Ингибитор продукции реактивных форм кислорода для лечения заболеваний, связанных со свободными радикалами кислорода

Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики, а именно к применению ингибитора продукции активных форм кислорода (АФК) митохондриальным комплексом I для профилактики или облегчения сердечно-сосудистых заболеваний, связанных со свободными радикалами кислорода, где ингибитором является анетола тритион, и указанные заболевания выбраны из группы, включающей сердечную недостаточность, сердечно-легочные заболевания, кардиотоксичность антрациклинов, кардиотоксичность противораковых препаратов, кардиотоксичность хинолонов, сердечную фибрилляцию, легочную артериальную гипертензию и кардиомиопатию; а также к применению ингибитора продукции АФК митохондриальным комплексом I для улучшения сердечной сокращаемости у субъектов с пониженной сокращаемостью, где указанным ингибитором является анетола тритион. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 6 табл., 10 пр., 18 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к применению соединений для профилактики и лечения заболеваний, возникновение и/или развитие которых связано с продукцией и воздействием активных форм кислорода (АФК) митохондриального происхождения.

Предшествующий уровень техники

Митохондрии лежат в основе широко признанной в настоящее время "свободнорадикальной теории старения" и, таким образом, участвуют в патогенезе почти всех связанных со старением заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания, нейродегенеративные заболевания (болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и т.п.), рак и диабет, а также тканевые дисфункции ишемического происхождения. Согласно этой теории накопление повреждений, вызванных активными формами кислорода (АФК), влияет на многочисленные клеточные функции, в частности, на митохондриальные функции, которые необходимы для энергоснабжения и оптимального функционирования клеток. Таким образом, митохондрии оказываются основными мишенями АФК, поскольку оптимальное функционирование клеток имеет решающее значение для обеспечения энергии, необходимой для их восстановления.

Интересно, что митохондрии являются основным источником активных форм кислорода (АФК) и, таким образом, особенно подвержены окислительному повреждению. Следовательно, продукция АФК в самих митохондриях вызывает окислительное повреждение, которое способствует дисфункции митохондрии и гибели клеток.

Исследовано влияние различных антиоксидантов на физиологическую и патологическую активность АФК. В результате исследований антиоксидантов получено множество природных и сконструированных молекул, которые модулируют АФК с различной избирательностью в отношении АФК различного происхождения, т.е. физиологического (клеточная сигнализация) или патологического. Однако хотя АФК связывают с многочисленными заболеваниями, а антиоксиданты продемонстрировали свои перспективность во множестве доклинических экспериментов, почти все клинические испытания антиоксидантных лекарственных средств показали их ограниченную эффективность (Orr и др., 2013, Free Radic. Biol. Med. 65:1047-59).

Кроме того, в нескольких недавних исследованиях также было продемонстрировано, что чрезмерное сокращение АФК в клетках является вредным и, по-видимому, для функционирования клеток необходим адекватный баланс продукции АФК (Goodman и др., 2004, Dec 1. J. Natl. Cancer Inst. 96(23): 1743-50; Bjelakovic G и др., 2007 Feb 28. JAMA. 297 (8):842-57). Как следствие, растет интерес к избирательному ингибированию продукции АФК митохондриями без воздействия на клеточную сигнализацию со стороны продукции АФК в цитозоле.

Поскольку окислительное повреждение митохондрий способствует возникновению широкого спектра заболеваний человека, были разработаны антиоксиданты, предназначенные для накопления митохондриями in vivo. Наиболее широко изученным из антиоксидантов, нацеленных на митохондрий, является MitoQ, который содержит антиоксидантный остаток хинона, ковалентно связанный с липофильным катионом трифенилфосфония. В настоящее время MitoQ используется в ряде исследований in vivo на крысах и мышах и в двух испытаниях фазы II на человеке. В настоящее время лучше охарактеризованы условия высокой продукции АФК. По-видимому, АФК могут продуцироваться на множестве участков дыхательной цепи в митохондриях (Quinlan CL и др., 2013 May 23. Redox Biol. 1:304-12). Максимальная продукция супероксида/Н₂О₂ происходит в условиях высокого восстановления переносчиков электронов, главным образом хинонов, и высоких значений мембранных потенциалов митохондрий. Как это ни парадоксально, эти условия выполняются при низком окислительном фосфорилировании митохондрий (слабом мышечном сокращении) или при низком содержании кислорода (гипоксии).

Заявителем продемонстрировано, что AOL (анетола тритион) действует не как молекула классического неспецифического антиоксиданта, а что более интересно, как прямой избирательный ингибитор продукции активных форм кислорода (АФК) преимущественно на участке I_Q комплекса I митохондриальной дыхательной цепи, который является основным участком продукции АФК в митохондриях и основным участком, ответственным за дисфункции митохондрий. Кроме того, заявителем продемонстрировано, что AOL не влияет на окислительное фосфорилирование митохондрий, что предполагает отсутствие каких-либо неблагоприятных побочных эффектов и возможность лечения и/или предотвращения болезней, связанных со свободными радикалами кислорода, в долгосрочной перспективе. Таким образом, AOL является первым известным лекарством, получившим разрешение на применение человеком (разрешение на продажу Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов), которое предотвращает продукцию АФК митохондриями на участке I_Q.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к ингибитору продукции активных форм кислорода (АФК) для лечения или применения при лечении заболеваний, связанных со свободными радикалами кислорода.

В одном из вариантов осуществления ингибитором является анетола тритион (AOL).

В одном из вариантов осуществления ингибитор ингибирует продукцию АФК митохондриями.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления ингибитор ингибирует продукцию АФК митохондриями на участке I_Q митохондриального комплекса I.

В одном из вариантов осуществления болезни, связанные со свободными радикалами кислорода, выбраны из группы, включающей возрастную дегенерацию желтого пятна, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, ишемическое и реперфузионное поражение, легочную артериальную гипертензию, склеродермию, атеросклероз, сердечную недостаточность, инфаркт миокарда, артрит, токсическое поражение легких, сердечно-легочные заболевания, воспалительные заболевания, рак, метастазы, токсическое поражение сердца антрациклинами, сердечную недостаточность независимо от происхождения, ишемию, сердечный приступ, инсульт, тромбоз и эмболию, астму, аллергические/воспалительные состояния, бронхиальную астму, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Хантингтона, когнитивные расстройства, прогерию, прогероидные синдромы, эпилептическую деменцию, пресенильную деменцию, посттравматическую деменцию, старческое слабоумие, сосудистую деменцию, связанную с ВИЧ-1 деменцию, постинсультную деменцию, синдром Дауна, болезнь моторных нейронов, амилоидоз, амилоидоз, связанный с диабетом типа II, болезнь Крейтцфельта-Якоба, некротическую гибель клеток, синдром Герстмана-Штрауслера, куру и губчатый энцефалит у животных, амилоидоз, связанный с длительным гемодиализом, старческий амилоидоз сердца и семейную амилоидную полинейропатию, церебропатию, нарушения, относящиеся к вегетативной нервной системе, потерю памяти, интоксикацию алюминием, снижение уровня железа в клетках живого организма, снижение уровней ионов свободных переходных металлов у млекопитающих, токсичные количества металла в организме пациентов или в некоторых частях тела, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз, катаракту, диабет, рак, заболевания печени, старение кожи, трансплантацию, ототоксичные вторичные эффекты аминогликозидов, новообразования, токсичность противоопухолевых средств или иммунодепрессантов и химических веществ, врожденные иммунные ответы и атаксию Фридрейха.

В одном из вариантов осуществления ингибитор предназначен для предотвращения или применения при предотвращении метастазов.

Определения

Следующие термины в настоящем изобретении имеют следующие значения.

"Лечение" или "облегчение" относится как к терапии, так и к профилактическим или предупредительным мерам, при этом его задачей является предотвращение или замедления целевого патологического состояния или заболевания. Нуждающиеся в лечении включают тех, кто уже заболел, а также тех, кто имеет предрасположенность, к заболеванию, или тех, у кого должна быть предотвращена болезнь. У субъекта или млекопитающего успешно "лечат" заболевание или поражение или состояние, если после полученного лечения согласно настоящему изобретению у субъекта или млекопитающего наблюдается обнаруживаемое и/или измеряемое уменьшение или отсутствие одного или нескольких из следующих: уменьшение продукции АФК; и/или облегчение до некоторой степени одного или нескольких симптомов, связанных с конкретным заболеванием или состоянием; снижение заболеваемости и смертности и повышение качества жизни. Указанные параметры оценки успешности лечения и положительной динамики заболевания легко поддаются измерению стандартными методами, знакомыми врачам.

"Терапевтически эффективное количество" означает уровень или количество средства, которое, не вызывая значительных отрицательных или неблагоприятных побочных эффектов для мишени, (1) задерживает или предотвращает начало заболевания, нарушения или состояния, связанного со свободными радикалами кислорода; (2) замедляет или останавливает прогрессирование, обострение или ухудшение одного или нескольких симптомов заболевания, нарушения или состояния, связанного со свободными радикалами кислорода; (3) обеспечивает улучшение симптомов заболевания, нарушения или состояния, связанного со свободными радикалами кислорода; (4) снижает тяжесть или частоту заболевания, нарушения или состояния, связанного со свободными радикалами кислорода; или (5) излечивает заболевание, нарушение или состояние, связанное со свободными радикалами кислорода. Терапевтически эффективное количество может вводиться до начала заболевания, нарушения или состояния, связанного со свободными радикалами кислорода, в профилактических или предупредительных целях. В качестве альтернативы или дополнительно, терапевтически эффективное количество может вводиться после начала заболевания, нарушения или состояния, связанного со свободными радикалами кислорода, в терапевтических целях.

"Фармацевтически приемлемый эксципиент" относится к эксципиенту, который не вызывает неблагоприятную, аллергическую или другую нежелательную реакцию при введении животному, предпочтительно человеку. Он включает любые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и задерживающие абсорбцию средства и т.п. В случае введения человеку препараты должны соответствовать требованиям стерильности, апирогенности и общим стандартам безопасности и чистоты, установленным регламентирующими органами, такими как, например, FDA или ЕМА.

"Субъект" означает млекопитающее, включая человека. В контексте настоящего изобретения субъектом может являться пациент, то есть лицо, которое получает медицинскую помощь, является или являлся объектом лечения или наблюдался на предмет развития заболевания. В одном из вариантов осуществления субъектом является субъект мужского пола. В другом варианте осуществления субъектом является субъект женского пола.

Термин "около", предшествующий какой-либо численной величине, означает на 10% больше или меньше указанной величины.

Подробное описание изобретения

Одной из задач настоящего изобретения является создание способа лечения заболеваний, связанных со свободными радикалами кислорода, у нуждающегося в этом субъекта, включающего введение эффективного количества ингибитора продукции митохондриальных активных форм кислорода (АФК).

Другой задачей настоящего изобретения является создание ингибитора продукции активных форм кислорода (АФК) для лечения или использования при лечении заболеваний, связанных со свободными радикалами кислорода, при этом ингибитор ингибирует продукцию митохондриальных АФК.

В одном из вариантов осуществления ингибитор согласно изобретению не влияет на физиологическую (цитозольную) продукцию АФК. В одном из вариантов осуществления физиологическая (цитозольная) продукция АФК модулируется не более, чем на 5% (в сторону увеличения или уменьшения) в присутствии ингибитора согласно изобретению.

Используемый термин "не влияет" относится к отсутствию эффекта ингибитора согласно изобретению, измеренного известными специалистам в данной области техники методами определения уровня продукции АФК.

В другом варианте осуществления ингибитор согласно изобретению не является ингибитором цитозольной продукции АФК.

Цитозольная продукция АФК определяется как разность между общей клеточной продукцией АФК и митохондриальной продукцией АФК.

В другом варианте осуществления ингибитор согласно изобретению действует выше по потоку относительно продукции АФК.

Тесты для обнаружения цитозольной продукции АФК хорошо известны специалистам в данной области техники.

Примеры таких тестов включают.

Измерение общей клеточной продукции АФК

5-(и -6)-хлорметил-2',7'-дихлордигидрофлуоресцеиндиацетат, ацетиловый эфир (CM-H2DCFDA) и/или H2DCFDA являются индикаторами цитозольных активных форм кислорода (АФК) в клетках. CM-H2DCFDA пассивно диффундирует в клетки, где его ацетатные группы расщепляются внутриклеточными эстеразами, а его способная вступать в реакцию с тиолом хлорметильная группа вступает в реакцию с внутриклеточным глутатионом и другими тиолами. В результате последующего окисления образуется флуоресцентный аддукт, который захватывается внутри клетки, что облегчает длительные исследования (Zhang, X. и др., 2008), J. Cardiovasc. Pharmacol. 51(5):443-449; Sarvazyan, N., 1996. Am. J. Physiol. 271(5 Pt 2):H2079-2085).

Измерение продукции митохондриальных АФК в клетках

Измерение внутриклеточных АФК в интактных клетках и выявление митохондрий в качестве их источника является значительно более сложным. В последние годы для нацеливания разнообразных соединений на высокоотрицательную митохондриальную матрицу с использованием липофильного трифенилфосфониевого катиона ТРР(+) в качестве конъюгата "доставки" применяется ключевая для митохондриальной функции протон-движущая сила. Из них для оценки митохондриальных АФК широко используется MitoSOX Red, также называемый митогидроэтидином или митодигидроэтидием. ТРР(+)фрагмент MitoSOX позволяет накапливать чувствительный к АФК-гидроэтидина в митохондриальной матрице, а окисление гидроэтидина супероксидом приводит к образованию специфического продукта флуоресцентного окисления 2-гидроксиэтидия (Zhao, Н. и др., 2005), Proc. Natl. Акад. Sci. США. 102 (16):5727-5732; Polster, В. М. и др., 2014. Methods Enzymol. 547:225-250).

В одном из вариантов осуществления ингибитором согласно изобретению является избирательный ингибитор продукции митохондриальных активных форм кислорода.

Используемый термин "избирательный ингибитор" также относится к соединению, способному ингибировать продукцию АФК на участке I_Q комплекса I с минимальным влиянием на продукцию АФК на остальных участках и на мембранный потенциал митохондрий (ΔΨm) и окислительное фосфорилирование. Например, в случае выделенных митохондрий в присутствии ротенона (т.е. при ингибировании продукции АФК на участке I_Q) и антимицина А (т.е. при продукции АФК по большей части комплексом III) показатель ЕС₅₀ ингибирования продукции АФК примерно в 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 раз превышает показатель при отсутствии ротенона.

В одном из вариантов осуществления используемый термин "избирательный ингибитор" относится к соединению, способному ингибировать митохондриальную продукцию АФК на участке I_Q комплекса I с показателем ЕС₅₀ около 10 мкМ. В другом варианте осуществления соединение существенно не ингибирует цитозольную продукцию АФК по данным анализа in vitro продукции АФК NAD(Р)Н-оксидазой.

В другом варианте осуществления ингибитором или избирательным ингибитором согласно изобретению является избирательный ингибитор продукции АФК на участке I_Q комплекса I митохондриальной дыхательной цепи.

Используемый термин "избирательный ингибитор" относится также к соединению, способному ингибировать продукцию АФК на участке I_Q комплекса I с минимальным влиянием на продукцию АФК на остальных участках и на мембранный потенциал митохондрий (ΔΨm) и окислительное фосфорилирование. Например, в случае выделенных митохондрий в присутствии ротенона (т.е. при ингибировании продукции АФК на участке I_Q) показатель ЕС₅₀ ингибирования продукции АФК примерно в 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 превышает показатель в присутствии антимицина А (т.е. при продукции АФК по большей части комплексом III).

Ингибирование активности комплекса I ротеноном и нейротоксином МРР+ связано с паркинсонизмом у грызунов и людей, что указывает на связь между дисфункциональным комплексом I, продукцией АФК и нейродегенерацией. Соответственно, соединения, способные ингибировать продукцию АФК комплексом I, могут быть полезны при терапии.

Специалистам в данной области хорошо известны испытания на митохондриях, выделенных из различных тканей, с целью специфического обнаружения АФК, продуцируемых на участке I_Q комплекса I митохондриальной дыхательной цепи.

Также описаны высокопроизводительные анализы с целью идентификации ингибиторов продукции АФК на определенных участках в выделенных митохондриях также без изменения энергии продукции. При этом идентифицируют сайт-специфические модуляторы продукции АФК, а также выявляют менее специфические эффекторы, такие как антиоксиданты широкого действия и различные ингибиторы митохондриальной биоэнергетики. Соответственно, можно идентифицировать ингибиторы, которые различают нежелательную утечку электронов в кислород (продукцию АФК) на специфических участках цепи переноса электронов без изменения нормальных энергетически связанных потоков электронов и протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану. В анализах адаптируют стандартные флуоресцентные исследования продукции митохондриальных АФК с использованием красителя Amplex UltraRed (Invitrogen) и исследования ΔΨm с использованием потенциометрического красителя TMRM (Invitrogen) к формату микропланшета с высокой пропускной способностью. Предусмотрен базовый набор из пяти анализов АФК и одного анализа ΔΨm для надежного обнаружения функциональной модуляции в свежевыделенных митохондриях скелетных мышц.

За счет варьирования субстратов и ингибиторов, добавляемых к общей смеси для анализа, в качестве мишеней могут по отдельности выбираться пять основных участков продукции АФК (I_Q, I_F, III_QO, SDH и mGPDH). Может параллельно проводится обратный скрининг с целью мониторинга ΔΨm, чтобы исключить соединения, которые, вероятно, являются общими ингибиторами или разобщающими агентами нормальной продукции митохондриальной энергии.

В другом варианте осуществления во всех анализах используют ингибиторы в концентрации 2,5 мкМ в двух экземплярах. Нормализуют конечную точку флуоресценции к контрольным лункам с ДМСО и известным ингибитором митохондрий, включенным в каждый планшет. Положительные результаты каждого анализа АФК могут первоначально фильтроваться путем применения в нем порога уменьшения предпочтительно 15% или более предпочтительно 18% или даже более предпочтительно 20% или более. Каждый анализ АФК может использоваться в качестве обратного скрининга применительно к другим анализам с одновременным исключением соединений, которые изменяли ΔΨm при обратном скрининге на основе TMRM. Таким образом, отфильтрованные результаты могут впоследствии оцениваться для исключения тех из них, которые изменяли другие анализы АФК более чем примерно на 20% или 18% или 15% или изменяли ΔΨm более чем на 10% или более предпочтительно на 5% или даже более предпочтительно на 4%.

В другом варианте осуществления ингибиторы, которые являются избирательными ингибиторами продукции АФК на одном участка продукции АФК, уменьшают продукцию АФК на одном из участков I_Q, I_F, III_QO, SDH и mGPDH продукции АФК и одновременно менее чем на 10% влияют на продукцию АФК на остальных участках продукции АФК.

Комплекс I дыхательной цепи может генерировать АФК на двух различных участках: убихинонсвязывающем участке и флавинмононуклеотидном участке.

Убихинонсвязывающий участок комплекса I (I_Q)

С целью специфического анализа продукции АФК на участке I_Q может использоваться 5 мМ сукцината в качестве субстрата для снабжения дыхательной цепи электронами. Продукция АФК на участке I_Q исключительно чувствительна к изменениям протон-движущей силы (PMF) через внутреннюю митохондриальную мембрану (PMF = ΔΨm + ΔρН). Соответственно, для анализа ΔΨm при оценке избирательности ингибирования продукции АФК на участке I_Q может использоваться консервативный порог.

Утечка электронов с участка I_Q лучше всего характеризуется при обратном переносе из сокращенного Q-пула в матрицу NAD⁺ через CI в присутствии сильного PMF. Согласно экспериментальным данным условия, которые благоприятствуют продукции АФК на участке I_Q, считаются далекими от физиологических условий, из-за чего многие не придают им значения, несмотря на способность обеспечивать высокие показатели. Однако даже при более низких концентрациях как глутамата (для поступательной подачи электронов через CI), так и сукцината (для подачи электронов в обратном направлении) дыхательные митохондрии по-прежнему продуцируют значительные количества чувствительных к ротенону АФК (т.е. АФК на участке I_Q). Кроме того, сравнительный анализ показывает обратную зависимость между максимальной продукцией АФК на участке I_Q (но не на участке I_F) и максимальной продолжительностью жизни у позвоночных различных видов (Lambert, А. и др., 2007). Aging Cell. 6(5):607-18; Lambert, А. и др., 2010. Aging Cell. 9(1):78-91). Поэтому избирательные модуляторы продукции АФК на участке I_Q обеспечили бы уникальные возможности исследования предполагаемой роли продукции митохондриальных АФК в нормальных и патологических процессах.

Флавинсвязывающий участок комплекса I (I_F)

С целью специфического анализа продукции АФК на участке I_F может использоваться раствор субстрата для снабжения дыхательной цепи электронами, содержащий 5 мМ глутамата, 5 мМ малат и 4 мкМ ротенона. Участок I_F продуцирует АФК со скоростью, пропорциональной состоянию сокращения пула NADH в митохондриальной матрице (Treberg, J. и др., 2011. J. Biol. Chem. 286(36):31361-72). Блокада участка I_Q пестицидным ротеноном может увеличивать продукцию АФК на участке I_F путем предотвращения окисления флавина. Максимальная продукция АФК на флавинсвязывающем участке комплекса I (участке I_F) относительно невелика по сравнению с участками I_Q и III_QO, и это может приводить к большей изменчивости данных анализа и, следовательно, к более высоким ложноположительным показателям исходного скрининга.

В другом варианте осуществления ингибитор согласно изобретению не оказывает существенного влияния на окислительное фосфорилирование непосредственно в митохондриях, окислительное фосфорилирование предпочтительно модулируется менее чем на 10, 9, 8, 7, 6, 5%.

Заболевания, связанные со свободными радикалами кислорода, связаны с дисбалансом окислительного стресса и дисфункцией митохондрии. В частности, заболевания, связанные с дисфункцией митохондрий, индуцируются продукцией митохондриальных АФК.

Заболевания, связанные со свободными радикалами кислорода, включают без ограничения связанные со старением заболевания, аутоиммунные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, прогероидные синдромы, синдромы паркинсонизма, неврологические заболевания, ишемические и реперфузионные повреждения, инфекционные заболевания, заболевания мышц, легких, почек и печени.

Связанные со старением заболевания включают без ограничения возрастную дегенерацию желтого пятна (AMD), старение кожи, поражение кожи ультрафиолетовым излучением, истончение, провисание, образование морщин, появление возрастных пятен, поврежденных кровеносных сосудов и областей сухости, себорейный кератоз, солнечные кератозы, синдром Киндлера, болезнь Боуэна, рак кожи, артрит, анкилозирующий спондилоартрит, воспалительные полиартропатии, артрит колена, эпидемический полиартрит, псориатический артрит, катаракту, глухоту, рак, метастазы, профилактику метастазирования, заболевания печени, трансплантацию, новообразования, токсичность противоопухолевых средств или иммунодепрессантов и химических веществ, остеопороз, пойкилодермию, акрогезия, наследственную склерозирующую поикилодермию, врожденный дискератоз, пигментную ксеродерму, синдром Блума, анемию Фанкони, синдром Кокейна и заболевания, вызванные загрязнением окружающей среды.

Аутоиммунные заболевания включают без ограничения рассеянный склероз, ревматоидный артрит, системную красную волчанку, сахарный диабет типа I, болезнь Крона; миастению, болезнь Грейвса, склеродермию, синдром Шегрена, язвенный колит, первичный билиарный цирроз, аутоиммунный гепатит, тиреоидит Хашимото, анкилозирующий спондилоартрит, псориаз. Аутоиммунным заболеванием может являться аутоиммунное заболевание, связанное с расстройствами крови, такими как аутоиммунная гемолитическая анемия, пернициозная анемия и аутоиммунная тромбоцитопения. Аутоиммунным заболеванием также может являться темпоральный артериит, антифосфолипидный синдром, васкулиты, такие как гранулематоз Вегенера и болезнь Бехчета. Другие аутоиммунные заболевания включают полимиозит, дерматомиозит, спондилоартропатии, такие как анкилозирующий спондилоартрит, антифосфолипидный синдром и полимиозит.

Сердечно-сосудистые заболевания включают без ограничения гипертензию, кардиотоксичность противораковых препаратов, кардиотоксичность антрациклинов, кардиотоксичность хинолонов, сердечную недостаточность независимо от происхождения, ишемию, сердечный приступ, инсульт, атеросклероз, сердечную фибрилляцию, гипертензию, тромбоз и эмболию, аллергические/воспалительные состояния, такие как бронхиальная астма, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, диабет типа II, сахарный диабет и глухота (DAD) или синдром Беллинджера-Уоллеса, воспалительные заболевания, ревматическую лихорадку, легочную артериальную гипертензиию, сердечно-легочные заболевания, такие как хроническая обструктивная болезнь легких, легочная эмболия, перикардит, коарктация аорты, тетралогия Фаллота, стеноз аорты, митральный стеноз, аортальная регургитация, митральная регургитация, пневмокониоз, бронхоэктаз, кардиомиопатии, эндотелиальная толерантность к нитроглицерину.

Прогероидные синдромы включают без ограничения прогерию, синдром Блума, синдром Кокейна, синдром Де Барси, врожденный дискератоз, рестриктивную дермопатию, синдром Ротмунда-Томсона, трихотиодистрофию, синдром Вернера, синдром Видеманна-Раутенштрауха, пигментную ксеродерму.

Синдромы паркинсонизма включают без ограничения болезнь Паркинсона, прогрессирующий супрануклеарный паралич, множественную системную атрофию, кортикобазальную дегенерацию или деменцию с тельцами Леви, индуцированный токсинами паркинсонизм и раннюю стадию болезни Паркинсона, такую как аутосомно-рецессивный паркинсонизм, связанный с PARK6, или аутосомно-рецессивный паркинсонизм, связанный с PINK1.

Неврологические заболевания включают без ограничения деменцию, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и старение, болезнь Хантингтона, атаксию Фридрейха, болезнь Вильсона, синдром Ли, синдром Кернса-Сейра, наследственную оптическую невропатию Лебера, когнитивные расстройства, расстройства настроения, нарушения движения, позднюю дискинезию, травму мозга, апоптоз, деменцию, эпилепсию, эпилептическую деменцию, пресенильную деменцию, посттравматическую деменцию, старческое слабоумие, сосудистую деменцию, связанную с ВИЧ-1 деменцию, постинсультную деменцию, шизофрению, синдром Дауна, болезнь моторных нейронов, амилоидоз, амилоидоз, связанный с диабетом типа II, болезнь Крейтцфельта-Якоба, некротическую гибель клеток, синдром Герстмана-Штрауслера, куру и губчатый энцефалит у животных, амилоидоз, связанный с длительным гемодиализом, старческий амилоидоз сердца и семейную амилоидную полинейропатию, церебропатию, нарушения, относящиеся к вегетативной нервной системе, потерю памяти, интоксикацию алюминием, снижение уровня железа в клетках живого организма, снижение свободного уровня ионов переходных металлов у млекопитающих, токсичные количества металла в организме пациентов или в некоторых частях тела, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз, акинетопсию, слабоумие, связанное с алкоголем, первичную возрастную тауопатию, аномальную афазию, аносогнозию, апраксию, апраксию речи, словесно-слуховую агнозию, лобно-височную деменцию, лобно-височную дегенерацию, логопеническую прогрессирующую афазии, нейрофибриллярные клубки, фоноагнозию, болезнь Пика, первичную прогрессирующую афазию, прогрессирующую моторную афазию, семантическую деменцию, синдром стероидной деменции, зрительно-пространственную агнозию, ототоксичные вторичные эффекты аминогликозидов, токсичность кокаина.

Ишемические и реперфузионные повреждения включают без ограничения инсульт, церебральную ишемию, синдром инсульта мозгового ствола, каротидную эндартерэктомию, синдром мозжечкового инсульта, церебральную ахроматопсию, внутримозговое кровоизлияние, церебральный инфаркт, тромбоз венозных синусов мозга, интрапаренхимное кровоизлияние, внутричерепное кровоизлияние, лакунарный инсульт, латеральный спинномозговой синдром, латеральный синдром моста мозга, парциальный инфаркт головного мозга в бассейне сонных артерий, инфаркт головного мозга в вертебробазилярном бассейне, бессимптомный инсульт, пояс инсульта, восстановление после инсульта, транзиторный ишемический приступ, инсульт на границе бассейнов крупных церебральных сосудов, синдром Вебера, ожирение, сохранение органов для трансплантации, ишемию, реперфузионное повреждение.

Инфекционные заболевания включают без ограничения гепатит С, сепсис, инфекционные миопатии, септический шок.

Болезни мышц включают без ограничения миопатии, митохондриальные миопатии, плече-лопаточно-лицевую миопатию, плече-лопаточно-лицевую миопатию типа 1, плече-лопаточно-лицевую миопатию типа 2, связанную с рианодиновым рецептором 1 (RYR1) миопатию, связанную с селенопротеином 1 (SEPN1) миопатию, синдром Кернса-Сейра, кардиомиопатии, расстройства движения, атрофию мышц, вызванную иммобилизацией, ожоговое поражение скелетных мышц, контрактуру Дюпюитрена.

Заболевания легких, почек и печени включают без ограничения кистозный фиброз, астму, заболевания, вызванные загрязнением окружающей среды, сердечно-легочные заболевания, легочную артериальную гипертензию, хроническую обструктивную болезнь легких, легочную эмболию, пневмокониоз, бронхоэктазию, бронхиальную астму, связанную с ИВЛ дисфункцию диафрагмы, рак легкого, алкогольную жировую болезнь печени, жировую болезнь печени, диабет, сохранение почек ex vivo, воспаление печени при гепатите С, повреждение почек при диабете типа I, цирроз.

Заболеваниями, в частности, подлежащими лечению в настоящем изобретении, являются связанные со старением заболевания, AMD, старение кожи, сердечно-сосудистые заболевания, такие как, например, кардиотоксичность антрациклинов, прогерия и прогероидные синдромы, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, атаксия Фридрейха, ишемическая реперфузия, сердечно-легочные заболевания, астма, рак, метастазы, болезни, вызванные загрязнением окружающей среды.

В одном из вариантов осуществления заболеванием, в особенности, подлежащим предотвращению в настоящем изобретении, является метастаз. Продукция АФК действительно вовлечена в механизмы роста опухолей и метастазирования: миграция опухолевых клеток, инвазия, клоногенность, метастатический захват и спонтанные метастазы стимулируются естественным отбором фенотипа митохондрий, связанного с продукцией АФК и аберрантной циклической активностью ТСА, механизмом известным как "метастатический митохондриальный переключатель" (Porporato и др., 2014). Cell Reports. 8:754-766). Гиперпродукция АФК также способствует ангиогенезу, и, соответственно, ингибиторы продукции АФК являются антиангиогенными продуктами.

В одном из вариантов осуществления ингибитор или избирательный ингибитор согласно изобретению имеет одну из следующих формул:

и их оксиды, производные и метаболиты, в которых

Z означает S, О, NR, R₂ или CR₂;

R означает -Н, -ОН, С₁-С₅-алкил, C₁-C₅-алкокси или C₁-C₅-алкоксикарбонил;

R2 вместе с атомами, к которым он присоединен, образует спирокольцо;

R1, R2, R3 и R4 независимо означают -Н, -алкил, -арил, -алкиларил, гетероцикл,

галоген, -алкоксикарбонил (C₁-C₅) или -карбоксил;

при этом каждый алкил представляет собой насыщенный или ненасыщенный C₁-C₁₀ фрагмент с линейной или разветвленной цепью, который необязательно замещен одним, двумя или более независимо выбранными простым эфиром (--O--), галогеном, алкилом (C₁-C₅), -ОН, алкокси (C₁-C₅), алкоксикарбонилом, (C₁-C₅), карбоксилом, амидо, алкиламидо (C₁-C₅), амино, моно- или диалкиламино (C₁-C₅), алкилкарбамоилом (C₁-C₅), тиолом, алкилтио (C₁-C₅) или бензоидным арилом; и

-арильный и -алкиларильный заместитель R1, R2, R3 и R4 представляет собой бензоидную группу (C₆-C₁₄), которая необязательно замещена одним, двумя или более независимо выбранными --SO₃H, галогеном, алкилом (C₁-C₅), --ОН, алкокси (C₁-C₅), алкоксикарбонилом, (C₁-C₅), карбоксилом, амидо, алкиламидо (C₁-C₅), амино, моно- или диалкиламино (C₁-C₅), алкилкарбамоилом (C₁-C₅), тиолом, алкилтио (C₁-C₅); и

гетероцикл означает как любое 4, 5 или 6-членное, необязательно замещенное, насыщенное или ненасыщенное гетероциклическое кольцо, содержащее 1-3 кольцевых атома, выбранных из N, О и S, при этом остальными атомами кольца являются атомы углерода; и

заместители арила или гетероциклила выбраны из группы, включающей галоген, алкил (C₁-C₅), гидроксил, алкокси (C₁-C₅), алкоксикарбонил (C₁-C₅), карбоксил, амидо, алкиламидо (C1-C5), амино, моно- и диалкиламино (C₁-C₅), алкилкарбамоил (C₁-C₅), тиол, алкилтио (С-С5), бензоид, арил, циано, нитро, галогеналкил (C₁-C₅), алкенилсульфонил C₁-C₅) или сульфонат, или

один из R1 и R2 и один из R3 и R4 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, представляют собой составное бициклическое или трициклическое соединение, которое является насыщенным или ненасыщенным, гетероциклическим или карбоциклическим, все кольца которого необязательно являются замещенными 5-, 6-, 7- или 8-членными кольцами с заместителями, необязательно выбранными из алкила, алкокси, --SO₃H, -ОН и галогена, или

R1 и R2 вместе или R3 и R4 вместе независимо представляют собой оксим (=NOH).

Примеры ингибиторов класса 1,2-дитиоланов включают без ограничения липоамид (1,2-дитиолан); 1,2-дитиолан-4-карбоновую кислоту; 4-октил-1,3-дитиолан-2-тион; 4-децил-1,3-дитиолан-2-тион; 4-додецил-1,3-дитиолан-2-тион; 4-тетрадецил-1,3-дитиолан-2-тион; и 1,3-дитиолан-2-тион.

Примеры ингибиторов класса 1,2-дитиолов включают без ограничения 4-метил-5-(2-пиразинил)-3-дитиолетион (олтипраз); 5-(4-метоксифенил)-3Н-1,2-дитиоил-3-тион (анетола тритион или АОЛ), анетола диэтиолтион (АДТ), АДО, 1,2-дитиоил-3-тион; 5-(4-фенил-1,3-бутадиенил)-1,2-дитиол-3-тион, 5-4 (4-хлорфенил)-1,3-бутадиенил-1,2-дитиол-3-тион, 5-{4-(4-метоксифенил)-1,3-бутадиенил}-1,2-дитиол-3-тион, 5-{4-(р-толуил)-1,3-бутадиенил}-1,2-дитиол-3-тион, 5-(4-(о-хлорфенил)-1,3-бутадиенил}-1,2-дитиол-3-тион и 5-{4-(m-метилфенил)-1,3-бутадиенил}-1,2-дитиол-3-тион.

Примеры ингибиторов класса 1,3-дитиолов включают без ограничения диизопропил-1,3-дитиол-2-илиденмалонат (малотилат); 1,3-дитилол(4,5-d)-1,3-дитиин-2-тион; 1,3-дитиол(4,5-d)-1,3-дитиоол-2-тион; 5-хлор-1,3-дитиол(4,5-d)-1,3-дитиоол-2-тион; и 5-циан-1,3-дитиол(4,5-d)-1,3-дитиоол-2-тион.

Примеры ингибиторов класса 1,3-дитиоланов включают без ограничения 5-(1-карбонил-L-амино)-2,2-диметил-[1,3]дитиолан-4-карбоновую кислоту; гексагидро-1-3-бензотиотиол-2-тион; 4-октил-1,3-дитиолан-2-тион; 4-децил-1,3-дитиолан-2-тион; 4-додецил-1,3-дитиолан-2-тион.

Ингибитор или избирательный ингибитор согласно изобретению предпочтительно выбран из группы, включающей 5-(4-метоксифенил)-3Н-1,2-дитиоил-3-тион (анетола тритион или АОЛ), анетола диэтиолтион (АДТ), ADO, 1,2-дитиол-2-тион, 1,2-дитиолан, 1,3-дитиол-2-тион, 4-метил-5-(2-пиразинил)-3-дитиоэтил (олтипраз) и диизопропил-1,3-дитиол-2-илиденмалонат (малотилат) или их производные или аналоги.

Примеры ингибиторов или избирательных ингибиторов согласно изобретению включают без ограничения:

В одном из вариантов осуществления ингибитором согласно изобретению является:

В одном из вариантов осуществления ингибитором согласно изобретению не является хелатообразующий агент, предпочтительно хелатообразующий агент, предпочтительно хелатообразующий агент Fe и/или Cu.

В одном из вариантов осуществления ингибитором согласно изобретению не является олтипраз.

В одном из вариантов осуществления ингибиторы или избирательные ингибиторы выбраны из ингибиторов, описанных в патентной заявке US 2004/053989.

В другом варианте осуществления ингибиторы или избирательные ингибиторы выбраны из ингибиторов, описанных в следующих патентах: US 3040057; ЕР 0576619; US 3576821; US 3959313; US 3109772.

В одном из вариантов осуществления ингибитором не является N-циклогексил-4-(4-нитрофенокси)бензолсульфонамид.

Настоящее изобретение также относится к композиции для лечения заболеваний, связанных со свободными радикалами кислорода, у нуждающегося в этом субъекта, содержащей или состоящей или преимущественно состоящей из описанного ингибитора.

Настоящее изобретение также относится к композиции для лечения или применения при лечении заболеваний, связанных со свободными радикалами кислорода, содержащей или состоящей или преимущественно состоящей из ингибитора или избирательного ингибитора продукции митохондриальных АФК.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения заболеваний, связанных со свободными радикалами кислорода, у нуждающегося в этом субъекта, содержащей или состоящей или преимущественно состоящей из описанного ингибитора в комбинации, по меньшей мере, с одним фармацевтически приемлемым эксципиентом.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения или применения при лечении заболеваний, связанных со свободными радикалами кислорода, содержащей или состоящей или преимущественно состоящей из ингибитора или избирательного ингибитора продукции митохондриальных АФК и, по меньшей мере, одного фармацевтически приемлемого эксципиента.

Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству для лечения заболеваний, связанных со свободными радикалами кислорода, у нуждающегося в этом субъекта, содержащему или состоящему или преимущественно состоящему из описанного ингибитора.

Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству для лечения или применения при лечении заболеваний, связанных со свободными радикалами кислорода, содержащему или состоящему или преимущественно состоящему из ингибитора или избирательного ингибитора продукции митохондриальных АФК. Применимые эксципиенты включают воду, физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и растворы этанола, глюкозы, сахарозы, декстрана, маннозы, маннита, сорбита, полиэтиленгликоля (ПЭГ), фосфата, ацетата, желатина, коллагена, Carbopol®, растительных масел и т.п. Могут дополнительно включаться применимые консерванты, стабилизаторы, антиоксиданты, противомикробные и буферные средства, такие как, например, ВНА, ВНТ, лимонная кислота, аскорбиновая кислота, тетрациклин и т.п.

Другие примеры фармацевтически приемлемых эксципиентов, которые могут использоваться в композиции согласно изобретению, включают без ограничения ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, белки сыворотки, такие как человеческий сывороточный альбумин, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия, частичные глицеридные смеси насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как протаминсульфат, динатрийгидрофосфат, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, полиакрилаты, воски, блокполимеры полиэтилена и полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и ланолин.

Кроме того, некоторые эксципиенты могут включать поверхностно-активные вещества (например, гидроксипропилцеллюлозу); применимые носители, такие как, например, растворители и дисперсионные среды, содержащие, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их применимые смеси и растительные масла, такие как, например, арахисовое масло и кунжутное масло; изотонические средства, такие как, например, сахара или хлорид натрия; покровные средства, такие как, например, лецитин; замедляющие абсорбцию средства, такие как, например, моностеарат алюминия и желатин; консерванты, такие как, например, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, хлорбутанол, тимерозал и т.п.; буферы, такие как, например, борная кислота, бикарбонат натрия и калия, бораты натрия и калия, карбонат натрия и калия, ацетат натрия, бифосфат натрия и т.п.; средства поддержания тонуса, такие как, например, декстран 40, декстран 70, декстроза, глицерин, хлорид калия, пропиленгликоль, хлорид натрия; антиоксиданты и стабилизаторы, такие как, например, бисульфит натрия, метабисульфит натрия, тиосульфит натрия, тиомочевина и т.п.; неионные смачивающие или осветляющие средства, такие как, например, полисорбат 80, полисорбат 20, полоксамер 282 и тилоксаполь; модифицирующие вязкость средства, такие как, например, декстран 40, декстран 70, желатин, глицерин, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксиметилпропилцеллюлоза, ланолин, метилцеллюлоза, вазелин, полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, карбоксиметилцеллюлоза; и т.п.

В одном из вариантов осуществления композицию, фармацевтическую композицию или лекарственное средство согласно изобретению следует вводить системно или местно.

В одном из вариантов осуществления композицию, фармацевтическую композицию или лекарственное средство согласно изобретению следует вводить перорально, путем инъекции, местно, назально, буккально, ректально, вагинально, внутритрахеально, путем эндоскопии, трансмукозально и путем чрескожного введения.

В одном из вариантов осуществления изобретения композицию, фармацевтическую композицию или лекарственное средство согласно изобретению предпочтительно вводят путем инъекции, предпочтительно системной инъекции. Примеры составов, приспособленных для системной инъекции, включают без ограничения жидкие растворы или суспензии, твердые формы, применимые для растворения или суспендировании в жидкости перед инъекцией. Примеры системных инъекций включают без ограничения внутривенную, подкожную, внутримышечную, внутрикожную и внутрибрюшинную инъекцию и перфузию. В другом варианте осуществления композиция, фармацевтическая композиция или лекарственное средство согласно изобретению являются стерильными при введении. Способы получения стерильной фармацевтической композиции включают без ограничения стандарт GMP ("надлежащей производственной практики").

В другом варианте осуществления композицию, фармацевтическую композицию или лекарственное средство согласно изобретению вводят перорально. Примеры составов, приспособленных для перорального введения, включают без ограничения твердые формы, жидкие формы и гели. Примеры твердых форм, приспособленных для перорального введения, включают без ограничения пилюлю, таблетку, капсулу, мягкую желатиновую капсулу, твердую желатиновую капсулу, таблетку в виде капсулы, прессованную таблетку, саше, пастилку, пилюлю с сахарным покрытием, таблетку с сахарным покрытием или рассасывающуюся/или распадающуюся таблетку, порошок, твердые формы, применимые для растворения или суспендирования в жидкости до перорального введения, и шипучую таблетку. Примерами жидкой формы, приспособленной для перорального введения, являются без ограничения растворы, суспензии, питьевые растворы, эликсиры, запечатанный пузырек, микстура, ороситель, сироп и водный раствор.

В другом варианте осуществления композицию, фармацевтическую композицию или лекарственное средство согласно изобретению вводят местно. Примеры составов, приспособленных для местного введения, включают без ограничения карандаши, помады, воски, кремы, лосьоны, мази, бальзамы, гели, глянцы, солнцезащитные средства, косметику, маски, несмываемые моющие или очищающие средства, депиляционные препараты и/или т.п.

Местное введение характеризует доставку, введение или применение композиции, фармацевтической композиции или лекарственного средства согласно изобретению непосредственно на интересующем участке с целью локализованного действия (обычно на одной или нескольких открытых или наружных поверхностях, таких как наружный слой эпидермиса, который обнажен и визуально различим), например, с помощью рук, пальцев или разнообразных аппликаторов (роликовых или других карандашей, трубчатых контейнеров, ватных тампонов, пуховок, ватных палочек, распылителей, щеток, матов, тканей и/или т.п.). Нанесение может осуществляться, например, путем накладывания ровным слоем, размещения, растирания, омывания, разливания, распределения и/или втирания в кожу или на нее или любым другим удобным или применимым способом. Местное введение предпочтительно осуществляется без какого-либо значительного всасывания компонентов композиции в кровоток субъекта (во избежание системного эффекта).

Композиция, фармацевтическая композиция или лекарственное средство согласно изобретению согласно изобретению могут представлять собой смесь в виде белого, гладкого, однородного, непрозрачного крема или лосьона, например, с 1% или 2% (по весу) бензиловым спиртом в качестве консерванта, эмульгирующим воском, глицерином, изопропилпальмитатом, молочной кислотой, очищенной водой и раствором сорбита. Кроме того, композиции могут содержать полиэтиленгликоль 400. Они могут представлять собой смеси в виде мазей, например, с 2% (по весу) бензиловым спиртом в качестве консерванта, белым вазелином, эмульгирующим воском и теноксом II (бутилированным гидроксианизолом, пропилгаллатом, лимонной кислотой, пропиленгликолем). Композициями в виде раствора, лосьона, крема, мази или в другой форме, которая также может использоваться для местного применения, могут быть пропитаны тампоны из тканого материала или рулоны перевязочного материала, например, марли.

Одной из задач настоящего изобретения является создание косметической композиции, содержащей ингибитор согласно изобретению.

Другой задачей изобретения является создание космецевтической композиции, содержащей ингибитор согласно изобретению.

В другом варианте осуществления композиция согласно изобретению может также применяться местно с использованием чрескожной системы, такой как система из полимерного клея на акриловой основе со смолистым сшивающим агентом, пропитанным композицией и наслоенным на непроницаемую подложку.

В одном из вариантов осуществления композиция согласно настоящему изобретению может вводиться в виде чрескожного пластыря, более точно, в виде чрескожного пластыря с замедленным высвобождением. Чрескожные пластыри могут иметь любую традиционную форму, такую как, например, адгезивная матрица, полимерная матрица, пластырь-депо, матричная или монолитная слоистая структура, и обычно состоят из одного или нескольких слоев подложки, адгезивов, усилителей проникновения, необязательной регулирующей скорость высвобождения мембраны и разделительной прокладки, которая удаляется, чтобы обнажить клеи перед нанесением. Полимерные матричные пластыри также содержат материал, образующий полимерную матрицу. Применимые чрескожные пластыри более подробно описаны, например, в патентах US 5262165; 5948433; 6010715 и 6071531, содержание каждого из которых во всей полноте включено в настоящую заявку.

Примеры составов, приспособленных для чрескожного введения, включают без ограничения мазь, пасту, крем, пленку, бальзам, пластырь, такой как, например, чрескожный пластырь, гель, липосомальные формы и т.п.

В одном из вариантов осуществления чрескожная композиция представляет собой мазь, пасту, крем; пленку, бальзам, пластырь, такой как, например, чрескожный пластырь, гель, липосомальные формы или т.п.

В одном из вариантов осуществления изобретения мазь представляет собой маслянистую мазь; эмульгированную мазь, такую как, например, масло в воде или вода в масле; или водорастворимую мазь, предпочтительно представляет собой маслянистую мазь.

В одном из вариантов осуществления изобретения в маслянистой мази используются такие основы, как, например, растительные и животные масла; растительные и животные жиры; воски; вазелин, такой как, например, белый вазелин или вазелиновое масло; и парафин, такой как, например, жидкий парафин или парафиновое масло.

В одном из вариантов осуществления изобретения чрескожная композиция дополнительно содержит один или несколько эксципиентов. Применимые фармацевтически приемлемые эксципиенты хорошо известны специалистам. Примеры применимых эксципиентов включают без ограничения носители, эмульгаторы, повышающие жесткость средства, модификаторы реологии или загустители, поверхностно-активные вещества, смягчающие вещества, консерванты, увлажнители, буферные средства, растворители, увлажняющие средства и стабилизаторы.

В другом варианте осуществления конкретным путем введения может являться внутриглазной путь. В другом варианте осуществления путем введения может являться местное внутриглазное введение, такое как, например, введение глазных капель или орошение глаз офтальмологическим раствором, содержащим ингибитор согласно изобретению.

Офтальмологическим раствором являются стерильные жидкие, полутвердые или твердые препараты, предназначенные для введения на глазное яблоко и/или в конъюнктиву или для введения в конъюнктивальный мешок или в задний сегмент глаза. Используемый термин "задний сегмент глаза" относится к задним двум третям глаза, содержащим переднюю мембрану стекловидного тела и расположенные позади нее структуры (стекловидное тело, сетчатку, сосудистую оболочку, зрительный нерв). В частности, офтальмологическая композиция может вводиться в стекловидное тело, например, путем интравитреальной инъекции. Примеры офтальмологических композиций включают без ограничения глазные капли, лосьоны для глаз, порошки для глазных капель, порошки для глазных лосьонов и композиции для инъекции в конъюнктивальный мешок или в стекловидное тело.

Примеры носителей включают без ограничения воду; забуференный физиологический раствор; вазелин, также известный как белый мягкий парафин); петролатум; масла, такие как, например, минеральное масло, растительное масло, животное масло, парафиновое масло, касторовое масло или вазелиновое масло; органические и неорганические воски, такие как, например, микрокристаллический, парафиновый, пчелиный воск и земляной воск; природные полимеры, такие как, например, ксантоны, желатин, целлюлоза, коллаген, крахмал или гуммиарабик; синтетические полимеры; спирты; полиолы; и т.п. В одном из вариантов осуществления изобретения носителем является крем основы, содержащий эмульгатор, ингредиент в масляной фазе и ингредиент в водной фазе.

Примеры хорошо известных экспициентов на основе мази или лосьона включают без ограничения вазелин, Plastibase™ (который является основой, полученной из полиэтилена (со средней молекулярной массой около 21000 Да) и жидкого парафина) или ESMA-P™ (изготовленный из микрокристаллического воска).

Примеры эмульгаторов включают без ограничения цетиловый спирт; цитостеариловый спирт; стеариловый спирт; карбоксиполиметилен; поликарбофил; полиэтиленгликоль и их производные; полиоксиэтилен и его производные, такие как, например, полисорбат 20 или полисорбат 80, отдельно или в сочетании с жирными спиртами, такими как, например, цетиловый спирт, стеариловый спирт и кетостеариловый спирт; и сорбитановые сложные эфиры, такие как, например, сложный эфир сорбитановой кислоты жирного ряда.

Примеры ингредиента в масляной фазе включают без ограничения вазелин, такой как, например, белый вазелин, желтый вазелин или вазелиновое масло; парафин, такой как, например, жидкий парафин или парафиновое масло; диметикон и их смеси.

Примеры ингредиентов в водной фазе включают без ограничения воду, глицерин и пропиленгликоль.

Примеры повышающих жесткость средств включают без ограничения стеариловый спирт, цетостеариловый спирт и цетиловый спирт.

Примеры модификаторов реологии или загустителей включают без ограничения карбомеры, такие как, например, Carbopol® и полиоксиэтиленовые таловые амины, такие как, например, Ethomeen®.

Примеры поверхностно-активных веществ включают без ограничения анионные, катионные, амфотерные и неионные поверхностно-активные вещества, такие как, например, лаурилсульфат натрия, цетостеариловый спирт, цетиловый спирт, лаурилсульфат магния, воск или их сочетание.

Примеры смягчающих средств включают без ограничения белый или желтый вазелин (белый или желтый вазелин), жидкий петролатум (жидкий вазелин), парафин или аквафор.

Примеры консервантов включают без ограничения антимикробные консерванты, такие как, например, нипагин (метилгидроксибензоат), нипазол (гидроксибензоат), бутилпарабен, этилпарабен, метилпарабен, калия пропилпарабен, натрия пропилпарабен; сложные эфиры парагидроксибензоата; сорбиновую кислоту; сорбат калия; бензойную кислоту; парабены; хлорбутанол; фенол; тимерозал; бензоат натрия и бензиловый спирт.

Примеры увлажнителей включают без ограничения пропиленгликоль и альгинат пропиленгликоля.

Примеры буферных средств включают без ограничения гидроксид натрия, лимонную кислоту и гидроксид калия.

Примеры растворителей включают без ограничения воду, изопропанол, бензиловый спирт и пропиленгликоль.

Примеры увлажняющих средств включают без ограничения глицерин, минеральное масло, отвержденное полиоксиэтиленовое касторовое масло и вазелин, пропиленгликоль; парафины; воски, такие как, например, пчелиный воск; полиэтиленгликоли или их смеси, такие как, например, макрогол (макроголом является смесь полиэтиленгликолей с различной молекулярной массой); стеариловый спирт; бензиловый спирт; сложные эфиры парагидроксибензойной кислоты (парабены); гелеобразный углеводород; лимонную кислоту; сквален; ланолины; глицерин; отвержденное полиоксиэтиленовое касторовое масло; сложный эфир сорбитановой кислоты жирного ряда, сложный эфир глицериновой кислоты жирного ряда; животные и растительные жиры; масла; крахмал; трагакант; производные целлюлозы; кремнийорганические соединения; бентониты; кремниевую кислоту; тальк; оксид цинка и их смеси.

Примеры стабилизаторов включают без ограничения углеводы, такие как, например, сахароза, лактоза и трегалоза; сахарные спирты, такие как, например, маннит и сорбит; аминокислоты, такие как, например, гистидин, глицин, фенилаланин и аргинин.

В одном из вариантов осуществления изобретения композиция, фармацевтическая композиция или лекарственное средство согласно изобретению могут применяться в сочетании с системами доставки, которые облегчают доставку средств в центральную нервную систему. Например, для временного и обратимого повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера для терапевтического средства могут использоваться различные усилители проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Такие усилители проницаемости ГЭБ включают без ограничения лейкотриены, агонисты брадикинина, гистамин, разрушители плотных соединений (например, зонулин, зот), гиперосмотические растворы (например, маннит), средства сжатия цитоскелета и короткоцепочечные алкилглицерины (например, 1-O-пентилглицерин). Доставку активного средства в центральную нервную систему могут обеспечивать пероральные, сублингвальные, парентеральные, имплантационные, назальные и ингаляционные пути. В некоторых вариантах осуществления соединения согласно настоящему изобретению могут вводиться в центральную нервную систему с минимальным воздействием на периферическую нервную систему.

Гематоэнцефалическим барьером (ГЭБ) является физический барьер и система механизмов клеточного транспорта между кровеносными сосудами центральной нервной системы (ЦНС) и большинством областей самой ЦНС. ГЭБ поддерживает гомеостаз, ограничивая проникновение потенциально вредных химических веществ из крови и позволяя проникать необходимым питательным веществам. Однако ГЭБ может представлять собой серьезный барьер для доставки фармакологических средств в ЦНС с целью лечения нарушений или поддержания или улучшения нормальных и желательных функций мозга, таких как познание, обучение и память.

В одном из вариантов осуществления вводят ингибитор, композицию, фармацевтическую композицию или лекарственное средство в форме с пролонгированным высвобождением. В другом варианте осуществления композиция, фармацевтическая композиция или лекарственное средство содержат систему доставки, которая контролирует высвобождение модулятора.

В одном из вариантов осуществления вводят ингибитор, композицию, фармацевтическую композицию или лекарственное средство согласно изобретению в дозе, определенной специалистом в данной области техники и индивидуально приспособленной к каждому субъекту.

Ясно, что решение об общем ежедневном применении ингибитора, композиции, фармацевтической композиции и лекарственного средства согласно настоящему изобретению принимается лечащим врачом на основании обоснованного медицинского заключения. Конкретное терапевтически эффективное количество для любого конкретного пациента будет зависеть от разнообразных факторов, включающих заболевание и степень его тяжести; конкретную применяемую композицию, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и пищевой рацион субъекта; время введения, способ введения, продолжительность лечения; препараты, используемые в комбинации или одновременно с применяемым полипептидном или последовательностью нуклеиновых кислот; и подобные факторы, хорошо известные в медицине. Например, хорошо известно, что можно начинать с введения доз терапевтического соединения на уровнях ниже, чем требуются для достижения желаемого терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозировку до достижения желаемого эффекта; и, наоборот, точно также можно начинать введения с нагрузочной дозы, чтобы быстрее достичь установившейся концентрации в плазме, а затем продолжать вводить поддерживающую дозу, рассчитанной таким образом, чтобы точно компенсировать эффекта процесса выведения из организма.

В одном из вариантов осуществления терапевтически эффективное количество ингибитора, композиции, фармацевтической композиции или лекарственного средства согласно изобретению вводят, по меньшей мере, один раз в день, два раза в день, по меньшей мере, три раза в день.

В другом варианте осуществления терапевтически эффективное количество ингибитора, композиции, фармацевтической композиции или лекарственного средства согласно изобретению вводят каждые два, три, четыре, пять, шесть дней

В другом варианте осуществления терапевтически эффективное количество ингибитора, композиции, фармацевтической композиции или лекарственного средства согласно изобретению вводят два раза в неделю, каждую неделю, каждые две недели, один раз в месяц.

В одном из вариантов осуществления изобретения суточное количество ингибитора, композиции, вводимой субъекту, составляет от около 2 мг/день до около 2000 мг/день, от около 2 мг/день до около 1500 мг/день, от около 2 мг/день до около 1000 мг/день, от около 2 мг/день до около 500 мг/день, от около 2 мг/день до около 200 мг/день, от около 5 мг/день до около 2000 мг/день, от около 5 мг/день до около 1500 мг/день, от около 5 мг/день до около 1000 мг/день, от около 5 мг/день до около 500 мг/день, от около 5 мг/день до около 200 мг/день, от около 10 мг/день до около 2000 мг/день, от около 10 мг/день до около 1500 мг/день, от около 10 мг/день до около 1000 мг/день, от около 10 мг/день до около 500 мг/день, от около 10 мг/день до около 200 мг/день.

В одном из вариантов осуществления изобретения суточное количество ингибитора, композиции, вводимой субъекту, составляет от около 1 мг/кг/день до около 20 мг/кг/день, от около 1 мг/кг/день до около 15 мг/кг/день, от около 1 мг/кг/день до около 12 мг/кг/день, от около 1 мг/кг/день до около 10 мг/кг/день, от около 1 мг/кг/день до около 9 мг/кг/день, от около 1 мг/кг/день до около 8 мг/кг/день, от около 1 мг/кг/день до около 7 мг/кг/день.

В другом варианте осуществления ингибитор, композиция согласно изобретению должны вводиться в количестве от около 5 до около 2000 мг, от около 5 мг до около 1500 мг, от около 5 мг до около 1000 мг, от около 5 мг до около 500 мг, от около 5 мг до около 200 мг.

В одном из вариантов осуществления способ согласно изобретению предназначен для хронического лечения. В другом варианте осуществления способ согласно изобретению предназначен для неотложного лечения.

В одном из вариантов осуществления изобретения у субъекта диагностировано заболевание, связанное со свободными радикалами кислорода. В другом варианте осуществления изобретения у субъекта существует риск развития заболевания, связанного со свободными радикалами кислорода.

В одном из вариантов осуществления таким субъектом является взрослый, подросток, ребенок, маленький ребенок или новорожденный.

Другой задачей изобретения является создание среды для сохранения, содержащей ингибитор согласно изобретению.

В одном из вариантов осуществления среда для сохранения предназначена для сохранения органов. В одном из вариантов осуществления органы включают без ограничения сердце, печень, почки, легкие, поджелудочную железу, кишечник. В одном из вариантов осуществления органы предназначены для трансплантации.

В одном из вариантов осуществления среда для сохранения содержит ингибитор согласно изобретению в концентрации от 5 мкМ до 120 мкМ, т.е. в концентрации около 5 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ, 50 мкМ, 80 мкМ, 100 мкМ или 120 мкМ.

Другой задачей настоящего изобретения является создание способа ингибирования образования свободных радикалов кислорода у нуждающегося в этом субъекта путем воздействия на митохондрии на участке I_Q комплекса I, включающего введение субъекту эффективного количества ингибитора активных форм кислорода.

Другой задачей настоящего изобретения является создание способа лечения связанных со старением заболеваний у нуждающегося в этом субъекта путем воздействия на митохондрии на участке I_Q комплекса I, включающего введение субъекту эффективного количества ингибитора активных форм кислорода.

Другой задачей настоящего изобретения является создание способа ингибирования образования свободных активных форм кислорода у нуждающегося в этом субъекта без ингибирования продукции цитозольных АФК, включающего введение субъекту эффективного количества ингибитора активных форм кислорода.

Другой задачей настоящего изобретения является создание способа увеличения секреции инсулина у нуждающегося в этом субъекта путем воздействия на митохондрии на участке I_Q комплекса I, включающего введение субъекту эффективного количества ингибитора продукции активных форм кислорода, как описано выше.

Другой задачей настоящего изобретения является создание способа защиты нейронов у нуждающегося в этом субъекта путем воздействия на митохондрии на участке I_Q комплекса I, включающего введение субъекту эффективного количества ингибитора продукции активных форм кислорода, как описано выше.

Другой задачей настоящего изобретения является создание ингибитора образования митохондриальных активных форм кислорода с целью лечения, по меньшей мере, одного заболевания, связанного со свободными радикалами кислорода.

Другой задачей настоящего изобретения является применение ингибитора продукции митохондриальных активных форм кислорода с целью лечения, по меньшей мере, одного заболевания, связанного со свободными радикалами кислорода.

Другой задачей настоящего изобретения является применение ингибитора продукции митохондриальных активных форм кислорода с целью изготовления лекарственного средства для лечения, по меньшей мере, одного заболевания, связанного со свободными радикалами кислорода.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 проиллюстрировано отсутствие эффекта AOL в отношении митохондриального дыхания. Панель А: после инкубации в присутствии AOL (20 мкМ в этом примере) митохондрии, выделенные из сердца крыс, окисляли глутамат + малат (GM) в качестве субстрата. Инициировали фосфорилирование аденозиндифосфатом (ADP) и прекратили атрактилозидом (ATR), специфическим ингибитором транслокатора адениновых нуклеотидов. Панели B-D: классическое исследование митохондриального окислительного фосфорилирования в присутствии различных респираторных субстратов по мере возрастания концентраций AOL (от 5 до 80 мкМ). Не наблюдалось статистических различий в митохондриальном дыхании при различных энергетических состояниях после добавления AOL. Скорость окисления после добавления ADP отражает активность синтеза аденозинтрифосфата (АТР) выделенными митохондриями.

На фиг. 2 представлены основные участки продукции активных форм кислорода выделенными митохондриями в присутствии субстратов обоих комплексов I и III при ингибировании с помощью АТР (состояние 4) с целью достижения максимальной продукции митохондриальных АФК. Как указано ранее, продукция митохондриальных АФК в большой степени зависит от активности и состояний митохондрий. Хотя AOL был испытан в многочисленных условиях, для ясности было решено представить только наиболее показательные результаты. Присутствие всех субстратов (т.е. глутамат + малат + сукцинат), обеспечивающих электронам всю цепь, является наиболее близким к условиям in situ в клетке. В этих условиях было оценено влияние присутствия AOL на продукцию АФК полной цепью при ингибировании с помощью ATR (ингибирование фосфорилирования: максимальная продукция), а также комплексом I (ингибированным ротеноном) и комплексом II (ингибированным антимицином А). Цвета относятся к фиг. 3.

На фиг. 3 показан эффект AOL (5-80 мкМ) в отношении продукции АФК/H₂O₂ выделенными митохондриями в присутствии субстратов комплексов I и II при ингибировании с помощью ATR (состояние 4), влияние ротенона, антимицина А и миксотиазола. В отсутствие специфических ингибиторов комплексов продукция АФК достигает максимума, и его источником в основном является обратный перенос электронов на участке I_Q (смотри фиг. 4). После добавления ротенона, который специфически реверсирует перенос электронов путем ингибирования I_Q, продукция уменьшается и почти полностью происходит на участке III_QO. Последующее добавление антимицина А, который блокирует перенос электронов в кислород, увеличивает продукцию АФК на участке III_QO и, наконец, миксотиазол блокирует продукцию АФК на участке III_QO (подробнее смотри фиг. 2).

На фиг. 4 схематически показано место воздействия AOL на продукцию АФК митохондрий и места, где воздействие AOL отсутствует или является слабым.

На фиг. 5 показана гистограмма, иллюстрирующая эффект 10 мкМ и 20 мкМ AOL в отношении стимулированной глюкозой секреции инсулина (СГСИ) на выделенных кусочках тканей самцов мышей линии C57B1/6J. Представлено сочетание трех экспериментов с использованием кусочков тканей двух мышей в каждом эксперименте; пяти кусочков тканей на лунку; от четырех до шести лунок для каждого условия. Нормализовали данные секреции инсулина к 11 мМ группы Glc-Veh, которая была принята за 100%. *р<0,05, **р<0,01 и ***р<0,001 против 3 мМ Glc-Veh; #р<0,05, ##р<0,01 и ###р<0,001 против 11 мМ Glc-Veh; однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Бонферрони.

На фиг. 6 показана гистограмма, иллюстрирующая жировую массу, определенную после 3 недель лечения. Жировая масса указана в граммах (г). Данные представлены как среднее значение ± SEM.

На фиг. 7 показана гистограмма, иллюстрирующая безжировую массу, определенную после 3 недель лечения. Безжировая масса указана в граммах (г). Данные представлены как среднее значение ± SEM.

На фиг. 8 показан график, иллюстрирующий эффект AOL при хроническом лечении (5 мг/кг и 10 мг/кг) в отношении реакции на глюкозы во время теста на толерантность к инсулину (ITT). График показывает изменения уровня глюкозы в крови во время ITT. Данные представлены как среднее значение ± SEM.

На фиг. 9 показана гистограмма, иллюстрирующая эффект AOL в отношении уровней глюкозы в крови. Определили уровень глюкозы в крови натощак у двух мышей через пять недель лечения. Данные представлены как среднее значение ± SEM.

На фиг. 10 показана гистограмма, иллюстрирующая нейропротекторный эффект AOL (5 мг/кг в течение 11 дней) в отношении количества ТН-положительных клеток в SN у мышей, получавших МРТР. Данные представлены как среднее значение ± SEM (n=10-11) и проанализированы путем однофакторного дисперсионного анализа с использованием повторных измерений и затем критерия множественного сравнения Даннета. **р<0,01; ***р<0,001 в сравнении с МРТР + носитель.

На фиг. 11 показан график, иллюстрирующая эффект AOL в отношении восстановления сократимости сердца во время фазы реперфузии после ишемии. Данные представлены как среднее значение ± SEM для контрольной группы (черный цвет) и группы, получавшей AOL (серый цвет) в 6 независимых экспериментах.

На фиг. 12 показан график, иллюстрирующая эффект AOL в отношении размера инфаркта на срезах пораженных ишемией сердец. В конце периода реперфузии окрасили сердца хлористым трифенилтетразолием (ТТС). Живая ткань выглядит красной, а поврежденная ткань выглядит белой.

На фиг. 13 показан набор из двух графиков, иллюстрирующих эффект AOL при лечении давления в легочной артерии и ремоделирования сердца. Группа А: эффект AOL (заштрихованные столбцы) в отношении среднего давления в легочной артерии (mPAP), измеренного у крыс в состоянии нормоксии (N, белые столбцы), крысы с хронической гипоксией (СН, светлосерые столбцы) и крыс, получавших монокроталин (МСТ, темно-серые столбцы). Панель В: гипертрофия правого желудочка, представленная как индекс Фултона (то есть отношение веса правого желудочка (RV) к весу левого желудочка плюс вес перегородки (LV + S)). n означает число крыс.*, ** и *** означают значимое различие при Р<0,05, 0,01 и 0,0001 соответственно, в сравнении с N. ### означает значимое различие при Р<0,05 в сравнении с СН. и означают значимое различие при Р<0,05 и 0,01, соответственно, в сравнении с N + AOL. означают значимое различие при Р<0,05 в сравнению с МСТ.

На фиг. 14 показан собой набор графиков, иллюстрирующих эффект AOL в отношении ремоделирования легочных артерий (РА). Оценили эффект AOL (заштрихованные столбы) в отношении ремоделирования РА путем измерения процента средней толщины РА у крыс состоянии нормоксии (N, белые столбцы), крысы с хронической гипоксией (СН, светло-серые столбцы) и крыс, получавших монокроталин (МСТ, темно-серые столбцы). Разделили интраацинарные артерии, наблюдаемые с целью оценки ремоделирования ПА, на три группы с различными диаметрами поперечного сечения (панель А: менее 50 мкм, панель В: от 50 до 100 мкм, панель С: от 100 до 150 мкм). n означает число сосудов. *, ** и *** означают значимое различие при Р<0,05, 0,01 и 0,0001 соответственно, в сравнении с N. ## и ### означают значимое различие при Р<0,01 и 0,0001 в сравнении с СН. и означают значимое различие при Р<0,05 и 0,01, соответственно, в сравнении с N + AOL. означают значимое различие при Р<0,05 в сравнению с МСТ.

На фиг. 15 показан набор графиков, иллюстрирующих эффект AOL в отношении толщины наружного ядерного слоя (ONL) сетчатки при прогрессирующей светоиндуцированной дегенерации сетчатки. Панель А: эффект носителя и AOL в отношении животных без перемещения из одних условий в другие. Животные содержались в условиях циклической малоинтенсивной освещенности и в течение 7 дней три раза в день получали инъекции носителя или AOL. Через 15 дней после окончания лечения провели гистологический анализ сетчатки. Данные представлены как среднее значение ± SEM толщины ONL у не получавших лечения животных (светлосерые квадратные точки), получавших носитель животных (темно-серые треугольные точки) и получавших AOL животных (черные круглые точки) в мкм от зрительного нерва и через каждые 0,39 мм на верхнем и нижнем полюсах диска зрительного нерва. Панель В: эффект носителя и AOL в отношении животных с перемещением из одних условий в другие. Животные содержались в условиях циклической малоинтенсивной освещенности и были на 7 суток перемещены в условия циклической высокоинтенсивной освещенности, в течение которых они три раза в день получали инъекции носителя или AOL. По окончании лечения вернули животных в условия циклической малоинтенсивной освещенности, и через пятнадцать дней провели гистологический анализ сетчатки. Данные представлены как среднее значение ± SEM толщины ONL у не получавших лечения животных (светлосерые квадратные точки), получавших носитель животных (темно-серые треугольные точки) и получавших AOL животных (черные круглые точки) в мкм от зрительного нерва и через каждые 0,39 мм на верхнем и нижнем полюсах диска зрительного нерва.

На фиг. 16 показан набор графиков, иллюстрирующих исследование продолжительности жизни на четырех группах нокаутных по кодирующему SOD2 гену мышей (WT-KOL: мыши дикого типа, получавшие носитель, WT-AOL: мыши дикого типа, получавшие AOL, KO-KOL: нокаутные по кодирующему SOD2 гену мыши, получавшие носитель, KO-AOL: нокаутные по кодирующему SOD2 гену мыши, получавшие AOL). Данные представлены как средние значения. Панель А: изменение массы тела мышей в граммах с течением времени в днях. Панель В: масса тела мышей с поправкой на исходные данные в процентах увеличения массы с течением времени в днях. Панель С: выживаемость в группах KO-KOL и KO-AOL в процентах с течением времени в днях.

На фиг. 17 показан график, иллюстрирующий активность сукцинатдегидрогеназа (SDH) в сердце, на пяти группах мышей (WT-KOL: мыши дикого типа, получавшие носитель, WT-AOL: мыши дикого типа, получавшие AOL, KO-KOL: нокаутные по кодирующему SOD2 гену мыши, получавшие носитель, KO-AOL: нокаутные по кодирующему SOD2 гену мыши, получавшие AOL, WT: не получавшие лечения мыши дикого типа). Измерили оптическую плотность реакции SDH, отобранной из срезов сердца, с помощью программного обеспечения Image Analyst MKII (Akos). Представили эту плотность как средний уровень серого, при этом средний уровень серого равен измеренной сумме серого/числу пикселей. Данные представлены как средние значения измеренной оптической плотности.

Фиг. 18 показан собой набор графиков, иллюстрирующих окрашивание масляным красным красителем О срезов печени мышей дикого типа и нокаутных по кодирующему SOD2 гену мышей, получавших или не получавших AOL. Гистограмма отображает средний размер липидных капель (панель А), плотность капель (число капель/область печени) (панель В) и общую площадь липидов (средний размер х число капель) (панель С).

Примеры

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами.

Пример 1. Отсутствие влияния AOL на митохондриальное окислительное фосфорилирование.

Материалы и методы

Все описанные эксперименты проводились в соответствии с Руководством Национального и Европейского исследовательского совета по уходу и использованию лабораторных животных. Р. Diolez имеет действующую лицензию на проведение экспериментов с животными, выданную ветеринарной службой охраны здоровья и защиты животных Министерства сельского хозяйства и промышленности Франции (17.03.1999, номер лицензии 3308010).

Материалы

Все химические вещества являлись реагентами, приобретенными у компании Sigma Chemical (Сент-Луис, штат Миссури, США), за исключением сахарозы и NADH-оксидазы (которые были получены от компании Merck (Дармштадт, Германия)). Соединение тритиоанетол (AOL) получено в дар от частной компании GMPO (Париж, Франция). Из него был получен 15 мМ исходных раствор в ДМСО, который хранили в темноте при 0°С в течение всего нескольких дней.

Выделение митохондрий

Оглушили самцов крыс линии Вистар (250-325 г, полученных от Janvier Labs, Ле Женес-Сент-Иль, Франция) и умертвили путем смещения шейных позвонков, быстро извлекли сердце и промыли в холодной разделительной среде, содержащей 100 мМ сахарозы, 180 мМ KCl, 50 мМ Трис, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ ЭДТК и 0,1% (в отношении веса к объему) обезжиренного БСА (рН 7,2).

Выделили митохондрий сердца в холодной камере. Перед гомогенизацией измельчили сердца (около 1,5 г) с помощью ножниц и в течение 5 мин выдержали в 5 мл той же среды, дополненной протеазой (2 мг бактериальной протеиназы типа XXIV на мл изолирующего буфера), с перемешиванием. Вылили суспензию ткани в 50 мл стеклянный гомогенизатор Potter, разбавили 20 мл изолирующего буфера, а затем в течение 3 минут гомогенизировали с использованием тефлонового пестика с электроприводом. Профильтровали гомогенат через ткань для сит (Sefar Nitex) с целью удаления мусора и в течение 10 минут центрифугировали при ускорении 8000 g. Промыли полученный осадок 5 мл изолирующего буфера, повторно суспендировали в 25 мл того же буфера, а затем в течение 8 минут подвергали низкоскоростному центрифугированию (400 г). В течение 15 минут дважды центрифугировали полученный супернатант при ускорении 7000 g, и получили промытый митохондриальный осадок, который осторожно повторно суспендировали в 150 мкл изолирующего буфера. Определили концентрацию белка методом Брэдфорда (Sigma, kit # B6916) с использованием БСА в качестве стандарта. В течение менее 5 часов выдержали митохондрий на льду при конечной концентрации 40-50 мг/мл.

Митохондриальное дыхание

Методом полярографии регистрировали потребление кислорода митохондриями сердца (0,1 мг/мл), инкубированными при отсутствии или в присутствии AOL в возрастающих дозах (с конечной концентрацией от 0 до 80 мкМ), в условиях постоянного перемешиванием при 25°C с использованием оксигемометра высокого разрешения (Oxygraph-2K, Oroboros Instruments, Австрия). Дыхательная среда состояла из 140 мМ сахарозы, 100 мМ KCL, 1 мМ EGTA, 20 мМ MgCl₂, 10 мМ KH₂PO₄ и 1 г/л (в отношении веса к объему) БСА, преимущественно не содержащего без жирных кислот (рН 7,2).

Продукция митохондриальных АФК/Н₂О₂

Оценили скорость продукции АФК/H₂O₂ митохондриями сердца путем окисления бесцветного, не флуоресцентного индикатора Amplex Red в присутствии экзогенной пероксидазы хрена (HRP, ЕС 1.11.1.7, Sigma). H₂O₂ вступает в реакцию с Amplex Red в стехиометрическом соотношении 1:1 с образованием флуоресцентного соединения резоруфин (длина волны возбуждения: 560 нм, длина волны излучения: 585 нм), которое является стабильным после образования. Непрерывно измеряли флуоресценцию спектрофлуориметром, оснащенным регулятором температуры и средством перемешивания (SAFAS Xenius, Monaco). Инкубировали выделенные митохондрии (0,1 мг/мл) в том же экспериментальном буфере, что и ранее, в который добавили 15 мкМ Amplex Red и 10 мкг/мл HRP. В качестве субстратов комплекса I и комплекса II, соответственно, использовали глутамат (5 мМ)/малат (2,5 мМ) вместе с сукцинатом (5 мМ). Эксперименты проводились в условиях без фосфорилирования в присутствии 15 мкМ атрактилозида, т.е. в условиях состояния IV, в котором митохондриальная мембрана является максимальной. После этого последовательно добавили ротенон (1,5 мкМ), Антимицин А (2 мкМ) и миксотиазол (0,2 мкМ) с целью ингибирования окислительно-восстановительных центров в цепи переноса электронов (смотри фиг. 2), а именно участков I_Q, I_F (ротеноном) IIlQi (антимицином А) и III_QO (миксотиазолом). Окончательно откалибровали образцы известными количествами H₂O₂ (кратными 300 нМ) в присутствии всех соответствующих соединений, включая AOL. Провели контрольное испытание тест на отсутствие воздействия AOL на сам образец Amplex Red и продукцию АФК/H₂O₂ NAD(Р)Н-оксидазой при отсутствии митохондрий сердца и в присутствии растворов NAD(P)H-оксидазы (ЕС 1.6.3.3, 5 мЕ/мл, Sigma) и NADH (100 мкМ).

Результаты

Сначала было установлено (фиг. 1), что соединение AOL не влияет непосредственно на окислительное фосфорилирование в выделенных митохондриях из сердца крыс. Это было определено классическим на сегодня методом оксиграфии. Сначала инкубировали митохондрий с AOL в различных концентрациях (от 5 до 80 мкМ), затем добавили дыхательный субстрат (состояние субстрата - черная кривая), а затем насыщающую концентрацию ADP с целью достижения максимальной скорости окислительного фосфорилирования (серая кривая) и, наконец, добавили атрактилозид (ATR), который ингибирует транслокатор ADP/ATP и обеспечивает скорость утечки митохондрий в условиях отсутствия фосфорилирования (фиг. 1А). На остальных панелях на фиг. 1B-D представлены результаты, полученные с использованием различных комбинаций дыхательных субстратов: глутамат + малат, который снабжает электронами комплекс I, сукцинат (+ ротенон), который снабжает электронами комплекс II, и глутамат + малат + сукцинат для снабжения электронами обоих комплексов. Было выбрано это последнее сочетание субстратов, поскольку оно яляется наиболее сходным с условиями in vivo, в которых действует цикла Кребса, и как сукцинат, так и NADH окисляются дыхательной цепью. Полученные результаты показывают, что присутствие AOL в широком диапазоне испытываемых концентраций не вызывало каких-либо статистических различий (фиг. 1), что говорит об отсутствии в этих условиях воздействия AOL на митохондриальное окислительное фосфорилирование, т.е. как на активность дыхательной цепи, так и на синтез АТР, а также на целостность внутренней митохондриальной мембраны (скорость утечки после добавления ATR). Этот последний результат показывает, что AOL не влияет на показатель окислительного фосфорилирования. Все эти результаты подтверждают отсутствие какого-либо документально подтвержденного вредного воздействия AOL на здоровья человека в результате применении этого препарата в течение длительного времени.

Пример 2. Ингибирование AOL продукции супероксида/H₂O₂ митохондриями

Как указано выше, продукция митохондриальных АФК сильно зависит от активности и состояния митохондрий. Хотя было испытано воздействие AOL на продукцию АФК митохондриями во множестве условиях, было решено для ясности представить только наиболее показательные результаты особо специфических эффектов AOL. Как уже говорилось, присутствие сочетания субстратов (т.е. глутамат + малат + сукцинат), снабжающих электронами всю дыхательную цепь, является наиболее репрезентативным из условий in situ в клетке при активном метаболизме. Кроме того, максимальная продукция АФК/H₂O₂ митохондриями происходит не в условиях сильного митохондриального фосфорилирования, а в условиях сильного уменьшения переноса электронов, т.е. низкого или отсутствующего фосфорилирования. Эти условия выполняются в присутствии ATR (ингибирование транслокатора АТР/АДФ с помощью ATR, фиг. 1), и удалось фактически установить, что добавление ATR в условиях насыщающего ADP инициирует продукцию АФК, которая находилась на пределе обнаружения при максимальных условиях фосфорилирования (результаты не показаны). В этих условиях продукция АФК происходит на разных участках дыхательной цепи (Orr и др., 2013). Free Radic. Biol. Med. 65:1047-1059; Quinlan и др., 2013. Redox Biol. 1:304-312) (фиг. 2). Основные участки продукции расположены в комплексах I и III, где происходят большие изменения потенциальной энергии электронов (Balaban и др., 2005. Cell. 120:483-495; Goncalves и др., 2015 Jan 2. J. Biol. Chem. 290(1):209-27), что также обеспечивает перекачку протонов на этих участках.

Была разработана серия титрованных ингибиторов, чтобы расшифровать воздействие AOL на продукцию АФК всей дыхательной цепью в условиях максимальной продукции АФК (фиг. 2Е). При отсутствии специфических ингибиторов комплексов продукция АФК находится на максимуме, и ее источником в основном является обратный транспорт электронов на участке I_Q (фиг. 2А). Крайне важно отметить, что АФК, продуцируемые комплексом I на участке I_Q (участок хинонов) или на участке сайтом If (участок флавинов), доставляются на внутреннюю сторону матрицы внутренней митохондриальной мембраны. После добавления ротенона, который является классическим ингибитором комплекса I и специфически связывает I_Q, продукция АФК сильно уменьшается и почти полностью происходит на участке III_QO, а остающаяся продукция происходит на участке I_f из-за присутствия сложных субстратов комплекса I и продукции NADH, которую не ингибирует ротенон (фиг. 2В). Последующее добавление антимицина А, который является ингибитором переноса электронов в цитохром с, приводит к увеличению соотношения между восстановленным и окисленным хиноном, которое по-прежнему уменьшено за счет активности комплекса II и, следовательно, к сопутствующему увеличению продукции АФК на участке III_QO (фиг. 1C). Наконец, при добавлении миксотиазола, который является ингибитором участка III_QO комплекса III, продукция АФК комплексом III прекращается, а остающаяся малая продукция может быть отнесена на счет участка флавинов комплекса I, для которого не существует известного ингибитора (Goncalves и др., 2015 Jan 2. J. Biol. Chem. 290(1):209-27).

На фиг. 3 проиллюстрировано влияние присутствия возрастающих концентраций AOL (от 5 до 80 мкМ) на продукцию АФК/H₂O₂, измеренную в различных условиях, проиллюстрированных на фиг. 2. Из представленных на фиг. 2 результатов ясно видно, что AOL примерно на 80% влияет на продукцию АФК только при отсутствии ингибитора, но AOL в этом диапазоне концентраций не вызывал каких-либо статистических различий в продукции АФК/H₂O₂, измеренной в других условиях. Как можно видеть на фиг. 2, это конкретное условие (только присутствие ATR) является единственным условием в данном исследовании, когда комплекс I (участок I_Q) продуцирует АФК. При добавлении ротенона продукция АФК/H₂O₂ выглядит невосприимчивой к AOL даже в высоких концентрациях независимо от вовлеченного участка. Явное отсутствие влияние на несколько участков продукции митохондриальных АФК является не только неожиданным, но и ставит интересные вопросы о самом механизме воздействия АОЛ на митохондрии. Действительно, эти результаты исключают основную гипотезу о механизме действия AOL, который описан в предыдущих документах и положен в основу патента на его терапевтическое применение. Эти результаты фактически демонстрируют, что AOL не является поглотителем радикалов, иначе его действие не зависело бы от происхождения АФК. Однако, поскольку ясно, AOL сильно уменьшает продукцию АФК комплексом I на участке I_Q и только на этом участке, существуют доказательства того, что AOL специфически ингибирует продукцию АФК на этом участке.

Хотя этот механизм еще предстоит исследовать, получено доказательство того, что соединение AOL специфически воздействует на митохондриальный комплекс I и избирательно ингибирует продукцию супероксида на убихинонсвязывающем участке комплекса I (участке i_q), не влияя на продукцию супероксида на других участках или на окислительное фосфорилирование. Насколько известно, существует только одно соединение с сопоставимыми свойствами, которое было недавно описано, а именно, N-циклогексил-4-(4-нитрофенокси)бензолсульфонамид (Orr и др., 2013). Free Radic. Biol. Med. 65:1047-1059). Подобно AOL, это соединение не модифицирует активность комплекса I как компонента дыхательной цепи и окислительного фосфорилирования.

Дополнительно испытали специфичность AOL in vitro с помощью системы пероксидазы-Amplex Red, используемой для измерения продукции АФК/H₂O₂ митохондриями, которая фактически измеряет появление H₂O₂ путем окисления Amplex Red до флуоресцентного резоруфина (фиг. 4). При отсутствии митохондрии и добавлении вместо этого системы продукции H₂O₂ в измерительную систему можно было проверить воздействие AOL на эту систему. Это было сделано с использованием предлагаемой на рынке NAD(P)H-оксидазы, которая продуцирует H₂O₂ в присутствии добавленного NAD(P)H, и измерения восстановления Amplex Red до резоруфина (фиг. 4). В этих условиях не наблюдалось какого-либо ингибирования флуоресценции, что исключает любое воздействие AOL на NAD(Р)Н-оксидазу или на активность пероксидазы (результаты не показаны). Эти результаты подтверждают, что AOL не воздействует на измерительную систему и непосредственно не взаимодействует с H₂O₂. Интересно, что эти результаты также демонстрируют, что AOL не ингибирует продукцию АФК/H₂O₂ NADP (Н)-оксидазой, которая является одним из основных немитохондриальных продуцентов АФК/H₂O₂ в клетках. Схема на фиг. 4 суммирует различные данные о механизме воздействия AOL на продукцию АФК/H₂O₂ митохондриями и NAD(P)H-оксидазой и подчеркивает очень высокую продемонстрированную специфичность. Эти результаты резко контрастируют с предыдущими утверждениями о предполагаемом действии AOL как поглотителя радикалов.

При испытании на выделенных митохондриях из сердца крыс AOL эффективно снижает продукцию митохондриальных АФК/H₂O₂ (в выделенных митохондриях H₂O₂ образуется в результате восстановлении АФК митохондриальной супероксиддисмутазой). Однако представленные результаты наглядно демонстрируют, что AOL не действует как простой антиоксидант или поглотитель радикалов. Хотя антиоксиданты являются общими поглотителями АФК/H₂O₂, AOL обладает полной избирательностью в отношении образованию АФК на участке I_Q комплекса I, что демонстрирует, что AOL не просто взаимодействует с супероксидными радикалами, а специфически предотвращает их образование в комплексе I. Соответственно, представляется, что AOL относится к совершенно новому классу средств защиты от окислительного стресса, единственный член которого был совсем недавно описан (Orr и др., 2013, Free Radic. Biol. Med. 65:1047-1059). Если антиоксиданты обычно не препятствуют прямому переносу электронов, поглощая АФК и/или H₂O₂ ниже по потоку места продукции, и, следовательно, никогда не могут полностью подавлять влияние АФК (Orr и др., 2013. Free Radio. Biol. Med. 65:1047-1059), AOL может действовать иначе, предотвращая продукцию АФК и тем самым более активно защищая митохондрии от их собственных АФК.

Более того, представленные данные демонстрируют, что AOL является специфическим ингибитором образования АФК на участке I_Q комплекса I митохондриальной дыхательной цепи. Однако необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы удостовериться в том, что AOL оказывает никакого влияния другие митохондриальные участки, но это не исключает приведенных выше выводов. Нами также представлены некоторые доказательства того, что AOL может взаимодействовать только с митохондриями, не влияя на образование активных форм кислорода в цитозоле и, следовательно, не влияет на внутриклеточную сигнализацию.

Ингибирование активности комплекса I ротеноном или нейротоксином МРР⁺ связывали с паркинсонизмом у грызунов и людей, что предполагало связь между нарушением функций комплекса I, продукцией АФК и нейродегенерацией (Langston и др., 1983. Science. 219:979-980; Betarbet и др., 2000. Nat. Neurosci. 3:1301-1306). Напротив, сравнительный анализ показывает обратную зависимость между максимальной продукцией супероксида/H₂O₂ на участке I_Q, но не на участке I_F, и максимальным сроком жизни у позвоночных различных видов (Lambert и др., 2007.

Aging Cell. 6:607-618; Lambert и др. 2010. Aging Cell. 9:78-91). Соответственно, избирательные модуляторы продукции супероксида/H₂O₂ с на участке I_Q или участке I_F обеспечили бы уникальные возможности исследования предполагаемой роли продукции митохондриальных АФК в нормальных и патологических процессах (Orr и др., 2013). Free Radic. Biol. Med. 65:1047-1059). Существуют также некоторые предположения, даже спорные, насчет того, что участок III_Q, не затронутый AOL, играет важную роль в клеточной сигнализации во время гипоксии.

В заключение, представляется, что свойства AOL могут обеспечить прорыв в поиске специфических модуляторов продукции АФК/H₂O₂ в клетках. Это является важной задачей исследований, и AOL имеет огромное преимущество перед вновь открытыми молекулами, поскольку он уже разрешен для применения на человеке.

AOL действует выше по потоку места продукции АФК, обеспечивая тем самым лучшую защиту, чем классические антиоксиданты;

AOL специфически воздействует на продукцию митохондриальных АФК;

AOL обеспечивает защиту митохондрий, имеющую решающее значение при множестве заболеваний, с особенности сердечных;

AOL не мешает клеточной сигнализации;

AOL специфически воздействует на участок I_Q комплекса I, который является основным митохондриальным участком и может быть вовлечен в важные заболевания, включая болезнь Паркинсона и мерцательную аритмию.

Следовательно, AOL может представлять собой первый член нового класса "протекторов", которые специфически предотвращает продукцию АФК внутри митохондрий, и по этой причине может использоваться для защиты митохондрий при различных окислительных стрессах и для предотвращения заболеваний с очень незначительными побочными эффектами в отношении решающей клеточной сигнализации АФК.

Пример 3. Воздействие AOL на сердечно-сосудистое заболевание: диабет

Влияние соединения AOL на стимулированную глюкозой секрецию инсулина (СГСИ) в кусочках ткани поджелудочной железы мышей

Цель исследования состояла в том, чтобы изучить способность соединения AOL модулировать индуцированную глюкозой секрецию инсулина (СГСИ) в выделенных в кусочках ткани поджелудочной железы мышей.

Материалы и методы

Эксперименты проводились в строгом соответствии с рекомендациями Европейского союза (2010/63/EU) и были одобрены Министерством сельского хозяйства и рыболовства Франции (разрешение №3309004) и местным комитетом по этике университета Бордо. Были предприняты максимальные усилия для уменьшения страданий и количества используемых животных.

Было проведено три независимых эксперимента, и в каждом из них умертвили по две мыши, у которых выделили кусочки ткани в соответствии с описанной далее процедурой.

Выделили кусочки ткани поджелудочной железы методом расщепления коллагеназой. Наполнили поджелудочную железу раствором Хэнкса, содержащим 0,33 мг/мл коллагеназы (Sigma-Aldrich), 5,6 мМ глюкозы и 1% бычьего сывороточного альбумина с рН 7,35, удалили и в течение 6-9 минут выдержали при 37°С. После расщепления ткани и удаления экзокринных клеток путем трех последовательных промываний вручную собрали кусочки ткани с использованием бинокулярного увеличителя. Восстановили кусочки ткани после расщепления путем культивирования в течение 20-24 часов в среде RPMI-1640, содержащей 11 мМ глюкозы (Invitrogen, СА, США) и дополненной 2 мМ глутамина, 200 МЕ/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина и 8% эмбриональной бычьей сывороткой, обедненной древесным углем-декстраном (Invitrogen).

Для каждого статического эксперимента с СГСИ кусочки ткани, взятые у двух мышей, сначала в течение 2 часов инкубировали при 37°С в 3 мл раствора бикарбонатного буфера Кребса (в мМ):14 NaCl, 0,45 KCl, 0,25 CaCl₂, 0,1 MgCl₂, 2 HEPES и 3 глюкозы, уравновешенного смесью из 95% 02:5% CO₂ с рН 7,4. Затем перенесли группы из пяти сходных по размеру кусочков ткани в лунки 24-луночного планшета с 0,5 мл свежего буфера, содержащего один из следующих раздражителей: 3 мМ глюкозы (Glc) и 11 мМ глюкозы плюс носитель (0,4% ДМСО в бикарбонатном буфере Кребса) или 11 мМ глюкозы плюс испытываемый разбавленный препарат (10 мкМ или 20 мкМ AOL в носителе), и дополнительно инкубировали в течение 1 часа. Для каждого экспериментального условия использовалось по шесть различных лунок. В конце инкубации добавили в каждую лунку бычий альбумин до конечной концентрации 1%, и в течение 15 минут выдержали планшет при 4°C с целью прекращения секреции инсулина. Затем собрали среду и хранили при -20°C с целью последующего измерения содержания инсулина методом ELISA (комплект производства компании Mercodia, Упсала, Швеция) в соответствии с указаниями производителя. Рассчитали секрецию инсулина в каждой лунке в нанограммах инсулина на кусочек ткани в час инкубации, а затем выразили в процентах секреции инсулина в группе с использованием 11 мМ глюкозы плюс носитель, которая была принята за 100%.

Описание экспериментальных групп представлено в таблице 1.

Результаты

Объединили и усреднили отдельные значения секреции инсулина, полученные в каждом из трех экспериментов. Они выражены как процент секреции инсулина, нормализованный к группе с использованием 11 мМ глюкозы плюс носитель (фиг. 5).

Комбинированный анализ данных показал, что AOL в концентрации как 10 мкМ, так и 20 мкМ улучшает СГСИ со сходной эффективностью, при этом увеличение СГСИ составляет около 65-75% по сравнению с группой с использованием 11 мМ глюкозы плюс носитель (однофакторный дисперсионный анализ; апостериорный критерий Бонферрони). Статистический анализ представлен в Таблице 2.

Вывод:

Исследование демонстрирует, что AOL в испытанных дозах (10 мкМ и 20 мкМ) усиливает СГСИ и значительно стимулирует секрецию инсулина in vitro в выделенных кусочках ткани поджелудочной железы мышей.

Таким образом, эти данные предполагают, что AOL может являться особо применимым при патологических состояниях с дефицитом секреции инсулина.

Влияние хронического лечения с помощью AOL на потребление пищи, массу тела и метаболизм глюкозы у мышей с вызванным пищевым рационом ожирением

Материалы и методы

Цель исследования состояла в том, чтобы определить, изменяет ли соединение AOL в дозах 5 мг/кг и 10 мг/кг, в течение до пяти недель вводимое путем ежедневной внутрибрюшинной инъекции мышам с вызванным пищевым рационом ожирением, получавшим рацион с высоким содержанием жиров, потребление пищи, массу тела, ожирение и метаболизм глюкозы.

Мыши в течение двенадцати недель до начала фармакологического исследования по желанию получали рацион с высоким содержанием жиров (60% калорий за счет жиров, в основном сала). Животные получали AOL или его носитель путем внутрибрюшинного введения и рацион с высоким содержанием жиров в течение всего исследования. Ежедневно измеряли и регистрировали потребление пищи и массу тела в течение до трех недель подряд.

С целью соответствующего распределения мышей по различным экспериментальным группам до начала фармакологического исследования оценили состав их тел in vivo с использованием Echo MRI 900 (EchoMedical Systems, Хьюстон, штат Техас, США) (см. также Cardinal P. и др., 2014 Oct. Mol. Metab. 3(7):705-16; Cardinal P. и др., 2015 Feb. Endocrinology. 156(2):411-8). Измеряли ежедневное потребление пищи и массу тела с помощью весов (модель ТР 1502, Denver Instruments).

Тридцать 7-недельных мышей C57/B16J поступили в лабораторию 25 февраля 2016 года и прошли первый анализ состава тела in vivo (Echo MRI 900, EchoMRI Systems) после 1 недели адаптации к помещению для проведения эксперимента. После этого первого анализа MRI животные в течение двенадцати недель по желанию получали рацион с высоким содержанием жиров. Затем они подверглись второму анализу MRI и были распределены по 3 экспериментальным группам с одинаковой массой и составом тела.

После начала фармакологического лечения (день 1) ежедневно до наступления темноты измеряли потребление пищи (FI) и массу тела (BW) у животных, размещенных в клетке. Ежедневно проверяли потери корма. Рассчитывали потребление корма путем вычитания количества корма, остававшегося в кормушках, из первоначального предварительно взвешенного количества. В течение трех последовательных недель измеряли FI и BW. Затем животные подверглись третьему анализу MRI с целью определить потенциальное влияние содержания на состав тела (изменения в жировой массе и безжировой массе), после чего было проведен исследование на толерантность к глюкозе (GTT) и исследование на толерантность к инсулину (ITT).

Ежедневно в течение общей сложности пяти недель внутрибрюшинно вводили мышам AOL или его носитель, пока они не были умерщвлены.

Для многократной оценки жировой массы и безжировой массы у находящихся в сознании мышей использовался анализатор состава тела (Echo MRI 900, EchoMedical Systems).

GTT и ITT обычно используются для оценки динамической модуляции метаболизма глюкозы, соответственно, во время сахарной нагрузки и инсулиновой нагрузки. Они дают информацию о наличии непереносимости глюкозы и возможной резистентности к действию гормонального инсулина.

Животным путем внутрибрюшинной инъекции ввели 1,5 г/кг D-глюкозы (Sigma-Aldrich) для проведения GTT или 0,5 Ед/кг инсулина (Humulin, Лилли, Франция) для проведения ITT. Животные не получали корма в течение ночи перед GTT и ITT. Исследования проводились следующим утром. Взяли образцы крови из хвостовой вены в различные моменты времени (0, 15, 30, 60, 90 и 120 минут после внутрибрюшинного введения глюкозы или инсулина), и измерили концентрацию глюкозы с использованием глюкозных палочек (OneTouch Vita, Lifescan France, Исси-ле-Мулино, Франция).

После умерщвления собрали образцы крови, быстро оценили уровень глюкозы в крови, используя глюкозные палочки, и затем в течение 15 минут центрифугировали образцы крови со скоростью 3000 об/мин. Хранили полученную плазмупри -80°C с целью последующего измерения инсулина, которое провели методом ELISA (комплект производства компании Mercodia, Упсала, Швеция) в соответствии с указаниями производителя.

Рассчитали индекс HOMA-IR, который дает информацию о наличии резистентности к инсулину, согласно формуле (глюкоза ммоль/л x инсулин Ед/л)/22,5.

Осуществили статистический анализ с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (Сан-Диего, штат Калифорния, США). Провели повторные измерения методом двухфакторного дисперсионного анализа с целью изучения влияния фактора лечения, фактора времени и их взаимодействия на потребление пищи, массу тела, GTT и ITT. Осуществили однофакторный дисперсионный анализ с целью сравнения влияния фактора лечения на совокупный прием пищи, состав тела, площадь под кривой GTT и ITT, а также на уровень глюкозы, инсулина и HOMA-IR в крови на момент умерщвления. Когда результаты дисперсионного анализа являлись значимыми (р<0,05), проводился апостериорный тест Тьюки, чтобы обеспечить соответствующее множество сравнений между группами. Данные представлены как среднее значение ± SEM. Графики создавались с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.

Результаты

Лечение не оказало существенного влияния на массу тела или процент (%) изменения массы тела, рассчитанного со дня 1, когда была измерена масса тела до первого введения AOL.

Через три недели хронического введения AOL жировая масса имела тенденцию уменьшаться (р=0,13, фиг. 6), но это не оказывало какого-либо влияния на безжировую массу (фиг. 7). На фиг. 6 и фиг. 7, представлены средние значения ± SEM, а Таблице 3 и Таблице 4, соответственно, приведен статистический анализ.

AOL в дозе 10 мг/кг значительно притупляет воздействие инсулина на уровни глюкозы в крови во время ITT (фиг. 8), что предполагает наличие резистентности к инсулину. Соответственно, эффект лечения был также обнаружен путем анализа площади под кривой (AUC veh: 12812,50±750,35, AUC AOL 5 мг/кг: 15006,56±1139,69, AUC AOL 10 мг/кг: 18168,33±1562,90, однофакторный дисперсионный анализ F(2, 23)=5,186, р=0,0138), при этом площадь под кривой в группе AOL 10 мг/кг находится значительно выше, чем в группе, получавшей носитель (апостериорный тест Тьюки, р=0,0107). На фиг. 8 представлены средние значения ± SEM, а в Таблице 5 приведен статистический анализ.

Измерили уровень глюкозы в крови не получавших корма в течение 2 часов мышей при умерщвлении после пяти недель лечения.

AOL имел тенденцию снижать уровень глюкозы в крови (фиг. 9) согласно статистическому анализу, приведенному в Таблице 6.

Заключение:

Хроническое ежедневное введение AOL имело тенденцию снижать массу тела и потребление пищи у мышей с вызванным рационом ожирением (данные не показаны). Соответственно, это было связано с тенденцией к снижению жировой массы и базальных уровней глюкозы в крови.

В целом, эти данные предполагают, что AOL может оказывать некоторое благоприятное воздействие на модели алиментарного ожирения.

Пример 4. Воздействие AOL на неврологическое заболевание: болезнь Паркинсона

В этом исследовании оценили потенциальный нейропротекторный эффект AOL путем подсчета количества тирозингидроксилаза-положительных (ТН-положительных) нейронов в черной субстанции (SN) на модели болезни Паркинсона, индуцированной у мышей путем субхронического введения 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МРТР). Мыши в течение 11 дней подряд получали AOL (5 мг/кг, внутрибрюшинно) или носитель. Вводили МРТР (20 мг/кг, внутрибрюшинно) или физиологический раствор в 4-8 дни лечения. Умертвили всех мышей на 12-й день после завершения лечения.

Субхроническое введение МРТР мышам линии С57/bl6 индуцирует дегенерацию нигростернальных дофаминергических нейронов, что приводит к уменьшению числа ТН-положительных нейронов в SN, которое в этом случае составило 39%.

Материалы и методы

Что касается носителя, растворили испытуемое вещество в 0,5% ДМСО/0,95% Твин 20 в физиологическом растворе, и внутрибрюшинно вводили AOL в дозе 5 мг/кг. Объем введения составлял 10 мл/кг.

Содержали самцов мышей линии C57bl/6 (Janvier) весом 22-28 г в помещении с регулируемой температурой в условиях 12-часового цикла чередования света и темноты со свободным доступом к пище и воде. Чтобы предположительно достичь конечных чисел n=10 на группу, использовали n=12 на группу с учетом возможных потерь в ходе эксперимента. С целью достижения нейродегенерации дофаминергических нейронов в черной субстанции вводили мышам гидрохлорид МРТР (20 мг/кг внутрибрюшинно один раз в день в течение пяти дней подряд).

Гуманно умертвили путем смещения шейных позвонков после последнего введения.

В течение 5 дней выдержали каудальную половину головного мозга (содержащую черную субстанцию) в параформальдегиде (4% в 0,1 М забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), рН 7,4), а затем перенесли в 20% сахарозу (20% в 0,1 М PBS) с целью криозащиты. Затем заморозили ткань в холодном изопентане (при температуре -50°С±2°С).

Иссекли полосатые тела, взвесили и мгновенно заморозили по отдельности в сухом льду (при температуре -70°С±10°С). Хранили образцы тканей при температуре -70°С±10°C с целью необязательного анализа допамина и его метаболитов методом ВЭЖХ. Если этого не делалось, полосатые тела уничтожались.

Выполнили серийные фронтальные срезы всего среднего мозга на криостате с интервалом 50 мкм. Собрали свободноплаваюшие срезы из лунок с раствором криопротектора и затем хранили при -20°С до иммуногистохимического исследования ТН.

Осуществили иммуногистохимическое исследование ТН каждого четвертого среза следующим образом. Извлекли срезы ткани из морозильника с температурой -20°С, выдержали до достижения комнатной температуры и затем промыли в растворе PBS. Ингибировали эндогенную пероксидазу путем инкубации в течение 10 минут в PBS, содержащем 0,3% H₂O₂. После этого промыли срезы в PBS, в течение 30 минут инкубировали в PBS с 4% нормальной лошадиной сывороткой (NHS) и 0,3% Triton X-100 с целью блокады неспецифических иммунодоминантных сайтов. Затем в течение ночи инкубировали срезы при комнатной температуре в разбавителе антител + первичное антитело к тирозингидроксилазе (ТН) (выделенное афинное антитело против ТН, Sigma T8700) в разведении 1/10000. Затем тщательно промыли срезы в PBS и в течение 30 минут инкубировали в полимерном реагенте ImmPRESS (Vector MP7401) для визуализации конъюгированного с пероксидазой Ig. После этого тщательно промыли срезы в PBS. Затем обнаружили иммунологическое окрашивание с помощью набора из 3,3'-диаминобензидина (ВАВ)/трис/H₂O₂ (Vector SK4100). Через одну минуту прекратили обнаружение путем нескольких промываний в PBS. Закрепили срезы и подвергли контрастному окрашиванию 0,1% крезиловым фиолетовым красителем.

Для оценки количества ТН-иммуноположительных (ТН+) нейронов был использован непредвзятый стереологический анализ (Mercator, Explora Nova, Ла-Рошель, Франция). Определили границы SN путем изучения размера и формы различных групп ТН+ нейронов. Рассчитали объем по формуле: V = ΣS td, в которой ΣS означает сумму площадей поверхности, t означает среднюю толщину среза, a d означает число слоев между двумя последовательными срезами. Использовали по одному из каждых 4 срезов; распределили оптические диссекторы с использованием схемы систематической выборки. Отделили диссекторы (длиной 50 мкм, шириной 40 мкм) друг от друга на расстояние 150 мкм (х) и 120 мкм (y). Использовали следующую формулу для оценки числа ТН+ нейронов: N = V (SN) (ΣQ-/ΣV (dis)), в которой N означает расчетное число клеток, V означает объем SN, ΣQ означает число клеток, подсчитанных в диссекторах, a ΣV (dis) означает общий объем всех диссекторов. Затем вычислили среднее расчетное число нейронов и SEM для каждой группы.

Все статистические анализы осуществлялись использованием версии 7 программы Graphpad prism. Все данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Эффект AOL анализировали путем однофакторного дисперсионного анализа и последующего апостериорного анализа с использованием критерия множественного сравнения Даннета. Значение Р менее 0,05 считалось значимыми.

Результаты

Лечение значимо повлияло на число ТН+ клеток в SN (F2,29=10,94, р<0,001, фиг. 10). При введении МРТР число ТН+ клеток в SN уменьшилось на 39% (р<0,001) по сравнению с животными, получавшими носитель. После введения AOL число ТН+ клеток в SN увеличилось на 44% (р<0,01) по сравнению с носителем у получавших МРТР мышей.

Вывод:

Лечение AOL в дозе 5 мг/кг в течение 11 дней подряд оказывает значимое по сравнению с носителем нейропротекторное воздействие на предотвращение индуцированного МРТР уменьшения числа ТН+ клеток в SN, что приводит к увеличению на 44% числа выживших клеток SN при введении AOL.

Эти данные предполагают, что лечение AOL может защищать дофаминергические нейроны в черной субстанции от интоксикации МРТР.

Пример 5. Воздействие AOL на сердечно-сосудистые заболевания: ишемическое и реперфузионное поражение

Настоящее исследование имеет целью оценить способности AOL защищать перфузируемое сердце крыс от повреждений, возникающих после глобальной ишемии и реперфузии.

Исследовали последствия 30-минутной глобальной ишемии с последующей 120-минутной реперфузией (фиг. 11) для сократимости и жизнеспособности тканей на выделенном перфузируемом сердце крысы с предварительным лечением 10 мкМ AOL или без него (контрольный носитель).

Материалы и методы

Все процедуры соответствовали британскому Закону 1986 года о животных (научные процедуры) и Руководству по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованному Национальным институтом здравоохранения (публикация NIH №85-23, пересмотренная в 1996 году). Анестезировали самцов крыс линии Вистар (250-300 г) 3% изофлураном, гепаринизировали и умертвили летальной внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала (130 мг/кг). Быстро извлекли сердца (~ 0,95 г веса сырой ткани) и поместили в ледяной буфер Кребса-Хенслейта, содержащий (в ммоль/л): NaCl 118, NaHCO₃ 25, KCl 4.8, KH₂PO₄ 1.2, MgSO₄ 1,2, глюкозу 11 и CaCl₂ 1,8; и газировали 95% 02/5% COi при 37°С (рН 7,4). Осуществили перфузию сердца по Лангендорфу (Garlid, K.D. и др., 2006). Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291(1):H152-60), и оценили сократимость путем непрерывного измерения произведения ЧСС и давления (RPP) с помощью баллона, помещенного в левый желудочек и соединенного с датчиком давления. Осуществили перфузию сердец в режиме установшегося потока (12 мл/мин). Через 10 минут стабилизации с последующим 10-минутным введением носителя (контроля) или 10 мкМ AOL вызвали глобальную нормотермическую ишемию путем остановки перфузионного потока в течение 30 минут с погружением сердца в перфузионный буфер при 37°С. В конце периода реперфузии окрасили сердца, чтобы оценить размер инфаркта, или зафиксировали путем замораживания с использованием охлажденного жидкого азота. В последнем случае измельчили сердца с среде жидкого азота и хранили при -80°С для дальнейшего анализа.

В конце периода реперфузии окрасили сердца хлористым трифенилтетразолием (ТТК): в течение 7 минут перфузировали сердца со скоростью 13 мл/мин 12-процентным (в отношении веса к объему) раствором ТТС до достижения 1-процентной конечной концентрации в сердце. Затем отсоединили сердца от канюли и еще в течение 4 минут инкубировали при 37°С до нарезки перпендикулярно продольной оси на 6 срезов. Затем в течение ночи обработали срезы 4-процентным (в отношении веса к объему) раствором формалина при 4°С и взвесили перед тем, как были сфотографированы обе стороны каждого среза. Идентифицировали путем планиметрии (AlphaEase v5.5) области некроза и области с повышенным риском на каждой сфотографированной стороне, и выразили размер инфаркта в процентах общей площади поперечного сечения сердца, поскольку ишемией было поражено все сердце.

Данные 6 независимых препаратов представлены как среднее значение ± SEM. Если число n в каждой группе составляло менее 20, распределение считалось ненормальным, и, следовательно, для сравнения двух групп проводился непараметрический тест согласно критерию Манна-Уитни (SPSS statistics 17.0). Результаты считались статистически значимыми, если значение р составляло менее 0,05.

Результаты

На фиг. 11 показано, как во время критической фазы реперфузии после ишемии изменялось RPP, считавшееся в этом случае показателем, заменяющим сократимость сердца. Очевидно, что AOL улучшает сократимость, и после идентичного процесса изменения в сравнении с контрольными сердцами сократимость улучшилась и примерно в три раза превышала сократимость контрольных сердец после 2 часов реперфузии. В этот момент подготовили сердца для окрашивания ТТС с целью оценки жизнеспособности тканей. Более высокая сократительная активность сердец с AOL была подтверждена окрашиванием ТТС, а фотографии срезов сердец с AOL и без AOL (данные не показаны) ясно показывают, что AOL индуцирует важную защиту сердечной ткани. Эта защита была проанализирована более тщательно, и результаты анализа представлены на фиг. 12. Размер инфаркта, т.е. пораженной ткани для каждого независимого эксперимента выражен в процентах общей поверхности вместе со средним значением для сердец с AOL и без AOL.

Результаты ясно показывают, что AOL обеспечивает высокозначимую защиту сердечную ткань от поражений, вызванных ишемией/реперфузией. Фактически, за счет предварительного введения AOL было спасено около 50% пораженной инфарктом ткани (фиг. 12).

Вывод:

Эти результаты расширяют роль AOL в условиях ex vivo (живого органа) как ингибитора продукции митохондриальных АФК, вероятнее всего, на уровне комплекса I.

Они также свидетельствуют о терапевтическом интересе, который представляет AOL с точки зрения защиты от поражений, вызванных ишемией/реперфузией, не только тканей сердца, но также любой ткани, подверженной ишемии.

Пример 6. Воздействие AOL на сердечно-сосудистое заболевание: кардиотоксичность антрациклинов

Настоящее исследование имеет целью оценить эффект AOL на модели кардиотоксичности антрациклинов. Это делалось путем введения 10-недельным крысам в течение 14-17 дней полученных из антрациклинов противораковых лекарств вместе с AOL.

Материалы и методы

Исследования проводились на крысах линии Спрег-Доули в возрасте 10 недель, которым в течение 14-17 дней внутрибрюшинно вводили различные средства, после чего извлекли сердце с целью анализа. С целью соблюдения принципа "трех R" в экспериментах на животных количество испытуемых групп было максимально ограничено, в частности, путем сосредоточения экспериментов на молекуле только одного антрациклина, а именно доксорубицина, и путем сравнения эффекта AOL с молекулой только одного альтернативного протектора, а именно, дексразоксана.

В конце эксперимента извлекли сердца, и тщательно изучили сердечную функцию после перфузии этих сердец по Лангендорфу, чтобы определить функцию сердца, пораженную доксорубицином, и эффективно ли лечение AOL.

В исследовании участвовало 5 различных групп по 8 крыс в каждой:

1. Контрольная группа.

Крысы в течение 17 дней два раза в день (утром и вечером) получали только носитель, состоящий из 5% ДМСО + 95% NaCl 0,9%.

2. Группа доксорубицина

Начиная с 3-го дня, крысы каждые два дня (утром) в течение 14 дней получали доксорубицин в дозе 3 мг/кг (внутрибрюшинно). Крысы получали носитель только с каждой второй инъекцией.

3. Группа дексразоксана

Начиная с 3-го дня, крысы каждые два дня в течение 14 дней получали дексразоксан (контрольный протектор) в дозе 30 мг/кг внутривенно одновременно с доксорубицином в дозе 3 мг/кг внутрибрюшинно (в соответствии с соотношением доз, рекомендованным в 2011 г.Французским региональным агентством здравоохранения ARS). Крысы получали носитель только с каждой второй инъекцией.

4. Группа AOL

Крысы получали AOL и доксорубицин:

4 мг/кг AOL внутрибрюшинно утром и вечером в течение 72 часов, предшествующих первой инъекции доксорубицина;

в дни инъекции доксорубицина (в группе доксорубицина):4 мг/кг AOL внутрибрюшинно вместе с инъекцией доксорубицина, а затем через 90 минут вторую инъекцию AOL в дозе 4 мг/кг внутрибрюшинно;

в дни без инъекции доксорубицина: 4 мг/кг AOL внутрибрюшинно, утром и вечером.

5. Группа AOL/карведиола/ эналаприла

Крыс лечили аналогично крысам из описанной выше группы AOL. Инъекции AOL дополняли классическим лечением сердечной недостаточности (β-блокатор карведиол в дозе 1 мг/кг и сосудорасширяющий препарат эналаприл в дозе 0,5 мг/кг).

Пример 7. Воздействие AOL на сердечно-сосудистое заболевание: легочная гипертензия

Настоящее исследование имеет целью изучить роль митохондрий в физиологии легочной сосудистой системы и создать новое альтернативное лечение легочной гипертензии. Это заболевание характеризуется повышенным артериальным давлением в легких и ремоделированием легочных артерий, что приводит к усилению сосудистого сопротивления легких, гипертрофии правого желудочка, правожелудочковой сердечной недостаточности и, в конечном итоге, смерти.

Легочную гипертензию можно разделить на пять групп, из которых группа 1 соответствует легочной артериальной гипертензии. Что касается группы 3, она включает легочную гипертензию вследствие болезней легких (таких как хроническая обструктивная болезнь легких) и/или альвеолярной гипоксемии.

Для решения вопроса об эффекте AOL использовались две различные модели на крысах: модель гипоксии и индуцированная монокроталином модель, которые имеют общие патофизиологические характеристики с легочной гипертензией группы 3 и группы 1, соответственно.

Материалы и методы

Разделили самцов крыс линии Вистар (300-400 г) на 3 группы и использовали через 4 недели:

первая группа (контроль или крысы в состоянии нормоксии - N крыс) содержалась в условиях атмосферного воздуха;

вторая группа (крысы с хронической гипоксией - СН крыс) в течение 3 недель содержалась в условиях хронической гипоксии в гипобарической камере (50 кПа), и

третья группа (крысы МСТ) получила разовую внутрибрюшинную инъекцию монокроталина в дозе 60 мг/кг. Растворили МСТ (Sigma, Сен-Кантен-Фаллавье, Франция) в равном объеме HCl (1 М) и NaOH (1 M).

В каждой группе некоторые животные получали AOL (Sulfarlem, EG Labo Eurogenerics, измельченные таблетки, смешанные с кормом, который животные получали по желанию), а некоторые другие животные не получали AOL. Каждый день взвешивали съеденный корм, чтобы оценить вводимую дозу AOL. Так, животные во второй и третьей группах получали по 10 мг/кг/день AOL в течение 3 недель эксперимента.

Использовали от 7 до 10 крыс в каждом состоянии. Все процедуры по уходу за животными и экспериментальные процедуры соответствовали рекомендациям Федерации Европейской научной ассоциации лабораторных животных и были одобрены местным комитетом по этике (Comite d'ethique region d'Aquitaine - справочный номер 50110016-А).

Оценили легочную гипертензию путем измерения как среднего давления в легочной артерии (mPAP), так и гипертрофии правого желудочка. Для измерения PAP, N, СН и МСТ анестезировали крыс путем внутрибрюшинной инъекции (60 мг/кг) пентобарбитала натрия (Centravet), и измерили mPAP у крыс на закрытой грудной клетке через катетер, вставленный в правую яремную вену, а затем через правое предсердие и правый желудочек в легочную артерию и прикрепленный к датчику избыточного давления Baxter Unifiow. Оценили гипертрофию правого желудочка по соотношению веса правого желудочка (RV) и левого желудочка плюс вес перегородки (LV + S) (индекс Фултона).

Оценили ремоделирование легочных артерий путем измерения доли средней толщины легочных артерий на залитых парафином срезах легочной ткани. Сначала окрасили срезы легочной ткани гематоксилином и эозином (VWR) в соответствии с обычной гистологической процедурой. На каждом срезе наблюдались по три группы из 10 интраацинарных артерий с различными диаметрами поперечного сечения с целью оценки средней толщины стенок (а именно, с диаметрами поперечного сечения до 50 мкм, от 50 до 100 мкм и от 100 до 150 мкм).

Результаты

Результаты представлены как среднее значение ± SEM n независимых наблюдений. Все данные были проанализированы с помощью непараметрического теста для непарных образцов (теста Манна-Уитни). На фиг. 13 показано воздействие AOL на давление в легочной артерии (фиг. 13А) и ремоделирование сердца (фиг. 13В). n означает число крыс для измерений mPAP и индекса Фултона. Все гистограммы и статистические данные получены с помощью программного обеспечения Graphpad PRISM (v6, Graphpad Software). Величина Р<0,05 считалась значимой. Как видно, AOL не оказывает существенного влияния на контрольную группу (N крыс). Однако среднее давление в легочной артерии снизилось у крыс МСТ, получавших AOL, и еще более значительно у крыс СН, получавших AOL. Тем не менее, AOL не влиял на индекс Фултона.

На фиг. 14 показано воздействие AOL на ремоделирование легочных артерий, n означает число анализируемых сосудов в процентах измеренной средней толщины. Все гистограммы и статистические данные получены с помощью программного обеспечения Graphpad PRISM (v6, Graphpad Software). Величина Р<0,05 считалась значимой. AOL продемонстрировал значительный эффект у крыс СН, диаметр легочных артерий которых уменьшился приблизительно на 30%.

Вывод:

AOL в пероральной дозе 10 мг/кг/день имеет значимый эффект при профилактике и/или лечении легочной гипертензии in vivo, в частности при легочной гипертензии 3-й группы. Результаты действительно показывают значимое улучшение клинической симптоматики.

Эти данные предполагают, что митохондрии играют важную роль в физиологии легочной сосудистой системы и расширяют применение AOL за счет лечения легочной гипертензии.

Пример 8. Воздействие AOL на связанные со старением заболевания и прогероидные синдромы: дегенерация желтого пятна

Настоящее исследование имеет целью оценить способности AOL защищать сетчатку от прогрессирующей дегенерации.

Материалы и методы

Крыс, выращенных в условиях циклической низкоинтенсивной освещенности, на одну неделю переместили в условия циклической высокоинтенсивной освещенности и разделили на 3 группы (не получавших лечения животных, получавших носитель животных и получавших AOL животных). Получавшим лечение животным три раза в день в течение 7 дней после перемещения вводили инъекции носителя или AOL в дозе 6 мг/кг/день (за 30 минут до включения света, в 13:00, в 21:00). Через неделю животных переместили в темноту (D0).

Контрольная группа (не перемещавшихся животных) не перемещалась в условия циклической высоко интенсивной освещенности, но получала описанное выше лечение: инъекции носителя или AOL три раза в день в течение 7 дней с последующим перемещением в темноту (D0).

На следующий день после перемещения в темноту (D1) была осуществлена первая электроретинография. С ее помощью измеряют электрофизиологический сигнал, который генерируется сетчаткой в ответ на стимуляцию светом. Обычно он характеризуется двумя волнами, а именно волной а и волной b. Волна а отображает исходный отрицательный изгиб роговицы, создаваемый колбочками и палочками наружных фоторецепторных слоев. Он отображает гиперполяризацию фоторецепторов вследствие блокирования ионных каналов натрия в мембране внешнего сегмента. b-волна отображает положительный изгиб роговицы, создаваемый внутренней сетчаткой (преимущественно клетками Мюллера и ON-биполярными клетками). Анализ электроретинограммы состоит в измерении амплитуды и/или латентности этих волн в зависимости от интенсивности стимуляции светом. Амплитуда волны а при заданной интенсивности стимуляции светом зависит от числа фоторецепторов, тогда как амплитуда волны b при заданной интенсивности стимуляции светом и заданном числе фоторецепторов указывает на эффективность передачи сигнала.

После электроретинографии в D1 вернули животных в условия циклической низкоинтенсивной освещенности, в D15 осуществили вторую электроретинографию.

Затем животных умертвили с целью гистологического анализа. Измерили толщину различных слоев сетчатки, в частности, толщину наружного ядерного слоя (ONL) и внутреннего ядерного слоя (INL) (в мкм, от оптического нерва и через каждые 0,39 мм на верхнем и нижнем полюсах диска зрительного нерва).

Результаты

На фиг. 15 представлен гистологический анализ. Он показывает, что в контрольной группе (не перемещавшихся животных) введение AOL не влияет на толщину ONL (фиг. 15А). Это предполагает, что AOL не оказывает токсического воздействия на фоторецепторы сетчатки.

Напротив, перемещение в условия циклической высокоинтенсивной освещенности (группы перемещавшихся животных) вызывает значительное уменьшение ОНЛ (в некоторых областях наполовину) у не получавших AOL животных. AOL, однако, имеет тенденцию защищать ONL от вызванных светом повреждений. Гистологический анализ действительно продемонстрировал значительное увеличение толщины ONL у получавших AOL животных, подвергшихся воздействию условий циклической высокоинтенсивной освещенности (фиг. 15 В).

Вывод:

Лечение AOL имеет значимый защитный эффект в отношении вызванных светом повреждений сетчатки. В частности, было показано, что толщина сетчатки сохраняется по сравнению с не получавшими AOL животными после длительного воздействия условий циклической высокоинтенсивной освещенности.

Пример 9. Воздействие AOL на заболевания, связанные с митохондриальными дисфункциями

Настоящее исследование имеет целью изучить эффект AOL in vivo на модели дисфункции окислительного фосфорилирования. Материалы и методы

Использовали мышей с дефицитом митохондриальной Mn-супероксиддизмутазы (Sod2-KO) на фоне CD1. Это генетическое изменение приводит к возникновению неблагоприятного фенотипа и смерти животных в среднем через 8 дней после рождения. Митохондриальная супероксиддисмутаза представляет собой поглощающий свободные радикалы фермент, который превращает супероксид (высокореактивный) в пероксид водорода (менее реактивный), который затем может скрещиваться с митохондриальными мембранами и обезвреживаться матричными и цитозольными антиоксидантными системами. Это исследование имело целью проверить, сможет ли AOL спасти фенотип Sod2-KO за счет своего воздействия на продукцию супероксида I_Q.

Генотипировали мышей после рождения (через 3 дня), и уменьшили размер помета до 6 животных на клетку. Затем животные получали (AOL в Kolliphor® - 5 мг/кг) или не получали (только Kolliphor®, далее - KOL) лечение. Выбор дозировки определялся главным образом пределом растворимости соединения (2,8 мМ в Kolliphor®) и максимальным инъецируемым объемом для животных (6-7 мкл на 1 грамм массы тела). Провели два исследования на двух различных поколениях от одних и тех же родителей: продолжительности жизни; и активности сукцинатдегидрогеназы (SDH) в сердце и окрашивания красителем Oil Red О в печени. Животных ежедневно взвешивали и вводили инъекции (внутрибрюшинно).

Активность сукцинатдегидрогеназы является маркером супероксида в митохондриальной матрице. Таким образом, отсутствие Sod2 связано с уменьшением активности SDH в сердце. Этот эксперимента имел целью проверить, может ли AOL восстанавливать активность SDH у мышей с дефицитом Sod2.

Окрашивание красителем Oil Red О является маркером липида, который, как было показано, накапливается в печени мышей Sod2-KO. Однако не установлена прямая связь между образованием супероксида/перекиси водорода и накоплением липидов в печени. Исследование имело целью проверить эффективность AOL с точки зрения предотвращения накопления липидов в печени мышей Sod2-KO.

Результаты

Продолжительность жизни

Были созданы 4 группы:

1. группа WT-KOL (n=7) мышей дикого типа, получавших только носитель,

2. группа WT-AOL (n=17) мышей дикого типа, получавших AOL,

3. группа KO-KOL (n=2), мышей Sod2-KO, получавших только носитель,

4. группа KO-AOL (n=4) мышей Sod2-KO, получавших AOL.

Животным вводили инъекции один раз в день, начиная с трехдневного возраста до смерти.

На фиг. 16А и 16В показано изменение массы тела (А) и доля первоначальной массы тела. Эти результаты показывают, что вес тела и увеличение массы тела были ниже у нокаутных мышей, чем у мышей дикого типа. Лечение AOL, однако, имеет тенденцию смягчать этот эффект, как видно с 8-го по 12-й день, что предполагает потенциальный положительный эффект соединения.

На фиг. 16С показан процент выживаемости мышей Sod2-KO независимо от того, получали ли они AOL. Как и ожидалось с учетом вышеприведенных результатов, как средняя продолжительность жизни, так и максимальная продолжительность жизни у нокаутных мышей незначительно выросли при лечении AOL, при этом получавшие AOL мыши, прожили до 2 дней дольше, чем не получавшие AOL мыши, что подтверждает благоприятный эффект AOL.

Активность SDH в сердце и окрашивание красителем Oil Red О

Были созданы 5 групп:

1. группа WT без инъекций (n=6) мышей дикого типа, не получавших лечения;

2. группа WT-KOL (n=6) мышей дикого типа, получавших только носитель;

3. группа WT-AOL (n=6) мышей дикого типа, получавших AOL;

4. группа KO-KOL (n=4) мышей Sod2-KO, получавших только носитель;

5. группа KO-AOL (n=6) мышей Sod2-KO, получавших AOL.

В этом исследовании животные ежедневно получали лечение (5 мг/кг) с 3-го по 5-й дни. На 6-й день извлекли сердце и печень.

Как и ожидалось, активность SDH имела тенденцию уменьшаться (незначительно) у нокаутных мышей по сравнению с мышами WT. Тем не менее, AOL вызвал лишь незначительное повышение активности SDH у нокаутных мышей, но не смог восстановить активность SDH до уровней мышей дикого типа (фиг. 17).

На фиг. 18 показаны средний размер липидных капель (панель А), плотность (панель В) и площадь (панель С). Не получавшие лечения нокаутные мыши имели фенотип с высоким содержанием липидов по сравнению с мышами дикого типа. Однако плотность липидных капель у получавших AOL нокаутных мышей уменьшалась по сравнению с не получавшими лечения животными. Что важнее, эти результаты также показывают, что лечение AOL позволило восстановить общую площадь липидов у нокаутных мышей, что согласуется с целевым подавлением продукции митохондриального супероксида in vivo у мышей Sod2-KO.

Вывод:

Исследования in vivo демонстрируют обнадеживающие результаты. Хотя лечение AOL не могло полностью противодействовать эффектам истощения Sod2 у мышей, результаты показывают, что продолжительность жизни могла продлеваться на несколько дней по сравнению с не получавшими лечения животными KO наряду с уменьшением снижения прироста массы тела. Это указывает на потенциальный эффект AOL.

Известно, что AOL имеет очень кратковременную биодоступность. Таким образом, лечение более высокими дозами могло бы приводить к улучшению эффектов AOL в этих экспериментах. Однако конститутивный нокаут остается крайне неблагоприятным фенотипом для спасения только одним высокоспецифичным средством и может требовать синергического взаимодействия с другими лекарственными средствами.

In vivo результаты также показали, что AOL может восстанавливать содержание липидов и/или предотвращать накопление липидов в печени мышей Sod2-KO.

Пример 10. Воздействие AOL на аутоиммунное заболевание:

склеродермия

Настоящее исследование имеет целью испытать воздействие AOL на фибробласты пациентов со склеродермией. Склеродермия является хроническим системным аутоиммунным заболеванием, характеризующимся повышенным синтезом коллагена, повреждением мелких кровеносных сосудов, активацией Т-лимфоцитов и образованием измененных соединительных тканей.

Материалы и методы

Культивировали фибробласты как здорового донора, так и пациента со склеродермией в колбах с полной средой DMEM (10% FCS, 1% антибиотика). После 6-часовой адгезии клетки были лишены сыворотки в течение ночи.

Приготовили AOL по индивидуальному рецепту. Взвесили и растворили AOL в ДМСО в концентрации 5 мг/мл. Дополнительно разбавили этот исходный раствор в ДМСО до окончательных концентраций 10 мМ и 5 мМ. Дополнительно разбавили AOL в полной среде DMEM до окончательных концентраций 40 мкМ, 20 мкМ и 10 мкМ.

Ввели культивированные клетки в контакт с AOL в концентрациях 40 мкМ, 20 мкМ и 10 мкМ. Ввели контрольные клетки в контакт с полной DMEM-средой, дополненной ДМСО (0,2%) и N-ацетилцистеином (3 мМ). В течение 6 или 24 часов инкубировали клетки в нормальных условиях (37°С, 20% O₂) и в условиях гипоксии (37°С, 1% О₂).

С целью анализа секреции ММР-1, MIP и МСР собрали культуральный супернатант, разделили на аликвоты и хранили при -20°С для дозирования. Определили количество ММР-1 методом ELISA (Abeam) в соответствии с указаниями производителя. Определили концентрации МСР-1 и MIP-1α с помощью системы СВА (Cytometric Bead Array, Biolegend).

С целью анализа экспрессии ММР-1, коллагена и СС12 отделили клетки трипсином и промыли с помощью PBS. Затем повторно суспендировали сгусток клеток в буфере для лизиса, и экстрагировали РНК согласно указаниям производителя (Nucleospin RNA Plus, Macherey Nagel). Подвергли 1 мкг РНК обратной транскрипции (GoScript, Promega), затем 10-кратно разбавили до добавления SYBR Green qPCR (SYBR qPCR Premix Ex Taq, Takara) в приборе для ПЦР BioRad CFX384. Использовали праймеры для ММР-1, Coll A2 и СС12 с целью измерения интересующих генов и праймеры для Ppia, RPLPO и EEF1 А1 с целью измерения эталонных генов.

1. Применение ингибитора продукции активных форм кислорода (АФК) митохондриальным комплексом I для профилактики или облегчения сердечно-сосудистых заболеваний, связанных со свободными радикалами кислорода, при этом ингибитором является анетола тритион, и сердечно-сосудистые заболевания, связанные со свободными радикалами кислорода, выбирают из группы, включающей сердечную недостаточность, сердечно-легочные заболевания, кардиотоксичность антрациклинов, кардиотоксичность противораковых препаратов, кардиотоксичность хинолонов, сердечную фибрилляцию, легочную артериальную гипертензию и кардиомиопатию.

2. Применение по п. 1, где сердечно-сосудистое заболевание представляет собой сердечную недостаточность.

3. Применение по п. 1, где сердечно-сосудистое заболевание представляет собой сердечно-легочное заболевание.

4. Применение по п. 1, где сердечно-сосудистое заболевание представляет собой кардиотоксичность антрациклинов.

5. Применение по п. 1, где сердечно-сосудистое заболевание представляет собой кардиотоксичность противораковых препаратов.

6. Применение по п. 1, где сердечно-сосудистое заболевание представляет собой кардиотоксичность хинолонов.

7. Применение по п. 1, где сердечно-сосудистое заболевание представляет собой сердечную фибрилляцию.

8. Применение по п. 1, где сердечно-сосудистое заболевание представляет собой легочную артериальную гипертензию.

9. Применение по п. 1, где сердечно-сосудистое заболевание представляет собой кардиомиопатию.

10. Применение ингибитора продукции активных форм кислорода (АФК) митохондриальным комплексом I для улучшения сердечной сокращаемости у субъектов с пониженной сокращаемостью, и указанным ингибитором является анетола тритион.