Способ получения питательной среды для селективного выявления candida auris

Изобретение относится к области биотехнологии. Сущность изобретения заключается в том, что в отечественную среду «Питательная среда для культивирования легионелл (Легионелбакагар)» вносят дрожжевой экстракт, глюкозу, железа пирофосфат растворимого и после автоклавирования и охлаждения эмульсию яичного желтка, а визуальную идентификацию культуры осуществляют по наличию зоны фосфолипазной активности вокруг колонии Candida auris и отсутствию данной зоны у других дрожжеподобных грибов вида Candida, что позволяет упростить и исключить ложную идентификацию возбудителя, сократить время исследования. 18 ил., 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии и может быть использовано для селективного выявления Candida auris в клиническом материале и других объектах. Колонизация и инфицирование Candida auris среди госпитализированных пациентов и лиц, находящихся на длительном лечении, стала глобальной проблемой,

Кандидоз, наиболее распространенная дрожжевая инфекция, чаще вызывается видом Candida albicans. Открытый недавно патоген - Candida auris становится значимым этиологическим агентом инвазивного кандидоза наряду с Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida glabrata. Реальная распространенность Candida auris как в мире, так и в России неизвестна. Патоген Candida albicans обычно чувствителен к азольным группам антигрибковых препаратов. Однако Candida glabrata, Candida tropicalis и Candida krusei толерантны к азолу. Candida auris обладает множественной устойчивостью к противогрибковым лекарственным средствам и единственный представитель грибов рода Candida, который легко передается от человека к человеку. Лабораторная диагностика инфекции Candida auris с использованием доступных тест-систем затруднительна ввиду частых ошибок идентификации. Быстрая идентификация видов кандид является необходимой для установления правильного диагноза и назначения лечения.

Наиболее высокой степенью точности идентификации обладает метод, основанный на матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (MALDI-TOF) и способен отличить Candida auris от других видов Candida. Такая услуга доступна крупным бактериологическим лабораториям, но не доступна для обычных клинических и бактериологических лабораторий.

Для бактериологического контроля Candida spp. (Candida albicans и других видов грибов рода Candida) рекомендовано использование питательных сред: «Питательная среда для контроля микробной загрязненности» Питательная среда (ГРМ №2 (Сабуро)», «Питательная среда для выделения и культивирования дрожжеподобных и плесневых грибов Сабуро - мальтоза агар», триптикоза - соевого агара по ОФС.1.2.4.0003.15 ГФ РФ Государственная фармокопея Российской Федерации XIV издание, МУК 4.2.2942-11 (Методы санитарно-бактериологических исcледований объектов окружающей среды, воздуха и контроля стерильности в лечебных организациях), регламентирующим перечень питательных сред для выявления Candida albicans.

Ведущими зарубежными фирмами выпускаются среды для обнаружения Candida spp.: Соево-казеиновый агар (Casein Soya Bean Digest MERCK), HiMedia выпускаются сухие питательные agar HiMedia, Агар Сабуро с глюкозой (Sabouraud 4% Glucose Agar) HiMedi, Бульон Сабуро (Sabouraud Broth) HiMedia, Декстрозный агар Сабуро с соевым лецитином и Твин 80 HiMedia (ФСЗ 2009/03709).

Недостатком вышеперечисленных сред является одинаковый рост колоний Candida spp.

Известна «Питательная среда для выращивания дрожжевых и плесневых грибов (агар Сабуро)». Состав питательной среды (агар Сабуро): панкреатический гидролизат рыбной муки - 10 г/л, панкреатический гидролизат казеина - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 2,0 г/л, натрий фосфорнокислый однозамещенный - 2 г/л, глюкоза моногидрат - 40 г/л, агар микробиологический - 10,0 +/- 3,0, вода очищенная - 1000 мл, рН 6,0. Данная среда традиционно используется для микробиологической практики. На агаре Сабуро рост Candida spp. в виде белых колоний среднего размера, рост Candida auris в виде более мелких белых колоний.

Однако эта среда не позволяет провести идентификацию до вида.

Для идентификации используют хромогенную среду, предназначенную для дифференциации C. albicans и других видов Candida в клинических и неклинических образцах: «HiCrome Candida Differential agar» M1297A состоящий из следующих компонентов г/л: пептон особый - 15,0 г/л, дрожжевой экстракт - 4,0г/л, дикалий гидрофосфат - 1,0 г/л, хромогенная смесь - 7,22 г/л, хлорамфеникол - 0,500 г/л, агар микробиологический - 15 г/л.

«HiCrome Candida Differential agar» является альтернативой традиционным средам для выделения и идентификации Candida spp. Хромогенные субстраты, содержащиеся в данной среде, позволяют быстро идентифицировать и дифференцировать различные виды кандид по цвету колоний. Колонии Candida albicans - зеленые, Candida krusei - фиолетово-розовые, Candida tropicalis - синие, Candida glabrata и Candida parapsilosis - бледно-фиолетовый. Candida auris может иметь на данной среде розовый, красный, кремовый или фиолетовый цвет, а также иметь сочетание этих цветов на одной чашке.

Слабовыраженное окрашивание колоний Candida auris, приводящее к сомнительным дифференцирующим свойствам, и высокая стоимость являются недостатками этой среды.

Наиболее близкой к предлагаемой является «Питательная среда для выращивания дрожжеподобных и плесневых грибов (Сабуро - мальтоза - агар)». Состав питательной среды (Сабуро - мальтоза - агар): пептон ферментативный 10,0 г/л, дрожжевой экстракт 2,0 г/л, лимонная кислота 0,15 г/л, мальтоза 40,0 г/л, агар 10,0 г/л, дистиллированная вода - 1,0 л, рН 5,7 - 6,3. Навеску, соответственно прописи, растворяют в 1000 мл дистиллированной воды, автоклавируют 15 мин. при 121°С, после охлаждения до 50 - 45°С вносят в среду 2%-ный раствор теллурита калия в расчете 5,0 мл/л, разливают в стерильные чашки Петри.

На традиционной среде «Сабуро - мальтоза - агар» для всех исследуемых штаммов, были одинаково мелкие черные колонии, что приводит к ложной идентификации возбудителя.

Техническим результатом изобретения является создание отечественной питательной среды, позволяющей достичь стабильности результатов по ростовым и дифференцирующим свойствам, упростить и исключить ложную идентификацию возбудителя, сократить время исследования.

Технический результат достигается тем, что что навеску питательной среды следующего состава: пептон ферментативный 10,0 г/л, дрожжевой экстракт 2,0 г/л, лимонную кислоту 0,15 г/л, мальтозу 40,0 г/л, агар 10,0 г/л, соответственно прописи, растворяют в 1,0 л дистилированной воды, вносят 10,0 мл/л 2%-ного раствора теллурита калия до стерилизации среды, автоклавируют 15 мин. при 121°С, охлаждают до 50 - 45°С, разливают в стерильные чашки Петри, подсушивают и используют для высева.

Графические материалы иллюстрирующие предлагаемое изобретение:

Фиг.1 фото среды по прототипу «Сабуро - мальтоза - агар».

Фиг.2 фото среды «Сабуро - мальтоза - агар» с теллуритом калия (внесен до стерилизации)

Фиг.3 фото среды «Сабуро - мальтоза - агар» с теллуритом калия (внесен после стерилизации)

Фиг.4 Рост культуры Candida albicans ATCC 90028 на питательной среде «Сабуро - мальтоза - агар» с теллуритом калия (внесен до стерилизации)

Фиг.5 Рост культуры Candida albicans ATCC 90028 на питательной среде «Сабуро - мальтоза - агар» с теллуритом калия (внесен после стерилизации)

Фиг.6 Рост культуры Candida auris СBS 10913 на питательной среде «Сабуро - мальтоза - агар» с теллуритом калия (внесен до стерилизации)

Фиг.7 Рост культуры Candida auris СBS 10913 на питательной среде «Сабуро - мальтоза - агар» с теллуритом калия (внесен после стерилизации)

Фиг.8 Рост культуры Candida auris 42/80 на питательной среде «Сабуро - мальтоза - агар» с теллуритом калия (внесен до стерилизации)

Фиг.9 Рост культуры Candida auris 42/80 на питательной среде «Сабуро - мальтоза - агар» с теллуритом калия (внесен после стерилизации)

Фиг.10 Рост культуры Candida lusitania на питательной среде «Сабуро - мальтоза - агар» с теллуритом калия (внесен до стерилизации)

Фиг.11 Рост культуры Candida lusitania на питательной среде «Сабуро - мальтоза - агар» с теллуритом калия (внесен после стерилизации)

Фиг.12 Рост культуры Candida glаbrata на питательной среде «Сабуро - мальтоза - агар» с теллуритом калия (внесен до стерилизации)

Фиг.13 Рост культуры Candida glаbrata на питательной среде «Сабуро - мальтоза - агар» с теллуритом калия (внесен после стерилизации)

Фиг.14 Рост культуры Candida dubliensis на питательной среде «Сабуро - мальтоза - агар» с теллуритом калия (внесен до стерилизации)

Фиг.15 Рост культуры Candida dubliensis на питательной среде «Сабуро - мальтоза - агар» с теллуритом калия (внесен после стерилизации

Фиг.16 Рост культуры Candida parapsilosis на питательной среде «Сабуро - мальтоза - агар» с теллуритом калия (внесен после стерилизации)

Фиг.17 Рост культуры Candida parapsilosis на питательной среде «Сабуро - мальтоза - агар» с теллуритом калия (внесен до стерилизации)

Фиг.18 Рост культуры Staphylococcus aureus (верхний сектор), Candida auris (нижний левый сектор), Candida albicans (нижний правый сектор), на питательной среде «Сабуро - мальтоза - агар» с теллуритом калия (внесен до стерилизации)

Пример 1.

Навеску 62,5г, содержащей пептон ферментативный 10,0 г/л, дрожжевой экстракт 2,0 г/л, лимонную кислоту 0,15 г/л, мальтозу 40,0 г/л, агар 10,0 г/л, и 10,0 мл/л 2%-ного раствора теллурита калия, растворяют в 1,0 л дистилированной воды, тщательно перемешивают, автоклавируют при температуре 121°С, охладают до 50 - 45°С, разливают в стерильные чашки Петри, подсушивают и используют для высева.

Контроль: «Сабуро - мальтоза - агар» с теллуритом калия (внесен после стерилизации) и питательная среда Сабуро.

Высев на данные питательные среды штаммов C. auris CBS 10913, C. auris 48/20, C. albicans ATCC 90028, C. lusitania AV85, C. glаbrata, C. dubliensis KM19, C. parapsilosisOR16, C. kefir до единичных колоний проводят общепринятым микробиологическим методом. Результаты характерных признаков роста колоний Candida spp., выращенных при температуре 37°C в течение 24 - 48 часов, представлены в таблице№1.

Таблица №1.
№ п/п	Наименование исследуемых штаммов	Исследуемые среды
Сабуро - мальтоза агар	Сабуро - мальтоза агар с теллуритом калия (внесен после стерилизации)	Сабуро - мальтоза агар с теллуритом калия (внесен до стерилизации
1	C. auris CBS 10913	Более мелкие белые колонии	Черные мелкие колонии	Средние серые колонии с четким серым центром
2	C. auris 48/20	Более мелкие белые колонии	Черные мелкие колонии	Средние серые колонии с четким серым центром
3	C. albicans ATCC 90028	Мелкие белые колонии	Черные мелкие колонии	Крупные бело- серые с более серым центром
4	C. lusitania AV85	Мелкие белые колонии	Черные мелкие колонии	Крупные темно- серые с более серым центром и светлой каймой вокруг колонии
5	C. glаbrata	Мелкие белые колонии	Черные мелкие колонии	Крупные серые с более серым центром
6	C. dubliensis KM19	Мелкие белые колонии	Черные мелкие колонии	Крупные белые с черной каймой вокруг колонии
7	C. parapsilosis OR16	Мелкие белые колонии	Черные мелкие колонии	Средние белые колонии
8	Staphylococcus aureus	Мелкие белые колонии	Рост подавлен	Средние четкие черные колонии

На Сабуро - мальтоза - агар рост Candida spp. в виде черных колоний среднего размера, рост Candida auris в виде более мелких колоний.

Предлагаемый способ получения питательной среды обеспечивает рост Candida albicans - крупные бело- серые с более серым центром, Candida lusitania - крупные темно - серые с более серым центром и светлой каймой вокруг колонии, Candida glabrata - крупные серые с более серым центром, Candida dubliensis - крупные белые с черной каймой вокруг колонии, Candida parapsilosis - средние белые колонии, Candida auris., на среде полученной предлагаемым способом, - средние серые колонии с четким серым центром.

Таким образом, из фото № 4 - № 18 видно, что предлагаемый способ получения питательной среды по сравнению со средой прототипом позволяет визуально идентифицировать Candida auris, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei, Candida glabrata, Candida parapsilosis и Staphylococcus aureus.

Внесение до стерилизации 10,0 мл/л 2%-ного раствора теллурита калия в традиционную среду для культивирования Candida spp. дает возможность не проводить трудоемких затрат для разработки питательных сред и одновременнно и получить четкий результат идентификации до вида, что позволяет исключить ложную идентификацию Candida auris.

Способ получения питательной среды для селективного выявления Candida auris, заключающийся в том, что навеску питательной среды следующего состава: пептон ферментативный 10,0 г/л, дрожжевой экстракт 2,0 г/л, лимонная кислота 0,15 г/л, мальтоза 40,0 г/л, агар 10,0 г/л растворяют в 1,0 л дистиллированной воды, отличающийся тем, что 10,0 мл/л 2%-ного раствора теллурита калия вносят до стерилизации среды Сабуро – мальтоза-агар, автоклавируют 15 мин при 121°С, охлаждают до 50-45°С, разливают в стерильные чашки Петри, после охлаждения чашки подсушивают и используют для высева.