Способ выращивания клубеньковб1х

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

293785

CoNs Советских

Социалистических

Респуолик

Зависимое от авт. свидетельства ¹

Заявлено 05111.1969 (№ 1329249/30-15) МПК С 05f 11/08 с присоединением заявки М

Приоритет

Опубликовано 26.!.1971. Бюллетень М 6

Дата опубликования описания 22.11 .1971

Комитет по делам изооретений и открытий при Совете Министров

СССР

УДК 631.86:631.461.5 (088.8) Авторы изобретения В. С. Краснопольская, Т. Б. Плаксина и T. В. Шмырева

Заявитель Всесоюзный научно-исследовательский институт микробиологических средств защиты растений и бактериальных препаратов

АЯ

IlATEHTIO-TEXHH×(ÑÊ

СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ КЛУБЕНЬКОВЪ|Х БАКТЕРИЙ БИБЛИОТЕКА

ЛУП И НА И СОИ

Изобретение относится к области производства бактериальных препаратов сельскохозяйственного назначения и может быть использовано для приготовления сухого бактериального удобрения нитрагина под культуры лупина и сои.

Для районов стародавнего возделывания бобовых прибавка от использования нитрагина составляет в среднем 15 — 25%. Для культур новых в данном районе, для KQTopblx в почве нет спонтанных клубеньковых бактерий, эффект от применения нитрагина значительно выше 100% и более.

Известно, что виды клубеньковых бактерий специфичны к растению-хозяину. По скорости роста на питательных средах они делятся на две группы — быстрорастущих и медленнорастущих. Клубеньковые бактерии лупина (Rhizobium 1upini) и сои (Rhizobium japonicum) относятся к медленнорастущим бактериям.

Нитрагин под лупин и сою в настоящее время производят на заводах только в виде почвенного препарата. Между тем способ производства почвенного нитрагина, основанный на размножении маточной культуры клубеньковых бактерий в почве, слабо механизирован и вытесняется более прогрессивным способом производства сухого нитрагина. Однако последний способ предусматривает производство сухого нитрагина только из быстрорасту щих клубеньковых бактерий с циклом выращивания 48 час. Переход к производству сухого нитрагина включает более интенсивное выращивание бактериальной массы. И в этом отношении состав среды и условия выращивания, позволяющие получать более высокие титры, приобретают важное значение.

10 Выращивание быстрорастущих клубеньковых бактерий производят на среде с кукурузным экстрактом, сахарозой и благоприятными для этих бактерий исходной реакцией среды (pH 6,8 — 7,0) и режимом аэрации (0,4 г/кас и

15 более кислорода на 1 л среды илп 1 л возду ха на 1 л среды в 1 .пик). Этот способ может быть применен также для выращивания медленнорастущпх клубеньковых бактерий, но он не является оптимальным для этих бактерий

20 и дает низкий выход биомассы. Бобовый отвар, широко применяемый в лабораториях и при выращивании маточной культуры клубеньковых бактерий при производстве почвенного нптрагпна, является средой, еще более не

25 отвечающей требованиям медленнорастущих клубеньковых бактерий.

Цель изобретения — разработка способа выращивания медленнорастущпх клубеньковых бактерий сои и лупина с хорошим выходом

30 биомассы.

293785

Таблица 1

Количество клеток, млн1мл

Аэрация, г|ЧаС Ог на1л среды**

Состав среды, з

Среда

Rhfzobium

lupini

Rhiz0b i u m

l aponicum

0,15

9300

Кукурузный экстракт 0,6, минеральная основа глюкоза 1,0 рН 60

Бобовый отвар КгНР01 0,05

Сахар 1,0 рН 7,0

Кукурузный экстракт 0,6

Минеральная основа

Сахар 1,0 рН 7,0

Кукурузный экстракт 0,5

Дрожжевой экстракт 0,3

Минеральная основа "

Сахар 1,0 NaHCO> 0,03 рН 7,0

6700

Для медленнорастущих клубеньковых бактерий

0,4

Бобовый отвар

650

700

0,4

1660

1120

Регламентная

0,4

1150

1110

По авт. св, Ха 161180

" Минеральная основа, %. К2НРО4 0,05; (NH4) zSO4 0,05; NaC1 0,02; MgSO4 0,02; мел 0,1.

Инокуляция 40 млн/ил, температура28 С.

Одной из„известных физиологических особенностей, медленнорастущих клубеньковых бактерий является подщелачивание питательной среды вотличие. от быстрорастущих, которые ее .подкисляют. Эта особенность была учтена при разработке предлагаемого способа. Уровень защелачивания среды зависит от ряда факторов и может явиться тормозом дальнейшего развития культуры. Так, на среде с сахарозой происходит подщелачивание культуральной жидкости до 8 и выше единиц рН и остановка размножения после двух-трех суток, когда количество клеток достигает только 1—

1,5 млд/лл.

Согласно предлагаемому способу поставленная цель достигается снижением уровня щелочности в ходе развития культуры путем подкисления исходной реакции среды до рl-1 около 6,0, введением в питательную среду глюкозы, которая является не только благоприятным источником углерода для клубеньковых бактерий лупина и сои, но и фактором регулирования реакции среды, и снижением аэрации до

0,1 — 0,2 г/час кислорода на 1 л среды.

На среде с кукурузным экстрактом и глюкозой при переходе культуры клубеньковых бактерий лупина и сои в фазу замедления роста происходит перелом кривой рН от щелочного максимума (pH 7,3 — 7,5) в кислую сторону, размножение продолжается в течение 4 — 6 суток, и максимальная концентрация клеток достигает порядка 7 12 ллд/л1л.

Предлагается способ выращивания клубеньковых бактерий лупина и сои на питательной среде, содержащей кукурузный экстракт, минеральные соли калия, натрия, магния, кальция и фосфора и источник углерода при аэрации и температуре предпочтительно 27 — 29 С.

При этом способе в качестве источника углерода и регулятора реакции среды берут глюкозу, реакцию среды доводят до рН 6,0 — 6,2, а аэрацию поддерживают из расчета 0,1—

0,2 г/иас кислорода на 1 л среды.

Предлагаемый способ был апробирован в

5 лабораторных и заводских условиях и показал, что он позволяет получать выход живых клеток Rhizobium lupini u Rhizobium japonicum в 6 — 10 раз больше, чем при использовании известных ранее способов выращивания

10 клубеньковых бактерий.

В табл. 1 приведены титры бактерий после четырех дней глубинного культивирования.

Выращивание медленнорастущих клубеньковых бактерий предлагаемым способом даст

15 снижение себестоимости урожая бактериальной массы в 6 — 10 раз по сравнению с другими способами, приведенными в таблице.

Пример осуществления способа.

Приготовлено 1,3 л питательной среды со20 гласно прописи: 7,8 г кукурузного экстракта растворили в 1 л водопроводной воды. После кипячения в течение 20 вин отфильтровали, довели объем до 1 л, внесли по 13 мл 5%-ных растворов (NH4) zSO4 и К2НРО и 2

25 растворов NaC1 и MgSO4, добавили 13 г глюкозы, довели объем воды до 1,3 л. рН 6.20.

Добавили 1 л л 7%-ной НС1 до рН 6,05. Разлили в три колбы для выращивания на 750 мл по 400 л1л среды и добавили по 400 мг мела

30 и в колбу на 250 лл со 100 лл среды без добавления мела — для получения яидкого посевного материала. Среду простерилизовали— большие колбы при 1 атл1 в течение 45 мин, малую при 1 атм в течение 20 лчин.

35 Определили в отдельной пробе рН среды после стерилизации 5,98.

В малую колбу внесли смыв с одного косяка

Rhizobium lupini, штамм 359а. Колбу поставили на малую качалку со 150 o&иин при тем40 пературе 28 С. Через трое суток инкубации

293785

Таблица 2

Титр, млн|.ил рН конеч№ колбы ный по подсчету по высеву

6,15

6,13

6,12

7300

10200

Среднее

6,13

7200

9800

Составитель М. Дранишников

Редактор Н. С. Старостина Текрсд Л. В. Куклина Корректор Л. А. Царькова

Заказ 1026/12 Изд. № 430 Тираж 473 Подписно

ЦИИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4 5

Типография, пр. Сапунова, 2 высеяли на чистоту (на косяк МПЛ), определили рН и титр в посевной колбе (подсчет в камере Горяева). рН 6,99, титр 2500 млн(мл.

Внесли в каждую из трех опытных колб по

6,5 мл из посевной колбы, что составило

40 млн)мл. Колбы с 400 мл засеянной среды поставили на большую круговую качалку с

160 об/мик, что обеспечивало скорость растворения кислорода 0,15 г/л час. Температура инкубации 28 С. Через четыре дня выращивание закончили. Определили конечное рН в колбах, титр по камере, чистоту культуры и сделали высев на маннпто-дрожжевую твердую среду для определения количества живых клеток.

Чашки Петри поставили в термостат во влаж5 ной камере. Через 10 дней просчитали колонии и вывели титр. Результаты приведены к табл. 2.

Предмет изобретения

Способ выращивания клубеньковых бактерий лупина и сои на питательной среде, содержащей кукурузный экстракт, минеральные соли калия, натрия, магния, кальция и фосфо15 ра и источник углерода, прп нейтральном значении реакции среды, аэрации и температуре предпочтительно 27 — 29 С, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода биомассы, в качестве источника углерода и регулятора ре20 акции среды берут глюкозу, реакцию среды доводят до рН 6.0 — 6,2, а аэрацию поддерживают из расчета 0,1 — 0,2 г/час кислорода на

1 л среды.