10 с., синтез при 72°С - 30 с.;

- дополнительный блок «Melt curve» при температурном режиме 60 – 90°С - 10 мин (1 цикл), дискретность 0,5°С/10 с.;

- хранение при 10°С.

Учет результатов выявления происходит автоматически на мониторе компьютера в виде кривых и в численных значениях, отражающих накопление продуктов амплификации в результате специфического взаимодействия предложенных праймеров с участками ДНК D. repens и D. immitis (рис. 2). За положительный результат принимается кривая, дуга которой начинается до 31 Ct. (цикла), за отрицательный результат принимается прямая линия или кривая после 31 Ct.

На рисунке 1 и 2 отражены результаты реакции:

- с праймерами к D. immitis F2690DI/R2812DI показали положительный результат пробы 1, 6, и 8, что соответствует линиям на графике 1, 6, 8;

- с праймерами к D. repens F2690DR/R2812DR показали положительный результат пробы 2, 5, и 7, что соответствует линиям на графике 11, 14, 16;

- с обоими парами праймеров к D. immitis и D. repens (F2690DI/R2812DI и F2690DR/R2812DR) показан положительный результат пробы 3 - линии на графике 3 и 12 соответственно;

- линии 4 и 13 на графике отражают отрицательный результат ПЦР пробы 4 (ДНК A. lumbricoides) с обоими парами праймеров F2690DI/R2812DI и F2690DR/R2812DR соответственно;

- видоспецифические праймеры показали отрицательный результат с ДНК противоположного вида и в отрицательном контроле – линии 2, 5, 7, 9, 10, 15, 17 и 18.

Вывод: праймеры F2690DR/R2812DR специфически выявляют ДНК D. repens; праймеры F2690DI/R2812DI специфически выявляют ДНК D. immitis при данных условиях проведения реакции.

Пример 2. Постановка электрофореза в 2% геле агарозы для подтверждения накопления специфических продуктов амплификата с предложенными специфическими праймерами F2690DR /R2812DR, F2690DI/ R2812DI для выявления D. repens и D. immitis.

Материалом для исследования служат продукты амплификации ДНК, полученные в ходе ПЦР в пробах D. repens и D. immitis с парами праймеров F2690DR/R2812DR и F2690DI/R2812DI по способу 1.

Электрофорез проводят с продуктами амплификации в 2% агарозном геле в присутствии маркера молекулярных масс в течение 20 минут при напряженности электрического поля 6 В/см. На рисунке 3 изображены результаты электрофореза. В лунке 1 - проба, содержащая амплификат специфического праймера F2690DR/R2812DR с ДНК D. repens; в лунке 4 - проба, содержащая амплификат специфического праймера F2690DI/R2812DI с ДНК D. immitis. Как показано на рисунке, выявляются амплифицифированные фрагменты, специфичные для D. repens и D. immitis соответственно (указаны стрелками). В пробах 2 и 3 не выявлено продуктов амплификации, в следствие отсутствия специфического взаимодействия в пробах ДНК дирофилярий с праймерами к противоположному виду.

Вывод: методом электрофореза показано, что при использовании видоспецифических праймеров F2690DR/R2812DR и F2690DI/R2812DI в ходе ПЦР происходит накопление продуктов амплификации специфичных для каждого вида - для D. repens и D. immitis соответственно.

Пример 3. Биоинформационное исследование структуры праймеров D. repens и D. immitis проводили с помощью онлайн ресурса «NCBI BLAST».

На рисунке 4 показано, что нуклеотидная последовательность, применяемая в праймерах F2690DR/R2812DR , на 100% строго специфически соответствует нуклеотидной последовательности ДНК возбудителя дирофиляриоза D. repens (отмечено выделением).

На рисунке 5 показано, что нуклеотидная последовательность, применяемая в праймерах F2690DI/R2812DI, на 100% строго специфически соответствует нуклеотидной последовательности ДНК возбудителя дирофиляриоза D. immitis (отмечено выделением).

Вывод: результаты биоинформационного анализа структуры праймеров F2690DR/R2812DR и F2690DI/R2812DI выявили строгую видовую специфичность нуклеотидной последовательности ДНК возбудителей дирофиляриоза D. repens и D. immitis соответственно.

Рассмотренные примеры доказывают исключительную специфичность предложенных праймеров для выявления видов возбудителя дирофиляриоза Dirofilaria repens и Dirofilaria immitis в ПЦР в режиме реального времени.

Использование предлагаемого изобретения позволяет простым и достоверным способом выявить виды возбудителя дирофиляриоза Dirofilaria repens и Dirofilaria immitis в ПЦР в режиме реального времени с помощью набора специфических праймеров F2690DR, R2812DR, F2690DI, R2812DI. Установление вида возбудителя дирофиляриоза является важным этапом лабораторной диагностики в медицинской, ветеринарной и эпидемиологической практике, а также в изучении распространенности дирофиляриоза у дефинитивных и промежуточных хозяев.

Источники информации

1. Ермакова, Л. А., Нагорный, С. А., Пшеничная, Н. Ю., Криворотова, Е. Ю. Клинические и лабораторные аспекты инвазии Dirofilaria repens человека //Инфекционные болезни. – 2018. – Т. 16. – №. 1. – С. 51-57.

2. Ermakova L. A. Nagorny S. A., Krivorotova E. Y., Pshenichnaya N. Y. Dirofilariarepens in the Russian Federation: current epidemiology, diagnosis, and treatment from a federal reference center perspective //International Journal of Infectious Diseases. – 2014. – Т. 23. – С. 47-52.

3. Ракова В.М. «Молекулярно-биологическая диагностика дирофиляриоза в организмах дефинитивного хозяина и переносчика»: автореф. дис. … канд. биол. наук. М., 2013.

4. Бескровная Ю.В. «Идентификация микрофилярий Dirofilaria spp. с помощью ПЦР MS // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями: сборник материалов международной научной конференции». – М., 2008. – С.73– 74).

5. Бескровная Ю.Г. «Дирофиляриоз на юге России (распространение и диагностика)»: автореф. дис. … канд. биол. наук. М, 2009 г.

6. Морозов Е.Н., Супряга В.Г., Ракова В.М., Морозова Л.Ф., Жукова Л.А. «Дирофиляриоз человека: клинико-диагностические признаки и методы диагностики» // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. – 2014 - №2. - С. 13-17.

1. Способ выявления видов возбудителей дирофиляриоза Dirofilaria repens и Dirofilaria immitis с помощью ПЦР в режиме реального времени, включающий выделение хромосомной ДНК из исследуемого материала, постановку ПЦР со специфическими праймерами и учет полученных результатов, отличающийся тем, что амплификацию исследуемой ДНК проводят с помощью предлагаемых праймеров, специфичных для каждого вида дирофилярий и состоящих из двух пар видовых праймеров:

для Dirofilaria repens

(F2690DR) 5’-АAGTGTTGATGGTCAACCTGAA-3’

(R2812DR) 5’- GTAGAACGCATATTCTGAGT-3’

для Dirofilaria immitis

(F2690DI) 5’- GAGTGTAGAGGGTCAGCCTGAG-3’

(R2812DI) 5’- GTAGAACGTATATTCTGAAC- 3’

выявление осуществляют автоматически в ходе проведения ПЦР на мониторе компьютера в виде кривых и в численных значениях, отражающих накопление продуктов амплификации, специфичных для D. repens и D. immitis со специфическими праймерами; в случае наличия в пробе ДНК D. repens, будет выявляться положительная реакция с праймерами F2690DR/R2812DR, а в случае наличия в пробе ДНК D. immitis, будет выявляться положительная реакция с праймерами F2690DI /R2812DI.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят предварительную подготовку исследуемой ДНК, которая включает: промывку нативных гельминтов однократно в стерильном 0,9% растворе NaCl, далее замораживание при температуре -20±2°С; затем механическое перетирание и гомогенизация до получения однородной суспензии, из которой выделяют ДНК с использованием набора М-Сорб-кровь («НПФ СИНТОЛ», Россия) для постановки ПЦР.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ПЦР проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит:

10-кратный ПЦР буфер с EVAGreen – 2,5 мкл; 25 мМ MgCl2 - 2,5 мкл; 2,5 мМ смесь dNTP – 2,5 мкл; праймер видовой F (1 О.Е.) - 1 мкл; праймер видовой R (1 О.Е.) – 1 мкл; ДНК-Taq-полимераза (5 Ед/мкл) – 0,3 мкл, деионизованная вода – 12,2 мкл.

4. Способ по п 1, отличающийся тем, что ПЦР проводят с соблюдением режимов:

- денатурация при 95°С - 5 мин (1 цикл);

- затем 45 циклов амплификации, включающих: денатурацию при 95°С - 10 с, отжиг при 60°С - 10 с, синтез при 72°С - 30 с;

- дополнительный блок «Melt curve» при температурном режиме 60 – 90°С - 10 мин (1 цикл), дискретность 0,5°С/10 с;

- хранение при 10°С.