Замещенное оксопиридиновое производное
Изобретение относится к 5-({6-амино-2-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2H)-ил]-3-метилгексаноил}амино)пиразоло[1,5-а]пиридин-3-карбоксамиду формулы (I) или к одной из его солей. Технический результат – получено новое соединение, которое может найти применение в медицине в качестве ингибитора разрушающей активности калликреина плазмы для получения лекарственных средств для лечения и/или профилактики заболеваний, в частности сердечнососудистых заболеваний, предпочтительно тромботических или тромбоэмболических нарушений и отеков, а также офтальмологических нарушений. 2 з.п. ф-лы, 3 пр.
Настоящее изобретение относится к 5-({6-амино-2-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]-3-метилгексаноил}амино)пиразоло[1,5-а]пиридин-3-карбоксамиду, к способам его получения, к его применению для лечения и/или профилактики заболеваний и к его применению для получения лекарственных средств для лечения и/или профилактики заболеваний, в частности сердечнососудистых заболеваний, предпочтительно тромботических или тромбоэмболических нарушений и отеков, а также офтальмологических нарушений, и его применению для ингибирования разрушающей активности калликреина плазмы для проведения экстракорпоральных процедур и аналитических анализов.
Свертывание крови представляет собой защитный механизм организма, который помогает быстро и надежно «запаивать» дефекты стенки сосудов. Таким образом, потери крови можно избежать или свести ее к минимуму. Гемостаз после повреждения кровеносных сосудов осуществляется в основном системой свертывания крови, в которой запускается ферментативный каскад сложных реакций белков плазмы. В этот процесс вовлечены многочисленные факторы свертывания крови, каждый из которых при активации превращает соответствующий следующий неактивный предшественник в его активную форму. В конце каскада происходит превращение растворимого фибриногена в нерастворимый фибрин, в результате чего образуется сгусток крови.
Основное внимание направлено на тот факт, что система свертывания крови может быть активирована, в частности, на отрицательно заряженных поверхностях, которые включают не только поверхностные структуры чужеродных клеток (например, бактерий), но также и искусственные поверхности, такие как протезы сосудов, стенты и экстракопоральное кровообращение. На поверхности первоначально фактор XII (FXII) активируется до фактора XIIa, который впоследствии активирует фактор XI до фактора XIa. Кроме того, фактор XIIa также активирует прекалликреин плазмы (PPK) в калликреин плазмы (PK), который в петле потенцирования сначала приводит к дальнейшей активации фактора XII, что в целом приводит к усилению инициации каскада коагуляции. Кроме того, PK является важной протеазой, высвобождающей брадикинин, которая, среди прочего, таким образом, приводит к повышенной проницаемости эндотелия. Другими описанными субстратами являются проренин и проурокиназа, активация которых может влиять на регуляторные процессы ренин-ангиотензиновой системы и фибринолиза. Таким образом, активация PK является важным связующим между коагулятивными и воспалительными процессами.
Неконтролируемая активация системы свертывания или неполноценное ингибирование процессов активации может привести к образованию местных тромбозов или эмболий в сосудах (артериях, венах, лимфатических сосудах) или полостях сердца. Кроме того, системная гиперкоагуляция может привести к общесистемному образованию тромбов и, наконец, к коагулопатии потребления в контексте рассеянного внутрисосуд истого свертывания крови. Тромбоэмболические осложнения также могут возникать в экстракорпоральных системах кровообращения, например, во время гемодиализа, а также в сосудистых протезах или протезах сердечных клапанов и стентах.
Калликреин плазмы (PK) связаны с другими нарушениями, которые связаны с повышенной проницаемостью сосудов или хроническими воспалительными нарушениями, такими как диабетическая ретинопатия, макулярный отек и наследственный ангионевротический отек или хронические воспалительные кишечные нарушения. Диабетическая ретинопатия в первую очередь вызвана недостаточностью микрососудов, которая приводит к утолщению базальной мембраны сосудов и потере васкуляризированных перицитов с последующей окклюзией сосудов и ишемией сетчатки, которая из-за вызванной таким образом гипоксии сетчатки может привести к усилению проницаемости сосудов с последующим образованием макулярного отека и, из-за всех присутствующих процессов, к слепоте пациента. При наследственном ангионевротическом отеке (НАЕ) сниженное образование физиологического ингибитора калликреина ингибитора С1-эстеразы вызывает неконтролируемую активацию калликреина плазмы, что приводит к воспалениям с молниеносным образованием отека и сильными болями. На экспериментальных животных моделях есть указания на то, что ингибирование калликреина плазмы подавляет повышенную проницаемость сосудов и, следовательно, может предотвратить образование макулярного отека и/или диабетической ретинопатии или может уменьшать острые симптомы НАЕ. Пероральные ингибиторы калликреина плазмы также можно использовать для профилактики НАЕ.
Кинины, образуемые с помощью калликреина плазмы, в частности играют причинную роль в прогрессировании хронических воспалительных кишечных расстройств (CID). Их провоспалительный эффект за счет активации рецепторов брадикинина индуцирует и потенцирует прогрессирование заболевания. Исследования пациентов с болезнью Крона показывают корреляцию между концентрацией калликреина в эпителии кишечника и степенью воспаления кишечника. Активация калликреин-кининовой системы также наблюдалась в экспериментальных исследованиях на животных. Соответственно, ингибирование синтеза брадикинина ингибиторами калликреина можно использовать также для профилактики и/или лечения хронических воспалительных кишечных расстройств.
При многих нарушений комбинация антитромботических и противовоспалительных принципов также может быть особенно привлекательной для предотвращения взаимного усиления коагуляции и воспаления.
В WO 2006/030032, среди прочего, описаны замещенные пиридиноны в качестве аллостерических модуляторов рецептора mGluR2, и в WO 2008/079787 описаны замещенные пиридин-2-оны и их применение в качестве активаторов глюкокиназы. В WO2005/123680, WO 2014/154794, WO 2014/160592, WO 2015/011087, WO 2015/063093, WO 2015/120777, WO 2016/046156, WO 2016/046157, WO 2016/046158, WO 2016/046159, WO 2016/046164, WO 2016/046166, WO 2016/146606, WO 2017/005725, WO 2017/037051 и WO 2018/041122 описаны замещенные пиридин-2-оны и их применение в качестве ингибиторов фактора XIa и/или ингибиторов калликреина.
Таким образом, задача настоящего изобретения состоит в обеспечении нового соединения для лечения сердечнососудистых заболеваний, в частности тромботических или тромбоэмболических нарушений, у людей и животных, и для применения в биологических образцах, содержащих прекалликреин плазмы (PPK) или калликреин плазмы (PK), для предотвращения разрушающих эффектов, вызванных использованием калликреином плазмы физиологических и искусственных субстратов.
Неожиданно было обнаружено, что определенная замещенное оксопиридиновое производное является высокоэффективным и селективным ингибитором калликреина плазмы.
Настоящее изобретение обеспечивает соединение 5-({6-амино-2-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2H)-ил]-3-метилгексаноил}амино)пиразоло[1,5-а]пиридин-3-карбоксамид, которое соответствует соединению формулы (I)
и его соли, его сольваты и сольваты его солей.
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает соединение 5-({6-амино-2-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]-3-метилгексаноил}амино)пиразоло[1,5-а]пиридин-3-карбоксамид трифторацетат, которое соответствует соединению формулы (Ia)
Предпочтительным является соединение 5-({(2,5)-6-амино-2-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2H)-ил]-3-метилгексаноил}амино)пиразоло[1,5-а]пиридин-3-карбоксамид, которое соответствует соединению формулы (Ib)
и его соли, его сольваты и сольваты его солей.
Кроме того, предпочтительным является соединение 5-({(2S)-6-амино-2-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]-3-метилгексаноил}амино)пиразоло[1,5-а]пиридин-3-карбоксамид трифторацетат, которое соответствует соединению формулы (Ic)
Соединения согласно настоящему изобретению могут, в зависимости от их структуры, существовать в различных стереоизомерных формах, то есть в форме конфигурационных изомеров или, если необходимо, в виде конформационных изомеров (энантиомеров и/или диастереомеров, в том числе в случае атропоизомеров). Таким образом, настоящее изобретение охватывает энантиомеры и диастереомеры и их соответствующие смеси. Стереоизомерно однородные компоненты могут быть выделены из таких смесей энантиомеров и/или диастереомеров известным способом; для этого предпочтительно используются хроматографические способы, особенно ВЭЖХ хроматографию на ахиральной или хиральной фазе.
Если соединения согласно настоящему изобретению могут находиться в таутомерных формах, настоящее изобретение охватывает все таутомерные формы.
В контексте настоящего изобретения термин «энантиомерно чистый» следует понимать как означающий, что рассматриваемое соединение в отношении абсолютной конфигурации хирального центра присутствует в энантиомерном избытке более 95%, предпочтительно более 97%. Энантиомерный избыток, ее, вычисляют в контексте настоящего изобретения посредством оценки соответствующей хроматограммы ВЭЖХ на хиральной фазе с использованием формулы ниже:
ее = [ЕА (% по площади) - ЕВ (% по площади)] × 100% / [ЕА (% по площади) + ЕВ (% по площади)]
(ЕА: основной энантиомер, ЕВ: второстепенный энантиомер)
Настоящее изобретение также включает все подходящие изотопные варианты соединений согласно настоящему изобретению. Под изотопным вариантом соединения согласно настоящему изобретению в контексте настоящего изобретения понимается соединение, в котором по меньшей мере один атом в соединении согласно настоящему изобретению был заменен на другой атом с тем же атомным номером, но с другой атомной массой, чем атомная масса, которая обычно или преимущественно встречается в природе. Примерами изотопов, которые могут быть включены в соединение согласно настоящему изобретению, являются изотопы водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, серы, фтора, хлора, брома и йода, такие как 2Н (дейтерий), 3Н (тритий), 13С, 14С, 15N, 17O, 18O и 36Cl. Конкретные изотопные варианты соединения согласно настоящему изобретению, особенно те, в которых были включены один или более радиоактивных изотопов, могут быть предпочтительными, например, для изучения механизма действия или распределения активного соединения в организме; благодаря сравнительно легкому получению и определению, соединения, помеченные 3Н- или 14С-изотопами, являются особенно подходящими в этих целях. Кроме того, включение изотопов, например, дейтерия, может привести к особенным терапевтическим преимуществам, благодаря большей метаболической стабильности соединения, например, увеличению периода полураспада в организме или уменьшению требуемой активной дозы; поэтому такие модификации соединений согласно настоящему изобретению могут, в некоторых случаях, также представлять собой предпочтительный вариант выполнения применения согласно настоящему изобретению. Изотопные варианты соединений согласно настоящему изобретению могут быть получены способами, известными специалистам в данной области техники, например, способами, описанными далее, и методиками, описанными в рабочих примерах, посредством применения соответствующих изотопных модификаций соответствующих реагентов и/или исходных соединений.
Предпочтительные соли в контексте настоящего изобретения представляют собой физиологически приемлемые соли соединений согласно настоящему изобретению. Однако настоящее изобретение также включает соли, которые сами по себе непригодны для фармацевтического применения, но могут быть использованы, например, для выделения или очистки соединений согласно настоящему изобретению.
Физиологически приемлемые соли соединений согласно настоящему изобретению включают кислотно-аддитивные соли минеральных кислот, карбоновых кислот и сульфоновых кислот, например, соли соляной кислоты, бромистоводородной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, метансульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, толуолсульфоновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, нафталиндисульфоновой кислоты, уксусной кислоты, трифторуксусной кислоты, пропионовой кислоты, молочной кислоты, винной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, фумаровой кислоты, малеиновой кислоты и бензойной кислоты.
В контексте настоящего изобретения сольватами обозначены те формы соединений согласно настоящему изобретению, которые образуют комплекс в твердом или жидком состоянии за счет координации с молекулами растворителя. Гидраты представляют собой особую форму сольватов, в которых координация осуществляется с водой.
Настоящее изобретение дополнительно также охватывает пролекарства соединений согласно настоящему изобретению. Термин «пролекарства» охватывает соединения, которые со своей стороны могут быть биологически активными или неактивными, но превращаются во время своего пребывания в организме в соединения согласно настоящему изобретению (например, путем метаболизма или гидролиза).
В контексте настоящего изобретения термин «лечение» или «лечить» включает ингибирование, замедление, проверку, облегчение, ослабление, ограничение, уменьшение, подавление, исключение или исцеление заболевания, состояния, нарушения, травмы или проблемы со здоровьем или развитием, течение или прогрессирование таких состояний и/или симптомы таких состояний. Термин «терапия» используется в настоящем документе как синоним термина «лечение».
Термины «предупреждение», «профилактика» и «предотвращение» используются как синонимы в контексте настоящего изобретения и относятся к предотвращению или снижению риска возникновения, испытания, страдания от или наличия заболевания, состояния, нарушения, травмы или проблемы со здоровьем, или развитие или прогрессирование таких состояний и/или симптомов таких состояний.
Лечение или профилактика заболевания, состояния, нарушения, травмы или проблемы со здоровьем могут быть частичными или полными.
Настоящее изобретение обеспечивает способ получения соединений формулы (I), (Ia), (Ib) и (Ic), или их солей, их сольватов или сольватов их солей. Соединения могут быть синтезированы как проиллюстрировано на схеме синтеза 1:
Схема 1:
Соединения согласно настоящему изобретению обладают непредвиденным спектром полезной фармакологической активности. Это соединения, которые влияют на протеолитическую активность сериновой протеазы калликреин плазмы (PK). Соединения согласно настоящему изобретению ингибируют ферментативное расщепление субстратов, катализируемое PK, которое играет важную роль в активации свертывания крови, в агрегации тромбоцитов и в воспалительных процессах, которые, в частности, включают увеличение проницаемости сосудов.
Поэтому они подходят для применения в качестве лекарственных средств для лечения и/или профилактики заболеваний у людей и животных.
Настоящее изобретение также обеспечивает применение соединений согласно настоящему изобретению для лечения и/или профилактики нарушений, в частности сердечнососудистых заболеваний, предпочтительно тромботических или тромбоэмболических нарушений и/или тромботических или тромбоэмболических осложнений, и/или офтальмологических нарушения, в частности диабетической ретинопатии или макулярного отека, и/или воспалительных нарушений, в частности тех, которые связаны с избыточной активностью калликреина плазмы, таких как наследственный ангионевротический отек (НАЕ), или хронические воспалительные заболевания, особенно кишечника, такие как болезнь Крона.
Фактор XIIa активирует прекалликреин плазмы (PPK) в калликреин плазмы (PK) в контексте внутренней активации, которая, среди прочего, в петле потенцирования, приводит к дальнейшей активации фактора XII, что в целом приводит к усилению инициирования каскада свертывания крови на поверхности. Таким образом, PK-ингибирующая активность соединения согласно настоящему изобретению снижает коагуляцию за счет активации поверхности и, таким образом, оказывает антикоагулянтный эффект.
Соответственно, соединения согласно настоящему изобретению являются подходящими для лечения и/или профилактики нарушений или осложнений, которые могут возникать в результате образования сгустков.
В контексте настоящего изобретения «тромботические или тромбоэмболические заболевания» включают заболевания, которые возникают как в артериальной, так и в венозной сосудистой сети и которые можно лечить с помощью соединений согласно настоящему изобретению, в частности нарушения в коронарных артериях сердца, такие как острый коронарный синдром (ACS), инфаркт миокарда с подъемом сегмента ST (STEMI) и без подъема сегмента ST (не STEMI), стабильная стенокардия, нестабильная стенокардия, реокклюзия и рестеноз после коронарные вмешательства, такого как ангиопластика, имплантация стента или аортокоронарное шунтирование, а также тромботические или тромбоэмболические нарушения в других сосудах, приводящие к окклюзионным нарушениям периферических артерий, тромбоэмболии легочной артерии, тромбоэмболии вен, тромбозу вен, особенно в глубоких венах ног и почках, временные ишемические приступы, а также тромботический инсульт и тромбоэмболический инсульт.
Стимуляция системы свертывания может происходить по разным причинам или связанным нарушениям. В контексте хирургических вмешательств, неподвижности, прикованности к постели, инфекций, воспаления или рака или терапии рака, среди прочего, система коагуляции может быть высоко активирована, и могут быть тромботические осложнения, в частности венозные тромбозы. Соединения согласно настоящему изобретению поэтому подходят для профилактики тромбозов в контексте хирургических вмешательств у пациентов, страдающих раком. Таким образом, соединения согласно настоящему изобретению также подходят для профилактики тромбозов у пациентов, имеющих активированную систему коагуляции, например, в описанных ситуациях стимуляции.
Соединения согласно настоящему изобретению поэтому также подходят для профилактики и лечения кардиогенных тромбоэмболий, например ишемии головного мозга, инсульта и системных тромбоэмболий и ишемий, у пациентов с острыми, прерывистыми или постоянными нарушениями сердечного ритма, например, мерцательной аритмии, и у пациентов, перенесших кардиостимуляцию электрошоком, а также у пациентов с нарушениями клапанов сердца или с искусственными клапанами сердца.
Кроме того, жидкие соединения согласно настоящему изобретению подходят для лечения и профилактики генерализованного тромбогеморрагического синдрома (DIC), который может возникнуть, в частности, в связи с сепсисом, а также вследствие хирургических вмешательств, опухолевых расстройств, ожогов или других травм и может привести к серьезным повреждениям органов вследствие микротромбозов.
Кроме того, тромбоэмболические осложнения возникают при микроангиопатических гемолитических анемиях и при контакте крови с инородными поверхностями в контексте экстракорпорального кровообращения, например, гемодиализ, ЕСМО («экстракорпоральная мембранная оксигенация»), LVAD («вспомогательное устройство левого желудочка») и аналогичные методы, AV фистулами, протезами сосудов и клапанов сердца.
Более того, соединения согласно настоящему изобретению подходят для лечения и/или профилактики нарушений, включающих образование микросгустка или отложение фибрина в кровеносных сосудах головного мозга, которые могут привести к расстройствам деменции, таким как сосудистая деменция или болезнь Альцгеймера. Здесь сгусток может способствовать расстройству как через окклюзию, так и путем связывания других факторов, связанных с заболеванием.
Более того, соединения согласно настоящему изобретению подходят для лечения и/или профилактики заболеваний, при которых, помимо прокоагулянтного компонента, провоспалительный компонент также играет важную роль. Взаимное усиление свертывания крови и воспаления, в частности, можно предотвратить с помощью соединений согласно настоящему изобретению, тем самым значительно снижая вероятность тромботических осложнений. В этом случае как компонент, ингибирующий фактор XIa (за счет ингибирования продукции тромбина), так и компонент, ингибирующий PK, могут способствовать антикоагулянтному и противовоспалительному эффекту (например, через брадикинин). Таким образом, могут быть рассмотрены, среди прочего, для лечения и/или профилактики в контексте атеросклеротических сосудистых нарушений, воспалительных процессов в контексте ревматических нарушений опорно-двигательной системы, воспалительных нарушений легкого, таких как легочные фиброзы, воспалительных заболеваний почек, таких как гломерулонефриты, воспалительных нарушений кишечника, таких как болезнь Крона или язвенный колит, или нарушений, которые могут присутствовать в контексте основного диабетического заболевания, такого как диабетическая ретинопатия или нефропатия.
Кинины, образуемые с помощью калликреина плазмов, в частности играют причинную роль в прогрессировании хронических воспалительных кишечных расстройств (CID). Их провоспалительный эффект за счет активации рецепторов брадикинина индуцирует и потенцирует прогрессирование заболевания. Исследования пациентов с болезнью Крона показывают корреляцию между концентрацией калликреина в эпителии кишечника и степенью воспаления кишечника. Активация калликреин-кининовой системы также наблюдалась в экспериментальных исследованиях на животных. Соответственно, ингибирование синтеза брадикинина ингибиторами калликреина можно использовать также для профилактики и/или лечения хронических воспалительных кишечных расстройств.
Более того, соединения согласно настоящему изобретению могут применяться для ингибирования роста опухоли и образования метастаз, а также для профилактики и/или лечения тромбоэмболических осложнений, например, венозные тромбоэмболии у онкологических больных, в частности тех, которые подвергаются серьезным хирургическим вмешательствам или химио- или лучевой терапии
Кроме того, соединения согласно настоящему изобретению также являются подходящими для лечения и/или профилактики диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови в контексте инфекционного заболевания и/или системного воспалительного синдрома (SIRS), септической дисфункции органа, недостаточность септического органной недостаточности и полиорганной недостаточности, синдрома острой дыхательной недостаточности (ARDS), острого повреждения легких (ALI), септического шока и/или септической органной недостаточности.
В ходе инфекции может происходить общая активация системы коагуляции (диссеминированная внутрисосудистая коагуляция крови или коагулопатия потребления, в дальнейшем называемая «DIC») с микротромбозом в различных органах и вторичными геморрагическими осложнениями. Кроме того, может иметь место повреждение эндотелия с повышенной проницаемостью сосудов и диффузией жидкости и белков в экстравазальное пространство. По мере развития инфекции может иметь место нарушение работы органа (например, почечная недостаточность, печеночная недостаточность, дыхательная недостаточность, дефицит центральной нервной системы и сердечно-сосудистая недостаточность) или полиорганная недостаточность.
В случае DIC происходит массивная активация системы коагуляции на поверхности поврежденных эндотелиальных клеток, на поверхностях инородных тел или сшитых внесосудистых тканей. Как следствие происходит коагуляция в мелких сосудах различных органов с гипоксией и последующей дисфункцией органов. Вторичным эффектом является расход факторов свертывания (например, фактор X, протромбин и фибриноген) и тромбоцитов, что снижает свертываемость крови и может привести к сильному кровотечению.
Помимо антикоагулянтной активности, калликреин плазмы представляет собой важную протеазу, высвобождающую брадикинин, который, среди прочего, приводит к повышенной проницаемости эндотелия. Таким образом, соединения можно использовать для лечения и/или профилактики нарушений, включающих образования отеков, таких как офтальмологические нарушения, в частности, диабетическая ретинопатия, макулярный отек или наследственный ангионевротический отек.
"Офтальмологические заболевания" в контексте настоящего изобретения включают в частности нарушения, такие как диабетическая ретинопатия, диабетический макулярный отек (DME), макулярный отек, макулярный отек, ассоциированный с окклюзией вен сетчатки, возрастная дегенерация желтого пятна (AMD), включая сухую (неэкссудативную) и влажную (экссудативную, неоваскулярную) AMD, хориоидальная неоваскуляризация (CNV), хориоидальные неоваскулярные мембраны (CNVM), цистоидный макулярный отек (СМЕ), эпиретинальные мембраны (ERM) и макулярный разрыв сетчатки, хориоидальная неоваскуляризация, ассоциированная с миопией, ангиоидные и сосудистые полосы, отслоение сетчатки, атрофические и гипертрофические изменения пигментного эпителия сетчатки, венозная окклюзия сетчатки, хориоидальная венозная окклюзия сетчатки, пигментный ретинит, болезнь Штаргардта, преждевременная ретинопатия, глаукома, воспалительные заболевания глаз, например, увеит, склерит или эндофтальмит, катаракта, рефракционные аномалии, например, близорукость, гиперметропия, астигматизм или кератоконус, ангиогенез роговицы как следствие, например, кератита, трансплантации роговицы или кератопластики, ангиогенез роговицы как следствие гипоксии (например, в результате продолжительного ношения контактных линз), птеригиум конъюктивы, суброговичный отек и отек внутри роговицы.
Соединения согласно настоящему изобретению также являются подходящими для первичной профилактики тромботических или тромбоэмболических нарушений и/или воспалительных нарушений и/или нарушений с повышенной проницаемостью сосудов у пациентов, у которых генные мутации приводят к повышенной активности ферментов или повышенным уровням зимогенов, и они установлены соответствующими тестами/измерениями активности фермента или концентраций зимогена.
Настоящее изобретение также обеспечивает для применения соединений согласно настоящему изобретению для лечения и/или профилактики нарушений, особенно нарушений, упомянутых выше.
Настоящее изобретение также обеспечивает для применения соединений согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики нарушений, особенно нарушений, упомянутых выше.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения и/или профилактики нарушений, особенно нарушений, упомянутых выше, применяя терапевтически эффективное количество соединения согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение также обеспечивает соединения согласно настоящему изобретению для применения в способе лечения и/или профилактики нарушений, особенно нарушений, упомянутых выше, применяя терапевтически эффективное количество соединения согласно настоящему изобретению.
В частности, настоящее изобретение обеспечивает соединения согласно настоящему изобретению для применения в способе лечения и/или профилактики тромботических или тромбоэмболических нарушений с использованием терапевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению.
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает лекарственные средства, содержащие соединение согласно настоящему изобретению и одно или более других активных соединений.
Кроме того, соединения согласно настоящему изобретению также можно применять для предотвращения коагуляции ex vivo, например, для защиты органов, подлежащих трансплантации, от повреждения органа, вызванного образованием сгустков, и для защиты органа-реципиента от тромбоэмболов из трансплантированного органа, для консервирования продуктов крови и плазмы, для очистки/предварительной обработки катетеров и других медицинских вспомогательных средств и инструментов, для покрытия синтетических поверхностей вспомогательных медицинских средств и инструментов, используемых in vivo или ex vivo.
Соединения согласно настоящему изобретению также можно применять в биологических образцах, содержащих прекалликреин плазмы (PPK) или калликреин плазмы (PK), для предотвращения разрушающих эффектов, вызванных использованием калликреином плазмы физиологических и искусственных субстратов.
Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает способ предотвращения коагуляции крови in vitro, в частности, в банках крови или биологических образцах, которые могут содержать калликреин плазмы, причем способ отличается тем, что добавляют антикоагулянтно эффективное количество соединения согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение также относится к лекарственным средствам, содержащим соединение согласно настоящему изобретению и одно или более дополнительных активных соединений, в частности для лечения и/или профилактики нарушений, упомянутых выше.
«Комбинации» в контексте настоящего изобретения означают не только лекарственные формы, которые содержат все компоненты (так называемые фиксированные комбинации) и комбинированные упаковки, которые содержат компоненты, отдельные друг от друга, но также компоненты, которые вводятся одновременно или последовательно, при условии, что они используются для профилактики и/или лечения одного и того же заболевания. Также возможно комбинировать два или более активных ингредиента друг с другом, что означает, что каждый из них, таким образом, находится в двухкомпонентных или многокомпонентных комбинациях.
Соединения согласно настоящему изобретению могут действовать системно и/или местно. Для этой цели их можно вводить подходящим способом, например, пероральным, парентеральным, легочным, назальным, сублингвальным, лингвальным, буккальным, ректальным, кожным, трансдермальным, конъюнктивальным или ушным путем, или в виде имплантата или стента.
Соединения согласно настоящему изобретению можно вводить в формах введения, подходящих для этих способов введения.
Для орального применения пригодны действующие согласно уровню техники формы применения, и доставляющие соединение согласно изобретению быстро и/или модифицированным образом, и которые содержат соединения согласно изобретению в кристаллической и/или аморфной и/или растворенной форме, такие как например, таблетки (непокрытые или покрытые оболочкой, например, с устойчивыми к действию желудочного сока или растворяющимися с задержкой или нерастворимыми оболочками, которые контролируют высвобождение соединения согласно изобретению), быстро распадающиеся в полости рта таблетки или пленки/облатки, пленки/лиофилизаты, капсулы (например, твердые или мягкие желатиновые капсулы), драже, гранулят, пеллеты, порошки, эмульсии, суспензии, аэрозоли или растворы.
Парентеральный прием может происходить в обход стадии всасывания (например, внутривенно, внутриартериально, внутрисердечно, интраспинально или интралюмбально) или при включении процесса всасывания (например, внутримышечно, подкожно, внутрикожно, чрескожно или внутрибрюшинно). Для парентерального применения в качестве форм применения подходят, среди прочего, препараты для инъекции и вливания в форме растворов, суспензий, эмульсий, лиофилизатов или стерильных порошков.
Для экстраокулярного (топического) введения подходят формы введения, которые действуют в соответствии с предшествующим уровнем техники, которые высвобождают активное соединение быстро и/или модифицированным или контролируемым образом и которые содержат активное соединение в кристаллической и/или аморфизированной, и или растворенном форма, как например, глазные капли, спреи и лосьоны (например, растворы, суспензии, везикулярные/коллоидные системы, эмульсии, аэрозоли), порошки для глазных капель, спреи и лосьоны (например, измельченное активное соединение, смеси, лиофилизаты, осажденное активное соединение), полутвердые препараты для глаз (например, гидрогели, гидрогели in-situ, кремы и мази), вкладыши для глаз (твердые и полутвердые препараты, например, биоадгезивы, пленки/пластины, таблетки, контактные линзы).
Внутриглазное введение включает, например, интравитреальное, субретинальное, субсклеральное, интрахориоидальное, субконъюнктивальное, ретробульбарное и субтеноновое введение. Для внутриглазного введения подходят формы для введения, которые действуют в соответствии с предшествующим уровнем техники, которые высвобождают активное соединение быстро и/или модифицированным или контролируемым образом и которые содержат активное соединение в кристаллической и/или аморфизированной, и/или растворенной форме, как например, препараты для инъекций и концентраты для препаратов для инъекций (например, растворы, суспензии, везикулярные/коллоидные системы, эмульсии), порошки для препаратов для инъекций (например, измельченное активное соединение, смеси, лиофилизаты, осажденное активное соединение), гели для препаратов для инъекций (полутвердые препараты, например, гидрогели, гидрогели in situ) и имплантаты (твердые препараты, например, биоразлагаемые и небиоразлагаемые имплантаты, имплантируемые насосы).
Предпочтение отдается пероральному введению или, в случае офтальмологических нарушений, экстраокулярному и внутриглазному введению.
Для прочих способов приема подходят, например, лекарственные формы для ингаляции (в том числе, порошковые ингаляторы, распылители), капли, растворы или спреи для носа, принимаемые на язык, под язык или трансбуккально таблетки, пленки/об латки или капсулы, свечи, ушные или глазные препараты, вагинальные капсулы, водные суспензии (лосьоны, болтушки), липофильные суспензии, мази, кремы, трансдермальные терапевтические системы (например, пластырь), молочко, пасты, пенки, присыпки, имплантаты или стенты.
Соединения согласно настоящему изобретению могут переводиться в указанные формы применения. Это может осуществляться известным способом путем смешивания с инертными, нетоксичными, приемлемыми в фармацевтике вспомогательными веществами. К таким вспомогательным веществам причисляют, в том числе, вещества-носители (например, микрокристаллическую целлюлозу, лактозу, маннитол), растворители (например, жидкий полиэтиленгликоль), эмульгаторы и диспергирующие или смачивающие средства (например, додецилсульфат натрия, полиоксисорбитанолеат), связующие средства (например, поливинилпирролидон), синтетические и природные полимеры (например, альбумин), стабилизаторы (например, антиоксиданты, такие как например аскорбиновая кислота), красители (например, неорганические пигменты, такие как, к примеру, оксид железа) и вещества, улучшающие вкус и/или запах.
Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает лекарственные средства, содержащие по меньшей мере одно соединение согласно настоящему изобретению, предпочтительно совместно с одним или более инертными нетоксичными фармацевтически приемлемыми эксципиентами, и их применения в указанных выше целях.
В случае парентерального введения в общем было обнаружено, что для достижения эффективных результатов предпочтительно вводить количества от около 5 до 250 мг каждые 24 часа. В случае перорального введения количество составляет от около 5 до 500 мг каждые 24 часа.
Несмотря на это, при необходимости может потребоваться отклонение от указанных количеств, в частности, в зависимости от массы тела, пути введения, индивидуального поведения по отношению к активному ингредиенту, типа препарата и времени или интервала введения.
Если не указано иное, проценты в испытаниях и примерах, которые следуют ниже, являются процентами по массе; части являются массовыми частями. Соотношения растворителей, коэффициенты разбавления и данные по концентрации для растворов жидкость/жидкость основаны в каждом случае на объеме. «Мас/об» означает «масса/объем». Например, «10% мас/об» означает: 100 мл раствора или суспензии содержат 10 г вещества.
А) Примеры
Аббревиатуры:
aq. - водный
Boc - трет-бутил оксикарбонил
Br - широкий (в ЯМР)
Brsm - На основе извлеченного исходного вещества
D - день(дни), дублет (в ЯМР)
Dd - Дублет дублетов (в ЯМР)
Ddd - Дублет дублета дублета (в ЯМР)
DMF - N,N-диметилформамид
DMSO - Диметилсульфоксид
ESI - Ионизация электрораспылением (в MS)
ч - час(часы)
HATU - O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат
ВЭЖХ - Высокоэффективная жидкостная хроматография высокого давления
HV - Высокий вакуум
LC-MS - Mac-спектрометрия, связанная с жидкостной хроматографией
М - мультиплет (в ЯМР)
Мин - минута(минуты)
MS - Mac-спектроскопия
ЯМР - Спектроскопия ядерного магнитного резонанса
Rt - Время удерживания (в ВЭЖХ)
S - синглет (в ЯМР)
Т - триплет (в ЯМР)
THF - тетрагидрофуран
TFA - трифторуксусная кислота
Т3Р - 2,4,6-трипропил-1,3,5,2,4,6-триоксатрифосфина 2,4,6-триоксид
LC-MS способы:
Способ 1: Устройство MS: Thermo Scientific FT-MS; ВЭЖХ устройство: Thermo Scientific UltiMate 3000; колонка: Waters Acquity UPLC HSS T3, 100 
, 1.8 мкм, 2.1 мм × 75 мм; Элюент A: 1 л воды + 0.01% муравьиной кислоты; Элюент В: 1 л ацетонитрила + 0.01% муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 10% В → 2.5 мин 95% В → 3.5 мин 95% В; печь: 50°С; поток: 0.90 мл/мин; УФ-обнаружение: 210 нм/ оптимальный путь интеграции 210-300 нм.
Способ 2: Устройство: Waters ACQUITY SQD UPLC System; колонка: Waters Acquity UPLC HSS T3, 100 , 1.8 мкм; 1 мм × 50 мм; Элюент A: 1 л воды + 0.25 мл 99% муравьиной кислоты, Элюент В: 1 л ацетонитрила + 0.25 мл 99% муравьиной кислоты; градиент: 0.0 мин 90% А → 1.2 мин 5% А → 2.0 мин 5% А; печь: 50°С; поток: 0.40 мл/мин; УФ-обнаружение: 210 нм.
Когда соединения согласно настоящему изобретению очищают хроматографией, в которой элюенты содержат добавки, например трифторуксусную кислоту, муравьиную кислоту или аммиак, соединения согласно настоящему изобретению могут быть получены в форме соли, например, как трифторацетат, формиат или соль аммония, если соединения согласно настоящему изобретению содержат достаточно основную или кислотную функциональность. Такую соль можно превратить в соответствующее свободное основание или кислоту различными способами, известными специалисту в данной области техники.
В случае синтеза промежуточных соединений и рабочих примеров настоящего изобретения, описанных ниже, любое соединение, указанное в форме соли соответствующего основания или кислоты, обычно представляет собой соль неизвестного точного стехиометрического состава, полученную с помощью соответствующего способа получения и/или очистки. Если не указано более подробно, дополнения к названиям и структурным формулам, такие как «гидрохлорид», «трифторацетат», «натриевая соль» или «х HCl», «х CF3COOH», «х Na+», поэтому не следует понимать в стехиометрическом смысле в случае таких солей, так как они имеют только описательный характер в отношении присутствующих в них солеобразующих компонентов.
Это применимо соответственно, если промежуточные соединения синтеза или рабочие примеры или их соли были получены в форме сольватов, например гидратов, неизвестного стехиометрического состава (если они имеют определенный тип) с помощью описанных способов получения и/или очистки.
Исходные соединения
Пример 1А
(2E)-Бут-2-ен-1-ил[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]ацетат
Смесь 4-хлор-2-(5-метокси-2-oxo-1,2-дигидропиридин-4-ил)бензонитрила [CAS-RN 1630193-83-7; WO 2015/063093, стр. 73f., пример 2.1С] (11.3 г, 43.2 ммоль), (2E)-бут-2-ен-1-ил бромацетата [CAS-RN 93455-19-7; S. М. Weinreb et al., J. Org. Chem. 1984, 49, 5058-5064] (10.0 г, 51.8 ммоль) и карбоната калия (8.95 г, 64.8 ммоль) в DMF (90 мл) нагревали до 100°С в течение 45 мин. Затем растворитель удаляли в вакууме. Воду добавляли, и смесь экстрагировали три раза этилацетатом. Объединенные органические слои промывали солевым раствором и сушили над сульфатом натрия. Растворитель выпаривали, и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель; элюент: градиент циклогексан-этилацетат) с получением 10.8 г (92% чистота, 62% выход) указанного в названии соединения.
LC-MS (Способ 2): Rt = 0.92 мин; MS (ESIpos): m/z = 373 [М+Н]+
1Н-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ [ppm] = 8.01-7.97 (m, 1H), 7.75-7.71 (m, 2Н), 7.58 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 5.88-5.78 (m, 1H), 5.65-5.55 (m, 1H), 4.74 (s, 2Н), 4.59 (d, 2Н), 3.62 (s, 3Н), 1.70 (dd, 3Н).
Пример 2А
2-[4-(5-Хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2H)-ил]-3-метилпент-4-еновая кислота (рацемическая смесь диастереомеров)
(2E)-Бут-2-ен-1-ил [4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопирид ин-1(2Н)-ил]ацетат (10.8 г, 92% чистота, 26.7 ммоль) растворяли в THF (150 мл) и охлаждали до -78°С. Лития бис(триметилсилил)амид (58 мл, 1.0 М в THF, 58 ммоль) добавляли. Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при -78°С. Затем, хлор(триметил)силан (7.4 мл, 58 ммоль) добавляли. Нагревали до 60°С и перемешивали в течение 1 ч. К реакционной смеси добавляли воду и ее подкисляли 1 Н соляной кислотой. Трижды экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические слои трижды экстрагировали 1 Н водным раствором гидроксида натрия. Объединенные основные слои подкисляли 4 Н водной соляной кислотой и пять раз экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические фазы сушили над сульфатом натрия, и растворитель выпаривали с получением 6,95 г (выход 70%) указанного в названии соединения as а рацемическая смесь диастереомеров (соотношение 38:62).
LC-MS (Способ 1): Rt = 1.59 мин (второстепенный изомер), 1.62 мин (основной изомер); MS (ESIpos): m/z = 373 [М+Н]+
1Н-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ [ppm] = 13.16 (br s, 1H), 7.99 (d, 1H основной изомер) и 7.98 (d, 1H второстепенный изомер), 7.76-7.69 (m, 2Н), 7.44 (s, 1H основной) и 7.38 (s, 1H второстепенный), 6.52 (s, 1H основной) и 6.46 (s, 1H второстепенный), 5.95 (ddd, 1H основной) и 5.59 (ddd, 1H второстепенный), 5.20 (d, 1H основной) и 5.02 (d, 1H второстепенный), 5.18-5.15 (m, 1H), 5.11 (dd, 1H основной) и 4.92 (dd, 1H второстепенный), 3.65 (s, 3Н основной) и 3.62 (s, 3Н второстепенный), 3.26-3.11 (m, 1H), 1.18 (d, 3Н второстепенный) и 0.87 (d, 3Н основной).
Пример 3А
2-[4-(5-Хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2H)-ил]-3-метил-N-(проп-2-ен-1-ил)-пент-4-енамид (рацемическая смесь диастереомеров)
2-[4-(5-Хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2H)-ил]-3-метилпент-4-еновую кислоту (рацемическая смесь диастереомеров) (4.00 г, 10.7 ммоль) и проп-2-ен-1-амин (12 мл, 160 ммоль) растворяли в пиридине (40 мл) и нагревали до 60°С. Раствор Т3Р в этилацетате (19 мл, 50% чистота, 32 ммоль) добавляли по каплям, и смесь далее перемешивали при 60°С в течение 1 часа. Добавляли воду и трижды экстрагировали этилацетатом. Добавляли воду и трижды объединенные органические слои высушивали над сульфатом натрияэкстрагировали этилацетатом, и растворитель удаляли в вакууме. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель; элюент: градиент циклогексан-этилацетат) с получением 2.56 г (58% выход) указанного в названии соединения в виде смеси диастереомеров.
LC-MS (Способ 1): Rt = 1.81 мин; MS (ESIpos): m/z = 412 [М+Н]+
1Н-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ [ppm] = 8.84 (t, 1H второстепенный изомер) и 8.69 (t, 1H основной изомер), 7.99 (d, 1H основной) и 7.97 (d, 1H второстепенный), 7.76-7.68 (m, 2Н), 7.64 (s, 1H основной) и 7.62 (s, 1H второстепенный), 6.52 (s, 1H основной) и 6.46 (s, 1H второстепенный), 5.89-5.43 (m, 3Н), 5.22-4.89 (m, 4Н), 3.85-3.60 (m, 2Н), 3.65 (s, 3Н основной) и 3.64 (s, 3Н второстепенный), 3.13-2.95 (m, 1H), 1.08 (d, 3Н второстепенный) и 0.83 (d, 3Н основной).
Пример 4А
трет-бутил аллил{2-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]-3-метилпент-4-еноил}карбамат (рацемическая смесь диастереомеров)
2-[4-(5-Хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2H)-ил]-3-метил-N-(проп-2-ен-1-ил)пент-4-енамид (рацемическая смесь диастереомеров) (2.50 г, 6.07 ммоль) растворяли в ацетонитриле (120 мл). Ди-трет-бутил дикарбонат (2.8 мл, 12 ммоль) и 4-диметиламинопиридин (297 мг, 2.43 ммоль) добавляли, и смесьнагревали до 60°С в течение 1 ч. Затем смесь концентрировали в вакууме, и остаток непосредственно очищали с помощью колоночной хроматографии(силикагель; элюент: градиент циклогексан-этилацетат) с получением 3.07 г (99% выход) указанного в названии соединения в виде смеси диастереомеров.
LC-MS (Способ 1): Rt = 2.41 мин; MS (ESIpos): m/z = 512 [М+Н]+
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ [ppm] = 7.99 (d, 1H основной изомер) и 7.97 (d, 1H второстепенный изомер), 7.75-7.63 (m, 2Н), 7.42 (s, 1H основной) и 7.39 (s, 1H второстепенный), 6.51 (s, 1H основной) и 6.46 (s, 1H второстепенный), 6.45 (br. d, 1H основной) и 6.36 (br. d, 1H второстепенный), 5.96-5.58 (m, 2Н), 5.22-4.92 (m, 4Н), 4.24-4.07 (m, 2Н), 3.66 (s, 3Н основной) и 3.62 (s, 3Н второстепенный), 3.35-3.20 (m, 1H), 1.484 (s, 9Н второстепенный) и 1.478 (s, 9Н основной), 1.16 (d, 3Н второстепенный) и 0.89 (d, 3Н основной).
Пример 5А
Трет-бутил 3-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]-4-метил-2-оксо-2,3,4,7-тетрагидро-1H-азепин-1-карбоксилат (рацемическая смесь диастереомеров)
Трет-бутил аллил{2-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]-3-метилпент-4-еноил}карбамат (рацемическая смесь диастереомеров) (3.00 г, 5.86 ммоль) растворяли в дихлорметан (1.0 1), и раствор дегазировали (атмосфера аргона). Бензилиден[1,3-бис(2,4,6-триметилфенил)имидазолидин-2-илиден]дихлоридрутения-трициклогексилфосфан (1/1) [CAS-RN 246047-72-3] (249 мг, 293 мкмоль) добавляли, и реакционную смесь перемешивали при 45°С в течение 1.5 ч. Затем насыщенный водный раствор бикарбонатта натрия добавляли. Органический слой отделяли, и водный слой дважды экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические слои промывали солевым раствором и сушили над сульфатом натрия. Растворитель выпаривали, и остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель; элюент: градиент циклогексан-этилацетат) с получением 2.75 г (97% выход) указанного в названии соединения в виде смеси диастереомеров.
LC-MS (Способ 1): Rt = 2.04 (основной изомер) и 2.06 мин (второстепенный изомер); MS (ESIneg): m/z = 482 [М-Н]-
1Н-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ [ppm] = 8.01 (m, 1H второстепенный изомер) и 8.00 (d, 1H основной изомер), 7.78-7.71 (m, 2Н), 7.47 (s, 1H основной) и 7.31 (s, 1H, второстепенный), 6.60 (s, 1H второстепенный) и 6.56 (s, 1H основной), 6.34 (d, 1H основной) и 6.18 (d, 1H второстепенный), 6.03-5.94 (m, 1H), 5.90-5.83 (m, 1H второстепенный) и 5.83-5.77 (m, 1H основной), 4.57 (dd, 1H второстепенный) и 4.47 (dd, 1H основной), 4.44-4.33 (m, 1H), 3.684 (s, 3Н второстепенный) и 3.676 (s, 3Н основной), 3.48-3.38 (m, 1H основной), 3.07-2.97 (m, 1H второстепенный), 1.46 (s, 9Н основной) и 1.45 (s, 9Н второстепенный), 1.18 (d, 3Н второстепенный) и 0.91 (d, 3Н основной).
Пример 6А
Трет-бутил 3-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]-4-метил-2-оксоазепан-1-карбоксилат (рацемическая смесь диастереомеров)
Трет-бутил 3-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]-4-метил-2-охо-2,3,4,7-тетрагидро-1H-азепин-1-карбоксилат (рацемическая смесь диастереомеров) (2.70 г, 5.58 ммоль) растворяли в этилацетате (250 мл) и добавляли палладий (10% на угле, 594 мг). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере водорода (атмосферное давление) в течение 4 ч. Смесь фильтровали через диатомитовую землю и растворитель удаляли в вакууме. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель; элюент: градиент циклогексан-этилацетат) с получением 0.54 г основного изомера исходного вещества и 1.78 г (66% выход, 82% выход на основе извлеченного исходного вещества) указанного в названии соединения в виде смеси диастереомеров.
LC-MS (Способ 1): Rt = 2.05 мин; MS (ESIneg): m/z = 484 [М-Н]-
1Н-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ [ppm] = 8.00 (d, 1H) и 7.99 (d, 1H), 7.77-7.71 (m, 2Н), 7.42 (s, 1H второстепенный изомер) и 7.16 (s, 1H основной изомер), 6.56 (s, 1H основной) и 6.52 (s, 1H второстепенный), 5.89 (s, 1H основной) и 5.86-5.66 (m, 1H второстепенный), 4.23-4.13 (m, 1H), 3.68 (s, 3Н основной) и 3.66 (s, 3Н второстепенный), 3.65-3.55 (m, 1H), 2.64-2.56 (m, 1H) и (2.15-2.03 (m, 1H), 1.97-1.55 (m, 4Н), 1.46 (s, 9Н), 1.14 (d, 3Н основной) и 0.86 (d, 3Н второстепенный).
Пример 7А
6-[(трет-Бутоксикарбонил)амино]-2-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2H)-ил]-3-метилгексановая кислота (рацемическая смесь диастереомеров)
Трет-бутил 3-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]-4-метил-2-оксоазепан-1-карбоксилат (рацемическая смесь диастереомеров) (1.77 г, 3.64 ммоль) растворяли в THF (25 мл), и водный раствор гидроксида лития (3.6 мл, 2.0 М, 7.2 ммоль) добавляли. Смесь перемешивали при 30°С в течение 1 ч, затем концентрировали в вакууме, и остаток растворяли в воде. Промывали этилацетатом. Водную фазу подкисляли 1H водной соляной кислотой и дважды экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои промывали солевым раствором и сушили над сульфатом натрия с получением 1.78 г (97% выход) указанного в названии соединения в виде смеси диастереомеров.
LC-MS (Способ 1): Rt = 1.80 мин (второстепенный изомер) и 1.84 мин (основной изомер); MS (ESIpos): m/z = 504 [М+Н]+
1Н-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ [ppm] = 13.13 (br. s, 1H), 8.01-7.97 (m, 1H), 7.76-7.71 (m, 2H), 7.38 (s, 1H), 6.80 (br. t, 1H основной изомер) и 6.70 (br. t, 1H второстепенный изомер), 6.51 (s, 1H), 5.10 (d, 1H второстепенный) и 5.05 (d, 1H основной), 3.64 (s, 3Н второстепенный) и 3.63 (s, 3Н основной), 3.01-2.71 и 2.49-2.37 (m, совместно 3Н), 1.64-1.40 и 1.31-1.13 и 1.02-0.93 (m, совместно 4Н), 1.38 (s, 9Н основной) и 1.34 (s, 9Н второстепенный), 1.05 (d, 3Н второстепенный) и 0.72 (d, 3Н основной).
Пример 8А
Трет-бутил {6-[(3-карбамоилпиразоло[1,5-а]пиридин-5-ил)амино]-5-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2H)-ил]-4-метил-6-оксогексил}карбамат (рацемическая смесь диастереомеров)
6-[(трет-Бутоксикарбонил)амино]-2-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2H)-ил]-3-метилгексановую кислоту (рацемическая смесь диастереомеров) (1.08 г, 2.14 ммоль) и 5-аминопиразоло[1,5-а]пиридин-3-карбоксамид трифторацетат [CAS-RN 1891071-11-6; WO 2016/046158, стр. 53 пример 1.1С] (746 мг, 2.57 ммоль) растворяли в DMF (4.0 мл). HATU (1.22 г, 3.21 ммоль) в виде раствора в DMF (2.0 мл) и затем N,N-диизопропилэтиламин (370 мкл, 2.1 ммоль) добавляли по каплям. Реакционную смесь перемешивали в течение 1.5 ч при комнатной температуре. Еще 5-аминопиразоло[1,5-а]пиридин-3-карбоксамид трифторацетат (187 мг, 643 мкмоль) и N,N-диизопропилэтиламин (370 мкл, 2.1 ммоль) добавляли. После перемешивания всю ночь, еще HATU (407 мг, 1.07 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламин (370 мкл, 2.1 ммоль) добавляли, и через 1 час реакционную смесь концентрировали в вакууме. Остаток кристаллизовали с водой, собирали посредством фильтрации с отсасыванием и промывали водой и сушили в вакууме. Соединение очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель; элюент: градиент дихлорметан/метанол) с получением 1.20 г (84% выход) указанного в названии соединения в виде смеси диастереомеров.
LC-MS (Способ 1): Rt = 1.75 мин; MS (ESIpos): m/z = 662 [M+H]+
1Н-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ [ppm] = 11.14 (br. s, 1H основной изомер) и 11.12 (br. s, 1H второстепенный изомер), 8.73-8.66 (m, 2H), 8.47 (s, 1H основной) и 8.46 (s, 1H второстепенный), 8.00 (d, 1H основной) и 7.99 (d, 1H второстепенный), 7.77-7.71 (m, 2H), 7.63 (s, 1H), 7.60 (br. s, 1H), 7.26 (dd, 1H), 6.98 (br. s, 1H), 6.76-6.70 (m, 1H), 6.56 (s, 1H второстепенный) и 6.55 (s, 1H основной), 5.57 (d, 1H основной) и 5.56 (d, 1H второстепенный), 3.72 (s, 3Н основной) и 3.71 (s, 3Н второстепенный), 2.96-2.76 (m, 2H), 1.64-0.96 (m, 5H), 1.34 (s, 9H основной) и 1.28 (s, 9Н второстепенный), 1.05 (d, 3Н основной) и 0.78 (d, 3Н второстепенный).
Разделение четырех стереоизомеров может быть достигнуто посредством хиральной хроматографии: Колонка и твердая фаза: 250 мм × 20 мм, Chiralpak IE, 5 мкм; Элюент: этанол; Поток 15.0 мл/мин. Получают три пика (7.0-8.5 мин, 11.1 мин, 13.9 мин). Первый пик нуждается в дополнительной хроматографии для очистки: Колонка и твердая фаза: 250 мм × 20 мм, Chiralpak IC, 5 мкм; Элюент: этанол; Поток 15.0 мл/мин. Получают два пика (6.29 мин, 7.33 мин).
Аналитическая ВЭЖХ: колонка 250 мм × 4.6 мм, Chiralcel ОХ-Н, 5 мкм; Элюент: изогексан/этанол 1:1; Поток 1.0 мл/мин; Температура: 40°С.
Стереоизомер 1: Rt = 10.90 мин.
Стереоизомер 2: Rt = 7.50 мин.
Стереоизомер 3: Rt = 8.85 мин.
Стереоизомер 4: Rt = 9.19 мин.
Стереоизомер 1 и 4, а также стереоизомер 2 и 3 являются энантиомерами друг друга.
Стереоизомер 1 и 4:
1Н-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ [ppm] = 11.14 (br. s, 1H), 8.70-8.67 (m, 2H), 8.47 (s, 1H), 8.00 (d, 1H), 7.75-7.71 (m, 2H), 7.60 (br. s, 1H), 7.62 (br. s, 1H), 7.25 (dd, 1H), 6.98 (br. s, 1H), 6.76-7.70 (m, 1H), 6.55 (s, 1H), 5.57 (d, 1H), 3.71 (s, 3H), 2.93-2.74 (m, 2H), 1.52-1.29 (m, 3H), 1.34 (s, 9H), 1.26-0.96 (m, 2H), 1.05 (d, 3H).
Стереоизомер 2 и 3:
1Н-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ [ppm] = 11.12 (br. s, 1H), 8.71 (d, 1H), 8.68 (d, 1H), 8.46 (s, 1H), 7.99 (d, 1H), 7.76 (d, 1H), 7.73 (dd, 1H), 7.62 (s, 1H), 7.59 (br. s, 1H), 7.25 (dd, 1H), 6.99 (br. s, 1H), 6.75 (br. t, 1H), 6.56 (s, 1H), 5.56 (d, 1H), 3.70 (s, 3H), 2.95-2.83 (m, 2H), 2.48-2.39 (m, 1H), 1.66-1.53 (m, 1H), 1.51-1.29 (m, 3H), 1.28 (s, 9H), 0.77 (d, 3H).
Рабочие примеры
Пример 1
5-({6-Амино-2-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]-3-метил-гексаноил}амино)пиразоло[1,5-а]пиридин-3-карбоксамид трифторацетат (рацемическая смесь диастереомеров)
Трет-бутил {6-[(3-карбамоилпиразоло[1,5-а]пиридин-5-ил)амино]-5-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2H)-ил]-4-метил-6-оксогексил}карбамат (рацемическая смесь диастереомеров) (1.20 г, 1.81 ммоль) растворяли в дихлорметане и охлаждали ледяной водой. Трифторуксусную кислоту (2.8 мл, 36 ммоль) добавляли. Смесь нагревали до комнатной температуры перемешивали в течение 1 ч. Смесь затем выпаривали. Дихлорметан добавляли и удаляли в вакууме. Эту процедуру повторили один раз. Остаток очищали посредством колоночной хроматографии (силикагель; элюент: градиент дихлорметан/метанол) с получением 785 мг (64% выход) указанного в названии соединения в виде смеси диастереомеров.
LC-MS (Способ 2): Rt = 0.64 мин (основной изомер) 0.68 (второстепенный изомер); MS (ESIpos): m/z=562 [М+Н]+
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ [ppm] = 11.17 (s, 1H основной изомер) и 11.14 (s, 1H второстепенный изомер), 8.73-8.67 (m, 2Н), 8.48 (s, 1H), 8.00 (d, 1H основной) и 7.99 (d, 1H второстепенный), 7.76-7.72 (m, 2Н), 7.69 (br. s, 4Н), 7.65 (s, 1H основной) и 7.61 (s, 1H второстепенный), 7.28-7.25 (m, 1H), 6.98 (br. s, 1H), 6.58 (s, 1H второстепенный) и 6.57 (s, 1H основной), 5.61-5.55 (m, 1H), 3.72 (s, 3Н основной) и 3.70 (s, 3Н второстепенный), 2.87-2.51 (т, 3Н), 1.80-1.09 (т, 4Н), 1.08 (d, 3Н основной) и 0.79 (d, 3Н второстепенный).
Пример 2
5-({(2S)-6-Амино-2-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]-3-метилгексаноил}амино)пиразоло[1,5-а] пиридин-3-карбоксамид трифторацетат (стереоизомер 3)
Следуя методике, описанной в Примере 1, отделенный стереоизомер 3 карбамата согласно Примеру 8А отдельно подвергали удалению защитных групп.
Стереоизомер 3:
LC-MS (Способ 1): Rt = 1.05 мин; MS (ESIpos): m/z = 562 [М+Н]+
1Н-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ [ppm] = 11.15 (s, 1H), 8.72 (d, 1H), 8.69 (d, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.00 (d, 1H), 7.76-7.72 (m, 2Н), 7.60 (s, 1H), 7.63 (br s, 4H), 7.27 (dd, 1H), 6.98 (br s, 1H), 6.58 (s, 1H), 5.56 (d, 1H), 3.70 (s, 3H), 2.88-2.72 (m, 2H), (1H под DMSO), 1.81-1.67 (m, 1H), 1.63-1.44 (m, 2H), 1.39-1.28 (m, 1H), 0.79 (d, 3H).
Пример 3
5-({(2S)-6-Амино-2-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2Н)-ил]-3-метилгексаноил}амино)пиразоло[1,5-а]пиридин-3-карбоксамид трифторацетат (стереоизомер 4)
Следуя методике, описанной в Примере 1, отделенный стереоизомер 4 карбамата согласно Примеру 8А отдельно подвергали удалению защитных групп.
Стереоизомер 4:
LC-MS (Способ 1): Rt = 0.99 мин; MS (ESIpos): m/z = 562 [М+Н]+
1Н-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6): δ [ppm] = 11.17 (s, 1H), 8.72-8.67 (m, 2Н), 8.48 (s, 1H), 8.03-7.98 (m, 1H), 7.77-7.72 (m, 2Н), 7.65 (s, 1H), 7.62 (br s, 4H), 7.26 (dd, 1H), 6.98 (br s, 1H), 6.57 (s, 1H), 5.59 (d, 1H), 3.72 (s, 3H), 2.83-2.62 (m, 2H), 2.58-2.51 (m, 1H), 1.70-1.44 (m, 2H), 1.08 (d, 3H), 1.26-1.06 (m, 2H).
В) Оценка физиологической эффективности
Пригодность соединений согласно настоящему изобретению для лечения тромбоэмболических расстройств может быть продемонстрирована с помощью следующих аналитических систем:
а) Описания тестов (in vitro)
а.1) Определение активности калликреина плазмы
Для определения ингибирования калликреина плазмы веществами согласно настоящему изобретению используется биохимическая тест-система, которая использует реакцию пептидного субстрата калликреина плазмы для определения ферментативной активности калликреина плазмы человека. Здесь калликреин плазмы отщепляет от пептидного субстрата а плазмы С-концевой аминометилкумарин (АМС), флуоресценцию которого измеряют. Определения проводят на микротитровальных планшетах.
Тестируемые вещества растворяли в диметилсульфоксиде и последовательно разбавляли диметилсульфоксидом (от 3000 мкМ до 0,0078 мкМ; конечные концентрации в тесте: от 50 мкМ до 0,00013 мкМ). В каждом случае в лунки белых микротитровальных планшетов фирмы Greiner (384 лунки) вносили по 1 мкл разбавленных растворов веществ. 20 мкл аналитического буфера (50 мМ Трис/HCl рН 7,4; 100 мМ раствор хлорида натрия; 5 мМ раствор хлорида кальция; 0,1% бычьего сывороточного альбумина) и 20 мкл калликреина плазмы от Kordia (0,6 нМ в аналитическом буфере) затем добавляли последовательно. После 15 мин инкубации ферментную реакцию начинали добавлением 20 мкл субстрата Н-Pro-Phe-Arg-AMC, растворенного в аналитическом буфере (10 мкМ в аналитическом буфере) от Bachem, смесь инкубировали при комнатной температуре (22°С) в течение 30 минут и затем измеряли флуоресценцию (возбуждение: 360 нм, эмиссия: 460 нм). Измеренные эмиссии тестируемых партий с тестируемым веществом сравнивали с эмиссиями контрольных партий без тестируемого вещества (только диметилсульфоксид вместо тестируемого вещества в диметилсульфоксиде), и значения IC50 рассчитывали из соотношений концентрация/активность. Данные об активности, полученные в результате этого теста, перечислены в таблице А ниже (некоторые в виде средних значений нескольких независимых отдельных определений):
а.2) Измерение ингибирования FXIa
Ингибирование фактора XIa веществ согласно настоящему изобретению определяют с использованием биохимической тест-системы, которая использует реакцию пептидного субстрата фактора XIa для определения ферментативной активности человеческого фактора XIa. Здесь фактор XIa отщепляет от пептидного субстрата фактора XIa С-концевой аминометилкумарин (АМС), флуоресценцию которого измеряют. Определения проводят на микротитровальных планшетах.
Тестируемые вещества растворяли в диметилсульфоксиде и последовательно разбавляли диметилсульфоксидом (от 3000 мкМ до 0,0078 мкМ; конечные концентрации в тесте: от 50 мкМ до 0,00013 мкМ). В каждом случае в лунки белых микротитровальных планшетов фирмы Greiner (384 лунки) вносили по 1 мкл разбавленных растворов веществ. 20 мкл аналитического буфера (50 мМ Трис/HCl рН 7,4; 100 мМ раствор хлорида натрия; 5 мМ раствор хлорида кальция; 0,1% бычьего сывороточного альбумина) и 20 мкл фактора XIa от Kordia (0,45 нМ в аналитическом буфере) затем добавляли последовательно. После 15 мин инкубации ферментную реакцию начинали добавлением 20 мкл субстрата фактора XIa Boc-Glu(OBzl)-Ala-Arg-AMC, растворенного в аналитическом буфере (10 мкМ в аналитическом буфере) от Bachem, смесь инкубировали при комнатной температуре (22°С) в течение 30 минут и затем измеряли флуоресценцию (возбуждение: 360 нм, эмиссия: 460 нм). Измеренные эмиссии тестируемых партий с тестируемым веществом сравнивали с эмиссиями контрольных партий без тестируемого вещества (только диметилсульфоксид вместо тестируемого вещества в диметилсульфоксиде), и значения IC50 рассчитывали из соотношений концентрация/активность. Данные об активности, полученные в результате этого теста, перечислены в таблице В ниже (некоторые в виде средних значений нескольких независимых отдельных определений):
3) Определение селективности
Чтобы продемонстрировать селективность веществ в отношении ингибирования FXIa, тестируемые вещества исследовали на их ингибирование других сериновых протеаз человека, таких как фактор Ха, трипсин и плазмин. Для определения ферментативной активности фактора Ха (1,3 нмоль/л от Kordia), трипсина (83 мЕд/мл от Sigma) и плазмина (0,1 мкг/мл от Kordia) эти ферменты растворяли (50 ммоль/л Трис-буфера [С,С,С-трис(гидроксиметил)аминометан], 100 ммоль/л NaCl, 0,1% BSA [бычий сывороточный альбумин], 5 ммоль/л хлорида кальция, рН 7,4) и инкубировали в течение 15 мин с тестируемым веществом при различных концентрациях в диметилсульфоксиде, а также с диметилсульфоксидом без тестируемого вещества. Затем ферментативную реакцию начинали путем добавления соответствующих субстратов (5 мкмоль/л Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-AMC от Bachem для фактора Ха и трипсина, 50 мкмоль/л MeOSuc-Ala-Phe-Lys-AMC от Bachem для плазмина). После 30 мин инкубации при 22°С измеряли флуоресценцию (возбуждение: 360 нм, эмиссия: 460 нм). Измеренные эмиссии тестируемых смесей с тестируемым веществом сравнивали с эмиссиями контрольных смесей без тестируемого вещества (только диметилсульфоксид вместо тестируемого вещества в диметилсульфоксиде), и значения IC50 рассчитывали из соотношений концентрация/активность.
а.4) Определение антикоагулянтной активности
Антикоагулянтную активность тестируемых веществ определяли in vitro в плазме человека и плазме крысы. Для этого собирали кровь при соотношении смеси цитрат натрия/кровь, равном 1: 9, используя 0,11 молярный раствор цитрата натрия в качестве приемника. Сразу после взятия крови ее тщательно перемешивали и центрифугировали при около 4000 g в течение 15 минут. Супернатант отбирали пипеткой.
Активированное парциальное тромбопластиновое время (АРТТ) определяли в присутствии различных концентраций тестируемого вещества или соответствующего растворителя с использованием коммерческого тестового набора (реагент аРТТ от Siemens). Тестируемые соединения инкубировали с плазмой и реагентом аРТТ при 37°С в течение 3 минут. Затем начинали коагуляцию добавлением 25 мМ хлорида кальция и определяли время, когда происходит коагуляция. Определяли концентрацию тестируемого вещества, которая увеличивает на 50% или удваивает АРТТ.
а.5) Определение целостности эндотелия
Активность соединений согласно настоящему изобретению охарактеризована с помощью анализа проницаемости in vitro на «клетках пупочной вены человека» (HUVEC). Используя устройство EOS (ЕС IS: Electric Cell-Sub Impedance Sensing; Applied Biophysics Inc; Troy, NY), можно непрерывно измерять изменения трансэндотелиального электрического сопротивления (TEER) через монослой эндотелиальных клеток, нанесенный на золотые электроды. HUVEC высевают на 96-луночный сенсорный электродный планшет (96W1 Е, Ibidi GmbH, Martinsried, Германия). Гипер проницаемость образовавшегося монослоя конфлюэнтных клеток индуцируют стимуляцией кининогеном, прекалликреином и фактором XII (по 100 нМ каждый). Соединения согласно настоящему изобретению добавляют до добавления веществ, указанных выше. Обычные концентрации соединений составляют от 1×10-10 до 1×10-6 М.
а.6) Определение проницаемости in vitro эндотелиальных клеток
На другой модели гиперпроницаемости определяли активность веществ по модуляции макромолекулярной проницаемости. HUVEC высевали на покрытую фибронектином фильтровальную мембрану Transwell (24-луночные планшеты, вставка 6,5 мм с поликарбонатной мембраной 0,4 мкМ; Costar №3413). Фильтровальная мембрана отделяет верхнее пространство культивирования клеток от нижнего, при этом сливающийся слой эндотелиальных клеток находится на дне верхнего пространства культивирования клеток. 250 мкг/мл 40 кДа FITC-декстана (Invitrogen, D1844) добавляли в среду верхней камеры. Гиперпроницаемость монослоя индуцировали стимуляцией кининогеном, прекалликреином и фактором XII (по 100 нМ каждый). Каждые 30 мин образцы среды удаляли из нижней камеры и с помощью флуориметра определяли относительную флуоресценцию как параметр изменений макромолекулярной проницаемости в виде функции от времени. Соединения согласно настоящему изобретению добавляют до добавления веществ, указанных выше. Обычные концентрации соединений составляют от 1×10-10 до 1×10-6 М.
b) Определение антитромботической активности (in vivo)
b.1) Модель артериального тромбоза (тромбоз, вызванный хлоридом железа (II)) в комбинации с временем ушного кровотечения у кроликов
Антитромботическую активность ингибиторов FXIa тестировали на модели артериального тромбоза. Здесь образование тромба запускали, вызывая химическое повреждение области сонной артерии у кроликов. Одновременно определяли время ушного кровотечения.
Самцов кроликов (Crl: KBL (NZW) BR, Charles River), получающих нормальный рацион и имеющих массу тела 2,2-2,5 кг, анестезировали путем внутримышечного введения ксилазина и кетамина (Rompun, Bayer, 5 мг/кг и Ketavet, Pharmacia & Upjohn GmbH, 40 мг/кг массы тела). Анестезию поддерживали, кроме того, внутривенным введением тех же препаратов (болюс: непрерывная инфузия) через правую предсердную вену.
Правую сонную артерию обнажали, и повреждение сосуда вызывали путем наматывания кусочка фильтровальной бумаги (10 мм × 10 мм) на полосу Parafilm® (25 мм × 12 мм) вокруг сонной артерии без нарушения кровотока. Фильтровальная бумага содержит 100 мкл 13% -ного раствора хлорида железа (II) (Sigma) в воде. Через 5 мин фильтровальную бумагу удаляли, и сосуд дважды промывали водным раствором хлорида натрия с концентрацией 0,9%. Через 30 минут после травмы травмированный участок сонной артерии удаляли хирургическим путем, и любой тромботический материал удаляли и взвешивали.
Тестируемые вещества вводили либо внутривенно анестезированным животным через бедренную вену, либо перорально бодрствующим животным через желудочный зонд, в каждом случае за 5 минут и 2 часа, соответственно, до травмы.
Время ушного кровотечения определяли через 2 мин после повреждения сонной артерии. Для этого брили левое ухо и делали разрез длиной 3 мм (лезвие, артикул 10-150-10, Martin, Tuttlingen, Германия) параллельно продольной оси уха. Здесь следует соблюдать осторожность, чтобы не повредить видимые сосуды. Любую кровь, которая выделялась, собирали с интервалом в 15 секунд с помощью точно взвешенных кусочков фильтровальной бумаги, не касаясь непосредственно раны. Время кровотечения рассчитывали как время от момента разреза до момента времени, когда кровь не может быть обнаружена на фильтровальной бумаге. Объем экстравазированной крови вычисляли после взвешивания кусочков фильтровальной бумаги.
с) Определение эффекта на кровоизлияние/образование отека и/или неоваскуляризацию в глазах (in vivo)
c.1) Тестирование эффективности веществ на модели индуцированной лазером хориоидальной неоваскуляризации
Это исследование служит для изучения эффективности исследуемого вещества в отношении уменьшения кровоизлияния/образования отека и/или хориоидальной неоваскуляризации на крысиной модели индуцированной лазером хориоидальной неоваскуляризации.
С этой целью отбирали пигментированных крыс линии Brown-Norway, не проявляющих каких-либо признаков офтальмологических нарушений, и рандомизировали в группы лечения. В день 0 животных анестезировали внутрибрюшинной инъекцией (15 мг/кг ксилазина и 80 мг/кг кетамина). После закапывания капли 0,5% раствора тропикамида для расширения зрачков с помощью фотокоагулятора аргонового лазера с длиной волны 532 нм (диаметр 50-75 мкм, интенсивность 150 мВт, продолжительность 100 мс) запускали хориоидальную неоваскуляризацию в шести определенных местах вокруг зрительного нерва. Тестируемое вещество и соответствующий носитель (например, PBS, изотонический физиологический раствор) вводили либо системно пероральным или внутрибрюшинным путем, либо местно в глаз путем повторного введения в виде глазных капель или интравитреальной инъекции. Массу тела всех животных определяли перед началом исследования, а затем ежедневно во время исследования.
На 21 день проводили ангиографию с использованием флуоресцентной камеры глазного дна (например, Kowe, HRA). Под анестезией и после очередного расширения зрачка подкожно (s.c.) вводили краситель флуоресцеин натрия с концентрацией 10%. Через 2-10 мин. делали снимок задней области глаза. Степень кровоизлияния/отека, представленную утечкой флуоресцеина, оценивали двумя-тремя слепыми наблюдениями и классифицировали по степени тяжести от 0 (отсутствие кровоизлияния) до 3 (сильное окрашивание, превышающее фактическое поражение).
Животных умерщвляли на 23 день, после чего глаза удаляли и фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегида в течение одного часа при комнатной температуре. После одной промывки сетчатку осторожно отслаивали, и комплекс склеры-хориоидеи окрашивали с использованием антитела FITC к изолектину В4, а затем наносили на предметное стекло микроскопа. Полученные таким образом препараты оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа (Apotom, Zeiss) при длине волны возбуждения 488 нм. Площадь или объем хориоидальной неоваскуляризации (в мкм2 и мкм3, соответственно) рассчитывали с помощью морфометрического анализа с использованием программного обеспечения Axiovision 4.6.
с.2) Тестирование эффективности веществ на модели индуцированной кислородом ретинопатии
Было показано, что кислород-индуцированная ретинопатия является полезной животной моделью для изучения патологического ангиогенеза сетчатки. Эта модель основана на наблюдении, что гипероксия во время раннего постнатального развития сетчатки вызывает остановку или задержку роста нормальных кровеносных сосудов сетчатки. Когда после 7-дневной фазы гипероксии животных возвращают в нормоксический комнатный воздух, это эквивалентно относительной гипоксии, поскольку в сетчатке отсутствуют нормальные сосуды, которые необходимы для обеспечения адекватного снабжения нервной ткани в нормоксических условиях. Вызванная таким образом ишемическая ситуация приводит к аномальной неоваскуляризации, которая имеет некоторое сходство с патофизиологической неоваскуляризацией при глазных заболеваниях, таких как влажная AMD. Кроме того, вызванная неоваскуляризация хорошо воспроизводима, поддается количественной оценке и является важным параметром для изучения механизмов заболевания и возможных методов лечения различных форм заболеваний сетчатки.
Целью этого исследования является изучение эффективности ежедневных системно вводимых доз тестируемого соединения на рост сосудов сетчатки на модели ретинопатии, индуцированной кислородом. Новорожденных мышей C57Bl/6 и их матерей подвергают гипероксии (70% кислорода) на 7-й постнатальный день (PD7) в течение 5 дней. Начиная с PD12, мышей содержат в нормоксических условиях (комнатный воздух, 21% кислорода) до PD17. С 12 по 17 день мышей ежедневно обрабатывают тестируемым веществом или соответствующим носителем. На 17 день всех мышей анестезируют изофлураном, а затем умерщвляют посредством перелома шейки матки. Глаза удаляют и фиксируют 4% формалином. После промывания в физиологическом растворе с фосфатным буфером сетчатку иссекают, получают ее плоский препарат, который окрашивают антителом к изолектину В4. Количественная оценка неоваскуляризации проводится с использованием Zeiss ApoTome.
С) Рабочие примеры фармацевтических композиций
Вещества согласно настоящему изобретению можно превратить в фармацевтические препараты следующим образом:
Таблетка:
Состав:
100 мг соединения Примера 1, 50 мг лактозы (моногидрата), 50 мг кукурузного крахмала, 10 мг поливинилпирролидона (PVP 25) (от BASF, Германия) и 2 мг стеарата магния.
Масса таблетки 212 мг. Диаметр 8 мм, радиус закругления 12 мм.
Получение:
Смесь соединения Примера 1, лактозы и крахмала гранулируют с 5%-ным раствором (мас/мас) PVP в воде. После сушки гранулы смешивают со стеаратом магния в течение 5 мин. Эту смесь прессуют в обычном таблеточном прессе (формат таблетки см. выше).
Пероральная суспензия:
Состав:
1000 мг соединения Примера 1, 1000 мг этанола (96%), 400 мг Rhodigel (ксантановая камедь) (от FMC, USA) и 99 г воды.
10 мл пероральной суспензии соответствует одной дозе 100 мг соединения согласно настоящему изобретению.
Получение:
Rhodigel суспендировали в этаноле, и соединение согласно настоящему изобретению добавили к суспензии. Добавляли воду при перемешивании. Смесь перемешивали в течение около 6 часов, пока набухание Rhodigel не завершалось.
Раствор или суспензия для местного применения в глаза (глазные капли):
Стерильный фармацевтический препарат для местного введения в глаза может быть получен путем восстановления лиофилизата соединения согласно настоящему изобретению в стерильном физиологическом растворе. Подходящими консервантами для такого раствора или суспензии являются, например, хлорид бензалкония, тиомерсал или нитрат фенилртути в диапазоне концентраций от 0,001 до 1 мас %.
Раствор или суспензия для местного применения в глаза (глазные капли):
Стерильный фармацевтический препарат для местного введения в глаза может быть получен путем восстановления лиофилизата соединения согласно настоящему изобретению в стерильном физиологическом растворе. Подходящими консервантами для такого раствора или суспензии являются, например, хлорид бензалкония, тиомерсал или нитрат фенилртути в диапазоне концентраций от 0,001 до 1 мас %.
1. Соединение 5-({6-амино-2-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2H)-ил]-3-метилгексаноил}амино)пиразоло[1,5-а]пиридин-3-карбоксамид формулы (I)
или одна из его солей.
2. Соединение 5-({6-амино-2-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2H)-ил]-3-метилгексаноил}амино)пиразоло[1,5-а]пиридин-3-карбоксамид трифторацетат по п. 1 формулы (Ia)
3. Соединение 5-({(2S)-6-амино-2-[4-(5-хлор-2-цианофенил)-5-метокси-2-оксопиридин-1(2H)-ил]-3-метилгексаноил}амино)пиразоло[1,5-а]пиридин-3-карбоксамид по п. 1 формулы (Ib)
или одна из его солей.
