Способ получения комплекса физиологически активных веществ из дрожжей

 

О П И С А Н И Е 302368

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельст ва №

МПК С 12k 5/00

А Oln 15/00

Заявлено 19.1.1970 (№ 1395929/30-15) с присоединением заявки №

Приоритет

Опубликовано 28.1Ъ .1971. Бюллетень № 15

Дата опубликования описания 07.Х.1971

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

УДК 577.15.072:632. .981 (088,8) Авторы изобретения

С. Н. Московец, A. Г. Коваленко и В. П. Чернецкий

Заявитель

Институт микробиологии и вирусологии им. акад, Д. К. Заболотного

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ ДРОЖЖЕЙ

Известен способ получения комплекса физиологически активных веществ, который включает операции освобождения дрожжевых клеток, концентрирования культуральной жидкости и центрифугирования.

С целью получения комплекса, ингибирующего вирус табачной мозаики и Х-вируса картофеля, концентрирование проводят в вакууме, целевой продукт осаждают органическим растворителем, обрабатывают рибонеуклеазой, фенолом, органическим растворителем и подвергают диализу.

Известно, что дрожжи, например Candida

tropiса11э, Candida arborea, продуцируют вещества, ингибирующие активность фитопатогенных вирусов — вирус табачной мозаики и Х-вирус картофеля.

Применение антивирусных веществ совместно с культур альной жидкостью затруднено в связи с необходимостью хранения и транспортировки, а также в связи с низкой концентрацией активного начала в нативны. . биомассах.

Предлагается способ получения комплекса физиологически активных веществ из дрожжей, предпочтительно из дрожжей Candida

tropicalis 3b и Candida arborea КАМ-1, который, заключается в следующем.

Культур альную жидкость, предварительно освобожденную от дрожжевых клеток, концентрируют до 1/10 первоначального объема упариванием (t(45 Ñ) в вакууме, затем центрифугируют при 100000 g в течение 3—

4 час. Осадок отбрасывают, а из надосадочной жидкости вещества осаждают 80%-ным этанолом. Растворенный в воде (1(45 С) осадок обрабатывают вначале рибонуклеазой (30 мкг/и,г в 0,001 М NaC1, 2 час при 25 С), а затем фенолом (1: 1,30 мин) или фенольнохлороформной смесью (9:1). Реакционную смесь центрифугируют при 3000 g в течение

45 — 50 лин, фенольную фазу отбрасывают, а водную диализирую т через целофан против воды не менее 48 час. Из диализата ингибитор два-три раза переосаждают 80%-,ным этанолом. После этого его окончательно осаждают безводным этанолом, промывают этанольно-эфирной смесью (1: 1), эфиром и высушивают в вакууме.

20 В качестве исходного материала для получения ингибитора по предлагаемому способу наряду с культуральными жидкостями может

vcïoëüçoâàòüñÿ также водный экстракт гомогенизированных клеток дрожжей, а также дрожжевой экстракт.

Пример 1. Для выделения ингибитора были взяты культуральные жидкости дрожжей Candida tropicalis 31> и Candida arborea

КАЧ-1, выращенных на солодовом сусле (7

30 по Балингу) при 28 С в течение трех суток.

302368

Таблица

Химический состав антивирусных препаратов, выделенных из дрожжей

1 едуцирующие вещества, %

НуклеиноБелки, Источник получения препаратов вые кисЛОТЫ, после гидролиза до гидролиза

2,2 — 2,7

90,1

3,1

Дрожжевой экстракт

0,18

Candide tr0picali 3b, культуральная жидкость

82,2

2,6 — 2,9

0,25

Candide arborea КАМ-1, культуральна я жидкость

3,9 — 4,3

91,6 1,1

0,26

Таблица 2

Влияние препарата, выделенного из дрожжевого экстракта, на накопление Х-вируса картофеля в растениях табака сорта Самсун 3073 — 1969 г.

Титр Х-вируса в растениях (в некрозах на листьях Gamphrena (globosa) На 15-й день после заражения

На 30-" день после заражения

Варианты опыта процент от контроля процент от контроля опыт контроль опыт контроль

Растения, обработанные иигибитором за один день до заражения, 0,1%

9,6

191

260

73,5

73

130

20,5

То же, за три дня до заражения

То же, за пять дней до заражения

Го же, за семь дней до заражения

Го же, 0 01%

173

75,2

190

26,8

214

88,8

137

36,7

138

100,7

36

44,4

118

120

90,6

Исходный вес сухих веществ этих культуральных жидкостей соответственно составлял

30 и 27 г. По предлагаемому способу из них получено 0,51 и 0,52 г соответственно очищенных препаратов, что составляет 1,7 и

1,9% сухого веса исходного продукта„Воздушно сухие препараты имели вид белых порошков. Их влажность не превышала 9,0—

9,4%. Препараты хорошо растворялись в воде и физиологическом растворе. Седиментационным анализом установлена высокая степень гомогенности полученных препаратов.

Пример 2. Получение вирусного ингибитора из гомогената клеток дрожжей Candide

tropicalis ЗЬ и Candide агЬогеа КАМ-1.

1,54 г дрожжевых клеток, предварительно отмытых от культуральной жидкости физиологическим раствором, растирали в присутствии абразивов и 1 — 2 ял дистиллированной воды. Из полученного гомогената экстрагировали водорастворимые вещества, которые служили исходным материалом для выделения ингибитора по предлагаемому способу. Из этого экстракта вы делено 0,035 г очищенного ингибитора, т. е. 2 3% от веса взятой микробной массы. По внешнему вирду и физическим свойствам эти препараты не отличались от препаратов, полученных аналогичным способом из культуральных жидкостей дрожжей.

Из 27,8 г дрожжевого экстракта по предлагаемому способу получено 1,25 г очищенного препарата ингибитора, т. е. 4,5% от веса исходного продукта. Влажность воздуха сухого препарата 8,8%, цвет — белый или слабокоричневый. По други м показателям этот препарат не отличается от препаратов, вы10 деленных из культур альных жидкостей вышеуказанных видов дрожжей.

Полученные препараты в концентрации

0,001 — 0,1% в опытах in vitro подавляют об15 разование некрозов, вызванных Х-вирусом картофеля и вирусом табачной мозаики на листьях тест-растений Datura stramonium 1. и Datura Metel Z. на 77,5 — 100%. Они обладают также высокой антивирусной активно20 стью при системной инфекции, вь1званной

Х-вирусом картофеля в растениях табака прп профилактическом применении. Антивирусная активность выделенных препаратов примерно в 50 — 1000 раз превышает антивирус25 ную активность исходного м атери ал а.

В табл. 1 приведены сведения о химическом составе получаемых препаратов, а в табл. 2 и 3 результаты их испытаний.

302368

Таблица 3

Подавление инфекционности Х-вируса картофеля исходным материалом и полученными из него препаратами (опыты in vitro) Количество некрозов на 10 — 15 половинках листьев Datura

stramonium

Количество некрозов на 6 — 15 половинках листьев Datura

stramonium

Очищенные препараты исходного материала

Концентрация сухих веществ, Исходный материал концентрация, 00 номера препаратов снижение, контопыт контснижение, опыт роль роль

Дрожжевой экстракт

1

0,1

57

338

100,0

98,1

81,7

612

904

381

96,7

93,7

11,5

13

123

107

0,1

0,01

0,0014

Candide trooicalis ЗЬ, культуральная жидкость

469

207

1

0,1

633

194

61,5

25,8

16

154

82

100,0

93,9

79,2

0,1, 0,01

0,001

C andi de trop ica1is ЗЬ, водный экстракт гомогената клеток

3, 0,1

0,01

О 01

133

0,5

0,05

109

О

16

100,0

88,0

78,3

294

97,6

58,9,О

Candide arborea КАМ-1, культуральная жидкость

302

518

28

0,1

0,001 .

0,01

172

734

693

58,9

23,9

81,3

82,5

77,5

Предмет изобретения

Состаив.ель М. Дранишников

Техред Л. Л. Евдонов Корректор Е. Н. Миронова

Редактор Д, Пинчук

Заказ 2635/16 Изд. № 1134 Тираж 473 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретешш и открытий при Совете М.шпстров СССР

Москва, >К-35, Раушская нao., д. 4 5

Типография, пр. Сапунова.

Способ получения комплекса физиологически активных веществ из дрожжей, включающий операци1и освобождения от дрожжевых клеток, концентрирования культуральной жидкости или дрожжевого экстракта и центрифугирования, отличающийся тем, что, с целью получения комплекса, ингибирующего вирус табачной мозаики и Х-вируса картофеконцентрирование культуральной 2KHjji