Способ выявления токсигенных pasteurella multocida методом пцр в режиме реального времени
Владельцы патента RU 2785435:
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГБУ "ВГНКИ") (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарной микробиологии и генетической инженерии и может применяться для детекции токсигенных Pasteurella multocida в различном биологическом материале. Способ включает подготовку образца, выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции c гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием набора олигонуклеотидов для совместной амплификации генов kmt1 и toxA Pasteurella multocida, содержащего прямые - Pm_F 5'-TGCCACTTGAAATGGGAAATG-3'; toxA_F 5'-CAGTGAAAGCACGGCTGA-3' и обратные -Pm_R 5'-AATAACGTCCAATCAGTTGCG-3'; toxA_R 5'-CATAAGCAGGAAGTTCCCAGT-3' праймеры и флуоресцентно-меченые зонды Pm_Z 5'-R6G-TGTGAGTGGGCTTGTCGGTAGTCT-BHQ-3'; toxA_Z 5’-Cy5-TCAGCGCCTTTTCGCGGATATGCTG-BHQ-3’, и реакционной смеси. Результаты амплификации оценивают с помощью программного обеспечения амплификатора, при этом результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,05 пороговой линией и диагностируют наличие генома бактерии Pasteurella multocida и гена токсина toxA. Способ позволяет осуществлять быстрое подтверждение присутствия токсигенных вариантов Pasteurella multocida в культурах и образцах биологического материала: респираторных смывах и внутренних органов от разного вида животных: свиней, КРС, МРС, кроликов, птицы, при высокой чувствительности и специфичности. 2 ил., 1 табл., 2 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарной микробиологии и генетической инженерии и может применяться для детекции токсигенных Pasteurella multocida в различном биологическом материале (образцах респираторных смывов и внутренних органов).
Pasteurella multocida - грамотрицательная бактерия семейства Pasteurellaceae, вызывающая пастереллез - контагиозную инфекционную болезнь многих видов животных, характеризующуюся при остром течении признаками септицемии и геморрагического воспаления слизистых оболочек дыхательных путей и кишечника, отеками в различных областях тела и высокой - до 100% - летальностью. При подостром и хроническом течениях болезнь проявляется пневмониями, поражением глаз, суставов, молочной железы и геморрагическим энтеритом. Pasteurella multocida относится к условно-патогенным микроорганизмам, в возникновении болезни существенную роль играет ослабление резистентности организма под воздействием неблагоприятных факторов внешней среды. Пастереллоносительство в неблагополучных хозяйствах среди крупного рогатого скота достигает 70%, среди овец до 50%, свиней 45%, кроликов более 50% и среди кур - от 35 до 50% [1]. Заболеваемость и летальность при пастереллезе могут сильно меняться в зависимости от вирулентности возбудителя, иммунологической структуры стада, условий содержания и кормления, наличия сопутствующих инфекций и своевременности проведения оздоровительных мероприятий. Таким образом, необходим способ, позволяющий не только достоверно выявлять бактерии Pasteurella multocida, но и также отличать патогенные варианты от непатогенных. Одним из основных факторов вирулентности Pasteurella multocida является способность данного микроорганизма продуцировать дермонекротический токсин, который вызывает остеолиз в костях носовых раковин и играет важную роль в патогенезе атрофического ринита свиней, обнаружен также при случаях пневмонии у других домашних и диких животных.
Из-за большой вариабельности клинических проявлений пастереллеза, постановка соответствующего диагноза является непростой задачей. Лабораторный способ идентификации P. multocida чрезвычайно необходим, поскольку при пастереллезе наблюдается широкое бактерионосительство как среди переболевших, так и среди клинически здоровых животных, контактировавших, а иногда и неконтактировавших с животными неблагополучных хозяйств, нужно провести дифференциацию токсигенных вариантов и принять своевременные меры по ограничению распространения заболевания.
В настоящее время для детекции P. multocida в основном используются культуральные методы. Токсигенные штаммы у свиней обычно обнаруживают путем выделения P. multocida из первичных культур мазков из носа или миндалин на селективном агаре. Затем изоляты тестируются на производство дермонекротического токсина. Основным методом определения патогенности культур признан метод на основе постановки биологической пробы на мышах с последующей оценкой летальности. Однако данный способ трудоёмок и длителен по времени.
Методы, основанные на использовании полимеразной цепной реакции, являются более быстрыми, удобными и при этом чувствительными, а также позволяют проводить специфичную идентификацию P. multocida даже в присутствии других патогенных бактерий.
Известно несколько способов идентификации пастерелл, созданных на основе методов молекулярной биологии, одни из которых - с проведением последующей гибридизации [2], и без гибридизации [3], [4]. В России разработан и запатентован способ выявления патогенных штаммов и изолятов Pasteurella multocida [5]. Однако все описанные выше способы позволяют проводить определение токсигенности выделенных культур Pasteurella multocida и образцов, в которых присутствует данный микроорганизм и не дают информации о присутствии нетоксигенных вариантов. Кроме того, в данных системах детекция продуктов амплификации проводится с использованием горизонтального гель-электрофореза.
Аналогом предлагаемого способа является ПЦР-тест-система для выявления токсигенных вариантов P. multocida - LSI VetMAX™ P. multocida Toxinogenic Kit, производство Laboratoire Service International (LSI), Франция. Но данная тест-система предназначена для детекции токсигенных вариантов пастерелл у свиней, информация о пригодности её для детекции токсигенных Pasteurella у животных других видов отсутствует.
В заявленном способе предполагается использование гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов амплификации, которая значительно ускоряет процесс и повышает чувствительность анализа. Наличие двух генов-мишеней (одной - специфического для Pasteurella multocida гена kmt1, и другой - гена toxA для дифференциации токсигенных вариантов пастерелл) в одном анализе позволяет проводить более четкую диагностику.
Целью настоящего изобретения является разработка способа диагностики пастереллеза на основе детекции ДНК бактерии-возбудителя Pasteurella multocida с одновременной дифференциацией патогенных вариантов с помощью идентификации гена дермонекротоксина.
Техническим результатом настоящего изобретения является быстрое подтверждение присутствия токсигенных вариантов Pasteurella multocida в культурах и образцах биологического материала (респираторных смывах и внутренних органов) от разного вида животных (свиней, КРС, МРС, кроликов, птицы), характеризующееся высокой чувствительностью и специфичностью.
Технический результат достигается благодаря тому, что способ выявления токсигенных Pasteurella multocida осуществляется методом ПЦР и включает подготовку образца, выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции c гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием набора олигонуклеотидов, комплементарных последовательностям генов kmt1 и toxA Pasteurella multocida, содержащего прямые (Pm_F 5'-TGCCACTTGAAATGGGAAATG-3'; toxA_F 5'-CAGTGAAAGCACGGCTGA-3') и обратные (Pm_R 5'-AATAACGTCCAATCAGTTGCG-3'; toxA_R 5'-CATAAGCAGGAAGTTCCCAGT-3') праймеры и флуоресцентно-меченые зонды (Pm_Z 5'-R6G-TGTGAGTGGGCTTGTCGGTAGTCT-BHQ-3'; toxA_Z 5'-Cy5-TCAGCGCCTTTTCGCGGATATGCTG-BHQ-3’). Реакционная смесь имеет следующий состав: 10 мм3 ДНК-матрицы, 10 мм3 ПЦР-смеси-1 (по 6 пмоль специфических праймеров и по 3 пмоль специфических зондов, 2,5 мм3 раствора дНТФ с концентрацией каждого нуклеотида 1,76 ммоль/дм3 (Синтол, Россия), деионизованная вода), 0,5 мм3 Taq-F полимеразы, 5 мм3 ПЦР-буфера-Flu (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора); амплификация проводится по следующей программе: 15 мин при 95°C; 10 с при 95°C, 20 с при 60°С, 10 с при 72°С (5 циклов без детекции флуоресцентного сигнала); 10 с при 95°C, 20 с при 60°С, 10 с при 72°С (35 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала на каналах R6G/Yellow и Cy5/Red). Результаты амплификации оценивают с помощью программного обеспечения амплификатора, при этом результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,05 пороговой линией и диагностируют наличие генома бактерии генома бактерии Pasteurella multocida и гена токсина toxA.
Аналитическая чувствительность методики выявления токсигенных Pasteurella multocida составляет 2x104 копий/см3 в образцах респираторных смывов и внутренних органов. Специфичность способа выявления Pasteurella multocida, несущих ген дермонекротического токсина, при исследовании предложенной контрольной панели составляет 100%, полная процедура исследования не превышает 3,5 часов и дает возможность детектировать продукты амплификации в «режиме реального времени».
Сбор и анализ нуклеотидных последовательностей геномов микроорганизмов семейства Pasteurellaceae, представленных в базе данных GenBank позволил выбрать в качестве гена-мишени для выявления ДНК Pasteurella multocida ген kmt1. Патогенность Pasteurella multocida оценивали по присутствию гена toxA, отвечающего за продукцию дермонекротического токсина у бактерий P. multocida. При подборе праймеров и зондов рассчитывали температуру отжига, возможность формирования димеров и вторичной структуры олигонуклеотидов. Технический результат достигается высокой степенью гомологии выбранных олигонуклеотидов с фрагментами соответствующих генов-мишеней Pasteurella multocida и значительным отличием от нуклеотидных последовательностей других микроорганизмов, в том числе представителей семейства Pasteurellaceae. Выбранные олигонуклеотиды имеют следующую структуру:
Pm_F 5'-TGCCACTTGAAATGGGAAATG-3';
Pm_R 5'-AATAACGTCCAATCAGTTGCG-3';
Pm_Z 5'-R6G-TGTGAGTGGGCTTGTCGGTAGTCT-BHQ-3';
toxA_F 5'-CAGTGAAAGCACGGCTGA-3';
toxA_R 5'-CATAAGCAGGAAGTTCCCAGT-3';
toxA_Z 5’-Cy5-TCAGCGCCTTTTCGCGGATATGCTG-BHQ-3’.
Оптимизированы условия амплификации: концентрации праймеров и зондов, концентрация ионов магния в реакционной смеси, температура отжига праймеров и длительность основных стадий амплификации.
Выявление токсигенных вариантов Pasteurella multocida в культурах и образцах биологического материала (респираторных смывах и внутренних органов) осуществляют следующим способом:
• Колонии, выросшие на плотных адаптированных для роста P. multocida питательных средах, переносят в стерильные одноразовые пробирки с 500 мм3 стерильного физиологического раствора, перемешивают на вортексе и осаждают кратковременным центрифугированием. Для экстракции ДНК используют 100 мм3 образца.
• Культуры микроорганизмов, выросшие на жидких средах, отбирают в отдельную пробирку по 500 мм3, для экстракции ДНК используют 100 мм3образца.
• Смывы со слизистых используют без предварительной подготовки. Для экстракции ДНК используют 100 мм3 образца.
• Пробы внутренних органов измельчают и готовят 10% суспензию в растворе натрия хлорида изотонического 0,9%. Суспензию отстаивают при комнатной температуре в течение 5-7 мин. Для экстракции ДНК используют 100 мм3 верхней фракции.
Выделение ДНК проводят с использованием приципитационного метода (наборы «Рибо-преп», ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора). Проводят ПЦР в конечном объеме 25 мм3 со следующим составом реакционной смеси: 10 мм3 ДНК-матрицы, 10 мм3 ПЦР-смеси-1 (6 пмоль специфических праймеров Pm_F и Pm_R, 6 пмоль специфических праймеров toxA_F и toxA_R, по 3 пмоль специфических зондов Pm_Z и toxA_Z, 0,2 мм3 раствора дНТФ с концентрацией каждого нуклеотида 1,76 ммоль/дм3 (Синтол, Россия), деионизованная вода), 0,5 мм3 Taq-F полимеразы, 5 мм3 ПЦР-буфера-Flu (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора).
Выявление токсигенных P. multocida проводится на приборах RotorGene 6000 (Corbett Research, Австралия) или RotorGene Q (Qiagen, Германия) по следующему температурному протоколу: 15 мин при 95°C; 10 с при 95°C, 20 с при 60°С, 10 с при 72°С (5 циклов без детекции флуоресцентного сигнала); 10 с при 95°C, 20 с при 60°С, 10 с при 72°С (35 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала). Детектирование результата амплификации генов kmt1 и toxA токсигенных P. multocida проводится на каналах R6G/Yellow и Cy5/Red соответственно. Результаты амплификации в режиме реального времени оценивают с помощью программного обеспечения, при этом результаты учитывают на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,05 пороговой линией.
Принцип учета результатов следующий:
• в образце обнаружена ДНК Pasteurella multocida, если для данной пробы в таблице результатов по каналу JOE/Yellow определено значение порогового цикла (Ct) менее 30.
• в образце не обнаружена ДНК Pasteurella multocida, если для данной пробы на каналах JOE/Yellow и Cy5/Red значения порогового цикла (Ct) отсутствуют (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию).
• в образце выявлен ген дермонекротоксина Pasteurella multocida (toxA), если для данной пробы в таблице результатов по каналу Cy5/Red определено значение порогового цикла (Ct) менее 30.
Результат исследования интерпретируют следующим образом:
• в образце обнаружена нетоксигенная Pasteurella multocida, если для данной пробы в таблице результатов по каналу JOE/Yellow определено значение порогового цикла (Ct) менее 30, а по каналу Cy5/Red значения порогового цикла (Ct) отсутствуют (кривая флуоресценции не пересекает пороговую линию).
• в образце обнаружена токсигенная Pasteurella multocida, если для данной пробы в таблице результатов по каналам JOE/Yellow и Cy5/Red определено значение порогового цикла (Ct) менее 30.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Проверка специфичности способа детекции токсигенных вариантов Pasteurella multocida.
С целью подтверждения специфичности ПЦР, реакцию проводили с ДНК/кДНК различных микроорганизмов и вирусов, вызывающих инфекционные заболевания животных, а также геномной ДНК свиньи, крупного рогатого скота, мелкого рогатого скота, кошек, собак, кроликов, норок, кур (табл. 1).
Таблица 1 - Результаты амплификации ДНК/кДНК, выделенных из образцов контрольной панели
| № образца |
Наличие фрагмента гена kmt1 P. multocida | Полученный Результат | Наличие фрагмента гена toxA P. multocida | Полученный Результат | Наименование Образца | ||
| Повтор №1 |
Повтор №2 |
Повтор №1 |
Повтор №2 |
||||
| - | - | - | - | - | - | Изолят Mannheimia haemolytica 169 | |
| - | - | - | - | - | - | Изолят Mannheimia haemolytica 33396 | |
| - | - | - | - | - | - | Изолят Biberstenia trehalosi 1982 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Histophilus somni ATCC-700025 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Haemophilus parasuis АТСС S19417 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Actinobacillus pleuropneumoniae | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Mycoplasma bovis ATCC-25523 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Mycoplasma bovirhinis ATCC-27748 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Mycoplasma arginini ATCC-23888 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Mycoplasma artritidis ATCC-19611 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Mycoplasma bovigenitaliumATCC 19852 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Campylobacter fetus 25936 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Brucella abortus 82 сер. 022 07.01.1980 г. | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Yersinia enterocolitica № Му 03 ВНИПЧИ «Микроб» | |
| - | - | - | - | - | - | Культура Yersinia pseudotuberculosis | |
| - | - | - | - | - | - | Культура Salmonella infantis | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Pseudomonas aeruginosaATCC 27853 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Staphylococcus aureus ВКПМВ 6646 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Mycobacterium bovis AN5 2/5-69-MS-07 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Mycobacterium intracellulare 539 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Mycobacterium avium D-4 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Leptospira interrogans Pomona ВГНКИ-6 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Bacillus cereus ВКПМВ-8076 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Arcanobacterium pyogenes ATCC-8164 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Neospora caninum ATCC-50977 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Escherichia coli 0157:Н7 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Clostridium perfringens тип С | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Streptococcus pyogenes; АТСС 19615 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Candida albicans ATCC 10231 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Aspergillus brasiliensis (niger) ATCC 16404 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Enterococcus faecalis ATCC 29212 | |
| - | - | - | - | - | - | Изолят Chlamydia sp. | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Bordetella bronchiseptica В-С2 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Bovine Herpesvirus 1 MBA 2 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Bovine Herpesvirus 2 ATCC-VR-845 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Bovine Herpesvirus 4 DN-599 | |
| - | - | - | - | - | - | Вирус заразного узелкового дерматита ВНД КРС/Дагестан/2015 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм вируса диареи КРС Бизон | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм вируса диареи КРС Орегон C24V | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм вируса диареи КРС NAD) | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм вируса парагриппа-3 КРС ПТК 45186 | |
| - | - | - | - | - | - | Сыворотка КРС, содержащая генетический материал вируса Шмалленберга | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм вируса респираторно-синцитиальной инфекции КРС LYM P56 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis ATCC 12315 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Lactobacillus casei ATCC 393 | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Bifidobacterium adolescentis ATCC15703 | |
| - | - | - | - | - | - | Изолят Klebsiella pneumoniae | |
| - | - | - | - | - | - | Штамм Klebsiella oxytoca | |
| - | - | - | - | - | - | Campylobacter stutum ГДР | |
| - | - | - | - | - | - | Геномная ДНК КРС | |
| - | - | - | - | - | - | Геномная ДНК лошади | |
| - | - | - | - | - | - | Геномная ДНК козы | |
| - | - | - | - | - | - | Геномная ДНК свиньи | |
| 54. | - | - | - | - | - | - | Геномная ДНК кошки |
| 55. | - | - | - | - | - | - | Геномная ДНК собаки |
| 56. | - | - | - | - | - | - | Геномная ДНК норки |
| 57. | - | - | - | - | - | - | Геномная ДНК курицы |
| 58. | - | - | - | - | - | - | Геномная ДНК кролика |
| 59. | + | + | + | - | - | - | Pasteurella multocida ATCC 43137 |
| 60. | + | + | + | - | - | - | Pasteurella multocida ATCC P1059 |
| 61. | + | + | + | - | - | - | Pasteurella multocida 1997 |
| 62. | + | + | + | + | + | + | Pasteurella multocida Т-80D |
Данный пример демонстрирует высокую специфичность (100%) настоящей разработки, так как набор выбранных праймеров позволяет амплифицировать и детектировать только целевые участки фрагментов генов kmt1 и toxA Pasteurella multocida и не дает специфический сигнал с фрагментами генома других микроорганизмов, вирусов и геномной ДНК различных животных.
Пример 2. Оценка аналитической чувствительности способа выявления токсигенных вариантов Pasteurella multocida.
Для определения аналитической чувствительности способа выявления токсигенных вариантов Pasteurella multocida использовали два положительных контрольных образца (ПКО) - рекомбинантные плазмиды, представляющие собой плазмиды pAL2-ТА, содержащие целевые вставки с фрагментами генов kmt1 и toxA Pasteurella multocida. Структуру положительных контрольных образцов подтверждали методом секвенирования по Сенгеру. Секвенирование фрагментов амплификации выполняли методом “cycle sequence” с набором ABI PRISM Big Dye v.1.1 («Applied Biosystems», USA), согласно инструкции изготовителя c использованием капиллярного автоматического секвенатора ABI-3100 PRISM Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Капиллярный электрофорез проводили на генетическом анализаторе ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer после очистки образцов от избытка дидезоксинуклеотидов и солей.
Определение аналитической чувствительности ПЦР проводили способом последовательного разбавления смеси ПКО kmt1 и toxA Pasteurella multocida c известной концентрацией плазмидной ДНК (5х105 копий/см3 и 2х105 копий/см3 соответственно). Использовали серии десятикратных разведений ПКО P. multocida в отрицательных образцах респираторных смывов и внутренних органов с концентрациями от 5х104 копий/см3 до 2х102 копий/см3. Амплификацию проводили на приборе Rotor Gene Q (Qiagen, Германия). Эксперимент проводили в разные дни, разные исполнители на разных приборах. Результаты представлены на фиг. 1.
Фиг. 1. Оценка аналитической чувствительности способа выявления токсигенных вариантов Pasteurella multocida в образцах респираторных смывов
А - кривые флуоресценции на канале JOE/Yellow смеси ПКО kmt1 и toxA
Б - кривые флуоресценции на канале Cy5/Red смеси ПКО kmt1 и toxA
Фиг. 2. Оценка аналитической чувствительности способа выявления токсигенных вариантов Pasteurella multocida в образцах лёгких
А - кривые флуоресценции на канале JOE/Yellow смеси разведений ПКО Pasteurella multocida (kmt1 и toxA)
Б - кривые флуоресценции на канале Cy5/Red смеси ПКО Pasteurella multocida (kmt1 и toxA)
За аналитическую чувствительность принимали наименьшую концентрацию ПКО, для которой получен положительный результат ПЦР для всех повторов (значения Ct < 30).
Аналитическая чувствительность способа выявления токсигенных вариантов Pasteurella multocida при исследовании респираторных смывов составила для фрагмента гена kmt1 - 5х103 копий/см3, для фрагмента гена toxA - 2х104 копий/см3, чувствительность при исследовании образцов лёгких составила для фрагмента гена kmt1 - 5х104 копий/см3, для фрагмента гена toxA - 2х104 копий/см3.
Литература:
1. Б.Ф. Бессарабов, А.А. Вашутин, Е.С. Воронин и др. Инфекционные болезни животных под ред. А.А. Сидорчука - М.: Колосс, 2007. - 671 с.)
2. Nagai S., Someno S., Yagihashi T. Differentiation of toxigenic from nontoxigenic isolates of Pasteurella multocida by PCR // J Clin Microbiol. - 1994. - Vol. 32, No 4. P. 1004-1010 doi: 10.1128/JCM.32.4.1004-1010.1994
3. Davies R.L, MacCorquodale R., Baillie S., Caffrey B. Characterization and comparison of Pasteurella multocida strains associated with porcine pneumonia and atrophic rhinitis // J Med Microbiol. - 2003. P. 59-67. doi: 10.1099/jmm.0.05019-0,
4. Lichtensteiger C.A., Steenbergen S.M., Lee R.M., Polson D.D., Vimr E.R. Direct PCR analysis for toxigenic Pasteurella multocida // J. Clin. Microbiol. - 1996. - Vol. 34. P. 3035-3039 doi: 10.1128/JCM.34.12.3035-3039.1996
5. Патент RU 2477321 C1, МПК C12Q 1/68 C12R 1/01 Нефедченко А.В., Глотова Т.И., Глотов А.Г. Патентообладатель ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ИЭВС и ДВ Россельхозакадемии).
Способ выявления токсигенных Pasteurella multocida методом ПЦР, включающий подготовку образца, выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции c гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием набора олигонуклеотидов, комплементарных последовательностям генов kmt1 и toxA Pasteurella multocida, содержащего прямые (Pm_F 5'-TGCCACTTGAAATGGGAAATG-3'; toxA_F 5'-CAGTGAAAGCACGGCTGA-3') и обратные (Pm_R 5'-AATAACGTCCAATCAGTTGCG-3'; toxA_R 5'-CATAAGCAGGAAGTTCCCAGT-3') праймеры и флуоресцентно-меченые зонды (Pm_Z 5'-R6G-TGTGAGTGGGCTTGTCGGTAGTCT-BHQ-3'; toxA_Z 5’-Cy5-TCAGCGCCTTTTCGCGGATATGCTG-BHQ-3’), и реакционной смеси следующего состава: 10 мм3 ДНК-матрицы, 10 мм3 ПЦР-смеси-1 (по 6 пмоль специфических праймеров и по 3 пмоль специфических зондов, 2,5 мм3 раствора дНТФ с концентрацией каждого нуклеотида 1,76 ммоль/дм3 (Синтол, Россия), деионизованная вода), 0,5 мм3 Taq-F полимеразы, 5 мм3 ПЦР-буфера-Flu (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора); амплификация проводится по следующей программе: 15 мин при 95°C; 10 с при 95°C, 20 с при 60°С, 10 с при 72°С (5 циклов без детекции флуоресцентного сигнала); 10 с при 95°C, 20 с при 60°С, 10 с при 72°С (35 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала на каналах R6G/Yellow и Cy5/Red); результаты амплификации оценивают с помощью программного обеспечения амплификатора, при этом результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,05 пороговой линией и диагностируют наличие генома бактерии Pasteurella multocida и гена токсина toxA.
