Экзогиалуронидазы

 

314787

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОВСКОМУ СВИ ЕТЕЛЬСТВУ

Со)оз Соеетскик

Социалистически)) Республик

Зависимое от авт. свидетельства No—

Заявлено 28.I I.1969 (№ 1310666/28-13) с неприсоединением заявки Ме—

Приоритет—

Опубликовано 21.1Х.1971. Б)оллете lb М 28

Дата опубликования описания 17.ХИ.1971

МПК С 12d 13, 10

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

УДК 577.15.07 (088.8) Авторы изобретения

Н. П. Елинов и иностранец Адель Эль Суккари (Объединенная Арабская Республика) Заявитель

Ленинградский химико-фармацевтический институ

СПОСОБ ОЧИСТКИ ЭКЗОГИАЛУРОИИДАЗЪ1

Изобретение относится к способам очнстк« ферментных препаратов.

Известен способ очистки экзогиалуронидазы путем введения в ее раствор новерхностноактивных веществ. По такому способу степень очистки ферментного препарата недостаточно высока.

Предлагаемый способ позволяет повысить степень очистки фсрментного препарата.

Предложено в качестве поверхностно-активного вещества использовать пара-метилфенил-диоксоэтил-гексил-децил-аммоний - бромид, имеющий следующую структурну)о форму:I) н 1

I СН . 0 С2ii4 0 Санц N С ОНе

1 ! С Н,) „— СН, J

Способ состоит в следу)ощсм.

Пример. Выращивают staph lococct)s

3))) ens (штамм 39, продуцирующий экзогналуронидазу) на скошенном мясо-псптонном агаре в пробирках в течение 1 суток пр.

37 С. Полученную биомассу из четырех г)1)1)бирок переносят в 120 мл мясо.пептонного бульона в колбе и оставляют в стационарных условиях tið)) 37 С в течение 18 кис. После этого культуру в бульоне тщательню взбалтыB3loT до образоваш)я гомогенной суси 1131) ll клстоl .

5 Вышеуказанную суспензню в количестве

25 ))л переносят в колбу, содержащую 200 л)л среды след ющего состава:

Дро кжевоЙ экст()акт г.

Гндролизат казснна 1 г.

1О Мясопептонный бульон 200 ))л.

Используют четыре такнс колбы, соgt р>кнмос которых после засева хорошо смешпвают, выдержнвак)т в начале нрн 37 С в тсчсннс

18 час, затем — при 24 С в течение 3 дней.

Полученную биомассу центрифугируют прн

6000 oot)шн. в течение 5 ))ин н в культурал)— ной жидкости определяют активность гналуронндазы внскознметрпческим методом, 3 также содержание белка по Лоурн.

К 800 ))л культуральной жидкости добавляют 5,44 г ацетата натрия 11 8 .))л 0.5 Ч уксусной кислоты, смесь переносят на лед н охлаждают до Трх пор, пока темисратура сс нс снизится до 2 С. После этого добавляют

560 ))л охлажденного до этой жс температуры 96 этанол3 и оставляют )3 мор03))льнон камере рефр)lжс))ато))3 на 18 ч))с. Охла?кдснную смесь затем цснтрнфуп)руют при

6000 or) )tr)H 13 те)ение 5 ).1)н.

ЗО Получe)))!ый осадок растворя)от в 40 лл

314787 о

Предмет изобретения

Составитель Б. Дунье

Редактор В. Смирнгина Техрсд Л, Я. Левина Корректор Е. Н, Зимина

Заказ 448/!796 Иад X- 1254 Тираж 473 Подписное

1!11ИИ!11! Комп гота по делам изобретений II открытий при (".оветс Министров C:ÑÑ "

Москва, P(-35, Раушская ваб., д. 4 5

Тип Харьк, фпл пре . «Патент» дистиллированной воды и повторно цсвтрпф,— гируют при тех жс условиях.

К 35 нл полученной жидкости добавляют

35 л1г пара-метил-фенил-диоксоэтил-гекс;1лдецил-аммонпй-бромида и оставляют !Ip!I 5" С 5 в течение 1 суток, центрифугируют при

ОООО об111ин 13 течение 5 11ин и еще раз осажта1от фермент этанолом из надосадоч1юй жидкости, как это указано выше.

Осадок экзогиалуронидазы промывают 10 ацетоном, эфиром и после этого порошок фермента собирают пз центрифужных пробирок, Экзогиалуронидаза имеет белый цвет, легко растворима в воде, содержит от 500 до 600 единиц вязкости (за единицу вязкости прини- 15 мают минимальное количество фермента, ко1орое расщепляет гиалуроновую кислоту ..1о

1/2 ее первоначальной вязкости в течение 5л1ин при 22 — 24 С).

Степень очистки экзогиалуронидазы с по- 20 мощь!о поверхностно-активного вещества достигает кратности не менее, чем в 800 раз и пересчете на конечную активность фермента

1 сравнении с активностью его в исходlloé культуральной жидкости Выход экзогиалуро- 25 нпдазы составляет около 22 лг (44о11о) от псрвоначального осадка (при осаждении та1юлом).

Приготовленный указанным способом фермент»е содержит свободных аминокислот, к раствору его можно добавлять мертиолат (1: 5000) в качестве консерванта, который пе снижает активности гиалуронидазы.

Способ очистки экзогиалуронидазы путем введения в ее раствор поверхностно-активных веществ, отличающийся тем, что, с целью llcвышеьиия степени очистки препарата, в ка1сстве поверхностно-активного вещества используют пара-метил-фснил — диоксоэтил — гексплдецпл-аммоний-бром ид, имекнций следу1он1 ю структурную формулу:

Н

CH,, - 0 — Сӓ́— Π— 1 ь1,— -1 1=, -ш

1 (cH,)„— сн,