Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с CD3 человека и с CD3 яванского макака, и их применение для лечения или профилактики злокачественного новообразования. Также раскрыты полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела, вектор и клетка для получения антитела, способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое связывается с CD3 человека и CD3 яванского макака, фармацевтическая композиция и способ лечения или профилактики злокачественного новообразования. Изобретение позволяет получить новые антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые обладают высокой аффиностью к CD3 человека и CD3 яванского макака. 12 н. и 21 з.п. ф-лы, 117 ил., 3 табл., 15 пр.

Область техники

[0001] Настоящее изобретение относится к новому антителу, которое связывается с CD3 человека и с CD3 яванских макак, и к молекулам, содержащим это антитело.

Уровень техники

[0002] 1) Функция моноклональных анти–CD3 антител, как и любого другого моноклонального антитела, заключается в точном распознавании их молекул–мишеней. Каждое анти–CD3 антитело распознает только один эпитоп на молекуле–мишени CD3. Среди моноклональных антител, специфичных к комплексу CD3, OKT3 является наиболее широко используемым и лучше всего охарактеризованным.

2) OKT3 представляет собой мышиное моноклональное антитело против человеческого CD3 (Непатентный документ 1). Моноклональные анти–CD3 антитела были использованы в методе профилактики отторжения трансплантированных органов. Антитела связываются с комплексами TCR на T–клетках человека и подавляют их активацию и пролиферацию. Такое лечение применялось в течение длительного периода времени для профилактики отторжения гомотрансплантата органа. (Непатентные документы 2–4). OKT3 представляет собой анти–CD3 антитело, которое впервые используется в таком способе. OKT3 обладает сильным иммуносупрессорным эффектом, и при этом, его клиническое применение затруднено из–за серьезных побочных реакций, связанных с его иммуногенностью и митогенным потенциалом (Непатентные документы 5–8).

3) OKT3 индуцирует активацию T–клеток и продукцию цитокинов in vitro и высвобождает большое количество цитокинов in vivo, что приводит к развитию цитокинового синдрома (Непатентный документ 5). Это обусловлено тем, что OKT3 представляет собой двухвалентную молекулу IgG, и таким образом, перекрестно связывается с T–клетками и с клетками, экспрессирующими рецептор Fcγ, что в конечном счете приводит к активации T–клеток (Непатентный документ 8). Кроме того, OKT3 представляет собой мышиное антитело, а поэтому известно, что оно вызывает образование гетерофильных антител, таких как человеческие антимышиные антитела (HAMA) после его длительного введения (Непатентный документ 7). Отчеты о применении лечения анти–CD3 антителами и их побочные реакции систематизированы ниже (Патентный документ 1).

4) Для решения этих проблем были получены OKT3 в форме scFv (Непатентный документ 9) и гуманизованное OKT3 (Непатентный документ 10). Биспецифическое антитело, включающее комбинацию одной цепи OKT3 с одной цепью антитела против антигена–мишени, экспрессирующегося на поверхности злокачественных клеток, описано в другом примере применения OKT3 (Патентный документ 2 и Непатентный документ 11).

5) Предполагается, что мультиспецифические антитела, содержащие анти–CD3 антитела, описанные в литературе, обладают значительным терапевтическим потенциалом при лечении злокачественных заболеваний. Так, например, известно, что TROP2 сверхэкспрессируется в эпителиальных опухолях различных типов (Непатентные документы 12–16). Экспрессированное биспецифическое антитело, которое генетически связывает человеческое TROP2–специфическое антитело с антигенсвязывающим фрагментом анти–CD3 антитела, пока еще не было описано.

6) OKT3 реагирует с CD3 шимпанзе, но не реагирует с CD3 других приматов, таких как яванские макаки (Непатентный документ 17). Аналогичным образом, моноклональное анти–CD3 антитело UCHT–1 также реагирует с CD3 шимпанзе, но не реагирует с CD3 яванских макак (Непатентный документ 18). С другой стороны, было обнаружено, что некоторые моноклональные антитела распознают антигены яванских макак, но не распознают их человеческие аналоги. Одним из примеров антител этой группы является FN–18, которое представляет собой моноклональное антитело, направленное против CD3 яванских макак (Непатентный документ 19).

7) Ограничение в применении OKT3 и серий модифицированных антител OKT3 заключается в их специфичности к CD3 человека. Такое ограничение может оказывать серьезные препятствия в разработке терапевтических лекарственных средств для лечения заболеваний человека. Это обусловлено тем, что лекарственные средства, которые являются кандидатами на их разработку, должны проходить преклинические испытания для получения разрешения на их продажу, и желательно, чтобы такие преклинические испытания были проведены на животных, а в частности, на высших приматах, таких как яванские макаки. Таким образом, в случае лекарственных средств–кандидатов, содержащих анти–CD3 антитела, было бы крайне желательно использовать анти–CD3 антитело, которое обладало бы способностью связываться с человеческим CD3 и с CD3 яванских макак.

8) Перекрестно–реагирующее антитело, связывающееся с CD3 человека и с CD3 яванских макак, было описано в Патентных документах 3 и 4 и Непатентном документе 20. Кроме того, было описано биспецифическое антитело, в котором одна цепь такого анти–CD3 антитела связывается с одной цепью антитела против антигена–мишени, экспрессируемого на поверхности раковых клеток (Патентный документ 5 и Непатентный документ 21). Однако, для сообщения мультиспецифическим антителам или мультиспецифическим молекулам способности в высокой степени различать нужные раковые мишени, необходимо, чтобы анти–CD3 антитело связывалось с эпитопами, не являющимися эпитопами, упомянутыми выше, и связывалось с человеческим CD3 и с CD3 яванских макак.

Уровень техники

[0003] [Патентные документы]

[Патентный документ 1] Публикация Международной заявки WO2012/162067

[Патентный документ 2] Публикация Международной заявки WO2007/108152A1

[Патентный документ 3] Публикация заявки на патент США 8236308B2

[Патентный документ 4] Публикация Международной заявки WO2008/119567A1

[Патентный документ 5] Публикация Международной заявки WO2015/026892A1

[0004] [Непатентный документ]

[Непатентный документ 1] Salmeron A. et al., J. Immunol. (1991) 147, 3047–3052

[Непатентный документ 2] Cosmi AB. et al., Transplantation (1981) 32, 535–539

[Непатентный документ 3] Gilbert EM. et al., Am.J.Med. (1987) 82, 202–206

[Непатентный документ 4] Thistlethwaite JR. et al., Transplanation (1987) 43, 176–184

[Непатентный документ 5] Abramowicz D. et al., Transplanation (1989) 47, 606–608

[Непатентный документ 6] Toussaint D. et al., Transplanation (1989) 48, 524–526

[Непатентный документ 7] Thistlethwaite, JR. et al., Am. J. Kidney Dis. (1988) 11, 112–119

[Непатентный документ 8] Meuer, SC. et al., Eur. J. Immunol. (1986) 136, 4106–4112

[Непатентный документ 9] George AJ. et al., J. Immunol. (1994) 152 (4), 1802–11

[Непатентный документ 10] Woodle ES. et al., J Immunol. (1992) 148 (9), 2756–63

[Непатентный документ 11] Yankelevich M. et al., Pediatr. Blood Cancer (2012) 59 (7), 1198–1205

[Непатентный документ 12] Ohmachi T. et al., Clin. Cancer Res. (2006) 12 (18), 3857–3863

[Непатентный документ 13] Muhlmann G., et al., J. Clin. Pathol. (2009) 62 (2), 152–158

[Непатентный документ 14] Fong D., et al., Br. J. Cancer (2000) 99 (8), 1290–1295.

[Непатентный документ 15] Fong D. et al., Mod. Pathol. (2000) 21 (2) (2000), 186–191

[Непатентный документ 16] Ning S., et al., Neurol. Sci. (2013) 34 (10), 1745–1750

[Непатентный документ 17] Sandusky et al., J. Med. Primatol. (1986) 15, 441–451

[Непатентный документ 18] http://www.nhpreagents.org/NHP/clonelist.aspx?ID=77

[Непатентный документ 19] Uda et al., J.Med.Primatol. (2001) 30, 141–147

[Непатентный документ 20] Conrad ML.et al., Cytometry A. (2007) 71 (11), 925–33

[Непатентный документ 21] Lum LG. et al., BioDrugs (2011) 25 (6), 365–379.

Сущность изобретения

Проблема, которая может решается настоящим изобретением

[0005] Целью настоящего изобретения является получение нового антитела или антигенсвязывающего фрагмент этого антитела (далее также называемого антителом и тому подобное), которые связываются с человеческим CD3 и с CD3 яванских макак; молекулы, содержащей антитело и тому подобное, а также 1 или 2 или более дополнительных антител или антигенсвязывающих фрагменов этих антител, где указанная молекула является мультиспецифической; и фармацевтической композиции, обладающей цитотоксической активностью и тому подобное и включающей антитело и тому подобное или такую молекулу в качестве активного ингредиента.

Средства для решения проблемы

[0006] Авторами настоящего изобретения было проведено интенсивное исследование для достижения данной цели, и настоящее изобретение было реализовано путем получения нового анти–CD3 антитела и молекулы, содержащей это антитело.

[0007] В частности, настоящее изобретение содержит следующие аспекты:

(1) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, где:

последовательность тяжелой цепи содержит:

CDRH1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:26,

CDRH2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:98, и

CDRH3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:28;

последовательность легкой цепи содержит

CDRL1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:29,

CDRL2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:99, и

CDRL3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:31; и

антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с человеческим CD3 и с CD3 яванских макак.

(2) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по (1), где:

в CDRH2

первая Xaa выбрана из группы, состоящей из A, E, G, H, I, L, T, V, R и S, а

вторая Xaa представляет собой S, или

первая Xaa представляет собой N, а

вторая Xaa выбрана из группы, состоящей из E, R, F, Y, L, V, I, K, и T,

в CDRL2,

Xaa выбрана из группы, состоящей из Q, A, G, S, N, и D, и

антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с человеческим CD3 и с CD3 яванских макак.

(3) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по (1) или (2), где:

в CDRH2,

первая Xaa выбрана из группы, состоящей из R и S, а вторая Xaa представляет собой S,

в CDRL2,

Xaa выбрана из группы, состоящей из Q, A, G, S, N, и D, и

антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с человеческим CD3 и с CD3 яванских макак.

(4) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по (1), где:

последовательность тяжелой цепи содержит вариабельную область, имеющую CDRH1, CDRH2 и CDRH3,

CDRH1 состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:26,

CDRH2 состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:27, и

CDRH3 состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:28;

последовательность легкой цепи содержит вариабельную область, имеющую CDRL1, CDRL2 и CDRL3,

CDRL1 состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:29,

CDRL2 состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:30, и

CDRL3 состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:31; и

антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с человеческим CD3 и с CD3 яванских макак.

(5) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из п.п.(1)–(4), где последовательность вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:100.

(6) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по (5), где:

в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:100:

первая Xaa выбрана из группы, состоящей из A, E, G, H, I, L, T, V, R и S, а

вторая Xaa представляет собой S, или

первая Xaa представляет собой N, а

вторая Xaa выбрана из группы, состоящей из E, R, F, Y, L, V, I, K и T.

(7) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по (5), где:

в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:100:

первая Xaa выбрана из группы, состоящей из R и S, а вторая Xaa представляет собой S.

(8) Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из п.п.(1)–(7), где вариабельная область легкой цепи содержит любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:101, 102 и 103.

(9) Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по (8), где

в аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO:101, 102 и 103,

Xaa выбрана из группы, состоящей из Q, A, G, S, N и D.

(10) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по (5), где последовательность вариабельной области тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16.

(11) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по (8), где последовательность вариабельной области легкой цепи содержит любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:17, 20 и 23.

(12) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по (1) или (2), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:100, и вариабельную область легкой цепи, содержащую любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:101, 102 и 103, где

в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:100:

первая Xaa выбрана из группы, состоящей из A, E, G, H, I, L, T, V, R и S, а вторая Xaa представляет собой S, или

первая Xaa представляет собой N, а вторая Xaa выбрана из группы, состоящей из E, R, F, Y, L, V, I, K и T, и

в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:101, 102 и 103:

Xaa выбрана из группы, состоящей из Q, A, G, S, N и D.

(13) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по (12), где

в SEQ ID NO:100

первая Xaa выбрана из группы, состоящей из R и S, а

вторая Xaa представляет собой S, и

в аминокислотной последовательности в любой из SEQ ID NO:101, 102 и 103,

Xaa выбрана из группы, состоящей из Q, A, G, S, N и D.

(14) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, по (13), содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:60 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные остатки 135–243 SEQ ID NO:60; антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:64 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные остатки 135–241 SEQ ID NO:64; антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:66 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные остатки 135–243 SEQ ID NO:66; антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:68 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные остатки 135–243 SEQ ID NO:68; антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:70 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные остатки 135–243 SEQ ID NO:70; антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:72 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные остатки 135–243 SEQ ID NO:72; антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:74 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные остатки 135–243 SEQ ID NO:74; антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:76 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные остатки 135–243 SEQ ID NO:76; антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:78 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные остатки 135–243 SEQ ID NO:78; антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:80 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные остатки 135–243 SEQ ID NO:80; антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:82 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные остатки 135–243 SEQ ID NO:82; или антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:84 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные остатки 135–243 SEQ ID NO:84.

(15) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по (1), (4), (5), (8), (10) или (11), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, линкер и вариабельную область легкой цепи, содержащую любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:17, 20 и 23.

(16) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по (1)–(15), где вариабельная область тяжелой цепи связывается с вариабельной областью легкой цепи в указанном порядке, или вариабельная область легкой цепи связывается с вариабельной областью тяжелой цепи в указанном порядке, начиная с амино–конца и, необязательно: i) имеет линкер между обеими вариабельными областями, ii) имеет глициновый остаток у амино–конца вариабельной области с амино–концевой стороны и iii) имеет линкер, FLAG–метку и/или HIS–метку у карбоксильного конца вариабельной области со стороны карбоксильного конца.

(17) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по (16), содержащее:

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:60,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–241 SEQ ID NO:64,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:66,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:68,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:70,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:72,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:74,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:76,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:78,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:80,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:82 или

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:84.

(18) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по (16), содержащее:

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–269 SEQ ID NO:19,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–269 SEQ ID NO:22,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–267 SEQ ID NO:25,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–269 SEQ ID NO:60,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–267 SEQ ID NO:64,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–269 SEQ ID NO:66,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–269 SEQ ID NO:68,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–269 SEQ ID NO:70,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–269 SEQ ID NO:72,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–269 SEQ ID NO:74,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–269 SEQ ID NO:76,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–269 SEQ ID NO:78,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–269 SEQ ID NO:80,

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–269 SEQ ID NO:82, или

аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 2–269 SEQ ID NO:84.

[0008] (19) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, содержащейся в полинуклеотиде, который гибридизуется в жестких условиях с комплементарной цепью полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащуюся в антителе или антигенсвязывающем фрагменте антитела по любому из (14)–(18), и связывающуюся с человеческим CD3 и с CD3 яванских макак.

(20) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности тяжелой цепи, содержащейся в антителе или в антигенсвязывающем фрагменте антитела по любому из (14)–(18), и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична аминокислотной последовательности легкой цепи, содержащейся в антителе или в антигенсвязывающем фрагменте антитела по любому из (14)–(18), и связывается с человеческим CD3 и с CD3 яванских макак.

(21) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, полученную путем замены, делеции или добавления 1 или более аминокислот аминокислотной последовательности, содержащейся в тяжелой цепи, содержащейся в антителе или в антигенсвязывающем фрагменте антитела по любому из (14)–(18), и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность, полученную путем замены, делеции или добавления 1 или более аминокислот аминокислотной последовательности, содержащейся в легкой цепи, содержащейся в антителе или в антигенсвязывающем фрагменте антитела по любому из (14)–(18) и связывающейся с человеческим CD3 и с CD3 яванских макак.

(22) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с тем же сайтом на CD3 человека, который связывается с антителом или с антигенсвязывающим фрагментом антитела по любому из (14)–(18) и связывается с CD3 яванских макак.

(23) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент конкурируют с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела по любому из (14)–(18) за связывание с человеческим CD3 и связываются с CD3 яванских макак.

(24) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по (22), где сайт на человеческом CD3, связанный с антителом, состоит из 7 или более аминокислот, выбранных из 55–го серина (Ser), 56–й глутаминовой кислоты (Glu), 58–го лейцина (Leu), 59–го триптофана (Trp), 65–го аспарагина (Asn), 66–го изолейцина (Ile), 77–го серина (Ser), 78–й аспарагиновой кислоты (Asp), 101–го аргинина (Arg), 102–го глицина (Gly), 103–го серина (Ser), 104–го лизина (Lys), и 105–го пролина (Pro) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1.

(25) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из (1)–(17) и (19)–(24), где антитело представляет собой IgG.

(26) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из (1)–(23), где антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, F(ab)’, Fv, scFv, и sdAb.

(27) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из (1)–(17) и (19)–(25), где антитело представляет собой гуманизованное антитело или человеческое антитело, содержащее константную область человеческого иммуноглобулина.

(28) Полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела по любому из (1)–(27).

(29) Полинуклеотид по (28), где полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность:

аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:19,

аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:22,

аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки 2–241 SEQ ID NO:25,

аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:60,

аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки 2–241 SEQ ID NO:64,

аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:66,

аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:68,

аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:70,

аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:72,

аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:74,

аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:76,

аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:78,

аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:80,

аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:82, или

аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:84.

(30) Вектор, содержащий полинуклеотид по (28) или (29).

(31) Клетка, содержащая полинуклеотид по (28) или (29) или вектор по (30) или продуцирующая антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из (1)–(27).

(32) Способ получения антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела, которое связывается с CD3 человека и с CD3 яванских макак, где указанный способ включает стадии: культивирования клетки по (31); и выделения антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела, которые связываются с человеческим CD3, из этих культур.

(33) Антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которое связывается с CD3 человека и с CD3 яванских макак, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент были получено способом по (32).

(34) Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из (1)–(27) и (33) в качестве активного ингредиента.

(35) Молекула, обладающая антигенсвязывающей активностью и содержащая антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из (1)–(27) и (33).

(36) Молекула по (35), где указанная молекула является мультиспецифической.

[0009] (37) Молекула по (35) или (36), также содержащая 1 или 2 или более дополнительных антител или антигенсвязывающих фрагментов антител помимо антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела по любому из (1)–(27) и (33).

(38) Молекула по (37), где антигенсвязывающий фрагмент дополнительного антитела представляет собой Fab, F(ab)’, Fv, scFv или sdAb.

(39) Молекула по (38), где указанная молекула содержит Fc.

(40) Молекула по любому из (37)–(38), где дополнительное антитело представляет собой гуманизованное антитело или человеческое антитело, содержащее константную область человеческого иммуноглобулина.

(41) Молекула по любому из (37)–(38), где дополнительное антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела связаны с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела по любому из (1)–(27) и (33) посредством линкера или без линкера.

(42) Молекула по (41), где карбоксильный конец аминокислотной последовательности дополнительного антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела связан с линкером, а карбоксильный конец аминокислотной последовательности линкера дополнительно связан с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела по любому из (1)–(27) и (33).

(43) Молекула по (42), где указанная молекула содержит аминокислотную последовательность, в которой карбоксильный конец аминокислотной последовательности дополнительного антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела связан с линкером, а карбоксильный конец аминокислотной последовательности линкера дополнительно связан:

с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела, содержащего аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:19,

с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела, содержащего аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:22, или

с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела, содержащего аминокислотные остатки 2–241 SEQ ID NO:25.

(44) Молекула по любому из (35)–(42), содержащая антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из (1)–(27) и (33), где вариабельная область содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи в указанном порядке или вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи в указанном порядке, начиная с амино–конца и, необязательно: i) имеет линкер между обеими вариабельными областями, ii) имеет глициновый остаток у амино–конца вариабельной области с амино–концевой стороны и iii) имеет линкер, FLAG–метку и/или HIS–метку у карбоксильного конца вариабельной области со стороны карбоксильного конца. Подходящими формами являются биспецифические молекулы гибридного типа и двойного типа.

(45) Молекула по (44), где дополнительное антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела связаны:

с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела, содержащими аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:19,

с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела, содержащими аминокислотные остатки 2–241 SEQ ID NO:25,

с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела, содержащими аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:60,

с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела, содержащими аминокислотные остатки 2–241 SEQ ID NO:64,

с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела, содержащими аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:66,

с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела, содержащими аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:68,

с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела, содержащими аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:70,

с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела, содержащими аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:72,

с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела, содержащими аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:74,

с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела, содержащими аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:76,

с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела, содержащими аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:78,

с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела, содержащими аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:80,

с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела, содержащими аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:82, или

с антителом или антигенсвязывающим фрагментом антитела, содержащими аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:84. Подходящими формами являются биспецифические молекулы гибридного типа и двойного типа.

(46) Молекула по любому из (36)– (45), где дополнительное антитело представляет собой антитело против злокачественной мишени.

(47) Молекула по любому из (36)–(46), где молекула является биспецифической.

(48) Молекула по любому из (36)–(47), где молекула представляет собой полипептид.

(49) Полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность молекулы по (48).

(50) Вектор, содержащий полинуклеотид по (49).

(51) Клетка, продуцирующая полинуклеотид по (49) или вектор по (50) или молекулу по (48).

(52) Способ получения молекулы, связывающейся с CD3 человека и с CD3 яванских макак, где указанный способ включает стадии: культивирования клетки по (51); и выделения молекулы, связывающейся с человеческим CD3, из этих культур.

(53) Молекула, связывающаяся с CD3 человека и с CD3 яванских макак, где указанная молекула была получена способом по (52).

(54) Фармацевтическая композиция, содержащая молекулу по любому из (35)–(48) и (53) в качестве активного ингредиента.

(55) Фармацевтическая композиция по (54), где фармацевтическая композиция индуцирует цитотоксичность в клетках–мишенях посредством перенацеливания T–клеток на клетки–мишени.

Эффект изобретения

[0010] Настоящее изобретение относится к получению нового анти–CD3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое связывается с CD3 человека и с CD3 яванских макак, и к новой молекуле, обладающей антигенсвязывающей активностью и содержащей антитело и тому подобное. Кроме того, была получена новая фармацевтическая композиция, содержащая такое антитело и тому подобное, или молекулу в качестве активного ингредиента. Антитело и тому подобное, или молекула обладают цитотоксической активностью, зависимой от T–клеток, и являются подходящими в качестве терапевтического или профилактического средства для лечения различных заболеваний, таких как рак.

Краткое описание чертежей

[0011] [Фигура 1] На фигуре 1 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность CD3ε человека.

[Фигура 2] На фигуре 2 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность человеческого CD3δ.

[Фигура 3] На фигуре 3 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая одноцепочечный антиген человеческого CD3εγ.

[Фигура 4] На фигуре 4 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность одноцепочечного антигена человеческого CD3εγ.

[Фигура 5] На фигуре 5 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность смыслового праймера Nhe–polyC–S для амплификации гена тяжелой цепи.

[Фигура 6] На фигуре 6 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность первого антисмыслового праймера rIgγ–AS1 для амплификации гена тяжелой цепи.

[Фигура 7] На фигуре 7 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность второго антисмыслового праймера rIgγ–AS2 для амплификации гена тяжелой цепи.

[Фигура 8] На фигуре 8 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность смыслового праймера Nhe–polyC–S2 для амплификации гена легкой цепи.

[Фигура 9] На фигуре 9 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность первого антисмыслового праймера rIgL–AS1 для амплификации гена легкой цепи.

[Фигура 10] На фигуре 10 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность второго антисмыслового праймера rIgL–AS2 для амплификации гена легкой цепи.

[Фигура 11] На фигуре 11 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность смыслового праймера rIgγ–seq для секвенирования тяжелой цепи.

[Фигура 12] На фигуре 12 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность антисмыслового праймера 1 rIgL–seq1 для секвенирования легкой цепи.

[Фигура 13] На фигуре 13 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность антисмыслового праймера 2 rIgL–seq2 для секвенирования легкой цепи.

[Фигура 14] На фигуре 14 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи C3–147.

[Фигура 15] На фигуре 15 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи C3–147.

[Фигура 16] На фигуре 16 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи C3–147.

[Фигура 17] На фигуре 17 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи C3–147.

[Фигура 18] На фигуре 18 представлена диаграмма, где показана олигонуклеотидная последовательность смысловой цепи линкера G4S.

[Фигура 19] На фигуре 19 представлена диаграмма, где показана олигонуклеотидная последовательность антисмысловой цепи линкера G4S.

[Фигура 20] На фигуре 20 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая C3E–7000.

[Фигура 21] На фигуре 21 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность в C3E–7000.

[Фигура 22] На фигуре 22 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи C3E–7034.

[Фигура 23] На фигуре 23 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи C3E–7034.

[Фигура 24] На фигуре 24 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность CDR–H1 в C3E–7000.

[Фигура 25] На фигуре 25 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность CDR–H2 в C3E–7000.

[Фигура 26] На фигуре 26 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность CDR–H3 в C3E–7000.

[Фигура 27] На фигуре 27 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность CDR–L1 в C3E–7000.

[Фигура 28] На фигуре 28 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность CDR–L2 в C3E–7000.

[Фигура 29] На фигуре 29 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность CDR–L3 в C3E–7000.

[Фигура 30] На фигуре 30 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи C3E–7035.

[Фигура 31] На фигуре 31 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность C3E–7035.

[Фигура 32] На фигуре 32 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи C3E–7036.

[Фигура 33] На фигуре 33 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность C3E–7036.

[Фигура 34] На фигуре 34 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая C3E–7034.

[Фигура 35] На фигуре 35 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая C3E–7035.

[Фигура 36] На фигуре 36 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая C3E–7036.

[Фигура 37] На фигуре 37 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность человеческого CD3γ.

[Фигура 38] На фигуре 38 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность C3E–7034.

[Фигура 39] На фигуре 39 представлена диаграмма, где показана комплексная структура CD3εγ и C3E–7034.

[Фигура 40] На фигуре 40 представлена пара диаграмм, где показано взаимодействие между CD3εγ и тяжелыми и легкими цепями C3E–7034.

На фигуре 40A представлена диаграмма, относящаяся к вариабельной области легкой цепи C3E–7034 и CD3ε, где аминокислотные остатки CD3ε, находящиеся на расстоянии 4 ангстрем друг от друга, показаны в этой модели жирными линиями, а другие аминокислоты показаны в этой модели тонкими линиями.

На фигуре 40B представлена диаграмма, относящаяся к вариабельной области тяжелой цепи C3E–7034 и CD3ε, где аминокислотные остатки CD3ε, находящиеся на расстоянии 4 ангстрем друг от друга, показаны в этой модели жирными линиями, а другие аминокислоты показаны в этой модели тонкими линиями.

[Фигура 41] На фигуре 41 представлена диаграмма, где показаны сайты взаимодействия человеческого CD3ε с последовательностями вариабельных областей тяжелой и легкой цепей в C3E–7034.

[Фигура 42] На фигуре 42 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи в OKT3.

[Фигура 43] На фигуре 43 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи в C3E–3007.

[Фигура 44] На фигуре 44 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи в OKT3.

[Фигура 45] На фигуре 45 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи в C3E–3007.

[Фигура 46] На фигуре 46 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая scFv C3E–3007.

[Фигура 47] На фигуре 47 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность scFv C3E–3007.

[Фигура 48] На фигуре 48 представлена диаграмма, где показана активность связывания C3E–3007, C3E–7034, C3E–7035 и C3E–7036, которые представляют собой гуманизованные анти–CD3 scFv, с человеческим CD3 (МКПК).

[Фигура 49] На фигуре 49 представлена диаграмма, где показана активность связывания C3E–3007, C3E–7034, C3E–7035 и C3E–7036, которые представляют собой гуманизованные анти–CD3 scFv, с CD3 яванских макак (МКПК).

[Фигура 50] На фигуре 50A представлена диаграмма, где показано активирующее действие C3E–7034 и C3E–3007, которые представляют собой анти–CD3 scFv, на человеческие CD8–позитивные клетки, а на фигуре 50B представлена диаграмма, где показано активирующее действие C3E–7034 и C3E–3007, которые представляют собой анти–CD3 scFv, на CD8–позитивные клетки яванских макак.

[Фигура 51] На фигуре 51 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность scFv HT1–11.

[Фигура 52] На фигуре 52 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая scFv HT1–11.

[Фигура 53] На фигуре 53 представлена пара диаграмм, где показано, что scFv HT1–11 связывается с человеческой TROP2–позитивной клеточной линией.

На фигуре 53A представлена диаграмма, где показано связывание с клеточной линией плоскоклеточного рака ротоглотки FaDu.

На фигуре 53B представлена диаграмма, где показано связывание с клеточной линией рака поджелудочной железы HPAF–II.

[Фигура 54] На фигуре 54 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность OРС, кодирующая T2C–0001.

[Фигура 55] На фигуре 55 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность OРС, кодирующая T2C–0003.

[Фигура 56] На фигуре 56 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность OРС, кодирующая T2C–0005.

[Фигура 57] На фигуре 57 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность OРС, кодирующая T2C–0006.

[Фигура 58] На фигуре 58 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность T2C–0001.

[Фигура 59] На фигуре 59 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность T2C–0003.

[Фигура 60] На фигуре 60 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность T2C–0005.

[Фигура 61] На фигуре 61 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность T2C–0006.

[Фигура 62] На фигуре 62 представлена пара диаграмм, где показано, что биспецифические анти–TROP2–CD3 молекулы T2C–0001, T2C–0003, T2C–0005 и T2C–0006 связываются с TROP2–позитивной клеточной линией.

На фигуре 62A представлена диаграмма, где показано связывание с клеточной линией плоскоклеточного рака ротоглотки FaDu.

На фигуре 62B представлена диаграмма, где показано связывание с клеточной линией рака поджелудочной железы HPAF–II.

[Фигура 63] На фигуре 63 представлена диаграмма, где показана активность связывания биспецифических анти–TROP2–CD3 молекул T2C–0001, T2C–0003, T2C–0005 и T2C–0006 с человеческим CD3 (МКПК).

[Фигура 64] На фигуре 64 представлена диаграмма, где показана активность связывания биспецифических анти–TROP2–CD3 молекул T2C–0001, T2C–0003, T2C–0005 и T2C–0006 с CD3 яванских макак (МКПК).

[Фигура 65] На фигуре 65A представлена диаграмма, где показано, что TROP2 экспрессируется в клеточной линии плоскоклеточного рака ротоглотки FaDu.

На фигуре 65B представлена диаграмма, где показано, что TROP2 экспрессируется в клеточной линии рака поджелудочной железы HPAF–II.

На фигуре 65C представлена диаграмма, где показано, что TROP2 не экспрессируется в клеточной линии рака легких Calu–6.

[Фигура 66] На фигуре 66A представлена диаграмма, где показано, что биспецифические анти–TROP2–CD3 молекулы T2C–0001, T2C–0003, T2C–0005 и T2C–0006 обладают цитотоксической активностью против клеточной линии плоскоклеточного рака ротоглотки FaDu в присутствии человеческих МКПК.

На фигуре 66B представлена диаграмма, где показано, что биспецифические анти–TROP2–CD3 молекулы T2C–0001, T2C–0003, T2C–0005 и T2C–0006 обладают цитотоксической активностью против клеточной линии рака поджелудочной железы HPAF–II в присутствии человеческих МКПК.

На фигуре 66C представлена диаграмма, где показано, что биспецифические анти–TROP2–CD3 молекулы T2C–0001, T2C–0003, T2C–0005 и T2C–0006 не обладают цитотоксической активностью против клеточной линии рака легких человека Calu–6 в присутствии человеческих МКПК.

[Фигура 67] На фигуре 67 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая C3E–7078.

[Фигура 68] На фигуре 68 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность C3E–7078.

[Фигура 69] На фигуре 69 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая C3E–7079.

[Фигура 70] На фигуре 70 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность C3E–7079.

[Фигура 71] На фигуре 71 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая C3E–7085.

[Фигура 72] На фигуре представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность C3E–7085.

[Фигура 73] На фигуре 73 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая C3E–7086.

[Фигура 74] На фигуре 74 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность C3E–7086.

[Фигура 75] На фигуре 75 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая C3E–7087.

[Фигура 76] На фигуре 76 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность C3E–7087.

[Фигура 77] На фигуре 77 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая C3E–7088.

[Фигура 78] На фигуре 78 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность C3E–7088.

[Фигура 79] На фигуре 79 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая C3E–7089.

[Фигура 80] На фигуре 80 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность C3E–7089.

[Фигура 81] На фигуре 81 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая C3E–7090.

[Фигура 82] На фигуре 82 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность C3E–7090.

[Фигура 83] На фигуре 83 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая C3E–7091.

[Фигура 84] На фигуре 84 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность C3E–7091.

[Фигура 85] На фигуре 85 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая C3E–7092.

[Фигура 86] На фигуре 86 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность C3E–7092.

[Фигура 87] На фигуре 87 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая C3E–7093.

[Фигура 88] На фигуре 88 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность C3E–7093.

[Фигура 89] На фигуре 89 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая C3E–7094.

[Фигура 90] На фигуре 90 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность C3E–7094.

[Фигура 91] На фигуре 91 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая C3E–7095.

[Фигура 92] На фигуре 92 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность C3E–7095.

[Фигура 93] На фигуре 93 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая праймер HN53R Fw.

[Фигура 94] На фигуре 94 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая праймер HN53R Rv.

[Фигура 95] На фигуре 95 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая праймер HN53S Fw.

[Фигура 96] На фигуре 96 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность, кодирующая праймер HN53S Rv.

[Фигура 97] На фигуре 97 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность OРС, кодирующая AXC–0001.

[Фигура 98] На фигуре 98 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность AXC–0001.

[Фигура 99] На фигуре 99 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность OРС, кодирующая AXC–0002.

[Фигура 100] На фигуре 100 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность AXC–0002.

[Фигура 101] На фигуре 101 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность OРС, кодирующая MGC–0001.

[Фигура 102] На фигуре представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность MGC–0001.

[Фигура 103] На фигуре 103 представлена диаграмма, где показана нуклеотидная последовательность OРС, кодирующая MGC–0002.

[Фигура 104] На фигуре 104 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность MGC–0002.

[Фигура 105] На фигуре 105 представлен список праймеров, используемых для получения вариантов CDR анти–CD3 антител.

[Фигура 106–1] На фигуре 106–1 представлена диаграмма, где показана активность связывания вариантов CDR анти–CD3 антител с человеческим CD3 и с CD3 яванских макак (МКПК).

[Фигура 106–2] На фигуре 106–2 представлена диаграмма, где показана активность связывания вариантов CDR анти–CD3 антител с человеческим CD3 и с CD3 яванских макак (МКПК).

[Фигура 107] На фигуре 107 представлена диаграмма, где показана экспрессия Axl в клеточной линии рака легких человека A549 (A), в клеточной линии рака поджелудочной железы человека PANC–1 (B), в клеточной линии рака поджелудочной железы человека MIA PaCa–2 (C), в клеточной линии человеческой миеломы U266B1 (D) и в клеточной линии лимфомы клеток коры головного мозга Jeko–1 (E).

[Фигура 108] На каждой из фигур 108A, 108B и 108C представлена диаграмма, где показано, что биспецифические анти–Axl CD3 молекулы AXC–0001 и AXC–0002 обладают цитотоксичностью, направленной против Axl–экспрессирующих клеточных линий в присутствии человеческих МКПК. На каждой из фигур 108D и 108E представлена диаграмма, где показано, что биспецифические анти–Axl CD3 молекулы AXC–0001 и AXC–0002 не обладают цитотоксичностью, направленной против клеточных линий, не экспрессирующих Axl в присутствии человеческих МКПК.

[Фигура 109] На фигуре 109 представлена диаграмма, где показана активность связывания scFv MAG–032 в клетках гибридной клеточной линии человеческих лимфобластов T2, к которым были добавлены пептид MAGEC1 (A) или ДМСО (B).

[Фигура 110] На фигуре 110A представлена диаграмма, где показано, что биспецифические анти–HLA–A2/MAGEC1–CD3 молекулы MGC–0001 и MGC–0002 обладают цитотоксической активностью против клеток T2, к которым был добавлен пептид MAGEC1, в присутствии человеческих МКПК.

На фигуре 110B представлена диаграмма, где показано, что биспецифические анти–HLA–A2/MAGEC1–CD3 молекулы MGC–0001 и MGC–0002 не обладают цитотоксической активностью против клеток T2, к которым был добавлен ДМСО, в присутствии человеческих МКПК.

[Фигура 111] На фигуре 111 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность пептида MAGEC1.

[Фигура 112] На фигуре 112 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность в области CDRH2 варианта CDR. Первая Xaa и вторая Xaa представляют собой произвольно выбранный природный аминокислотный остаток.

[Фигура 113] На фигуре 113 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность в области CDRL2 варианта CDR. Xaa представляет собой произвольно выбранный природный аминокислотный остаток.

[Фигура 114] На фигуре 114 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи варианта CDR C3E–7034. Первая Xaa и вторая Xaa представляют собой произвольно выбранный природный аминокислотный остаток.

[Фигура 115] На фигуре 115 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность в вариабельной области легкой цепи варианта CDR C3E–7034. Xaa представляет собой произвольно выбранный природный аминокислотный остаток.

[Фигура 116] На фигуре 116 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность в вариабельной области легкой цепи варианта CDR C3E–7035. Xaa представляет собой произвольно выбранный природный аминокислотный остаток.

[Фигура 117] На фигуре 117 представлена диаграмма, где показана аминокислотная последовательность в вариабельной области легкой цепи варианта CDR C3E–7036. Xaa представляет собой произвольно выбранный природный аминокислотный остаток.

Варианты осуществления изобретения

[0012] 1. Определения

В настоящем изобретении, термин «ген» означает нуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислоты белка, или ее комплементарную цепь. Термин «ген» содержит, например, полинуклеотид, олигонуклеотид, ДНК, мРНК, кДНК и кРНК как нуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислоты белка, или ее комплементарную цепь. Такой ген является одноцепочечным, двухцепочечным, трехцепочечным или другим многоцепочечным нуклеотидом. Термин «ген» также содержит комплекс цепей ДНК и РНК, смесь рибонуклеотидов (РНК) и дезоксирибонуклеотидов (ДНК) на одной нуклеотидной цепи, и двухцепочечный, трехцепочечный или другой многоцепочечный нуклеотид, содержащий такую нуклеотидную цепь. В настоящем изобретении, термины «последовательность оснований» и «нуклеотидная последовательность» являются синонимами.

[0013] В настоящем изобретении, термин «полинуклеотид» является синонимом термина «нуклеиновая кислота» и «молекула нуклеиновой кислоты» и также содержит, например, любые РНК, ДНК, зонд, олигонуклеотид и праймер. Такой полинуклеотид является одноцепочечным, двухцепочечным, трехцепочечным или другим многоцепочечным полинуклеотидом. Термин «полинуклеотид» также содержит комплекс цепей ДНК и РНК, смесь рибонуклеотидов (РНК) и дезоксирибонуклеотидов (ДНК) на одной полинуклеотидной цепи, и комплекс двух цепей или трех или более цепей, включающих такую полинуклеотидную цепь.

[0014] В настоящем изобретении, термины «полипептид», «пептид» и «белок» являются синонимами.

[0015] В настоящем изобретении, термин «антиген» иногда используется как «иммуноген».

[0016] В настоящем изобретении, термин «клетка» также содержит, например, любую клетку, происходящую от отдельных животных, субкультивированные клетки, первичные культивированные клетки, клеточные линии, рекомбинантные клетки и микробные клетки.

[0017] В настоящем изобретении, термин «антитело» является синонимом термина «иммуноглобулин». Однако, термин «антитело», если он используется для описания анти–CD3 антитела согласно изобретению, означает иммуноглобулин, имеющий константные и вариабельные области. Антитело не имеет конкретных ограничений и может представлять собой природный иммуноглобулин или иммуноглобулин, полученный путем частичного или полного синтеза. Анти–CD3 антитело согласно изобретению входит в понятие «молекула», описанное ниже.

[0018] Основная структура четвертичного антитела состоит из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью. Две тяжелых цепи связаны друг с другом одной или более дисульфидными связями, в зависимости от изотипов тяжелых цепей. Каждая легкая и тяжелая цепь имеют регулярно перемежающиеся внутрицепьевые дисульфидные связи. Каждая тяжелая и легкая цепь содержит константную область, которая имеет очень высокую степень сходства аминокислотных последовательностей, и вариабельную область, которая имеет низкую степень сходства аминокислотных последовательностей. Легкая цепь имеет вариабельную область (VL) у амино–конца, за которой расположена константная область (CL). Тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH) у амино–конца, за которой расположены три константных области (CH1, CH2 и CH3). VL и VH являются спаренными, а CL находится на одной цепи с первой константной областью (CH1) тяжелой цепи. VL и VH являются спаренными и образуют один антигенсвязывающий сайт.

Константные области антитела согласно изобретению не имеют конкретных ограничений. Предпочтительно, константные области, происходящие от человеческого антитела, используются в антителе согласно изобретению для лечения или профилактики заболеваний у человека. Примерами константных областей тяжелой цепи в человеческом антителе являются Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cµ, Cδ, Cα1, Cα2 и Cε. Примерами константных областей легкой цепи в человеческом антителе являются Cκ и Cλ.

[0019] Fab состоит из тяжелой цепи CH1, за которой следует VH, и легкой цепи CL, за которой следует VL. Каждая VH и VL содержит гипервариабельные области (CDR).

[0020] Fc состоит из карбокси–концевых областей константных областей тяжелой цепи и представляет собой димер, содержащий CH2 и CH3. Fc согласно изобретению может представлять собой Fc, имеющий природную последовательность, или он может представлять собой мутированную форму Fc, содержащую мутацию в природной последовательности.

[0021] Вариабельная область состоит из областей, называемых гипервариабельными областями (HVR), имеющими очень высокую степень вариабельности, и из относительно невариабельных областей, называемых каркасными областями (FR), прерываемыми гипервариабельными областями. Каждая природная вариабельная область тяжелой и легкой цепи содержит четыре FR, соединенных тремя гипервариабельными областями. Гипервариабельные области каждой цепи находятся в непосредственной близости с гипервариабельными областями другой цепи благодаря FR и участвуют в образовании антигенсвязывающего сайта в антителе.

[0022] Известно, что каждая тяжелая и легкая цепь молекулы антитела имеет три комплементарность–определяющих области (CDR). Комплементарность–определяющие области также называются гипервариабельными областями. Эти области расположены в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей антитела. Эти области имеют особенно высоковариабельную первичную структуру и обычно разделены в трех положениях в соответствующих первичных структурах полипептидых цепей в тяжелой и легкой цепи. В настоящем изобретении, гипервариабельные области антитела обозначаются CDRH1, CDRH2 и CDRH3, начиная с амино–конца аминокислотной последовательности тяжелой цепи для гипервариабельных областей тяжелой цепи, и CDRL1, CDRL2 и CDRL3, начиная с амино–конца аминокислотной последовательности легкой цепи для гипервариабельных областей легкой цепи. Эти области расположены близко друг к другу в трехмерной структуре и определяют специфичность связывания с антигеном.

[0023] В настоящем изобретении, положения и длины CDR были определены в соответствии с определениями по IMGT (Developmental and Comparative Immunology 27 (2003) 55–77).

[0024] Каркасные области (FR) представляют собой вариабельные области, за исключением остатков CDR. Каждая вариабельная область обычно имеет четыре FR, а именно, FR1, FR2, FR3 и FR4.

[0025] Положения CDR и FR могут быть также определены в соответствии с другими определениями, хорошо известными специалистам, например, в соответствии с определениями по IMGT, а также по Кэбату, Чотия, AbM и по их контактированию.

[0026] В настоящем изобретении, термин «антигенсвязывающий фрагмент антитела» означает неполный фрагмент антитела, который имеет вариабельные области тяжелой и легкой цепи и обладает активностью связывания с антигеном. Примерами «антигенсвязывающих фрагментов антитела» являются, но не ограничиваются ими, антигенсвязывающие фрагменты, такие как Fab, F(ab')₂, scFv, Fab', Fv и однодоменное антитело (sdAb). Такой антигенсвязывающий фрагмент антитела может быть получен бутем обработки полноразмерной молекулы белка антитела ферментом, таким как папаин или пепсин, либо он может представлять собой рекомбинантный белок, продуцируемый в соответствующей клетке–хозяине с использованием рекомбинантного гена.

[0027] В настоящем изобретении, термин «сайт», с которым связывается антитело, то есть, «сайт», распознаваемый антителом, означает неполный пептид или неполную структуру высшего порядка на антигене, которая связывается с антителом или распознается антителом.

[0028] В настоящем изобретении, такой сайт также называется эпитопом или антигенсвязывающим сайтом.

В настоящем изобретении, термин «антитело–мутант» означает полипептид, который имеет аминокислотную последовательность, происходящую от аминокислотной последовательности исходного антитела благодаря замене, делеции и/или добавлению (термин «добавление» содержит инсерцию)(далее этот термин будет называться общим термином «мутация») аминокислоты (аминокислот), и который связывается с CD3 согласно изобретению. Число мутированных аминокислот в таком антителе–мутанте составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40 или 50. Такое антитело–мутант может представлять собой «антитело» согласно изобретению.

[0029] В настоящем изобретении, термин «более» в выражении «1 или более» означает число от 2 до 10.

[0030] В настоящем описании, термин «молекула» означает молекулу, содержащую вышеупомянутое антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, а также содержит мультиспецифические молекулы, образованные антителами или множеством антигенсвязывающих фрагментов, происходящих от этих антител.

[0031] В настоящем изобретении, термин «молекула, которая являются мультиспецифической» является синонимом термина «мультиспецифическая молекула». Такая мультиспецифическая молекула не имеет конкретных ограничений при условии, что она будет связываться со множеством эпитопов, отличающихся друг от друга, на одной молекуле, и/или с эпитопами, отличающимися друг от друга, на двух или более молекулах. Молекула, которая является мультиспецифической, также содержит антитело, содержащее вариабельные области тяжелой цепи (VH) и вариабельные области легкой цепи (VL). Примерами таких мультиспецифических молекул являются, но не ограничиваются ими, полноразмерная молекула антитела, имеющая тяжелые цепи двух или более типов, и легкие цепи двух или более типов, то есть, мультиспецифическая молекула типа IgG, и молекула, состоящая из антигенсвязывающих фрагментов двух или более типов, имеющих VL и VH, то есть, молекула, образованная комбинацией Fab, Fab', Fv, scFv, sdAb и тому подобное (то есть, тандемным scFv, диантителами, одноцепочечными диантителами и триантителами). Кроме того, термин «мультиспецифическая молекула» также содержит молекулу, образованную посредством генетического или химического присоединения белка, обладающего антигенсвязывающей активностью, без иммуноглобулинового каркаса, к антигенсвязывающему фрагменту.

[0032] Примерами активностей или свойств, которыми обладают анти–CD3 антитело согласно изобретению, антигенсвязывающий фрагмент антитела согласно изобретению или мультиспецифическая молекула согласно изобретению, могут быть биологические активности или физико–химические свойства, а в частности, такие свойства могут включать различные биологические активности, активность связывания с антигеном или эпитопом, стабильность во время продуцирования или хранения и термостабильность.

[0033] В настоящем изобретении, термин «гибридизация в жестких условиях» означает гибридизацию в условиях, включающих гибридизацию при 65°C в растворе, содержащем 5×SSC, с последующей промывкой при 65°C в течение 20 минут в водном растворе, содержащем 2×SSC–0,1% ДСН; при 65°C в течение 20 минут в водном растворе, содержащем 0,5×SSC–0,1% ДСН; и при 65°C в течение 20 минут в водном растворе, содержащем 0,2×SSC–0,1% ДСН, или гибридизацию в эквивалентных условиях. SSC означает водный раствор 150 мМ NaCl–15 мМ цитрата натрия, а n×SSC означает SSC в n–кратной концентрации.

[0034] В настоящем изобретении, термин «цитотоксичность» означает некоторые патологические изменения, происходящие в клетках, и относится не только к непосредственному повреждению, но и к любому другому структурному или функциональному повреждению клеток, включая расщепление ДНК, образование основных димеров, хромосомные разрывы, повреждение митотического аппарата и снижение активности различных ферментов.

В настоящем изобретении, термин «цитотоксическая активность» означает активность, вызывающую цитотоксичность, упомянутую выше.

[0035] В настоящем изобретении, термин «антитело–зависимая клеточная цитотоксическая (ADCC) активность» означает эффект или активность, направленные на повреждение клеток–мишеней, таких как опухолевые клетки NK–клетками под действием антител.

[0036] В настоящем изобретении, термин «цитотоксическая активность при перенацеливании T–клеток» означает цитотоксичность, вызываемую мультиспецифической молекулой, содержащей антитело против опухолевого антигена и анти–CD3 антитело. В частности, этот термин означает, что антитело против опухолевого антигена связывается с опухолевой клеткой–мишенью, а анти–CD3 антитело связывается с T–клеткой, в результате чего опухолевая клетка–мишень и T–клетка локализуются еще ближе друг к другу, что индуцирует цитотоксичность, опосредуемую активацией T–клеток. Эта молекула может присутствовать в фармацевтической композиции.

2. Антигенный белок CD3 (комплекс CD3)

В настоящем изобретении, термин «CD3» является синонимом термина «белок CD3».

[0037] CD3 экспрессируется как часть мультимолекулярного комплекса T–клеточного рецептора на T–клетках и представляет собой комплекс из полипептидных цепей 5 типов (γ, δ, ε, ζ и ƞ) (с молекулярными массами 25000–28000, 21000, 20000, 16000 и 22000, соответственно).

[0038] CD3, используемый в настоящем изобретении, может быть получен путем очистки или выделения из тканей животных (включая физиологические жидкости), из клеток, происходящих из этих тканей, или клеточных культур, а также путем рекомбинации генов, трансляции in vitro, химического синтеза и тому подобное.

[0039] Нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая человеческий CD3ε, имеется в GenBank под регистрационным No. NM_000733.3. Нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующая CD3 яванских макак, имеется в GenBank под регистрационным No. NM_001283615.1. Аминокислотная последовательность человеческого CD3ε описана в SEQ ID NO:1 списка последовательностей.

[0040] кДНК CD3ε может быть получена, например, так называемым ПЦР–методом, где полимеразную цепную реакцию (далее обозначаемую «ПЦР») (Saiki, R.K., et al., Science (1988) 239, 487–489) осуществляют с использованием библиотеки кДНК, выделенной из органов, экспрессирующих мРНК CD3ε, в качестве матрицы и с использованием праймеров, способных специфически амплифицировать кДНК CD3ε.

[0041] Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, который состоит из аминокислотной последовательности, полученной из аминокислот CD3 посредством замены, делеции или добавления 1 или более аминокислот, и обладает биологической активностью, эквивалентной СD3, также включена в нуклеотидную последовательность гена CD3. Белок, который состоит из аминокислотной последовательности, полученной из аминокислотной последовательности CD3 посредством замены, делеции или добавления 1 или более аминокислот, и обладает биологической активностью, эквивалентной СD3, также включен в CD3.

[0042] Полинуклеотид, гибридизующийся в жестких условиях с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческий CD3ε или CD3ε яванских макак, и кодирующей белок, обладающий биологической активностью, эквивалентной CD3ε, также включен в кДНК CD3ε. Кроме того, варианты сплайсинга, транскрибируемые из локуса гена человеческого CD3ε или CD3ε яванских макак, или полинуклеотид, гибридизующиеся с ними в жестких условиях и кодирующие белок, обладающий биологической активностью, эквивалентной CD3ε, также включен в кДНК CD3ε.

[0043] 3. Анти–CD3 антитело

(3–1) Классификация антител

Анти–CD3 антитело согласно изобретению и антигенсвязывающий фрагмент антитела (далее также называемый антителом и тому подобное согласно изобретению) может представлять собой моноклональное или поликлональное антитело. Примерами моноклональных антител согласно изобретению являются антитела, происходящие от животных, не являющихся человеком (антитела животных, не являющихся человеком), человеческие антитела, химерные антитела и гуманизованные антитела.

[0044] Примерами антител животных, не являющихся человеком, являются антитела, происходящие от позвоночных, таких как млекопитающие и птицы. Примерами антител, происходящих от млекопитающих, являются антитела грызунов, такие как мышиные антитела и крысиные антитела. Примерами антител, происходящих от птиц, являются куриные антитела. Примером крысиного моноклонального антитела против человеческого CD3 является C3–147 [Пример 1)–7] согласно изобретению.

[0045] Примерами химерных антител являются, но не ограничиваются ими, антитела, содержащие вариабельные области, происходящие от антитела животного, не являющегося человеком, и связанные с константными областями человеческого антитела (человеческого иммуноглобулина).

[0046] Примерами гуманизованных антител могут быть, но не ограничиваются ими, человеческие антитела (вариабельные области человеческого иммуноглобулина), присоединенные к CDR в вариабельных областях антител животных, не являющихся человеком; человеческое антитело, присоединенное к CDR, а также к неполным последовательностям каркасных областей в антителах животного, не являющегося человеком; и антитела, имеющие аминокислоты человеческого антитела, замененные одной или более аминокислотами, происходящими от антитела животного, не являющегося человеком, в любых из этих гуманизованных антител. Примерами CDR в вариабельных областях антител животных, не являющихся человеком, являются CDRH1–CDRH3 в вариабельной области тяжелой цепи и CDRL1–CDRL3 в вариабельной области легкой цепи, происходящие от крысиного анти–CD3 антитела C3E–7000 согласно изобретению, и CDR, полученные от аминокислотных последовательностей этих CDR посредством замены 1 или 2 аминокислот другими аминокислотами.

[0047] Человеческое антитело не имеет конкретных ограничения, при условии, что такое антитело будет, предпочтительно, связываться с человеческим CD3, а более предпочтительно, с человеческим CD3 и с CD3 яванских макак. Примерами также являются человеческие антитела, связывающиеся с таким же сайтом, как и в гуманизованных антителах согласно изобретению. Примерами являются человеческие антитела, связывающиеся с таким же сайтом, как и C3E–7034.

[0048] Предпочтительно, антитело и тому подобное согласно изобретению связываются с человеческим CD3. Более предпочтительно, антитело и тому подобное согласно изобретению также обладают активностью связывания с CD3 яванских макак.

[0049] Антитело и тому подобное согласно изобретению могут состоять из частей, происходящих от множества различных антител, при условии, что такое антитело будет связываться с человеческим CD3, а также с CD3 яванских макак. Примерами этих антител являются антитела, содержащие тяжелые и/или легкие цепи, имеющие изменения по сравнению с множеством других антител; антитела, содержащие полноразмерные тяжелые и/или легкие цепи, отличающиеся между собой; антитела, содержащие вариабельные или константные области, отличающиеся между собой; и антитела, содержащие все или некоторые CDR, отличающиеся между собой. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей химерного антитела могут происходить от различных антител согласно изобретению. CDRH1 – CDRH3 и CDRL1 – CDRL3 вариабельных областей тяжелой и легкой цепи гуманизованного антитела могут происходить от двух или более различных антител согласно изобретению. CDRH1–CDRH3 и CDRL1–CDRL3 в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей человеческого антитела могут представлять собой комбинацию CDR, образованную двумя или более различными антителами согласно изобретению.

[0050] Примерами изотипа моноклонального антитела согласно изобретению могут быть, но не ограничиваются ими, IgG, такие как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, IgM; IgA, такие как IgA1 и IgA2, IgD и IgE.

[0051] Изотип и подкласс моноклонального антитела могут быть определены, например, с помощью теста Охтерлони, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или радиоиммуноанализа (РИА). Для идентификации может быть использован коммерчески доступный набор (например, набор для ELISA в целях определения изотипа крысиного иммуноглобулина (BD Pharmingen)).

[0052] (3–2) Специфичность связывания анти–CD3 антитела

Антитело и тому подобное согласно изобретению распознают CD3. Другими словами, антитело и тому подобное согласно изобретению связываются с CD3. Антитело и тому подобное согласно изобретению предпочтительно, связываются с человеческим CD3 и с обезьяньим CD3, а более предпочтительно, с человеческим CD3 и с CD3 яванских макак.

[0053] Более конкретно, антитело согласно изобретению и его антигенсвязывающий фрагмент и их вариабельные области связываются с Ig–подобным доменом, присутствующим во внеклеточной области цепи ε (фигура 1, SEQ ID NO:1) комплекса человеческого CD3. Кроме того, они также связываются с Ig–подобным доменом, присутствующим во внеклеточной области цепи ε комплекса CD3 яванских макак.

[0054 Эпитопы, присутствующие во внеклеточной области цепи ε (фигура 1, SEQ ID NO:1) комплекса человеческого CD3, связанного с антителом и тому подобное согласно изобретению, содержат следующие аминокислоты: Ser55, Glu56, Leu58, Trp59, Asn65, Ile66, Ser77, Asp78, Arg101, Gly102, Ser103, Lys104 и Pro105.

[0055] Предпочтительно, антитело и тому подобное согласно изобретению могут сохранять способность связываться с человеческим CD3 посредством связывания с областью эпитопа, содержащей по меньшей мере 7 аминокислот, выбранных из этих 13 аминокислот.

[0056] Если антитело находится на расстоянии 4 ангстрема от этих аминокислот, то такое антитело, как было подтверждено, может иметь такую же специфичность к эпитопу, как и антитело и тому подобное согласно изобретению. С другой стороны, аминокислоты эпитопа Arg101, Gly102, Ser103, Lys104 и Pro105 представляют собой остатки данного эпитопа, которые взаимодействуют с анти–CD3 антителом OKT3 или UCHT1, известными специалистам (Lars Kjer–Nielsen et al., PNAS (2004); и Kelly L Arnett et al., PNAS (2004)). Однако, OKT3 или UCHT1 связываются с человеческим CD3, но не связываются с CD3 яванских макак.

[0057] В настоящем изобретении, термины «разпознавание», то есть, «связывание» означает связывание, которое представляет собой адсорбцию, которая не являются неспецифической. Примерами критериев для определения наличия или отсутствия разпознавания, то есть, наличия или отсутствия связывания, могут быть константа диссоциации (далее обозначаемая «K_D»). Предпочтительно, антитело и тому подобное согласно изобретению имеют величину K_D 1×10^–5 M или менее, 5×10^–6 M или менее, 2×10^–6 M или менее, или 1×10^–6 M или менее для CD3.

[0058] В настоящем изобретении, связывание антитела с антигеном может быть оценено или определено с использованием системы анализов биомолекулярного взаимодействия (например, ППР или BLI), ELISA или РИА. Связывание антитела с антигеном, экспрессируемым на клеточной поверхности, может быть проанализировано с помощью проточной цитометрии.

[0059] Метод ППР (анализа с помощью поверхностного плазмонного резонанаса) используется в качестве аналитического подхода для определения константы диссоциации (величины KD) и тому подобное в качестве индекса аффинности путем измерения константы скорости ассоциации (величины ka) и константы скорости диссоциации (величины kd) с помощью кинетического анализа. Примерами оборудования, используемого в анализе ППР, являются BIAcore(TM)(изготавливаемое GE Healthcare), ProteOn(TM) (изготавливаемое Bio–Rad Laboratories,), ППР–Navi(TM) (изготавливаемое BioNavis), Spreeta(TM) (изготавливаемое Texas Instruments Inc.), SPRi–Plex II(TM) (изготавливаемое Horiba, Ltd.) и Autolab ППР(TM) (изготавливаемое Metrohm).

[0060] BLI (биослойная интерферометрия) представляет собой метод измерения биомолекулярных взаимодействий с использованием интерференции биослоев. Примерами оборудования, используемого в анализе взаимодействия BLI, является система Octet (изготавливаемая Pall ForteBio Corp.).

[0061 ELISA представляет собой метод, который содержит захват представляющего интерес антитела или антигена, содержащегося в растворе образца, посредством специфического антитела или антигена, а также детектирование и количественную оценку представляющего интерес антитела или антигена посредством ферментативной реакции. Меченные ферментом антиген или антитело вводят в реакционную систему и детектируют ферментативную активность. Для детектирования ферментативной активности используют субстрат, спектр поглощения которого изменяется под действием такой реакции, а затем, этот спектр поглощения оцифровывают путем измерения оптической плотности.

[0062] Клеточный ELISA представляет собой метод на клеточной основе, который содержит захват аналита на клеточной поверхности, а затем детектирование и количественную оценку аналита посредством ферментативной реакции.

[0063] РИА (радиоиммуноанализ) позволяет количественно оценивать антитело посредством мечения антитела радиоактивным веществом и измерять уровень радиоактивности антитела.

[0064] Проточная цитометрия представляет собой метод, применяемый для оптического анализа отдельных клеток посредством диспергирования тонкодисперсных клеток в жидкости и распределения жидкости по небольшим потокам. Антитело, меченное флуоресцентным красителем, связывается с клеточной поверхностью антигена посредством реакции «антиген–антитело», после чего число клеток, связанных с антителом, измеряют по интенсивности флуоресценции, которая являются показателем антигенсвязывающей активности антитела.

Как упоминалось выше, антитело и тому подобное, связывающиеся с человеческим CD3 и с CD3 яванских макак, могут быть подвергнуты различным анализам на эффективность или безопастность у приматов, а в частности, яванских макак, которые являются особенно подходящими для неклинической разработки (преклинической разработки) фармацевтических продуктов, и таким образом, являются предпочтительными. Кроме того, антитело и тому подобное, связывающиеся с человеческим CD3 и с CD3 яванских макак, обладают цитотоксической активностью и могут быть использованы либо отдельно, либо в качестве молекулы согласно изобретению для лечения или профилактики заболеваний, таких как рак у человека и яванских макак. Фармацевтические композиции описаны ниже.

[0065] Антитело и тому подобное согласно изобретению, связывающиеся с человеческим CD3 и с CD3 яванских макак, не связываются с мышиным CD3. Поэтому, различные анализы или иммуногистохимические тесты, проводимые с использованием мышиных клеток, тканей или особей, трансфецированных человеческим геном CD3 (включая трансгенных животных, животных с нокаутом и животных с нокином) и антител и тому подобное, могут быть осуществлены так, чтобы на эти анализы не влиял CD3 мыши–хозяина. Таким образом, антитело и тому подобное являются предпочтительными для их использования в исследованиях на мышах и в неклинической разработке лекарственных средств, лекарственных средств для животных и диагностических средств, содержащих антитело и тому подобное.

(3–3) Моноклональное антитело

Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам. Такими моноклональными антителами являются, например, моноклональные антитела, происходящие от животных, не являющихся человеком, такие как крысиные, мышиные, кроличьи, куриные и рыбьи антитела, химерные антитела, гуманизованные антитела, человеческие антитела, их антигенсвязывающие фрагменты, мутанты этих антител или их антигенсвязывающих фрагментов и варианты этих антител или их антигенсвязывающих фрагментов.

[0066] Так, например, C3–147, полученный способом, описанным в Примере 1, представляет собой крысиное моноклональное анти–CD3 антитело.

[0067] Нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи C3–147, описана в SEQ ID NO:6 (фигура 14) Списка последовательностей, а ее аминокислотная последовательность описана в SEQ ID NO:7 (фигура 15). Нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи C3–147, описана в SEQ ID NO:8 (фигура 16) Списка последовательностей, а ее аминокислотная последовательность описана в SEQ ID NO:9 (фигура 17).

[0068] Антитело–мутант согласно изобретению предпочтительно, может обладать, например, пониженной чувствительностью к разложению или окислению белка, улучшенными или сохраненными биологическими активностями или функциями, незначительным снижением или ухудшением таких биологических активностей или функций, повышенной способностью к связыванию с антигеном(ами) или улучшенными физикохимическими или функциональными свойствами, сообщаемыми этому антителу. Хорошо известно, что боковая цепь специфической аминокислоты в белке может быть изменена, что приводит к изменению активности или функции белка. Примерами таких изменений являются дезамидирование боковой цепи аспартата и изомеризация боковой цепи аспартата. Антителами–мутантами согласно изобретению являются антитела, в которых одна или более аминокислот были заменены другими аминокислотами для предупреждения таких модификаций.

[0069] Примерами таких антител–мутантов согласно изобретению являются антитела, имеющие аминокислотную последовательность, образованную аминокислотной последовательностью исходного антитела посредством консервативной аминокислотной замены. Консервативной аминокислотной заменой является замена в группе аминокислот с родственными аминокислотными боковыми цепями.

[0070] Предпочтительными группами аминокислот являются: группа кислотных аминокислот, включающая аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; группа основных аминокислот, включающая лизин, аргинин и гистидин; группа неполярных аминокислот, включающая аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин и триптофан; и группа семейства незаряженных полярных аминокислот, включающая глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин и тирозин. Другими предпочтительными группами аминокислот являются: группа алифатических оксикислот, включающая серин и треонин; группа амид–содержащих аминокислот, включающая аспарагин и глутамин; группа алифатических аминокислот, включающая аланин, валин, лейцин и изолейцин; и группа ароматических аминокислот, включающая фенилаланин, триптофан и тирозин. Аминокислотную замену вводят в антитело–мутант, предпочтительно, так, чтобы это не приводило к снижению антиген–связывающей активности исходного антитела.

[0071] Настоящее изобретение также охватывает антитело–мутант, имеющее аминокислотную последовательность, происходящую от аминокислотной последовательности, состоящей из антитела или его антигенсвязывающиего фрагмента по (1), упомянутых выше, например, C3–147, где присутствуют консервативная аминокислотная замена и/или некоторые другие аминокислотные мутации (или введенные мутации); мышиное антитело, крысиное антитело, химерное антитело, гуманизованное антитело или человеческое антитело, состоящее из CDR, имеющих аминокислотную последовательность, где присутствуют консервативная аминокислотная замена и/или некоторые другие аминокислотные мутации (или введенные мутации) в аминокислотной последовательности любых CDRH1–CDRH3 и CDRL1–CDRL3, происходящих от антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по (1), упомянутых выше, например, C3–147; антигенсвязывающий фрагмент любого из этих антител–мутантов и мутированные антитела; и молекула, включающая такое антитело–мутант, мутированные антитела или их антигенсвязывающий фрагмент.

[0072] (3–4) Антигенсвязывающий фрагмент анти–CD3 антитела

В соответствии с одним из своих аспектов, настоящее изобретение относится к антигенсвязывающему фрагменту анти–CD3 антитела согласно изобретению. Антигенсвязывающий фрагмент антитела означает фрагмент, который, из всех функций антитела, сохраняет по меньшей мере антигенсвязывающую активность или его вариант. Примерами функций антитела, по существу, являются антигенсвязывающая активность; активность, регулирующая активность антигена; антитело–зависимая клеточная цитотоксическая активность и комплемент–зависимая цитотоксическая активность. Примерами функций антитела и тому подобное согласно изобретению и мультиспецифической молекулы, содержащей антитело и тому подобное согласно изобретению, являются перенацеливание T–клеток, активация T–клеток и цитотоксическая активность, направленная против раковых клеток посредством активации T–клеток.

[0073] Антигенсвязывающий фрагмент антитела не имеет конкретных ограничений, при условии, что фрагмент антитела будет сохранять, из всех активностей антитела, по меньшей мере антигенсвязывающую активность. Примерами являются, но не ограничиваются ими, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, одноцепочечный Fv (scFv), содержащий Fv тяжелой и легкой цепей, связанные соответствующим линкером, и однодоменное антитело (sdAb). Антигенсвязывающий фрагмент антитела согласно изобретению также содержит молекулу, содержащую антигенсвязывающий фрагмент антитела согласно изобретению, а также другие части, такие как scFv, сохраняющий часть линкера.

[0074] В объем термина антигенсвязывающий фрагмент антитела также входит молекула, образованная белком антитела посредством делеции 1 или более аминокислот у амино–конца и/или карбоксильного конца, и сохраняющая по меньшей мере часть функций этого антитела. Такой вариант антигенсвязывающего фрагмента антитела или вариант (описанный далее) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента также входит в объем термина «антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент».

[0075] В соответствии с одним из аспектов изобретения, антигенсвязывающим фрагментом антитела согласно изобретению scFv. scFv получают путем связывания вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела посредством полипептидного линкера (Pluckthun A., The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg and Moore, ed., Springer Verlag, New York, 269–315 (1994); and Nature Biotechnology (2005), 23, 1126–1136). Кроме того, в качестве биспецифической молекулы может быть использован тандемный scFv, включающий два scFv, связанных полипептидным линкером. Альтернативно, в качестве мультиспецифической молекулы могут быть использованы триантитела и антитела, содержащие три или более scFv.

[0076] Антитело согласно изобретению может представлять собой антитело, которое имеет одну вариабельную область тяжелой цепи и не имеет последовательности легкой цепи. Сообщалось, что такое антитело, называемое однодоменным антителом (sdAb) или наноантителом, сохраняет способность связываться с антигеном (Muyldemans S. et al., Protein Eng., (1994), 7 (9), 1129–35; и Hamers–Casterman C. et al., Nature (1993), 363 (6428), 446–448). Эти антитела также входят в объем термина «антигенсвязывающий фрагмент антитела согласно изобретению».

[0077] Настоящее изобретение также содержит одноцепочечный иммуноглобулин, содержащий полноразмерные последовательности тяжелой и легкой цепей антитела, связанные посредством соответствующего линкера (Lee, H–S, et al., Molecular Immunology (1999) 36, 61–71; and Shirrmann, T. et al., mAbs (2010), 2 (1), 1–4). Такой одноцепочечный иммуноглобулин может быть димеризован для сохранения структуры и активностей, аналогичных структуре и активностям антитела, которое по своей природе является тетрамером.

[0078] (3–5) Молекулы, обладающие антигенсвязывающей активностью

Молекула согласно изобретению содержит анти–CD3 антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент.

[0079] Молекула согласно изобретению может также содержать, например, сигнальную последовательность, метку для очистки, амино–концевой Gly, линкерную часть, связывающую лекарственное средство в ADC, альбумин–связывающий полипептид, полимер, такой как ПЭГ, антитело, не являющееся анти–CD3 антителом, его антигенсвязывающий фрагмент и белок, обладающий антигенсвязывающей активностью, но не имеющий иммуноглобулинового каркаса, которые будут описаны ниже.

[0080] Молекула согласно изобретению связывается с человеческим CD3 и с CD3 яванских макак.

[0081] Молекула согласно изобретению содержит мультиспецифическую молекулу, описанную ниже.

[0082] Молекула согласно изобретению может иметь форму, подходящую для ее введения в клетку, или форму, подходящую для ее представления на клеточной поверхности, такую как CAR–T, и тому подобное.

[0083] (3–6) Мультиспецифические молекулы и биспецифические молекулы

Мультиспецифическая молекула согласно изобретению представляет собой молекулу, имеющую два или более антигенсвязывающих сайтов. В частности, мультиспецифическая молекула согласно изобретению представляет собой молекулу, способную связываться с двумя или более эпитопами, отличающимися друг от друга, на одной молекуле, или с эпитопами, отличающимися друг от друга, на двух или более молекулах, и содержит множество антигенсвязывающих фрагментов, отличающимися друг от друга. Примерами мультиспецифических молекул являются, но не ограничиваются ими, мультиспецифические молекулы типа IgG и мультиспецифические молекулы, имеющие вариабельные области двух или более типов, например, фрагменты антител, такие как тандемный scFv, одноцепочечные диантитела, диантитела, триантитела и фрагменты антител, связанные ковалентной связью или нековалентной связью. Мультиспецифическая молекула может содержать Fc.

[0084] Мультиспецифическая молекула согласно изобретению содержит анти–CD3 антитело согласно изобретению или антигенсвязывающий фрагмент этого антитела. Мультиспецифическая молекула согласно изобретению содержит антитело и тому подобное согласно изобретению и 1 или 2 или более дополнительных антител или антигенсвязывающих фрагментов этих антител. Примерами антигенсвязывающих фрагментов антитела являются Fab, F(ab)’, Fv, scFv и sdAb.

[0085] Мультиспецифическая молекула согласно изобретению специфически связывается с CD3 или может также связываться с мишенью, такой как Fc–рецептор на эффекторных клетках.

[0086] Предпочтительными примерами мультиспецифических молекул согласно изобретению являются биспецифические молекулы. Термин «биспецифический» означает способность связываться с двумя или более эпитопами, отличающимися друг от друга, на одной молекуле, или с эпитопами, отличающимися друг от друга, на двух молекулах. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, обладающие такой биспецифичностью, входят в объем настоящего изобретения. Биспецифическая молекула согласно изобретению связывается с CD3 и с эпитопом, который отсутствует в CD3, но присутствует в другом антигене. Более конкретно, такая биспецифическая молекула (i) связывается с эпитопом на CD3 (эпитопом 1) и (ii) связывается с эпитопом, отличающимся от эпитопа 1 на CD3 (эпитопом 2), или связывается с эпитопом на антигене, не являющимся CD3 (эпитопом 3).

[0087 Так, например, в биспецифической молекуле типа тандемного scFv, типированной BiTE, антигенсвязывающий сайт в вариабельной области тяжелой цепи первого антитела и антигенсвязывающий сайт в вариабельной области легкой цепи первого антитела связаны либо посредством линкера, либо непосредственно без линкера, с образованием первого полипептида. Кроме того, антигенсвязывающий сайт в вариабельной области тяжелой цепи второго антитела и антигенсвязывающий сайт в вариабельной области легкой цепи второго антитела связаны либо посредством линкера, либо непосредственно без линкера, с образованием второго полипептида. Первый полипептид и второй полипептид связаны либо посредством линкера, либо непосредственно без линкера. Альтернативно, первый полипептид и второй полипептид могут быть связаны посредством дополнительной молекулы.

[0088] В биспецифической молекуле типа диантитела, антигенсвязывающий сайт в вариабельной области тяжелой цепи первого антитела и антигенсвязывающий сайт в вариабельной области легкой цепи второго антитела связаны либо посредством линкера, либо непосредственно без линкера. Кроме того, антигенсвязывающий сайт в вариабельной области легкой цепи первого антитела и антигенсвязывающий сайт в вариабельной области тяжелой цепи второго антитела связаны либо посредством линкера, либо непосредственно без линкера. Кроме того, биспецифическая молекула может быть получена путем дополнительной димеризации биспецифических молекул типа диантитела. Кроме того, биспецифическая молекула типа диантитела может быть связана с одной единственной цепью или с обеими цепями Fc посредством линкера (биспецифическая молекула типа «диантитело–Fc»).

[0089] В биспецифической молекуле типа двойных scFv, два scFv, связанные с различными эпитопами, связаны с двумя цепями димерного Fc, либо посредством линкеров, либо непосредственно без линкеров. Альтернативно, scFv двух типов, связанные с различными эпитопами, связаны с CH и CL, соответственно, посредством линкеров и дополнительно связаны с двумя цепями димерного Fc, соответственно, посредством линкеров.

В биспецифической молекуле типа IgG, два Fab, связанные с различными эпитопами, связаны с двумя цепями димерного Fc либо посредством линкеров, либо непосредственно без линкеров.

Альтернативно, биспецифическая молекула согласно изобретению может представлять собой биспецифическое антитело, в котором Fab и scFv, связанные с различными эпитопами, связаны с двумя цепями димерного Fc либо посредством линкеров, либо непосредственно без линкеров. Альтернативно, биспецифическая молекула согласно изобретению может представлять собой биспецифическую молекулу, где Fab в первом антителе и scFv во втором антителе связаны с двумя цепями димерного Fc посредством линкеров.

[0090] scFv и Fab, содержащиеся в биспецифической молекуле согласно изобретению, предпочтительно, представляют собой scFv и Fab гуманизованного антитела или человеческого антитела, а Fc, предпочтительно, представляет собой Fc человеческого антитела.

[0091] В вариабельной области, содержащейся в биспецифическом антителе согласно изобретению, вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи могут быть связаны в указанном порядке, или вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи могут быть связаны в указанном порядке, начиная с амино–конца. Биспецифическое антитело согласно изобретению имеет, но необязательно, линкер между обеими вариабельными областями и может (но необязательно) иметь глициновый остаток у амино–конца вариабельной области, который расположен с амино–концевой стороны. Биспецифическое антитело типа тандемного scFv согласно изобретению имеет, но необязательно, линкер, FLAG–метку, и/или HIS–метку у карбоксильного конца вариабельной области, расположенной на карбоксильной концевой стороне. Предпочтительными примерами биспецифических антител согласно изобретению являются биспецифическое антитело, в котором вариабельная область тяжелой цепи, первый линкер, вариабельная область легкой цепи, второй линкер, FLAG–метка и HIS–метка связаны в указанном порядке, начиная с амино–конца.

[0092] Линкер также содержит одноцепочечный полипептид или одноцепочечный олигопептид, или синтетические продукты, такие как ПЭГ, нуклеотиды, сахарные цепи и соединения. Кроме того, может быть использован любой линкер, известный специалистам, без каких–либо конкретных ограничений, при условии, что такой линкер будет связывать два полипептида.

[0093] Линкер, например, пептидный линкер имеет длину от 5 до 30 аминокислот. Если биспецифическая молекула содержит множество линкеров, то все используемые линкеры могут иметь одинаковую длину, либо эти линкеры могут иметь различные длины.

[0094] Примером пептидного линкера является повторяющееся звено (Gly∙Gly∙Gly∙Gly∙Ser). Могут быть добавлены один или более аминокислотных остатков, не являющихся Gly и Ser.

[0095] (3–7) Гуманизованные анти–CD3 антитела

В соответствии с одним из своих аспектов, настоящее изобретение относится к гуманизованному анти–CD3 антителу или его антигенсвязывающему фрагменту.

[0096] Примерами гуманизованных антител согласно изобретению являются человеческие антитела, содержащие только гипервариабельные области (CDR) (Nature (1986) 321, 522–525), и человеческие антитела, присоединенные к последовательностям CDR и к некоторым аминокислотным остаткам каркасных областей посредством связывания с CDR (Публикация Международной заявки No. WO1990/07861A1).

[0097] Предпочтительно, вариабельная область тяжелой цепи, содержащаяся в гуманизованном анти–CD3 антителе согласно изобретению или в его антигенсвязывающем фрагменте, сохраняет CDRH1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:26 (Фигура 24) (GVTFNYYG), и CDRH2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:98 (Фигура 112) (IT Xaa Xaa GGRI) (где первая и вторая Xaa представляет собой любой природный аминокислотный остаток. Далее, первая Xaa также обозначена как X₁, а вторая Xaa также обозначена как X₂), и CDRH3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:28 (Фигура 26) (TLDGRDGWVAY).

[0098] Также предпочтительно, чтобы вариабельная область легкой цепи, содержащаяся в гуманизованном анти–CD3 антителе согласно изобретению или в его антигенсвязывающем фрагменте, сохраняла CDRL1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:29 (Фигура 27) (TGNIGSNY); CDRL2, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:99 (Фигура 113) (R Xaa D) (где Xaa представляет собой любой природный аминокислотный остаток. Далее, Xaa CDRL2 также обозначена как X₃), и CDRL3, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:31 (Фигура 29) (QSYSSGFI).

[0099] В CDRH2 (ITX₁X₂GGRI), упомянутом выше, предпочтительно, X₁ выбран из группы, состоящей из A, E, G, H, I, L, T, V, R и S, а X₂ представляет собой S; или X₁ представляет собой N, а X₂ выбран из группы, состоящей из E, R, F, Y, L, V, I, K и T.

В CDRL2 (RX₃D) упомянутом выше, предпочтительно, X₃ выбран из группы, состоящей из Q, A, G, S, N и D.

[0100] В CDRH2 (ITX₁X₂GGRI), упомянутом выше, более предпочтительно, X₁ выбран из группы, состоящей из R и S, а X₂ представляет собой S.

В CDRL2 (RX₃D), упомянутом выше, более предпочтительно, X₃ выбран из группы, состоящей из Q, A, G, S, N и D.

[0101] Предпочтительными примерами вариабельных областей тяжелой цепи, содержащихся в таких гуманизованных анти–CD3 антителах согласно изобретению или в их антигенсвязывающих фрагментах, являются вариабельная область тяжелой цепи, содержащая аминокислотные остатки, представленные SEQ ID NO:100 (Фигура 114).

[0102] Кроме того, предпочтительными примерами вариабельных областей легкой цепи, содержащихся в гуманизованных анти–CD3 антителах согласно изобретению или в их антигенсвязывающих фрагментах, являются вариабельная область легкой цепи, содержащая аминокислотные остатки, представленные SEQ ID NO:101 (Фигура 115), SEQ ID NO:102 (Фигура 116) или SEQ ID NO:103 (Фигура 117).

[0103] Особенно предпочтительными примерами вариабельных областей тяжелой цепи, содержащихся в гуманизованных анти–CD3 антителах согласно изобретению или в их антигенсвязывающих фрагментах, являются:

вариабельная область тяжелой цепи, которая сохраняет:

CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:26 (Фигура 24) (GVTFNYYG),

CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:27 (Фигура 25) (ITNSGGRI), и

CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:28 (Фигура 26) (TLDGRDGWVAY).

[0104] Особенно предпочтительными примерами вариабельных областей легкой цепи, содержащихся в гуманизованных анти–CD3 антителах согласно изобретению или в их антигенсвязывающих фрагментах, являются:

вариабельная область легкой цепи, которая сохраняет:

CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:29 (Фигура 27) (TGNIGSNY),

CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:30 (Фигура 28) (RDD), и

CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:31 (Фигура 29) (QSYSSGFI).

[0105] В настоящем изобретении, положения и длины CDR определяют в соответствии с определениями по IMGT (Developmental and Comparative Immunology 27 (2003) 55–77).

[0106] Конкретными примерами вариабельных областей тяжелой цепи согласно изобретению является аминокислотная последовательность, содержащая аминокислотные остатки SEQ ID NO:16.

[0107] Конкретными примерами вариабельных областей легкой цепи согласно изобретению является аминокислотная последовательность, содержащая аминокислотные остатки SEQ ID NO:17, 20 или 23.

[0108] Особенно предпочтительными примерами гуманизованных анти–CD3 антител согласно изобретению или антигенсвязывающих фрагментов этих антител являются антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:60 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотные остатки 135–241 SEQ ID NO:60,

антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:64 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотные остатки 135–241 SEQ ID NO:64,

антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:66 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотные остатки 135–243 SEQ ID NO:66; антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:68 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотные остатки 135–241 SEQ ID NO:68; антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:70 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотные остатки 135–243 SEQ ID NO:70; антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:72 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотные остатки 135–243 SEQ ID NO:72; антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:74 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотные остатки 135–243 SEQ ID NO:74; антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:76 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотные остатки 135–243 SEQ ID NO:76; антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:78 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотные остатки 135–243 SEQ ID NO:78; антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:80 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотные остатки 135–243 SEQ ID NO:80; антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:82 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотные остатки 135–243 SEQ ID NO:82, или антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотные остатки 2–119 SEQ ID NO:44 и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотные остатки 135–243 SEQ ID NO:84.

[0109] Конкретными примерами гуманизованных анти–CD3 антител или антигенсвязывающих фрагментов этих антител согласно изобретению являются антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16, линкер и вариабельную область легкой цепи, включающую любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:17, 20 и 23.

[0110] В вариабельных областях, содержащихся в антителах или в антигенсвязывающих фрагментах антител согласно изобретению, вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепей могут быть связаны в указанном порядке, или вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи могут быть связаны в указанном порядке, начиная с амино–конца. Вариабельные области могут содержать глициновый остаток у амино–концов. Линкер, FLAG–метка и/или HIS–метка могут быть связаны у карбоксильных концов вариабельных областей.

[0111] Конкретными предпочтительными примерами гуманизованных анти–CD3 антител согласно изобретению или их антигенсвязывающих фрагментов являются антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:19,

антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее аминокислотные остатки 2–243 SEQ ID NO:22, и

антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащее аминокислотные остатки 2–241 SEQ ID NO:25.

[0112] Более конкретными предпочтительноыми примерами гуманизованных анти–CD3 антител согласно изобретению или их антигенсвязывающих фрагментов являются антитело (клон ID: C3E–7078) или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие аминокислотные остатки 1–243 SEQ ID NO:60 (Фигура 68); антитело (клон ID: C3E–7085) или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие аминокислотные остатки 1–241 SEQ ID NO:64 (Фигура 72); антитело (клон ID: C3E–7086) или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие аминокислотные остатки 1–243 SEQ ID NO:66 (Фигура 74); антитело (клон ID: C3E–7087) или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие аминокислотные остатки 1–243 SEQ ID NO:68 (Фигура 76); антитело (клон ID: C3E–7088) или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие аминокислотные остатки 1–243 SEQ ID NO:70 (Фигура 78); антитело (клон ID: C3E–7089) или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие аминокислотные остатки 1–243 SEQ ID NO:72 (Фигура 80); антитело (клон ID: C3E–7090) или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие аминокислотные остатки 1–243 SEQ ID NO:74 Фигура 82); антитело (клон ID: C3E–7091) или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие аминокислотные остатки 1–243 SEQ ID NO:76 (Фигура 84); антитело (клон ID: C3E–7092) или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие аминокислотные остатки 1–243 SEQ ID NO:78 (Фигура 86); антитело (клон ID: C3E–7093) или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие аминокислотные остатки 1–243 SEQ ID NO:80 (Фигура 88); антитело (клон ID: C3E–7094) или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие аминокислотные остатки 1–243 SEQ ID NO:82 (Фигура 90), и антитело (клон ID: C3E–7095) или антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащие аминокислотные остатки 1–243 SEQ ID NO:84 (Фигура 92).

[0113] Конкретными предпочтительными примерами гуманизованных анти–CD3 антител согласно изобретению или антигенсвязывающих фрагментов этих антител, где вариабельная область тяжелой цепи, линкер и вариабельная область легкой цепи связываются в указанном порядке у амино–конца, и кроме того, второй линкер, FLAG–метка и HIS–метка связываются у карбоксильного конца вариабельной области легкой цепи, являются антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, описанных в вышеупомянутом (16) и включающих: