Способ прогнозирования течения хронического лимфолейкоза

Изобретение относится к области медицины - к онкогематологии и может быть использовано для прогнозирования течения хронического лимфолейкоза. На амбулаторном этапе после постановки диагноза определяют уровень лимфоцитов и экспрессию PD-1 и LAG-3 на CD19+ клетках в крови методом проточной цитофлуориметрии. При уровне лимфоцитов ≥ 67,11%, экспрессии PD-1 ≥ 40,81% и LAG-3 ≥ 24,62% на CD19+ клетках прогнозируют неблагоприятное течение хронического лимфолейкоза. Применение способа позволяет прогнозировать течение заболевания уже на амбулаторном этапе, в дополнение к стандартным критериям прогнозирования течения хронического лимфолейкоза. 2 пр., 1 табл.

 

Изобретение относится к области медицины, к онкогематологии и может быть использовано для прогнозирования течения хронического лимфолейкоза.

Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) является самым часто встречающимся типом лейкоза среди людей старшей возрастной группы и составляет 12% от всех зрелых В-ЛПЗ (см. Yosifov, D.Y.; Wolf, C.; Stilgenbauer, S.; Mertens, D. From Biology to Therapy: The CLL Success Story. HemaSphere 2019, 3, e175. [CrossRef] [PubMed]). В Российской Федерации в 2018 году заболеваемость хроническим лимфолейкозом составила 2,95:100000 населения, медиана возраста на момент установления диагноза - 68 лет (см. КапринА.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В. Злокачественные новообразования в России в 2018 году (заболеваемость и смертность). М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России; 2019. 250 с.).

Хронический лимфолейкоз - В-клеточное лимфопролиферативное заболевание, характеризующееся накоплением в периферической крови, костном мозге, селезенке и других лимфоидных тканях небольших, зрелых, опухолевых клональных лимфоидных клеток, с иммунофенотипом CD19+CD5+CD23+, который соответствует В-лимфоцитам поздних стадий дифференцировки (см. Kipps, T.J.; Stevenson, F.K.; Wu, C.J.; Croce, C.M.; Packham, G.; Wierda, W.G.; O’Brien, S.; Gribben, J.; Rai, K. Chroniclymphocyticleukaemia. Nat. Rev. Dis. Prim. 2017, 3, 1-22. [CrossRef] [PubMed]. Chiorazzi, N.; Rai, K.R.; Ferrarini, M. Chronic Lymphocytic Leukemia. N. Engl. J. Med. 2005, 352, 804-815. [CrossRef]).

ХЛЛ демонстрирует клиническую гетерогенность, начиная от вялотекущего заболевания, не требующего лечения у одних пациентов, до быстрого прогрессирования заболевания и последующей рефрактерности к лечению у других (см. Rodríguez-Vicente, A.E.; Díaz, M.G.; Hernández-Rivas, J.M. Chronic lymphocytic leukemia: A clinical and molecular heterogenous disease. Cancer Genet. 2013, 206, 49-62. [CrossRef] [PubMed]).

В этой связи, одной из основных задач на момент установления диагноза является оценка риска развития прогрессирования заболевания, что позволит своевременно начать специфическую терапию (см. Eichhorst, B.; Robak, T.; Montserrat, E.; Ghia, P.; Niemann, C.; Kater, A.; Gregor, M.; Cymbalista, F.; Buske, C.; Hillmen, P.; et al. Chronic lymphocytic leukaemia: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann. Oncol. 2021, 32, 23-33 [CrossRef]. Baliakas, P.; Mattsson, M.; Stamatopoulos, K.; Rosenquist, R. Prognostic indices in chronic lymphocytic leukaemia: Where do we stand how do we proceed? J. Intern. Med. 2015, 279, 347-357 [CrossRef]).

Наиболее известные прогностические биомаркеры - время удвоения лимфоцитов, уровень бета-2 микроглобулина, экспрессия CD38, ZAP-70, статус мутации гена тяжелой цепи иммуноглобулина (IgHV) и другие генетические аномалии (см. Brown JR, Hillmen P, O'Brien S, et al.: Extended follow-up and impact of high-risk prognostic factors from the phase 3 RESONATE study in patients with previously treated CLL/SLL. Leukemia. 2018, 32:83-91.10.1038/leu.2017.175. Taghiloo S, Allahmoradi E, Ebadi R, et al.: Upregulation of galectin-9 and PD-I1 immune checkpoints molecules in patients with chronic lymphocytic leukemia. Asian Pac J Cancer Prev. 2017, 18:2269-2274.10.22034/APJCP.2017.18.8.2269. Basabaeen AAM, Abdelgader EA, Babekir EA, et al.: TP53 gene 72 arg/pro (rs1042522) single nucleotide polymorphism contribute to increase the risk of b-chronic lymphocytic leukemia in the Sudanese population. Asian Pac J Cancer Prev. 2019, 20:1579-1585. 10.31557/APJCP.2019.20.5.1579).

Наиболее часто применяемые клинически значимые прогностические маркеры течения ХЛЛ - предварительная стадия по Rai/Binet, высокий уровень β2-микроглобулина (>35 мг/л), отсутствие мутации IGHV, делеция(11q)/мутация ATM, делеция (17p) /мутация TP53, сложный кариотип, мутация NOTCH1, мутация SF3B1, мутация BTK/PCLG2, мутация BCL2, персистенция минимальной остаточной болезни (MОБ-позитивность) (см. Pérez-Carretero, C.; González-Gascón-y-Marín, I.; Rodríguez-Vicente, A.E.; Quijada-Álamo, M.; Hernández-Rivas, J.-Á.; Hernández-Sánchez, M.; Hernández-Rivas, J.M. The Evolving Landscape of Chronic Lymphocytic Leukemia on Diagnosis, Prognosis and Treatment. Diagnostics 2021, 11, 853. https://doi.org/10.3390/ diagnostics11050853).

Для оценки прогноза ХЛЛ используют международный прогностический индекс (ХЛЛ ‒ IPI), включающий 5 параметров: делеция/мутация 17p/TP53, статус IgVH , уровень β2-микроглобулина сыворотки крови, возраст, стадия по Binet или Rai.

С учетом этих параметров выделяют 4 группы риска: низкая, промежуточная, высокая, очень высокая (см. Joshi N.S. Inflammation Directs Memory Precursor and Short-Lived Effector CD8+ T Cell Fates via the Graded Expression of T-bet Transcription Factor / N. S. Joshi, W. Cui, A. Chandele, H. K. Lee, D. R. Urso, J. Hagman, L. Gapin, S. M. Kaech // Immunity - 2007. - Т. 27 - № 2 - 281-295).

Учитывая изменчивый естественный анамнез заболевания, системы стадирования Rai, Binet и Ann Arbor не могут выступать единственным критерием прогноза. Недостаточно и использование сывороточных маркеров для оценки прогноза в контексте гетерогенности ХЛЛ.

Не нашло широкого применения в качестве прогностических показателей и определение экспрессии иммунофенотипических маркеров CD38 и ZAP70, ввиду значительных различий в экспрессии данных антигенов при ХЛЛ, полученных отдельными исследователями из разных регионов мира.

Наряду с этим, ПЦР, секвенирование или вестерн-блоттинг, используемые для выявления мутаций и делеций, остаются дорогостоящими, трудозатратными, длительными по времени методами, имеющие также целый ряд формальных и методических ограничений.

В последнее время по всему миру проводится множество исследований по изучению роли иммунных контрольных точек (ИКТ) в патогенезе хронического лимфолейкоза и возможности их использования в качестве прогностических маркеров.

Наибольший интерес с этой точки зрения представляют рецепторы программируемой клеточной гибели PD-1 и LAG-3 (активационный ген 3 лимфоцитов). Ли Дж. и др. выявлено, что PD-1 высоко экспрессирован в периферической крови пациентов с ХЛЛ CD19+ B- клетками в сравнении со здоровыми донорами.

Отмечена также роль экспрессии PD-1 в прогнозировании течения ХЛЛ (см. Li, J.H., Pang, N.N., Zhang, Z.H., Zhang, R., Chen, G., Qu, J.H., 2017. PD-1/PD-L1 expression and its implications in patients with chronic lymphocytic leukemia. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi 38, 198-203. https://doi.org/10.3760/cma.j.issn. 0253- 2727.2017.03.005).

В исследованиях Rusak M. показано, что у пациентов с высоким уровнем экспрессии PD-1 проходит меньше времени до начала первой линии терапии, чем у пациентов с низким уровнем рецептора (см. Rusak, M., et al., 2015. Prognostic significance of PD-1 expression on peripheral blood CD4+ T cells in patients with newly diagnosed chronic lymphocytic leukemia. Pol. Arch. Med. Wewn. 125, 553-559. https://doi.org/10.20452/pamw.2967). Shapiro M. и др. показали, что высокие уровни поверхностного и растворимого LAG3 связаны с немутированным статусом вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (UM-IGHV) и более короткой медианой времени от постановки диагноза до начала первого лечения (см. Shapiro M, Herishanu Y, Katz BZ, Dezorella N, Sun C, Kay S, Polliack A, Avivi I, Wiestner A, Perry C. Lymphocyte activation gene 3: a novel therapeutic target in chronic lymphocytic leukemia. Haematologica. 2017 May;102(5):874-882. doi: 10.3324/haematol.2016.148965. Epub 2017 Feb 2. PMID: 28154084; PMCID: PMC5477606). Оценка уровня экспрессии LAG3 была предложена в качестве прогностического маркера у пациентов с ХЛЛ, поскольку повышенные уровни экспрессии LAG3 коррелировали с немутированным статусом вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (UM-IGHV) и сниженной выживаемостью без лечения (см. Kotaskova J, Tichy B, Trbusek M, et al. High expression of lymphocyte-activation gene 3 (LAG3) in chronic lymphocytic leukemia cells is associated with unmutated immunoglobulin variable heavy chain region (IGHV) gene and reduced treatment free survival. JMolDiagn. 2010;12(3):328-334).

В этой связи, изучение особенностей экспрессии PD-1 (CD279) и LAG-3 (CD223) на В-клетках и значимости их влияния на течение заболевания у пациентов с хроническим лимфолейкозом является перспективным. При этом наиболее простым, быстрым и дешевым в сравнении молекулярно-генетическими исследованиями является метод проточной цитофлуориметрии.

Из патентных источников известны следующие способы:

1. Известен «Способ прогнозирования развития и течения хронического лимфолейкоза» (см. патент RU 2 248 574 С1, опубл. 20.03.2005, Бюл. № 8). Недостатком данного способа является: дороговизна и значительная трудоемкость выполнения генотипирования полиморфизма промоторной области гена TNF-α и TNF-β как в амбулаторных, так и в условиях стационара, применение критерия χ² не выявило достоверных различий по частотам аллелей между больными хроническим лимфолейкозом и контрольной группой.

2. Также известен «Способ прогнозирования течения хронического лимфолейкоза» (см. патент RU 2 256 921 С1, опубл. 20.07.2005 Бюл. № 20), заключающийся в определении в периферической крови больного количества CD20 позитивных В-лимфоцитов человека методом иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител и при уровне CD20+ клеток от 0,4 до 7,0×10⁹/л. прогнозируют не прогрессирующее течение хронического лимфолейкоза, а при уровне CD20+ клеток выше 7,0×10⁹/л - прогрессирующее течение. Недостатками данного способа является то, что данный способ требует длительных затрат времени, применения специфического оборудования, субъективный характер учета реакции требующий особой квалификации персонала, проводящего исследования.

3. Разработан «Способ прогнозирования общей выживаемости больных хроническим лимфолейкозом» (см. патент RU 2 498 313 С1, опубл. 10.11.2013, Бюл. № 31), основанный на выделении ДНК из периферической венозной крови, анализе полиморфизма -590С/Т гена интерлейкина 4, -174G/C гена интерлейкина 6 и выявлении наличия цитопенических осложнений, на основании чего прогнозируют снижение общей выживаемости больных хроническим лимфолейкозом. Недостатками данного способа являются дорогостоящее специальное оборудование, трудоемкость, и длительность процесса исследования.

4. Известен «Способ прогнозирования течения хронического лимфолейкоза» (см. патент RU 2 400 753 С1, опубл. 27.09.2010 Бюл. № 27) основанный на количественном определении in vitro основного фактора роста фибробластов (bFGF) и фактора роста сосудистого эндотелия человека (VEGF) методом ИФА (ELISA) в сыворотке крови человека. При значениях VEGF 185,66±33,5 и более пг/мл, bFGF 35,84±2,02 и более пг/мл прогнозируют быстрое развитие и агрессивное течение заболевания, плохой ответ на проводимую терапию. Недостатками метода являются то, что специфичность применения данных факторов у больных ХЛЛ вызывает сомнение, ввиду того, что повышение уровней bFGF и VEGF может быть обусловлено наличием часто встречающихся у этой категории больных таких сопутствующих заболеваний, как сахарный диабет, ишемическая болезнь.

5. Существует «Способ прогнозирования общей выживаемости больных хроническим лимфолейкозом в стадии А» (см. патент RU 2 565 453 C1, опубл. 20.10.2015, Бюл. № 29), основанный на определении в момент постановки диагноза показателя соотношения абсолютного содержания NK-клеток к абсолютному содержанию клеток ХЛЛ. Недостатками данного метода являются: ограничение только группой пациентов в стадии А, а также отсутствие учета иммунного статуса каждого пациента до начала заболевания, что представляется важным, поскольку уровень NK-клеток даже у здоровых лиц может варьировать в широких пределах, также как и абсолютное содержание клеток ХЛЛ у больных.

6. Имеется также «Способ прогнозирования ответа на химиотерапию при хроническом лимфолейкозе» (см. патент RU 2 495 427 С1, опубл. 10.10.2013, Бюл. № 28), основанный на генотипировании полиморфного локуса 9360Т гена фактора роста эндотелия сосудов. Недостатками данного способа являются дорогостоящее специальное оборудование, трудоемкость и длительность процесса исследования.

7. Имеется также «Способ прогнозирования формирования хронического лимфолейкоза и развития сочетанных осложнений в дебюте заболевания» (см. патент RU 2 458 349 С1, опубл. 10.08.2012, Бюл. № 22), основанный на выделении ДНК из периферической венозной крови, проведении анализа полиморфизма гена рецептора фактора некроза опухоли 2-го типа (+1663 A/G TNFR2) и прогнозировании повышенного риска формирования хронического лимфолейкоза и развития сочетанных осложнений в дебюте заболевания в случае выявления аллеля +1663 G TNFR2. Недостатками данного способа являются дорогостоящее специальное оборудование, трудоемкость и длительность процесса исследования, отсутствие данных о влиянии изученных показателей на прогноз дальнейшего течения заболевания.

8. Имеется также «Способ прогнозирования клинической формы хронического лимфолейкоза» (см. патент RU 2 490 642 С1, опубл. 20.08.2013 Бюл. № 23), основанный на генотипировании полиморфного локуса 309T>G гена MDM2, и прогнозировании высокой вероятности развития агрессивной формы хронического лимфолейкоза при выявлении у больного генотипа GG. Недостатками данного способа являются также трудоемкость, дорогостоящее специальное оборудование и длительность процесса.

9. Имеется также «Способ прогнозирования «тлеющей» формы хронического лимфолейкоза» (см. патент RU 2 496 110 С1, опубл. 20.10.2013, Бюл. № 29), основанный на генотипировании полиморфного локуса - 248G>A гена Bcl-2 ассоциированного X белка (ВАХ - 248G>A), и прогнозировании высокой вероятности развития «тлеющей» формы хронического лимфолейкоза при выявлении у больного генотипа GG. Недостатками данного способа являются также трудоемкость, дорогостоящее специальное оборудование и длительность процесса.

10. Имеется также «Способ дифференциальной диагностики доброкачественной и прогрессирующей форм хронического лимфолейкоза» (см. патент RU 2 242 004 С1, опубл. 10.12.2004, Бюл. № 34), основанный на определении в сыворотке крови больного с помощью радиоиммунологического метода с I¹²⁵ уровня β2-микроглобулина. Недостатками данного способа являются специальные методические требования, а также известные современные факты о недостаточности исследования только сывороточных маркеров для выяснения прогноза в контексте гетерогенности ХЛЛ.

По сравнению с существующими патентами предлагаемый нами способ:

- может использоваться при иммунофенотипировании ХЛЛ на этапе диагностики наряду с основной панелью моноклональных антител, не требует дополнительного оборудования;

- обеспечивает возможность использования на амбулаторном этапе, рутинное применение, быстроту выполнения.

Техническим результатом данного изобретения является разработка способа прогнозирования течения хронического лимфолейкоза, позволяющего на амбулаторном этапе прогнозировать возможный исход заболевания.

Технический результат достигается тем, что на амбулаторном этапе после постановки диагноза определяют уровень лимфоцитов и экспрессию PD-1 и LAG-3 на CD19+клетках в крови методом проточной цитофлуориметрии, и при уровне лимфоцитов ≥ 67,11%, экспрессии PD-1 ≥ 40,81% и LAG-3 ≥ 24,62% на CD19+клетках прогнозируют неблагоприятное течение хронического лимфолейкоза.

Новизной изобретения является то, что помимо определения групп риска раннего прогрессирования заболевания путем подсчета баллов согласно индексу ХЛЛ-IPI, в качестве дополнительных критериев высокого риска включены исходный уровень лимфоцитов и профиль экспрессии PD-1 (CD279) и LAG-3 (CD223) на CD19+клетках больных ХЛЛ.

Способ осуществляется следующим способом.

На амбулаторном этапе, при обследовании после постановки диагноза, методом 10-цветной проточной цитофлуориметрии оценивают уровень лимфоцитов и профиль экспрессии PD-1 (CD279) и LAG-3 (CD223) на CD19+клетках в крови больного следующим способом:

- у больного производят забор крови из периферической вены стандартным способом в пробирку с К3(К2) -ЭДТА;

- исследование образцов крови проводят не позднее 6 часов после взятия образца (оптимально в течение 2-х часов);

- непосредственно перед исследованием кровь тщательно перемешивают в течение нескольких минут для равномерного распределения форменных элементов в плазме;

- для цитофлуориметрических исследований в качестве зондов, позволяющих локализовать клетки мишени, применяют коньюгаты моноклональных антител, меченых флюоресцентными метками CD5, CD19, CD23, CD45, CD279 (PD-1), CD223 (LAG-3);

- пробоподготовка:

a) маркируют пробирки для цитофлуориметрического анализа

b) в пробирки вносят раствор моноклональных антител, меченых флуорохромом, в количестве, рекомендованном инструкцией производителя

c) далее добавляют в пробирку 50-100 мкл венозной крови

d) аккуратно перемешивают при помощи вихревого встряхивателя 1-3 сек. и инкубируют в защищенном от света месте в течение времени, рекомендованного инструкцией (обычно15 минут)

e) проводят лизис эритроцитов с применением лизирующих растворов согласно инструкции. Обычно добавляют 1-2 мл лизирующего раствора и перемешивают при помощи вихревого встряхивателя 1-3 сек

f) инкубируют 10 минут при комнатной температуре и в темноте

g) осаждают окрашенные клетки центрифугированием (1500 об/мин, 5 мин)

h) сливают надосадочную жидкость

i) добавляют 3 мл фосфатно-солевого буфера - ФСБ (PBS)

j) центрифугируют 5 минут при скорости 1500 об/мин

k) сливают надосадочную жидкость и добавляют 0,5 мл ФСБ (PBS)

- проводят анализ полученного образца на проточном цитофлуориметре.

В исследование были включены 30 пациентов с установленным диагнозом хронический лимфолейкоз в стадии С по Binet, которым на амбулаторном этапе определялся уровень лимфоцитов и профиль экспрессии PD-1 (CD279) и LAG-3 (CD223) на CD19+клетках методом 10-цветной проточной цитофлуориметрии, а затем проводилась противоопухолевая лекарственная терапия на базе онкогематологического отделения ФГБУ «НМИЦ онкологии» МЗ РФ в период с 2020 по 2022 годы. В качестве контроля обследовали группу здоровых индивидов в соответствии с возрастом и полом исследуемых групп больных, проживающих на территории Ростовской области (20 человек), у которых отсутствовали какие-либо злокачественные заболевания. Установлено, что при уровне лимфоцитов ≥67,7%, экспрессии PD-1 (CD279) ≥40,81% от лимфоцитов и LAG-3 (CD223) ≥24,62% от лимфоцитов на CD19+клетках наблюдалось неблагоприятное течение хронического лимфолейкоза.

В таблице 1 представлены данные проведенного анализа результатов определения уровня лимфоцитов, экспрессии PD-1 (CD279), LAG-3 (CD223) на CD19+клетках у больных ХЛЛ в зависимости от течения заболевания.

Согласно полученным данным, уровень лимфоцитов у всех больных хроническим лимфолейкозом был достоверно выше по сравнению с контролем (р<0,001). В группе больных хроническим лимфолейкозом обнаружена экспрессия PD-1 (CD279) и LAG-3 (CD223) на CD19+клетках, которая отсутствовала в группе контроля.

Таблица 1 Уровень лимфоцитов, экспрессии PD-1 (CD279) и LAG-3 (CD223) на CD19+ клетках у больных хроническим лимфолейкозом, М±m
Обследованные группы	Объем выборки	Лимфоциты, % от лейкоцитов	CD19+/CD279+, % от лимфоцитов	CD19+/CD223+, % от лимфоцитов
Человек
Контроль	20	30,87±0,57*	0*	0*
Больные ХЛЛ, в целом	30	67,11±4,01*	40,81±3,81*	24,62±2,50*
Благоприятное течение ХЛЛ	19	52,59±3,26*	25,51±1,31*	14,57±0,66*
Неблагоприятное течение ХЛЛ	11	92,19±1,21*	67,25±1,88*	41,95±1,62*
* - р<0,001

При этом у пациентов с неблагоприятным течением ХЛЛ уровень лимфоцитов, экспрессия PD-1 (CD279) и LAG-3 (CD223) на CD19+клетках значительно выше, чем у больных ХЛЛ с благоприятным течением заболевания. Различия статистически достоверны (р<0,001).

Приводим клинические примеры применения способа.

Клинический пример №1

Пациент, 68 лет, считает себя больным c апреля 2021 года, когда обратил внимание на резкое похудение на 8 кг в течение двух недель, в июле 2021 года обратился к терапевту по месту жительства, обнаружено увеличение всех групп периферических лимфоузлов, в анализе крови отмечен лейкоцитоз (28,9×10⁹/л), анемия 3 степени тяжести, тромбоцитопения 1 степени тяжести без клинических проявлений геморрагического синдрома.

В августе выполнена эксцизионная биопсия шейного лимфатического узла справа, ГА + ИГХ от 24.08.2021 - морфологическая картина и иммунофенотип клеток характерны для В-клеточного хронического лимфоидного лейкоза/лимфомы из малых лимфоцитов.

Самостоятельно обратился в ФГБУ «НМИЦ онкологии» МЗ РФ.

Пересмотр CD ПЭТ-КТ органов шеи, органов грудной клетки, брюшной полости, малого таза от 14.08.2021 г.

Лимфоузлы шеи: С обеих сторон множественные до 2,0 см. В «легочном» электронном окне участков повышения плотности легочной ткани по типу «матового стекла», по типу консолидации, а также объемных образований не определяется.

С обеих сторон участки пневмосклероза. В «мягкотканном» окне над и подключичные лимфоузлы с обеих сторон множественные справа до 1,4 см, слева до 1,7 см, аксиллярные лимфоузлы с обеих сторон до 2,5 см. Внутригрудные лимфоузлы: правого корня 1,1 см, бифуркационные 1,2 см. В печени без очагов.

Забрюшинные лимфоузлы: все группы множественные мезентриальные до 2,0 см, парааортальные 1,5 см, паракавальные 1,6 см, подвздошные с обеих сторон до 2,0 см, внутритазовые с обеих сторон до 3,0 см.

В «костном» электронном окне деструктивных, травматических изменений не определяется.

Паховые лимфоузлы справа до 2,3 см, слева до 2,4 см.

Заключение: Системное лимфопролиферативное заболевание с поражением шейных лимфоузлов, аксиллярных, надключичных, подключичных, внутригрудных, забрюшинных, внутритазовых, паховых лимфоузлов.

Иммунохимические исследования: Бетта-2-микроглобулин - 10,3 мкг/мл.

Миелограмма. Заключение: костно-мозговой пунктат среднеклеточный, мономорфный. 65,7% составляют лимфоциты. Гранулоцитарный и эритроидный ростки кроветворения резко сужены, угнетены. Лейко-эритробластическое соотношение нарушено (18,61). Количество мегакариоцитов снижено. Морфологические признаки ХЛЛ.

Проточная цитометрия: в исследованном образце периферической крови относительное содержание лимфоцитов составило 65,8%, выявлена моноклональная пролиферация В-лимфоцитов (93,4% от лимфоцитов) с иммунофенотипом: CD19+/Lambda+/CD5+/CD10-/CD23+/CD20_dim+/CD22_dim+/ FMC7-/CD38+.

Заключение: Данный иммунофенотип соответствует CD5-позитивной В-зрелоклеточной лимфоидной опухоли. Более всего соответствует В-клеточному хроническому лимфолейкозу/лимфоме из малых лимфоцитов. Было выполнено исследование профиля экспрессии PD-1 (CD279) и LAG-3 (CD223) на CD19+клетках, в результате которого экспрессия PD-1 (CD279) составила 26,3% от лимфоцитов, LAG-3 (CD223) - 13,9 % от лимфоцитов.

Был установлен диагноз: (С 83.0) Хронический лимфоцитарный лейкоз, стадия С по Binet, с поражением периферических лимфоузлов (шейных, аксиллярных), внутригрудных, забрюшинных лимфоузлов, лимфоузлов брыжейки, тазовых, паховых лимфоузлов, костного мозга кл.гр. 2.

С 03.09,2021 по 13.12.2021 проведено 6 курсов ХТ по схеме RB: ритуксимаб 634 мг в/в капельно в 1й день, бендамустин 152 мг в/в капельно в 1,2 дни. Без признаков клинически значимой токсичности.

Контрольное СРКТ органов шеи, грудной клетки, брюшной полости и малого таза от 06.12.2021. Лимфоузлы шеи не увеличены. В легочной ткани участков повышения плотности легочной ткани по типу «матового стекла», по типу консолидации, а также объемных образований не определяется. Внутригрудные лимфоузлы не увеличены. В печени без очагов. В размерах не увеличена.

Свободной жидкости в брюшной полости не выявлено. Забрюшинные лимфоузлы: не увеличены, без признаков патологических изменений. В «костном» электронном окне деструктивных, травматических изменений не определяется.

В миелограмме: костно-мозговой пунктат беден клеточными элементами, количество миелокариоцитов 3,0×10^9/л. 40,0% составляют лимфоциты, 28,6 % моноциты. Гранулоцитарный росток кроветворения сужен, нейтрофильный ряд составляет 20,4%. Эритроидный росток представлен единичными эритрокариоцитами. Мегакариоциты не обнаружены.

По результатам исследования минимальной остаточной болезни (МОБ) методом проточной цитофлуориметрии в исследованном образце костного мозга популяция лимфоцитов с иммунофенотипом, характерным для В-ХЛЛ/лимфомы из малых лимфоцитов, не обнаружена. У пациента достигнута полная МОБ-негативная ремиссия.

Таким образом, полученные данные по уровню лимфоцитов, экспрессии PD-1 (CD279) и LAG-3 (CD223) на CD19+клетках у пациента с хорошим клиническим эффектом на проводимую химиотерапию (ХТ) и отсутствием активации процесса позволяют использовать указанные показатели в прогнозе благоприятного течения ХЛЛ.

Клинический пример №2

Пациентка 64 лет в июле 2021 года отметила появление боли в области тазобедренного сустава, поясничной области. Проводилась консервативная терапия без эффекта. Выполнила МРТ: МР-признаки компрессионных переломов L3, L4, клиновидной деформации Th 7, компрессионных переломов Th 8, 9, 11, 12.

ИФТ периферической крови по месту жительства: иммунофенотип может соответствовать В-ХЛЛ с высокой экспрессией CD38 и абберантной экспрессией CD8. Миелограмма: лимфоциты 86%. ОАК: лейкоциты - 15,04 × 10⁹/л, гемоглобин 84 г/л, тромбоциты - 252 × 10⁹/л.

Электрофорез белков мочи: смешанная протеинурия, подозрительна на Bence-Jones белок, 0,09 г/сут. Электрофорез белков сыворотки: обнаружен моноклональный компонент, содержание парапротеина 3,2 г/л, IgМ представлен легкими цепями лямбда.

Выполнена трепан-биопсия крыла подвздошной кости. Морфологическое и иммуногистохимическое исследование: костный мозг большой по объему, балки с признаками резорбции, гранулоцитарный и эритроидный ростки сужены, костномозговые полости диффузно инфильтирированы мелкими атипичными мономорфными лимфоидными клетками, строма полнокровная, отечная.

Морфологическая картина и иммунофенотип характерны для В-ХЛЛ.

Установлен диагноз: С91.1 Хронический лимфолейкоз/лимфома из малых лимфоцитов, стадия C по Binet, МПИ 5, группа риска высокая кл.гр.2. Осложнения: анемия 2 степени тяжести. Остеодеструктивный синдром. ВИДС. Гиперпластический синдром.

По месту жительства получала метрономную терапию пероральным циклофосфамидом, суммарно в течение 3 месяцев. В декабре 2021 года получила 1 введение золедроновой кислоты.

Обратилась в КДО ФГБУ «НМИЦ онкологии» МЗ РФ.

Выполнена биопсия увеличенного шейного лимфоузла с целью исключения синдрома Рихтера (трансформации в ДБКЛ).

ГА: картина в объеме трепан-биоптатов лимфоидной ткани характерна для неходжкинской мелкоклеточной лимфомы.

С целью определения иммунофенотипа опухолевых клеток рекомендовано ИГХ исследование. ИГХ 1578/22: Морфологическая картина и иммунофенотип опухолевых клеток в объеме биоптатов лимфоидной ткани (CD20+, CD5+, CD3-, CD23+, CD38-, CD10-, bcl-6-, Ki-67~25%) характерны для хронического лимфолейкоза/ лимфомы из малых лимфоцитов.

Проточная цитометрия: в исследованном образце периферической крови относительное содержание лимфоцитов составило 98,1%, выявлена моноклональная пролиферация В-лимфоцитов (99,0% от лимфоцитов) с иммунофенотипом: CD19+/Lambda+/CD5+/CD10-/CD23+/CD20_dim+/CD22_dim+/ FMC7-/CD38+/CD8_dim+.

Заключение: Данный иммунофенотип соответствует В-клеточному хроническому лимфолейкозу/лимфоме из малых лимфоцитов с высокой экспрессией CD38 и аберрантной экспрессией CD8. Выполнено исследование профиля экспрессии PD-1 (CD279) и LAG-3 (CD223) на CD19+клетках, в результате которого экспрессия PD-1 (CD279) составила 75,5% от лимфоцитов, LAG-3 (CD223) - 49,1 % от лимфоцитов.

Электрофорез белков сыворотки крови от 27.05.2022: в электрофореграмме, в динамике от 11.2021, интенсивность «М»- градиента в гамма-зоне остается практически константной на фоне протеинемии. Количественная характеристика пика: 5,3 - 3,7 г/л. Суточная протеинурия: 0,03 г/сут.

Рентгеноденситометрия от 05.2022, заключение: Снижение МПК соответствует остеопорозу. В сравнении от 11.2021 отрицательная динамика в поясничном отделе позвоночника (-5.6%) и в левой бедренной кости (-11.2%) по BMD критерию. Бетта-2 микроглобулин от 16.06.2022: 5,45 мг/л.

Анализ делеции TP53 (FISH, количественный), заключение: делеция локуса гена TP53/17p13 в проанализированных интерфазных ядрах не выявлена.

СРКТ ОГК, ОБП, малого таза от 06.2022: В «легочном» электронном окне участков повышения плотности легочной ткани по типу «матового стекла», по типу консолидации, а также объемных образований не определяется. В «мягкотканном» окне: подмышечные до 2,0 см, подключичные множественные до 2,1 см. Внутригрудные лимфоузлы: не увеличены. Легочной ствол и легочные артерии: до 1,7 см. В «костном» электронном окне в грудных позвонках, ребрах, грудине деструктивных изменений не определяется. Визуализируются множественные деформирующие разрастания тел позвонков грудного отдела позвоночника в виде «крючков», «шипов» и «скоб» небольшого размера. Печень: при исследовании в «мягкотканном» окне определяется: контуры печени ровные, четкие. Край не закруглен. В размерах печень не увеличена. Селезенка: увеличена до 12,2 см, без патологических включений в структуре. Почки: киста справа до 0,9 см. Oбъемных образований, конкрементов в чашечках и лоханках не определяется. Чашечно-лоханочная система не расширена. Мочеточники визуализируются с обеих сторон, не расширены, не деформированы, конкрементов в просвете обоих мочеточников не выявлено.

Свободной жидкости в брюшной полости не выявлено.

Забрюшинные лимфоузлы: глубокие паховые до 2,1 см.

В «костном» электронном окне в поясничных позвонках, костях таза деструктивных, травматических изменений не определяется.

C июля 2022 по октябрь 2022 проведено 4 курса химиотерапии по схеме RB: ритуксимаб 500 мг в/в капельно №1, бендамустин 97 мг в/в капельно № 2 на фоне сопроводительной терапии (ондансетрон, дексаметазон, дифенгидрамин, анальгин, милдронат).

Выполнено контрольное обследование: достигнут частичный гематологический ответ - купировалась анемия, сохраняется лимфоцитоз, снизился уровень М-градиента.

По результатам исследования минимальной остаточной болезни (МОБ) методом проточной цитофлуориметрии в исследованном образце периферической крови сохраняется популяция лимфоцитов с иммунофенотипом, характерным для В-ХЛЛ/лимфомы из малых лимфоцитов, которая составляет 14,3% (от CD45+клеток).

У пациентки неблагоприятное течение ХЛЛ.

Данным способом был рассчитан прогноз 30 пациентам.

Технико-экономическая эффективность способа прогнозирования течения хронического лимфолейкоза заключается в том, что его применение позволяет прогнозировать течение заболевания уже на амбулаторном этапе, путем определения исходного уровня лимфоцитов и экспрессии PD-1 (CD279) и LAG-3 (CD223) на CD19+клетках в крови пациентов в дополнение к стандартным критериям ХЛЛ IPI.

Способ прогнозирования течения хронического лимфолейкоза, заключающийся в том, что на амбулаторном этапе после постановки диагноза определяют уровень лимфоцитов и экспрессию PD-1 и LAG-3 на CD19+клетках в крови методом проточной цитофлуориметрии, и при уровне лимфоцитов ≥ 67,11%, экспрессии PD-1 ≥ 40,81% и LAG-3 ≥ 24,62% на CD19+клетках прогнозируют неблагоприятное течение хронического лимфолейкоза.