Способ получения вирусоподобных частиц норовируса, содержащих белок vp1 энтеровируса echovirus 30, in vitro

Изобретение относится к области молекулярной вирусологии, биотехнологии и медицины, в частности к получению химерного белка, самопроизвольно формирующего in vitro вирусоподобные частицы (VLP), содержащие белок VP1 Echovirus 30 (ЕСНО30). Полученные вирусоподобные частицы норовируса, содержащие на своей поверхности белок VP1 энтеровируса Echovirus 30, могут быть использованы для приготовления вакцин против неполиомиелитных энтеровирусов. Способ получения вирусоподобных частиц норовируса, содержащих белок VP1 Echovirus 30 (ЕСНО30), in vitro включает культивирование трансформированных химерным белком клеток E. coli в подходящей культуральной среде, выделение и очистку вирусоподобных частиц. При этом создают химерный белок S_N-VP1_E30 размером 516 аминокислот с молекулярной массой 57 кДа, со структурой в соответствии с последовательностью SEQ ID NO: 1 и трансформацией клеток Е. coli, штамм Rosette 2 (DE3) плазмидой, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Осуществление изобретения обеспечивает создание химерного белка SN-VP1E30 размером 516 аминокислот с молекулярной массой 57 кДа, который способен самопроизвольно собираться в VLP, презентирующие антигенные детерминанты белка VP1 энтеровируса Е30. 4 ил., 6 пр.

 

Изобретение относится к области молекулярной вирусологии, биотехнологии и медицины, в частности, к получению химерного белка, самопроизвольно формирующего in vitro вирусоподобные частицы (VLP), содержащие белок VP1 энтеровируса Echovirus 30 (Picornaviridae: Enterovirus: Enterovirus B), и может быть использовано для приготовления вакцин для профилактики энтеровирусного менингита.

Энтеровирусы (ЭВ) (род Enterovirus, семейство Picornaviridae, порядок Picornavirales) - многочисленная группа безоболочечных РНК-содержащих вирусов, способных вызывать различные по клинической картине и степени тяжести заболевания преимущественно у детей первых лет жизни. Энтеровирусная инфекция может проявляться в форме экзантемы полости рта и конечностей (hand, foot and mouth disease - HFMD), герпангины, менингита, менинго-энцефалита, энцефалита, полинейропатии, вялого паралича, миокардита и др. Тяжесть течения заболевания может варьировать от легкого лихорадочного состояния до мультисистемных проявлений с поражением сердечно-сосудистой и центральной нервной систем. Часто энтеровирусные инфекции имеют эпидемическое распространение, охватывающее большие группы детского населения [Фомина С.Г., Новикова Н.А. Энтеровирусы у детей с гастроэнтеритом//Медиаль. - 2014. - №12 (2). - С. 58-71.; Мао Q. EV-A71 vaccine licensure: a first step for multivalent enterovirus vaccine to control HFMD and other severe diseases/ Q. Mao, Y. Wang, L. Bian, M. Xu, Z. Liang//Emerging Microbes and Infections - 2016, V.5.7.].

На основе генетических характеристик и антигенных свойств эньеровирусы разделены на четыре вида (А - D), среди которых вирусы, относящиеся к видам Enterovirus A (ЭВ-А) и Enterovirus B (ЭВ-В), имеют наибольшее распространение [Zell R. ICTV virus taxonomy profile: picornaviridae/ R. Zell, E. Delwart, A.E. Gorbalenya, T. Hovi, A.M.Q. King, N.J. Knowles//J. Gen. Virol. - 2017. Vol. 98. 10. - P. 2421-2.]. Энтеровирусы вида ЭВ-А (энтеровирус А71, Коксаки А6, Коксаки А10, Коксаки А16 и др.) чаще всего вызывают HFMD у детей младшего возраста. Подавляющее большинство заболевших полностью выздоравливают через 7-10 дней. Однако у некоторых заболевших развиваются серьезные осложнения, вызванные поражением центральной нервной системы, описаны единичные летальные случаи. Представители вида ЭВ-В (вирусы Коксаки В3, Коксаки В5, ECHO25, ЕСНО30) чаще связаны с такими серьезными заболеваниями, как миокардит, асептический менингит, энцефалит и гепатит, нередко приводящими к инвалидности или смерти [Xu W. Distribution of enteroviruses in hospitalized children with hand, foot and mouth disease and relationship between pathogens and nervous system complications/W. Xu, C. Liu, L. Yan, J. Li, L. Wang, Y. Qi//Virology J. - 2012. 9. (8).]. Среди ЭВ-В особо выделяются вирусы ECHO, поскольку являются причиной асептического менингита и энцефалита не только у детей, но и у взрослых [Kupila L. Etiology of aseptic meningitis and encephalitis in an adult population/L.Kupila, T. Vuorinen, R. Vainionpaa, V. Hukkanen, R.J. Marttila., P.//Neurology. - 2006. Vol. 66. - P. 75-80.].

Для вирусов ECHO характерен эпидемический характер заболеваемости, выражающийся в некоторых случаях в регистрации сотен, тысяч и миллионов больных. Наиболее частыми являются вспышки серозного менингита, в качестве возбудителей которого в Европе, Азии, Америке выступают преимущественно вирусы ECHO 11 и 30. ЕСНО-вирусы обладают огромным потенциалом генетической изменчивости, в частности показано значение рекомбинаций, приводящих в естественных условиях к образованию новых высоко патогенных вариантов. Не поддающийся наблюдению и контролю процесс внутрипопуляционной изменчивости и селекции эпидемических вариантов реализуется в ряде случаев "внезапным" развитием вспышек, характеризующихся несвойственными для данных вирусов поражениями, в любых географических районах. Вирус размножается и накапливается в лимфоидной ткани носоглотки и желудочно-кишечного тракта, вызывая локальные патологические изменения в слизистых оболочках респираторного тракта, кишечника. Вирус выделяется из носоглотки в течение недели, а из кишечника - до месяца. В случае перехода в стадию виремии инфекция проникает в ЦНС, поражая вещество головного и спинного мозга, мягкие мозговые оболочки, а также миокард и перикард, поджелудочную железу, мышечную ткань, печень, ткани глаза, кожу. Типоспецифические вируснейтрализующие антитела появляются в сыворотке крови пациентов вместе с первыми симптомами болезни.

Энтеровирусы распространены повсеместно, однако в странах Юго-Восточной Азии наибольшее эпидемическое значение имеют ЭВ-А, в странах, расположенных на территориях Европы и Северной Америки, - ЭВ-В [Chang L.Y Enterovirus А71 neurologic complications and long-term sequelae/ L.Y. Chang, H.Y. Lin, S.S. Gau, C.Y. Lu, S.H. Hsia, Y.C. Huang, et al.//J. Biomed. Sci. - 2019. 26(57); Abedi G.R. Enterovirus and human parechovirus surveillance - United States, 2009-2013/ G.R. Abedi, J.T. Watson, H. Pham, W.A. Nix, M.S. Oberste, S.I. Gerber// Morbidity and Mortality Weekly Report. - 2015. Vol. 64. №34. - P. 940-943.]. Эпидемиологические исследования распространенности энтеровирусов на территории Российской Федерации показали, что в последнее время у детей и взрослых, больных энтеровирусным менингитом, наиболее часто выявляется вирус ЕСНОЗО [Голицына Л.Н., Зверев В.В., Селиванова С.Г., Пономарева Н.В., Кашников А.Ю., Созонов Д.В., и др. Этиологическая структура энтеровирусных инфекций в Российской Федерации в 2017-2018 г.//ЗНИИСО. - 2019. - №8. - С. 30-8.].

Более 60 из 102 известных в настоящее время серотипов энтеровирусов вызывают несколько десятков форм заболеваний, наиболее тяжелыми из которых являются энтеровирусный менингит (ЭВМ), менингоэнцефалит, вирусный сепсис и некроз печени новорожденных, увеит, миокардит, панкреатит, гепатит, летальный отек легких [Rhoades, R.E. Enterovirus Infections of the Central Nervous System/R.E. Rhoades, J.M. Tabor-Godwin, G. Tsueng and R. Feuer//Virology. - 2011. Vol.411. №2. - P. 288-305.; A.H. Лукашев, Л.H. Голицына, Ю.А. Вакуленко, Л.В. Ахмадишина, Н.И. Романенкова, Е.Ю. Сапега, Н.С. Морозова, Н.А. Новикова, О.Е. Троценко, О.Е. Иванова Современные возможности и направления развития молекулярно-эпидемиологического мониторинга в надзоре за энтеровирусными инфекциями. Опыт Российской Федерации//Инфекция и иммунитет - 2018. - Т. 8. №4. - С. 452-464.].

Вакцинация доступна лишь в отношении полиовирусов. Разнообразие серотипов неполиомелитных энтеровирусов и их генетическая изменчивость затрудняют разработку вакцин против этой группы возбудителей. В настоящее время проходят клинические испытания вакцин против энтеровируса 71, однако ни одна из заявленных кандидатных вакцин еще не прошла все стадии испытаний.

Перспективным направлением в области вакцинопрофилактики против (неполно) энтеровирусов является разработка вакцин на основе вируспоподобных частиц.

Вирусоподобные частицы (virus-like particle - VLP) имеют сходство со зрелыми вирионами, но не содержат генетического материала вируса. VLP имитируют структуру вирусного капсида, но не содержат генов, поэтому не могут реплицироваться или обеспечивать механизм вторичной инфекции. VLP собираются после экспрессии специфических вирусных белков и находятся на внешней поверхности, напоминая внешнюю поверхность соответствующего вируса, но в отличие от истинной вирусной частицы не включают генетического материала и являются оптимальными системами доставки для презентации нейтрализующих эпитопов иммунной системе. Обладая способностью эффективно взаимодействовать с антигенпрезентирующими клетками, VLP максимизируют иммуногенный потенциал нейтрализующих эпитопов и защитные свойства антител [Mohsen М.О. Interaction of viral capsid-derived virus-like particles (VLPs) with the innate immune system/ M.O. Mohsen, A.C. Gomes, M. Vogel, M.F. Bachmann//Vaccines. - 2018. - Vol. 6. №3. - P. 37.].

В VLP-вакцинах сохраняется конформационная структура эпитопов, что имеет значение для иммуногенности вакцин, кроме того, отсутствует риск получения вирулентных ревертантов, что имеет место при применении живых аттенуированных вакцин.

На сегодняшний день сконструирован ряд VLP-вакцин (например, против ВИЧ, коронавирусов), которые вызывают образование вируснейтрализующих антител и стимулируют Т-клеточный цитотоксический ответ. Так, Y.C. Hu et al. [Hu Y.C. Formation of enterovirus-like particle aggregates by recombinant baculoviruses co-expressing P1 and 3CD in insect cells/Y.C. Hu, J.T. Hsu, J.H. Huang, M.S. Ho, Y.C. Ho//Biotechnol Lett. - 2003. Vol. 25. №12. - P. 919-925.] и Y.C. Chung et al. [Chung Y.C.. Immunization with virus-like particles of enterovirus 71 elicits potent immune responses and protects mice against lethal chal-lenge/Y.C. Chung, M.S. Ho, W.-J. Chen, J.-H. Huang, S.T. ChouY., Ch. Hu//Vaccines. - 2008. Vol. 26. №15. - P. 1822-1862.] использовали рекомбинантную систему бакуловирусов насекомых для получения VLP-ЭВ 71 типа, которые в эксперименте на животных вызывали Th-1 и Th-2 хелперный ответ. При этом было показано, что потомство, полученное от иммунизированных вакциной, было защищено от заражения энтеровирусом 71.

В настоящее время VLP-вакцины в основном разрабатываются с использованием клеток насекомых, что ограничивает масштабность выпуска вакцин. Для данной технологии могут быть полезны трансгенные растения и дрожжи, способные продуцировать VLP-частицы, что создает возможность их использования для пероральной вакцинации или путем инъекции. Однако, при получении VLP ЭВ in vivo в клетках насекомых или дрожжей для последующего использования в качестве антигена в составе вакцин капсидные белки собираются в VLP внутри клеток-хозяев, что приводит к инкапсулированию внутрь VLP связанных с клеткой-хозяином загрязнений, потенциально способных вызвать нежелательный иммунный ответ, в том числе аллергические реакции [Le D.T. In Vitro Assembly of virus-like particles and their applications/D.T.Le, K.M. Müller//Life. - 2021. Vol. 11. №4.:334.].

В последующих исследованиях разрабатывались рекомбинантные технологии по получению и изучению вирусоподобных частиц энтеровируса 71 [Chung Y.C., Но M.S., Wu J.C., Chen W.J., Huang J.H., Chou S.T. et al. Immunization with virus-like particies of enterovirus 71 elicits potent immune responses and protect mice against lethal challenge. Vaccine. 2008; 26: 1855-1862.] и комбинации ЭВ 71 и вируса Коксаки А 16 (бивалентные вакцины) [Zhao Н. Novel recombinant chimeric virus-like particle is immunogenic and protective against bother enterovirus 71 coxsackievirus A16 in mice/H.Zhao, H.-Ya Li, Ji.-F. Han, Yo.-Q., Deng Sh.-Ya. Zhu, X.-F. Li. et al.// Scientific Reports. - 2015. Vol. 5. №1. - P. 1-8.]. Эти препараты активировали Th1- и Th2-клеточные иммунные ответы и были эффективны при испытаниях в тесте пассивной защиты мышей.

В качестве ближайшего аналога нами рассматривается замещенный мономер капсидного белка норовируса, имеющий только Р-домен, содержащий чужеродный антиген, введенный в одну или более из трех поверхностных петель, присутствующих на каждом мономере Р-домена, путем молекулярного клонирования. Рекомбинантный мономер легко образуется в кишечной палочке и дрожжах, обладает высокой стабильностью и устойчив к широкому спектру физико-химических условий [патент США №9096644, 04.08.2015].

Норовирусы - род РНК-содержащих вирусов, который относится к семейству калицивирусов (Caliciviridae). Выделяют пять геногрупп норовирусов (GI-GV). Наиболее распространенной является вторая геногруппа (GII), на долю которой приходится до 80-90% всех случаев норовирусного гастроэнтерита. Вирусы высоко контагиозны. Инфицирование норовирусами вызывает появление специфических антител, которые формируют иммунный ответ против возбудителя и препятствуют повторной инфекции, но иммунитет носит временный характер. Существует генетически обусловленная невосприимчивость к норовирусной инфекции (до 15% в популяции) и возможность бессимптомного течения (до 10-13% в популяции). Возбудитель обладает выраженной изменчивостью, с этим связана высокая вероятность реинфекции из-за невозможности формирования стойкого иммунитета к нему. Вирусный белок 1 (VP1) норовируса является основным структурным компонентом поверхности капсида, состоит из двух доменов - S (shell-домен), ответственный за образования капсида, и Р (protruding), несущий сайт связывания с рецептором. Ранее предложена платформа на основе белка VP1 норовируса для презентации вирусных антигенов иммунной системе. Было показано, что полученные в E. coli белки, состоящие из аминокислотной последовательности S домена VP1, слитого в одну молекулу с фрагментами аминокислотных последовательностей VP8 ротавируса, гемагглютинина вируса гриппа A (H7N9) или белка капсида вируса гепатита Е, способны формировать VLP, содержащие на поверхности добавленные пептиды. Иммунизация лабораторных животных химерными VLP приводила к продукции нейтрализующих антител в высоких титрах [Xia М. Bioengineered norovirus S60 nanoparticles as a multifunctional vaccine platform/ M., P. Huang, C. Sun, L. Han, F.S. Vago, K. Li, et al.// ACS Nano. - 2018. Vol. 12: №11. - P. 1-20; Tan M. Norovirus P particle, a novel platform for vaccine development and antibody production/M., P. Huang, M. Xia, P.A. Fang, W. Zhong, M. McNeal, et al.//J Virol. - 2011. Vol. 85. №2. - P. 753-64.].

Задачами, на решение которых направлено изобретение, являются разработка структуры рекомбинантного химерного белка, состоящего из аминокислотных последовательностей белка VP1 норовируса сем. Caliciviridae и белка VP1 энтеровируса Echovirus 30 сем. Picornaviridae, слитых в одну молекулу, и разработка способа получения вирусоподобных частиц норовируса, содержащих на своей поверхности белок VP1 энтеровируса Echovirus 30 (Е30), в клетках Е. coli, штамм Rosetta2 DE3.

Технический результат изобретения заключается в создании химерного белка S_N-VP1_E30 размером 516 аминокислот, с молекулярной массой 57 к Да, который способен самопроизвольно собираться в VLP, презентирующие антигенные детерминанты белка VP1 энтеровируса Е30. В первичной структуре РНК норовируса методами биоинформатики определяют участок, кодирующий S и hinge регионы белка VP1 (S_N).

Технический результат, достигаемый при реализации заявленного изобретения, заключается в разработке способа получения вирусоподобных частиц норовируса, содержащих на своей поверхности белок VP1 энтеровируса Е30, включающего изготовление генетической конструкции, которая в составе плазмидной ДНК содержит последовательность SEQ ID NO: 1, кодируемую химерным белком S_N-VP1_E30 , который используют для трансформации клеток Е. coli, штамм Rosetta2 DE3.

В уровне техники отсутствуют сведения, указывающие на возможность получения вирусоподобных частиц, содержащих белок VP1 Е30, путем химерного белка S_N-VP1_E30 на основе нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих белок VP1 норовируса и белок VP1 Е30, состоящей из последовательностей, кодирующих Shell(S) и шарнирный регионы белка VP1 норовируса и белок VP1 Е30, трансформации клеток E. coli химерным белком с последующим культивированием в подходящей культуральной среде и выделением S_N-VP1_E30 методом аффинной хроматографии и самосборки in vitro VLP из S_N-VP1_E30.Способ осуществляется следующим образом.

Создают химерный белок S_N-VP1_E30 размером 516 аминокислот с молекулярной массой 57 к Да со структурой в соответствии с последовательностью SEQ ID NO: 1:

Для создания химерного белка в первичной структуре РНК норовируса методами биоинформатики определяют участок, кодирующий S и hinge регионы белка VP1 (S_N). В структуре РНК вируса Е30, определяют участок, кодирующий белок VP1 (VP1_E30). Данные участки объединяют в одну молекулу с образованием химерной нуклеотидной последовательности S_N-VP1_E30, добавляют последовательность кодирующую 6 гистидинов и стоп кодон. Полученную нуклеотидную последовательность используют для предсказания аминокислотной. В химерной последовательности проводят замену сайтов, кодирующих аминокислоты, расположенные в позициях 57, 58 и 136 на нуклеотиды, кодирующие цистеин. Далее кодоны оптимизируют для экспрессии в E. coli. Для экспрессии рекомбинантного белка используют штамм Е. coli Rosetta 2 (DE3) (Novagen, США). Клетки E. coli трансформируют плазмидой, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

Сущность заявленного изобретения поясняется чертежами, где:

на Фиг. 1 изображена структурная организация химерного белка S_N-VP1_E30,

на Фиг. 2 показаны результаты очистки S_N-VP1_E30 из E. coli,

на Фиг. 3 показана электрофоретическая подвижность не денатурированного (1) и денатурированного S_N-VP1_E30,

на Фиг. 4 показаны VLP, образованные S_N-VP1_E30 in vitro.

Осуществление изобретения.

Пример 1. Конструирование слитого белка.

В работе использовали нуклеотидные последовательности (н.п.) генов белка VP1 норовируса генотипа GII.4 (GenBank no. MZ958411) и белка VP1 ЕСНО30 генотипа h (GenBank no. КР090772), штаммов, циркулирующих на территории России. Конструирование слитого гена проводили на основе анализа нуклеотидных последовательностей, с использованием пакета программ Lasergene (Dnastar, Inc). Оптимизацию кодонов осуществляли на основе информации, представленной в базе данных Codon usage database (http://www.kazusa.or.jp/codon/). ДНК синтезировали в ООО "Люмипроб РУС" (Россия) и клонировали в составе pET22b (Novagen, США).

Пример 2. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка.

Для экспрессии рекомбинантного белка использовали штамм E. coli Rosetta 2 (DE3) (Novagen, США). Клетки E. coli трансформировали плазмидой, кодирующей рекомбинантный белок с использованием мультипоратора фирмы Eppendorf (Германия). E. coli выращивали при 37°С в среде LB (1% триптон, 2% дрожжевой экстракт, 0,9% NaCl и 100 мкг/мл ампицилина) до оптической плотности 0,7. Экспрессию индуцировали добавлением изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида до концентрации 0,5 мМ, после чего культуру инкубировали в течение 6 часов при 30°С. Клетки осаждали низкоскоростным центрифугированием, однократно отмывали в 0,9% NaCl и лизировали с использованием BugBuster Protein Extraction Reagent (Novagen, США), согласно рекомендациям производителя. Лизат разделяли центрифугированием при 12000 g в течение 15 мин на растворимую и осадочную фракции белков. Для очистки рекомбинантного белка осадочную фракцию растворяли в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl, 6М гуанидин гидрохлорида, 150 мМ NaCl, рН 7,5, и затем проводили аффинную хроматографию с использованием IMAC Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare, Швеция) согласно рекомендациям производителя для денатурирующих условий. Ренатурацию белка осуществляли методом диализа против 3000 объемов буфера, содержащего 50 мМ трис-HCl рН 7,5, 150 мМ NaCl, 20%, 10% или 5% сахарозы.

Пример 3. Определение концентрации белка.

Концентрацию белка в растворе определяли на спектрофотометре NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, США) при длине волны 280 нм. Эффективность ренатурации белка оценивали путем сравнения концентрации растворимого белка до и после диализа. Концентрацию белка до диализа принимали за 100%.

Пример 4. Электрофорез в ПААГ и иммуноблоттинг.

Все этапы экспрессии и очистки рекомбинантного белка контролировали методом электрофореза белков в 10% ПААГ в присутствии додецил сульфата натрия. Результаты визуализировали окрашиванием геля с помощью Coomassie brilliant blue R250. Использовали маркер молекулярных масс Thermo Scientific PageRuler Unstained Protein Ladder (10 to 200 kDa). Для проведения иммуноблоттинга белки переносили из геля на мембрану PVDF (Thermo Scientific, США) с использованием системы влажного переноса (Bio-Rad, США). Для контроля переноса и определения молекулярной массы использовали PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific, США). Мембрану блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином в фосфатно-солевом буфере и инкубировали с антителами anti-His-HRP:GG1-6F4.3.2 (Miltenyi Biotec, США). Мембрану окрашивали в растворе субстрата Super Signal West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Scientific, США) и измеряли хемилюминесценцию с помощью сканера C-DiGit Blot Scanner (Li-Cor, США), согласно рекомендациям производителей.

Пример 5. Самосборка VLP.

Самосборку VLP из химерного белка осуществляли in vitro методом диализа против 3000 объемов буфера, содержащего 50 мМ трис-HCl рН 7,5, 150 мМ NaCl, 20%, 10% или 5% сахарозы. Результаты самосборки оценивали методами ЭФ в ПААГ и электронной микроскопии. Использовали трансмиссионную электронную микроскопию. На электронно-микроскопическую медную сетку, покрытую парлодиевой пленкой, наносили 5 мкл раствора белка в концентрации 100 мкг/мл, отмывали водой от несвязавшихся компонентов и окрашивали водным раствором 2% уранилацетата (рН 4,5). Образцы просматривали с помощью электронного микроскопа просвечивающего типа НТ7700 (Hitachi, Япония).

Пример 6. Характеристика антигенных свойств VP1 энтеровируса Echovirus 30 в составе РТР.

Антигенные свойства исследовали методом иммуноферментного анализа. Для этого РТР разводили в физиологическом растворе и сорбировали в 96-луночном планшете, инкубировали в течение 24 часов. В лунки планшета содержащего по 90 мкл раствора фосфатно-солевого буфера с твином (ФСБ-Т), добавляли по 10 мкл плазмы крови человека заведомо содержащей антитела к VP1 Echovirus 30. Инкубировали в термостатируемом шейкере при температуре 37°С в течение 60 минут с частотой 500 об/мин. После инкубации лунки планшета промывали 5 раз 1х ФСБ-Т. По окончании промывки удаляли остатки влаги и вносили во все лунки по 100 мкл раствора конъюгата (140 нг/мл), представляющего собой продуцируемые клоном 3D3cc моноклональные антитела к IgG, меченные пероксидазой хрена (МоАТ к IgG HPR) производства Hytest (Россия), и инкубировали 60 минут в шейкере при температуре 37°С. После инкубации повторяли отмывку 1х ФСБ-Т пять раз. Далее вносили во все лунки по 100 мкл раствора ТМБ Hytest (Россия) и инкубировали 10 минут, избегая попадания солнечного света. Реакцию останавливали 50 мкл 1N серной кислоты и измеряли величину оптической плотности на спектрофотометре Infinite М200 Pro (Tecan, Austria) в двухволновом режиме: при основной длине волны 450 нм и длине волны сравнения 680 нм. Анализ полученных данных проводили с использованием компьтерных программ Magellan 7.2 (Tecan, Austria) и Microsoft Excel (Microsoft, США).

Проведенные исследования показали осуществимость заявленного способа получения in vitro вирусоподобных частиц, состоящих из химерного рекомбинантного белка, включающего S-домен и шарнирную часть белка VP1 норовируса, слитых с полноразмерным белком VP1 энтеровируса ЕСНО30.

После индукции в E. coli нарабатывался дополнительный белок, содержащий последовательность из 6 гистидинов, что подтверждало экспрессию SN-VP1_E30. При сравнении набора белков E. coli в растворимой и осадочной фракциях установлено, в осадочной фракции присутствовало большое количество белка с ориентировочной молекулярной массой 50-60 кДа. Расчетная масса S_N-VP1_E30 составляла 57 кДа, а после растворения осадочной фракции белков в буфере, содержащем 6М гуанидин гидрохлорида, выделяли методом аффинной хроматографии S_N-VP1_E30 содержащий гистидиновый хвост Электрофоретическая подвижность очищенного S_N-VP1_E30, совпадала с расчетной.

Способность мономеров S_N-VP1_E30 самостоятельно собираться в VLP исследовали методом электронной микроскопии. Использовали препарат S_N-VP1_E30, ренатурированный в присутствии 20% сахарозы, в котором были обнаружены сферические вирусоподобные частицы, размером приблизительно 50 нм Полученные результаты свидетельствовали о способности к самосборке химерного белка, состоящего из S фрагмента белка VP1 норовируса и полноразмерного белка VP1 энтеровируса ЕСНО30. Сохранение антигенных свойств VP1 Echovirus 30 в составе VLP оценивали по его взаимодействию с антителами к VP1 Echovirus 30 присутствующими в плазме крови человека.

--->

Перечень последовательностей

˂110˃ Федеральное бюджетное учреждение науки «Нижегородский научно-

исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н.

Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и

благополучия человека (ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной

Роспотребнадзора)

˂120˃ Способ получения вирусоподобных частиц норовируса (Caliciviridae:

Norovirus), содержащих белок VP1 энтеровируса Echovirus 30 (Picornaviridae:

Enterovirus: Enterovirus B), in vitro

˂160˃ 1

˂210˃ 1

˂211˃ 516

˂212˃ PRT

˂213˃ Artificial Sequence

<220>

˂223˃ Chimeric protein consisting of the amino acid sequences of the VP1

protein of the norovirus (Caliciviridae: Norovirus) and the VP1 protein of

the enterovirus Echovirus 30 (Picornaviridae: Enterovirus: Enterovirus B)

fused into one molecule

<300>

<301> Novikov, Dmitry V.; Melentev, Dmitriy A.; Mokhonov, Vladislav V.;

Kashnikov, Alexander Yu.; Novikova, Nadezhda A.; Lapin, Vladislav A.;

Mokhonova, Ekaterina V.; Novikov, Viktor V.

<302> Construction of norovirus (Caliciviridae: Norovirus) virus-like

particles containing VP1 of the Echovirus 30 (Picornaviridae: Enterovirus:

Enterovirus B)

<303> Problems of Virology (Voprosy Virusologii)

<304> 66

<305> 5

<306> 383-389

<307> 2021-10-31

˂400˃ 1

Met Lys Met Ala Ser Ser Asp Ala Asn Pro Ser Asp Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Asn Leu Val Pro Glu Val Asn Asn Glu Val Met Ala Leu Glu

20 25 30

Pro Val Val Gly Ala Ala Ile Ala Ala Pro Val Ala Gly Gln Gln

35 40 45

Asn Val Ile Asp Pro Trp Ile Arg Asn Asn Phe Cys Cys Ala Pro

50 55 60

Gly Gly Glu Phe Thr Val Ser Pro Ala Asn Ala Pro Gly Glu Ile

65 70 75

Leu Trp Ser Ala Pro Leu Gly Pro Asp Leu Asn Pro Tyr Leu Ser

80 85 90

His Leu Ala Arg Met Tyr Asn Gly Tyr Ala Gly Gly Phe Glu Val

95 100 105

Gln Val Ile Leu Ala Gly Asn Ala Phe Thr Ala Gly Lys Ile Ile

110 115 120

Phe Ala Ala Val Pro Pro Asn Phe Pro Thr Glu Gly Leu Ser Pro

125 130 135

Cys Gln Val Thr Cys Phe Pro His Ile Ile Val Asp Val Arg Gln

140 145 150

Leu Glu Pro Val Leu Ile Pro Leu Pro Asp Val Arg Asn Asn Phe

155 160 165

Tyr His Tyr Asn Gln Ser Asn Asp Ser Thr Ile Lys Leu Ile Ala

170 175 180

Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Ala Asn Asn Ala Gly Asp Asp Val

185 190 195

Phe Thr Val Ser Cys Arg Val Leu Thr Arg Pro Ser Pro Asp Phe

200 205 210

Asp Phe Ile Phe Leu Val Pro Pro Thr Val Glu Ser Arg Ile Leu

215 220 225

Asn Arg Ala Val Gly Arg Val Ala Asp Thr Ile Ala Ser Gly Pro

230 235 240

Val Asn Thr Glu Gln Ile Pro Ala Leu Thr Ala Val Glu Thr Gly

245 250 255

His Thr Ser Gln Val Val Pro Ser Asp Thr Met Gln Thr Arg His

260 265 270

Val Val Asn Tyr His Thr Arg Ser Glu Ser Ser Ile Glu Asn Phe

275 280 285

Met Gly Arg Ala Ala Cys Val Tyr Ile Ala Gln Tyr Ala Thr Glu

290 295 300

Lys Val Asn Asp Glu Leu Asp Arg Tyr Thr Asn Trp Glu Ile Thr

305 310 315

Thr Arg Gln Val Ala Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu Met Phe Thr

320 325 330

Tyr Met Arg Phe Asp Leu Glu Val Thr Phe Val Ile Thr Ser Ser

335 340 345

Gln Arg Thr Ser Thr Thr Tyr Ala Ser Asp Ser Pro Pro Leu Thr

350 355 360

His Gln Val Met Tyr Val Pro Pro Gly Gly Pro Ile Pro Arg Ser

365 370 375

Tyr Glu Asp Phe Ala Trp Gln Thr Ser Thr Asn Pro Ser Val Phe

380 385 390

Trp Thr Glu Gly Asn Ala Pro Pro Arg Met Ser Ile Pro Phe Met

395 400 405

Ser Val Gly Asn Ala Tyr Cys Asn Phe Tyr Asp Gly Trp Ser His

410 415 420

Phe Ser Gln Ser Gly Val Tyr Gly Tyr Thr Thr Leu Asn Asn Met

425 430 435

Gly His Leu Tyr Phe Arg His Val Asn Lys Ser Thr Ala Phe Pro

440 445 450

Val Asp Ser Val Ala Arg Val Tyr Phe Lys Pro Lys His Val Lys

455 460 465

Ala Trp Val Pro Arg Ala Pro Arg Leu Cys Pro Tyr Leu Tyr Ala

470 475 480

Gly Asn Val Asn Phe Asp Val Gln Gly Val Thr Glu Ser Arg Ser

485 490 495

Lys Ile Thr Leu Asp Arg Ser Thr His Asn Pro Leu Ser Asn Thr

500 505 510

His His His His His His

515

<---

Способ получения вирусоподобных частиц норовируса, содержащих белок VP1 энтеровируса Echovirus 30, in vitro, включающий культивирование трансформированных химерным белком клеток E. coli в подходящей культуральной среде, выделение и очистку вирусоподобных частиц, отличающийся тем, что создают химерный белок S_N-VP1_E30 размером 516 аминокислот с молекулярной массой 57 кДа, со структурой в соответствии с последовательностью SEQ ID NO: 1 и трансфомируют клетки Е. coli, штамм Rosette 2 DE3 плазмидой, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.