Способ количественного определения борнеола и его сложных эфиров в масляном экстракте древесной зелени хвойных пород методом газовой хроматографии
Владельцы патента RU 2778287:
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет» (RU)
Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способу количественного определения борнеола и его сложных эфиров в масляном экстракте древесной зелени хвойных пород методом газовой хроматографии. Способ количественного определения борнеола и его сложных эфиров в масляном экстракте древесной зелени хвойных пород методом газовой хроматографии включает пробоподготовку анализируемого образца и хроматографирование полученного раствора, при этом используют капиллярную колонку размером 50 м × 0,32 мм и толщиной слоя стационарной фазы 0,5 мкм, содержащую полиэтиленгликоль, модифицированный нитротерефталевой кислотой, начальную температуру термостата колонок 120°С выдерживают в течение 3,5 мин, затем производят нагрев термостата со скоростью 5°С/мин до температуры 130°С и выдерживают данную температуру в течение 13 мин, после чего производят нагрев термостата со скоростью 5°С/мин до 250°С и выдерживают данную температуру в течение 2 мин, в качестве газа-носителя используют азот, скорость потока газа-носителя устанавливают на уровне 1 см3/мин, применяют деление потока 1:20, в испаритель микрошприцем вводят 0,2 мкл полученного раствора, строят градуировочную зависимость для борнеола в диапазоне 1,0-10,0%, по которой рассчитывают содержание борнеола, борнилацетата и изоборнилацетата. Техническим результатом является возможность одновременного количественного определения борнеола (1,0-80,0%), борнилацетата (1,0-80,0%) и изоборнилацетата (0,1-1,0%). 5 табл., 3 ил.
Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способу количественного определения борнеола и его сложных эфиров в масляном экстракте древесной зелени хвойных пород методом газовой хроматографии.
В настоящее время одним из перспективных направлений современных химико-медицинских исследований является разработка лекарственных средств растительного происхождения, обладающих низкой токсичностью и высокой биологической активностью. Наиболее известным и распространенным по применению в народной медицине с лечебными целями является эфирное масло пихты сибирской.
Анализ литературных данных показывает разнообразие химических веществ, входящих в состав пихтового масла. Данные компоненты представлены следующими соединениями: борнилацетат, лимонен, камфен, пинены, 3-карен, борнеол [1].
Борнилацетат, с точки зрения химической структуры - сложный эфир уксусной кислоты и борнеола, который является производным терпенов. Борнилацетат представляет собой кристаллы или жидкость в зависимости от температуры окружающей среды (температура плавления 27-29°С); является гидрофобным, имеет хвойно-камфорный запах. Борнеол также является гидрофобным, обладает хвойно-камфорным запахом, но отличается от борнилацетата температурой плавления (208-209°С).
Основным методом исследования растительных экстрактов, содержащих борнилацетат и борнеол, является газожидкостная хроматография. Существует ГОСТ ISO 10869-2015 на анализ масла эфирного пихты сибирской [2]. Стандарт заключается в проведении испытания эфирного масла методом газовой хроматографии на полярной и неполярной колонках. Определяют в полученной хроматограмме репрезентативные и характерные компоненты по методу внутренней нормализации. Однако представленные условия газохроматографического анализа не дают разрешения хроматографических пиков борнилацетата и изоборнилацетата, что затрудняет количественный анализ компонентов.
Аналогичная картина перекрывания хроматографических пиков борнилацетата и изоборнилацетата наблюдается в ряде статей [3-6]. При этом содержание борнилацетата определяется совместно с изоборнилацетатом. Главной особенностью данного способа является использование полярной колонки DB-FFAP вместо слабополярной HP-5.
Представленные авторами [3] хроматографические условия анализа с градиентом температур от 70 до 290°С не позволяют определить наличие изоборнилацетата в исследуемой пробе.
В статье коллектив авторов исследовал различия масс-спектров борнилацетата и изоборнилацетата в образцах эфирных масел некоторых хвойных деревьев [4]. Как заявляют сами авторы, представленные хроматографические условия (колонка Agilent Technologies DB-5ms [(5%-Фенил)-метилполисилоксан], 30 м × 0,25 мм × 0,25 мкм; температурная программа от 60° до 246°C с использованием He в качестве газа-носителя; температура инжектора 220°С; объем пробы 0,5 мкл, в режиме деления потока 50:1; режим постоянного давления He 108 кПа) не позволяют достоверно провести идентификацию масс-спектров искомых соединений. Это приводит к грубым ошибкам, поскольку данные соединения могут служить хемотаксономическими маркерами для некоторых хвойных пород.
В данной работе в качестве детектирующего устройства используется пламенно-ионизационный детектор (ПИД), характеризующейся универсальностью к определяемым веществам. Однако поскольку в основе процесса детектирования лежит ионизация СН-групп, наблюдается некоторое падение чувствительности детектора при определении веществ, содержащих С-ОН, С=О, СООН-группы. Авторами [5] в качестве количественного метода определения борнилацетата в образцах эфирного масла Валерианы лекарственной предложен метод внутренней нормализации, что является приближенным расчетом, не учитывающим чувствительность детектора к разным классам соединений. В данном патенте представлен метод внутреннего стандарта для количественной оценки содержания компонентов, в качестве стандарта предложен циклогексанон, что позволяет учесть изменения чувствительности детектора и увеличить точность определения.
Прототипом является метод, описанный в ФС-42-3370-97 "Пихты сибирской хвои масло эфирное" [6]. В тексте статьи представлены хроматографические условия, которые также не дают достаточного разрешения хроматографических пиков борнилацетата и изоборнилацетата. Кроме того, данный метод анализа требует наличия нескольких стандартных образцов, что увеличивает стоимость проводимого анализа.
Техническим результатом заявленного изобретения является возможность одновременного количественного определения борнеола (1,0-80,0%), борнилацетата (1,0-80,0%) и изоборнилацетата (0,1-1,0%).
Способ количественного определения борнеола и его сложных эфиров в масляном экстракте древесной зелени хвойных пород методом газовой хроматографии, включающий пробоподготовку анализируемого образца и хроматографирование полученного раствора, отличается от прототипа тем, что используют капиллярную колонку размером 50 м × 0,32 мм и толщиной слоя стационарной фазы 0,5 мкм, содержащую полиэтиленгликоль, модифицированный нитротерефталевой кислотой, начальную температуру термостата колонок 120°С выдерживают в течение 3,5 мин, затем производят нагрев термостата со скоростью 5°С/мин до температуры 130°С и выдерживают данную температуру в течение 13 мин, после чего производят нагрев термостата со скоростью 5°С/мин до 250°С и выдерживают данную температуру в течение 2 мин, в качестве газа-носителя используют азот, скорость потока газа-носителя устанавливают на уровне 1 см3/мин, применяют деление потока 1:20, в испаритель микрошприцем вводят 0,2 мкл полученного раствора, строят градуировочную зависимость для борнеола в диапазоне 1,0-10,0%, по которой рассчитывают содержание борнеола, борнилацетата и изоборнилацетата.
Заявленное изобретение по одновременному определению борнеола и его сложных эфиров в масляном экстракте древесной зелени хвойных пород, полученном методом углекислотной экстракции, состоит из следующих этапов:
1. Подготовка проб: некоторые фракции представляют собой азеотропные смеси, из которых невозможно отобрать представительную пробу без специальной подготовки. Для этого образец помещают в ультразвуковую баню при температуре 80°С и термостатируют в течение часа.
2. Приготовление раствора: к навеске образца фракции пихтового масла добавляют циклогексанон (внутренний стандарт), затем добавляют этиловый спирт, записывают навески с точностью ~ 0,0001 г. Соотношения навески образца к циклогексанону устанавливают равным 1:1, остальное этиловый спирт (минимальная масса исследуемого раствора 1,0 г), фиксируя итоговую массу с точностью ~ 0,0001 г.
3. Построение градуировочной зависимости: градуировочная кривая зависимости по отношению площадей пиков борнеола к внутреннему стандарту от соотношения концентраций борнеола и внутреннего стандарта в диапазоне: 1,0-10,0%.
4. Анализ пробы: анализируют полученный раствор в следующих условиях:
Капиллярная колонка DB-FFAP, полиэтиленгликоль, модифицированный нитротерефталевой кислотой, 50 м × 0,32 мм, толщина фазы 0,5 мкм, Agilent Technologies;
Газ-носитель: азот;
Детектор: пламенно-ионизационный;
Температура испарителя: 250°С;
Температура детектора: 250°С;
Скорость потока: 1 см3/мин; деление потока: 1:20;
Температурный режим колонки: плато 120°С - 3,5 мин, нагрев 5°С/мин до 130°С - плато 13 мин, нагрев 5°С/мин до 250°С - плато 2 мин;
Объем вводимой пробы: 0,2 мкл.
Разработанные хроматографические условия позволяют разделить борнеол, борнилацетат, изоборнилацетат. Способ, на основе данных хроматографических условий с предварительным термостатированием образца, позволяет проводить одновременное количественное определение компонентов.
На фиг. 1 приведена хроматограмма образца фракции эфирного масла пихты "сухой остаток", где времена выхода циклогексанона 8,9 мин, борнилацетата 18,3 мин, изоборнилацетата 18,7 мин, борнеола 24,1 мин.
В таблице 1 указаны хроматографические параметры разделения.
В таблице 2 указаны диапазоны количественного определения компонентов (борнеол, борнилацетат, изоборнилацетат) в пробах.
Таблица 1 - Хроматографические параметры разделения
Вещество | Время, мин | Разрешение n,n+1 | Асимметрия |
Изоборнилацетат | 18,7 | 3,7 | 1,0 |
Борнилацетат | 18,3 | 2,4 | 1,0 |
Борнеол | 24,1 | 2,6 | 1,1 |
Циклогексанон (внутренний стандарт) | 8,9 | 34,5 | 1,1 |
Для градуировочного образца (борнеол) определяют площадь хроматографического пика. Образец анализируют не менее трех раз. Полученную зависимость отношений массовой доли компонентов к массовой доле стандарта от отношения площадей хроматографического пика компонента к площади пика стандарта методом линейного регрессионного анализа интерполируют уравнением прямой. Градуировочная зависимость считается пригодной при коэффициенте корреляции не менее 0,995.
Массовую долю компонентов (борнеол, борнилацетат, изоборнилацетат) в анализируемом растворе рассчитывают по формуле:
где Ci - массовая доля компонентов (борнеол, борнилацетат, изоборнилацетат) в растворе, %;
Si - площадь хроматографического пика компонента, мВ⋅с;
Sст - площадь хроматографического пика внутреннего стандарта, мВ⋅с;
a, b - коэффициенты градуировочной зависимости.
Массовую долю определяемых компонентов в пробе рассчитывают по формуле:
где Xi - массовая доля компонента в пробе, %;
Ci - массовая доля компонента в анализируемом растворе, %;
mp-ра - масса приготовленного раствора, г;
mnp - навеска пробы, г.
Таблица 2 - Диапазоны количественного определения компонентов в образце
Показатель | Содержание в образце, % | Диапазон методики, % |
Массовая доля борнеола | 10,0-80,0 | 1,0-80,0 |
Массовая доля борнилацетат | 11,0-45,0 | 1,0-80,0 |
Массовая доля изоборнилацетат | 0,2-0,6 | 0,1-1,0 |
Ниже приведены примеры конкретного осуществления изобретения.
Пример 1. Количественное определение борнеола, борнилацетата и изоборнилацетата в образце пихтового масла "фракция 5"
Навеску образца фракции пихтового масла 0,1022 г растворили в 0,8090 г этилового спирта с добавлением 0,1002 г циклогексанона (внутренний стандарт). Полученный раствор был гомогенным без видимых включений и опалесценции. Раствор хроматографировали по приведенным условиям. Заранее была построена градуировочная зависимость отношения массовых долей борнеола и стандарта от отношения площадей их хроматографических пиков (таблица 3).
Таблица 3 - Диапазон градуировочной зависимости отношения массовых долей борнеола и циклогексанона от отношения площадей их хроматографических пиков
Компонент | Диапазон градуировки | Уравнение | Коэффициент корреляции |
Борнеол | 1,0-10,0% | у = 0,9319⋅х - 0,0004 | 0,9997 |
Результат расчета содержания борнеола, борнилацетата и изоборнилацетата в образце фракции пихтового масла представлен в таблице 4.
Таблица 4 - Содержание борнеола, борнилацетата и изоборнилацетата в образце пихтового масла "фракция 5"
Компонент | Площадь пика, мВ⋅с | Содержание, % |
Борнеол | 11922,5 | 30,10 |
Борнилацетат | 17867,5 | 44,54 |
Изоборнилацетат | 224,2 | 0,60 |
На фиг. 2 представлена хроматограмма образца эфирного пихтового масла "фракция 5", где времена выхода циклогексанона 8,9 мин, борнилацетата 18,3 мин, изоборнилацетата 18,7 мин, борнеола 24,1 мин.
Пример 2. Количественное определение борнеола, борнилацетата и изоборнилацетата в образце пихтового масла "фракция 9"
Две параллельные навески образца пихтового масла "фракция 9" 0,1031 г (навеска 1) и 0,1030 г (навеска 2), параллельные навески циклогексанона (внутренний стандарт) 0,1002 г (навеска 1) и 0,1006 г (навеска 2), массу раствора довели этанолом до 1,0053 г (навеска 1) и 1,0102 г (навеска 2). Полученный раствор был гомогенным без видимых включений. Раствор хроматографировали по приведенным условиям.
На фиг. 3 представлена хроматограмма образца эфирного пихтового масла "фракция 9", где времена выхода циклогексанона 8,9 мин, борнилацетата 18,3 мин, изоборнилацетата 18,7 мин, борнеола 24,1 мин.
Результат расчета содержания борнеола, борнилацетата и изоборнилацетата в образце пихтового масла приведен в таблице 5.
Таблица 5 - Содержание определяемых компонентов в образце пихтового масла "фракция 9"
Компонент | Навеска | Площадь пика, мВ⋅с | Содержание, % | Содержание (ср. знач.), % | СКО |
Борнеол | 1 | 5616,8 | 14,10 | 13,81 | 0,41 |
2 | 5422,1 | 13,52 | |||
Борнилацетат | 1 | 5735,6 | 14,40 | 14,15 | 0,35 |
2 | 5574,3 | 13,90 | |||
Изоборнилацетат | 1 | 50,8 | 0,17 | 0,17 | 0,01 |
2 | 56,4 | 0,18 |
Литература
1. Лобанов В.В., Степень Р.А. Влияние биоценотических факторов на содержание и состав пихтового масла // Хвойные бореальной зоны. 2004. Т. 22, № 1-2. С. 148-156.
2. ГОСТ ISO 10869-2015 Межгосударственный стандарт масло эфирное сибирской пихты (Abies sibirica Lebed) Технические условия. - Москва: Стандартинформ, 2019.
3. Хасанов В.В., Рыжова Г.Л., Куряева Т.Т., Дычко К.А. Изучение состава и антиокислительной активности продуктов водно-паровой дистилляции пихты сибирской (Abies sibirica Ledeb) // Химия растительного сырья. 2009. №4.
4. Bernant M. Closely eluting bornyl and isobornyl acetates are chemotaxonomic markers in the Pinaceae by virtue of their unique mass spectra. American J Essential Oils Nat Pdts. 2016;4(2):41-46.
5. Feng, Y.-X., Wang, Y., Chen, Z.-Y., Guo, S.-S., You, C.-X., & Du, S.-S. (2019). Efficacy of bornyl acetate and camphene from Valeriana officinalis essential oil against two storage insects. Environmental Science and Pollution Research.
6. X Государственная Фармакопея / Частная фармакопейная статья "Пихты сибирской хвои масло эфирное" (ФС 42-3370-97).
Способ количественного определения борнеола и его сложных эфиров в масляном экстракте древесной зелени хвойных пород методом газовой хроматографии, включающий пробоподготовку анализируемого образца и хроматографирование полученного раствора, отличающийся тем, что используют капиллярную колонку размером 50 м × 0,32 мм и толщиной слоя стационарной фазы 0,5 мкм, содержащую полиэтиленгликоль, модифицированный нитротерефталевой кислотой, начальную температуру термостата колонок 120°С выдерживают в течение 3,5 мин, затем производят нагрев термостата со скоростью 5°С/мин до температуры 130°С и выдерживают данную температуру в течение 13 мин, после чего производят нагрев термостата со скоростью 5°С/мин до 250°С и выдерживают данную температуру в течение 2 мин, в качестве газа-носителя используют азот, скорость потока газа-носителя устанавливают на уровне 1 см3/мин, применяют деление потока 1:20, в испаритель микрошприцем вводят 0,2 мкл полученного раствора, строят градуировочную зависимость для борнеола в диапазоне 1,0-10,0%, по которой рассчитывают содержание борнеола, борнилацетата и изоборнилацетата.