Усовершенствованные агенты, связывающие tnf

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина (ISVD), специфически связывающему TNFα. Также раскрыты соединение и композиции, содержащие вышеуказанный ISVD. Изобретение эффективно для лечения воспалительного заболевания кишечника (ВЗК), синдрома раздраженного кишечника, болезни Крона, язвенного колита, мукозита, афтозного стоматита, целиакии, травмы пищеварительного тракта и/или рака пищеварительного тракта. 5 н. и 9 з.п. ф-лы, 11 ил., 16 табл., 7 пр.

 

Изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к аминокислотным последовательностям, соединениям и полипептидам, связывающим фактор некроза опухоли альфа («TNF» или «TNF-альфа»). В частности, настоящее изобретение относится к усовершенствованным одиночным вариабельным доменам тяжелой цепи иммуноглобулинов (также обозначаемым как «ISV» или «ISVD»), связывающимся с фактором некроза опухоли альфа, а также к белкам, полипептидам и другим конструкциям, соединениям, молекулам или химическим компонентам, которые включают такие ISVD, вместе обозначаемым как агенты, связывающие TNF. Другие аспекты, варианты осуществления, характеристики, применения и преимущества изобретения станут понятными для специалистов в данной области техники на основе настоящего раскрытия.

Предшествующий уровень техники

В настоящей заявке аминокислотные остатки/положения в вариабельном домене тяжелой цепи иммуноглобулина указываются по нумерации в соответствии с Kabat. Для удобства на Фигуре 1 приведена таблица, где перечислены некоторые из аминокислотных положений, которые обсуждаются здесь, и их нумерация в соответствии с некоторыми альтернативными системами нумерации (такими, как Aho и IMGT. Однако следует отметить, что если однозначно не указано противоположное, для настоящего описания и формулы изобретения нумерация Kabat имеет главное значение; другие системы нумерации приведены только для ссылки).

Что касается CDR, как хорошо известно в данной области техники, имеется множество общепринятых подходов для определения и описания CDR из VH или VHH фрагмента, таких как определение Kabat (которое основано на вариабельности последовательности и наиболее часто применяется) и определение Chothia (которое основано на расположении структурных петель). Например, можно привести ссылку на сайт http://www.bioinf.org.uk/abs/. Для целей настоящего описания и формулы изобретения, даже если может упоминаться CDR в соответствии с Kabat, CDR наиболее предпочтительно определяется на основе определения Abm (которое основано на программном обеспечении моделирования антител Oxford Molecular's AbM), и считается оптимальным компромиссом между определениями Kabat и Chothia. Вновь приводится ссылка на сайт http://www.bioinf.org.uk/abs/.

Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК) являются хроническими, ведущими к потере трудоспособности и прогрессирующими заболеваниями. Большинство небиологических лекарственных препаратов, таких как аминосалицилаты, стероиды и иммуномодуляторы, обеспечивают симптоматическое улучшение, но не позволяют остановить основной воспалительный процесс и не меняют курс болезни. Появление агентов против фактора некроза опухоли-α (анти-TNF-α) (инфликсимаба, адалимумаба, цертолизумаб пегола) резко изменило способ лечения ВЗК, изменив как курс болезни (меньше операций, меньше госпитализаций, улучшение качества жизни, избавление от стероидов, более высокая клиническая ремиссия и скорость заживления слизистой оболочки как при БК, так и при ЯК), так и качество жизни пациентов и производительность труда (см. Amiot и Peyrin-Biroulet 2015 Ther Adv Gastroenterol 8:66-82). Наиболее распространенным путем применения этих терапевтических белков является инъекция. Так как большинство из этих белков имеют короткий период полужизни в сыворотке, их нужно вводить часто или в больших дозах, чтобы они были эффективными. Системное применение, кроме того, связано с повышенным риском инфицирования. Вместе это приводит к не соблюдению пациентом режима лечения (см. Singh et al. 2008 J Pharm Sci 97:2497-2523).

Однако нежелательные долговременные побочные эффекты и оппортунистические инфекции, в том числе туберкулез и неходжкинская лимфома, обусловлены генерализованной иммуносупрессией, и являются результатом неоднократных системных инъекций согласно текущему протоколу лечения моноклональными антителами (Ali et al., 2013; Galloway et al., 2011; Ford & Peyrin-Biroulet, 2013; Kozuch & Hanauer, 2008; Schreiber et al., 2007; Syed et al., 2013).

Пероральное применение анти-TNF-α-антител позволит избежать некоторых из этих побочных эффектов.

Однако эти анти-TNF-α-агенты представляют собой сложные белки. При пероральной доставке происходит деградация в кислой и богатой протеазами среде желудочно-кишечного тракта (ЖКТ).

При использовании белков-ловушек для защиты терапевтического антитела испытание на больных, с применением поликлональных антител коровьего молозива к человеческому TNF-альфа (AVX-470), вводимых перорально, недавно было проведено Avaxia Biologics Inc. у пациентов с язвенным колитом. Однако исследование было прекращено.

Следовательно, существует потребность в новых лекарствах для ВЗК.

ISVD (и в частности, нанотела), которые могут связывать TNF, и их применение хорошо известны в данной области техники, например, из WO 2004/041862 и WO 2006/122786, которые описывают нанотела против TNF и их применение для профилактики и/или лечения заболеваний и расстройств, связанных и/или опосредованных TNF-α или передачей сигналов для TNF-α, таких как воспаление, ревматоидный артрит, болезнь Крона, язвенный колит, синдром воспаленного кишечника, рассеянный склероз, болезнь Аддисона, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный паротит, диабет 1 типа, эпидидимит, гломерулонефрит, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, болезнь Хашимото, гемолитическая анемия, системная красная волчанка, мужское бесплодие, миастения гравис, пемфигус, псориаз, ревматическая лихорадка, саркоидоз, склеродермия, синдром Шегрена, спондилоартропатии, тиреоидит и васкулит.

WO 2006/122786 раскрывает как SEQ ID NO: 125 специфическое анти-TNF-α нанотело, обозначенное как NC55TNF_NC7 (PMP6C11). Последовательность этого нанотела из предшествующего уровня техники приведена в Таблице А ниже как SEQ ID NO: 58. В Таблице А также приведена (как SEQ ID NO: 1) оптимизированная версия последовательности (также обозначенной в настоящей заявке как «Эталон А») этого агента, связывающего TNF, из предшествующего уровня техники, вместе с его CDR (в соответствии с конвенциями Kabat и Abm). Как можно видеть из выравнивания на Фигуре 2, эта оптимизированная версия последовательности содержит, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 58 из предшествующего уровня техники, следующие мутации: Q1E, A14P, Q27F, S29F, P40A, A49S, K73N, Q75K, V78L, D82aN, K83R и Q108L (в соответствии с нумерацией Kabat).

WO 2015/1733256 относится к усовершенствованным иммуноглобулиновым доменам, включающим С-концевые удлинения, предотвращающим связывание с так называемыми предсуществующими антителами («PEAs»). WO 2015/1733256 раскрывает SEQ ID NO: 345 как специфическое анти-TNF-α нанотело, которое обозначается также как TNF345 (SEQ ID NO: 59). Как можно видеть из выравнивания на Фигуре 2, версия оптимизированной последовательности Эталона А содержит, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 59 из предшествующего уровня техники, следующие мутации: V11L и L89V (в соответствии с нумерацией Kabat).

Коктейль из нейтрализующих токсин VHH фрагментов моноклональных антител ламы недавно был предложен для потенциальной пероральной терапии (Hussack et al., 2011 J Biol Chem 286, 8961–76.). Однако, Dumoulin et al. (2002 Protein Sci, 11, 500–15), Harmsen et al. (2006 Appl Microbiol Biotechnol, 72, 544–51) и Hussack et al. (2012 Methods Mol Biol, 911, 417–29) утверждают, что однодоменные фрагменты антител ламы, как кажется, сильно подвержены протеолитическому разрушению в желудочно-кишечной системе человека.

WO2007/025977 описывает лечение хронического энтероколита, включающего секрецию in situ анти-мTNF нанотел перорального применяемыми бактериями L. lactis.

Изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение направлено на обеспечение усовершенствованных агентов, связывающих TNF, в частности, усовершенствованных анти-TNF соединений и полипептидов, более конкретно анти-TNF ISVD, и еще более конкретно, усовершенствованных анти-TNF нанотел. Усовершенствованные агенты, связывающие TNF, обеспечиваемые изобретением, также упоминаются здесь как «агенты, связывающие TNF, по изобретению» или «агенты, связывающие TNF».

Более конкретно, настоящее изобретение направлено на обеспечение усовершенствованных агентов, связывающих TNF, которые были бы полезны при лечении заболеваний пищеварительного тракта, таких как, например, воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), синдром раздраженного кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, мукозит, афтозный стоматит, целиакия, травма пищеварительного тракта и рак пищеварительного тракта. Эти агенты, связывающие TNF, должны предпочтительно быть стабильными и пригодными для перорального применения.

Ожидается, что перорально применяемые агенты, связывающие TNF, не только нейтрализуют TNF в просвете пищеварительного тракта, но и получают доступ к собственной пластинке слизистой оболочки и подслизистой оболочке, поскольку интестинальный барьер пищеварительного тракта может быть нарушен или скомпрометирован при сильном воспалении и/или изъязвлении, включая заболевание пародонта, афтозный стоматит; бактериальные, вирусные, грибковые или паразитарные инфекции пищеварительного тракта; пептические язвы; язвы, связанные со стрессом или инфекцией H.pylori; повреждение, вызванное рефлюксом пищевода; воспалительное заболевание кишечника; повреждение, вызванное раком пищеварительного тракта; непереносимость пищи, включая целиакию, или язвы, вызванные НПВС или другими перорально или системно доставляемыми лекарствами, но не ограничиваясь ими.

Таким образом, изобретение направлено на усовершенствованные агенты, связывающие TNF, которые являются вариантами Эталона А, и которые отличаются уменьшенным связыванием с интерферирующими факторами (как правило, обозначаемыми как «предсуществующие антитела» или «PEAs»), которые могут присутствовать в сыворотках некоторых здоровых субъектов, а также пациентов. Приводится ссылка на WO 2012/175741, WO 2013/024059 а также, например, на и Holland et al. (J. Clin. Immunol. 2013, 33(7):1192-203), а также на одновременно ожидающую решения опубликованную РСТ заявку WO2015/173325 (№ PCT/EP2015/060643) от Ablynx N.V., поданную 13 мая 2015 и озаглавленную «Усовершенствованные иммуноглобулиновые вариабельные домены».

Как дополнительно описано в настоящей заявке, агенты, связывающие TNF, из изобретения, имеют ту же комбинацию CDR (т.е. CDR1, CDR2 и CDR3), как представлено в Эталоне А.

Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие агенты, связывающие TNF, из изобретения перечислены на Фигуре 3 как SEQ ID NO 8-41, 62, 63, 64, 65, 66 и 69. Фигура 4 показывает выравнивание последовательностей SEQ ID NO: 8-41 с SEQ ID NO: 1 (Эталон A) и SEQ ID NO: 58 (PMP6C11). Агенты, связывающие SEQ ID NO 22 - 41, 62-66 и 69, являются примерами агентов, связывающий TNF, из изобретения, имеющих С-концевое аланиновое удлинение, т.е. аланиновый остаток на С-конце последовательности ISVD (также иногда обозначаемый как «положение 114»), по сравнению с С-концевой последовательностью VTVSS (SEQ ID NO: 55,. как присутствует в Эталоне А). Как описано в WO 2012/175741 (но также, например, в WO 2013/024059 и WO2015/173325), это С-концевое аланиновое удлинение может предотвращать связывание так называемых «предсуществующих антител» (предположительно являющихся IgG) с предполагаемым эпитопом, который расположен на С-концевой области ISVD. Этот эпитоп, как предполагают, включает, среди прочих остатков, расположенные на поверхности аминокислотные остатки С-концевой последовательности VTVSS, а также аминокислотный остаток в положении 14 (и аминокислотные остатки, следующие/близкие к нему в аминокислотной последовательности, такие как в положениях 11, 13 и 15), и может также включать аминокислотный остаток в положении 83 (и аминокислотные остатки, следующие/близкие к нему в аминокислотной последовательности, такие как в положениях 82, 82а, 82b и 84) и/или аминокислотный остаток в положении 108 (и аминокислотные остатки, следующие/близкие к нему в аминокислотной последовательности, такие как в положении 107).

Однако, хотя наличие такого С-концевого аланина (или в целом, С-концевого удлинения) может значительно уменьшить (и во многих случаях даже по существу полностью предотвратить) связывание «предсуществующих антител», которые могут быть найдены в сыворотках некоторых субъектов (как здоровых, так и больных), было обнаружено, что сыворотки некоторых субъектов (такие, как сыворотки от пациентов с некоторыми иммунными заболеваниями, такими как СКВ) могут содержать предсуществующие антитела, которые могут связываться с C-концевой областью ISVD (когда такая область подвергается воздействию), даже если ISVD содержит такой C-концевой аланин (или, более обобщенно, такое C-концевое удлинение). Ссылка снова приводится на ожидающую решения опубликованную заявку РСТ WO 2015/173325 от заявителя, поданную 13 мая 2015 года и озаглавленную «Усовершенствованные иммуноглобулиновые вариабельные домены».

Соответственно, одной из конкретных целей изобретения является обеспечение агентов, связывающих TNF, которые являются усовершенствованными вариантами анти-TNF нанотел, которые упоминаются здесь как «Эталон А», и которые имеют уменьшенное связывание с так называемыми «предсуществующими антителами» и, в частности, типа, описанного в WO 02015/173325 (т.е. с теми предсуществующими антителами, которые могут связываться с открытой C-концевой областью ISVD даже в присутствии С-концевого удлинения).

Как правило, изобретение достигает этой цели путем обеспечения аминокислотных последовательностей, которые являются вариантами последовательности SEQ ID NO: 1, которые включают следующие аминокислотные остатки (то есть мутации по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 1):

- 89T; или

- 89L в комбинации с 11V; или

- 89L в комбинации с 110K или 110Q; или

- 89L в комбинации с 112K или 112Q; или

- 89L в комбинации с 11V и 110K или 110Q; или

- 89L в комбинации с 11V и 112K или 112Q; или

- 11V в комбинации с 110K или 110Q; или

- 11V в комбинации с 112K или 112Q.

В частности, в агентах, связывающих TNF, обеспеченных настоящим изобретением:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L или V; и

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V или L; и

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K или Q;

так что (i) положение 89 представлено T; или (ii) положение 89 представлено L, а положение 11 представлено V; или (iii) положение 89 представлено L, а положение 110 представлено K или Q; или (iv) положение 89 представлено L, а положение 112 представлено K или Q; или (v) положение 89 представлено L, а положение 11 представлено V, а положение 110 представлено K или Q; или (vi) положение 89 представлено L, а положение 11 представлено V и положение 112 представлено K или Q; или (vii) положение 11 представлено V, а положение 110 представлено K или Q; или (vii) положение 11 представлено V, а положение 112 представлено K или Q.

Из аминокислотных последовательностей, обеспечиваемых изобретением, аминокислотные последовательности, в которых положение 89 представлено T или в которых положение 11 представлено V, а положение 89 представлено L (при необходимости в подходящей комбинации с мутацией 110K или 110Q и/или мутацией 112K или 112Q, и в частности в сочетании с мутацией 110K или 110Q), являются особо предпочтительными. Еще более предпочтительными являются аминокислотные последовательности, в которых положение 11 представлено V, а положение 89 представлено L, при необходимости с мутацией 110K или 110Q.

В особенно предпочтительном варианте осуществления в агентах, связывающих TNF, обеспеченных в настоящем изобретении, аминокислотный остаток в положении 11 представляет собой V, аминокислотный остаток в положении 89 представляет собой L, аминокислотный остаток в положении 110 представляет собой T, и аминокислотный остаток в положении 112 представляет собой S.

В особо предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к агентам, связывающим TNF, таким как одиночные вариабельные домены иммуноглобулина (ISVD), имеющие:

- CDR1 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью GFTFSTADMG (SEQ ID NO: 5); и

- CDR2 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью RISGIDGTTY (SEQ ID NO: 6); и

- CDR3 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4);

и имеющие:

- степень идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой какое-либо С-концевое удлинение, которое может присутствовать, а также CDR, не учитываются при определении степени идентичности последовательности) по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%; и/или

- не более 7, например, не более 5, предпочтительно не более 3, например, всего 3, 2 или 1 «аминокислотные различия» (как определяется в настоящей заявке, и не учитывая любую из вышеперечисленных мутаций в положении(ях) 11, 89, 110 или 112, которые могут присутствовать, и без учета любого С-концевого удлинения, которое может присутствовать) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой указанные аминокислотные различия, если присутствуют, могут присутствовать в каркасе и/или CDR, но предпочтительно присутствуют только в каркасе, но не в CDR); и

- аминокислотным остатком в положении 11 является V; и

- аминокислотным остатком в положении 89 является L; и

- аминокислотным остатком в положении 110 является T; и

- аминокислотным остатком в положении 112 является S; и

- аминокислотным остатком в положении 49 является A; и

- аминокислотным остатком в положении 74 является S.

Как уже упоминалось, аминокислотные последовательности, предлагаемые описанным здесь изобретением, могут связываться (и, в частности, могут специфически связываться) с TNF.

Аминокислотные последовательности, предлагаемые изобретением, предпочтительно имеют значение EC50 в анализе на основе клеток с использованием клеток KYM, описанных в Примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше чем 50 нМ, более предпочтительно, лучше чем 25 нМ, такое как менее 10 нм.

В Таблице B перечислены некоторые не ограничивающие возможные комбинации аминокислотных остатков, которые могут присутствовать в положениях 11, 89, 110 и 112 в агентах, связывающих TNF, по изобретению. Комбинации, которые являются особенно предпочтительными, выделены жирным шрифтом, и наиболее предпочтительные комбинации указаны жирным шрифтом/подчеркиванием.

Однако при оптимизации последовательностей («оптимизации последовательности») агентов, связывающих TNF, в отношении минимизации или исключения участков связывания для предсуществующих антител, с одной стороны, и гуманизации, с другой стороны, различные свойства агентов, связывающих TNF, включая стабильность, были (заметно) подвержены отрицательному влиянию. В частности, температура плавления как мера физической стабильности уменьшалась, продукция как у эукариотического хозяина P. pastoris, так и прокариотического хозяина E. coli уменьшалась, а стабильность в жидкостях ЖКТ снижалась.

Вместо «мутации к первоначальному виду» сайтов связывания PEA и гуманизирующих мутаций, тем самым дискредитируя оптимизацию последовательности, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что аминокислотные остатки 49 и/или 74 могут быть изменены таким образом, чтобы удовлетворялись оба кажущиеся взаимоисключающими требования. В Таблицах B-1 и B-2 перечислены некоторые не ограничивающие возможные комбинации аминокислотных остатков, которые могут присутствовать в положениях 11, 89, 110, 112, 49 и/или 74 в агентах, связывающих TNF, по изобретению.

Агенты, связывающие TNF, в соответствии с изобретением, являются также такими, как изложено в описании, примерах и фигурах, т.е. они имеют CDR, которые являются такими, как описано в настоящей заявке, и имеют общую степень идентичности последовательности (как описано в настоящей заявке) с последовательностью SEQ ID NO: 1, являющейся такой, как раскрыто в настоящей заявке, и/или могут иметь ограниченное число «аминокислотных различий» (как описано в настоящей заявке) с этими эталонными последовательностями (одной из них).

Агенты, связывающие TNF, из изобретения, предпочтительно включают следующие CDR (в соответствии с конвенцией Kabat):

- CDR1 (в соответствии с Kabat), который является аминокислотной последовательностью TADMG (SEQ ID NO: 2); и

- CDR2 (в соответствии с Kabat), который является аминокислотной последовательностью RISGIDGTTYYDEPVKG (SEQ ID NO: 3); и

- CDR3 (в соответствии с Kabat), который является аминокислотной последовательностью PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO:4).

Альтернативно, когда CDR приведены в соответствии с конвенцией Abm, агенты, связывающие TNF, из изобретения предпочтительно включают следующие CDR:

- CDR1 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью GFTFSTADMG (SEQ ID NO:5); и

- CDR2 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью RISGIDGTTY (SEQ ID NO:6); и

- CDR3 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO:4).

Агент, связывающий TNF, из изобретения, предпочтительно также имеет:

- степень идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой какое-либо С-концевое удлинение, которое может присутствовать, а также CDR, не учитываются при определении степени идентичности последовательности) по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%; и/или

- не более 7, например, не более 5, предпочтительно не более 3, например, всего 3, 2 или 1 «аминокислотные отличия» (как определяется в настоящей заявке, и не учитывая любую из вышеперечисленных мутаций в положении(ях) 11, 89, 110 или 112, которые могут присутствовать, и без учета любого С-концевого удлинения, которое может присутствовать) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой указанные аминокислотные отличия, если присутствуют, могут присутствовать в каркасе и/или CDR, но предпочтительно присутствуют только в каркасе, но не в CDR).

Что касается различных аспектов и предпочтительных аспектов агентов, связывающих TNF, обеспечиваемых изобретением, когда они доходят до степени идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 1 и/или числу и виду «аминокислотных различий», которые могут присутствовать в таком связывающем агенте из изобретения (т.е., по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 1), необходимо отметить, что, когда сказано, что (i) аминокислотная последовательность по изобретению имеет степень идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO:1 по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно не менее 95% (где CDR, любое C-терминальное удлинение, которое может присутствовать, а также мутации в позициях 11, 89, 110 и / или 112, требуемые конкретным аспектом, не учитываются для определения степени идентичности последовательности); и/или когда сказано, что (ii) аминокислотная последовательность по изобретению имеет не более 7, предпочтительно не более 5, например, только 3, 2 или 1 «аминокислотных различия» с последовательностью SEQ ID NO: 1 (опять же, не принимая во внимание любое С-концевое удлинение, которое может присутствовать, и не принимая во внимание мутации в положениях 11, 89, 110 и/или 112, требуемые конкретным аспектом), тогда она также включает в себя последовательности, которые не имеют аминокислотных различий с последовательностью SEQ ID NO: 1, кроме мутаций в положениях 11, 89, 110 и/или 112, требуемых по конкретному аспекту, и любое C-концевое удлинение, которое может присутствовать.

Таким образом, в одном конкретном аспекте изобретения агенты, связывающие TNF, по изобретению могут иметь 100% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1 (включая CDR, но не принимая во внимание мутацию (мутации) или комбинацию мутаций в положениях 11 , 49, 74, 89, 110 и/или 112, раскрытые в настоящей заявке, и/или любое С-концевое удлинение, которое может присутствовать), и/или могут не иметь аминокислотных различий с SEQ ID NO: 1 (то есть иных, чем мутация (мутации)) или комбинацию мутаций в положениях 11, 89, 110 и/или 112, раскрытых в настоящей заявке, и любое С-концевое удлинение, которое может присутствовать).

Когда присутствуют какие-либо аминокислотные различия (т.е. помимо С-концевого удлинения и мутаций в положениях 11, 89, 110 и/или 112, которые требуются специфическим аспектом настоящего изобретения), эти аминокислотные различия могут присутствовать в CDR и/или в каркасных областях, но предпочтительно они присутствуют только в каркасных областях (как определено конвенцией Abm, т.е. не в CDR, как определено в соответствии с конвенцией Abm), т.е. чтобы агенты, связывающие TNF, из настоящего изобретения, имели те же самые CDR (определенные в соответствии с конвенцией Abm), которые присутствуют в SEQ ID NO: 1.

Кроме того, когда агент, связывающий TNF, по изобретению в соответствии с любым аспектом изобретения имеет одно или несколько аминокислотных различий с последовательностью SEQ ID NO: 1 (помимо мутаций в положениях 11, 89, 110 и/или 112, которые требуются по конкретному аспекту), то некоторые конкретные, но не ограничивающие примеры таких мутаций/аминокислотных различий, которые могут присутствовать (т.е. по сравнению с последовательностями SEQ ID NO: 1), представляют собой, например, E1D, P40A, P40L, P40S (и, в частности, P40A), S49A, A74S, L78V, T87A или любую их подходящую комбинацию. Кроме того, агенты, связывающие TNF по изобретению, могут соответственно содержать (подходящую комбинацию) мутаций D60A, E61D и/или P62S, в частности, как мотив ADS в положениях 60-62 (см. SEQ ID NO: 39 для не ограничивающего примера). Другими примерами мутаций являются (подходящая комбинация) одна или несколько подходящих «гуманизирующих» замен; ссылка, например, приводится на WO 2009/138519 (или на известный уровень техники, указанный в WO 2009/138519) и WO 2008/020079 (или на известный уровень техники, указанный в WO 2008/020079), а также на Таблицы A-3 - A-8 из WO 2008/020079 (которые представляют собой списки, показывающие возможные гуманизирующие замены).

Из вышеупомянутых мутаций присутствие S49A, A74S и/или L78V мутации (или любой подходящей комбинации любых двух из них, включая все три) является предпочтительным (см. SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41, и 62-63). Фигура 5 показывает выравнивание SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO 36-41.

Кроме того, когда агенты, связывающие TNF, по изобретению, присутствуют и/или образуют N-концевую часть полипептида или соединения, в котором они присутствуют, тогда они предпочтительно содержат D в положении 1 (то есть мутацию E1D по сравнению с Эталоном A). Соответственно, в следующем аспекте изобретение относится к полипептиду по изобретению (который описан далее здесь), который имеет агент, связывающий TNF, по изобретению, (который описан далее) на своем N-конце, где указанный агент, связывающий TNF, по изобретению, имеет D в положении 1.

Аналогично, когда агент, связывающий TNF, по изобретению, используется в одновалентном формате, он предпочтительно имеет как C-концевое удлинение X(n), как описано в настоящей заявке, так и D в положении 1.

Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие примеры одновалентных агентов, связывающих TNF, с D в положении 1 и C-концевым удлинением, приведены как SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 и 62-63, предпочтительно SEQ ID NO: 36, 39 и 40, наиболее предпочтительно SEQ ID NO: 40. В этом отношении следует отметить, что агенты, связывающие TNF с SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 и 62-63 также могут быть использованы в соединении или полипептиде по изобретению, который не находится в одновалентном формате. В этом случае, когда связывающие TNF последовательности SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 и 62-63 предпочтительно будут иметь E вместо D на своем N-конце (т.е. мутацию D1E, по сравнению с последовательностями SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 и 62-63), когда они не присутствуют на N-концевом конце указанного полипептида или соединения из изобретения (вместо этого предпочтительно N-концевой ISVD указанного полипептида или соединения по изобретению будет иметь D в положении 1; а также они предпочтительно не будут содержать С-концевое удлинение (такое как С-концевой аланин, присутствующий в SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 и 62-63), когда они не присутствуют на С-конце соединения или полипептида (вместо этого предпочтительно С-концевой ISVD указанного полипептида или соединения по изобретению будет иметь C-концевое удлинение).

С помощью предпочтительных, но не ограничивающих примеров SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38 и 62-63 также являются примерами агентов, связывающих TNF, по изобретению, имеющих дополнительные аминокислотные отличия с SEQ ID NO: 1, т.е. S49A, A74S и/или L78V. Таким образом, в конкретном аспекте изобретение относится к агентам, связывающим TNF, по изобретению (т.е. имеющим мутации в положениях 11, 89, 110 и/или 112, как описано в настоящей заявке, а также далее, как описано здесь), которые по меньшей мере имеют подходящую комбинацию мутацию S49A, A74S и/или L78V, и предпочтительно подходящую комбинацию любых двух из этих мутаций, таких как все три из этих мутаций.

Агенты, связывающие TNF, из настоящего изобретения, когда они применяются в одновалентном формате и/или когда они присутствуют на С-конце и/или образуют С-конец белка, полипептида или другого соединения или конструкции, в которой они присутствуют (или когда они иначе имеют «открытый» С-конец на таком белке, полипептиде или другом соединении или конструкции, это, как правило, означает, что С-конец ISVD не ассоциирован и не связан с константным доменом (таким, как СН1 домен); вновь приводится ссылка на WO 2012/175741 и WO 2015/1733256), предпочтительно, также имеют С-концевое удлинение формулы (X)_n, в котором n составляет от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 (и предпочтительно 1 или 2, например, 1); а каждый Х является (предпочтительно природным) аминокислотным остатком, независимо выбранным из природных аминокислотных остатков (хотя в соответствии с одним предпочтительным аспектом, он не включает каких-либо цистеиновых остатков), и предпочтительно независимо выбранным из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) или изолейцина (I).

В соответствии с некоторыми предпочтительными не ограничивающими примерами таких С-концевых удлинений, X_(n), X и n могут быть следующими:

- n = 1 и X = Ala;

- n = 2, а каждый Х = Ala;

- n = 3, а каждый X = Ala;

- n = 2 и по меньшей мере один X = Ala (где остальные аминокислотные остатки (остаток) Х независимо выбраны из природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбраны из Val, Leu и/или Ile);

- n = 3 и по меньшей мере один X = Ala (где остальные аминокислотные остатки (остаток) Х независимо выбраны из природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбраны из Val, Leu и/или Ile);

- n = 3 и по меньшей мере два X = Ala (где остальные аминокислотные остатки (остаток) Х независимо выбраны из природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбраны из Val, Leu и/или Ile);

- n = 1 и X = Gly;

- n = 2 и каждый X = Gly;

- n = 3 и каждый X = Gly;

- n = 2 и по меньшей мере один X = Gly (где остальные аминокислотные остатки (остаток) Х независимо выбраны из природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбраны из Val, Leu и/или Ile);

- n = 3 и по меньшей мере один X = Gly (где остальные аминокислотные остатки (остаток) Х независимо выбраны из природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбраны из Val, Leu и/или Ile);

- n = 3 и по меньшей мере X = Gly (где остальные аминокислотные остатки (остаток) Х независимо выбраны из природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбраны из Val, Leu и/или Ile);

- n = 2 и каждый X = Ala или Gly;

- n = 3 и каждый X = Ala или Gly;

- n = 3 и по меньшей мере один X = Ala или Gly (где остальные аминокислотные остатки (остаток) Х независимо выбраны из природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбраны из Val, Leu и/или Ile); или

- n = 3 и по меньшей мере два X = Ala или Gly (где остальные аминокислотные остатки (остаток) Х независимо выбраны из природных аминокислот, но предпочтительно независимо выбраны из Val, Leu и/или Ile);

где аспекты (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) и (n) являются особо предпочтительными, аспекты, в которых n =1 или 2, являются предпочтительными, а аспекты, в которых n = 1, являются особо предпочтительными.

Необходимо также отметить, что предпочтительно каждое С-концевое удлинение, присутствующее в агенте, связывающем TNF, из изобретения не содержит (свободного) цистеинового остатка (если только указанный цистеиновый остаток не используется или не предназначается для дополнительной функционализации, например, для пэгилирования).

Некоторые специфические, но не ограничивающие примеры пригодных С-концевых удлинений являются следующими аминокислотными последовательностями: A, AA, AAA, G, GG, GGG, AG, GA, AAG, AGG, AGA, GGA, GAA или GAG.

Когда агенты, связывающие TNF, из настоящего изобретения, содержат мутации в положениях 110 или 112 (при необходимости в комбинации с мутациями в положениях 11 и/или 89, как описано в настоящей заявке), С-концевые аминокислотные остатки из каркаса 4 (начиная от положения 109) могут быть следующими: (i) если не присутствует С-концевое удлинение: VTVKS (SEQ ID NO: 43), VTVQS (SEQ ID NO: 44), VKVSS (SEQ ID NO: 45) или VQVSS (SEQ ID NO: 46); или (ii) если присутствует С-концевое удлинение: VTVKSX_(n) (SEQ ID NO: 47), VTVQSX(n) (SEQ ID NO: 48), VKVSSX(n) (SEQ ID NO: 49) или VQVSSX_(n) (SEQ ID NO: 50), например, VTVKSA (SEQ ID NO: 51), VTVQSA (SEQ ID NO: 52), VKVSSA (SEQ ID NO: 53) или VQVSSA (SEQ ID NO: 54). Когда агенты, связывающие TNF, из изобретения не содержат мутаций в положениях 110 или 112 (но только мутации в положениях 11 и/или 89, как описано в настоящей заявке), С-концевые аминокислотные остатки из каркаса 4 (начиная от положения 109) обычно являются либо: (i) когда не присутствует С-концевое удлинение: VTVSS (SEQ ID NO: 55) (как в последовательности SEQ ID NO: 1); либо (ii) когда присутствует С-концевое удлинение: VTVSSX_(n) (SEQ ID NO: 56), например, VTVSSA (SEQ ID NO: 57). В этих С-концевых последовательностях X и n являются такими, как определено в настоящей заявке для С-концевых удлинений.

Как можно видеть из выравнивания на Фигуре 4, а также на Фигуре 3, агенты, связывающие TNF, из SEQ ID NOs: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 и 62-63 имеют и мутацию E1D, и С-концевое аланиновое удлинение. Как упоминалось, присутствие D в положении 1, а также С-концевого удлинения делает эти агенты, связывающие TNF (и другие агенты, связывающие TNF, из изобретения с D в положении 1 и С-концевым удлинением), особенно пригодными для применения в одновалентном формате (т.е. для целей, описанных в настоящей заявке).

Соответственно, в следующем аспекте изобретение относится к агенту, связывающему TNF (который описан далее), который имеет D в положении 1 и C-концевое удлинение X(n) (которое предпочтительно представляет собой один остаток Ala). Указанные агенты, связывающие TNF, предпочтительно (используются и/или предназначены для использования) в одновалентном формате. В одном конкретном аспекте указанный одновалентный агент, связывающий TNF, выбран из SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 62, 63 и 41.

Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие примеры агентов, связывающих TNF, по изобретению приведены в SEQ ID NO: 8-41 и 62-69, и каждая из этих последовательностей образует еще один аспект изобретения (как и белки, полипептиды или другие соединения или конструкции, которые содержат одну из этих последовательностей).

Некоторыми особенно предпочтительными агентами, связывающими TNF, по изобретению являются последовательности SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41 и 62-63 (или, как описано в настоящей заявке, их варианты с E в положении 1 и/или без С-концевого удлинения, в зависимости от их предполагаемого использования в полипептиде или соединении по изобретению).

Таким образом, в первом аспекте изобретение относится к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина, имеющему:

- CDR1 (в соответствии с Kabat), являющийся аминокислотной последовательностью TADMG (SEQ ID NO: 2); и

- CDR2 (в соответствии с Kabat), являющийся аминокислотной последовательностью RISGIDGTTYYDEPVKG (SEQ ID NO: 3); и

- CDR3 (в соответствии с Kabat), являющийся аминокислотной последовательностью PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4);

и имеющему:

- степень идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой любое C-концевое удлинение, которое может присутствовать, а также CDR не учитываются для определения степени идентичности последовательности), по меньшей мере, 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%;

и/или

- не более 7, например, не более 5, предпочтительно не более 3, например, только 3, 2 или 1 «аминокислотных различия» (как определено в настоящей заявке, и не принимая во внимание ни одну из перечисленных выше мутаций в положении(ях) 11, 89, 110 или 112, которые могут присутствовать, и не учитывать любое С-концевое удлинение, которое может присутствовать) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой указанные аминокислотные различия, если имеются, могут присутствовать в каркасах и/или CDR, но предпочтительно присутствуют только в каркасах, а не в CDR);

и при необходимости имеющему:

- C-концевое удлинение (X)_n, в котором n составляет от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 (и предпочтительно, 1 или 2, например, 1); а каждый X является (предпочтительно природным) аминокислотным остатком, который независимо выбран, и предпочтительно независимо выбран из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) или изолейцина (I);

в котором:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L или V; и

- аминокислотный остаток в положении 89 предпочтительно выбран из T, V или L; и

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран из T, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран из S, K или Q;

так что (i) положение 89 представлено T; или (ii) положение 89 представлено L, а положение 11 представлено V; или (iii) положение 89 представлено L, а положение 110 представлено K или Q; или (iv) положение 89 представлено L, а положение 112 представлено K или Q; или (v) положение 89 представлено L, а положение 11 представлено V, а положение 110 представлено K или Q; или (vi) положение 89 представлено L, а положение 11 представлено V, а положение 112 представлено K или Q; или (vii) положение 11 представлено V, а положение 110 представлено K или Q; или (vii) положение 11 представлено V, а положение 112 представлено K или Q.

В другом аспекте изобретение относится к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина, имеющему:

- CDR1 (в соответствии с Kabat), который является аминокислотной последовательностью TADMG (SEQ ID NO: 2); и

- CDR2 (в соответствии с Kabat), который является аминокислотной последовательностью RISGIDGTTYYDEPVKG (SEQ ID NO: 3); и

- CDR3 (в соответствии с Kabat), который является аминокислотной последовательностью PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4);

и имеющему:

- степень идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой любое C-концевое удлинение, которое может присутствовать, а также CDR не учитываются для определения степени идентичности последовательности), по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%;

и/или

- не более 7, например, не более 5, предпочтительно не более 3, например, только 3, 2 или 1 «аминокислотных различия» (как определено в настоящей заявке, и не принимая во внимание ни одну из перечисленных выше мутаций в положении(ях) 11, 89, 110 или 112, которые могут присутствовать, и не учитывать любое С-концевое удлинение, которое может присутствовать) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой указанные аминокислотные различия, если они имеются, присутствуют в каркасах и/или CDR, но предпочтительно присутствуют только в каркасах, а не в CDR);

и при необходимости имеющему:

- C-концевое удлинение (X)_n, в котором n составляет от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 (и предпочтительно 1 или 2, например, 1); а каждый X является (предпочтительно природным) аминокислотным остатком, который независимо выбран, и предпочтительно независимо выбран из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) или изолейцина (I);

где одиночный вариабельный домен иммуноглобулина включает следующие аминокислотные остатки (т.е. мутации, по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1) в упомянутых положениях (нумерация в соответствии с Kabat):

- 89T; или

- 89L в комбинации с 11V; или

- 89L в комбинации с 110K или 110Q; или

- 89L в комбинации с 112K или 112Q; или

- 89L в комбинации с 11V и 110K или 110Q; или

- 89L в комбинации с 11V и 112K или 112Q; или

- 11V в комбинации с 110K или 110Q; или

- 11V в комбинации с 112K или 112Q.

В частности, агенты, связывающие TNF, по изобретению предпочтительно имеют не более 7, например не более 5, предпочтительно не более 3, например, только 3, 2 или 1 «аминокислотных различия» (как определено в настоящей заявке, и не учитывая любую из вышеперечисленных мутаций в положении(ях) 11, 89, 110 или 112, которые могут присутствовать и не учитывая любое С-концевое удлинение, которое может присутствовать) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой указанные аминокислотные различия, если они имеются, могут присутствовать в каркасах и/или CDR, но предпочтительно присутствуют только в каркасах, а не в CDR).

В частности, в агентах, связывающих TNF, обеспеченных изобретением, аминокислотный остаток в положении 11 представлен V, аминокислотный остаток в положении 89 представлен L, аминокислотный остаток в положении 110 представлен T, и аминокислотный остаток в положении 112 представлен S.

Как описано в настоящей заявке, некоторые конкретные, но не ограничивающие примеры таких мутаций/аминокислотных различий, которые могут присутствовать (то есть в подходящей комбинации), представляют собой, например, E1D, P40A, P40L, P40S (и в частности, P40A), S49A, A74S, L78V, T87A или любую их подходящую комбинацию, а также, например, (подходящую комбинацию) мутаций D60A, E61D и/или P62S (в частности, как мотив ADS в положениях 60-62) и (подходящую комбинацию, см., например, SEQ ID NO: 39) одну или несколько подходящих «гуманизирующих» замен. Как также упоминалось, присутствие мутации S49A, A74S и/или L78V (или любой подходящей комбинации любых двух из них, включая все три из них) является предпочтительным (а также наличие D в положении 1, когда агент, связывающий TNF, присутствует и/или образует N-конец соединения или полипептида по изобретению, или находится в одновалентном формате).

В предпочтительном аспекте агент, связывающий TNF, из изобретения, такой как ISVD, включает аланин в положении 49 (A49).

В другом предпочтительном аспекте агент, связывающий TNF, из изобретения, такой как ISVD, включает серин в положении 74 (S74).

В другом предпочтительном аспекте агент, связывающий TNF, из изобретения, такой как ISVD, включает аспарагин в положении 73 (N73) и/или лизин в положении 75 (K75).

Как упоминалось, в изобретении аминокислотные последовательности, в которых положение 89 представлено T или в которых положение 11 представлено V, а положение 89 представлено L (при необходимости в подходящей комбинации с мутацией 110K или 110Q и/или мутацией 112K или 112Q, и особенно в сочетании с мутацией 110K или 110Q) являются особо предпочтительными. Еще более предпочтительными являются аминокислотные последовательности, в которых положение 11 представлено V, а положение 89 представлено L, при необходимости с мутацией 110K или 110Q.

Таким образом, в одном предпочтительном аспекте изобретение относится к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина, имеющему:

- CDR1 (в соответствии с Kabat), который является аминокислотной последовательностью TADMG (SEQ ID NO: 2); и

- CDR2 (в соответствии с Kabat), который является аминокислотной последовательностью RISGIDGTTYYDEPVKG (SEQ ID NO: 3); и

- CDR3 (в соответствии с Kabat), который является аминокислотной последовательностью PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4);

и имеющему:

- степень идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой любое C-концевое удлинение, которое может присутствовать, а также CDR не учитываются для определения степени идентичности последовательности), по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%;

и/или

- не более 7, например, не более 5, предпочтительно не более 3, например, только 3, 2 или 1 «аминокислотных различия» (как определено в настоящей заявке, и не принимая во внимание ни одну из перечисленных выше мутаций в положении(ях) 11, 89, 110 или 112, которые могут присутствовать, и не учитывать любое С-концевое удлинение, которое может присутствовать) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой указанные аминокислотные различия, если они имеются, присутствуют в каркасах и/или CDR, но предпочтительно присутствуют только в каркасах, а не в CDR);

и при необходимости имеющему:

- C-концевое удлинение (X)_n, в котором n составляет от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 (и предпочтительно 1 или 2, например, 1); а каждый X является (предпочтительно природным) аминокислотным остатком, который независимо выбран, и предпочтительно независимо выбран из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) или изолейцина (I);

в котором:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L или V; и

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен Т; и

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно подходящим образом выбран из T, K или Q (и предпочтительно представлен Т); и

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно подходящим образом выбран из S, K или Q (и предпочтительно представлен S).

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина, имеющему:

- CDR1 (в соответствии с Kabat), который является аминокислотной последовательностью TADMG (SEQ ID NO: 2); и

- CDR2 (в соответствии с Kabat), который является аминокислотной последовательностью RISGIDGTTYYDEPVKG (SEQ ID NO: 3); и

- CDR3 (в соответствии с Kabat), который является аминокислотной последовательностью PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4);

и имеющему:

- степень идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой любое C-концевое удлинение, которое может присутствовать, а также CDR не учитываются для определения степени идентичности последовательности), по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%;

и/или

- не более 7, например, не более 5, предпочтительно не более 3, например, только 3, 2 или 1 «аминокислотных различия» (как определено в настоящей заявке, и не принимая во внимание ни одну из перечисленных выше мутаций в положении(ях) 11, 89, 110 или 112, которые могут присутствовать, и не учитывать любое С-концевое удлинение, которое может присутствовать) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой указанные аминокислотные различия, если они имеются, присутствуют в каркасах и/или CDR, но предпочтительно присутствуют только в каркасах, а не в CDR);

и при необходимости имеющему:

- C-концевое удлинение (X)_n, в котором n составляет от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 (и предпочтительно 1 или 2, например, 1); а каждый X является (предпочтительно природным) аминокислотным остатком, который независимо выбран, и предпочтительно независимо выбран из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) или изолейцина (I);

в котором:

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен V; и

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен L; и

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно подходящим образом выбран из T, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно подходящим образом выбран из S, K или Q.

В одном специфическом, но не ограничивающем аспекте агенты, связывающие TNF, из изобретения включают следующие аминокислотные остатки (т.е. мутации, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 1) в упомянутых положениях (нумерация в соответствии с Kabat):

- 11V в комбинации с 89L; или

- 11V в комбинации с 110K или 110Q;

- 11V в комбинации с 112K или 112Q;

- 11V в комбинации с 89L и 110K или 110Q; или

- 11V в комбинации с 89L и 112K или 112Q;

и имеют CDR (в соответствии с Kabat), и имеют общую степень идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, которая описана выше.

В другом специфическом, но не ограничивающем аспекте агенты, связывающие TNF, из изобретения включают следующие аминокислотные остатки (т.е. мутации, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 1) в упомянутых положениях (нумерация в соответствии с Kabat):

- 89L в комбинации с 11V; или

- 89L в комбинации с 110K или 110Q; или

- 89L в комбинации с 112K или 112Q; или

- 89L в комбинации с 11V и 110K или 110Q; или

- 89L в комбинации с 11V и 112K или 112Q;

и имеют CDR (в соответствии с Kabat), и имеют общую степень идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, которая описана в настоящей заявке.

В другом специфическом, но не ограничивающем аспекте агенты, связывающие TNF, из изобретения включают следующие аминокислотные остатки (т.е. мутации, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 1) в упомянутых положениях (нумерация в соответствии с Kabat):

- 110K или 110Q в комбинации с 11V; или

- 110K или 110Q в комбинации с 89L; или

- 110K или 110Q в комбинации с 11V и 89L;

и имеют CDR (в соответствии с Kabat), и имеют общую степень идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, которая описана в настоящей заявке.

В другом специфическом, но не ограничивающем аспекте агенты, связывающие TNF, из изобретения включают следующие аминокислотные остатки (т.е. мутации, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 1) в упомянутых положениях (нумерация в соответствии с Kabat):

- 112K или 112Q в комбинации с 11V; или

- 112K или 112Q в комбинации с 89L; или

- 112K или 112Q в комбинации с 11V и 89L;

и имеют CDR (в соответствии с Kabat), и имеют общую степень идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, которая описана в настоящей заявке.

В другом аспекте агенты, связывающие TNF, из изобретения, включают Т в положении 89, и имеют CDR (в соответствии с Kabat), и имеют общую степень идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, как описано в настоящей заявке.

В другом аспекте агенты, связывающие TNF, из изобретения, включают Т в положении 11 и L в положении 89, и имеют CDR (в соответствии с Kabat), и имеют общую степень идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, как описано в настоящей заявке.

Как уже упоминалось, агенты, связывающие TNF, по изобретению в соответствии с вышеприведенными аспектами предпочтительно являются такими, что они содержат подходящую комбинацию мутаций S49A, A74S и/или L78V, и предпочтительно подходящую комбинацию любых двух из этих мутаций, таких как все три из этих мутаций (и вновь, когда агент, связывающий TNF, является одновалентным или присутствует на N-конце соединения или полипептида по изобретению, предпочтительно также мутацию E1D).

В другом аспекте изобретение относится к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина, имеющему:

- CDR1 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью GFTFSTADMG (SEQ ID NO: 5); и

- CDR2 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью RISGIDGTTY (SEQ ID NO: 6); и

- CDR3 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4);

и имеющему:

- степень идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой любое C-концевое удлинение, которое может присутствовать, а также CDR не учитываются для определения степени идентичности последовательности), по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%;

и/или

- не более 7, например, не более 5, предпочтительно не более 3, например, только 3, 2 или 1 «аминокислотных различия» (как определено в настоящей заявке, и не принимая во внимание ни одну из перечисленных выше мутаций в положении(ях) 11, 89, 110 или 112, которые могут присутствовать, и не учитывать любое С-концевое удлинение, которое может присутствовать) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой указанные аминокислотные различия, если они имеются, присутствуют в каркасах и/или CDR, но предпочтительно присутствуют только в каркасах, а не в CDR);

и при необходимости имеющему:

- C-концевое удлинение (X)_n, в котором n составляет от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 (и предпочтительно 1 или 2, например, 1); а каждый X является (предпочтительно природным) аминокислотным остатком, который независимо выбран, и предпочтительно независимо выбран из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) или изолейцина (I);

в котором:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L или V; и

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен Т, V или L; и

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно подходящим образом выбран из T, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно подходящим образом выбран из S, K или Q;

так что (i) положение 89 представлено T; или (ii) положение 89 представлено L, а положение 11 представлено V; или (iii) положение 89 представлено L, а положение 110 представлено K или Q; или (iv) положение 89 представлено L, а положение 112 представлено K или Q; или (v) положение 89 представлено L, а положение 11 представлено V, а положение 110 представлено K или Q; или (vi) положение 89 представлено L, а положение 11 представлено V, а положение 112 представлено K или Q; или (vii) положение 11 представлено V, а положение 110 представлено K или Q; или (vii) положение 11 представлено V, а положение 112 представлено K или Q.

В другом аспекте изобретение относится одиночному вариабельному домену иммуноглобулина, имеющему:

- CDR1 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью GFTFSTADMG (SEQ ID NO: 5); и

- CDR2 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью RISGIDGTTY (SEQ ID NO: 6); и

- CDR3 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4);

и имеющему:

- степень идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой любое C-концевое удлинение, которое может присутствовать, а также CDR не учитываются для определения степени идентичности последовательности), по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%;

и/или

- не более 7, например, не более 5, предпочтительно не более 3, например, только 3, 2 или 1 «аминокислотных различия» (как определено в настоящей заявке, и не принимая во внимание ни одну из перечисленных выше мутаций в положении(ях) 11, 89, 110 или 112, которые могут присутствовать, и не учитывать любое С-концевое удлинение, которое может присутствовать) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой указанные аминокислотные различия, если они имеются, присутствуют в каркасах и/или CDR, но предпочтительно присутствуют только в каркасах, а не в CDR);

и при необходимости имеющему:

- C-концевое удлинение (X)_n, в котором n составляет от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 (и предпочтительно 1 или 2, например, 1); а каждый X является (предпочтительно природным) аминокислотным остатком, который независимо выбран, и предпочтительно независимо выбран из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) или изолейцина (I);

где одиночный вариабельный домен иммуноглобулина включает следующие аминокислотные остатки (т.е. мутации, по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1) в упомянутых положениях (нумерация в соответствии с Kabat):

- 89Т; или

- 89L в комбинации с 11V; или

- 89L в комбинации с 110K или 110Q; или

- 89L в комбинации с 112K или 112Q; или

- 89L в комбинации с 11V и 110K или 110Q; или

- 89L в комбинации с 11V и 112K или 112Q; или

- 11V в комбинации с 110K или 110Q; или

- 11V в комбинации с 112K или 112Q.

Как уже упоминалось, когда агент, связывающий TNF, по изобретению используется в одновалентном формате и/или присутствует на С-конце соединения по изобретению (как определено в настоящей заявке), агент, связывающий TNF (и, следовательно, полученное соединение из изобретения), предпочтительно имеет C-концевое удлинение X(n), причем C-концевое удлинение может быть таким, как описано в настоящей заявке для агентов, связывающих TNF, по изобретению и/или как описано в WO 2012/175741 или WO 2015/173325.

Как упоминалось в изобретении, аминокислотные последовательности, в которых положение 89 представлено T или в которых положение 11 представлено V, а положение 89 представлено L (при необходимости в подходящей комбинации с мутацией 110K или 110Q и/или мутацией 112K или 112Q, и в особенно в сочетании с мутацией 110K или 110Q) являются особенно предпочтительными. Еще более предпочтительными являются аминокислотные последовательности, в которых положение 11 представлено V, а положение 89 представлено L, при необходимости с мутацией 110K или 110Q.

Таким образом, в одном предпочтительном аспекте изобретение относится к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина, имеющему:

- CDR1 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью GFTFSTADMG (SEQ ID NO: 5); и

- CDR2 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью RISGIDGTTY (SEQ ID NO: 6); и

- CDR3 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4);

и имеющему:

- степень идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой любое C-концевое удлинение, которое может присутствовать, а также CDR не учитываются для определения степени идентичности последовательности), по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%;

и/или

- не более 7, например, не более 5, предпочтительно не более 3, например, только 3, 2 или 1 «аминокислотных различия» (как определено в настоящей заявке, и не принимая во внимание ни одну из перечисленных выше мутаций в положении(ях) 11, 89, 110 или 112, которые могут присутствовать, и не учитывать любое С-концевое удлинение, которое может присутствовать) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой указанные аминокислотные различия, если они имеются, присутствуют в каркасах и/или CDR, но предпочтительно присутствуют только в каркасах, а не в CDR);

и при необходимости имеющему:

- C-концевое удлинение (X)_n, в котором n составляет от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 (и предпочтительно 1 или 2, например, 1); а каждый X является (предпочтительно природным) аминокислотным остатком, который независимо выбран, и предпочтительно независимо выбран из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) или изолейцина (I);

в котором:

- аминокислотный остаток в положении 11 предпочтительно выбран из L или V; и

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен Т; и

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно подходящим образом выбран из Т, К или Q (и предпочтительно представлен Т); и

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно подходящим образом выбран из S, K или Q (и предпочтительно представлен S).

В другом предпочтительном аспекте изобретение относится к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина, имеющему:

- CDR1 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью GFTFSTADMG (SEQ ID NO: 5); и

- CDR2 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью RISGIDGTTY (SEQ ID NO: 6); и

- CDR3 (в соответствии с Abm), который является аминокислотной последовательностью PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4);

и имеющему:

- степень идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой любое C-концевое удлинение, которое может присутствовать, а также CDR не учитываются для определения степени идентичности последовательности), по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%;

и/или

- не более 7, например, не более 5, предпочтительно не более 3, например, только 3, 2 или 1 «аминокислотных различия» (как определено в настоящей заявке, и не принимая во внимание ни одну из перечисленных выше мутаций в положении(ях) 11, 89, 110 или 112, которые могут присутствовать, и не учитывать любое С-концевое удлинение, которое может присутствовать) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 (в которой указанные аминокислотные различия, если они имеются, присутствуют в каркасах и/или CDR, но предпочтительно присутствуют только в каркасах, а не в CDR);

и при необходимости имеющему:

- C-концевое удлинение (X)_n, в котором n составляет от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 (и предпочтительно 1 или 2, например, 1); а каждый X является (предпочтительно природным) аминокислотным остатком, который независимо выбран, и предпочтительно независимо выбран из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) или изолейцина (I);

в котором:

- аминокислотный остаток в положении 11 представлен V; и

- аминокислотный остаток в положении 89 представлен L; и

- аминокислотный остаток в положении 110 предпочтительно выбран подходящим образом из T, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 предпочтительно выбран подходящим образом из S, K или Q.

В одном специфическом, но не ограничивающем аспекте агенты, связывающие TNF, из изобретения включают следующие аминокислотные остатки (т.е. мутации, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 1) в упомянутых положениях (нумерация в соответствии с Kabat):

- 11V в комбинации с 89L; или

- 11V в комбинации с 110K или 110Q;

- 11V в комбинации с 112K или 112Q;

- 11V в комбинации с 89L и 110K или 110Q; или

- 11V в комбинации с 89L и 112K или 112Q;

и имеют CDR (в соответствии с Abm) и имеют общую степень идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, как описано в настоящей заявке.

В другом специфическом, но не ограничивающем аспекте агенты, связывающие TNF, из изобретения включают следующие аминокислотные остатки (т.е. мутации, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 1) в упомянутых положениях (нумерация в соответствии с Kabat):

- 89L в комбинации с 11V; or

- 89L в комбинации с 110K или 110Q; или

- 89L в комбинации с 112K или 112Q; или

- 89L в комбинации с 11V и 110K или 110Q; или

- 89L в комбинации с 11V и 112K или 112Q;

и имеют CDR (в соответствии с Abm) и имеют общую степень идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, как описано в настоящей заявке.

В другом специфическом, но не ограничивающем аспекте агенты, связывающие TNF, из изобретения включают следующие аминокислотные остатки (т.е. мутации, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 1) в упомянутых положениях (нумерация в соответствии с Kabat):

- 110K или 110Q в комбинации с 11V; или

- 110K или 110Q в комбинации с 89L; или

- 110K или 110Q в комбинации с 11V и 89L;

и имеют CDR (в соответствии с Abm) и имеют общую степень идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, как описано в настоящей заявке.

В другом специфическом, но не ограничивающем аспекте агенты, связывающие TNF, из изобретения включают следующие аминокислотные остатки (т.е. мутации, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 1) в упомянутых положениях (нумерация в соответствии с Kabat):

- 112K или 112Q в комбинации с 11V; или

- 112K или 112Q в комбинации с 89L; или

- 112K или 112Q в комбинации с 11V и 89L;

и имеют CDR (в соответствии с Abm) и имеют общую степень идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, как описано в настоящей заявке.

В другом аспекте агенты, связывающие TNF, из изобретения включают Т в положении 89, и имеют CDR (в соответствии с Abm) и имеют общую степень идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, как описано в настоящей заявке.

В другом аспекте агенты, связывающие TNF, из изобретения включают V в положении 11 и L в положении 89, и имеют CDR (в соответствии с Abm) и имеют общую степень идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, как описано в настоящей заявке.

Как уже упоминалось, агенты, связывающие TNF, по изобретению в соответствии с вышеприведенными аспектами предпочтительно являются такими, что они содержат подходящую комбинацию мутаций S49A, A74S и/или L78V и предпочтительно подходящую комбинацию любых двух из этих мутаций, таких как все три из этих мутаций (и вновь, когда агент, связывающий TNF, является одновалентным или присутствует на N-конце соединения или полипептида по изобретению, предпочтительно также мутацией E1D).

В другом специфическом, но не ограничивающем аспекте изобретение относится к агенту, связывающему TNF, описанному в настоящей заявке, который находится в одновалентном формате и, в частности, к агенту, связывающему TNF, как описано в настоящей заявке, который находится в одновалентном формате и который имеет D в положении 1 (и/или мутацию E1D) и C-концевое удлинение X(n), как описано в настоящей заявке (например, С-концевой остаток аланина).

В другом специфическом, но не ограничивающем аспекте изобретение относится к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина, который является или по существу состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из одной из следующих аминокислотных последовательностей: SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 и SEQ ID NO: 68.

В другом специфическом, но не ограничивающем аспекте изобретение относится к одиночному вариабельному домену иммуноглобулина, который является или по существу состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из одной из следующих аминокислотных последовательностей: SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 и SEQ ID NO: 68.

Для целей изобретения пищеварительный тракт состоит из рта, глотки, пищевода, желудка, тонкой кишки (двенадцатиперстной кишки, тощей кишки, подвздошной кишки), толстой кишки (слепой кишки, толстой кишки, прямой кишки) и заднего прохода.

Для целей изобретения «желудочно-кишечный тракт» или «ЖКТ» подразумевает желудок, тонкую кишку (двенадцатиперстную кишку, тощую кишку, подвздошную кишку), толстую кишку (слепую кишку, толстую кишку, прямую кишку) и задний проход. Под термином «расщепление в желудке», как он используется здесь, понимается расщепление в желудке, тонком кишечнике и/или в толстой кишке.

Термин «деградация в желудке» антитела используется здесь для обозначения деградации ISVD, соединения или полипептида по изобретению в желудке, тонком кишечнике, толстой кишке эндогенными или экзогенными ферментами, присутствующими в желудке, тонком кишечнике и толстой кишке, или из-за воздействия кислых условий при желудочном расщеплении.

Термин «стабилизированный ISVD», «стабилизированные соединения» и «стабилизированные полипептиды», как используется в настоящей заявке, понимается как описывающий ISVD, соединение или полипептид, соответственно, который был сконструирован таким образом, чтобы сделать его более устойчивым к деградации в пищеварительном тракте при локальном введении. По сравнению с ISVD, соединением или полипептидом, которые не были обработаны или сконструированы в соответствии с изобретением, стабилизированный ISVD, соединение или полипептид, который сконструирован в соответствии с изобретением, деградирует более медленно или в меньшей степени при расщеплении в желудке, таком как расщепление эндогенными или экзогенными ферментами, присутствующими в желудке, тонком кишечнике и толстой кишке и/или в кислых условиях, присутствующих в желудке. «Стабилизированные ISVD», «стабилизированные соединения» и «стабилизированные полипептиды» также упоминаются как «ISVD с повышенной устойчивостью к деградации в ЖКТ», «соединения с повышенной устойчивостью к деградации в ЖКТ» и «полипептиды с повышенной устойчивостью к деградации в ЖКТ», соответственно.

Местное применение ISVD, соединения или полипептида в пищеварительном тракте является сложным, потому что пищеварительный тракт деградирует и переваривает местно применяемые ISVD, соединения и полипептиды. В желудке низкий рН и протеаза пепсин деградируют проглатываемые ISVD, соединения и полипептиды. В тонком кишечнике ферменты трипсин и химотрипсин, среди прочего, разрушают проглатываемые ISVD, соединения и полипептиды. В толстой кишке бактериальные протеазы разрушают поглощенные ISVD, соединения и полипептиды. ISVD, соединения и полипептиды с улучшенной устойчивостью к расщеплению в желудке были бы предпочтительны для местного применения в ЖКТ.

Стабилизированные ISVD, соединения и полипептиды могут быть получены мутацией одного или нескольких аминокислотных остатков, которые подвержены деградации в желудке, в аминокислотные остатки, которые устойчивы к деградации в желудке. Стабилизированные ISVD, соединения и полипептиды могут быть получены путем мутации множественных аминокислотных остатков, которые повышают устойчивость к деградации в желудке.

Следовательно, настоящее изобретение относится к идентификации аминокислотных остатков, придающих стабильность агенту, связывающему TNF, по изобретению, и к повышению стабильности агента, связывающего TNF. Предпочтительно агент, связывающий TNF, гораздо более устойчив к деградации в желудке при одном или нескольких состояниях с низким рН или активностью одного или нескольких протеаз, таких как пепсин, трипсин, химотрипсин и/или бактериальные протеазы.

В одном варианте осуществления изобретение относится к способу идентификации аминокислотного остатка, который придает устойчивость ISVD, соединению или полипептиду к деградации в желудке, включающему стадии: (а) деградации ISVD, соединения или полипептида одной или несколькими протеазами на фрагменты; и (b) анализ фрагментов стадии (а) с помощью подходящих средств, таких как, например, ЖХ-МС; тем самым идентифицируя аминокислотный остаток (остатки), придающий устойчивость ISVD, соединению или полипептиду к деградации в желудке.

В одном варианте осуществления изобретение относится к способу повышения устойчивости ISVD, соединения или полипептида к деградации в желудке, включающему стадии (a) и (b) выше, за которыми следуют: (c) мутация аминокислотного остатка (остатков), придающая устойчивость ISVD, соединению или полипептиду к деградации в желудке; и (d) повторение стадий (a) и (b) выше; в результате чего отсутствие одного или более фрагментов указывает на улучшенную стабильность ISVD, соединения или полипептида к деградации в желудке.

В настоящем описании:

- термин «одиночный вариабельный домен иммуноглобулина» (также называемый «ISV» или «ISVD») обычно используется для обозначения вариабельных доменов иммуноглобулина (которые могут быть доменами тяжелой цепи или легкой цепи, включая VH, VHH или VL-домены), которые могут формировать функциональный участок связывания антигена без взаимодействия с другим вариабельным доменом (например, без взаимодействия VH/VL, которое требуется между доменами VH и VL обычного 4-цепочечного моноклонального антитела). Примеры ISVD будут понятны специалисту в данной области техники, и, например, включают нанотела (включая VHH, гуманизированный VHH и/или камелизированный VH, такие как камелизированный VH человека), IgNAR, домены, (однодоменные) антитела (такие как dAb's™), которые являются доменами VH или которые получены из домена VH и (однодоменных) антител (таких как dAb's™), которые являются доменами VL или которые получены из домена VL. Если явно не указано иное, ISVD, которые основаны и/или получены из вариабельных доменов тяжелой цепи (таких как VH или VHH-домены), как правило, являются предпочтительными. Наиболее предпочтительно, если в настоящем документе явно не указано иное, ISVD является нанотелом;

- термин «нанотело» в целом определяется в WO 2008/020079 или WO 2009/138519, и, таким образом, в конкретном аспекте, как правило, обозначает VHH, гуманизированный VHH или камелизированный VH (такой как камелизированный человеческий VH) или, как правило, оптимизированный по последовательности VHH (такой как, например, оптимизированный для химической стабильности и/или растворимости, максимально перекрывающийся с известными каркасными областями человека и максимально экспрессирующийся). Отмечается, что термины «нанотело» или «нанотела» являются зарегистрированными товарными знаками Ablynx N.V и поэтому могут также упоминаться как Нанотело® и/или Нанотела®);

- Как правило, если не указано иное, ISVD, нанотела, полипептиды, белки и другие соединения и конструкции, упомянутые в настоящей заявке, предназначены для использования в профилактике или лечении заболеваний или расстройств у человека (и/или при необходимости, также у теплокровных животных и в частности млекопитающих). Таким образом, как правило, ISVD, нанотела, полипептиды, белки и другие соединения и конструкции, описанные в настоящей заявке, предпочтительно таковы, что они могут быть использованы и/или могут быть подходящим компонентом, (биологического) лекарственного средства или другого фармацевтически или терапевтически активного соединения и/или фармацевтического продукта или композиции. Такое лекарственное средство, соединение или продукт предпочтительно являются такими, что они пригодны для введения человеку, например, для профилактики или лечения субъекта, нуждающегося в такой профилактике или лечении, или, например, в рамках клинического испытания. Как дополнительно описано в настоящей заявке, для этой цели такое лекарственное средство или соединение может содержать другие компоненты, элементы или связывающие единицы, кроме ISVD, предоставленных изобретением (которые, как также описано здесь, могут быть, например, одним или несколькими другими терапевтическими компонентами и/или одним или несколькими другими фрагментами, которые влияют на фармакокинетические или фармакодинамические свойства биологического вещества на основе ISVD или на основе нанотел, такие как его период полужизни). Подходящие примеры таких дополнительных терапевтических или других фрагментов понятны специалисту в данной области техники и, например, обычно могут включать любой терапевтически активный белок, полипептид или другой связывающий домен или единицу связывания, а также, например, такие модификации, как описанные на страницах 149 до 152 документа WO 2009/138159. Биологический средство на основе ISVD или биологическое средство на основе нанотел предпочтительно является терапевтическими или предназначено для использования в качестве терапевтического средства (которое включает профилактику и диагностику), и для этой цели предпочтительно содержит по меньшей мере один ISVD против терапевтически релевантной мишени (такой как, например, RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, IL-23 или другие интерлейкины и т.д.). Для некоторых конкретных, но не ограничивающих примеров таких биологических средств на основе ISVD или биологических средств на основе нанотел приводится ссылка в Примерах с 8- 18, а также, например, на различные заявки Ablynx NV (такие как, например, без ограничений WO 2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 и WO 2009/068627), а также, например (без ограничения), на такие заявки, как WO 2006/038027, WO 2006/059108, WO 2007/063308, WO 2007/063311, WO 2007/066016 и WO 2007/085814. Кроме того, как дополнительно описано здесь, дополнительным компонентом может быть ISVD или нанотело, как описано в настоящей заявке, направленное против белка (сыворотки крови человека), такого как (человеческий) сывороточный альбумин; и такой ISVD или нанотело может также найти терапевтическое применение, в частности и/или для продления периода полужизни агентов, связывающих TNF, описанных здесь. Ссылка приведена, например, на WO 2004/041865, WO 2006/122787 и WO 2012/175400, которые в целом описывают использование связывающих сывороточный альбумин нанотел для продления времени полужизни. Кроме того, в настоящем описании, если прямо не указано иное, все термины, упомянутые здесь, имеют значение, указанное в WO 2009/138519 (или в предшествующем уровне техники, указанном в WO 2009/138519) или в WO 2008/020079 (или в предшествующем уровне техники, цитированном в WO 2008/020079). Кроме того, если способ или методика конкретно не описаны в настоящей заявке, их можно выполнить, как описано в WO 2009/138519 (или в предшествующем уровне техники, цитируемом в WO 2009/138519) или WO 2008/020079 (или в предшествующем уровне техники, указанном в WO 2008/020079). Кроме того, как описано в настоящей заявке, любой фармацевтический продукт или композиция, содержащая любой ISVD или соединение по изобретению, может также содержать один или несколько других компонентов, известных как таковые, для использования в фармацевтических продуктах или композициях (то есть в зависимости от предполагаемой фармацевтической формы) и/или, например, одно или несколько других соединений или активных веществ, предназначенных для терапевтического использования (т.е. для обеспечения комбинированного продукта).

Кроме того, при использовании в настоящем описании или формуле изобретения следующие термины имеют то же значение, что указано, и/или там, где это применимо, могут быть определены способом, описанным на страницах 62-75 WO 2009/138519: «агонист», «антагонист», «обратный агонист», «неполярный, незаряженный аминокислотный остаток», «полярный незаряженный аминокислотный остаток», «полярный, заряженный аминокислотный остаток», «идентичность последовательности», «точно такой же» и «аминокислотное различие (при сравнении двух аминокислотных последовательностей), «(в) по существу изолированной (форме)», «домен», «связывающий домен», «антигенная детерминанта», «эпитоп», «против» или «направленный против» (антиген), «специфичность» и «период полужизни». Кроме того, термины «модуляция» и «модулировать», «участок взаимодействия», «специфичный к», «кросс-блок», «кросс-блокированные» и «кросс-блокирующие» и «по существу не зависящие от рН» являются такими, как определено (и/или может быть определено, как описано) на страницах 74-79 WO 2010/130832 Ablynx NV. Кроме того, когда речь идет о конструкции, соединении, белке или полипептиде по изобретению, такие термины, как «одновалентный», «двухвалентный» (или «поливалентный»), «биспецифический» (или «полиспецифический»), и «бипаратопный» (или «полипаратопный»), могут иметь значение, указанное в WO 2009/138519, WO 2010/130832 или WO 2008/020079.

Термин «период полужизни», используемый здесь в отношении ISVD, нанотела, биологического средства на основе ISVD, биологического средства на основе нанотела, или любой другой аминокислотной последовательности, соединения или полипептида, упомянутых здесь, может быть обычно определен, как описано в параграфе (o) на стр.57 WO 2008/020079 и, как упоминалось в нем, относится к времени, затрачиваемому на снижение сывороточной концентрации аминокислотной последовательности, соединения или полипептида на 50% in vivo, например, из-за деградации последовательности или соединения и/или клиренса или секвестрация последовательности или соединения посредством естественных механизмов. Период полужизни in vivo аминокислотной последовательности, соединения или полипептида по изобретению может быть определен любым известным способом, таким как фармакокинетический анализ. Подходящие методики известны специалисту в данной области техники, и могут, например, обычно быть такими, как описано в параграфе (o) на стр.57 WO 2008/020079. Как также упоминалось в параграфе (o) на стр. 57 WO 2008/020079, период полужизни может быть выражен с использованием таких параметров, как t1/2-альфа, t1/2-бета и площадь под фармакокинетической кривой (AUC). В этом отношении следует отметить, что термин «период полужизни», используемый здесь в частности, относится к периоду полужизни t1/2-бета или терминальному периоду (в котором t1/2-альфа и/или AUC или оба из них могут не учитываться). Ссылка, например, приводится на экспериментальный раздел ниже, а также на стандартные справочники, таких как Kenneth, A et al: «Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists и Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach» (1996). Также упоминается «Pharmacokinetics», M Gibaldi & D Perron, опубл. Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982). Аналогично, термины «увеличение периода полужизни» или «повышенный период полужизни» также определены в пункте (o) на стр.57 WO 2008/020079 и, в частности, относятся к увеличению t1/2-бета, либо с увеличением t1/2-альфа и/или AUC или обоих, либо без увеличения.

Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к соединению, описанному в настоящей заявке, где указанное соединение дополнительно содержит компонент, связывающий сывороточный белок.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к соединению, описанному в настоящей заявке, где указанный компонент, связывающий сывороточный белок, связывает сывороточный альбумин.

Когда термин не определен специально, он имеет обычное значение в данной области техники, которое понятно специалисту в данной области техники. Например, приводится ссылка на стандартные справочники, такие как Sambrook et al, «Molecular Cloning: A Laboratory Manual» (2nd.Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al., eds., «Current protocols in molecular biology», Green Publishing и Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, «Genes II», John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old et al., «Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering», 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., «Immunology» (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., «Roitt’s Essential Immunology», 10th Ed. Blackwell Publishing, UK (2001); и Janeway et al., «Immunobiology» (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), а также к общему уровню техники, цитированному в настоящей заявке.

Также, как уже указано здесь, аминокислотные остатки нанотела нумеруются в соответствии с общей нумерацией для VH, представленной Kabat et al. (“Sequence of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), применительно к доменам VHH верблюда в статье Riechmann и Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195; или как упоминается здесь. Согласно этой нумерации, FR1 из нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 1-30, CDR1 нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 31-35, FR2 нанотела содержит аминокислоты в положениях 36-49, CDR2 нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 50-65, FR3 нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 66-94, CDR3 нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 95-102, а FR4 нанотела включает аминокислотные остатки в положениях 103-113. [В связи с этим следует отметить, что (как хорошо известно в данной области техники для VH-доменов и для VHH доменов) общее количество аминокислотных остатков в каждом из CDR может варьировать, и может не соответствовать общему числу аминокислотных остатков, обозначенных нумерацией Kabat (то есть одно или несколько положений в соответствии с нумерацией Kabat не могут быть заняты в реальной последовательности, или фактическая последовательность может содержать больше аминокислотных остатков, чем число, допустимое нумерацией Kabat). Это означает, что, как правило, нумерация по Kabat может соответствовать или не соответствовать фактической нумерации аминокислотных остатков в реальной последовательности. Однако, как правило, можно сказать, что согласно нумерации Kabat и независимо от количества аминокислотных остатков в CDR, положение 1 в соответствии с нумерацией Kabat соответствует началу FR1 и наоборот, положение 36 в соответствии с нумерация Kabat соответствует началу FR2 и наоборот, положение 66 в соответствии с нумерацией Kabat соответствует началу FR3 и наоборот, а положение 103 в соответствии с нумерацией Kabat соответствует началу FR4 и наоборот].

Альтернативные способы нумерации аминокислотных остатков VH доменов, которые также могут быть применены аналогичным образом к VHH доменам верблюда и к нанотелам, представляют собой метод, описанный Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989)), так называемое «определение AbM» и так называемое «контактное определение». Однако в настоящем описании аспекты и цифры будут сопровождаться нумерацией по Kabat, применительно к VHH доменам Riechmann и Muyldermans, если не указано иное.

Следует также отметить, что фигуры, любой список последовательностей и Экспериментальная часть/Примеры приведены только для дополнительной иллюстрации изобретения, и не должны толковаться или рассматриваться как ограничивающие объем изобретения и/или прилагаемой формулы изобретения любым способом, если явно не указано иное.

Изобретение также относится к белкам, полипептидам и другим конструкциям, молекулам или химическим объектам, которые содержат или по существу состоят из агентов, связывающих TNF, по изобретению, как описано в настоящей заявке (то есть, которые содержат или по существу состоят из одного или нескольких таких агентов, связывающих TNF, таких как один, два или три таких агента, связывающих TNF); к способам экспрессии/продукции агентов, связывающих TNF, по изобретению и/или к экспрессии/продукции белков, полипептидов и других конструкций, молекул или химических соединений, содержащих их; к композициям и продуктам (таким, как фармацевтические композиции и продукты), которые включают агенты, связывающие TNF, по изобретению и/или белки, полипептиды и другие конструкции, молекулы или химические соединения, содержащие их; к нуклеотидной последовательности и нуклеиновым кислотам, которые кодируют агенты, связывающие TNF, по изобретению и/или кодируют белки или полипептиды, содержащие их; и к использованию (и, в частности, терапевтическому, профилактическому и диагностическому применению) агентов, связывающих TNF, по изобретению и белков, полипептидов и других конструкций, молекул или химических веществ, которые включают их.

Эти и другие аспекты, варианты осуществления, преимущества, приложения и применения изобретения станут понятны из следующего описания.

Соответственно, в следующем аспекте изобретение относится к белкам (таким, как слитые белки), полипептидам, конструкциям, соединениям или другим химическим объектам, которые содержат или по существу состоят из по меньшей мере одного (такого как один, два или три) агента, связывающего TNF (также совместно именуемым здесь как «соединения по изобретению», «полипептиды по изобретению», «конструкции по изобретению» или «слитые белки по изобретению»). Следовательно, соединение по изобретению может быть полипептидом.

Такие соединения по изобретению могут, кроме одного или нескольких агентов, связывающих TNF, по изобретению, дополнительно содержать одну или несколько других аминокислотных последовательностей, химических объектов или фрагментов. Эти другие аминокислотные последовательности, химические объекты или фрагменты могут обеспечивать одно или несколько необходимых свойств (результирующего) соединения по изобретению и/или могут изменять свойства (результирующего) соединения по изобретению желательным образом, например, обеспечивать (результирующее) соединение по изобретению с требуемой биологической и/или терапевтической активностью (например, обеспечивать полученное соединение по изобретению с аффинностью и предпочтительной активностью против другой терапевтически релевантной мишени, так что полученное соединение становится «биспецифическим» по отношению к TNF и этой другой терапевтически релевантной мишени), чтобы обеспечить необходимый период полужизни и/или (иным образом) модифицировать или улучшать фармакокинетические и/или фармакодинамические свойства, нацеливать соединение по изобретению на конкретные клетки, ткани или органы (включая раковые клетки и раковые ткани), чтобы обеспечить цитотоксический эффект и/или служить в качестве выявляемой метки или маркера. Некоторыми не ограничивающими примерами таких других аминокислотных последовательностей, химических объектов или компонентов являются:

- один или несколько подходящих линкеров (таких, как линкер 9GS, 15GS или 35GS); и/или

- один или несколько связывающих доменов или связывающих единиц, которые направлены против терапевтически релевантной мишени, отличной от TNF (то есть, чтобы обеспечить соединение по изобретению, которое является биспецифическим как для TNF, так и для другой терапевтически релевантной мишени); и/или

- один или несколько связывающих доменов или связывающих единиц, которые обеспечивают увеличение периода полужизни (например, связывающий домен или связывающая единица, которая может связываться с сывороточным белком, таким как сывороточный альбумин); и/или

- один или несколько связывающих доменов или связывающих единиц, которые направляют соединение по изобретению на необходимую клетку, ткань или орган (например, раковую клетку); и/или

- один или несколько связывающих доменов или связывающих единиц, которые обеспечивают повышенную специфичность против TNF (обычно они могут связываться с TNF, но, как правило, сами по себе не могут функционировать против TNF); и/или

- связывающий домен, единица связывания или другой химический объект, который позволяет интернализировать соединение по изобретению в (необходимую) клетку (например, интернализующее анти-EGFR нанотело, как описано в WO 2005/044858); и/или

- компонент, который улучшает период полужизни, такой как подходящая группа полиэтиленгликоля (т.е. ПЭГилирование), или аминокислотная последовательность, которая обеспечивает увеличенный период полужизни, такая как человеческий сывороточный альбумин или его подходящий фрагмент (например, гибрид альбумина) или, например, пептид, связывающий сывороточный альбумин, как описано в WO 2008/068280; и / или

- нагрузка, такая как цитотоксическая нагрузка; и/или

- выявляемая метка или маркер, такая как радиоактивная метка или флуоресцентная метка; и/или

- метка, которая способствует иммобилизации, обнаружению и/или очистке соединения по изобретению, такой как маркер HIS или FLAG3; и/или

- метка, которая может функционировать, такая как C-концевая метка GGC или GGGC; и/или

- С-концевое удлинение X(n), которое может быть далее описано здесь для агентов, связывающих TNF, по изобретению, и/или как описано в WO 2012/175741 или WO 2015/173325.

Хотя обычно это менее предпочтительно, из объема изобретения также не исключено, что соединения по изобретению могут также содержать одну или несколько частей или фрагментов (предпочтительно человеческого) обычного антитела (такого как Fc-часть или её функциональный фрагмент) или один или несколько константных доменов) и/или только из тяжелой цепи верблюжьего антитела (таких, как один или несколько константных доменов).

В конкретном аспекте настоящее изобретение относится к конструкции, которая содержит или по существу состоит из ISVD, как определено в настоящей заявке, или к соединению, как определено в настоящей заявке, и которое дополнительно содержит одну или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц, при необходимости связанных через один или более пептидных линкеров.

В следующем конкретном аспекте настоящее изобретение относится к конструкции, как определено в настоящей заявке, в которой указанные одна или несколько других групп, остатков, фрагментов или связывающих единиц выбраны из группы, состоящей из молекулы полиэтиленгликоля, сывороточных белков или их фрагментов, связывающих единиц, которые могут связываться с сывороточными белками, Fc-части, и небольших белков или пептидов, которые могут связываться с сывороточными белками.

Когда соединения по изобретению содержат один или несколько дополнительных связывающих доменов или связывающих единиц (например, дополнительный, по существу нефункциональный связывающий домен или связывающую единицу против TNF, которые обеспечивают повышенную специфичность против TNF, связывающий домен или связывающую единицу против иной терапевтической мишени, чем TNF, связывающий домен или связывающую единицу против такой мишени, как человеческий сывороточный альбумин, который обеспечивает повышенный период полужизни, и/или связывающий домен или связывающую единицу, которые нацеливают соединение по изобретению на конкретную клетку, ткань или орган и/или которые позволяет интернализировать соединение по изобретению в клетку), эти другие связывающие домены или связывающие единицы предпочтительно содержат один или несколько ISVD, и более предпочтительно все являются ISVD. Например, и без ограничения, эти один или несколько дополнительных связывающих доменов или связывающих единиц могут быть одним или несколькими нанотелами (включая VHH, гуманизированный VHH и/или камелизированные VH, такие как камелизированные человеческие VH), (однодоменным) антителом, которое является VH доменом или которое получено из VH домена, dAb, который является или по существу состоит из VH домена или который получен из VH домена, или даже (одно) доменным антителом или dAb, которое является или по существу состоит из VL домена. В частности, эти один или несколько связывающих доменов или связывающих единиц, если они присутствуют, могут содержать одно или более нанотел, и, в частности, все являются нанотелами.

Когда соединение по изобретению имеет ISVD на своем С-конце (где C-концевой ISVD может быть агентом, связывающим TNF, по изобретению или может, например, быть, если он присутствует в соединении по изобретению, еще более существенно нефункциональным ISVD против TNF, который обеспечивает повышенную специфичность против TNF, и ISVD против терапевтической мишени, отличной от TNF, ISVD против такой мишени, как человеческий сывороточный альбумин, который обеспечивает повышенный период полужизни, или ISVD, который нацеливает соединение по изобретению на конкретную клетку, ткань или орган и/или который позволяет интернализовать соединение по изобретению в клетку), то соединение по изобретению (то есть указанный C-концевой ISVD) предпочтительно имеет C-концевое удлинение X(n), где C-концевое удлинение может быть таким, как описано в настоящей заявке для агентов, связывающих TNF, по изобретению и/или как описано в WO 2012/175741 или WO2015/173325.

Когда соединение по изобретению содержит в дополнение к одному или нескольким агентам, связывающим TNF, по изобретению любые другие ISVD (где один или несколько дополнительных ISVD могут, как упомянуто, быть еще более по существу нефункциональным ISVD против TNF, который обеспечивает увеличение специфичности против TNF, ISVD против терапевтической мишени, отличной от TNF, ISVD против такой мишени, как человеческий сывороточный альбумин, который обеспечивает увеличение периода полужизни, и/или ISVD, который нацеливает соединение по изобретению на конкретную клетку, ткань или орган, и/или который обеспечивает интернализацию соединения по изобретению в клетку); и где такие дополнительные ISVD представляют собой нанотела или являются ISVD, которые, по существу, состоят и/или которые получены из VH последовательностей, тогда в соответствии с предпочтительным аспектом изобретения, указанный один или несколько (и предпочтительно все) дополнительные ISVD, присутствующие в соединении по изобретению, будут содержать в своей последовательности одну или несколько каркасных мутаций, которые уменьшают связывание с предсуществующими антителами. В частности, согласно этому аспекту изобретения, такие дополнительные ISVD могут содержать (подходящую комбинацию) аминокислотные остатки/мутации в положениях 11, 89, 110 и/или 112, которые описаны в WO 02015/173325 и/или по существу являются такими, как описано в настоящей заявке для агентов, связывающих TNF, по изобретению. В одном конкретном аспекте, когда соединение по изобретению имеет такой ISVD на своем С-конце (т.е. не имеет агента, связывающего TNF, по изобретению на своем С-конце), то по меньшей мере упомянутый ISVD, который присутствует и/или образует С-конец, имеет такие каркасные мутации, которые уменьшают связывание с предсуществующими антителами (и указанный C-концевой ISVD предпочтительно также имеет C-концевое удлинение X(n), как описано в настоящей заявке).

Как уже упоминалось, когда соединение по изобретению должно иметь увеличенный период полужизни (т.е. по сравнению с одновалентным агентом, связывающим TNF, по изобретению), соединение по изобретению предпочтительно содержит по меньшей мере один (например, один) ISVD (и в частности, нанотело), который обеспечивает такое увеличение периода полужизни. Такой ISVD обычно направлен против подходящего сывороточного белка, такого как трансферрин, и в частности, против (человеческого) сывороточного альбумина. В частности, такой ISVD или нанотело может быть (одно)доменным антителом или dAb против человеческого сывороточного альбумина, как описано, например, в ЕР 2139918, WO 2011/006915, WO 2012/175400, WO 2014/111550 и может, в частности, быть нанотелом, связывающим сывороточный альбумин, как описано в WO 2004/041865, WO 2006/122787, WO 2012/175400 или WO2015/173325. Особенно предпочтительными ISVD, связывающими сывороточный альбумин, являются нанотело Alb-1 (см. WO 2006/122787) или его гуманизированные варианты, такие как Alb-8 (WO 2006/122787, SEQ ID NO: 62), Alb-23 (WO 2012/175400, SEQ ID NO: 1) и другие гуманизированные (и предпочтительно также оптимизированные по последовательности) варианты Alb-1 и/или варианты Alb-8 или Alb-23 (или, как правило, ISVD, которые имеют по существу те же CDR, что и Alb-1, Alb-8 и Alb-23).

Вновь, как уже упоминалось, такой ISVD, связывающий сывороточный альбумин, если он присутствует, может содержать в своей последовательности одну или несколько каркасных мутаций, которые уменьшают связывание с предсуществующими антителами. В частности, когда такой ISVD, связывающий сывороточный альбумин, представляет собой нанотело или (одиночное) доменное антитело, которое по существу состоит и/или является производным от VH домена, ISVD, связывающий сывороточный альбумин, может содержать (подходящую комбинацию) аминокислотные остатки/мутации в положениях 11, 89, 110 и / или 112, которые описаны в WO 02015/173325 и/или которые, по существу являются такими, как описано здесь для агентов, связывающих TNF по изобретению. Например, в WO 02015/173325 описывается ряд вариантов Alb-1, Alb-8 и Alb-23, которые содержат аминокислотные остатки/мутации в положениях 11, 89, 110 и/или 112, которые уменьшают связывание с предсуществующими антителами, которые могут быть использованы в соединениях по изобретению.

В конкретном, но не ограничивающем аспекте изобретения настоящее изобретение обеспечивает соединение по изобретению, такое как полипептид по изобретению, содержащий помимо одного или нескольких составляющих элементов, например, ISVD, связывающих TNF, по меньшей мере один составляющий элемент, связывающий сывороточный альбумин, такой как ISVD, связывающий сывороточный альбумин, предпочтительно, связывающий человеческий сывороточный альбумин, как описано в настоящей заявке, где указанный ISVD, связывающий сывороточный альбумин, по существу состоит из 4 каркасных областей (FR1-FR4,соответственно) и 3 гипервариабельных областей (CDR1-CDR3, соответственно), в которых CDR1 представляет собой SFGMS, CDR2 представляет собой SISGSGSDTLYADSVKG, а CDR3 представляет собой GGSLSR. Предпочтительно, указанный ISVD, связывающий человеческий сывороточный альбумин, выбран из группы, состоящей из Alb8, Alb23, Alb129, Alb132, Alb11, Alb11 (S112K) -A, Alb82, Alb82-A, Alb82-AA, Alb82-AAA, Alb82-G, Alb82-GG, Alb82-GGG, Alb92 или Alb223 (см. Таблицу D).

Опять же, когда такой ISVD, связывающий сывороточный альбумин, присутствует на С-конце соединения по изобретению, ISVD, связывающий сывороточный альбумин (и как результат, соединение по изобретению) предпочтительно имеет C-концевое удлинение X(n), причем C-концевое удлинение может быть таким, как описано в настоящей заявке для агентов, связывающих TNF, по изобретению и/или как описано в WO 2012/175741 или WO 2015/173325. Он также предпочтительно имеет мутации, которые уменьшают связывание с предсуществующими антителами, такие как (подходящая комбинация) аминокислотные остатки/мутации в положениях 11, 89, 110 и/или 112, описанные в WO 2015/173325.

Однако, как упоминалось, другие средства увеличения периода полужизни соединения по изобретению (такие, как ПЭГилирование, гибридизация с альбумином человека или его подходящим фрагментом, или использование подходящего пептида, связывающего сывороточный альбумин), хотя и менее предпочтительны, также включены в объем изобретения.

Соответственно, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению, как описано в настоящей заявке, где указанный компонент, связывающий сывороточный белок, представляет собой полипептид не на основе антитела.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединению, описанному в настоящей заявке, дополнительно содержащему ПЭГ.

Как правило, когда соединение по изобретению имеет увеличенный период полужизни (например, благодаря наличию ISVD, увеличивающего период полужизни, или за счет любого другого подходящего способа увеличения периода полужизни), полученное соединение по изобретению предпочтительно имеет период полужизни (как определено в настоящей заявке), который по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно по меньшей мере в 5 раз, например, по меньшей мере в 10 раз или более чем в 20 раз, превышает период полужизни одновалентного агента, связывающего TNF, по изобретению (как измерено у человека и/или на подходящей животной модели, такой как с применением мышей или яванских макак). В частности, соединение по изобретению предпочтительно имеет период полужизни (как определено в настоящей заявке) у человеческих индивидуумов по меньшей мере 1 день, предпочтительно по меньшей мере 3 дня, более предпочтительно по меньшей мере 7 дней, например, по меньшей мере 10 дней.

Из раскрытия станет понятно, что соединения по изобретению, которые основаны на одном или нескольких ISVD, могут иметь разные «форматы», например, по существу являются одновалентными, двухвалентными или трехвалентными; могут быть моноспецифическими, биспецифическими, триспецифическими и т.д., и могут быть бипаратопными (как определено в настоящей заявке, и например, в WO 2009/068625). Например, соединение по изобретению может быть:

- (по существу) одновалентным, то есть (по существу) содержащим единственный агент, связывающий TNF, по изобретению. Как уже упоминалось, при использовании в одновалентном формате агент, связывающий TNF, по изобретению предпочтительно имеет C-концевое удлинение X(n), как описано в настоящей заявке. Такое соединение по изобретению может также иметь увеличенный период полужизни;

- (по существу) двухвалентным или трехвалентным и моноспецифическим. Такое соединение по изобретению будет содержать два или более ISVD против TNF, которые могут быть одинаковыми или различными, и когда они разные, то могут быть направлены против одного и того же эпитопа на TNF или против разных эпитопов на TNF (в последнем случае, чтобы обеспечить бипаратопное или полипаратопное соединение по изобретению). Такое соединение по изобретению может также иметь увеличенный период полужизни;

- (по существу) двухвалентным, трехвалентным (или поливалентным) и биспецифическим или триспецифическим (или полиспецифическим). Такое соединение по изобретению будет направлено против TNF и по меньшей мере одной другой мишени. Как описано в настоящей заявке, указанная другая мишень может представлять собой, например, другую терапевтически значимую мишень (то есть отличную от TNF), чтобы обеспечить соединение по изобретению, которое является биспецифичным по отношению к TNF и указанной другой терапевтической мишени. Указанная другая мишень также может быть мишенью, которая обеспечивает повышенный период полужизни (такой, как человеческий сывороточный альбумин), с тем чтобы обеспечить соединение по изобретению, которое имеет увеличенный период полужизни. Как также упомянуто здесь, такая другая мишень может также обеспечивать нацеливание соединения по изобретению на конкретные клети, ткани или органы, или обеспечивать интернализацию соединения по изобретению в клетке. Также возможно комбинировать эти подходы/ISVD, например, для получения соединения по изобретению, которое является биспецифичным для TNF и по меньшей мере для одной другой терапевтически релевантной мишени, и имеет повышенной период полужизни.

Опять же, предпочтительно, когда эти соединения по изобретению содержат один или несколько ISVD, отличных от по меньшей мере одного агента, связывающего TNF, по изобретению, по меньшей мере один и предпочтительно все из этих других ISVD будут содержать в своей последовательности одну или более каркасных мутаций, которые снижают связывание с предсуществующими антителами (такими как, в частности, комбинация аминокислотных остатков/мутаций в положениях 11, 89, 110 и/или 112, как описано в настоящей заявке для агентов, связывающих TNF, по изобретению и/или, как описано в целом в WO2015/173325). Кроме того, когда такие соединения по изобретению имеют агент, связывающий TNF, по изобретению на их С-конце, то указанный С-концевой агент, связывающий TNF (и, как результат, соединение по изобретению), предпочтительно будет иметь С-концевое удлинение Х(n), как описано в настоящей заявке. Аналогично, когда такие соединения по изобретению имеют другой ISVD на своем С-конце (т.е. не агент, связывающий TNF, по изобретению, но, например, ISVD, увеличивающий период полужизни), тогда указанный C-концевой ISVD (и, как результат, соединение по изобретению) предпочтительно будет иметь C-концевое удлинение X(n), как описано в настоящей заявке, и/или будет содержать в своей последовательности одну или несколько каркасных мутаций, которые уменьшают связывание с предсуществующими антителами (вновь, как дополнительно описано в настоящей заявке и в WO2015/173325).

Как понятно специалисту в данной области техники, когда соединение по изобретению предназначено для местного применения (например, на коже или в глазу), или, например, должно иметь (локализованное) терапевтическое действие где-либо, например, в ЖКТ (например, после перорального введения или с помощью суппозитория) или в легких (например, после введения путем ингаляции), или иначе предназначено для непосредственного применения в его предполагаемом месте действия (например, путем прямой инъекции), соединение в соответствии с настоящим изобретением обычно не требует удлинения периода полужизни. Кроме того, для лечения определенных острых состояний или показаний может быть предпочтительным не иметь удлиненного периода полужизни. В этих случаях использование одновалентного соединения по изобретению, или соединения по изобретению (содержащего агент, связывающий TNF) без удлинения периода полужизни (например, соединения по изобретению, которое является двухвалентным или бипаратопным по отношению к TNF), является предпочтительным.

Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие примеры таких соединений по изобретению схематически представлены в Таблице С-1 ниже, и каждая из этих форм является еще одним аспектом изобретения. Другие примеры подходящих соединений по изобретению без продления периода полужизни будут понятны для специалиста в данной области техники на основании раскрытия настоящей заявки.

Как понятно специалисту в данной области техники, когда соединение по изобретению предназначено для системного применения и/или для профилактики и/или лечения хронического заболевания или расстройства, обычно будет предпочтительно, чтобы указанное соединение по изобретению имело увеличенный период полужизни (как определено в настоящей заявке), т.е. по сравнению с агентом (агентами), связывающим TNF, присутствующим в таком соединении по изобретению. Более предпочтительно, такое соединение по изобретению содержит ISVD, увеличивающий период полужизни, предпочтительно, такой как ISVD и, в частности, нанотело, связывающееся с человеческим сывороточным альбумином (как описано в настоящей заявке).

Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие примеры таких соединений по изобретению схематически представлены в Таблице С-2 ниже, и каждое из них является еще одним аспектом изобретения. Другие примеры подходящих соединений по изобретению с продлением периода полужизни будут ясны специалисту в данной области техники на основании раскрытого здесь описания. Как правило, для соединений по изобретению с увеличением периода полужизни предпочтительным является наличие С-концевого удлинения.

Одиночные вариабельные домены иммуноглобулина могут быть использованы в качестве «кирпичиков» для получения соединения, такого как полипептид по изобретению, которое может при необходимости содержать один или несколько дополнительных «кирпичиков», таких как ISVD, против того же самого или другого эпитопа на TNF, и/или против одного или нескольких других антигенов, белков или мишеней, чем TNF; например, кирпичиков, имеющих терапевтический способ действия.

Как правило, соединения, полипептиды или конструкции, которые содержат или по существу состоят из одного кирпичика, одиночного вариабельного домена иммуноглобулина или одного нанотела, будут в дальнейшем упоминаться как «одновалентные» соединения или «одновалентные» полипептиды или как «одновалентные конструкции», соответственно. Соединения, полипептиды или конструкции, которые содержат два или более кирпичика или связывающих единиц (например, ISVD), также будут упоминаться в настоящей заявке как «поливалентные» соединения, полипептиды или конструкции, а также кирпичики/ISVD, присутствующие в таких соединениях, полипептидах или конструкциях также будут упоминаться здесь, как находящиеся в «поливалентном формате». Например, «двухвалентное» соединение или полипептид может содержать два одиночных вариабельных домена иммуноглобулина, при необходимости связанных через линкерную последовательность; тогда как «трехвалентное» соединение или полипептид может содержать три одиночных вариабельных домена иммуноглобулина, при необходимости связанных через две линкерные последовательности; тогда как «четырехвалентное» соединение или полипептид может содержать четыре одиночных вариабельных домена иммуноглобулина, при необходимости связанных через три линкерные последовательности, и т.д.

В поливалентном соединении, полипептиде или конструкции два или более ISVD, таких как нанотела, могут быть одинаковыми или разными, и могут быть направлены против того же антигена или антигенной детерминанты (например, против одной и той же части (частей) или эпитопа (эпитопов), или против разных частей или эпитопов), или могут быть альтернативно направлены против различных антигенов или антигенных детерминант; или любой их подходящей комбинации. Соединения, полипептиды или конструкции, которые содержат по меньшей мере два структурных элемента (например, ISVD), в которых по меньшей мере один структурный элемент направлен против первого антигена (то есть, TNF), и по меньшей мере один структурный элемент направлен против второго антигена (т.е. отличающийся от TNF), также будут называться «полиспецифическими» соединениями, полипептидами или конструкциями, соответственно, а структурные элементы (такие как, например, ISVD), присутствующие в таких соединениях, полипептидах или конструкциях, будут также упоминаться в настоящей заявке, как присутствующие в «полиспецифическом формате». Так, например, «биспецифическое» соединение или полипептид по изобретению представляет собой соединение или полипептид, который содержит по меньшей мере один ISVD, направленный против первого антигена (то есть, TNF) и по меньшей мере еще один ISVD, направленный против второго антигена (то есть, отличающегося от TNF), тогда как «триспецифическое» соединение или полипептид по изобретению представляет собой соединение или полипептид, который содержит по меньшей мере один ISVD, направленный против первого антигена (то есть, TNF), по меньшей мере еще один ISVD, направленный против второго антигена (т.е., отличающегося от TNF) и по меньшей мере еще один ISVD, направленный против третьего антигена (т.е. отличающегося и от TNF, и от второго антигена); и т.д.

«Полипаратопные» соединения, «полипаратопные» полипептиды и «полипаратопные» конструкции, такие как, например, «бипаратопные» соединения, полипептиды или конструкции, или «трипаратопные» соединения, полипептиды или конструкции, содержат или по существу состоят из двух или более структурных элементов, каждый из которых имеет другой паратоп.

Соответственно, ISVD по изобретению, которые связывают TNF, могут быть по существу в изолированной форме (как определено в настоящей заявке) или они могут составлять часть соединения, полипептида или конструкции, которая может содержать или по существу состоять из одного или нескольких ISVD, которые связывают TNF и которые могут при необходимости дополнительно содержать одну или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей (все они при необходимости связаны через один или несколько подходящих линкеров). Настоящее изобретение относится к соединению, полипептиду или конструкции, которые содержат или по существу состоят из по меньшей мере одного ISVD в соответствии с изобретением, такого как один или несколько ISVD по изобретению (или их подходящие фрагменты), связывающие TNF, как определено в настоящей заявке.

Один или несколько ISVD по изобретению могут быть использованы в качестве связывающей единицы или структурного элемента в таком соединении, полипептиде или конструкции, чтобы обеспечить одновалентное, поливалентное или полипаратопное соединение, полипептид или конструкцию изобретения, соответственно, все как описано в настоящей заявке. Таким образом, настоящее изобретение относится также к соединению или полипептиду, который является одновалентным, содержащим или по существу состоящим из одного одновалентного полипептида или ISVD по изобретению. Таким образом, настоящее изобретение относится также к соединению, полипептиду или конструкции, которые представляют собой поливалентное соединение, поливалентный полипептид или поливалентную конструкцию, соответственно, например, двухвалентное или трехвалентное соединение, полипептид или конструкцию, содержащие или по существу состоящие из двух или более ISVD из изобретения (для поливалентных и полиспецифических соединений или полипептидов, содержащих один или более VHH доменов и их получения, также приводится ссылка на Conrath et al. (J. Biol.Chem., 276: 7346-7350, 2001), а также, например, на WO 96/34103, WO 99/23221 и WO 2010/115998).

Изобретение также относится к поливалентному соединению или полипептиду (также упоминаемому здесь как «поливалентное соединение (соединения) по изобретению» и «поливалентный полипептид(ы) по изобретению», соответственно), включающему или (по существу) состоящему из по меньшей мере из одного ISVD (или его подходящих фрагментов), направленного против TNF, предпочтительно человеческого TNF, и одного дополнительного ISVD.

В одном аспекте в его простейшей форме поливалентное соединение, полипептид или конструкция по изобретению представляют собой двухвалентное соединение, полипептид или конструкцию по изобретению, включающий первый ISVD, такой как нанотело, направленный против TNF, и идентичный второй ISVD, такой как нанотело, направленный против TNF, причем указанные первый и второй ISVD, такие как нанотела, могут быть при необходимости связаны посредством линкерной последовательности (как определено в настоящей заявке). В его простейшей форме поливалентное соединение, полипептид или конструкция по изобретению могут представлять собой трехвалентное соединение, полипептид или конструкцию по изобретению, включающие первый ISVD, такой как нанотело, направленный против TNF, идентичный второй ISVD, такой как нанотело, направленный против TNF, и идентичный третий ISVD, такой как нанотело, направленный против TNF, в котором указанные первый, второй и третий ISVD иммуноглобулины, такие как нанотела, могут быть при необходимости связаны через одну или более, и в частности две линкерные последовательности.

В другом аспекте поливалентное соединение, полипептид или конструкция по изобретению могут быть биспецифическим соединением, полипептидом или конструкцией по изобретению, содержащими первый ISVD, такой как нанотело, направленный против TNF, и второй ISVD, такой как нанотело, направленный против второго антигена, в котором указанные первые и второй ISVD, такие как нанотела, могут быть при необходимости связаны посредством линкерной последовательности (как определено в настоящей заявке); в то время как поливалентное соединение, полипептид или конструкция по изобретению могут также представлять собой триспецифическое соединение, полипептид или конструкцию изобретения, включающие первый ISVD, такой как нанотело, направленный против TNF, второй ISVD, такой как нанотело, направленный против второго антигена, и третий ISVD, такой как нанотело, направленный против третьего антигена, в котором указанные первый, второй и третий ISVD, такие как нанотела, могут быть при необходимости связаны через одну или более, и в частности две линкерные последовательности. В конкретном аспекте соединение, полипептид или конструкция по изобретению представляют собой трехвалентное, биспецифическое соединение, полипептид или конструкцию, соответственно. Трехвалентное, биспецифическое соединение, полипептид или конструкция по изобретению в его простейшей форме могут представлять собой трехвалентное соединение, полипептид или конструкцию по изобретению (как определено в настоящей заявке), содержащие два идентичных ISVD, таких как нанотела, против TNF, и третий ISVD, такой как нанотело, направленный против другого антигена, где указанные первый, второй и третий ISVD, такие как нанотела, могут быть при необходимости связаны через одну или более, и в частности две линкерные последовательности.

В другом аспекте соединение или полипептид по изобретению представляет собой биспецифическое соединение или полипептид. Биспецифическое соединение, полипептид или конструкция по изобретению в их простейшей форме могут представлять собой двухвалентное соединение, полипептид или конструкцию изобретения (как определено в настоящей заявке), которые содержат ISVD, такой как нанотело, против TNF, и второй ISVD, такой как нанотело, направленный против другого антигена, где указанные первый и второй ISVD, такие как нанотела, могут быть при необходимости связаны посредством линкерной последовательности.

В предпочтительном аспекте поливалентное соединение, полипептид или конструкция по изобретению содержат или по существу состоят из двух или более одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина, направленных против TNF. В одном аспекте изобретение относится к соединению, полипептиду или конструкции, которые содержат или по существу состоят из по меньшей мере двух ISVD в соответствии с изобретением, таких как 2, 3 или 4 ISVD (или их подходящих фрагментов), связывающих TNF. Два или более ISVD могут быть при необходимости связаны через один или несколько пептидных линкеров.

В предпочтительном аспекте соединение, полипептид или конструкция по изобретению содержат или по существу состоят из по меньшей мере двух ISVD, причем указанные по меньшей мере два ISVD могут быть одинаковыми или разными, но из которых по меньшей мере один ISVD направлен против TNF, такой как агент, связывающий TNF.

В конкретном аспекте соединение, полипептид или конструкция по изобретению содержат или по существу состоят из по меньшей мере двух ISVD, где по меньшей мере два ISVD независимо выбраны из группы, состоящей из SEQ ID №: 8 - 41 и 61-66 и 69.

Относительные аффинности могут зависеть от местоположения ISVD в полученном соединении, полипептиде или конструкции по изобретению. Понятно, что порядок ISVD в соединении или полипептиде по изобретению (ориентация) может быть выбран в соответствии с потребностями специалиста в данной области техники. Порядок отдельных ISVD, а также то, включает ли соединение или полипептид линкер, является вопросом дизайна. Некоторые ориентации, с линкерами или без линкеров, могут обеспечивать предпочтительные характеристики связывания по сравнению с другими ориентациями. Например, порядок первого ISVD (например, ISVD 1) и второго ISVD (например, ISVD 2) в соединении, полипептиде или конструкции по изобретению может быть (от N-конца до C-конца): (i) ISVD 1 (например, нанотело 1) - [линкер] - ISVD 2 (например, нанотело 2); или (ii) ISVD 2 (например, нанотело 2) - [линкер] - ISVD 1 (например, нанотело 1); (где линкер является необязательным). Изобретение охватывает все направления. Соединения, полипептиды и конструкции, которые содержат ISVD в той ориентации, которая обеспечивает необходимые характеристики связывания, могут быть легко идентифицированы путем рутинного скрининга.

В соединениях или конструкциях по изобретению, таких как полипептиды по изобретению, два или более структурных элемента, таких как, например, ISVD и при необходимости одна или несколько других групп, лекарственные средства, агенты, остатки, фрагменты или связующие единицы могут быть непосредственно связаны друг с другом (как, например, описано в WO 99/23221) и/или могут быть связаны друг с другом посредством одного или более подходящих спейсеров или линкеров, или любой их комбинации. Подходящие спейсеры или линкеры для использования в поливалентных и полиспецифических соединениях или полипептидах будут ясны специалисту в данной области, и могут обычно представлять собой любой линкер или спейсер, используемый в данной области для связывания аминокислотных последовательностей. Предпочтительно, указанный линкер или спейсер подходит для использования при создании соединений, конструкций, белков или полипептидов, предназначенных для фармацевтического применения.

В одном варианте осуществления изобретение относится к соединению или полипептиду, как определено в настоящей заявке, где указанные ISVD непосредственно связаны друг с другом, или связаны через линкер. В другом варианте осуществления изобретение относится к соединению или полипептиду, как определено в настоящей заявке, где первый ISVD и/или второй ISVD и/или, возможно, третий ISVD и/или, возможно, ISVD-связывающий сывороточный альбумин связаны через линкер.

Некоторые особо предпочтительные линкеры и спейсеры включают спейсеры и линкеры, которые используются в данной области техники для связывания фрагментов антител или доменов антител. К ним относятся линкеры, упомянутые в уровне техники, указанном выше, а также, например, линкеры, которые используются в данной области техники для создания диател или фрагментов ScFv (в этом отношении, однако, следует отметить, что, хотя в диателах и в ScFv фрагментах используемая последовательность линкеров должна иметь длину, степень гибкости и другие свойства, которые позволяют соответствующим доменам VH и VL объединяться, чтобы сформировать полный антигенсвязывающий участок, нет особых ограничений по длине или гибкости линкера, используемого в полипептиде по изобретению, поскольку каждый ISVD, такой как нанотело, сам по себе образует полный антигенсвязывающий участок).

Например, линкер может быть подходящей аминокислотной последовательностью, в частности, аминокислотными последовательностями от 1 до 50, предпочтительно между 1 и 30, например, от 1 до 10 аминокислотных остатков. Некоторые предпочтительные примеры таких аминокислотных последовательностей включают глицин-сериновые линкеры, например типа (Gly_xSer_y)_z, такие как (например, (Gly₄Ser)₃ или (Gly₃Ser₂)₃, как описано в WO 99/42077, и линкеры GS30, GS15, GS9 и GS7, описанные в заявках Ablynx, упомянутых здесь (см., например, WO 06/040153 и WO 06/122825), а также шарнирные области, такие как шарнирные области встречающихся в природе антител из тяжелых цепей, или аналогичные последовательности (как описано в WO 94/04678). Предпочтительные линкеры показаны в Таблице E, например SEQ ID №: 85-100.

Некоторые другие особо предпочтительные линкеры представляют собой полиаланин (такой как ААА), а также линкеры GS30 (SEQ ID NO: 85 в WO 06/122825) и GS9 (SEQ ID NO: 84 в WO 06/122825).

В одном варианте осуществления изобретение относится к соединению, определенному в настоящей заявке, где указанный линкер выбран из группы, состоящей из линкеров 5GS, 7GS, 9GS, 10GS, 15GS, 18GS, 20GS, 25GS, 30GS, 35GS и 40GS.

Другие подходящие линкеры обычно содержат органические соединения или полимеры, в частности те, которые пригодны для использования в белках для фармацевтического применения. Например, поли(этиленгликолевые) компоненты использовались для связывания доменов антител, см., например, WO 04/081026.

Объемом изобретения охватывается, что длина, степень гибкости и/или другие свойства используемого линкера(-ов) (хотя и не критические, как это обычно бывает для линкеров, используемых в фрагментах ScFv) могут оказывать определенное влияние на свойства конечного соединения или конструкции по изобретению, таких как полипептид по изобретению, включая, но не ограничиваясь, аффинность, специфичность или авидность для хемокина или для одного или нескольких других антигенов. На основании описания, специалист в данной области сможет определить оптимальный линкер (линкеры) для использования в конкретном соединении или конструкции по изобретению, таком как полипептид по изобретению, при необходимости после небольшого числа рутинных экспериментов.

Например, в поливалентных соединениях или полипептидах по изобретению, которые включают в себя кирпичики, такие как ISVD или нанотела, направленные против TNF и другой мишени, длина и гибкость линкера предпочтительно таковы, что они позволяют каждому кирпичику, такому как ISVD, из настоящего изобретения, присутствующего в полипептиде, связываться с его собственной мишенью, например антигенной детерминантой на каждой из мишеней. Опять же, на основании раскрытого здесь описания специалист в данной области техники сможет определить оптимальный линкер (линкеры) для использования в конкретном соединении или конструкции по изобретению, таких как полипептид по изобретению, при необходимости после небольшого числа рутинных экспериментов.

Также в объем настоящего изобретения входит, что используемый линкер(ы) обеспечивает одно или несколько других благоприятных свойств или функциональных возможностей для соединений или конструкций по изобретению, таких как полипептиды по изобретению, и/или обеспечивает один или нескольких участков для образования производных и/или для присоединения функциональных групп (например, как описано в настоящей заявке для производных ISVD по изобретению). Например, линкеры, содержащие один или несколько заряженных аминокислотных остатков, могут обеспечить улучшенные гидрофильные свойства, тогда как линкеры, которые образуют или содержат небольшие эпитопы или метки, могут использоваться для обнаружения, идентификации и/или очистки. Опять же, на основании описания, специалист в данной области сможет определить оптимальные линкеры для использования в конкретном соединении, полипептиде или конструкции по изобретению, при необходимости после небольшого числа рутинных экспериментов.

Наконец, когда два или более линкера используются в соединениях или конструкциях, таких как полипептиды по изобретению, эти линкеры могут быть одинаковыми или разными. Опять же, на основании раскрытого здесь описания специалист в данной области техники сможет определить оптимальные линкеры для использования в конкретном соединении или конструкции или полипептиде по изобретению, при необходимости после небольшого числа рутинных экспериментов.

Для общего описания поливалентных и полиспецифических соединений и полипептидов, содержащих одно или несколько нанотел, и их получения, также приводится ссылка на Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001; Muyldermans, «Reviews in Molecular Biotechnology», 74 (2001), 277-302; а также, например, на WO 1996/34103, WO 1999/23221, WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 или WO 2009/068627.

Изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям или нуклеиновым кислотам, которые кодируют аминокислотные последовательности, агенты, связывающие TNF, полипептиды, слитые белки, соединения и конструкции, описанные в настоящей заявке. Изобретение далее включает в себя генетические конструкции, которые содержат вышеупомянутые нуклеотидные последовательности или нуклеиновые кислоты, и один или несколько элементов для известных генетических конструкций. Генетическая конструкция может быть в виде плазмиды или вектора. Опять-таки, эти конструкции могут быть в целом такими, как описано в опубликованных патентных заявках Ablynx N.V., таких как, например, как WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 или WO 2009/068627.

В одном аспекте изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей ISVD, полипептид, соединение или конструкцию в соответствии с изобретением.

В другом аспекте изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему нуклеиновую кислоту согласно изобретению.

Изобретение также относится к хозяевам или клеткам-хозяевам, которые содержат такие нуклеотидные последовательности или нуклеиновые кислоты и/или экспрессируют (или способны экспрессировать) аминокислотные последовательности, агенты, связывающие TNF, полипептиды, слитые белки, соединения и конструкции, описанные в настоящей заявке. Опять же, такие клетки-хозяева могут быть, как правило, такими, как описано в опубликованных патентных заявках Ablynx N.V, таких как, например, WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 или WO 2009/068627.

В одном аспекте изобретение относится к хозяину или клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением, или вектор экспрессии согласно изобретению.

Изобретение также относится к способу получения аминокислотной последовательности, агентов, связывающих TNF, полипептидов, слитого белка, соединений или конструкций, как описано в настоящей заявке, причем этот способ включает культивирование или поддержку клетки-хозяина, как описано в настоящей заявке, в условиях, при которых указанная клетка-хозяин продуцирует или экспрессирует аминокислотную последовательность, агенты, связывающие TNF, полипептиды, слитый белок, соединения или конструкцию, как описано в настоящей заявке, и при необходимости дополнительно включает выделение аминокислотной последовательности, агентов, связывающих TNF, полипептидов, слитого белка, соединений или конструкций, полученных таким способом. Опять-таки, такие способы могут быть выполнены, как обычно описано в опубликованных патентных заявках Ablynx N.V, таких как, например, WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 или WO 2009/068627.

В конкретном аспекте изобретение относится к способу получения ISVD в соответствии с изобретением или соединения в соответствии с изобретением, или полипептида в соответствии с изобретением, причем указанный способ по меньшей мере включает следующие стадии:

а) экспрессию в подходящей клетке-хозяине или в организме-хозяине или в другой подходящей системе экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, как определено в настоящей заявке; при необходимости, с последующей стадией:

b) выделения и/или очистки ISVD в соответствии с изобретением, соединения в соответствии с изобретением, или полипептида в соответствии с изобретением, соответственно.

Изобретение также относится к композиции, которая содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, агент, связывающий TNF, полипептид, слитый белок, соединение или конструкцию, как описано в настоящей заявке.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, которая включает по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, агент, связывающий TNF, полипептид, слитый белок, соединение или конструкцию, как описано в настоящей заявке, и при необходимости по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель и/или адъювант, и при необходимости содержит один или несколько дополнительных фармацевтически активных полипептидов и/или соединений. Такие препараты, носители, наполнители и разбавители обычно могут быть такими, как описано в опубликованных патентных заявках Ablynx NV, например, таких как WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 или WO 2009/068627.

Когда аминокислотные последовательности, агенты, связывающие TNF, полипептиды, слитые белки, соединения или конструкции, описанные в настоящей заявке, имеют увеличенный период полужизни, их предпочтительно вводят в кровоток. Таким образом, их можно вводить любым подходящим способом, который позволяет аминокислотным последовательностям, агентам, связывающим TNF, полипептидам, слитым белкам, соединениям или конструкциям проникать в кровоток, например, внутривенно, путем инъекции или инфузии, или любым другим подходящим способом (включая пероральное введение, подкожное введение, внутримышечное введение, введение через кожу, интраназальное введение, введение через легкие и т.д.), который позволяет аминокислотным последовательностям, агентам, связывающим TNF, полипептидам, слитым белкам, соединениям или конструкциям проникать в кровоток. Подходящие способы и пути введения будут понятны специалисту в данной области техники, опять же, например, из учения опубликованных патентных заявок Ablynx NV, например, таких как WO 2004/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 или WO 2009/068627.

В другом аспекте изобретение относится к способу профилактики и/или лечения по меньшей мере одного заболевания или расстройства, которое может быть предотвращено или вылечено с использованием аминокислотной последовательности, агента, связывающего TNF, полипептида, слитого белка, соединения или как описано в настоящей заявке, причем способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически активного количества аминокислотной последовательности, агента, связывающего TNF, полипептида, слитого белка, соединения или конструкции по изобретению и/или фармацевтической композиции, включающей их. Заболевания и расстройства, которые могут быть предотвращены или вылечены с использованием полипептида, слитого белка, соединения или конструкции, как описано в настоящей заявке, будут в целом такими же, как заболевания и расстройства, которые могут быть предотвращены или вылечены с использованием терапевтического компонента, который присутствует в полипептиде, слитом белке, соединении или конструкции по изобретению. В частности, настоящее изобретение относится к соединению, композиции, конструкции, полипептиду, агенту, связывающему TNF, или ISVD, как описано здесь для использования в качестве лекарственного средства.

В контексте настоящего изобретения термин «профилактика и/или лечение» включает не только профилактику и/или лечение заболевания, но также, как правило, включает предотвращение начала заболевания, замедление или предотвращение прогрессирования заболевания; предотвращение или замедление развития одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием; уменьшение и/или облегчение одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием; снижение тяжести и/или продолжительности заболевания и/или любых связанных с ним симптомов; и/или предотвращение дальнейшего увеличения тяжести заболевания и/или любых связанных с ним симптомов; предотвращение, уменьшение или восстановление любого физиологического повреждения, вызванного заболеванием; и обычно любое фармакологическое действие, которое полезно для пациента, которого лечат. Чтобы представлять собой подходящий терапевтический агент композиция по изобретению не обязана вызывать полное излечение или устранять любой симптом или проявление заболевания. Как считают в соответствующей области техники, чтобы быть признанными в качестве полезных терапевтических агентов лекарственные средства, используемые в качестве терапевтических агентов, могут снижать тяжесть данного патологического состояния, но не обязаны отменять каждое проявление заболевания. Точно так же профилактически применяемое лечение не обязательно может быть 100% эффективным в предотвращении возникновения состояния, чтобы составлять пригодный профилактический агент. Простое снижение воздействия болезни (например, уменьшение числа или тяжести ее симптомов, или повышение эффективности другого лечения, или создание другого благоприятного эффекта) или снижение вероятности возникновения или ухудшения заболевания у субъекта является достаточным.

В одном варианте осуществления указанием на то, что пациенту было введено терапевтически эффективное количество композиции, является устойчивое улучшение, по сравнению с базовым уровнем, показателя, который отражает тяжесть конкретного расстройства. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат терапевтически эффективное количество ISVD, соединения или полипептида по настоящему изобретению, сформированного вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями или наполнителями. Под «терапевтически эффективным количеством» ISVD, соединения или полипептида по изобретению подразумевается количество композиции, которое оказывает терапевтический эффект у субъекта, получающего лечение, при разумном соотношении пользы/риска, применимом к любому лечению. Терапевтический эффект является достаточным для «лечения» пациента, поскольку этот термин используется здесь.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, конструкции, соединению, агенту, связывающему TNF, ISVD или полипептиду, как описано в настоящей заявке, для использования при лечении заболевания и/или расстройства пищеварительного тракта.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, конструкции, соединению, агенту, связывающему TNF, ISVD или полипептиду, как описано в настоящей заявке, где указанным заболеванием и/или расстройством пищеварительного тракта является воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), синдром раздраженного кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, мукозит, афтозный стоматит, целиакия, травма пищеварительного тракта и рак пищеварительного тракта.

Пациенты с синдромом раздраженного кишечника имеют измененную проницаемость кишечника, несмотря на то, что в кишечнике мало гистологических изменений, или они вообще не обнаруживаются (Dunlop Am J Gastroenterol, 2006 Jun, 101 (6): 1288-94). У пациентов с целиакией изменена проницаемость кишечника, и отмечается характерное повреждение ворсинок тонкой кишки, что позволяет отличить это заболевание от ВЗК. Воспалительное заболевание кишечника, как полагают, является результатом нарушения регуляции иммунного ответа, инициированного взаимодействием микроб-хозяин. Иммунная система реагирует на непатогенные комменсальные бактерии, вызывая хроническое воспаление. Аналогичным образом, при некротизирующем энтероколите подвергнутая стрессу, недостаточно развитая иммунная система генерирует неадекватный ответ на нормальные кишечные бактерии, вызывая потенциально фатальную форму колита (Jilling et al., 2006, J Immunol, 177, 3273-82).

Субъектом, подвергаемым лечению, может быть любое теплокровное животное, но, в частности, млекопитающее, и в частности, человек. Как будет ясно специалисту в данной области, субъект, подлежащий лечению, будет, в частности, человеком, страдающим или подверженным риску развития заболеваний и расстройств, упомянутых в настоящей заявке.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу иммунотерапии и, в частности, пассивной иммунотерапии, который включает введение субъекту, страдающему или подверженному риску развития заболеваний и расстройств, упомянутых в настоящей заявке, фармацевтически активного количества аминокислотной последовательности, агента, связывающего TNF, полипептида, слитого белка, соединения или конструкции по изобретению и/или фармацевтической композиции, содержащей их.

Аминокислотную последовательность, агент, связывающий TNF, полипептид, слитый белок, соединение или конструкцию и/или композиции, содержащие их, вводят в соответствии с режимом лечения, который подходит для профилактики и/или лечения заболевания или расстройства, которое следует предотвратить или вылечить. Клиницист, как правило, сможет определить подходящий режим лечения в зависимости от таких факторов, как заболевание или нарушение, которые следует предотвратить или вылечить; тяжесть заболевания, подлежащего лечению, и/или тяжесть его симптомов, конкретная аминокислотная последовательность, агент, связывающий TNF, полипептид, слитый белок, соединение или конструкция по изобретению, конкретный путь введения и фармацевтическая композиция или состав, которые должны использоваться; возраст, пол, масса тела, диета, общее состояние пациента и аналогичные факторы, хорошо известные клиницисту.

Как правило, режим лечения будет включать введение одной или нескольких аминокислотных последовательностей, агентов, связывающих TNF, полипептидов, слитых белков, соединений или конструкций по изобретению, или одной или нескольких композиций, содержащих их, в одном или нескольких фармацевтически эффективных количествах или дозах. Конкретное количество(а) или дозы, подлежащие введению, могут быть определены клиницистом, опять же на основании приведенных выше факторов.

Как правило, для профилактики и/или лечения заболеваний и расстройств, упомянутых здесь, и в зависимости от конкретного заболевания или расстройства, подлежащего лечению, эффективности и/или периода полураспада конкретных слитых белков или конструкций, которые будут использоваться, специфического способа введения и конкретного фармацевтического состава или используемой композиции, аминокислотные последовательности, агенты, связывающие TNF, полипептиды, слитые белки, соединения или конструкции по изобретению обычно вводят в количестве от 1 г до 0,01 мкг на кг массы тела в сутки, предпочтительно от 0,1 г до 0,1 мкг на кг массы тела в сутки, например, около 1, 10, 100 или 1000 мкг на кг массы тела в сутки, либо непрерывно (например, путем инфузии), либо в виде единичной суточной дозы, либо в виде нескольких разделенных доз в течение суток. Обычно клиницист может определить подходящую суточную дозу, в зависимости от факторов, упомянутых в настоящей заявке. Также будет ясно, что в конкретных случаях клиницист может выбрать отклонение от этих количеств, например, на основе приведенных выше факторов и его экспертного заключения. Как правило, некоторые рекомендации по вводимым количествам могут быть получены из количеств, обычно применяемых для сопоставимых обычных антител или фрагментов антител против той же мишени, вводимых по существу таким же способом, принимая во внимание, однако, различия в аффинности/авидности, эффективности, биораспределении, периоде полужизни, и аналогичные факторы, хорошо известные специалисту.

Обычно в вышеуказанном способе будет использоваться одна аминокислотная последовательность, агент, связывающий TNF, полипептид, слитый белок, соединение или конструкция по изобретению. Однако в объем настоящего изобретения входит использование двух или более аминокислотных последовательностей, агентов, связывающих TNF, полипептидов, слитых белков, соединений или конструкций по изобретению в комбинации.

Аминокислотные последовательности, агенты, связывающие TNF, полипептиды, слитые белки, соединения или конструкции по изобретению могут также использоваться в комбинации с одним или несколькими другими фармацевтически активными соединениями или действующими веществами, то есть в качестве комбинированного режима лечения, который может приводить или не приводить к синергетическому эффекту. Опять же, клиницист сможет выбрать такие дополнительные соединения или действующие вещества, а также подходящий комбинированный режим лечения, основанный на приведенных выше факторах и его экспертном суждении.

В частности, аминокислотные последовательности, агенты, связывающие TNF, полипептиды, слитые белки, соединения или конструкции по изобретению могут быть использованы в комбинации с другими фармацевтически активными соединениями или действующими веществами, которые используются или могут быть использованы для профилактики и/или лечения заболеваний и расстройств, которые могут быть предотвращены или вылечены аминокислотными последовательностями, агентами, связывающими TNF, полипептидами, слитыми белками, соединениями или конструкциями по изобретению, и в результате чего может быть достигнут или не достигнут синергический эффект.

Эффективность режима лечения, используемого в соответствии с изобретением, может быть определена и/или соблюдена любым способом, известным как таковой для заболевания или расстройства, как это будет понятно клиницисту. Врач также сможет, при необходимости и/или в каждом конкретном случае, изменять или модифицировать конкретный режим лечения, чтобы достичь желаемого терапевтического эффекта, чтобы избежать, ограничить или уменьшить нежелательные побочные эффекты, и/или для достижения надлежащего баланса между получением необходимого терапевтического эффекта, с одной стороны, и предотвращения, ограничения или уменьшения нежелательных побочных эффектов, с другой стороны.

Как правило, режим лечения будет выполняться до тех пор, пока не будет достигнут необходимый терапевтический эффект и/или до тех пор, пока нужно сохранить необходимый терапевтический эффект. Опять же, это может определить врач.

Поскольку аминокислотные последовательности, агенты, связывающие TNF, полипептиды, слитые белки, соединения или конструкции по изобретению способны связываться с TNF, их можно, в частности, использовать для профилактики и/или лечения заболеваний или расстройств, которые можно лечить другими биологическими лекарствами (например, антителами, например, таким как адалимумаб /HUMIRA™ или Инфликсимаб/REMICADE™), которые способны связываться с TNF и/или модулировать TNF. Такие заболевания и расстройства будут очевидны для квалифицированного специалиста. Агенты, связывающие TNF, по изобретению могут, в частности, использоваться для профилактики и лечения заболеваний и расстройств, упомянутых в WO 2004/041862 и WO 2006/122786.

Как уже упоминалось, один конкретный аспект изобретения относится к агентам, связывающим TNF, по изобретению, которые находятся в одновалентном формате. Эти одновалентные агенты, связывающие TNF, согласно изобретению особенно подходят для местного введения (включая применение на коже, в ЖКТ или легких) и/или для местного применения (например, на коже), перорального введения (например, в желудочно-кишечный тракт), введения с помощью суппозитория (опять же, например, в желудочно-кишечный тракт), и/или введения в легкие (например, путем ингаляции). Таким образом, они могут использоваться для профилактики и/или лечения заболеваний и расстройств кожи, легких или желудочно-кишечного тракта, которые могут быть предотвращены или вылечены путем применения ингибитора TNF для кожи, легких или желудочно-кишечного тракта, соответственно (таких, как воспалительные и/или аутоиммунные заболевания, поражающие кожу, легкие или желудочно-кишечный тракт, соответственно).

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, соединению, конструкции, агенту, связывающему TNF, полипептиду или ISVD, как описано в настоящей заявке, где композицию, соединение, конструкцию, агент, связывающий TNF, полипептид или ISVD вводят местно в пищеварительный тракт.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, соединению, конструкции, агенту, связывающему TNF, полипептиду или ISVD, как описано в настоящей заявке, где композицию, соединение, конструкцию, агент, связывающий TNF, полипептид или ISVD вводят перорально в лекарственной форме, подходящей для перорального введение в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ).

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, соединению, конструкции, агенту, связывающему TNF, полипептиду или ISVD, как описано в настоящей заявке, где композицию, соединение, конструкцию, агент, связывающий TNF, полипептид или ISVD применяют в лекарственной форме для перорального введения в ЖКТ, где лекарственная форма выбрана из таблеток, капсул, порошков для таблеток, гранул, эмульсий, микроэмульсий, растворов, суспензий, сиропов и эликсиров.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, соединению, конструкции, агенту, связывающему TNF, полипептиду или ISVD, как описано в настоящей заявке, где композицию, соединение, конструкцию, агент, связывающий TNF, полипептид или ISVD вводят ректально для лечения заболевания или расстройства пищеварительного тракта.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, соединению, конструкции, агенту, связывающему TNF, полипептиду или ISVD, как описано в настоящей заявке, где композицию, соединение, конструкцию, агент, связывающий TNF, полипептид или ISVD вводят ректально в лекарственной форме для ректального введения, предпочтительно выбранной из суппозиториев и клизм.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится также к композиции, соединению, конструкции, агенту, связывающему TNF, полипептиду или ISVD, как описано в настоящей заявке, где композицию, соединение, конструкцию, агент, связывающий TNF, полипептид или ISVD вводят парентерально посредством подкожной инъекцией, внутрикожной инъекции, внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, внутриочаговой инъекции, или посредством методик инфузии.

Некоторые конкретные, но не ограничивающие примеры таких заболеваний и расстройств являются заболеваниями или нарушениями ЖКТ, такими как воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), болезнь Крона, синдром раздраженного кишечника, язвенный колит, мукозит, афтозный стоматит, целиакия, травма пищеварительного тракта и/или рак пищеварительного тракта. Как упоминалось, при использовании для этих целей одновалентные агенты, связывающие TNF, по изобретению предпочтительно имеют D (или E1D) мутацию в положении 1 и С-концевое удлинение (такое, как С-концевой аланин), и агенты, связывающие TNF, с SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41, 62-63 и 65-66, в частности SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64 и 69, в частности SEQ ID NO: 40 являются предпочтительными примерами агентов, связывающих TNF, по изобретению, которые особенно подходят для этих целей.

Таким образом, в еще одном аспекте изобретение относится к агенту, связывающему TNF, по изобретению (как описано в настоящей заявке), который по существу находится в одновалентном формате (и который предпочтительно является мутацией D или E1D в положении 1 и C-концевым удлинением, таким как C-концевой аланин) для использования с целью профилактики и лечения заболеваний и расстройств кожи, легких или желудочно-кишечного тракта, и в частности, в профилактике и лечении воспалительных и/или аутоиммунных заболеваний, поражающих кожу, легкие или желудочно-кишечный тракт. Указанный агент, связывающий TNF, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41, 62-63 и 65-66, в частности SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64 и 69, в частности SEQ ID NO: 40.

Изобретение также относится к агенту, связывающему TNF, по изобретению (как описано в настоящей заявке), который по существу находится в одновалентном формате (и который предпочтительно является мутацией D или E1D в положении 1 и C-концевым удлинением, таким как C-концевой аланин) для использования в профилактике и лечении заболеваний или расстройств ЖКТ, таких как воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), болезнь Крона, синдром раздраженного кишечника, язвенный колит, мукозит, афтозный стоматит, целиакия, травма пищеварительного тракта и/или рак пищеварительного тракта, в частности, ВЗК и болезнь Крона. Опять же, указанный агент, связывающий TNF, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41, 62-63 и 65-68, в частности SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64 и 69, в частности SEQ ID NO: 40.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, предназначенной (и/или подходящей) для местного нанесения на кожу, введения путем ингаляции или другого введения в легкие и/или для перорального введения, ректального введения или другого способа введения в желудочный трактат, содержащей агент, связывающий TNF, по изобретению, который по существу находится в одновалентном формате (и предпочтительно в виде мутации D или E1D в положении 1 и C-концевом удлинении, таком как C-концевой аланин). Опять же, указанный агент, связывающий TNF, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40, 39, 36, 64, 69, 37, 38, 41, 62-63 и 65-68, в частности SEQ ID NO: 40, 39, 36 , 64 и 69, в частности SEQ ID NO: 40.

Изобретение также относится к способу профилактики или лечения заболевания или расстройства кожи, причем этот способ включает нанесение на кожу субъекта, нуждающегося в таком лечении, агента, связывающего TNF, по изобретению, который по существу находится в одновалентном формате (и предпочтительно в качестве мутации D или E1D в положении 1 и C-концевом удлинении, таком как C-концевой аланин) или композиции, содержащей такой одновалентный агент, связывающий TNF.

Изобретение также относится к способу профилактики или лечения заболевания или расстройства кожи, причем этот способ включает введение (например, путем ингаляции) в легкие субъекта, нуждающегося в таком лечении, агента, связывающего TNF, по изобретению, который по существу находится в одновалентном формате (и предпочтительно в виде мутации D или E1D в положении 1 и C-концевом удлинении, таком как C-концевой аланин), или композиции, содержащей такой одновалентный агент, связывающий TNF.

Изобретение также относится к способу профилактики или лечения заболеваний или расстройств ЖКТ, таких как воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), болезнь Крона, синдром раздраженного кишечника, язвенный колит, мукозит, афтозный стоматит, целиакия, травма пищеварительный тракт и/или рак пищеварительного тракта, в частности, ВЗК или болезнь Крона, причем этот способ включает введение (например, пероральное или ректальное введение) в желудочно-кишечный тракт субъекта, нуждающегося в таком лечении, агента, связывающего TNF, по изобретению, который по существу находится в одновалентном формате (и предпочтительно в виде мутации D или E1D в положении 1 и C-концевом удлинении, таком как C-концевой аланин) или композиции, содержащей такой одновалентный агент, связывающий TNF.

Как упоминалось ранее, в местах воспаления часто нарушается слизистый барьер пищеварительного тракта, из-за чего перорально вводимые белки могут проникать в кишечные ткани и системный кровоток. В одном варианте осуществления изобретение также относится к композиции, соединению, конструкции, агенту, связывающему TNF, полипептиду или ISVD, как описано здесь, где композиция, соединение, конструкция, агент, связывающий TNF, полипептид или ISVD достигает тканей кишечника и системного кровотока у пациента.

Другие аспекты, варианты осуществления, преимущества и приложения изобретения станут понятны из дальнейшего описания.

Далее настоящее изобретение будет описано с помощью следующих не ограничивающих предпочтительных аспектов, примеров и фигур, в которых:

- Фигура 1 является таблицей, в которой перечислены некоторые положения аминокислот, которые будут конкретно упомянуты здесь, и их нумерация в соответствии с некоторыми альтернативными системами нумерации (такими как Aho и IMGT);

- Фигура 2 показывает выравнивание SEQ ID NO: 1, 59 и 58;

- Фигура 3 показывает аминокислотные последовательности, указанные в настоящей заявке;

- Фигура 4 показывает выравнивание SEQ ID NO: 1, 8-41 и 58;

- Фигура 5 показывает выравнивание SEQ ID NO: 1, 31 и 36-41;

- Фигура 6 показывает два соответствующих графика точек данных, полученных в Примере 1, когда 96 образцов сыворотки (66 от здоровых людей и 30 от больных СКВ) были испытаны на связывание со следующими аминокислотными последовательностями: SEQ ID NO: 58 (с мутацией Q108L), Эталон A, Эталон A (L11V, V89L)-Ala, Эталон A (L11V, A74S, V89L)-Ala и Эталон A (L11V, S49A, V89L)-Ala. Каждая точка представляет уровень связывания для одного из 96 тестируемых образцов. Точки данных, показанные на правой панели и левой панели, одинаковы; на правой панели измеряют данные, определенные с каждым отдельным образцом для каждого из тестируемых соединений (например, SEQ ID NO: 58 (Q108L), Эталона A, Эталона A (L11V, V89L)-A, Эталона A (L11V, A74S , V89L) -A и Эталона A (L11V, S49A, V89L)-A), связаны с помощью линии (в результате наклон линии указывает на степень, в которой связывание уже существующих антител уменьшено при введении мутации по изобретению и С-концевого аланина);

- Фигура 7 представляет собой таблицу, в которой перечислены данные связывания (5 колонок, дающих нормализованные уровни связывания Пред.Ат (Отн.ед. на 125 секундах) и 4 колонки, дающих процент снижения связывания Пред.Ат по сравнению с Эталоном A из точек данных, представленных на Фигуре 6).

- Фигура 8 (A) Приводит Прогностические («P») и Экспериментальные («E») участки расщепления трипсином и химотрипсином на основе последовательности A016600015. (B) Анализ A016600015 на геле после SDS-PAGE, окрашенном кумасси. (C) Примерный результат анализа расщепления трипсином последовательности A016600015 с помощью ОФХ ЖХ-МС.

- Фигура 9 - схематическое изображение модели SHIME.

- Фигура 10 - конкурентный FACS анализ на клетках HEK293H-mTNF, обработанных Enbrel (EC30 = 0,02 нМ, панель A), и Enbrel (EC90 = 0,2 нМ, панель B). IRR000027 = нерелевантное нанотело.

- Фигура 11 демонстрирует результаты экспрессии A016600021, A016600039 и A016600040 на 12% NuPage Bis-Tris геле в не-восстанавливающих условиях, при нанесении 5 мкл образца. Дорожки были следующими: (1) A016600021; (2) A016600039; (3) A016600040; (4) нерелевантный препарат сравнения; (5) нерелевантный препарат сравнения; (6) белковый стандарт «Precision Plus» (BioRad); (7) Стандарт 0,5 мкг; (8) Стандарт 1,0 мкг; (9) Стандарт 2,5 мкг.

Примеры

Авторы настоящего изобретения поставили перед собой задачу оптимизировать аминокислотную последовательность («Оптимизация последовательности») агентов, связывающих TNF. В этом случае агенты, связывающие TNF, предназначены для перорального введения, поэтому агенты, связывающие TNF, предпочтительно должны быть устойчивы к действию протеаз. Кроме того, в процессе оптимизации последовательности также предполагается (1) гуманизировать агенты, связывающие TNF; (2) инактивировать потенциальные эпитопы предсуществующих антител; а также (3) инактивировать участки для посттрансляционных модификаций (PTM). В то же время эти характеристики должны быть приведены в соответствие с функциональными характеристиками агентов, связывающих TNF, то есть ингибированием TNF-α, которое предпочтительно должно быть примерно одинаковым или даже улучшенным.

Пример 1. Получение нанотела в Pichia pastoris и очистка с помощью связывания с белком A.

Клетки Pichia pastoris X33, содержащие конструкции анти-TNFα нанотела, выращивали (30°C, 250 об./мин) в 24-луночных планшетах (24 мл) в BGCM-цитратном буфере. Через два дня среду заменяли на буфер, содержащий метанол (BMCM-цитрат), чтобы вызвать экспрессию. Добавляли свежий метанол на регулярной основе, чтобы компенсировать потребление и испарение метанола, и среду собирали через два дня. Нанотела очищали путем захвата на колонке с белком A (Poros) или MEP Hypercel (Pall), с последующей элюцией в глициновом буфере, в соответствии с инструкциями производителя. Затем нанотела обессоливали в PBS с использованием 2 мл колонки Zebaspin (Pierce). Фракции концентрировали с использованием колонок VivaSpin (MWCO 5000, PES). Концентрации фракций нанотел измеряли с использованием Trinean Dropsense. Концентрация была основана на измерении ОП280 с нормализацией значений ОП340. Чистоту и целостность нанотел проверяли методом SDS-PAGE и МС с использованием системы ВЭЖХ с обращенной фазой, связанной с квадрупольным времяпролетным масс-спектрометром с электрораспылительной ионизацией (Q-TOF Ultimate (Waters).

Пример 2. Гуманизация

Белковые последовательности агентов, связывающих TNF, по настоящему изобретению были в конечном итоге получены от лам, и частично отличались от гомологичных антител, встречающихся в природе у людей. Поэтому эти агенты, связывающие TNF, потенциально являются иммуногенными при введении пациентам - людям.

Как правило, для целей гуманизации последовательности нанотел делают более гомологичными консенсусной последовательности зародышевой линии человека. За исключением остатков «Холлмарка» нанотел, специфические аминокислоты в каркасных областях, которые отличаются между консенсусной последовательностью нанотела и человеческой зародышевой линии, заменяют на человеческий аналог таким образом, что предпочтительно сохраняются неповрежденными структура, активность и стабильность белка.

В этом случае после выравнивания с базой данных V гена зародышевой линии человека, идентифицировали DP51 как имеющий самую высокую гомологию с SEQ ID NO:58. Все возможные перестановки были разработаны с учетом изменения исходной последовательности нанотела, более соответствующей консенсусной последовательности человеческой зародышевой линии DP51, сохраняя при этом предпочтительные характеристики других нанотел, или даже улучшая эти характеристики.

В итоге в SEQ ID NO: 58: 1E, 14P, 27F, 29F, 40A, 49S, 73N, 75K, 78L, 82aN, 83R и 108L были введены в общей сложности 12 аминокислотных остатков. Примечательно, что Q27F и S29F являются частью CDR1, но не влияют на связывание (см. SEQ ID NO: 1, данные не показаны).

Пример 3. Сниженное связывание предсуществующих антител

3.1. Экспериментальная часть

Образцы человека, используемые в Примере 3.2 ниже, были получены либо из коммерческих источников, либо от людей-добровольцев (после получения всех необходимых согласований и утверждений), и были использованы в соответствии с применимыми юридическими и нормативными требованиями (включая те, которые относятся к медицинской тайне и конфиденциальности пациента, но не ограничиваясь ими).

В Примере 3.2 ниже, если явно не указано иное, связывание предсуществующих антител, которые присутствуют в используемых образцах (то есть от здоровых добровольцев, пациентов с ревматоидным артритом (РА) и пациентов с СКВ), с тестируемыми нанотелами определяли с использованием ProteOn следующим образом:

Нанотела захватывали либо сывороточным альбумином, либо меткой FLAG3, с применением моноклонального антитела анти-FLAG M2.

В случае связывания предсуществующих антител с нанотелами, захвачеными на человеческом сывороточном альбумине (HSA), оценку проводили с использованием ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). PBS/Tween (забуференный фосфатом физиологический раствор, pH 7,4, 0,005% Tween20) использовали в качестве электродного буфера, и эксперименты проводили при 25°C. Лигандные полосы сенсорного чипа ProteOn GLC активировали с помощью EDC/NHS (скорость потока 30 мкл/мин), и HSA вводили в концентрации 10 мкг/мл в ацетатном буфере ProteOn, pH 4,5 (скорость потока 100 мкл/мин), чтобы обеспечить уровни иммобилизации приблизительно 3200 Отн.ед. После иммобилизации поверхности дезактивировали посредством этаноламин-HCl (скорость потока 30 мкл/мин). Нанотела вводили в течение 2 минут при 45 мкл/мин над поверхностью HSA, для обеспечения уровня захвата нанотел примерно 200 Отн.ед. Образцы, содержащие предсуществующие антитела, центрифугировали в течение 2 минут при 14 000 об./мин, и надосадочную жидкость разбавляли 1:10 в PBS-Tween20 (0,005%) перед введением в течение 2 минут со скоростью 45 мкл/мин с последующей стадией диссоциации 400 секунд. После каждого цикла (т.е. перед новой стадией захвата нанотел и стадии введения образца крови) поверхности HSA регенерировали с помощью 2-минутной инъекции HCl (100 мМ) при 45 мкл/мин. Обработку сенсограмм и анализ данных проводили с программным обеспечением ProteOn Manager 3.1.0 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Сенсограммы, показывающие связывание предсуществующих антител, были получены после двойного сравнения с эталоном путем вычитания (1) диссоциации нанотела-HSA и (2) неспецифического связывания с дорожкой эталонного лиганда. Уровни связывания предсуществующих антител определяли путем установки отчетных точек на 125 секунд (через 5 секунд после окончания ассоциации). Процентное уменьшение связывания предсуществующих антител рассчитывали относительно уровней связывания на 125 секундах для эталонного нанотела.

В случае связывания предсуществующих антител с FLAG-мечеными нанотелами, захваченными на моноклональном анти-FLAG M2 (Sigma), проводили оценку с использованием ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). PBS/Tween (забуференный фосфатом физиологический раствор, pH 7,4, 0,005% Tween 20) использовали в качестве электродного буфера, и эксперименты проводили при 25°C. Лигандные полосы ProteOn GLC Sensor Chip активировали с помощью EDC/NHS (скорость потока 30 мкл/мин), вводили мАт против FLAG M2 с концентрацией 10 мкг/мл в ацетатном буфере ProteOn, pH 4,5 (скорость потока 100 мкл/мин) для обеспечения уровня иммобилизации приблизительно 4000 отн.ед. После иммобилизации поверхности дезактивировали этаноламином-HCl (скорость потока 30 мкл/мин). Нанотела вводили в течение 2 минут со скоростью 45 мкл/мин над поверхностью анти-FLAG M2, для обеспечения уровня захвата нанотел приблизительно 100 отн.ед. Чтобы уменьшить неспецифическое связывание образцов крови с поверхностью анти-FLAG M2, в образцы крови добавляли 100 нМ 3xFLAG-пептида (Sigma). Образцы, содержащие предсуществующие антитела, центрифугировали в течение 2 минут при 14000 об/мин, и надосадочную жидкость разбавляли 1:10 в PBS-Tween20 (0,005%) перед введением в течение 2 минут со скоростью 45 мкл/мин с последующей стадией диссоциации в течение 600 секунд. После каждого цикла (т.е. перед новой стадией захвата нанотел и стадией введения образца крови) поверхности анти-FLAG M2 регенерировали посредством 10-секундного введения глицина, pH 1,5 (10 мМ) при 150 мкл/мин. Обработку сенсограмм и анализ данных осуществляли с помощью ProteOn Manager 3.1.0 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Сенсограммы, показывающие связывание предсуществующих антител, были получены после двойного сравнения с эталоном путем вычитания (1) диссоциации нанотела-анти- FLAG M2 и (2) неспецифического связывания с дорожкой эталонного лиганда. Уровни связывания предсуществующих антител определяли путем установки отчетных точек на 125 секунд (через 5 секунд после окончания ассоциации). Процентное уменьшение связывания предсуществующих антител рассчитывали относительно уровней связывания на 125 секундах для эталонного нанотела.

3.2. Введение мутаций по изобретению в Эталон А (SEQ ID NO: 1) приводит к снижению связывания предсуществующих антител.

Использовали следующие аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 58 (с мутацией Q108L), Эталон A, Эталон A (L11V, V89L) -Ala, Эталон A (L11V, A74S, V89L) -Ala и Эталон A (L11V, S49A , V89L) -Ala, все с N-концевой меткой HIS6-FLAG3 (SEQ ID NO: 42). Эти нанотела были протестированы на предмет связывания с предсуществующими антителами, которые присутствуют в образцах сыворотки от 96 здоровых людей-добровольцев. Соединения были захвачены с использованием маркера FLAG, и связывание измеряли с использованием ProteOn в соответствии с протоколом, данным в преамбуле к этой экспериментальной части.

Результаты показаны на Фигуре 6. На Фигуре 7 приведены результаты для каждого из образцов, которые формируют одну из точек данных на Фигуре 6.

Можно видеть, что для большинства из 96 испытываемых образцов введение мутаций в соответствии с изобретением приводит к уменьшению связывания предсуществующих антител, причем степень уменьшения, как правило, зависит от уровня, до которого предсуществующие антитела в каждом образце были способны связываться с Эталоном А.

Пример 4. Анализ химической стабильности

Химическую стабильность различных гуманизированных и/или оптимизированных нанотел оценивали с помощью анализов ускоренного окисления и температурного стресса.

Было получено новое эталонное соединение, то есть A016600015 (SEQ ID NO: 61). Это новое эталонное соединение больше соответствует предполагаемым клиническим кандидатам, и, таким образом, позволяет лучше оценить влияние мутаций. A016600015 идентично Эталону A (SEQ ID NO: 1), за исключением С-концевого аланина и аспартата в аминокислотном остатке 1. С-концевой аланин вводили с учетом уменьшения предсуществующих антител, согласно WO 2012/175741 (см. Пример 3). N-концевой глутамат был заменен аспартатом на аминокислотном остатке 1 после оценки образования пироглутамата. Активность нового эталона A016600015 была практически идентична Эталону A (данные не показаны). Это новое соединение A016600015 далее используется на всех примерах в качестве эталонного соединения, если не указано иное.

Исходя из результатов Примера 3, анти-PEA-мутации L11V и V89L были введены (среди прочего), по сравнению с новым эталонным соединением A016600015, в результате чего получали A016600018 (SEQ ID NO: 37) и A016600019 (SEQ ID NO: 38). Последовательности показаны на Фигуре 3.

4.1. Стабильность при ускоренном окислении

Образцы нанотел эталонного соединения A016600015 (1 мг/мл) подвергали в течение четырех часов при комнатной температуре и в темноте воздействию 10 мМ H₂O₂ в PBS, параллельно с контрольными образцами без H₂O₂, с последующей заменой буфера PBS с использованием обессоливающих центрифужных колонок Zeba (0,5 мл) (Thermo Scientific). Затем подвергнутые стрессу и контрольные образцы анализировали с помощью обращенно-фазовой хроматографии на аппарате серии 1200 или 1290 (Agilent Technologies) на колонке Zorbax 300SB-C3 (Agilent Technologies) при 70°C. Окисление нанотел количественно определяли путем анализа % площади предшествующих пиков, возникающих в результате окислительного стресса, по сравнению с основным белковым пиком.

Не наблюдалось никаких изменений в образцах, подвергнутых окислительному стрессу, из эталонного соединения A016600015 (данные не показаны).

4.2. Стабильность при температурном стрессе

Образцы нанотел (1-2 мг/мл) хранили в PBS в течение четырех недель при -20°C (отрицательный контроль), 25 и 40°C. После этого периода инкубации нанотела расщепляли трипсином или LysC. Затем пептиды подвергнутых стрессу и контрольных образцов анализировали с помощью обращенно-фазовой хроматографии на аппарате серии 1290 (Agilent Technologies) на колонке Acquity UPLC BEH300-C18 (Agilent Technologies) при 60°C. Колонка соединена с масс-спектрометром Q-TOF (6530 Accurate Mass Q-TOF (Agilent)). Интеграция пептидной карты UV 214 нм или EIC хроматограмм (экстрагированных ионных хроматограмм) позволяет обеспечить надежную количественную оценку данной модификации.

Только при 40°С наблюдалась некоторая изомеризация и пироглутаматные варианты. Примечательно, что аминокислотный остаток 54D, который находится в CDR2, подвергающемся воздействию внешней среды и потенциально поддающемся изомеризации, практически не подвергался изомеризации. Изомеризация аминокислотного остатка 1 была незначительной, если нанотела поддерживали при температуре 25°C или ниже в течение продолжительных периодов времени.

4.3. Температуры плавления при анализе теплового сдвига (АТС)

Температура плавления нанотела является мерой его биофизической стабильности.

Температуры плавления различных нанотел оценивали методом теплового сдвига (АТС), по существу, согласно Ericsson et al. 2006 (Anals of Biochemistry, 357: 289-298). Вкратце, 5 мкл очищенных одновалентных нанотел (800 мкг/мл) инкубировали с 5 мкл флуоресцентного зонда Sypro Orange (Invitrogen, S6551) (конечная концентрация 10 ×) в 10 мкл буфера (100 мМ фосфата, 100 мМ бората, 100 мМ цитрата, 115 мМ NaCl, забуференного при разном рН от 3,5 до 9). Образцы нагревали в аппарате LightCycler 480II (Roche) от 37 до 99°C со скоростью 4,4°C/с, после чего их охлаждали до 37°C со скоростью 0,03°C/с. При развертывании, вызванном нагреванием, обнажаются гидрофобные части белков, с которыми связывается Sypro Orange, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции (Возб./Исп. = 465/580 нм). Точка перегиба первой производной кривой интенсивности флуоресценции служит мерой температуры плавления (Tп).

Эталонное соединение A016600015 (SEQ ID NO: 61) сравнивали с A016600018 (SEQ ID NO:37) и A016600019 (SEQ ID NO:38). В отличие от A016600015, как A016600018, так и A016600019 содержат анти-PEA мутации L11V и V89L, в соответствии с Примером 3.

Результаты показаны в Таблице 4.3.

Таблица 4.3

NB ID	Анти-PEA	Количество (мкг)	Tп (°C), pH 7
A016600015	-	87	59
A016600018	L11V V89L	38	59
A016600019	L11V V89L	16	56

Как видно из Таблицы 4.3, анти-PEA мутации, по-видимому, либо не влияют на Tп (A016600018), либо отрицательно влияют на Tп (A016600019). Примечательно, что разница между A016600018 («00018») и A016600019 («00019») составляет 78L и 78V, соответственно. В целом, было показано, что любые эффекты этой разницы в аминокислотном остатке 78 были незначительными, по сравнению с введением анти-PEA мутаций (см. также ниже).

При изготовлении также было замечено, что экспрессия этих вариантов, содержащих анти-PEA мутации, является субоптимальной. Это далее количественно определяли с использованием способа из Примера 1.

Результаты показаны в Таблице 4.3.

Действительно, количество, извлекаемое из обоих вариантов, содержащих анти-PEA мутации, было примерно в 2 раза ниже (A016600018) или даже в 4 раза ниже (A016600019), чем у эталонного нанотела. Это стало полной неожиданностью для изобретателей, поскольку ранее введение этих анти-PEA мутаций L11V и V89L не приводило к столь серьезному снижению способности к извлечению антител, что определяли для любого другого клона.

4.4. Устойчивость к протеазам

Предполагается, что TNF-ингибиторы могут в конечном итоге вводиться перорально. Однако желудок и кишечник представляют собой естественную враждебную среду, поскольку они предназначены для ферментативного разрушения и поглощения частично твердых продуктов. В общем, протеолиз белкового субстрата может произойти только в том случае, если 8-10 аминокислотных остатков внутри полипептидной цепи могут связываться и адаптироваться к специфической стереохимии активного участка протеазы (Fontana et al., 2004 Acta Biochim Pol, 51, 299-321). Следовательно, восприимчивость к ферментативному расщеплению во многом зависит от физических свойств субстрата.

Чтобы идентифицировать потенциальные участки деградации протеазами и разработать более стабильные варианты, авторы настоящего изобретения решили идентифицировать участки расщепления трипсином и химотрипсином в соответствии со стандартными методами.

Прогнозируемые участки действия протеаз («P») SEQ ID NO: 58 и новое эталонное соединение A016600015 («00015») изображены как («X») на Фигуре 8A как для трипсина, так и для химотрипсина.

Из этого рисунка уже можно сделать вывод, что:

- CDR3 содержит 9 потенциальных участков расщепления протеазой.

- гуманизирующая мутация Q75K (VH3-DP51) вводит потенциальный участок расщепления трипсином.

- гуманизирующая мутация K73N (VH3-DP51) устраняет потенциальный участок расщепления трипсином.

- анти-PEA мутации L11V и V89L были нейтральными в этом отношении, т. е. эти мутации не ввели или не устранили потенциальные участки расщепления протеазой, что и ожидалось.

Чтобы оценить предсказанные участки расщепления протеазами в условиях, близких к in vivo, нанотела расщепляли трипсином и химотрипсином. В частности, анти-TNFα нанотела инкубировали в 10% растворах трипсина или α-химотрипсина. Два мкг нанотела подвергали расщеплению трипсином в течение 2 ч, 4 ч и в течение ночи при 37°С, или расщеплению химотрипсином в течение 2 ч, 4 ч или в течение ночи при 25°С. Протеолитическую реакцию останавливали добавлением ТФУК (до итоговой концентрации 0,1%). Реакционные смеси анализировали с помощью обращенно-фазовой жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии или разделяли на геле в SDS-PAGE и окрашивали кумасси синим. Используя ImageQuant (GE), рассчитывали количество интактного материала и нормализовали на 0 часов качестве контрольной точки времени.

Примерный результат расщепления трипсином на окрашенном кумасси геле от SDS-PAGE представлен на Фигуре 8В. Примерный результат анализа расщепления трипсином с помощью обращенно-фазовой ЖХ-МС представлен на Фигуре 8C. Экспериментально («Е») подтвержденные участки расщепления изображены на Фигуре 8А как трипсиновые («Е») и химотрипсиновые («Е»).

Из Фигуры 8А видно, что количество реальных участков расщепления уменьшается. Тем не менее, остаются различные участки, выявляемые трипсином и химотрипсином.

Для оптимизации устойчивости к трипсину было выбрано 5 положений для разработки одного оптимизированного варианта: R38, K64, S94, P95 и R96, с получением варианта A016600013; SEQ ID NO: 65.

Однако мутация этих сайтов приводила к снижению уровней экспрессии и внутриклеточного накопления варианта (A016600013; SEQ ID NO: 65). Фактически, когда аминокислотный остаток 38 мутировал к первоначальному виду, что улучшало экспрессию, полученный вариант (A016600014; SEQ ID NO: 66) полностью противоречил ожиданиям большей чувствительности к протеазам, чем контрольное соединение A016600015 (данные не показаны). Следовательно, было решено не подвергать мутациям эти положения в контрольном соединении и исследуемых нанотелах, то есть A016600018 и A016600019.

Краткое изложение результатов показано в таблице 4.4.

Таблица 4.4			Содержание интактного антитела (%) после инкубации (часы) с протеазами
			Трипсин	Химотрипсин
Нанотело	L11	V89	0 ч	2 ч	4 ч	Ночь	0 ч	2 ч	4 ч	Ночь
A016600015	.	.	100	95	99	79	100	16	18	15
A016600019	V	L	100	83	91	78	100	27	39	31
A016600018	V	L	100	89	85	63	100	38	31	14

Пример 5. Стабильность в кишечных соках при исследовании на модели SHIME

Чтобы исследовать устойчивость анти-ФНО-α нанотел в человеческом ЖКТ, нанотела инкубировали в 5 различных жидкостях, полученных из SHIME (симулятор кишечной микробиологической экосистемы человека), представляющих желудочно-кишечный тракт человека (ЖКТ). Модель SHIME представляет собой научно обоснованную динамическую модель полного желудочно-кишечного тракта, которая используется для изучения физико-химических, ферментативных и микробных параметров в желудочно-кишечном тракте в контролируемой среде in vitro.

Модель SHIME состоит из пяти реакторов, которые последовательно моделируют желудок (кислые условия и расщепление пепсином), тонкую кишку (пищеварительные процессы) и 3 области толстой кишки, то есть восходящую («А»), поперечную («Т») и нисходящую ободочную кишку («D») (микробные процессы). Тщательный контроль параметров окружающей среды в этих реакторах обеспечил комплексные и стабильные микробные сообщества, которые очень похожи по структуре и функции на микробное сообщество в разных областях человеческой толстой кишки (см. Фигуру 9). Все жидкости ЖКТ были предоставлены ProDigest (Technologiepark 4, 9052 Звейнарде, Бельгия). Анти-TNF нанотела были испытаны в течение максимального периода 39 часов в жидкостях ЖКТ. После инкубации в жидкостях ЖКТ стабильность нанотел определяли с помощью тестирования функциональности в конкурентном ELISA. Нанотела тестировали при фиксированной концентрации 100 мкг/мл при 37°C в 5 различных жидкостях ЖКТ на модели SHIME. В разных временных точках брали образцы, и хранили их при -20°С с добавлением или без добавления ингибиторов протеаз, в соответствии с графиком в Таблице 5.1. Образцы переносили на покрытые ELISA пластины, и впоследствии тестировали в ELISA. Вкратце, A016600015 наносили с концентрацией 1 мкг/мл в PBS. После блокировки добавляли фиксированную концентрацию 0,3 нМ биотинилированного чTNFα вместе с серией титрования вариантов в различных жидкостях ЖКТ. Выявление проводили с экстравидином - пероксидазой хрена

Таблица 5.1. Календарь инкубации.

Жидкость	Моменты времени
ТК натощак	0, 1, 2, 4, 6, 8 ч*
ТК после приема пищи	0, 1, 2, 4, 6, 8 ч*
Кишка A	0, 1, 2, 4, 8, 15, 20, 24 ч
Кишка T	0, 1, 2, 4, 8, 15, 20, 24, 39 ч
Кишка D	0, 1, 2, 4, 8, 15, 20, 24, 32 ч
PBS	0, 1, 2, 4, 6, 8, 15, 20, 24, 32 ч

*после инкубации с добавлением 1 мг/мл пефаблока и 1 мкМ пепстатина (ингибиторов протеаз).

Примерные результаты в кишке «Т» приведены в Таблице 5.2.

Таблица 5.2

		0 ч	1 ч	2 ч	4 ч	8 ч	15 ч	20 ч	24 ч	39 ч
00015	IC50	7,3E-10	5,0E-10	6,4E-10	6,2E-10	9,7E-10	1,3E-09	1,9E-09	2,8E-09	2,0E-08
	Отно-шение	1,00	0,69	0,88	0,85	1,34	1,72	2,56	3,88	27,41
%	100%	145%	113%	117%	75%	58%	39%	26%	4%
	IC50	5,7E-10	5,5E-10	6,9E-10	1,2E-09	2,8E-09	9,5E-09	3,2E-08	4,2E-08	6,2E-07
00018	Отно-шение	1,00	0,97	1,22	2,19	4,96	16,68	55,58	73,79	1097,18
	%	100%	103%	82%	46%	20%	6%	2%	1%	0%
	IC50	5,0E-10	4,7E-10	4,5E-10	9,1E-10	7,2E-10	1,7E-09	3,0E-09	5,2E-09	4,1E-08
00019	Отно-шение	1,00	0,93	0,89	1,81	1,43	3,36	6,02	10,32	82,22
	%	100%	108%	112%	55%	70%	30%	17%	10%	1%

На основании результатов с жидкостями, полученными из различных отделов SHIME, оценка стабильности позволяет ранжировать нанотела, представляя стабильность во всех отделах ЖКТ: 00015> 00019> 00018.

В совокупности устранение участков расщепления протеазами, по-видимому, не оказывает положительного влияния, например, на стабильность и чувствительность к протеазам для этого семейства нанотел. Введение анти-PEA мутаций L11V и V89L в A16600015, по-видимому, отрицательно сказывается на стабильности этого конкретного нанотела.

Пример 6. Стабилизированные варианты

Поскольку удаление участков расщепления протеазами не приводило к ожидаемым результатам, изобретатели далее разработали сложные варианты анти-TNF-α, которые по своей природе были бы более стабильными, но в которых гуманизирующие и анти-PEA мутации предпочтительно не нарушались. Для этого потребовался нетрадиционный подход с учетом различных аминокислотных остатков, демонстрирующих взаимоисключающие характеристики, такие как гуманизация против устойчивости к протеазам против аффинности.

6.1. Внутренняя цистеиновая связь и устранение участка расщепления химотрипсином CDR3.

Хотя Y100d находится в CDR3 и потенциально влияет на связывающие свойства, тем не менее, было решено построить вариант, в котором аминокислотный остаток Y100d, который является участком расщепления химотрипсином, был удален с помощью замены Y100dL (A016600046 100dL; SEQ ID NO: 62). Вариант A016600045 (SEQ ID NO: 69) был разработан для оценки влияния тирозина на положение 100d CDR3.

Кроме того, авторы изобретения предположили, что могут быть сконструированы варианты, которые по своей сути были бы стабильными, с помощью введения внутридоменной дисульфидной связи (см. Wozniak-Knopp et al., 2012 PLoS One. 2012; 7 (1): e30083). Это потребовало бы введения двух цистеиновых остатков, которые затем должны были образовывать цистин. После разрешения белковой структуры нанотела и его взаимодействия с мишенью TNF-α с помощью исследований кристаллизации (данные не показаны), авторы изобретения решили осуществить мутацию аминокислот S49C и I69C мутаций для введения внутридоменной дисульфидной связи, хотя аминокислотный остаток S49 расположен рядом с CDR2, и был введен с целью гуманизации (соответствующей зародышевой линии DP51 человека, см. Пример 2). Новый вариант, содержащий S49C, I69C и Y100dL, обозначен как A016600052 (SEQ ID NO: 63).

Чтобы полноценно оценить влияние положения аминокислоты 49, этот аминокислотный остаток заменяли аланином. Примечательно, что эта мутация в положении 49 соответствовала бы (хоть и отличалась) человеческой зародышевой линии IgHV3-IgHJ. Все новые варианты A016600046 (SEQ ID NO: 62), A016600016 (SEQ ID NO: 36), A016600020 (SEQ ID NO: 39) и A016600021 (SEQ ID NO: 40) содержат A49.

Кроме того, в варианте A016600020 (SEQ ID NO: 39) положения D60A, E61D и P62S оценивали с учетом физической стабильности. Аминокислотные остатки A60, D61 и S62 расположены рядом с экспериментально подтвержденным участком расщепления химотрипсином Y58 и внутри CDR2 в соответствии с Kabat, что подразумевает высокий риск возможной потери.

Далее, участок расщепления протеазами был случайно введен гуманизирующей мутацией Q75K. Не углубляясь в какую-либо теориею, авторы изобретения предположили, что изменение расположенного рядом аминокислотного остатка A74S потенциально повлияет как на гуманизацию, так и на чувствительность к протеазам, но только до определенной степени, то есть надеялись, что и гуманизация, и чувствительность к протеазам уменьшились в приемлемой степени. Варианты, включающие S74, представляют собой A016600016 («00016»), A016600020 («00020»), A016600021 («00021»), A016600046 («00046») и A016600052 («00052») (SEQ ID NO 36, 39, 40, 62 и 63 соответственно). Сравнительным вариантом был A016600038 («00038», SEQ ID NO: 64), который идентичен A016600021 (SEQ ID NO: 40), но с 74S вместо 74A.

Полученные последовательности показаны на Фигуре 3.

6.2. Характеристики стабилизированных вариантов

Затем эти варианты оценивали по различным характеристикам, по существу, как указано в Примерах 3 и 4.

В первом случае продукцию вариантов 00016, 00020 и 00021 определяли в P.pastoris в соответствии с Примером 1.

Краткое изложение полученных результатов приведено в Таблице 6.2A.

Таблица 6.2А

Нанотело	L11	S49	D60	E61	P62	A74	L78	V89	Количество (мкг)	Tп при pH 7 (°C)	Стабильность в жидкости ЖКТ (по возрастанию)
A016600021	V	A	.	.	.	S	V	L	332	65	1
A016600016	V	A	.	.	.	S	.	L	499	65	2
A016600020	V	A	A	D	S	S	V	L	374	75	3

Из этих результатов видно, что эти мутации привели к увеличению продукции более чем в 4-5 раз, по сравнению с получением эталонного соединения, которое было получено в количестве 87 мкг (см. Пример 4.3) или даже более чем в 20-30 раз, по сравнению с тесно связанными вариантами 00018 и 00019.

Затем термическую стабильность этих вариантов определяли в соответствии с Примером 4.3. Краткое изложение полученных результатов также представлено в Таблице 6.2A.

Не только продукция резко возросла, но и тепловая стабильность неожиданно увеличилась с 5-16°C, по сравнению с эталонным соединением, и даже до 16-19°C, по сравнению с более близкими вариантами 00018 и 00019.

Неожиданно, аминокислотный остаток A49 устранял влияние анти-PEA аминокислотных остатков V11 и L89 на продукцию и стабильность.

Различные варианты из Примера 6.1 оценивали вместе в жидкостях ЖКТ, полученных на модели SHIME в соответствии с Примером 5.

Краткое описание полученной активности в конце инкубационного периода в различных условиях A016600021, A016600038, A016600046 и A016600052 приведено в Таблице 6.2B. Инкубация в PBS подтвердила присущую стабильность нанотел (данные не показаны).

Таблица 6.2B	C/C0 против времени, в часах
БК кишка A	БК кишка D	БК кишка T	ТК натощак *	ТК после приема пищи*	ЯК2 кишка A	ЯК2 кишка D	ЯК2 кишка T
A016600021	66	58	76	65	31	86	57	71
A016600038	48	41	47	60	33	77	50	59
A016600046	47	29	62	52	24	92	59	>100
A016600052	41	49	40	ND	ND	64	43	55
A016600039	38	26	39	23	20	78	20	55
A016600040	38	40	19	67	24	91	83	63
A016600045	85	>100	49	60	26	68	41	>100

*при патологии; ND - не определяли; БК - болезнь Крона; ЯК - язвенный колит.

Варианты A016600046 Y100dL (SEQ ID NO: 62), в которых удаляли участок расщепления протеазами, и вариант A016600052 (SEQ ID NO: 63), который дополнительно стабилизировали с помощью внутридоменной цистеиновой связи, не обеспечивали никаких улучшений в этом отношении. Примечательно, что показатель IC50 вариантов 00046 и 00052 увеличился в 2-5 раз по сравнению с 00021 (1,13 нМ и 3,56 нМ, соответственно, по сравнению с 0,67 нМ) из-за мутации в CDR3.

Результаты SHIME существенно подтвердили и расширили результаты продукции и Tп. Кроме того, модель SHIME показала, что вариант 00021 (SEQ ID NO: 40) является существенно более стабильным, чем вариант A016600040 («00040», SEQ ID NO: 67) и вариант 00038 (SEQ ID NO: 64), что является показателем положительного вклада серина в положении 74.

Примечательно, что вариант A016600039 (SEQ ID NO: 68), который идентичен варианту 00040 (SEQ ID NO: 67), но с A74S, показал, что S74 был значительно менее стабильным, чем A74, на модели SHIME.

Основываясь на всех результатах, включая результаты с жидкостями, полученными из различных отделов SHIME, общая оценка стабильности позволяет ранжировать нанотела, представляя стабильность во всех отделениях ЖКТ: 00021> 00016> 00020> 00040> 00015> 00019> 00018.

Следовательно, анти-PEA мутации L11V и V89L в A16600015, по-видимому, оказывают отрицательное влияние на стабильность этого конкретного нанотела, которая может быть уменьшена посредством 49A, но не 49C-69C. Более того, в нанотелах, включающих мутации против PEA, L11V и V89L, аминокислотный остаток 74S был благоприятен для стабильности на модели SHIME.

6.3. A016600021 имеет благоприятные характеристики (по сравнению с A016600039 и A016600040)

Считается, что для перорального введения в дополнение к стабилизации может потребоваться более высокая доза. Чтобы иметь приемлемые затраты, кандидат предпочтительно получают в больших количествах, очищают без значительных потерь и готовят с высокой концентрацией. Следовательно, авторы изобретения провели эксперименты для проверки этих параметров.

Во-первых, авторы изобретения решили сравнить уровни экспрессии A016600039 и A016600040 с A016600021.

Как можно видеть на Фигуре 11А, экспрессия A016600039 (SEQ ID NO: 68) была значительно ниже, чем уровни экспрессии A01660021 (SEQ ID NO: 40) и A016600040 (SEQ ID NO: 67). Эти данные также количественно проанализированы с помощью AKTAmicro, результаты которого приведены в Таблице 6.3.

Таблица 6.3

Клон	Выход Aktaµ (г/л бесклеточной среды)
A016600021	6,3
A016600039	0,49
A016600040	2,3

Что касается технологичности A016600021 по сравнению с A016600040, обе были испытаны на максимальную растворимость во время концентрирования ферментационного бульона. Максимальная растворимость в очищенном ферментационном бульоне составляет всего 30 г/л для A016600040 (против 75 г/л для A016600021). Кроме того, значительные потери были обнаружены при дальнейшей очистке A016600040.

Следовательно, в дополнение к стабильности, A016600021 также имеет неожиданно благоприятные характеристики продукции и очистки, по сравнению с A016600039 и A016600040.

Исходя из выгодных характеристик стабильности, экспрессии и очистки, авторы изобретения сосредоточились на A016600021, для которого была определена растворимость. К полной неожиданности для авторов изобретения, A016600021 обладал растворимостью до беспрецедентного количества 200 мг/мл в H₂O.

Пример 7. Стабилизированные варианты превосходят контрольные показатели

Варианты A016600021 (SEQ ID NO: 40), A016600038 (SEQ ID NO: 64) и A016600045 (SEQ ID NO: 69) оценивали на связывание с человеческим мембраносвязанным TNF (мTNF), в конкурентном анализе с Enbrel (Etanercept), анти-TNF терапевтическим агентом на основе TNF-R2. Для этого клеточную линию, стабильно экспрессирующую нерасщепляемую форму человеческого TNF, получали путем трансфекции клеток HEK293H эукариотическим экспрессионным вектором, кодирующим вариант TNF R77T/S78T человека (называемый HEK293H-мTNF), как описано ранее (Harashima et al., 2001 J. Immunol 166: 130-136). После отбора путем совместной экспрессии гена устойчивости к пуромицину, сортировку отдельных экспрессирующих мTNF клеток проводили через FACS (BD FACS Aria) при окрашивании клеток с помощью Remicade (Инфликсимаба) и вторичных козьих F(ab')₂ антител против IgG человека, мышиных антител, меченных ФЭ. Конститутивную экспрессию мембраносвязанного TNF в избранных индивидуальных клонах подтверждали проточной цитометрией (BD FACS Array).

В первом случае оценивали связывание Enbrel с мTNF в этих клетках. Для этого 5,10⁵ клеток одного клона HEK293H-мTNF высевали в 96-луночные планшеты с круглым дном, и непосредственно инкубировали с разной концентрацией Enbrel, разбавленного в FACS-буфере (PBS с добавлением 10% ЭТС и 0,05% азида натрия) в течение 90 минут при 4°С. Клетки промывали FACS-буфером и окрашивали вторичным козьим F(ab')₂ антителом против человеческого IgG, мышиным антителом, меченым ФЭ, в течение 30 минут при 4°C. После промывки и инкубации клеток в буфере FACS в присутствии красителя для нежизнеспособных клеток TO-PRO-3 Йодида, связывание Enbrel с мTNF в жизнеспособных HEK293H-мTNF клетках измеряли путем считывания на BD FACS Array. Из полученной дозозависимой кривой значения EC30 и EC90 для Enbrel для связывания с мTNF были определены, соответственно, как 0,02 нм и 0,2 нМ. Обе концентрации были впоследствии применены в конкурентном анализе с нанотелами, нацеленными на TNF.

Для оценки связывания mTNF A016600021, A016600038 и A016600045 был проведен эксперимент по конкуренции с Enbrel при фиксированных концентрациях EC30 и EC90. Активность анти-TNF нанотел сравнивали с контрольным соединением Cimzia (цертолизумаб пегол). Кроме того, в качестве отрицательного контроля было включено нерелевантное нанотело (IRR00027). В этом анализе применяли идентичные условия, описанные выше для связывания Enbrel, за исключением первой стадии инкубации, которая в этом эксперименте включала совместную обработку клеток с фиксированной концентрацией Enbrel (EC30 или EC90) в комбинации с различными концентрациями анти-TNF нанотел или Cimzia от 300 нм до 12,5 пМ. Показания на матрице BD FACS определяли связывание Enbrel на клетках HEK293H-mTNF, которое было явно снижено при совместной обработке с увеличением концентрации нанотел, а также с Cimzia, что указывало на конкуренцию анти-TNF агентов с Enbrel при связывании с мTNF. Значения IC50 анти-TNF агентов определяли, как указано в Таблице 7.

Таблица 7	Enbrel (EC30: 0,02 нM)	Enbrel (EC90: 0,2 нM)
A016600021	0,43 нМ	0,65 нМ
A016600038	0,43 нМ	0,70 нМ
A016600045	0,54 нМ	0,76 нМ
Cimzia	7,9 нМ	4,8 нМ

Полученные результаты показывают, что A016600021, A016600038 и A016600045 имеют эффективность в 6-7 раз выше, чем Cimzia на EC90, и удивительную в 15-18 раз лучшую эффективность, чем Cimzia на EC30. Стабилизированные варианты имеют сопоставимую эффективность, чтобы конкурировать с Enbrel за связывание мTNF.

В конкурентном FACS было продемонстрировано, что нанотела также могут полностью ингибировать связывание Enbrel с мTNF. Это может быть показателем превосходной пригодности в качестве лекарственного средства для перорального применения. Напротив, высокие концентрации Cimzia приводили лишь к частичной блокировке связывания Enbrel (Фигура 10).

Полное содержание всех ссылок (включая ссылки на литературу, изданные патенты, опубликованные патентные заявки и одновременно ожидающие решения патентные заявки), приведенные во всей настоящей заявке, явно включены в качестве ссылки, в частности для учения, которое упоминается выше.

Таблица А: Эталон А и его CDR и PMP6C11

SEQ ID №	Описание	Последовательность
58	NC55TNF-NC7 (PMP6C11). WO06/122786: SEQ ID NO: 125	QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGQTSSTADMGWFRQPPGKGREFVARISGIDGTTYYDEPVKGRFTISRDKAQNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCRSPRYADQWSAYDYWGQGTQVTVSS
59	WO2015/173325 SEQ ID NO: 345	EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCTASGFTFSTADMGWFRQAPGKGREFVSRISGIDGTTYYDEPVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCRSPRYADQWSAYDYWGQGTLVTVSS
1	Эталон A:	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSTADMGWFRQAPGKGREFVSRISGIDGTTYYDEPVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCRSPRYADQWSAYDYWGQGTLVTVSS
2	CDR1 (Kabat)	TADMG
3	CDR2 (Kabat)	RISGIDGTTYYDEPVKG
4	CDR3 (Kabat/Abm)	PRYADQWSAYDY
5	CDR1 (Abm)	GFTFSTADMG
6	CDR2 (Abm)	RISGIDGTTY
7	CDR3 (Kabat/Abm)	PRYADQWSAYDY
Замечание: SEQ ID NO: 4 идентична SEQ ID NO: 7

Таблица В. Возможные комбинации аминокислот в положениях 11, 89, 110 и 112.

Таблица B-1: Возможные комбинации аминокислот в положениях 11, 89, 110, 112, 49 и 74.

Таблица B-2: Возможные комбинации аминокислот в положениях 11, 89, 110, 112, 49 и 74.

Таблица C-1: Схематическая презентация некоторых соединений по изобретению без ISVD, увеличивающего период полужизни.

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-X(n)

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-X(n)

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[TNF2]

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[TNF2]-X(n)

[TNF2]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]

[TNF2]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-X(n)

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[Единица для нацеливания]

[Единица для нацеливания]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[Единица для нацеливания]-X(n)

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[Единица для нацеливания]-X(n)

Обозначения: - «[Агент, связывающий TNF, по изобретению]» представляет агент, связывающий TNF, по изобретению. - «-» представляет либо прямую ковалентную связь, либо подходящий линкер, такой как 9GS, 15GS или 35GS линкер. - «X(n)» представляет С-концевое удлинение, как определено в настоящей заявке, такое как единственный аланиновый остаток. - «[TNF2]» представляет связывающий домен или связывающую единицу (и в частности, ISVD) против TNF, отличающуюся от агента, связывающего TNF, по изобретению. - «[Единица для нацеливания]» представляет связывающий домен или связывающую единицу (и в частности, ISVD), нацеливающую соединение по изобретению на специфическую клетку, ткань или орган.

Таблица С-2. Схематическая презентация некоторых соединений по изобретению с ISVD, увеличивающим период полужизни.

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[HLE]

[HLE]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[HLE]-X(n)

[HLE]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-X(n)

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[HLE]

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[HLE]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]

[HLE]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[HLE]-X(n)

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[HLE]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-X(n)

[HLE]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-X(n)

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[TNF2]-[HLE]

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[HLE]-[TNF2]

[HLE]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[TNF2]

[HLE] -[TNF2]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]

[TNF2]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[HLE]

[TNF2 -[HLE] -[Агент, связывающий TNF, по изобретению]

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[TNF2]-[HLE]-X(n)

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[HLE]-[TNF2]-X(n)

[HLE]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[TNF2]-X(n)

[HLE] -[TNF2]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-X(n)

[TNF2]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[HLE]-X(n)

[TNF2 -[HLE] -[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-X(n)

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[Единица для нацеливания]-[HLE]

[Единица для нацеливания]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[HLE]

[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[Единица для нацеливания]-[HLE]-X(n)

[HLE]-[Единица для нацеливания]-[Агент, связывающий TNF, по изобретению]-[HLE]-X(n)

Обозначения: - «[Агент, связывающий TNF, по изобретению]» представляет агент, связывающий TNF, по изобретению. - «-» представляет либо прямую ковалентную связь, либо подходящий линкер, такой как 9GS, 15GS или 35GS линкер. - «X(n)» представляет С-концевое удлинение, как определено в настоящей заявке, такое как единственный аланиновый остаток. - «[HLE]» представляет домен или связывающую единицу, увеличивающие период полужизни (и в частности, ISVD, увеличивающий период полужизни), такие как ISVD (и в частности, нанотело) против (человеческого) сывороточного альбумина; - «[TNF2]» представляет связывающий домен или связывающую единицу (и в частности, ISVD) против TNF, отличающуюся от агента, связывающего TNF, по изобретению. - «[Единица для нацеливания]» представляет связывающий домен или связывающую единицу (и в частности, ISVD), нацеливающую соединение по изобретению на специфическую клетку, ткань или орган.

Таблица D: Последовательности ISVD, связывающего сывороточный альбумин («ID» означает SEQ ID NO, как применяется в настоящей заявке).

Наименование	ID	Аминокислотная последовательность
Alb8	70	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb23	71	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb129	72	EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA
Alb132	73	EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTATYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA
Alb11	74	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb11 (S112K)-A	75	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVKVSSA
Alb82	76	EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb82-A	77	EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA
Alb82-AA	78	EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAA
Alb82-AAA	79	EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSAAA
Alb82-G	80	EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSG
Alb82-GG	81	EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGG
Alb82-GGG	82	EVQLVESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGG
Alb92	83	EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
Alb223	84	EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSA

Таблица Е. Различные аминокислотные последовательности («ID» означает SEQ ID NO, как применяется в настоящей заявке)

Наименование	ID	Аминокислотная последовательность
5GS линкер	85	GGGGS
7GS линкер	86	sggsggs
8GS линкер	87	ggggcgggs
9GS линкер	88	GGGGSGGGS
10GS линкер	89	GGGGSGGGGS
15GS линкер	90	GGGGSGGGGSGGGGS
18GS линкер	91	GGGGSGGGGSGGGGGGGS
20GS линкер	92	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
25GS линкер	93	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
30GS линкер	94	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
35GS линкер	95	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
40GS линкер	96	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
G1 шарнир	97	EPKSCDKTHTCPPCP
9GS-G1 шарнир	98	GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP
Верхняя длинная шарнирная область ламы	99	epktpkpqpaaa
G3 шарнир	100	ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> АБЛИНКС НВ

<120> УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЕ АГЕНТЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ TNF

<130> 192557

<150> US62/254375

<151> 2015-11-12

<160> 105

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 2

Thr Ala Asp Met Gly

1 5

<210> 3

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 3

Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 4

Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 5

Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala Asp Met Gly

1 5 10

<210> 6

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 6

Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 7

Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Lys Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Ser

115 120

<210> 12

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Gln Ser

115 120

<210> 13

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Lys Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Ser Ser

115 120

<210> 15

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Ser

115 120

<210> 16

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Gln Ser

115 120

<210> 17

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Lys Val Ser Ser

115 120

<210> 19

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 20

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Ser

115 120

<210> 21

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Gln Ser

115 120

<210> 22

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 22

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 23

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Lys Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 24

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 24

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 25

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Ser Ala

115 120

<210> 26

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Gln Ser Ala

115 120

<210> 27

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Lys Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 28

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 28

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 29

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 29

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Ser Ala

115 120

<210> 30

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 30

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Gln Ser Ala

115 120

<210> 31

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 31

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 32

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 32

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Lys Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 33

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 33

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 34

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 34

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Ser Ala

115 120

<210> 35

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 35

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Gln Ser Ala

115 120

<210> 36

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 36

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 37

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 37

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 38

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 38

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 39

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 39

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 40

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 40

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 41

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 41

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 42

<211> 34

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> МЕТКА HIS6-FLAG3

<400> 42

His His His His His His Gly Ala Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly

1 5 10 15

Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly

20 25 30

Ala Ala

<210> 43

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> С-КОНЕЦ

<400> 43

Val Thr Val Lys Ser

1 5

<210> 44

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> С-КОНЕЦ

<400> 44

Val Thr Val Gln Ser

1 5

<210> 45

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> С-КОНЕЦ

<400> 45

Val Lys Val Ser Ser

1 5

<210> 46

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> С-КОНЕЦ

<400> 46

Val Gln Val Ser Ser

1 5

<210> 47

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> С-КОНЕЦ

<220>

<221> сайт

<222> (6)..(6)

<223> Xaa означает (X)n, который относится к C-концевому удлинению

на n аминокислот, где каждое положение независимо выбирается из любой

аминокислоты

<400> 47

Val Thr Val Lys Ser Xaa

1 5

<210> 48

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> С-КОНЕЦ

<220>

<221> сайт

<222> Xaa означает (X)n, который относится к C-концевому удлинению

на n аминокислот, где каждое положение независимо выбирается

из любой аминокислоты

<400> 48

Val Thr Val Gln Ser Xaa

1 5

<210> 49

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> С-КОНЕЦ

<220>

<221> САЙТ

<222> (6)..(6)

<223> Xaa означает (X)n, который относится к C-концевому удлинению

на n аминокислот, где каждое положение независимо выбирается

из любой аминокислоты

<400> 49

Val Lys Val Ser Ser Xaa

1 5

<210> 50

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> С-КОНЕЦ

<220>

<221> SITE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa означает (X)n, который относится к C-концевому удлинению

на n аминокислот, где каждое положение независимо выбирается

из любой аминокислоты

<400> 50

Val Gln Val Ser Ser Xaa

1 5

<210> 51

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> С-КОНЕЦ

<400> 51

Val Thr Val Lys Ser Ala

1 5

<210> 52

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> С-КОНЕЦ

<400> 52

Val Thr Val Gln Ser Ala

1 5

<210> 53

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> С-КОНЕЦ

<400> 53

Val Lys Val Ser Ser Ala

1 5

<210> 54

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> С-КОНЕЦ

<400> 54

Val Gln Val Ser Ser Ala

1 5

<210> 55

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> С-КОНЕЦ

<400> 55

Val Thr Val Ser Ser

1 5

<210> 56

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> С-КОНЕЦ

<220>

<221> SITE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa означает (X)n, который относится к C-концевому удлинению

на n аминокислот, где каждое положение независимо выбирается

из любой аминокислоты

<400> 56

Val Thr Val Ser Ser Xaa

1 5

<210> 57

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> С-КОНЕЦ

<400> 57

Val Thr Val Ser Ser Ala

1 5

<210> 58

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 58

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gln Thr Ser Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Gln Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 59

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 59

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 60

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 60

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 61

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 61

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 62

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 62

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 63

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 63

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Cys Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Cys Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 64

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 64

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 65

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 65

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Leu Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Pro Ser Gln Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 66

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 66

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Pro Ser Gln Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 67

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 67

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gln Thr Ser Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Gln Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 68

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 68

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gln Thr Ser Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Gln Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 69

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 69

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala His Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 70

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 70

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 71

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 71

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 72

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 72

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 73

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 73

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 74

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 74

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 75

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 75

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Lys

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 76

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 76

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 77

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 77

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 78

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 78

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ala

115

<210> 79

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 79

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ala Ala

115

<210> 80

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 80

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly

115

<210> 81

<211> 117

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 81

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly

115

<210> 82

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 82

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly

115

<210> 83

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 83

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 84

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 84

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala

115

<210> 85

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> Линкер

<400> 85

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 86

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> Линкер

<400> 86

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 87

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> Линкер

<400> 87

Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 88

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> Линкер

<400> 88

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 89

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> Линкер

<400> 89

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 90

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> Линкер

<400> 90

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 91

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> Линкер

<400> 91

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser

<210> 92

<211> 20

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> Линкер

<400> 92

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 93

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> Линкер

<400> 93

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25

<210> 94

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> Линкер

<400> 94

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

<210> 95

<211> 35

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> Линкер

<400> 95

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser

35

<210> 96

<211> 40

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> Линкер

<400> 96

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

35 40

<210> 97

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> G1 шарнир

<400> 97

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 98

<211> 24

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> 9GS-G1 шарнир

<400> 98

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

1 5 10 15

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

20

<210> 99

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> Верзняя длинная область шарнира ламы

<400> 99

Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala

1 5 10

<210> 100

<211> 62

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> G3 шарнир

<400> 100

Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys

1 5 10 15

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

20 25 30

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu

35 40 45

Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

50 55 60

<210> 101

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 101

Ser Phe Gly Met Ser

1 5

<210> 102

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 102

Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 103

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ CDR

<400> 103

Gly Gly Ser Leu Ser Arg

1 5

<210> 104

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> TNF006C11

<400> 104

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gln Thr Ser Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Gln Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 105

<211> 4

<212> БЕЛОК

<213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<220>

<223> Метка

<400> 105

Gly Gly Gly Cys

1

<---

1. Одиночный вариабельный домен иммуноглобулина (ISVD), специфически связывающий TNFα, имеющий:

- CDR1 в соответствии с Abm, который является аминокислотной последовательностью GFTFSTADMG (SEQ ID NO: 5); и

- CDR2 в соответствии с Abm, который является аминокислотной последовательностью RISGIDGTTY (SEQ ID NO: 6); и

- CDR3 в соответствии с Abm, который является аминокислотной последовательностью PRYADQWSAYDY (SEQ ID NO: 4);

- где аминокислотный остаток в положении 49 является аланином; и

- где аминокислотный остаток в положении 74 является серином

- где аминокислотные остатки в положениях 11, 89, 110 и 112 являются следующими:

- аминокислотный остаток в положении 11 выбран из L или V; и

- аминокислотный остаток в положении 89 выбран из T, V или L; и

- аминокислотный остаток в положении 110 выбран из T, K или Q; и

- аминокислотный остаток в положении 112 выбран из S, K или Q;

Таким образом, что

(i) в положении 89 находится T; или

(ii) в положении 89 находится L и в положении 11 находится V; или

(iii) в положении 89 находится L и в положении 110 находится K или Q; или

(iv) в положении 89 находится L и в положении 112 находится K или Q; или

(v) в положении 89 находится L, и в положении 11 находится V, и в положении 110 находится K или Q; или

(vi) в положении 89 находится L, и в положении 11 находится V, и в положении 112 находится K или Q; или

(vii) в положении 11 находится V, и в положении 110 находится K или Q; или

(viii) в положении 11 находится V и в положении 112 находится K или Q;

и имеющий:

- степень идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, но в которой С-концевое удлинение, которое может присутствовать, а также CDR и аминокислотные остатки в положениях 11, 89, 110 или 112 не учитываются при определении степени идентичности последовательности;

и/или

- не более 7, например не более 5, предпочтительно не больше 3, например всего лишь 3, 2 или 1 «аминокислотных различия» с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, но где С-концевое удлинение, которое может присутствовать, а также CDR и аминокислотные остатки в положениях 11, 89, 110 или 112 не учитываются при определении степени идентичности последовательностей,

и при необходимости имеющий:

- С-концевое удлинение (X)_n, в котором n составляет 1-10, предпочтительно 1-5, например 1, 2, 3, 4 или 5, и, предпочтительно, 1 или 2, например 1; а каждый X является аминокислотным остатком, который, предпочтительно, является природным, и который независимо выбран и, предпочтительно, независимо выбран из группы, состоящей из аланина (А), глицина (G), валина (V), лейцина (L) или изолейцина (I).

2. ISVD по п.1, где аминокислотный остаток в положении 73 представлен N, а аминокислотный остаток в положении 75 представлен К.

3. ISVD по любому из пп.1, 2, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 40, 39, 36, 62 и 69, в частности SEQ ID NO: 40, 39 и 36, более конкретно SEQ ID NO: 40.

4. ISVD по п.3, имеющий D в положении 1.

5. ISVD по п.3 или 4, имеющий С-концевое удлинение X(n), которое предпочтительно является С-концевым аланиновым остатком.

6. Соединение, которое специфически связывает TNFα, включающее по меньшей мере один ISVD по любому из пп.1-5.

7. Соединение по п.6, включающее по меньшей мере два ISVD по любому из пп.1-5, где указанные по меньшей мере два ISVD могут быть одними и теми же или различными.

8. Соединение по п.7, где указанные по меньшей мере два ISVD независимо выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8-41, 61-66 и 69, предпочтительно 40, 39, 36, 62 и 69.

9. Соединение по любому из пп.6-8, включающее компонент, связывающий сывороточный белок, где указанный компонент, связывающий сывороточный белок, связывает сывороточный альбумин.

10. Соединение по п.9, где указанный компонент, связывающий сывороточный белок, является ISVD, связывающим сывороточный альбумин, и где указанный ISVD, связывающий сывороточный альбумин, по существу состоит из 4 каркасных областей (FR1-FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных областей (CDR1-CDR3, соответственно), где CDR1 является SFGMS, CDR2 является SISGSGSDTLYADSVKG, а CDR3 является GGSLSR.

11. Соединение по п.10, где указанный ISVD, связывающий сывороточный альбумин, представлен любой из SEQ ID NO:70-84.

12. Конструкция, которая специфически связывает TNFα, которая включает или по существу состоит из ISVD по любому из предыдущих пп.1-6 или соединения по любому из пп.7-11 и которая дополнительно включает одну или несколько групп, остатков, компонентов или связывающих единиц, при необходимости соединенных вместе посредством одного или нескольких пептидных линкеров, в которой указанные одна или несколько групп, остатков, компонентов или связывающих единиц выбраны из группы, состоящей из молекулы полиэтиленгликоля, сывороточных белков или их фрагментов, связывающих единиц, которые могут связываться с сывороточными белками, Fc-части, и малых белков или пептидов, которые могут связываться с сывороточными белками.

13. Композиция, включающая ISVD по любому из пп.1-4 в активном количестве для применения в лечении воспалительного заболевания кишечника (ВЗК), синдрома раздраженного кишечника, болезни Крона, язвенного колита, мукозита, афтозного стоматита, целиакии, травмы пищеварительного тракта и/или рака пищеварительного тракта.

14. Композиция, содержащая соединение по любому из пп.6-11 в активном количестве, для применения в лечении воспалительного заболевания кишечника (ВЗК), синдрома раздраженного кишечника, болезни Крона, язвенного колита, мукозита, афтозного стоматита, целиакии, травмы пищеварительного тракта и/или рака пищеварительного тракта.