Способ снижения уровня контаминации клинического материала при посеве на плотные питательные среды для выделения mycobacterium tuberculosis complex
Владельцы патента RU 2786394:
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Башкирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к микробиологии. Описан способ ингибирования роста сопутствующей бактериально-грибковой микрофлоры при культивировании на плотных питательных средах для выделения Mycobacterium tuberculosis complex. Он включает предварительную обработку мокроты NALC-NaOH, инкубирование и центрифугирование. Затем проводят посев осадка в пробирки со скошенной твердой питательной средой, инкубирование посевов в термостате при 37°С до появления колоний микобактерий, не более 90 дней со дня начала инкубации. Способ отличается тем, что перед посевом в пробирки вносят 0,5 мл смеси, содержащей 50 мг Амфотерицина В на 100 мл препарата «Пиобактериофаг комплексный», а после посева пробирки выдерживают в наклонном положении в течение 30 минут до инкубации. Технический результат заключается в повышении частоты обнаружения в клиническом материале Mycobacterium tuberculosis complex культуральным методом за счет снижения исходной обсемененности исследуемого материала сопутствующей грибково-бактериальной микрофлорой. 1 пр., 3 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии и фтизиатрии и может быть использовано в бактериологической диагностике туберкулеза.
Микробиологическую диагностику туберкулеза и заболеваний, вызываемых нетуберкулезными микобактериями (в частности, применение культурального и бактериоскопического методов) серьезно осложняет высокая обсемененность клинического материала посторонней быстрорастущей сапрофитной микрофлорой и микроскопическими грибами. Последние истощают питательные среды и могут образовывать в процессе роста метаболиты и другие продукты жизнедеятельности с антимикобактериальной активностью. Отличаясь достаточно быстрым ростом, они существенно затрудняют выявление микобактерий.
Эти существенно снижает количество колоний на питательных средах и осложняет визуальное обнаружение микобактерий в клиническом материале в процессе окраски специальными методами и микроскопии [Приказ Минздрава РФ от 21.03.2003 N 109 (ред. от 29.10.2009) «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации».
До настоящего времени культуральный метод, основывающийся на выделении чистой культуры микобактерий из клинического материала, считается «золотым стандартом» и является основным в лабораторной диагностике туберкулеза. Это обусловлено тем, что выделение чистой культуры возбудителя обеспечивает определение ее видовой принадлежности, спектра лекарственной устойчивости, вирулентности, молекулярно-генетических характеристик и ряда других свойств, значимых для эпидемиологии и позволяющих обнаруживать источник инфекции [Ерохин В.В., Голышевская В.И., Севастьянова Э.В., Шульгина М.В. Микробиологические методы диагностики туберкулеза: Эпидемиология туберкулеза. Характеристика возбудителя туберкулеза. Лабораторные методы диагностики туберкулеза: Теоретическое учебное пособие для проведения курсов обучения: «Выявление туберкулеза методом микроскопии», «Культуральные методы диагностики туберкулеза». - М. Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2008. - 40 с.].
Специфичность и чувствительность культурального метода по сравнению с микроскопией достаточно существенно выше и обеспечивает выявление МБ при наличии в исследуемом материале всего лишь нескольких десятков жизнеспособных клеток возбудителя [Черноусова Л.Н., Пузанов В.А., Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Попов С.А. Лабораторная диагностика туберкулеза. Методические материалы к проведению цикла тематического усовершенствования / под ред. проф. В.В. Ерохина. М., 2012. - 707 с.; Черноусова Л.Н., Севастьянова Э.В., Ларионова Е.Е., Смирнова Т.Г., Андреевская С.Н., Попов С.А., Журавлев В.Ю., Пузанов В.А., Марьяндышев А.О., Вахрушева Д.В., Кравченко М.А., Сафонова С.Г., Васильева И.А., Эргешов А.Э. Федеральные клинические рекомендации по организации и проведению микробиологической и молекулярно-генетической диагностики туберкулеза. РОФ. - М., 2015. - 35 с.].
Для культивирования микобактерий можно использовать как плотные, так и жидкие питательные среды.
Однако посев клинического материала на жидкие питательные среды не позволяет обнаруживать изолированные колонии возбудителя для оценки культуральных признаков и его последующей идентификации. Кроме того, на жидких питательных средах более интенсивно размножается сопутствующая бактериально-грибковая микрофлора и, соответственно, более выражен ее ингибирующий рост микобактерий эффект. В этой связи на практике для получения изолированных колоний и культурального обнаружения Mycobacterium tuberculosis complex преимущественно используются плотные питательные среды.
Вне зависимости от используемых питательных сред культуральное обнаружение микобактерий существенно затрудняется тем, что исследуемый клинический материал, а основным является мокрота, исходно содержит большое количество слизи, имеет высокую вязкость и сильно обсеменен сопутствующей грибково-бактериальной флорой. Поэтому для повышения эффективности культурального обнаружения микобактерий клинический материал обязательно подвергается процедуре обогащения.
В связи с этим перед посевом клинический материал гомогенизируют и проводят деконтаминацию. Для этого может использоваться 3% серная кислота, 4% раствор едкого натра (модифицированный метод Петрова) или обработка материала 10% раствором ЫазР04. Однако обработка кислотой или щелочью, наряду с задержкой роста сапрофитной контаминантной микрофлоры, одновременно ингибирует рост микобактерий, а обработка материала 10% раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия не обеспечивает необходимого уровня задержки роста грибов-контаминантов [Ерохин В.В., Голышевская В.И., Севастьянова Э.В., Шульгина М.В. Микробиологические методы диагностики туберкулеза: Эпидемиология туберкулеза. Характеристика возбудителя туберкулеза. Лабораторные методы диагностики туберкулеза: Теоретическое учебное пособие для проведения курсов обучения: «Выявление туберкулеза методом микроскопии», «Культуральные методы диагностики туберкулеза». - М. Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2008. - 40 с.; Приказ Минздрава РФ от 21.03.2003 N 109 (ред. от 29.10.2009) «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской федерации»].
Наиболее близким аналогом изобретения является способ деконтаминации, заключающийся в том, что перед посевом на питательные среды проводят предварительную обработку клинического материала N-ацетил-L-цистеином (NALC-NaOH). Этот способ обеспечивает быстрое разжижение мокроты. Деконтаминирующий эффект NALC-NaOH достигается применением раствора NaOH, но в меньшей конечной концентрации в пробе (не более 1%). Сохранность микобактерий при этом в известной степени стабилизируется и достигает 85%, но снижается эффективность ингибирования роста сопутствующей микрофлоры, в особенности грибковой. Кроме того в рабочем растворе литической смеси необходимо наличие цитрата натрия для связывания ионов тяжелых металлов, которые могут присутствовать в пробе и снижать активность N-ацетил-L-цистеина. При этом цитрат натрия может использоваться в качестве источника углерода бактериями, контаминирующими образец, снижая эффективность задержки их роста [О.М. Залуцкая, Е.Р. Сагальчик, Л.К. Суркова. Руководство по лабораторной диагностике туберкулеза. - Минск. 2013. 135 с.].
Задачей изобретения является разработка способа предпосевной деконтаминации клинического материала для последующего посева на питательные среды и выделения Mycobacterium tuberculosis complex.
Технический результат при использовании изобретения - повышение частоты обнаружения в клиническом материале Mycobacterium tuberculosis complex культуральным методом для последующей идентификации и определения их устойчивости к противотуберкулезным препаратам за счет снижения исходной обсемененности исследуемого материала сопутствующей грибково-бактериальной микрофлорой.
Предлагаемый способ снижения уровня исходной микробной обсемененности клинического материала для последующего высева на плотные питательные среды с целью выделения Mycobacterium tuberculosis complex в чистой культуре заключается в следующем.
Для снижения вязкости мокроты используют раствор NALC-NaOH, включающий натрий лимоннокислый 3х-замещенный (хч) (ООО «АО РЕАХИМ», Россия), N-ацетил-L-цистеин (хч) (ООО «АО РЕАХИМ», Россия), натрия гидроокись (хч) (ООО «АО РЕАХИМ», Россия). Рабочий раствор NALC-NaOH готовят по следующей рецептуре: 20,0 г натрия гидроокиси и 14,5 г натрия лимоннокислого 3х-замещенного растворяют в дистиллированной Н2О, итоговый объем раствора доводят до 1000 мл. Перед использованием к рабочему раствору добавляют 0,37 г N-ацетил-Е-цистеина. Исследуемый материал (мокрота) предварительно инкубируют в растворе NALC-NaOH в соотношении 1:1 20 минут для снижения вязкости и центрифугируют при 3000 об./мин - 15 минут для обогащения. Надосадочную жидкость сливают, осадок (в количестве 200 мкл) стерильной одноразовой пипеткой Пастера вносят в пробирку со скошенной питательной средой Мордовского «Новая» [Приказ Минздрава РФ от 21.03.2003 N 109 (ред. от 29.10.2009) «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской федерации»], дополнительно содержащую 0,5 мл деконтаминирующего агента, представляющего собой суспензию препарата «Пиобактериофаг комплексный» (смесь фильтратов стерильных фаголизатов бактерий родов Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Proteus, Klebsiella (pneumoniae и oxytoca), Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli) (НПО «Микроген», Россия) и противогрибковый препарат Амфотерицин В (ОАО «Синтез», Россия) из расчета 50 мг антибиотика на 100 мл препарата «Пиобактериофаг комплексный» (0,05% раствор). После посева пробирки выдерживают в наклонном положении (с целью равномерного распределения посевного материала по всей поверхности среды) в течение 30 минут, после чего инкубируют в термостате при 37°С. Просмотр посевов производят еженедельно (до 90 дней) до появления колоний.
В рамках эксперимента нами был произведен посев 100 клинических образцов с применением в качестве деконтаминирующего агента только NALC-NaOH (табл. 1) и 100 клинических образцов с использованием для предварительной обработки NALC-NaOH и добавлением к клиническому материалу деконатминационной смеси («Пиобактериофаг комплексный»+Амфотерицин В) (табл. 2).
Результаты проведенных исследований свидетельствуют об относительной эффективности применения деконтаминационной смеси («Пиобактериофаг комплексный»+Амфотерицин В) в части снижения частоты случаев роста посторонней микрофлоры. Помимо этого наблюдается увеличение частоты случаев положительных (МБТК+) результатов инкубации (табл. 2, 3).
Исходя из данных, приведенных в табл. 1, 2, видно, что использование в качестве деконтаминирующего агента NALC-NaOH и смеси пиобактериофага с антимикотиком имеет преимущество в части уменьшения удельного веса посевов с контаминацией с одновременным увеличением удельного веса положительных (МБТК+) посевов. Сравнение приведено в табл. 3.
Сущность изобретения поясняется следующим примером. Клинический материал больного Е. (мокрота, лабораторный номер исследования 14638) в количестве 3 мл, взятый в соответствии с правилами сбора мокроты для бактериологического исследования, подвергли соответствующей предпосевной обработке (разжижению, деконтаминации, в т.ч. с использованием смеси Амфотерицина В и пиобактериофага комплексного, приготовленной из расчета 50 мг Амфотерицина В на 100 мл пиобактериофага комплексного) по следующей схеме: мокроту предварительно инкубировали в растворе Nalc-NaOH в соотношении 1:1, после чего полученную суспензию процентрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость слили и произвели посев осадка в количестве 200 мкл стерильной одноразовой пипеткой Пастера в пробирки со скошенной питательной средой Мордовского «Новая», выдержали пробирки в наклонном положении (с целью равномерного распределения посевного материала по всей поверхности среды) в течение 30 минут. Далее в вертикальном положении инкубировали засеянную пробирку в термостате при 37°С с еженедельным ее просмотром на наличие роста колоний МБТК.
Через 49 дней инкубации был обнаружен рост в количестве свыше 20 КОЕ (2+) типичных колоний МБТК цвета слоновой кости в R-форме. При микроскопии приготовленного из выросшей культуры мазка, окрашенного по методу Ziehl-Neelsen, были обнаружены тонкие, прямые кислотоустойчивые палочки с характерным для микобактерий туберкулезного комплекса расположением скоплениями в виде «кос». Выросшие колонии были посеяны для внутривидовой идентификации на среду ТСН и для дифференциации МБТК от нетуберкулезных микобактерий на среду с 1000 мкг/мл салицилата натрия. На среде с салицилатом натрия рост отсутствовал, а на среде ТСН наблюдался рост более 20 КОЕ (2+). Отсутствие роста на среде с салицилатом натрия свидетельствует о том, что выделенная культура принадлежит к виду Mycobacterium tuberculosis.
Способ ингибирования роста сопутствующей бактериально-грибковой микрофлоры при культивировании на плотных питательных средах для выделения Mycobacterium tuberculosis complex, включающий предварительную обработку мокроты NALC-NaOH, инкубирование и центрифугирование, посев осадка в пробирки со скошенной твердой питательной средой, инкубирование посевов в термостате при 37°С до появления колоний микобактерий, не более 90 дней со дня начала инкубации, отличающийся тем, что перед посевом в пробирки вносят 0,5 мл смеси, содержащей 50 мг Амфотерицина В на 100 мл препарата «Пиобактериофаг комплексный», а после посева пробирки выдерживают в наклонном положении в течение 30 минут до инкубации.
