Терапевтические и нейропротекторные пептиды
Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предложено применение пептида, который содержит глицинил-аргинил-глицинил-цистеиновую кислоту-треонил-пролин для восстановления ранее утраченной остроты зрения у субъекта, представляющего собой человека или животного, страдающего от неэкссудативной или сухой возрастной макулярной дегенерации, или для защиты зрительного нерва, клеток Мюллера сетчатки, нейронов сетчатки или клеток пигментного эпителия сетчатки от повреждения вследствие повышенного внутриглазного давления или дегенеративного заболевания сетчатки. Изобретение обеспечивает улучшение наибольшей остроты зрения с коррекцией (BCVA) у субъектов с сухой возрастной макулярной дегенерацией, в частности BCVA улучшилось до 20 букв. 5 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 табл., 6 пр.
Родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительными заявками на патент США № 62/448300, озаглавленной «Нейропротекторные пептиды», поданной 19 января 2017 г., и 62/500998, озаглавленной «Терапевтические пептиды и их механизмы действия», поданной 3 мая 2017 г., полное раскрытие обоих этих заявок включено в настоящий документ посредством ссылки.
Перечень последовательностей
Настоящая заявка содержит Перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и настоящим полностью включен посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 31 мая 2018 г., называется ALLEG-008PC_SL.txt и имеет размер 591 байт.
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение в целом относится к областям биологии и медицины и, в частности, к нейропротекторным пептидам, используемым для лечения повреждений нервов, возникающих в результате нейродегенеративных или нейропатических заболеваний (например, глаукомы, пигментного ретинита, наследственных или приобретенных дегенераций сетчатки, периферической нейропатии, нейродегенеративной центральной нервной системы (ЦНС) или периферических нарушений), гипоксических поражений (например, остановки сердца или инсульта) или механических повреждений (например, травмы, повреждений спинного мозга), а также применимы для усиления восстановления сетчатки и неврологических тканей и регенерационной терапии сетчатки и неврологических заболеваний посредством улучшения иммуномодулирующей функции.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
В соответствии с 37 CFR 1.71(e) настоящий патентный документ содержит материал, который подлежит защите авторских прав, и владелец настоящего патентного документа сохраняет за собой все авторские права.
Известно, что помимо травматических повреждений нервов и гипоксических поражений различные заболевания вызывают нейродегенеративные или нейропатические эффекты. Например, глаукома представляет собой нейропатию зрительного нерва, которая вызывает экскавацию или «купирование» диска зрительного нерва, дегенерацию ганглиозных клеток сетчатки и, как следствие, потерю поля зрения. Поскольку повышенное внутриглазное давление (IOP) является основным фактором риска развития глаукомы, многие стратегии лечения были направлены на снижение внутриглазного давления.
Недавние исследования показывают, что дегенерация нерва, возникающая при глаукоме, может быть результатом процесса, подобного тому, который происходит после травматического повреждения нейронов центральной нервной системы (ЦНС). Например, после повреждения ЦНС уровни некоторых нейротоксичных веществ увеличиваются во внеклеточной жидкости. Считается, что эти токсичные вещества затем вызывают вторичное повреждение нейронов в дополнение к механическому повреждению, которое произошло в результате первичной травмы. Лекарственные средства, способные предотвращать или уменьшать действие этих нейротоксических веществ, могут быть кандидатами для разработки не только в качестве нейропротекторов для глаз, но также и в качестве нейропротекторов, применимых для уменьшения гибели или нарушений нейронов после повреждения или травмы других нейрональных тканей, включая в себя головной и спинной мозг. Смотрите Yoles, E., et al.; a2-Adrenoreceptor Agonists Are Neuroprotective in a Rat Model of Optic Nerve Degeneration; Investigative Ophthalmology & Visual Science, Vol. 40, No. 1, pp. 65-73 (January 1999) и Neufeld, A.H., et al.; Inhibition of Nitric-Oxide Synthase 2 by Aminoguanidine Provides Neuroprotection of Retinal Ganglion Cells in a Rat Model of Chronic Glaucoma; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999).
Заявитель в настоящее время разрабатывает синтетический олигопептид (Luminate®, Allegro Ophthalmics, LLC), который ингибирует ряд интегринов и при введении в глаз может вызывать витреолиз, заднюю витреоретинальную отслойку (PVD) и может использоваться для лечения нарушений зрения, таких как влажная форма макулодистрофии (WMD), диабетическая ретинопатия (PDR), диабетическая макулопатия (DME) и витреомакулярная тракция (VMT). Как описано в настоящем документе, заявитель обнаружил, что этот синтетический олигопептид также демонстрирует нейропротекторные эффекты в крысиной модели дегенерации зрительного нерва и, как указано выше, также может быть эффективным для предотвращения или восстановления других типов повреждения или дегенерации нерва, таких как вторичное повреждение нейронов, связанное с травматическими повреждениями.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
В соответствии с настоящим изобретением предложен способ индукции у человека или отличного от человека животного эффекта, выбранного из следующих: нейропротекция, защита от патологии или повреждения нервов или их уменьшение, лечение глаукомы, лечение возрастной макулярной дегенерации или других унаследованных или приобретенных дегенераций сетчатки, усиление восстановления ткани сетчатки, усиление регенеративной терапии сетчатки посредством активации врожденных иммунных клеток или лечение наследственной или приобретенной дегенерации сетчатки. Такой способ предусматривает введение субъекту неприродного пептида, который вызывает такой эффект, в количестве, которое эффективно для того, чтобы вызвать такой эффект.
В соответствии с настоящим изобретением, пептид может содержать глицинил-аргинил-глицинил-цистеиновую кислоту-треонил-пролин (SEQ ID NO: 1), включая в себя любой фрагмент, аналог, производное, фармацевтически приемлемую соль, гидрат, изомер, мультимер, циклическую форму, линейную форму, конъюгат, производное или другую модифицированную форму, которая вызывает указанный эффект. Другие неприродные пептиды, которые могут быть использованы в способах по настоящему изобретению, могут включать в себя некоторые из соединений, описанных в рассматриваемой предварительной заявке на патент США № 62/521984, поданной 19 июня 2017 г., полное описание которой прямо включено в настоящий документ посредством ссылки.
Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, способ может быть осуществлен для защиты от повреждения, уменьшения повреждения или восстановления функции после повреждения зрительного нерва и/или сетчатки у субъекта, страдающего от глаукомы, возрастной макулярной дегенерации, сухой макулярной дегенерации или других наследственных или приобретенных дегенераций сетчатки, таких как пигментный ретинит.
Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением способ может быть осуществлен для лечения субъекта, который перенес травму, механическое повреждение или поражение (например, гипоксическое или ишемическое поражение) головного мозга, спинного мозга, ЦНС или периферической нервной системы.
Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением способ может быть осуществлен для лечения или восстановления ослабленной функции головного мозга или другой части нервной системы субъекта после события, повреждающего нерв или головной мозг, такого как заболевание, травма или поражение, включая в себя, без ограничения, остановку сердца, инсульт, гипоксическое или ишемическое поражение, заболевание, нарушение или травму.
Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением способ может быть осуществлен для защиты или уменьшения повреждения нерва из-за нейропатического или нейродегенеративного заболевания или нарушения, будь то глазное или системное.
Другие аспекты и детали настоящего изобретения будут понятны после прочтения подробного описания и примеров, изложенных ниже.
Краткое описание графических материалов
Следующее подробное описание и примеры предоставлены с целью неисчерпывающего описания некоторых, но не обязательно всех, примеров или вариантов осуществления настоящего изобретения и никоим образом не должны ограничивать объем настоящего изобретения.
Фиг. 1 представляет собой гистограмму сравнения количества ганглиозных клеток в каждом поле с количеством исследованных полей, как описано в примере 1 ниже, при обработке люминатом по сравнению с контролем.
Фиг. 2 представляет собой гистограмму сравнения общего количества клеток во всех полях с количеством всех клеток при обработке люминатом и контроле, как описано в примере 1 ниже, при обработке люминатом и контроле.
Фиг. 3 представляет собой гистограмму сравнения количества клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE) в контрольных и обработанных планшетах, как описано в примере 2 ниже (условные обозначения: Cont = контрольная (BSS) обработка; Lu = обработка люминатом (только); H2O2, 100 мкМ = обработка пероксидом (только); Lu, H2O2, 100 мкМ = люминат с последующей обработкой пероксидом).
Фиг. 4 представляет собой гистограмму сравнения количества клеток Мюллера сетчатки в контрольных и обработанных планшетах, как описано в примере 3 ниже (условные обозначения: Cont = контрольная (BSS) обработка; Lu = обработка люминатом (только); KA = обработка каиновой кислотой (только) и KA-Lu, 500 мкМ = люминат с последующей обработкой каиновой кислотой).
На фиг. 5 показаны гистологические микрофотографии ткани сетчатки, взятые у крыс, обработанных контрольными или увеличивающимися дозами нейротоксического средства каиновой кислотой, как описано в примере 4 ниже.
Фиг. 6 представляет собой гистограмму сравнения количества нейронов сетчатки в контрольных и обработанных планшетах, как описано в примере 5 ниже (условные обозначения: Cont = контрольная (BSS) обработка; Lu = обработка люминатом (только); KA, 100 мкМ = обработка каиновой кислотой (только) и Lu-KA, 100 мкМ = люминат с последующей обработкой каиновой кислотой).
Подробное описание настоящего изобретения
Следующее подробное описание и сопровождающие графические материалы, на которые оно ссылается, предназначены для описания некоторых, но не обязательно всех, примеров или вариантов осуществления настоящего изобретения. Описанные варианты осуществления следует рассматривать во всех отношениях только как иллюстративные, а не ограничивающие. Содержание этого подробного описания и прилагаемых графических материалов никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения.
Заявитель изучил безопасность и нейропротектекторные эффекты соединения, содержащего неприродный пептид глицинил-аргинил-глицинил-цистеиновая кислота-треонил-пролин (SEQ ID NO: 1), имеющего структурную формулу соединения 1 ниже (также упоминаемого как ALG-1001 или Luminate®, Allegro Ophthalmics, LLC):
Циклическая форма неприродного пептида глицинил-аргинил-глицинил-цистеиновая кислота-треонил-пролин (SEQ ID NO: 1) показана ниже как соединение 2:
Соединения 1 и 2, а также другие родственные соединения описаны в рассматриваемых патентных заявках США с серийными номерами 13/467995 и 14/696250, причем полное раскрытие каждой такой заявки специально включено в настоящий документ посредством ссылки.
Пример 1
Глазная нейропротекция in vivo на крысиной моделе повышенного внутриглазного давления
Здоровых крыс Wister (n=8) в возрасте десяти (10) недель содержали в виварии, в котором поддерживалась постоянная температура 26°C и постоянный цикл свет-темнота (14 часов и 10 часов, соответственно) с доступной по желанию пищей. Крыс случайным образом делили на группу лечения люминатом из пяти (5) животных (группа А) и группу лечения основным солевым раствором (контроль BSS) из трех (3) животных (группа В).
Каждое животное группы А получало одну интравитреальную инъекцию в дозе 1,28 мг/20 мкл люмината в правый глаз. Каждое животное группы В получало по одной интравитреальной инъекции в дозе 20 мкл сбалансированного солевого раствора (BSS). Левые глаза всех животных в группах A и B не подвергали инъекции и использовали в качестве необработанных контролей. Интравитреальные инъекции вводили на расстоянии 2 мм за каймой в супроназальном квадранте с использованием иглы 30-го калибра, прикрепленной к шприцу объемом 1,0 куб. Были приняты меры, чтобы избежать повреждения линзы или сетчатки.
Через двадцать четыре (24) часа после введения инъекций крыс анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции в дозе 3,0 мл/кг смеси гидрохлорида кетамина (2,5 мг/мл), диазепама (2,0 мг/мл) и атропина (0,1 мг/мл). Затем глаза подвергали перитонеальной отслойке конъюнктивы боковой прямой мышцы, чтобы обнажить зрительный нерв. Затем зрительный нерв лигировали шелковым швом в течение 60 минут, в течение которых отсутствие кровотока в сетчатке каждого лигированного глаза проверяли с помощью контактной линзы Plano. Лигатуры удаляли через 60 минут, и восстановление кровотока в сетчатке проверяли в каждом ранее лигированном глазу с использованием контактной линзы Plano.
После удаления лигатур и проверки восстановления кровотока в сетчатке крыс содержали живыми в течение 48 часов, а затем умерщвляли посредством направления в брюшную аорту и нижнюю полую вену и перфузии 200 мл 10% формальдегида.
Затем глаза энуклеировали и фиксировали для гистопатологического анализа. Образцы сетчатки и зрительного нерва от каждого глаза обезвоживали и погружали в парафин. Горизонтальные срезы толщиной 4 микрона разрезали и окрашивали гематоксилином и эозином. Посредством световой микроскопии подсчитывали количество ганглиозных клеток в осевых срезах сетчатки каждого глаза от границы между зрительно и слепой частями сетчатки до зрительного нерва. Кроме того, в каждом сечении число ганглиозных клеток на миллиметр по всей длине сетчатки рассчитывали в цифровом виде с использованием калибровочного предметного стекла, откалиброванного для этой цели.
Измерение внутреннего сетчатого слоя проводили путем наблюдения срезов при увеличении в 40 раз не более 1 мм от зрительного нерва.
Результаты подвергали статистическому анализу. Результаты для каждой группы выражали как среднее ± стандартное отклонение, и статистическую значимость между результатами групп оценивали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа, а также U-критерия Манна-Уитни. Вероятности <0,05 считались значимыми.
В таблице 1 ниже показано количество ганглиозных клеток на поле для пяти (5) глаз, обработанных LUMINATE®, и трех глаз, обработанных BSS (контроль):
Таблица 1
| Случай 1 | Случай 2 | Случай 3 | Случай 4 | Случай 5 | |
| Поле 1 | 20 | 5 | 8 | 16 | 14 |
| Поле 2 | 17 | 14 | 10 | 16 | 24 |
| Поле 3 | 19 | 25 | 21 | 13 | 20 |
| Поле 4 | 19 | 16 | 9 | 28 | 16 |
| Поле 5 | 16 | 5 | 23 | 24 | 12 |
| Поле 6 | 21 | 25 | 29 | 16 | 15 |
| Поле 7 | 22 | 37 | 29 | 15 | 16 |
| Поле 8 | 19 | 15 | 31 | 25 | 10 |
| Поле 9 | 40 | 16 | 41 | 33 | 12 |
| Поле 10 | 28 | 7 | 29 | 8 | 19 |
| Поле 11 | 13 | 29 | 24 | 17 | |
| Сумма | 234 | 165 | 259 | 218 | 175 |
| SD | 7,268 | 10,157 | 10,596 | 7,454 | 4,036 |
| Контроль 1 | Контроль 2 | Контроль 3 | |||
| Поле 1 | 3 | 5 | 4 | ||
| Поле 2 | 6 | 14 | 2 | ||
| Поле 3 | 3 | 25 | 11 | ||
| Поле 4 | 13 | 16 | 15 | ||
| Поле 5 | 3 | 5 | 10 | ||
| Поле 6 | 0 | 25 | 14 | ||
| Поле 7 | 0 | 37 | 15 | ||
| Поле 8 | 1 | 15 | 8 | ||
| Поле 9 | 3 | 16 | 10 | ||
| Поле 10 | 0 | 7 | 19 | ||
| Поле 11 | 2 | 16 | |||
| Сумма | 34 | 165 | 124 | ||
| SD | 3,754 | 10,157 | 5,198 |
В таблице 2 ниже представлен двухфакторный дисперсионный анализ данных, представленных в таблице 1. Группа A включает в себя глаза, обработанные ALG1001, а группа B включает в себя глаза, обработанные BSS (контроль):
Таблица 2
| Сгруппировано в табличный формат | Группа A | Группа B | ||||||||
| Случаи | Контроли | |||||||||
| A:Y1 | A:Y2 | A:Y3 | A:Y4 | A:Y5 | B:Y1 | B:Y2 | B:Y3 | B:Y4 | B:Y5 | |
| Поле 1 | 20 | 5 | 8 | 16 | 14 | 3 | 5 | 4 | ||
| Поле 2 | 17 | 14 | 10 | 16 | 24 | 6 | 14 | 2 | ||
| Поле 3 | 19 | 25 | 21 | 13 | 20 | 3 | 25 | 11 | ||
| Поле 4 | 19 | 16 | 9 | 28 | 16 | 13 | 16 | 15 | ||
| Поле 5 | 16 | 5 | 23 | 24 | 12 | 3 | 5 | 10 | ||
| Поле 6 | 21 | 25 | 29 | 16 | 15 | 0 | 25 | 14 | ||
| Поле 7 | 22 | 37 | 29 | 15 | 16 | 0 | 37 | 15 | ||
| Поле 8 | 19 | 15 | 31 | 25 | 10 | 1 | 15 | 8 | ||
| Поле 9 | 40 | 16 | 41 | 33 | 12 | 3 | 16 | 10 | ||
| Поле 10 | 28 | 7 | 29 | 8 | 19 | 0 | 7 | 19 | ||
| Поле 11 | 13 | 29 | 24 | 17 | 2 | 16 |
В таблице 3 приведены результаты дисперсионного анализа в виде таблицы, представленные в таблице 2, с указанием статистически значимой разницы (р<0,0001) между глазами, обработанными люминатом (группа A), и глазами, обработанными BSS (контроль) (группа B).
Таблица 3
Табличные результаты двухфакторного дисперсионного анализа
| Анализируемая таблица | Двухфакторный дисперсионный анализ, не RM | ||||
| Двухфакторный дисперсионный анализ | Единичный | ||||
| Альфа | 0,05 | ||||
| Источник изменчивости | % полной вариации | P-значение | Итоговое Р-значение | Статистически значимый? | |
| Неаддитивность | 3,810 | 0,9385 | Незнач. | Нет | |
| Фактор строки | 12,37 | 0,2386 | Незнач. | Нет | |
| Фактор столбца | 22,62 | <0,0001 | **** | Да | |
| Таблица дисперсионного анализа | SS | DF | MS | F (DFn,DFd) | P-значение |
| Неаддитивность | 297,7 | 10 | 29,77 | F(10,64)=0,4070 | P=0,9385 |
| Фактор строки | 966,7 | 10 | 96,67 | F(10,64)=1,321 | P=02386 |
| Фактор столбца | 1767 | 1 | 1767 | F(10,64)=24,16 | P<0,0001 |
| Остаточное | 4682 | 64 | 73,16 |
Фиг. 1 представляет собой столбчатую диаграмму количества ганглиозных клеток в каждом поле относительно количества полей, исследованных в отношении обработки люминатом и контроля, иллюстрирующую различия между средним.
В таблице 4 показаны результаты в табличном виде U-критерия Манна-Уитни, которые также указывают на статистически значимое различие (р<0,0001) между глазами, обработанными люминатом (группа A), и глазами, обработанными BSS (контроль) (группа B).
Таблица 4
Табличные результаты Манна-Уитни
| Проанализированная таблица | Данные 1 |
| Колонка B | Контроли |
| против | против |
| Колонки A | Случаев |
| Критерий Манна-Уитни | |
| P-значение | <0,0001 |
| Точное или приближенное значение? | Точное |
| Итоговое P-значение | **** |
| Значимо различны? (P<0,05) | Да |
| Одно- или двустороннее значение? | Двустороннее |
| Сумма рангов в колонке A,B | 2871, 870,5 |
| U Манна-Уитни | 342,5 |
| Разность медиан | |
| Медиана колонки A | 18,00, n=54 |
| Медиана колонки B | 9,000, n=32 |
| Разница: фактическая | -9,000 |
| Разница: Ходжеса-Лемана | -10,00 |
| 95,05% CI разницы | От -13,00 до -6,000 |
| Точный или приближенный CI? | Точный |
Фиг. 2 представляет собой гистограмму сравнения среднего количества ганглиозных клеток на поле между глазами, обработанными люминатом (группа A), и глазами, обработанными BSS (контроль) (группа B), с использованием U-критерия Манна-Уитни.
На основании этих данных примера 1 сделан вывод, что интравитреальное введение препарата, содержащего эффективное количество пептида глицинил-аргинил-глицинил-цистеиновая кислота-треонил-пролин (SEQ ID NO: 1) (люминат), характеризовалось значительными нейропротективными эффектами у этой крысиной модели повышенного IOP. Как отмечалось выше, положительные результаты на этой животной модели индуцированного глаукомой повреждения нейронов в глазу не только свидетельствуют о его полезности в качестве нейропротекторного средства для глаз, но также и в качестве нейропротекторного средства, применимого для снижения гибели или нарушения нейрональной функции после повреждения или травмы других нейрональных тканей, в том числе головного и спинного мозга.
Пример 2
InVitro нейропротекторное действие люмината на пигментный эпителий сетчатки (RPE)
Известно, что пероксид водорода (H2O2), физиологический медиатор окислительного стресса, вызывает апоптоз в эпителиальных клетках сетчатки (RPE).
Клетки ARPE-19 инкубировали в среде DMEM/F12 с добавлением фетальной бычьей сыворотки (FBS) в концентрации 10% и стрептомицина в концентрации 50 мкг/мл и пенициллина в концентрации 50 мкг/мл при температуре 37°C в атмосфере 5% CO2. Для индукции дифференцировки клетки ARP-19 культивировали в трансвелах с покрытием ламинином в течение 2 недель в той же среде, дополненной 1% FBS и антибиотиками. Затем клетки RPE выделяли и аликвоты приблизительно 150-200 мкл клеточной суспензии распределяли в чашки Петри, содержащие контрольную среду. Затем клетки инкубировали при температуре 37°С в течение 24 часов перед использованием.
После этого готовили следующие четыре (4) отдельные чашки нейронов, как показано ниже:
А) Контрольные клетки сетчатки RPE;
B) Клетки сетчатки RPE, инкубированные с ALG-1001 (люминат) в концентрации 1,0 мг/мл;
C) Клетки сетчатки RPE, инкубированные с пероксидом водорода в концентрации 100 мкМ; а также
D) Клетки RPE сетчатки, инкубированные с ALG-1001 (люминат) в концентрации 1,0 мг/мл в течение 24 часов перед воздействием пероксидом водорода в концентрации 100 мкМ.
Через восемь (8) часов после воздействия количество клеток измеряли с использованием способа вытеснения трипанового синего в камере Нейбауэра. Фиг. 3 представляет собой гистограмму сравнения количества клеток RPE на планшетах A, B, C и D. Эти данные примера 2 показывают, что пероксид водорода был токсичен для клеток RPE, о чем свидетельствует тот факт, что количество клеток RPE в планшете, обработанном только пероксидом водорода (планшет C), составляло только 78% от количества контрольных клеток (планшет A). Однако количество клеток RPE в планшете, предварительно обработанном ALG-1001 (люминатом) до воздействия пероксида водорода (пластина D), составляло 90% от количества контрольных клеток (пластина A), что указывает на то, что предварительная обработка ALG-1001 (люминатом), характеризовалась нейропротекторным эффектом в этой модели in vitro.
Пример 3
InVitro нейропротекторные эффекты люмината на клетки Мюллера сетчатки
Мышей CD1 умерщвляли путем декапитации, глаза быстро энуклеировали в комплемент DMEM с раствором антибиотика и хранили в течение ночи при комнатной температуре. Затем интактные глазные яблоки инкубировали в DMEM, содержащей 0,1% трипсина и 70 Ед/мл коллагеназы, при температуре 37°С в течение 60 минут.
Инкубированные материалы помещали в чашку Петри, содержащую DMEM, дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой, и сетчатки удаляли без клеток RPE в небольшие агрегаты и высевали в чашки 35 мм для культивирования. Среду не меняли в течение 6 дней, а затем пополняли каждые 3 - 4 дня. Культуры выдерживали при температуре 37°С в 55% СО2/95% О2 в увлажненном инкубаторе.
Когда разрастание клеток достигало полуконфлюентности, (80%) агрегатов сетчатки удаляли путем пипетирования среды в чашку. Эту операцию повторяли три (3) раза до получения очищенной плоской клеточной популяции. Через 24 часа клетки подвергали экспериментальным условиям.
Готовили четыре (4) отдельные чашки для клеток Мюллера следующим образом: А) контрольные клетки Мюллера; B) клетки Мюллера, инкубированные с ALG-1001 (люминат) в концентрации 1,0 мг/мл; C) клетки Мюллера, инкубированные с каиновой кислотой в концентрации 500 мкМ и D) клетки Мюллера, инкубированные с люминатом в концентрации 1,0 мг/мл в течение 24 часов перед воздействием каиновой кислотой в концентрации 500 мкМ. Через сорок восемь (48) часов после воздействия количество клеток измеряли с использованием способа вытеснения трипанового синего в камере Нейбауэра.
Фиг. 4 представляет собой гистограмму сравнения количества клеток Мюллера на планшетах A, B, C и D. Эти данные показывают, что планшет, инкубированный с люминатом в концентрации 1,0 мг/мл в течение 24 часов перед воздействием каиновой кислотой в концентрации 500 мкМ (планшет D), характеризовался более высоким количеством клеток Мюллера, чем любой из других планшетов (A, B или C), и значительно большим количеством клеток Мюллера, чем планшет (планшет C), который подвергался воздействию каиновой кислотой без предварительной обработки люминатом.
Через сорок восемь (48) часов после воздействия количество клеток измеряли с использованием способа вытеснения трипанового синего в камере Нойбауэра. Фиг. 4 представляет собой гистограмму сравнения количества клеток Мюллера на планшетах A, B, C и D. Эти данные указывают на то, что планшет, инкубированный с люминатом в концентрации 1,0 мг/мл в течение 24 часов до воздействия каиновой кислотой в концентрации 500 мкМ (планшет D), характеризовался более высоким числом клеток Мюллера, чем любой из других планшетов (A, B или C), и значительно более высоким числом клеток Мюллера, чем планшет (планшет C), который подвергался воздействию каиновой кислотой без предварительной обработки люминатом.
Пример 4
Дозозависимое нейротоксическое действие каиновой кислоты in vivo
В правые глаза 4 крысам Wister вводили интравитреально 20 мкл четырех различных растворов, как указано ниже: A) раствор BSS в качестве контроля, B) каиновую кислоту в концентрации 0,5 мМ, C) каиновую кислоту в концентрации 5,0 мМ и D) каиновую кислоту в концентрации 50,0 мМ.
Крыс умерщвляли через 24 часа после обработки, и глаза готовили к гистопатологическому исследованию. На фиг. 5 показаны репрезентативные гистологические срезы для каждого из четырех (4) обработанных глаз.
Результаты ясно демонстрируют дегенерацию сетчатки крыс Wister при увеличении концентрации каиновой кислоты от 0,5 мМ до 5,0 мМ. Это подтверждает, что каиновая кислота действительно вызывает дозозависимую нейротоксичность сетчатки in vitro, и подтверждает актуальность исследований с использованием обработанных каиновой кислотой клеток сетчатки in vitro, таких как примеры 2, 3 и 5 настоящей патентной заявки.
Пример 5
InVitro нейропротекторные эффекты люмината на нейроны сетчатки
Мышей CD1 умерщвляли путем декапитации, глаза быстро энуклеировали в комплемент DMEM с раствором антибиотика и сетчатку выделяли из пигментного эпителия.
Выделенную сетчатку инкубировали в среде Хэнка, содержащей папаин в концентрации 2,5 мг/мл и цистеин в концентрации 0,1 мг/мл, в течение 15 минут при температуре 30°С. После промывания средой Хэнка с добавлением CaCl2 в концентрации 1,9 мМ, MgCl2 в концентрации 0,6 мМ и бычьего сывороточного альбумина в концентрации 0,1 мг/мл.
Сетчатку механически отделяли, приблизительно 150-200 мкл клеточной суспензии вносили в чашку Петри, содержащую контрольную среду. Биполярные клетки идентифицировали под микроскопом по морфологии клеток. Клетки инкубировали в течение 6 часов перед использованием.
Четыре (4) отдельные чашки нейронов готовили следующим образом: A) контрольные нейроны сетчатки, B) нейроны сетчатки, инкубированные с ALG-1001 (люминат) в концентрации 1,0 мг/мл, C) нейроны сетчатки, инкубированные с каиновой кислотой в концентрации 100 мкМ, D) нейроны сетчатки, инкубированные с люминатом в концентрации 1,0 мг/мл в течение 24 часов перед воздействием каиновой кислоты в концентрации 500 мкМ.
Через восемь (8) часов после воздействия количество клеток измеряли с использованием способа вытеснения трипанового синего в камере Нейбауэра.
Фиг. 6 представляет собой гистограмму сравнения количества нейронов сетчатки на планшетах A, B, C и D. Эти данные показывают, что каиновая кислота была токсичной для нейронов сетчатки, и предварительная обработка люминатом существенно снижала эту токсичность. В частности, количество нейронов в планшете, обработанном только каиновой кислотой в концентрации 100 мкМ (планшет C), составляло 58% по сравнению с контролем, в то время как количество нейронов в планшете, инкубированном с люминатом в концентрации 1,0 мг/мл в течение 24 часов перед воздействием каиновой кислотой в концентрации 500 мкМ (планшет D), составляло 80% от контроля. Эти результаты заслуживают особого внимания, учитывая, что планшет D получил в пять (5) раз больше каиновой кислоты, чем планшет C.
Пример 6
Проспективное открытое исследование на людях люмината при лечении сухой AMD
Чтобы определить, оказывает ли единичная интравитреальная инъекция люмината в концентрации 1,0 мг/50 мкл какое-либо влияние на улучшение наибольшей остроты зрения с коррекцией (BCVA) у субъектов с сухой AMD, с умеренной или умеренно выраженной сухой AMD.
Это проспективное интервенционное, открытое, одобренное IRB клиническое подтверждение на людях концепции исследования проводили на 7 людях с умеренной и умеренно тяжелой сухой AMD.
Основные критерии включения включали в себя пациентов с сухой макулярной дегенерацией с относительно интактными фоторецепторными слоями и слоями RPE в центральном 1 мм макулы по OCT.
Исходный уровень BCVA у субъектов находился между 20/30 и 20/400 без каких-либо признаков субретинальной жидкости или CNV и отсутствии лечения анти-VEGF в анамнезе.
Все включенные пациенты проходили базовую однократную интравитреальную инъекцию люмината в концентрации 1,0 мг/50 мкл и подвергались мониторингу ежемесячно, кроме того, получали толщину центральной макулы, OCT, цифровые цветные фотографии и BCVA до и после лечения.
Результаты этого открытого подтверждающего концепцию исследования люмината при лечении сухого AMD у пациентов-людей, обобщены в таблице 5 ниже:
Таблица 5
| Пациент | Исходная BCVA | BCVA через 3 месяца после лечения |
| 1 | 0,5 log Mar (20/63) | 0,3 log Mar (20/40) Добавилось 10 букв |
| 2 | 1,0 log Mar (20/200) | 0,6 log Mar (20/80) Добавилось 20 букв |
| 3 | 1,3 log Mar (20/400) | 1,0 log Mar (20/200) Добавилось 15 букв |
| 4 | 0,2 log Mar (20/32) | 1,0 log Mar (20/200) Добавилось 15 букв |
| 5 | 1,3 log Mar (20/400) | 1,3 log Mar (20/400) Не добавилось букв |
| 6 | 0,40 log Mar (20/50) | 0,20 log Mar (20/32) Добавилось 10 букв |
* У пациента 5 наблюдались худшие исходные фовеальные анатомические особенности в группе и не было обнаружено заметного улучшения BCVA.
Эти результаты указывают на то, что в этом исследовании BCVA субъектов, получавших люминат, улучшилось до 20 букв.
Следует принимать во внимание, что, хотя настоящее изобретение было описано выше со ссылкой на определенные примеры или варианты осуществления настоящего изобретения, в описанные примеры и варианты осуществления могут быть внесены различные дополнения, исключения, изменения и модификации, не отступая от предполагаемой сущности и объема настоящего изобретения. Например, любые элементы, стадии, представители, компоненты, композиции, реагенты или части одного варианта осуществления или примера могут быть включены или использованы с другим вариантом осуществления или примером, если не указано иное или если это не сделает этот вариант осуществления или пример неподходящим для его предполагаемого использования. Кроме того, если стадии способа или процесса были описаны или перечислены в определенном порядке, порядок таких стадий может быть изменен, если не указано иное, или если это не сделает способ или процесс непригодным для его предполагаемой цели. Кроме того, элементы, стадии, представители, компоненты, композиции, реагенты или части любого изобретения или примера, описанного в настоящем документе, могут необязательно существовать или использоваться при отсутствии или существенном отсутствии любого другого элемента, стадии, представителя, компонента, композиции, реагента или части, если не указано иное. Все разумные добавления, исключения, модификации и изменения должны рассматриваться как эквиваленты описанных примеров и вариантов осуществления и должны быть включены в объем следующей формулы изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> АЛЛЕГРО ФАРМАСЬЮТИКАЛС, ИНК.
<120> ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ И НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫЕ ПЕПТИДЫ
<130> ALLEG-008PC
<140> PCT/US2018/014287
<141> 2018-01-18
<150> 62/500998
<151> 2017-05-03
<150> 62/448,300
<151> 2017-01-19
<160> 1
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Цистеиновая кислота
<400> 1
Gly Arg Gly Xaa Thr Pro
1 5
<---
1. Применение пептида, который содержит глицинил-аргинил-глицинил-цистеиновую кислоту-треонил-пролин для а) восстановления ранее утраченной остроты зрения у субъекта, представляющего собой человека или животного, страдающего от неэкссудативной или сухой возрастной макулярной дегенерации, или b) защиты зрительного нерва, клеток Мюллера сетчатки, нейронов сетчатки или клеток пигментного эпителия сетчатки от повреждения вследствие повышенного внутриглазного давления или дегенеративного заболевания сетчатки.
2. Применение по п. 1, в котором пептид характеризуется формулой:
.
3. Применение по любому из предыдущих пунктов, в котором субъект характеризуется отсутствием признаков субретинальной жидкости и отсутствием лечения анти-VEGF в анамнезе.
4. Применение по любому из предыдущих пунктов, в котором композицию пептида вводят интравитреально.
5. Применение по п.4, в котором композицию пептида вводят путем интравитреальной инъекции.
6. Применение по п.5, в котором в глаз субъекта интравитреально вводят раствор, содержащий 1,0 мг композиции пептида на 50 мкл.
