Комплекс агониста толл-подобного рецептора 7 или 8 и холестерина и его применение

Настоящее изобретение относится к комплексному средству агониста толл-подобного рецептора 7 или 8 и холестерина, в котором холестерин связан с аминогруппой (NH₂) активного центра агониста толл-подобного рецептора 7/8, где связь является расщепляемой, и к использованию комплексного средства. Агонист толл-подобного рецептора 7 или 8, содержащий холестерин, химически связанный с ним, не абсорбируется в кровеносных сосудах и, таким образом, позволяет уменьшить неблагоприятные побочные эффекты исходного толл-подобного рецептора 7 или 8. В частности, поскольку комплексное средство создано таким образом, что функция иммунной активации агониста толл-подобного рецептора 7 или 8 ингибируется из-за химической связи с холестерином, а затем функция иммунной активации восстанавливается в микроокружении опухоли или в иммунных клетках-мишенях, комплексное средство демонстрирует динамические характеристики, которые могут модулировать эффективность иммунной активации с течением времени, и позволяет минимизировать индукцию неспецифических иммунных ответов. Кроме того, комплекс агониста толл-подобного рецептора 7 или 8 и холестерина легко приготовить в виде различных составов наночастиц и, таким образом, можно широко использовать в лекарственных композициях для различных целей, таких как активация терапевтических иммунных клеток в микроокружении опухоли, а также контроль иммуносупрессорных клеток и окружения. 9 н. и 4 з.п. ф-лы, 24 ил., 6 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к комплексу агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, и более конкретно, к комплексу, в котором холестерин связан с активным центром агониста толл-подобного рецептора 7/8 посредством химической связи с расщепляемым участком, и к его применению.

Предшествующий уровень техники

Иммунный ответ является серией ответов активированных иммунных клеток против экзогенных и эндогенных субстанций, то есть антигенов, и когда микроорганизмы, такие как бактерии или вирусы, или чужеродные биологические вещества, попадают в организм, они распознаются иммунными клетками, которые затем активируются для секреции такого фактора, как цитокин, тем самым вызывая воспалительный ответ. В последнее время интенсивно проводятся активные исследования механизмов на стадии врожденного иммунного ответа, неспецифически действующих на ранней стадии инфекции. Среди этих механизмов толл-подобный рецептор (TLR), который способен распознавать патоген на ранней стадии воспаления, как известно, распознает компонент клеточной мембраны патогена или нуклеиновокислотный компонент для индукции иммунного ответа, и с использованием TLR активно проводятся исследования различных лигандов толл-подобных рецепторов для активации иммунных клеток.

Среди этих лигандов в качестве адъюванта, индуцирующего клеточный иммунный ответ, используется вещество на основе агониста толл-подобного рецептора 7/8, которое может представлять собой имиквимод, резиквимод, дактолисиб, гардиквимод, суманирол, мотолимод, весатолимод, локсорибин, SM360320, CL264, 3M-003, IMDQ или соединение 54 (US 2012-0294885 A1). Агонист толл-подобного рецептора 7/8 является агонистом толл-подобного рецептора 7/8 в эндосоме и, как известно, эффективно индуцирует не только гуморальный иммунитет, но и клеточный иммунитет. Однако агонист толл-подобного рецептора 7/8 трудно диспергировать в водном растворе из-за его молекулярной структуры. Кроме того, поскольку такой агонист растворяется только в специальном органическом растворителе, таком как ДМСО или метанол, но не растворяется в обычно используемом органическом растворителе, существует ограничение на приготовление различных форм материалов для иммунной активации. Таким образом, агонист коммерчески используется в составе крема (например, крема Aldara®), в котором смешаны различные поверхностно-активные вещества. В некоторых исследованиях для преодоления этой проблемы, будучи приготовленным в форме соли для растворения в водном растворе, агонист толл-подобного рецептора 7/8, приготовленный в форме соли, абсорбируется в кровеносный сосуд в организме, индуцируя системный иммунный ответ в кровеносном сосуде, тем самым вызывая множество побочных эффектов (например, цитокиновый шторм и различные неспецифические иммунные реакции гиперчувствительности). По этой причине описанный выше агонист толл-подобного рецептора 7/8 в солевой форме трудно использовать. Из-за этих побочных эффектов, чтобы действительно использовать его для лечения, указанный агонист необходимо применять в более низкой концентрации, чем эффективная доза, и, таким образом, это может стать причиной снижения эффективности. В некоторых фармацевтических компаниях для преодоления таких проблем также предпринимаются попытки предотвратить прямую абсорбцию указанного агониста в кровеносный сосуд путем введения в агонист липида, обладающего липофильными свойствами, или непосредственного химического связывания агониста с полимерной цепью огромного размера. Однако, поскольку активный центр агониста толл-подобного рецептора 7/8, полученного вышеупомянутым способом, все еще экспонирован во внешнюю среду, он все еще способен проявлять токсичность, вызывая неспецифический иммунный ответ в организме.

Соответственно, если будет получен агонист толл-подобного рецептора 7/8, который не абсорбируется в кровеносный сосуд в организме и может быть приготовлен в различных формах, которые подавляют неспецифический иммунный ответ, ожидается, что он получит широкое применение в качестве различных иммуноактивирующих агентов с низкими побочными эффектами.

Раскрытие сущности изобретения

Техническая задача

Для решения соответствующих технических задач настоящее изобретение направлено на создание комплекса агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, который предназначен для временного ингибирования функции иммунной активации и восстановления иммунной активности в микроокружении опухоли или клетках-мишенях, а также на его применение.

Настоящее изобретение относится к технологии, в которой агонист толл-подобного рецептора 7/8 может быть применен при получении различных фармацевтических препаратов для эффективного использования в реальной клинической практике и для минимизации индукции неспецифического иммунного ответа и цитокинового шторма в организме.

Настоящее изобретение относится к разработке структуры агониста толл-подобного рецептора 7/8 с кинетически контролируемой активностью, который обладает подавленной функцией иммунной активации, а затем восстанавливает активность в микроокружении опухоли и иммунных клетках-мишенях, тем самым демонстрируя эффективность иммунной активации.

Кроме того, настоящее изобретение относится к нанолипосоме, наноэмульсии, наномицелле и полимерной наночастице, которые включают комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина.

Кроме того, настоящее изобретение относится к адъювантной композиции, включающей комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина.

Кроме того, настоящее изобретение относится к вакцинной композиции, которая включает адъювантную композицию, содержащую комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина и антиген.

Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции, активирующей иммунные клетки, которая включает комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина.

Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции, контролирующей функцию иммуносупрессивных клеток, которая включает комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина.

Кроме того, настоящее изобретение относится к иммунотерапевтической композиции для лечения рака, которая включает комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина.

Кроме того, настоящее изобретение относится к противораковой композиции, которая включает комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина; и дополнительно включает противоопухолевый агент и ингибитор иммунной контрольной точки.

Однако технические задачи, которые должны быть решены в настоящем изобретении, не ограничиваются вышеописанными, и другие задачи, которые не раскрыты в настоящей заявке, будут полностью понятны специалистам в данной области техники из следующего описания.

Техническое решение

Настоящее изобретение обеспечивает комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, в котором холестерин связан с активным центром агониста толл-подобного рецептора 7/8.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения связь представляет собой отделяемую структуру, и предпочтительно связь является расщепляемой химической связью, такой как карбаматная, дисульфидная, сложноэфирная, пептидная или азидная, или расщепляемой химической связью на связанном участке в ответ на микроокружение опухоли или фермент из эндосомы и лизосомы и pH в клетках, но связь не ограничивается этим. Кроме того, активный центр агониста толл-подобного рецептора 7/8 обнажается за счет разрыва связи, тем самым кинетически восстанавливая функцию в течение 4 дней.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения агонист толл-подобного рецептора 7/8 предпочтительно представляет собой соединение на основе имидазохинолина, соединение на основе 8-гидроксиаденина, соединение на основе птеридона, соединение на основе 2-аминопиримидина, соединение на основе бензоазепина, соединение на основе 7-тиа-8-оксогуанозина, его производное, или их комбинацию, и более предпочтительно имиквимод, резиквимод, дактолисиб, гардиквимод, суманирол, мотолимод, весатолимод, локсорибин, SM360320, CL264, 3M- 003, IMDQ или Соединение 54. Но любой агонист толл-подобного рецептора 7/8, который может существовать в неактивной форме за счет химического связывания холестерина с активным центром, используется без ограничений.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает композицию наночастиц, которая включает комплекс.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения наночастицы повышают эффективность активации иммунных клеток и предпочтительно представляют собой нанолипосомы, наномицеллы, твердые наночастицы, наноэмульсию или полимерные наночастицы, которые включают комплекс, но настоящее изобретение этим не ограничивается. «Включающий» может означать форму, содержащуюся внутри, независимо от химической связи, форму, прикрепленную к поверхности наночастицы, или форму, находящуюся между структурой наночастиц, но используется любая форма, включая комплекс по настоящему изобретению, без ограничений.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает адъювантную композицию, включающую комплекс.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает вакцинную композицию, которая включает адъювантную композицию и антиген.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения антиген предпочтительно представляет собой белок, рекомбинантный белок, гликопротеин, ген, пептид, полисахарид, липополисахарид, полинуклеотид, клетки, клеточный лизат, бактерии, вирус или общеизвестный антиген, но настоящее изобретение этим не ограничивается.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает композицию для контроля иммунной функции, включающую комплекс в качестве активного ингредиента.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция для контроля иммунной функции может индуцировать активацию иммунных клеток в микроокружении опухоли или контролировать функцию иммуносупрессорных клеток и, предпочтительно, индуцировать иммунную активацию антигенпрезентирующих клеток (дендритных клеток, макрофагов и т.д.), естественных киллерных клеток (NK-клеток) или Т-клеток, или регулировать функцию иммунных клеток, проявляющих иммуносупрессивное действие (регуляторных Т-клеток (Treg), миелоидных супрессорных клеток (MDSC) и макрофагов (M2), тем самым регулируя иммунную функцию в организме.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения рака, которая включает комплекс в качестве активного ингредиента.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция может дополнительно включать материалы, которые обычно используются при лечении рака, и предпочтительно дополнительно включает химиотерапевтический агент и ингибитор иммунной контрольной точки. Поскольку фармацевтическая композиция может включать комплекс по настоящему изобретению для эффективной активации иммунной функции в организме, она может повышать эффективность обычного химиотерапевтического агента или ингибитора иммунной контрольной точки.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция ингибирует пролиферацию, метастазирование и рецидив рака, или устойчивость к противораковой терапии, но поскольку она является частью обычно используемого метода лечения рака, ее можно использовать без ограничений.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения рак предпочтительно представляет собой рак молочной железы, колоректальный рак, рак прямой кишки, рак легких, рак толстой кишки, рак щитовидной железы, рак полости рта, рак глотки, рак гортани, рак шейки матки, опухоль головного мозга, рак яичников, рак мочевого пузыря, рак почки, рак печени, рак поджелудочной железы, рак простаты, рак кожи, рак языка, рак матки, рак желудка, рак костей или гемобластоз, но настоящее изобретение этим не ограничивается.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ профилактики или лечения рака, который включает введение субъекту композиции, содержащей комплекс в качестве активного ингредиента.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает применение композиции, включающей комплекс в качестве активного ингредиента, для предотвращения или лечения рака.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает применение композиции, включающей комплекс в качестве активного ингредиента, для предотвращения или лечения инфекционного заболевания.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает применение комплекса для получения лекарственного средства, используемого для предотвращения или лечения рака.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ получения комплекса агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, который включает химическое связывание холестерина с активным центром агониста толл-подобного рецептора 7/8 с использованием расщепляемого линкера.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ получения может включать смешивание и обеспечение реагирования агониста толл-подобного рецептора 7/8, холестерил-хлорформиата и пиридина в дихлорметане.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения способ получения может включать (а) получение дисульфидного сшивающего агента путем растворения 2-гидроксиэтил-дисульфида в тетрагидрофуране, добавления и растворения его в растворе толуола, а также добавления и растворения N-гидросукцинимида и триэтиламина; (b) получение сшивающего агента дисульфид-холестерина путем смешивания и обеспечения взаимодействия дисульфидного сшивающего агента и холестерина; и (c) смешивание и обеспечения взаимодействие дисульфид-холестеринового сшивающего агента и агониста толл-подобного рецептора 7/8.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения при смешивании на стадии (b) дисульфидный сшивающий агент и холестерин могут быть смешаны в массовом отношении от 3:1 до 1:1, и во время смешивания на стадии (c) сшивающий агент дисульфид-холестерин и агонист толл-подобного рецептора 7/8 могут быть смешаны в массовом отношении от 4:1 до 1:1.

Преимущества изобретения

Агонист толл-подобного рецептора 7/8, с которым холестерин химически связан согласно настоящему изобретению (комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина), не только предотвращает проникновение в кровь агониста из-за повышенной липофильности, но также значительно снижает побочные эффекты и цитотоксичность обычного агониста толл-подобного рецептора 7/8, поскольку его функция иммунной активации ингибируется в среде, отличной от микроокружения опухоли или эндосом в иммунных клетках.

Кроме того, после доставки в микроокружение опухоли и иммунные клетки холестерин и агонист толл-подобного рецептора 7/8 медленно разделяются и последовательно реагируют с толл-подобным рецептором в течение длительного времени посредством кинетической иммуномодуляции активного центра агониста толл-подобного рецептора 7/8, так что он может значительно усилить терапевтический эффект за счет повышения устойчивости иммунной активации иммунных клеток по сравнению с агонистом толл-подобного рецептора, используемым отдельно.

Кроме того, поскольку комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина может индуцировать иммунную активацию антигенпрезентирующих клеток (дендритных клеток, макрофагов и т.д.), естественных киллерных клеток (NK-клеток) или Т-клеток, и регулировать функцию иммунных клеток, проявляющих иммуносупрессивное действие (регуляторных Т-клеток (Treg), супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC) или макрофагов M2) в микроокружении опухоли, он не только проявляет противоопухолевый эффект, но также значительно усиливает противоопухолевый эффект благодаря синергетическому эффекту при совместном применении с ингибитором иммунной контрольной точки или химиотерапевтическим агентом.

Более того, поскольку комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина основан на холестерине, который является основным компонентом биомембраны, его можно легко получить в различных формах, таких как наноэмульсия, нанолипосома и наномицелла в комбинации с различными липидами, и, следовательно, эффективность внутриклеточной доставки может увеличиваться. По этой причине в настоящем изобретении комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина может быть получен в различных формах, и также ожидается, что он значительно повысит терапевтический эффект при различных заболеваниях за счет индукции иммунной активации благодаря включению в различные фармацевтические композиции.

Описание фигур

Фиг. 1 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую структуру и механизм активации/ инактивации комплекса агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина.

Фиг. 2 показывает результат анализа структуры агониста толл-подобного рецептора 7/8, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, с помощью ¹H-ЯМР.

Фиг. 3 демонстрирует результат анализа структуры связанного с холестерином агониста толл-подобного рецептора 7/8, в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, с помощью ¹H-ЯМР.

Фиг. 4 демонстрирует результат анализа структуры агониста толл-подобного рецептора 7/8, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, посредством ¹⁵N-HSQC (гетероядерной спектроскопии с одноквантовым переносом когеренции).

Фиг. 5 демонстрирует результат проверки структуры связанного с холестерином агониста толл-подобного рецептора 7/8, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, посредством ¹⁵N-HSQC.

Фиг. 6 показывает увеличенное изображение результатов анализа структуры связанного с холестерином агониста толл-подобного рецептора 7/8, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, посредством ¹⁵N-HSQC.

Фиг. 7 демонстрирует механизм разделения связанного с холестерином агониста толл-подобного рецептора 7/8, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, на холестерин и агонист толл-подобного рецептора 7/8 под действием физиологической среды в клетках.

Фиг. 8 демонстрирует механизм отделения агониста толл-подобного рецептора 7/8, поперечно сшитого с холестерином дисульфидом, в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, от холестерина под действием физиологической среды в клетках.

Фиг. 9 представляет собой набор схематических диаграмм, иллюстрирующих формы наночастиц, включающих комплекс холестерина и агониста толл-подобного рецептора 7/8.

Фиг. 10 представляет собой график, подтверждающий, что комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, кинетически разделяется с течением времени при постоянном pH.

Фиг. 11 представляет собой график, подтверждающий, что комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, кинетически разделяется с течением времени под действием фермента.

Фиг. 12 представляет собой график, подтверждающий цитотоксичность нанолипосом, включающих комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 13 представляет собой график, подтверждающий зависимость между индикатором активации иммунных клеток (IL-6) и нанолипосомами, включающими комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 14 представляет собой график, подтверждающий зависимость между индикатором активации иммунных клеток (ФНО-альфа) и нанолипосомами, включающими комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 15 показывает разницу в активации иммунных клеток под действием средства Chol-R848, синтезированного для обеспечения расщепления в участке связывания комплекса агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, и под действием средства C18-R848, синтезированного для предотвращения его расщепления.

Фиг. 16 иллюстрирует количество, достигающее лимфатического узла, и время удержания нанолипосом после их введения в организм, причем нанолипосомы включают ресквимод и комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 17 показывает результат подтверждения эффективности активации иммунных клеток и токсичности нанолипосом, включающих комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 18 показывает результат подтверждения эффекта ингибирования роста опухоли и выживаемости нанолипосом, включающих комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 19 показывает результаты, подтверждающие способность к регуляции активности иммунных клеток нанолипосом, включающих комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, на участке опухоли.

Фиг. 20 показывает результаты, подтверждающие способность к регуляции активности иммунных клеток нанолипосомы, включающих комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, в селезенке.

Фиг. 21 показывает результаты, подтверждающие эффект совместного применения нанолипосом, включающих комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, и ингибитора иммунной контрольной точки на животной модели B16-OVA.

Фиг. 22 показывает результаты, подтверждающие эффект совместного применения нанолипосом, включающих комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, и ингибитора иммунной контрольной точки на животной модели 4T1.

Фиг. 23 показывает результаты, подтверждающие эффект совместного применения нанолипосом, включающих комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, и ингибитора иммунной контрольной точки на животной модели TC1.

Фиг. 24 показывает результаты, подтверждающие эффект совместного применения нанолипосом, включающих комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, и химиотерапевтического средства.

Наилучшие варианты осуществления изобретения

В настоящем изобретении в комплексе агониста толл-подобного рецептора 7/8 с холестерином группа холестерина связана с активным центром агониста толл-подобного рецептора 7/8 в расщепляемой форме, и, таким образом, функция иммунной активации временно ингибируется (фиг. 1). Ингибирование может означать, что функция активного центра агониста толл-подобного рецептора 7/8 отсрочена.

В настоящем изобретении комплекс поперечно сшит с участком, в котором расщепление индуцируется под действием микроокружения опухоли и/или внутриклеточной среды, в частности, физиологической среды (низкого pH, фермента, глутатиона и т.д.) эндосомы и лизосомы (фиг. 1). В частности, в микроокружении опухоли может находиться форма связи, которая способна регулироваться таким образом, чтобы расщепление происходило под действием определенного стимула, такого как pH, температура, окислительно-восстановительный потенциал, ультразвук, фермент, магнитное поле или ближний инфракрасный свет. Хотя связь предпочтительно является карбаматной, дисульфидной, сложноэфирной, пептидной или азидной связью, любая связь в расщепляемой форме используется без ограничения.

Кроме того, согласно настоящему изобретению, в комплексе агонист толл-подобного рецептора 7/8 и холестерин могут быть разделены под действием различных ферментов, присутствующих в микроокружении и клетках опухоли, таких как кислая фосфатаза, кислая пирофосфатаза, фосфодиэстераза, фосфопротеин-фосфатаза, фосфатаза фосфатидной кислоты, арилсульфатаза, протеазы, катепсины, коллагеназа, ариламидаза, пептидаза, кислая рибонуклеаза, кислотная дезоксирибонуклеаза, липазы, триглицерид-липаза, фосфолипаза, эстераза, карбоксиэстераза, глюкоцереброзидаза, галактоцереброзидаза, сфингомиелиназа, гликозидазы, альфа-глюкозидаза, бета-глюкозидаза, бета-галактозидаза, альфа-маннозидаза, альфа-фукозидаза, бета-ксилозидаза, альфа-N-ацетилгексозаминидаза, бета-N-ацетилгексозаминидаза, сиалидаза, лизоцим, гиалуронидаза и бета-глюкуронидаза.

В настоящем изобретении, поскольку агонист толл-подобного рецептора 7/8 получают путем химического связывания холестерина таким образом, чтобы он не абсорбировался в кровеносных сосудах в организме, недостатки агониста толл-подобного рецептора 7/8 в форме соли устраняются.

В настоящем изобретении комплекс легко получают в различных формах, таких как нанолипосома, наномицелла и наноэмульсия, путем простого взаимодействия с различными средствами, такими как различные липидные материалы и сапонины, тем самым повышая эффективность доставки в иммунные клетки.

Используемый в настоящей заявке термин «холестерин» представляет собой тип липидов и охватывает органические соединения на основе стероидов, обладающие гидрофобными свойствами, и холестерин может включать различные производные на основе структуры холестерина и соединения, которые могут быть получены путем химического изменения части холестерина. Предпочтительно холестерин включает желчные кислоты (холевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, литохолевую кислоту и хенодезоксихолевую кислоту), витамин D и стероидные гормоны (тестостерон, эстрадиол, кортизол, альдостерон, преднизолон и преднизон), но настоящее изобретение не ограничено ими. Кроме того, холестерин представляет собой соединение, которое помогает агонисту толл-подобного рецептора 7/8 располагаться на поверхности и в различных формах наночастиц, и может быть заменен липидными материалами, имеющими аналогичную функцию, например, натуральными липидами, такими как фосфолипиды и синтетические липиды.

Используемый в настоящей заявке термин «средство на основе агониста толл-подобного рецептора 7/8» может быть выбран из группы, состоящей из агонистов толл-подобного рецептора 7 или 8, таких как соединение на основе имидазохинолина, соединение на основе 8-гидроксиаденина, соединение на основе птеридона, соединение на основе 2-аминопиримидина, соединение на основе бензоазепина и соединение на основе 7-тиа-8-оксогуанозина. При этом соединение на основе имидазохинолина включает соединения, раскрытые в WO 2018 196823, WO 2011 049677, WO 2011 027022, WO 2017 102652 и WO 2019 040491, или их фармацевтически приемлемые соли, но настоящее изобретение этим не ограничивается. Кроме того, соединение на основе 8-гидроксиаденина включает соединения, раскрытые в WO 2012 080730, WO 2013 068438, WO 2019 036023, WO 2019 035969, WO 2019 035970, WO 2019 035971, WO 2019 035968, CN 108948016, US 2014 8846697, WO 2016 023511, WO 2017 133683, WO 2017 133686, WO 2017 133684, WO 2017 133687, WO 2017 076346, WO 2018 210298, WO 2018 095426, WO 2018 068593, WO 2018 078149, WO 2018 041763, или их фармацевтически приемлемые соли, но настоящее изобретение не ограничивается ими. Соединение на основе птеридона включает соединения, раскрытые в US 2010 0143301, WO 2016 007765, WO 2016 044182, WO 2017 035230, WO 2017 219931, WO 2011 057148 и CN 1087 94486, или их фармацевтически приемлемые соли, но настоящее изобретение не ограничивается ими. Соединение на основе 2-аминопиримидина включает соединения, раскрытые в WO 2010 133885, WO 2012066335, WO 2012 066336, WO 2012 067268, WO 2013 172479, WO 2012 136834, WO 2014 053516, WO 2014 053595, US 2018 0215720, WO 2012 156498, WO 2014 076221, WO 2016 141092, WO 2018 045144, WO 2015 014815, WO 2018 233648, WO 2014 207082, WO 2014 056593, WO 2018 002319 и WO 2013 117615, или их фармацевтически приемлемые соли, но настоящее изобретение не ограничивается ими. Соединение на основе бензоазепина включает соединения, раскрытые в WO 2007 024612, WO 2010 014913, WO 2010 054215, WO 2011 022508, WO 2011 022509, WO 2012 097177, WO 2012 097173, WO 2016 096778, WO 2016 142250, WO 2017 202704, WO 2017 202703, WO 2017 216054, WO 2017 046112 и WO 2017 197624 или их фармацевтически приемлемые соли, но настоящее изобретение не ограничивается ими. Соединение на основе 7-тиа-8-оксогуанозина включает соединения, раскрытые в WO 2016 180691, WO 2016 055553, WO 2016 180743 и WO 2016 091698, или их фармацевтически приемлемые соли, но настоящее изобретение не ограничивается ими. Кроме того, могут быть включены соединения толл-подобного рецептора 7/8, раскрытые в PCT/US2009/035563, PCT/US2015/028264, PCT/US2016/020499, WO 2015 023598 и PCT/US 2015/039776, или их фармацевтически приемлемые соли, но настоящее изобретение не ограничивается ими. Включены все доступные агонисты толл-подобных рецепторов 7/8, которые могут быть легко предположены специалистами в данной области техники.

Используемый в настоящей заявке термин «агонист толл-подобного рецептора 7/8» может применяться к «агонисту толл-подобного рецептора 3» или «агонисту толл-подобного рецептора 9», который имеет рецептор в эндосоме и доставляется в клетки таким же способом, и поэтому «агонист толл-подобного рецептора 3» или «агонист толл-подобного рецептора 9» также может формировать комплекс с холестерином, но настоящее изобретение этим не ограничивается.

Согласно описанию изобретения, комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина может регулировать иммунную функцию иммунных клеток, так что индуцируется иммунная активация антигенпрезентирующих клеток (дендритных клеток, макрофагов и т.д.), естественных клеток-киллеров или Т-клеток, или регулировать иммунную функцию иммунных клеток путем регуляции функции иммунных клеток (регуляторных Т-клеток (Treg), миелоидных супрессорных клеток (MDSC) и макрофагов M2), которые проявляют иммунодепрессивное действие, в микроокружении опухоли. Функция иммунных клеток, проявляющих иммуносупрессивное действие, может регулироваться путем ингибирования действия Treg или MDSC, или уменьшения количества клеток, или регулироваться методом преобразования MDSC в антигенпрезентирующие клетки, индуцируя противораковую иммунную функцию. В качестве альтернативы, макрофаги M2 могут быть преобразованы в макрофаги M1.

Термины «совместное введение» или «комбинированное введение», используемое в настоящей заявке, представляет собой введение комплекса агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина вместе с различными материалами, такими как антиген, ингибитор иммунной контрольной точки, адъювант, материал для иммунной активации и химиотерапевтический агент, и нет никаких ограничений типа и формы материалов.

Используемый в настоящей заявке термин «химиотерапевтический агент» может быть любым соединением, известным в данной области техники, которое может быть использовано для лечения рака, без ограничения, и химиотерапевтическим агентом может быть паклитаксел, доцетаксел, 5-фторурацил, алендронат, доксорубицин, симвастатин, гидразинокуркумин, амфотерицин B, ципрофлоксацин, рифабутин, рифампицин, эфавиренц, цисплатин, теофиллин, псевдомонадный экзотоксин А, золедроновая кислота, трабектин, силтуксимаб, дазатиниб, сунитиниб, апатиниб, 5,6-диметилксантенон-4-уксусная кислота, силибинин, PF-04136309, трабектедин, карлумаб, BLZ945, PLX3397, эмактузумаб, AMG-820, IMC-CS4, GW3580, PLX6134, N-ацетил-1-цистеин, витамин C, бортезомиб, аспирин, салицилаты, производные индолкарбоксамида, хиназолиновые аналоги, талидомид, простагландиновые метаболиты, 2МЕ2, 17-AAG, камптотецин, топотекан, плевротин, 1-метилпропил,2-имидазолил-дисульфид, тадалафил, силденафил, L-AME, нитроаспирин, целекоксиб, NOHA, бардоксолон-метил, D,L-1-метил-триптофан, гемцитабин, акситиниб, сорафениб, кукурбитацин B, JSI-124, анти-IL-17 антитела, анти-гликановые антитела, анти-VEGF антитела, бевацизумаб, антрациклин, тасквинимод, иматиниб или циклофосфамид, но настоящее изобретение этим не ограничивается.

Используемый в настоящей заявке термин «ингибитор иммунной контрольной точки» включает все способы лечения рака, которые активируют иммунную функцию иммунных клеток для борьбы с раковыми клетками, и ингибитор иммунной контрольной точки включает, например, анти-PD-1, анти-PD-L1, анти-CTLA-4, анти-KIR, анти-LAG3, анти-CD137, анти-OX40, анти-CD276, анти-CD27, анти-GITR, анти-TIM3, анти-41BB, анти-CD226, анти-CD40, анти-CD70, анти-ICOS, анти-CD40L, анти-BTLA, анти-TCR или анти-TIGIT, но настоящее изобретение не ограничивается ими.

Используемый в настоящей заявке термин «иммунный активирующий материал» включает все материалы для активации иммунных клеток, а иммунный активирующий материал представляет собой, например, агонист толл-подобного рецептора, сапонин, противовирусный пептид, индуктор инфламмасомы, лиганд NOD, лиганд цитозольного сенсора ДНК (CDS), лиганд стимулятора гена интерферона (STING), эмульсию или квасцы, но настоящее изобретение этим не ограничивается.

Используемый в настоящей заявке термин «антиген» включает все субстанции, вызывающие иммунный ответ в организме, и предпочтительно представляет собой патоген (бактерии, вирус и др.), химическое соединение, пыльцу, раковые клетки, креветки, или пептид или белок, полученный из антигена, и более предпочтительно, раковый антигенный пептид или материал, который может вызывать иммунный ответ в организме, но настоящее изобретение этим не ограничивается. Антиген предпочтительно представляет собой белок, рекомбинантный белок, гликопротеин, ген, пептид, полисахарид, липополисахарид, полинуклеотид, клетку, клеточный лизат, бактерию или вирус, и более предпочтительно раковый антигенный пептид. Гликопротеин может представлять собой антитело, фрагмент антитела, структурный белок, регуляторный белок, фактор транскрипции, белок токсина, гормон, производное гормона, фермент, фрагмент фермента, транспортный белок, рецептор, фрагмент рецептора, индуктор биозащиты, запасной белок, транспортный белок, функциональный белок или репортерный белок. Однако, поскольку он является материалом, который может вызывать иммунный ответ, действуя как антиген в организме, он этим не ограничивается.

Используемый в настоящей заявке термин «вакцина» относится к биологическому препарату, содержащему антиген, вызывающий иммунный ответ в организме, и иммуноген, который вызывает иммунитет в организме при инъекции или пероральном введении человеку или животному для предотвращения инфекции. Животное представляет собой человека или животное, не являющееся человеком, такое как свинья, корова, лошадь, собака, коза или овца, но настоящее изобретение этим не ограничивается.

Термин «профилактика», используемый в настоящей заявке, относится ко всем действиям по подавлению заболевания, такого как рак, иммунное заболевание или инфекционное заболевание, или по отсрочке их начала путем введения композиции согласно настоящему изобретению.

Используемый в настоящей заявке термин «лечение» относится ко всем действиям, связанным с облегчением или благоприятным изменением симптомов заболевания, такого как рак, иммунное заболевание или инфекционное заболевание, путем введения композиции согласно настоящему изобретению.

Используемый в настоящей заявке термин «индивидуум или субъект» относится к мишени, для которой можно применять композицию по настоящему изобретению, и нет никаких ограничений для субъекта.

Используемый в настоящей заявке термин «рак» относится к общему термину для различных типов рака крови и злокачественных солидных опухолей, которые могут распространяться локально за счет инфильтрации и системно за счет метастазов. Без конкретных ограничений, специфические примеры рака включают колоректальный рак, рак надпочечников, рак кости, злокачественную опухоль головного мозга, рак молочной железы, рак бронхов, рак толстой кишки и/или рак прямой кишки, рак желчного пузыря, гастроинтестинальный рак, рак головы и шеи, рак почки, рак гортани, рак печени, рак легких, злокачественные новообразования нервной ткани, рак поджелудочной железы, рак простаты, рак паращитовидной железы, рак кожи, рак желудка и рак щитовидной железы. Другие примеры рака включают аденокарциному, аденому, базально-клеточную карциному, цервикальную дисплазию и карциному in situ, саркому Юинга, плоскоклеточную карциному, протоковую карциному, злокачественную опухоль головного мозга, волосатоклеточную опухоль, ганглионеврому кишечника, гиперпластическую опухоль роговичного нерва, карциному островковых клеток, саркому Капоши, лейомиому, лейкоз, лимфому, злокачественный карциноид, злокачественную меланому, злокачественную гиперкальциемию, опухоль при марфаноидном внешнем виде, медуллярную карциному, метастатический рак кожи, неврому слизистой оболочки, миелодиспластический синдром, миелому, грибовидный микоз, остеогенную саркому и другие виды сарком, рак яичника, феохромоцитому, полицитемию, первичную опухоль головного мозга, мелкоклеточный рак легкого, язвенную и папиллярную плоскоклеточную карциному, семиному, саркому мягких тканей, ретинобластому, рабдомиосаркому, почечно-клеточную опухоль или почечно-клеточную карциному (ПКР), ретикулумоклеточную саркому и опухоль Вильмса. Примеры рака также включают астроцитому, гастроинтестинальную стромальную опухоль (GIST), глиому или глиобластому, гепатоцеллюлярную карциному (HCC) и нейроэндокринный рак поджелудочной железы.

Термин «инфекционное заболевание» включает все заболевания, вызванные инфекцией, обусловленной гетерогенными организмами, такими как бактерии и вирусы.

Используемый в настоящей заявке термин «фармацевтическая композиция» или «вакцинная композиция» относится к композициям, приготовленным в форме капсулы, таблетки, гранулы, инъекции, мази, порошка или напитка, и фармацевтическая композиция или вакцинная композиция может быть предназначена для человека. Фармацевтическая композиция или вакцинная композиция может быть использована в пероральном препарате, таком как порошок, гранула, капсула, таблетка или водная суспензия, средства для наружного применения, суппозиторий и стерильный инъекционный раствор в соответствии с обычным способом, но настоящее изобретение этим не ограничивается. Фармацевтическая композиция или вакцинная композиция по настоящему изобретению может включать фармацевтически приемлемый носитель. В качестве фармацевтически приемлемых носителей для перорального введения можно использовать связующий агент, любрикант, дезинтегрант, наполнитель, солюбилизатор, диспергатор, стабилизатор, суспендирующий агент, краситель и ароматизатор; смесь буфера, консервант, анальгетик, солюбилизатор, изотонический агент и стабилизатор могут быть использованы для инъекционного препарата, а основа, наполнитель, любрикант и консервант могут быть использованы для местного применения. Фармацевтическая композиция или вакцинная композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена в различных дозированных формах путем смешивания вышеописанных фармацевтически приемлемых носителей. Например, для перорального введения фармацевтическая композиция или вакцинная композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена в различных лекарственных формах, таких как таблетка, пастилка, капсула, эликсир, суспензия, сироп и вафля, а для инъекций фармацевтическая композиция или вакцинная композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена в ампуле с единичной дозой или в виде множественных дозированных форм. Кроме того, фармацевтическая композиция или вакцинная композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена в виде раствора, суспензии, таблетки, капсулы или препарата с замедленным высвобождением.

Между тем, примеры носителей, наполнителей и разбавителей, подходящих для приготовления, могут включать лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбитол, маннитол, ксилитол, эритритол, мальтитол, крахмал, аравийскую камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло. Примеры носителей, вспомогательных веществ и разбавителей могут также включать наполнитель, антислеживающий агент, глидант, смачивающий агент, ароматизатор, эмульгатор и консервант.

Пути введения фармацевтической композиции или вакцинной композиции согласно, настоящему изобретению, могут включать пероральное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интрамедуллярное, интратекальное, внутрисердечное, трансдермальное, подкожное, интраперитонеальное, интраназальное, интестинальное, местное, сублингвальное или ректальное введение, но не ограничиваются ими. Предпочтительным является пероральное или парентеральное введение. Используемый в настоящей заявке термин «парентеральное» означает подкожное, внутрикожное, внутривенное, внутримышечное, внутрисуставное, интрабурсальное, интрастернальное, интратекальное, внутриочаговое и внутричерепное введение. Фармацевтическая композиция или вакцинная композиция по настоящему изобретению может быть введена в форме суппозитория для ректального применения.

Фармацевтическая композиция или вакцинная композиция по настоящему изобретению может быть изменена по-разному в соответствии с различными факторами, включая активность конкретного используемого соединения, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол, рацион, время введения, путь введения, скорость выведения, лекарственный состав, и тяжесть конкретного заболевания, которое необходимо предотвратить или лечить, и дозировка фармацевтической композиции может быть подходящим образом выбрана специалистами в данной области техники в зависимости от состояния пациента, массы тела, тяжести заболевания, типа лекарственного средства, способа введения и продолжительности введения, и может составлять от 0,0001 до 500 мг/кг или от 0,001 до 500 мг/кг в сутки. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может применяться один раз в день или несколько раз разделенными порциями. Доза никоим образом не ограничивает объем настоящего изобретения. Фармацевтическая композиция или вакцинная композиция, согласно настоящему изобретению, может быть приготовлена в виде пилюли, каплетки, капсулы, жидкости, геля, сиропа, взвеси или суспензии.

Кроме того, вакцинная композиция, согласно настоящему изобретению, может дополнительно включать традиционно известный «адъювант». Адъювант обычно включает все материалы, увеличивающие гуморальный и/или клеточный иммунный ответ (ответы) против антигена, и любой адъювант, известный в данной области техники, можно использовать без ограничений. Например, иммунитет может быть повышен путем дополнительного добавления полного или неполного адъюванта Фрейнда к вакцинной композиции согласно настоящему изобретению. Кроме того, в случае вакцинной композиции, при необходимости, необязательная повторная стимуляция антигеном может быть проведена после начальной дозы.

Далее, чтобы способствовать пониманию настоящего изобретения, ниже приведены типичные примеры. Однако следующие примеры приведены просто для более легкого понимания настоящего изобретения, а не для ограничения настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1. Синтез комплекса агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина

Различные агонисты толл-подобных рецепторов 7/8 (на основе имидазохинолина, на основе 8-гидроксиаденина, на основе птеридона, на основе 2-аминопиримидина, на основе бензоазепина и на основе 7-тиа-8-оксогуанозина), конъюгированные с холестерином, были получены химической реакцией, такой как представлено на Схеме реакции 1 или 2. Агонист толл-подобного рецептора 7/8 может быть получен путем обеспечения взаимодействия активного центра агониста толл-подобного рецептора 7/8, аминогруппы (NH₂), с производным холестерина, которое может формировать связь с карбаматом, дисульфидом, сложным эфиром, пептидом или азид. Производное включает аналогичные соединения, полученные химическим изменением части агониста толл-подобного рецептора 7/8.

[Схема реакции 1]

R представляет собой боковую цепь, имеющую алифатическую или ароматическую группу, и может включать -NH-, -CO-, -CONH-, -CSNH-, -COO-, -CSO-, -SO₂NH-, -SO₂-, -SO-, и -O-.

[Схема реакции 2]

R представляет собой боковую цепь, имеющую алифатическую или ароматическую группу, и может включать -NH-, -CO-, -CONH-, -CSNH-, -COO-, -CSO-, -SO₂NH-, -SO₂-, -SO-, и -O-.

1.1. Синтез комплекса ресквимод-холестерин, имеющего карбаматную связь

Для синтеза конъюгированного с холестерином ресквимода (R848) использовали способ, описанный ниже в Схеме реакции 3. Более конкретно, готовили раствор 90,0 мг холестерил-хлорформиата в 1 мл дихлорметана, медленно по каплям добавляли к приготовленному раствору 31,4 мг ресквимода в 100 мкл пиридина, и добавляли и растворяли в 3 мл раствора дихлорметана. Затем смесь готовили путем перемешивания полученного раствора при 4°С в течение 16 часов. Затем смесь доводили до комнатной температуры и добавляли дистиллированную воду для разделения слоев воды и дихлорметана. Затем к отделенному слою дихлорметана добавляли сульфат натрия, проводили реакцию в течение 16 часов для удаления оставшейся воды. Затем оставшийся раствор очищали с использованием колонки с силикагелем, получая таким образом белый порошок ресквимода, конъюгированного с холестерином. Структуры ресквимода, используемого в синтезе, и полученного ресквимода, конъюгированного с холестерином, проверяли с помощью спектроскопии ¹H-ЯМР и ¹⁵N-гетероядерной одноквантовой когерентной спектроскопии (HSQC). Структуры ресквимода показаны на фиг. 2 и 4, а структуры ресквимода, конъюгированного с холестерином, показаны на фиг. 3, 5 и 6. Механизм отделения холестерина от холестерин-конъюгированного ресквимода под действием физиологической среды в клетках показан на фиг. 7.

[Схема реакции 3]

1.2. Синтез комплекса имиквимод-холестерин, имеющего карбаматную связь

Для синтеза конъюгированного с холестерином имиквимода (R837) использовали способ, показанный на Схеме реакции 4 ниже. Более конкретно, готовили раствор 90,0 мг холестерил-хлорформиата в 1 мл дихлорметана, медленно по каплям добавляли к приготовленному раствору 31,4 мг имиквимода в 100 мкл пиридина, а затем добавляли и растворяли в 3 мл дихлорметана. Затем смесь готовили путем перемешивания полученного раствора при 4°С в течение 16 часов. Затем смесь доводили до комнатной температуры, а затем добавляли дистиллированную воду для разделения слоев воды и дихлорметана, и добавляли сульфат натрия к отделенному слою дихлорметана для проведения реакции в течение 16 часов с целью удаления оставшейся воды. Оставшийся раствор затем очищали с использованием колонки с силикагелем, получая в результате белый порошкообразный конъюгированный с холестерином имиквимод.

[Схема реакции 4]

R₁ или R₂ представляют собой боковую цепь, имеющую алифатическую или ароматическую группу, и могут включать -NH-, -CO-, -CONH-, -CSNH-, -COO-, -CSO-, -SO₂NH-, -SO₂-, - SO- и -O-.

Пример 2. Синтез комплекса агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, поперечно сшитого дисульфидом

2.1. Синтез комплекса ресквимод-холестерин, поперечно сшитого дисульфидом

Чтобы синтезировать ресквимод, поперечно сшитый с холестерин-дисульфидом, использовали способ, показанный на Схеме реакции 5 ниже. Более конкретно, готовили раствор 1,54 г 2-гидроксиэтилдисульфида в 30 мл тетрагидрофурана, а затем медленно добавляли по каплям к раствору фосгена (15 мл, 15 масс % в толуоле), тем самым получая смесь. Затем смесь перемешивали при 25°C в течение 10 часов и выпаривали растворитель в вакууме. Затем добавляли 2,3 г N-гидросукцинимида, растворяли в тетрагидрофуране и смешивали со смесью с последующим добавлением 1,57 мл триэтиламина. Кроме того, после реакции при 40°C в течение 16 часов осадок удаляли, а затем растворитель выпаривали в вакууме. Затем полученный раствор очищали хроматографией на колонке с силикагелем и подвергали перекристаллизации, используя холодный гексан, и сушили в вакууме, получая белое твердое вещество, которое представляет собой очищенный сшитый дисульфидом линкер. Затем готовили раствор 387 мг холестерина в 10 мл дихлорметана, добавляли 523 мг сшитого дисульфидом линкера и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов, а затем белый порошок холестерина-дисульфида, в котором холестерин и дисульфид являются связанными, очищали с использованием колонки с силикагелем. Затем 31,4 мг ресквимода и 80 мг холестерин-дисульфида добавляли к 5 мл дихлорметана и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем к перемешиваемому раствору добавляли дистиллированную воду для разделения слоев воды и дихлорметана, и к отделенному слою дихлорметана добавляли сульфат натрия, и проводили реакцию в течение 16 часов, чтобы удалить оставшуюся воду. Затем оставшийся раствор очищали с использованием колонки с силикагелем, получая таким образом белый порошок комплекса ресквимод-холестерин, поперечно сшитого дисульфидом.

[Схема реакции 5]

Механизм отделения холестерина от комплекса ресквимод-холестерин, поперечно сшитого дисульфидом, под действием физиологической среды в клетках показан на фиг. 8.

2.2. Синтез комплекса имиквимод-холестерин, поперечно сшитого дисульфидом

Чтобы синтезировать имиквимод, поперечно сшитый с холестерин-дисульфидом, использовали способ, показанный на Схеме реакции 6 ниже. Более конкретно, готовили раствор 1,54 г 2-гидроксиэтил-дисульфида в 30 мл тетрагидрофурана, а затем медленно добавляли по каплям к раствору фосгена (15 мл, 15 масс % в толуоле), тем самым получая смесь. Затем смесь перемешивали при 25°C в течение 10 часов, и выпаривали растворитель в вакууме. Затем 2,3 г N-гидросукцинимида растворяли в тетрагидрофуране и смешивали со смесью с последующим добавлением 1,57 мл триэтиламина. Затем после реакции при 40°C в течение 16 часов осадок удаляли, а затем растворитель выпаривали в вакууме. Затем полученный раствор очищали хроматографией на колонке с силикагелем и подвергали перекристаллизации, используя холодный гексан, и сушили в вакууме, получая тем самым белое твердое вещество, которое представляет собой очищенный сшитый дисульфидом линкер. Затем готовили раствор 387 мг холестерина в 10 мл дихлорметана, добавляли 523 мг сшитого дисульфидом линкера и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов, а затем белый порошок холестерин-дисульфида, в котором конъюгированы холестерин и дисульфид, очищали с использованием колонки с силикагелем. Кроме того, 31,4 мг имиквимода и 80 мг дисульфида холестерина добавляли к 5 мл дихлорметана и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Кроме того, к перемешиваемому раствору добавляли дистиллированную воду, чтобы разделить слои воды и дихлорметана, и сульфат натрия добавляли к отделенному слою дихлорметана и проводили реакцию в течение 16 часов для удаления оставшейся воды. Кроме того, оставшийся раствор очищали с использованием колонки с силикагелем, получая таким образом белый порошок комплекса имиквимод-холестерин, поперечно сшитого дисульфидом.

[Схема реакции 6]

R₁ или R₂ представляют собой боковую цепь, имеющую алифатическую или ароматическую группу, и могут включать -NH-, -CO-, -CONH-, -CSNH-, -COO-, -CSO-, -SO₂NH-, -SO₂-, - SO- и -O-.

Пример 3. Получение наночастиц, включающих комплекс холестерина и агониста толл-подобного рецептора 7/8.

Чтобы максимизировать взаимодействие с иммунными клетками, комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина может быть получен в виде различных форм наночастиц (фиг. 9).

3.1. Получение нанолипосом, включающих ресквимод, конъюгированный с холестерином

Для приготовления анионных нанолипосом, включающих ресквимод, конъюгированный с холестерином, 4 мг 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DOPC, Avanti), 1,2 мг ресквимода, конъюгированного с холестерином, и 1 мг 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфо-(1'-rac-глицерина) (DPPG, Avanti) растворяли в 1 мл хлороформа с получением смеси. Смесь получали в виде тонкой пленки путем выпаривания растворителя с помощью роторного испарителя, к тонкой пленке добавляли 2 мл фосфатно-солевого буфера и перемешивали при 45°С в течение 30 минут, тем самым получая анионные нанолипосомы, содержащие конъюгированный с холестерином ресквимод путем гомогенизации с использованием ультразвукового гомогенизатора с наконечником (амплитуда: 20%, 2 мин). Для приготовления катионных нанолипосом, включающих ресквимод, конъюгированный с холестерином, 4 мг DOPC, 1,2 мг ресквимода, конъюгированного с холестерином, и 2 мг диметилоктадециламмония бромида (DDAB) растворяли в 1 мл хлороформа с получением смеси. Смесь получали в виде тонкой пленки путем выпаривания растворителя с использованием роторного испарителя, к тонкой пленке добавляли 2 мл фосфатно-солевого буфера и перемешивали при 45°С в течение 30 минут, тем самым получая катионные нанолипосомы, содержащие холестерин-конъюгированный ресквимод, путем гомогенизации с использованием ультразвукового гомогенизатора с наконечником (амплитуда: 20%, 2 мин).

3.2. Приготовление наноэмульсии, включающей ресквимод, конъюгированный с холестерином

Для приготовления наноэмульсии, включающей ресквимод, конъюгированный с холестерином, растворяли 1 мг DOPC, 240 мкг холестерина и 240 мкг ресквимода, конъюгированного с холестерином, в 1 мл хлороформа, получая таким образом смесь. Затем смесь получали в виде тонкой липидной пленки, помещая ее в круглодонную колбу и полностью выпаривая хлороформ с помощью роторного испарителя. Затем растворяли сквален (5 об.%), Твин 80 (0,5 об.%) и Span 85 (0,5 об.%) в 2 мл физиологического раствора с фосфатным буфером, и раствор добавляли на липидную пленку, диспергировали с помощью ультразвукового гомогенизатора с наконечником в течение 1 минуты, и перемешивали с помощью устройства для вращения пробирок в течение примерно 2 часов, получая таким образом наноэмульсию, включающую ресквимод, конъюгированный с холестерином, и хранили ее при 4°С холодильнике до использования.

3.3. Получение наномицелл, состоящих из ресквимода, конъюгированного с холестерином, и сапонина

Для приготовления наномицелл, состоящих из ресквимода, конъюгированного с холестерином, и сапонина, фосфатидилхолин, сапонин и ресквимод, конъюгированный с холестерином, смешивали в массовом соотношении 5:3:2, добавляли эфир и растворяли в смеси до концентрации 14 мг/мл, получая таким образом эфирный раствор, включающий липид. Затем сапонин растворяли в 4 мл дистиллированной воды в концентрации 1,5 мг/мл и помещали в стеклянную бутылку объемом 20 мл. Стеклянную бутылку закрывали резиновой пробкой, а затем хранили в водяной рубашке при 55°C. Затем 1 мл липид-содержащего эфирного раствора добавляли в стеклянную бутылку, содержащую сапонин, со скоростью 0,2 мл/мин, используя шприцевой насос, и перемешивали в течение 2 часов. Кончик иглы шприца помещали ниже поверхности содержащего сапонин водного раствора, а вторую иглу вставляли в резиновую пробку для вентиляции. Затем стеклянную бутылку переносили в условия комнатной температуры, перемешивали в течение 3 часов для стабилизации, получая таким образом наномицеллы, состоящие из ресквимода, конъюгированного с холестерином, и сапонина.

3.4. Получение полимерных наночастиц, состоящих из ресквимода, конъюгированного с холестерином

60 мг полимера PLGA (Eudragit), имеющего соотношение лактида и гликолида в составе 50:50, растворяли в 1 мл хлороформного растворителя. К растворителю добавляли 5 мг ресквимода, конъюгированного с холестерином, и комплекс холестерин-ресквимода и полимера растворяли с использованием ультразвукового гомогенизатора (ультразвуковая ванна, Emerson Model CPX5800H-E). Затем, полученный раствор добавляли к 10 мл 2,5% водного раствора ПВС по 200 мкл и диспергировали в течение 1 минуты с помощью ультразвукового гомогенизатора с наконечником (Sonics & Materials Model VCX 750). Здесь мощность диспергатора составляла 750 Вт, интенсивность вибрации составляла 20 кГц, а амплитуда была установлена на 20%. Затем для полного испарения органического растворителя, растворенного в PLGA, приготовленный водный раствор перемешивали при 600 об/мин и комнатной температуре в течение 8 часов или более. Для удаления непрореагировавшего полимера и комплекса холестерин-ресквимод центрифугирование выполняли при 12000 об/мин в течение 12 минут с использованием центрифуги (Hanil, Combi-514R), удаляли надосадочную жидкость, добавляли 10 мл деионизованной воды, а затем полученный раствор диспергировали в ультразвуковом гомогенизаторе в течение 30 секунд. Вышеописанный процесс повторяли три раза, после чего проводили сушку лиофилизацией и хранили при температуре -20°C.

Пример 4. Характеристика наночастиц, включающих комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, и оценка, насколько эффективно он способен активировать иммунные клетки

После того, как наночастицы, включающие комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина по настоящему изобретению, были доставлены в клетки, проверяли, отделялись ли друг от друга холестерин и ресквимод в кислых условиях в цитоплазме. Более конкретно, нанолипосомы, включающие ресквимод, конъюгированный с холестерином, получали тем же способом, что и в Примере 3.1, и далее 10 мкг приготовленных нанолипосом добавляли к 1 мл фосфатно-солевого буферного раствора (ФБР), имеющего pH 5 или 7, при 37°С. Кроме того, каждый образец получали на день 0,5; 1; 1,5 или 2 для измерения концентрации отделенного ресквимода с использованием УФ-видимой области спектра. Результаты приведены на фиг. 10.

Как показано на фиг. 10, хотя ресквимод и холестерин не были отделены друг от друга при pH 7, было подтверждено, что ресквимод отделяется от холестерина с течением времени при pH 5. Согласно результату исследования, после того, как наночастицы, включающие комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, были доставлены в цитоплазму клетки, было подтверждено, что агонист толл-подобного рецептора 7/8 отделен от холестерина, чтобы вызвать реакцию иммунной активации в цитоплазме.

Кроме того, чтобы проверить, происходит ли расщепление комплекса конкретным ферментом, присутствующим в микроокружении опухоли, нанолипосомы, содержащие холестерин-конъюгированный ресквимод, получали тем же способом, что и в примере 3.1, обрабатывали с 30 единицами карбоксилэстеразы и проводили реакцию при 37°C. Было подтверждено отделение холестерина. Результаты приведены на фиг. 11.

Как показано на фиг. 11, было подтверждено, что холестерин из комплекса агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина выщеплялся под действием специфического фермента, присутствующего в микроокружении опухолевых клеток.

Для подтверждения цитотоксичности 10⁴ макрофагов Raw264.7 обрабатывали 100 мкл каждого из 500 нг/мл и 1000 нг/мл липосом, нанолипосом, включающих комплекс холестерин-ресквимод, и ресквимода, и проводили реакцию в течение 24 часов. Кроме того, выживаемость клеток измеряли с помощью анализа пролиферации клеток CellTiter 96 AQueous One Solution (Promega). В качестве отрицательного контроля был проведен эксперимент с использованием физиологического раствора с фосфатным буфером. Результат приведен на фиг. 12.

Как показано на фиг. 12, было подтверждено, что нанолипосомы, включающие комплекс холестерин-ресквимод, не только проявляют цитотоксичность, но также проявляют эффект стимуляции пролиферации за счет активации иммунных клеток.

Кроме того, для проверки степени активации иммунных клеток 10⁶ макрофагов Raw264.7 обрабатывали 1 мл каждого из 500 нг/мл и 1000 нг/мл липосом, нанолипосом, включающих комплекс холестерин-ресквимод, и ресквимода, и инкубировали в течение 24 часов, получая жидкую культуру клеток. Жидкую культуру клеток центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут для получения бесклеточной надосадочной жидкости, и определяли концентрации ИЛ-6 и ФНО-α, содержащихся в надосадочной жидкости, посредством ИФА с использованием набора BD OptiEIATM. Результаты приведены на фиг. 13 и 14.

Как показано на фиг. 13 и 14, по сравнению с применением только одного ресквимода, было подтверждено, что количество высвобождаемых ИЛ-6 и ФНО-α увеличивается в экспериментальной группе, получавшей нанолипосомы, включающие комплекс холестерин-ресквимод, демонстрируя, что иммунная активация агонистом толл-подобного рецептора 7/8 может не только стабильно индуцироваться в необходимый момент времени в клетках, но также увеличивать степень иммунной активации с использованием нанолипосом, включающих комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина.

Степень активации иммунных клеток проверяли с использованием комплекса холестерин-ресквимод, в котором холестерин не расщепляется в определенный момент времени, в качестве контроля. Более конкретно, 2×10⁵ дендритных клеток костного мозга (BMDC) или макрофагов, происходящих из костного мозга (BMDM), на миллилитр, обрабатывали каждым из липосомального препарата (Lipo (Chol-R848)), включающего комплекс холестерин-ресквимод в соответствии с настоящим изобретением, липосомального препарата (Lipo (C18-R848)), включающего нерасщепленный комплекс холестерин-ресквимод, липосом и ресквимода, и инкубировали в течение 24 часов. Кроме того, получали жидкую культуру, центрифугировали при 490 g в течение 5 минут, таким образом получая только надосадочную жидкость, и проводили ИФА с использованием набора BD OptEIA™. Результаты приведены на фиг. 15.

Как показано на фиг. 15, хотя комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина по настоящему изобретению эффективно активирует иммунные клетки за счет индукции выщепления холестерина в цитоплазме, было подтверждено, что комплекс, в котором выщепление холестерина не индуцируется, не активирует иммунные клетки, так как активный центр ресквимода не экспонирован. Из приведенных выше результатов видно, что комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина по настоящему изобретению не активен, когда холестерин не выщепляется, но эффективно активирует иммунные клетки после того, как холестерин выщепляется в определенных условиях, тем самым регулируя иммунную реакцию.

Пример 5. Оценка иммунной активации в лимфатическом узле и токсического действия в сыворотке после инъекции in vivo комплекса агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина

Чтобы подтвердить действие комплекса агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина in vivo, был проведен эксперимент in vivo. Более конкретно, липосомы, включающие комплекс холестерин-ресквимод, или ресквимод (свободное лекарственное средство), вводили подкожно в правый бок мышам C57BL/6 в дозе 25 мкг/100 мкл. Затем через 1, 4 и 8 дней у мышей выделяли лимфатические узлы и готовили криосрезы. Затем дендритные клетки и макрофаги метили антителом к CD205 и антителом к CD169, соответственно, которые выявляли с помощью флуоресцентного микроскопа. Результаты приведены на фиг. 16.

Как показано на фиг. 16, хотя активация иммунных клеток в лимфатическом узле не индуцируется у мышей, получавших ресквимод сам по себе, было подтверждено, что иммунные клетки активируются в лимфатическом узле у мышей, получавших липосомы, включающие комплекс холестерин-ресквимод.

Кроме того, для проверки длительного in vivo эффекта комплекса агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина липосомы (Lipo (Chol-R848)), включающие комплекс холестерин-ресквимод, липосомы или ресквимод (R848), вводили подкожно в правый бок мышей C57BL/6 в дозе 25 мкг/100 мкл, а затем выделяли лимфатические узлы в зависимости от времени лечения до 15 дней. Кроме того, полученные лимфатические узлы сначала были физически измельчали с помощью ножниц, далее их обрабатывали 1 мг/мл коллагеназы D, проводили реакцию в течение 1 часа для второго лизиса, а затем отделяли фильтрацией с использованием сита с размером пор 70 мкм с последующим разделением клеток и надосадочной жидкости с использованием центрифуги (490 g, 5 мин). Затем полученные клетки метили антителом к CD11c и антителом к CD11b, и фиксировали с использованием 4% параформальдегида. Затем проводили анализ с использованием проточного цитометра BD FACS Canto II. Далее отделенную надосадочную жидкость анализировали с помощью ИФА для измерения количества цитокина ИЛ-12. Результаты приведены на фиг. 17А.

Как показано на фиг. 17А, в то время как активация иммунных клеток не наблюдалась у мышей, получавших липосомы или ресквимод по отдельности, было подтверждено, что в экспериментальной группе, получавшей наночастицы, включающие комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина по настоящему изобретению, не только количество иммунных клеток в лимфатическом узле постепенно увеличивалось, но и иммунные клетки эффективно активировались, при этом стабильно высвобождая цитокин в течение длительного времени.

Кроме того, для проверки токсичности in vivo липосомы (Lipo (Chol-R848)), включающие комплекс холестерин-ресквимод, липосомы или ресквимод (R848), вводили подкожно в правый бок мышей C57BL/6 в дозе 25 мкг/100 мкл, измеряли массу тела мыши и каждый раз отбирали кровь из орбитальной вены. Затем собранную кровь центрифугировали (4°C, 13000 об/мин, 20 мин) для разделения сыворотки и клеток крови, и количество цитокинов измеряли с помощью ИФА в сыворотке. Результаты приведены на фиг. 17B.

Как показано на фиг. 17В, в экспериментальной группе, получавшей только ресквимод, количество цитокинов быстро увеличивалось в сыворотке на ранней стадии, вызывая цитокиновый шторм, тем самым приводя к резким изменения массы тела за счет индукции цитотоксичности, тогда как в случае наночастиц, включающих комплекс холестерина и агониста рецептора 7/8 по настоящему изобретению, количество цитокинов в сыворотке не изменялось, и потеря массы тела не наблюдалась, что подтверждает отсутствие токсичности in vivo.

Пример 6. Подтверждение противоракового действия комплекса агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина

6.1. Проверка противоракового эффекта комплекса холестерина и агониста толл-подобного рецептора 7/8 и ракового антигена

Чтобы подтвердить, что комплекс холестерина и агониста толл-подобного рецептора 7/8 проявляет противораковый эффект, был проведен эксперимент с использованием линии клеток меланомы B16-OVA и овальбуминового антигена (OVA). Более конкретно, 5×10⁵ клеток линии клеток B16-OVA вводили подкожно в правый бок мышей C57BL/6, и время, когда размер опухоли достигал приблизительно 50 мм³, принимали за день 0, и мышам вводили фосфатно-солевой буферный раствор (ФБР) (контроль), овальбуминовый антиген (OVA), ресквимод + антиген OVA (R848 + OVA) и нанолипосомы, включающие комплекс холестерин-ресквимод, + антиген OVA (Lipo (Chol-R848) + OVA) посредством внутриопухолевой инъекции в дни 0, 3, 6 и 9. Вводили 10 мкг антигена OVA, 25 мкг ресквимода и 25 мкг (в пересчете на ресквимод) нанолипосом, включающих комплекс холестерин-ресквимод. Затем определяли выживаемость мышей и размер опухоли. Результаты приведены на фиг. 18.

Как показано на фиг. 18, в экспериментальной группе, которой вводили только антиген OVA, как и в контрольной группе, которой вводили фосфатно-солевой буферный раствор, размер опухоли резко увеличивался, и не было ни одной мыши, выживающей три недели или более, а в экспериментальной группе, получавшей ресквимод и антиген OVA, по сравнению с контролем, было подтверждено снижение скорости увеличения размера опухоли, но размер опухоли все еще увеличивался. Однако было подтверждено, что в экспериментальной группе, получавшей наночастицы, включающие комплекс холестерина и агониста толл-подобного рецептора 7/8 по настоящему изобретению, опухоль практически не растет, и даже через 60 дней выживаемость составила примерно 60% или более.

Затем для подтверждения действия на иммунные клетки, таким же образом, как описано выше, каждый из ФБР, антигена OVA и нанолипосом (липосом), ресквимода и антигена OVA (R848), а также нанолипосом, включающих комплекс холестерин-ресквимод и антиген OVA (Lipo (Chol-R848)), вводили в дни 0, 3, 6 и 9 посредством внутриопухолевой инъекции, и через 7 дней после введения последнего образца у мышей брали опухолевую ткань и селезенку. Полученную опухолевую ткань сначала измельчали ножницами, измельченную ткань обрабатывали 1 мг/мл коллагеназы типа I и проводили реакцию при 37°С в течение 1 часа для разделения на отдельные клетки. Затем отделенные клетки фильтровали, используя фильтр с размером пор 70 мкм, и промывали, используя ФБР. Полученную селезенку сначала измельчали ножницами, обрабатывали буфером для лизиса эритроцитов и проводили реакцию при 37°C в течение 10 минут для лизиса эритроцитов. Затем клетки фильтровали, используя фильтр с размером пор 70 мкм, и промывали ФБР. Промытые опухолевые клетки и клетки селезенки метили антителами. Т-клетки метили анти-CD4-антителами и анти-CD8-антителами, макрофаги 2-го типа (макрофаги M2) метили анти-CD11b-антителом и анти-CD206-антителом, миелоидные супрессорные клетки (MDSC) метили анти-CD11b-антителом и анти-Gr1 антителом, и естественные киллерные клетки (NK-клетки) метили анти-NK1.1 антителом. Затем эти клетки анализировали с помощью флуоресцентного проточного цитометра. Результаты приведены на фиг. 19 и 20.

Как показано на фиг. 19 и 20, в опытной группе, получавшей наночастицы, включающие комплекс холестерина и агониста толл-подобного рецептора 7/8, количество CD4+ T-клеток, CD8+ T-клеток и NK-клеток, которые проявляют противоопухолевый эффект в опухолевой ткани, значительно увеличивается; было подтверждено, что количество макрофагов M2 и клеток MDSC, обладающих иммуносупрессивной функцией, значительно снижается.

6.2. Проверка противоопухолевого эффекта, вызванного совместным введением комплекса холестерина и агониста толл-подобного рецептора 7/8 и ингибитора иммунной контрольной точки

Чтобы подтвердить противораковый эффект совместного применения комплекса холестерина и агониста толл-подобного рецептора 7/8 и ингибитора иммунной контрольной точки, был проведен эксперимент с клеточной линией меланомы B16-OVA, клеточной линией рака легкого TC-1, и клеточной линией рака молочной железы 4T1. Более конкретно, 5×10⁵ клеток линии клеток B16-OVA, линии клеток TC-1 или линии клеток 4T1 вводили подкожно в правый бок мышей C57BL/6, и по истечении времени, когда размер опухоли достигал приблизительно 50 мм³, принятого за день 0, в дни 0, 3, 6 и 9 вводили ФБР; анти-PD-1 и раковый антиген (α-PD-1); анти-PD-L1 и раковый антиген (α-PD-L1); нанолипосомы, включающие комплекс холестерин-ресквимод и раковый антиген (Lipo (Chol-R848)); нанолипосомы, включающие комплекс холестерин-ресквимод, анти-PD-1 и раковый антиген (Lipo (Chol-R848) + α-PD-1); и нанолипосомы, включающие комплекс холестерин-ресквимод, анти-PD-L1 и раковый антиген (Lipo (Chol-R848) + α-PD-L1. Анти-PD-1 и анти-PD-L1, которые являются ингибиторами иммунной контрольной точки, вводили интраперитонеально в дозе 100 мкг/100 мкл в дни 0, 3 и 6, а другие агенты применяли посредством внутриопухолевой инъекции таким же образом, как в разделе 5.1. В качестве ракового антигена использовали антиген OVA для животной модели B16-OVA, антиген на основе пептида использовали для животной модели TC-1, а лизат опухолевых клеток использовали в качестве антигена для животной модели 4T1. Кроме того, определяли выживаемость мышей и размер опухоли. Результаты приведены на фиг. 21-23.

Как показано на фиг. 21, в случае животной модели B16-OVA было подтверждено, что рост опухоли значительно ингибируется, и отмечены 6 или 7 мышей без опухолей из 10 мышей в экспериментальной группе, в которой животным совместно вводили комплекс и ингибитор иммунной контрольной точки, что указывает на высокий противоопухолевый эффект.

Как показано на фиг. 22, в случае животной модели TC1 также было подтверждено, что рост опухоли значительно ингибируется, а выживаемость увеличивается в экспериментальной группе при совместном введении комплекса и ингибитора иммунной контрольной точки. Более того, было подтверждено, что метастазирование в легкие также подавлялось.

Как показано на фиг. 23, в случае животной модели 4T1 также было подтверждено, что рост опухоли ингибируется, а выживаемость увеличивается в экспериментальной группе при совместном введении комплекса и ингибитора иммунной контрольной точки.

6.3. Проверка противоопухолевого эффекта при совместном применении комплекса холестерина и агониста толл-подобного рецептора 7/8, и химиотерапевтического агента

Для подтверждения противоопухолевого эффекта при совместном введении комплекса холестерина и агониста толл-подобного рецептора 7/8 и химиотерапевтического агента применяли животную модель 4T1 тем же способом, что и в разделе 6.2, и совместно применяли доксорубицин или паклитаксел в качестве химиотерапевтического агента, и нанолипосомы, включающие комплекс холестерин- ресквимод. Затем, спустя две недели определяли размер опухоли. Результаты приведены на фиг. 24.

Как показано на фиг. 24, по сравнению с группой, которой вводили только химиотерапевтический агент, в случае совместного введения было подтверждено, что рост опухоли не только эффективно подавлялся, но также увеличивалось количество мышей без опухолей.

Из приведенных выше результатов следует, что поскольку можно предотвратить проникновение комплекса агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина в кровь, побочные эффекты обычного агониста толл-подобного рецептора 7/8 могут быть значительно уменьшены, и цитотоксичность не проявляется. При этом было подтверждено, что увеличивается не только эффективность внутриклеточной доставки, но также степень иммунной активности из-за эффективного отделения агониста от холестерина по сравнению с тем, когда используют только агонист толл-подобного рецептора 7/8. Кроме того, поскольку комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина основан на холестерине, он может быть легко приготовлен в форме наноэмульсии, нанолипосом или наномицелл, и таким образом, ожидается, что агонист толл-подобного рецептора 7/8 может не только широко использоваться в качестве терапевтического агента, активирующего иммунную систему, но также может усиливать иммунный ответ на антиген при использовании в качестве адъюванта в комбинации с антигеном. Кроме того, комплекс холестерина с агонистом толл-подобного рецептора 7/8 по настоящему изобретению индуцирует иммунную активацию антигенпрезентирующих клеток (дендритных клеток или макрофагов), NK-клеток и Т-клеток, и регулирует функцию иммунных клеток, обладающих иммуносупрессорным действием (регуляторных Т-клеток (Tregs), супрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC) или макрофагов M2) в микроокружении опухоли, и таким образом, ожидается, что он может быть использован в качестве состава для различных типов противоопухолевого лечения. Кроме того, особенно, поскольку противоопухолевый эффект может значительно усиливаться из-за синергетического эффекта при совместном применении со средствами для противоопухолевого лечения, такими как ингибитор иммунной контрольной точки и химиотерапевтический агент, комплекс холестерина и агониста толл-подобного рецептора 7/8 также может использоваться при совместном применении с различными противораковыми терапевтическими агентами.

Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что приведенное выше описание настоящего изобретения является иллюстративным, и иллюстративные варианты осуществления, раскрытые в настоящей заявке, могут быть легко преобразованы в другие конкретные формы без изменения технической сущности или существенных признаков настоящего изобретения. Следовательно, описанные выше примерные варианты осуществления следует интерпретировать как иллюстративные и не ограничивающие изобретение в каком-либо аспекте.

Промышленная применимость

Комплекс холестерина с агонистом толл-подобного рецептора 7/8 по настоящему изобретению является неактивным при введении в организм, но активируется при отделении от него холестерина в микроокружении опухоли и/или при определенных условиях в клетках. Следовательно, не только снижается побочный эффект агониста, такой, как неспецифический гиперчувствительный иммунный ответ, но агонист также может быть приготовлен в различных составах, поскольку он образует комплекс с холестерином, который ингибирует абсорбцию агониста в кровеносном сосуде, тем самым подавляя побочный эффект, такой, как цитокиновый шторм. Кроме того, поскольку комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина сам по себе может проявлять противоопухолевое действие за счет эффективной регуляции иммунных клеток, а этот эффект значительно усиливается при совместном введении комплекса с различными терапевтическими агентами против рака и иммунотерапевтическими агентами, ожидается, что комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина будет эффективно и широко использоваться для лечения различных заболеваний, при которых показано применение агонист толл-подобного рецептора.

1. Комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, в котором

холестерин связан с аминогруппой (NH₂) активного центра агониста толл-подобного рецептора 7/8,

где агонист толл-подобного рецептора 7/8 выбран из группы, состоящей из агониста на основе имидазохинолина, агониста на основе гидроксиаденина, агониста на основе птеридона, агониста на основе аминопиримидина, агониста на основе бензоазепина и агониста на основе тиа-оксогуанозина;

где связь является расщепляемой, причем расщепляемая связь является по меньшей мере одной связью, выбранной из группы, состоящей из карбаматной, дисульфидной, сложноэфирной, пептидной, азидной и их комбинации; и

где связь расщепляется в ответ на микроокружение опухоли, температуру, эндосомные и лизосомальные ферменты или pH в клетках, и активный центр агониста толл-подобного рецептора 7/8 обнажается.

2. Комплекс по п. 1, где кинетическая функция агониста толл-подобного рецептора 7/8 восстанавливается в течение 4 дней, когда связь расщепляется.

3. Адъювантная композиция, содержащая комплекс по п. 1 в качестве активного ингредиента.

4. Вакцинная композиция для предотвращения или лечения инфекционного заболевания, содержащая адъювантную композицию по п. 3 и антиген,

где композиция предотвращает или лечит инфекционное заболевание путем активации по меньшей мере одного типа иммунных клеток, выбранных из группы, состоящей из антигенпрезентирующих клеток, естественных киллерных клеток (NK-клеток) и Т-клеток; и/или

путем регуляции функции одного или нескольких типов иммунных клеток, выбранных из группы, состоящей из регуляторных Т-клеток (Treg), миелоидных супрессорных клеток (MDSC) и макрофагов М2.

5. Вакцинная композиция по п. 4, где антиген включает один или несколько антигенов, выбранных из группы, состоящей из белка, рекомбинантного белка, гликопротеина, гена, пептида, полисахарида, липополисахарида, полинуклеотида, клетки, клеточного лизата, бактерии и вируса.

6. Композиция для регуляции иммунной функции, включающая комплекс по п. 1 в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество или разбавитель,

при этом композиция предназначена для активации по меньшей мере одного типа иммунных клеток, выбранных из группы, состоящей из антигенпрезентирующих клеток, естественных киллерных клеток (NK-клеток) и Т-клеток; и/или

где композиция предназначена для регуляции функции одного или нескольких типов иммунных клеток, выбранных из группы, состоящей из регуляторных Т-клеток (Treg), миелоидных супрессорных клеток (MDSC) и макрофагов М2.

7. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения рака, включающая комплекс по п. 1 в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество или разбавитель.

8. Фармацевтическая композиция по п. 7, дополнительно включающая химиотерапевтический агент или ингибитор иммунной контрольной точки.

9. Фармацевтическая композиция по п. 7 для ингибирования пролиферации, метастазирования, рецидива рака или устойчивости к противоопухолевой терапии.

10. Способ профилактики или лечения рака, включающий:

введение субъекту композиции, содержащей комплекс по п. 1 в качестве активного ингредиента.

11. Применение композиции, содержащей комплекс по п. 1 в качестве активного ингредиента, для профилактики или лечения рака.

12. Применение комплекса по п. 1 для производства лекарственного средства, используемого для профилактики или лечения рака.

13. Наночастица, включающая комплекс агониста толл-подобного рецептора 7/8 и холестерина, в котором холестерин связан с аминогруппой (NH₂) активного центра агониста толл-подобного рецептора 7/8,

где агонист толл-подобного рецептора 7/8 выбран из группы, состоящей из агониста на основе имидазохинолина, агониста на основе гидроксиаденина, агониста на основе птеридона, агониста на основе аминопиримидина, агониста на основе бензоазепина и агониста на основе тиа-оксогуанозина;

где связь является расщепляемой, причем расщепляемая связь является по меньшей мере одной связью, выбранной из группы, состоящей из карбаматной, дисульфидной, сложноэфирной, пептидной, азидной и их комбинации;

где связь расщепляется в ответ на микроокружение опухоли, температуру, эндосомные и лизосомальные ферменты или pH в клетках, и активный центр агониста толл-подобного рецептора 7/8 обнажается и где

наночастица выбрана из группы, состоящей из нанолипосомы, наноэмульсии, наномицеллы, твердой наночастицы и полимерной наночастицы.