Способ получения литического фермента
ОПИСАНИЕ 3480I0
ИЗОБРЕТЕНИЯ
Со1оэ Саветскик
Социалистических
Республик
N ПАТЕНТУ
Завися:i1ЫЙ от 111ITLIIT I ¹
М. Кл. С 12d 13/10
Заявлено 12.111.1970 (№ 1412761/28-13)
Приоритет 12 III.1969 (№ 18312!69, Япония) 11очитет па солом
11еойретсиий и открытий при Совете Мииистров
СССР
УДК 577.15.08(088.8) Опубликовано 10.VIII.1972. Б1оллетень Х 24
Дата опубликования nolle;III!III 05.1Х.1972
Автор изобретения
Иностранец
Хироси Оказаки (Япония) Иностранная фирма
«Чугай Сейяку Кабусики Кайша» и иностранец
Хироси Иизука (Япония) :I 3
Заявители
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА
Изобретение относится к области микробиологической промышленности, а именно к получению ферментов, способных лизировать оболочку клеток Chlorel la, дрожжей н т. п.
Известен способ получения литического фермента путем выращивания его продуцептов на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в присутствии минеральных солей с последующим выделением ферменга из культуральной жидкости. 10
Предложенный способ отличается от известного тем, что в качестве продуцента используют микроорганизм М1сгоро1уз рога 434. При этом выращивание последнего желательно производить при температуре 40 — 60 С в те- 15 чение 16 — 24 час, Микроорганизм Micropolys рога 434 имеет следующую характеристику, Морфология. Воздушный мнцелий диаметром около 0,7 — 1,0 лтк, разветвленный, умерен- 20 но прилипший к среде, белый.
Субстратный мпцелнй немного тоньше, чем воздушный; днамстp около 0,5 — 0,7 л1к, имеет тенденцию проникать в агаровую среду.
На поверхности агаровой среды, часто на- 25 блюдается скопление из куполообразны. . образований.
Споры сферические или овальные, диамегр нх около 08 — 1,0 11к, ооразуются главным образом сбоку мнцелия. Иногда наблюдаются 30 отдельные споры, но главным образом цепочки пз 2 — 10 спор. Цепочки прямые, сравнительно легко разделяются на отдельные споры и при выращивании со встряхиванием не наблюдается цепочек длиннее, чем из 2 — 3 спор.
Спиральные не образуются.
При прорастании спор нчблюдается l—
2 трубчатых зародыша.
Фрагментов мнцелпя в чашках Петри не наблюдается, Но часто встреча1отся фрагменты в 5 — 20 лк прн намазыванни на стекло.
Как показывает хром атографическнн анализ на бумаге после гидролиза клеточной обопочкн 6Н НС1 клеточная оболочка состоит 113 мезо-а, е-диамннопомслиновой «ислоты, арабинозы, галактозы и т. д.
Физиологические признаки. На сахарозоннтратном агаре не растет.
На глюкозо-аспарагнновом агаре нс растет.
На глицерин-аспарагнновом агаре ро т умеренный. На поверхности среды образу1отся тссные слои. Субстратньш мицелий светло-коричневый. Воздушный мицепнй белый.
На жидком агаре рост хороший. Воздушный мицелий белый. Субстратный мицелнй свегло-коричневый, Растворимого пигмента нег.
Среда имеет порошковатую поверхность.
Агар с желатнной. Через четыре дня нрн
50 С наблюдается большой рост на поверхно348010 сти среды. Ilc) Бторон . j(нь рязжп KOUII51 студня нс няблюдастся, но на четвертый день н;lолюдается умеренное разжиженис.
Среда Беннета. Хороший рост. Воздушный мпцелий ослый, Субстратный мпцслии I)cãЛО-КОРИЧНЕВЫЙ, Рс)СТБОРИ)!Ы!! НПГМСЧ(т Сгц) ГЛОкорич ИС 130ГО UBCT3.
Лгсчр <. Кряк Мсt. 1О <1 U Н СОр Гспи(1(СИИ I ll Со,l ям и . (I c p c 3 и (т! >I p c п р и 5 (j С р 0 с I B U (. Г. 1 il 3 !l< i Jit< L И И 51 К Р Я Х ) Я . i cl Н С Т .
<) I BP C КРЯ Х 3! c),10)i 11 >(Я I!hi (1 Нсf!TO!10)l. >сор<)ШИИ р<)СТ В(Е)дуiilfl l>! È <(ИЦС>!11111 б(>гl L! II. С> Й(ГРсlТ>!Ы Н» И Ц(,111 0 ((3(Т.lо-1<0() f1 I !i(. 15!>I JJ, 1 >10 I B>0J)U (LI JI I I 0 I )1 IIT, 015(1. J()-КОРII I I!<. БЫ И. (C. J)(75, i!3(i,(051 I! j) 1 00 С I!0 1 11, (!)0, 111: 3 У С 1 С 51 ,. (СКСТРИ НО-Кс)3Сilli<)IJI>ll(сlГЯР. AOJ)0(UIt II P<)С Г.
Воздушный мицслий жслтовято-бслый. РястВОРИМЫй ПИГМ ilT СБ T;10-жСЛто- ОР iclUCI)LIII
1! (IТр сlТII 351 с j)С 1я. Г<) 0 êl(1(ПЛ(Il ê0()бр>1.51! i:It! р<И T L303,(TIU IILI li (и ЦСЛ ип ОС)I I>l li
I 11!Tрс)T II(Бос TclllclВЛIIБс)(. 1 . ! I сl, I cl K )1) CОВО.>1,>10 I OK(pet< ГС Г « )<) J) it 5<))511
Ii!1(. )l 0,7сц. -Iср 3 lllcl Ili)I н(и! 50 С JJBO li0Д 1(!051 I JL f! TOU113 B 1) 0 51.
1 (сl к )р Гофс.1ьнои:
Н(T, ССЛ, I i0.103 Я I I(. !ЭсlЗЛ Я ГЯСТС51.
L 1, с, !,л 10, I О 3 О -, ((к с т j) 1(и 0 - K я 3 с 1! и 0 13 я я (() с; j я .
Умсрсинhié рост B видс колонии. Воздxiiilli>IU
3!П ЦСЛИ Й ()СЛ 1>l li. ГI ОЧ7 И НС 1!Я() I IO;l ñ!СТСя р !13.10.
Ж<. пни 1((.,1,110.(ОЗЫ.
1(я IIJITilтсл(п!ой ()Г)1 ро!301! Срс;((!(с(рост: !
lpII 80, с,lc)<)1>lit j)0(! Ilj)U 87, умсрснный
40 — -45 lt хороший рос! IJJ)li 10 45 С. Ум(рсll
l l l >I l l Р 0 С T, I I () С;1 сl 0 ОС С Ц С l i, Ñ I l J J (13 03;! У! и! 10 (0 Х! i Iцсl!151 ири 55--60" С lf п 1050ll рос Г II>)ll 65 С.
Спорl>! J le Г1 ОГИ 0 сl IОГ U pil ТС I I 1 013011 0() J) B 0011> С
Б Te ieiiitc 10 >пни при 100> С. Ilp;l экстрякц:i.i
I OJ) 5I III tbl 80% -U (>I. >I этан о 103! н ) б 110;I clCT(51 I J) l Iсу Гс ГBUc 2,6-диноl<олсинОБОи кисгlот(,1. ) 1<)! фа КТ U(0 cl <)1 К)Дсl TCH, (Ë и ИЗ ВС>(I НОГО J) 0;I cl.
Гl итятсльU 151 срс, (с(, U рп )JCU 51c > I 151 li р U I! J)<> ,10iKc tt)t<))t спосоос, СОД ()el с<)ОТ Я, J1(<) j) Г!Нl п 1(. СКИ X С() 1 0I I I I Л I > 11 >1 х Б <. . 1 (i C с Т 13 . .1 1 С T 0 I I I I (K 0 Ъ(3 Л (. —
j)0;1il 3(ОЖ>>. Г 0(>IT I> 110!I IDIC If )tC 101!lit It J) cl BIJUтс ll>!10 ВЫСОКУЮ СтСНСII l> ПОЛ ИМ С Р)1::И(И П, l1 cl !
1Рп М (. Р КРЯ > )!сl 1,,((KCTJ) cl It,, (CКС ГР. П), I J 0 5 t И Н
U 1, U., UO СЯХс(РЯ, U .I(ЮЩИС 0 II:51>) Ю С С. ПСUL !
Голимсриз )I(JIB, няпримср, м<н!Осяхяр(!ды, дисахярпды и т. п.:!спригÎ;ilibl, Ис Гочникями
cl3OTB )J 0?K(>Т ÎLlTL С > ЛьфяТ cl ll )i,t OI! J(Я, Х, I 0pU;I, сl )>! 310! I II JI, фОС(1) сl f c) 31 3(ÎÏÈ51> It Jt T J) i)1 с) >1,">10Н tl с(Il 1 . II 11(0(ЭГЯНИИСCН)!С COËII дООсп3Л)по i 51 к срсдс В качествс источников различных элсмснТ()Л, СУIЦСCTB(. 0 III>I <;(tf)I POCTcl,I 0J
clЛ1>II ЫХ, ЦИ!I КÎBЫ Х, .(!С, (И(>(Х, ЖС ЛСЗ! I I>l., !>!с(Р
ГclifU(Вых и 1. п. солси. В кячсс.l Б(Oj)1 сlli!i÷с
СК!!Х НИТЯ 1 С. ЛЬИЫХ 15(П(СС В >jO()c7B.751IOT 1, 11>t!L13СИ(ССТ()Я, K c) K 1)ИТсl МИНЬI, it)li)HOKJIC.10ТЫ>,l POiK
iI
Среда моэкет так)кс состоять из сущесгве(3Uo важных неоргBUIiчсских солей и живых клеТоК нскоторых .< ро)1<жсй,:<лорс.1лы, Г!ЗиокОВ, бактсрий и т. д., которые подвергаются действию фермс(гга настоящсго изобретения. В поСЛСДIJCJ>l СЛУ le)(. i! 10 дрожжсвой н солодGBI>JJ t экстракт и т. д. Выращивание обычно начинают суспег!ДироBBttneJt MjcI0p0JyB рога 434 в стерилизоБЛ!1!1ОИ Bn;te U<, Т().! ИСрС н<)С я tt(. Т i(. 1! 1!;I BTlliiOBOII иглы !исто!! куг!ь Гур(! !<, >Обяв lcUIJH получаю15 !Цсйся «yet!(.JIзiil! к питятсльной среде онисапJJ0«) вышс т:!Иа. Выра(цивя»ис обычно закан t1I 15ÿþ1 3я llсpil0;I, 1 6 -48 ч() с с я эpи j)ОВяиис ы Uри тсу(псратурс 40- -60 С. 20 Фсрх!Снт иакапл JBBeic;i Бо время выращива-! Ия в культуральнои жидкости и верхний слой после удаления мицслия, например, ценгрифуГирОВя1!Исм, можст примсняться кяк тякОВОй ;j:l H c7 J13 U p0I3 Я 111151 K.l СTOH II 013 000Л 0il(>!! Ш(ГО, (оос113.)СI I И Я ДО СТСНСНИ Н ЯСЫ з5 !ц< нпя 0,6 и собирания осевшего фермента., l ОосlВЛ 51 ТЬ C) 1 ЬфсlТ c()l \(ОН ИЯ . >IОЖНО за ОДИН прнсм.. (у(пи!с рсзульгаты в этом случае 170лучают, сс IU сульфаг аммония добавляют до стсUciiп насыщсllll51 0,8. С другой стороны для 40 Оса)кдспия фсрмсUTB можно обрабатывать раствор ацстоиом. 1lаилучший результат полу !Bioà прп мсдлснном добавлении ацетона 10 l<0Jll(LIITpclUUll 60% и отдслении осадка после псрсмеш иван и я Б тсчснне 1 <(ас. Полученный 45 фсрмснт растворяют затем в подходящем буферном растворе, например в 0,01 и. растворе !(Т(РО, (рl 1==7,0J и диализируют в тот же буфсриый раствор. Внутренний раствор (расги)р, остающийся 15 мешке из мембраны после 50 (и ализа Ирсдстявля T высоко чистый раствор фсрмс!Ггя, сго можно высушить при температурс нижс 0 С аналогично исочищенному раствору (!)ср) !Сита. l lрсдлож lllll>ill литичсский фсрмент имеет 55 следуя)!цпе характеристики. Уста" чив в прсдслах р!1 5,0 — 9,0. Оптимальный прсдсл рll 7,0 — 8,0. Лктив!II при темпсрятурс 40 — 70 С, в особс!(ности ирп 50--60 С. 60 1)у;(учи с!Ойкпм при низкой температуре, оН IIc . дсзяктивирустся при 0 С и теряет актив1!ость Ilpè 100" С за 10 мин. Лсгко растворим Б воде li в разбавленных раствора. солсй, HO пе растворим в ацетоне. 65 Сильно ш(гибируется ионами Ag+, Cu++, 348010 Hg++, Гс++, Zn++, Cd++, Ni++ и умеренно Мп++, Со1+, но активируется и Мц++. Полученный литический фермент пригоден для экстрагирования многих полезных внутриклеточных веществ, например протеина, нуклсиновой кислоты, аминокислот, витамина 1i ДР. Пример 1. В среду А производят посев Micropolys pora 434. Среда содержит 5 г живых клеток Cartdida rugosa IF — 101; 1 г К НРО, 0,5 г MgSO4. 7Н О и 1000 мл дистиллированной воды; рН 7,4. Выращивают со встряхиванием 24 час при 50 — 55 С, после чего живые клетки Calldida rugosa IF — 101 полностью растворяются. Получснну1о культуральную жидкость затем цснтрифугируют при 5000 об, ла н в течение 10 мин, клетки и споры MicropoIys рога 434 удаляют. Получают неочищенный раствор фермента, обладающий большой активностью по растворенгио клеточной оболочки. Готовят суспензию живых клеток каждого вида дрожжей, перечисленных в табл. 1, с концентрацией 10 мл, содержащую 0,1% К211Р04 и 0,05% MgSOi.7НаО в дистиллированной воде и рН доводят до 7,4. Применявшиеся дрожжи, содержащие живые клетки, получают посевом этих дрожжей в среду, содержащую глюкозу, (ХН4)2306 КняРО.ь Мдь04, солодовый и дрожжевой экстракты, имеющую рН 5,4. Выращивают их встряхиванием 24 час при 30 С. Затем после доведения неочищенного ра;твора до рН 7,4 к каждым 3 мл этого раствора добавляют 0,2 мл суснензии живых клеток и смесь слегка встряхивают 4 час при 50 С. Результаты, приведенные в табл. 1, показывают, что большая часть дрожхкевых клеток разрушена и растворена. Уменьшение мутности реакционной смеси, указанное в табл. 1, определяется визуально 1 ри .плюса обозначают полное раствореги1е клеток, два плюса — умеренное растворение и один плюс — слабый лизис клеток. Степень лизиса клеток вычисляют по следующей формуле: - X 100, S ate St — исходное число клеток; S, — число нелизированных клеток, остающихся в реакционной смеси. Пример 2. В стерилизова1шую при 120 С в течение 3 мин среду Б, содержащую около 10 г увлажненных клеток Chlorella ellipso idella tamiga; 1 г К21-1РО4, 0,5 г MgSO.i><7H;0 и 1 г дрожжевого экстракта в 1000 мл дистиллированной воды с рН 7,4 засевают мицелий MicropoIys рога 434 и выращивают при 50 С 24 час. Нелизированные клетки Chlorella удаляют центрифугированием для получения неочищенного раствора фермента, который имсег большую активность по лизированию живых и теплообработанных клеток (при 98 С Змин). Таблица 1 х z + v v О и - эИ v o ° ох хжх ve î и И Штамм Х v o (ID в О х L+ +++ +" - 4+ 1+++ + i-+ — + ++ + + К 3,0 мл полученного таким образом раствора добавляют 0,2 мл суспензии клеток Chlorella (3;;10" мл) 11 смесь выдерживают при 50 С в течение 18 час при легком встряхивании. Получсш1ыс результаты показаны в табл. 2, где мутность дана в величинах оптической плотности, измеренной при длине.волны 530 ммн. 30 Стандартный раствор готовят путем добавления к суспснзии Chlorella фосфатного буферного раствора (рН 7,4) вместо раствора фермента в количестве равном раствору фермента. Таблица 2 Мутность Время реакции, inc 1 д + v О,в и Л х х Ю col ах ° I ((@ о co, а ж ca C. > 2 о охх Елетки 0,78 0,77 19 Живые клетки 0,70 0,56 0,84 0,80 19 0,77 0,58 Пример 3, К неочищенному раствору фермента, полученному как в примере 1, добавля50 ют сульфаг аммония до степени насыщения 0,4. Образовавшиеся осадки удаляюг и сульфат аммония добавляют до степени насыщения 0,6. Полученные осадки собирают центрифугированием и суспендируют в дистиллиро55 ванной воде. Суспснзию диализировали через целлофановый мешок для получения очищенного фермента. Полученный очищенный фермент добавляют к жидкому образцу, содержащему мицелий 60 Aspergillusorizal IАМ 2024. После выдерживания смеси при 50 С в течение 4 час большая часть клеточных оболочек мицелия была разрушена. К 0,3 мл суспензии клеток (10а нл) Eschere65 chia Coli IАМ 1264, обработанных при 90 С 10 Сапй4а rugosa Candida t(rusei 3АМ 480! Candida t(rus-«4 3АМ 4489 Candirla utilis 3АМ 4215 Candida utilis 3АМ 4295 Candida pseudotropicalis 3АМ 4829 15 Сandida parapsiloris,1АМ 4488 Candida lipolytica ЛАМ 4947 Sacchram1ces cer«nisiai ЛАМ 4039 Sacchramyces cerevisial 3АМ 4308 Sa«chramyces cheyalicri 3ЛМ 4801 Pichia inemt>ranae faciens 1АМ 4025 HanseIula anomalo,1ЛМ 4668 Schiz osacchromyces ровиье 3АМ 4879 45 Теплообработанные клетки 81 86 83 92 93 42 61 81 77 86 348010 Составитель С. Могилевский Корректор Е. михеева Техред T. Ускова Редактор А. Бер Заказ 2687/16 Изд, М 1141 Тираж 406 Подписное VHHHHH Комитета по делам изооре)еиий и открытий при Совете Министров СССР Москва, )К-35, Раушская наб, д. 4 5 Типография, пр. Сапунова, 2 3 ман, добавляют 2,0 >1л раствора фсрмспга, полученного в примере 3. После доведения рН до 7,4 смесь выдержиBBIOT 4 IQC 1)pH 50 С. Около 70% I<.!OTOI< I)I I !:) разрушено. Г1 р и м е р 4. В среду В (содержагцую 20 крахмала; 2 г (11Н1),SOI, 2 г К I,PO,; 5 г К2НРО.,; 2 г М1тЬОI 7Н,О; 0,006 г CuSO. . 5Н О; 0,001 г ГеЯО, 7Н О; 0,008 г МпС1 ° 4Н20; 0,002 г Z!)SO) 71-1 0 и 10 г дро>к>ксзаго экстракта в 1000 14л дистиллированной l!оды при рН 7,4) засевают Miciopol) s рога 434 и выращивают при встряхивании при 50 С в течение 24 час. Культуральиую жидкость цсптрифугирх IOT при 5000 oб т н 10 л1ин. Мицелий и споры удаляют и получа)от раствор неочищенного фсргиецта, обладающий большой активгп)стью по лизировацию клеточных оболочек, К полученному раствору исочищсииого фсрмспта дооавл1110т c) ëüôÿT >1)1)10tl II!1 .Io стспсии насыщения 0,8 и смесь перемешивают:15 час при 5 С, при этом пол) 1а10) коричп )вый осадок. Последний отделяют цс1ггрифугироваиием при 10000 об|вин, растворяют в 90 ил 0,01 М раствора фосфатиого буфера (р11 7,()) и диализируюг в тот >ке буферный раствор при 5 С. 11олучают раствор очигцеииого фсрмента, который высушивают при низкой температуре. Получают 195 г чистого фермента в виде порошка, П р и м с р 5. К раствору неочищенного фер5 мента, получсииого как в примере 4, поддерживаемому при 5 С, добавляют ацеточ при псрсмс1цивации до дости>кения ацетоиом 60%-цой концситрации и продолжают псремешивание 5 час. Образовавшийся осадок отде10 л IIOT цситрифугировацием при 10000 об л1ин 10 лшн и растворяют в 90 мл 0,01 М раствора фосфорного буфера (р1-1 7,0). Полученный раств1)р диализируют в тот же буферный рас1вор при 5 С и получают раствор очищенного 15 фермента, Предмет изобретения 1. Способ получения литического фермента путем выращивания его продуцентов иа пита20 тельной среде, содержащей источники углерода, азота, в присутствии миисральиых солей с последующим выделением фермента из культ) ралы10й жидкости, 0тл чающаг)ся тем, что в качестве продуцснта используют микроор25 1 аиизм MIOI opol) рога 434. 2. Способ ио и. 1, отличающийся тем, pro вырагциваиие осуществляют при температуре 40 — 60 С в течение 16 — 24 час.
